JP2023510916A

JP2023510916A - 遺伝子発現の制御のための安全スイッチ

Info

Publication number: JP2023510916A
Application number: JP2022543490A
Authority: JP
Inventors: クラーク，ライアン; ホフマン，グレッグ; メイ，アンドリュー; タム，エレノア
Original assignee: サナバイオテクノロジー，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-01-17
Filing date: 2021-01-15
Publication date: 2023-03-15
Also published as: EP4090747A1; IL294820A; CN115298314A; AU2021207993A1; BR112022014118A2; KR20220142433A; CA3165076A1; US20230062612A1; TW202140784A; MX2022008783A; WO2021146627A1

Abstract

本明細書では、免疫抑制因子を条件付きで発現する多能性幹細胞を含む細胞、ならびに関連するそれらの使用方法及び生成方法が開示される。一部の実施形態では、開示される細胞は、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩヒト白血球抗原を発現せず、場合によっては、１つまたは複数のＴＣＲ複合体もまた発現しない。一部の実施形態では、該細胞の低免疫原性は、細胞を特定の因子または薬剤に接触させた際の、制御可能な発現システムの活性化によって制御される。
【選択図】図１

Description

相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０２０年１月１７日に出願された米国仮出願第６２／９６２，７３０号、２０２０年１月１７日に出願された同第６２／９６２，７３９号、及び２０２０年１月１７日に出願された同第６２／９６２，７６４号に対する優先権を主張するものであり、同文献の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

配列表の参照による援用
本願は、配列表とともに電子形式で出願されている。この配列表は、２０２１年１月１４日に作成された３３，９４８バイトのサイズであるＳＡＮＡ００６ＷＯ１ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔと題されるファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

変性疾患は、ヒトの健康を不相応に脅かしている。しばしば加齢関連で、これらの疾患は、罹患した組織及び臓器の進行性の衰退、ならびに最終的には罹患した対象の身体障害及び死亡をもたらす。再生医療の将来性は、病変細胞または欠けた細胞を新たな健常細胞と置き換えることである。過去５年間で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を使用して患者への移植用の任意の成体細胞種を生成するという、再生医療に関する新たなパラダイムが台頭してきている。原理的に、ｈＰＳＣベースの細胞療法は、全てではなくともほとんどの変性症を処置する可能性を有するが、かかる療法の成功は、対象の免疫応答によって制限され得る。

免疫拒絶反応を克服するために考慮されてきた戦略には、ＨＬＡマッチング（例えば、一卵性双生児または臍帯バンキング）、対象への免疫抑制薬の投与、遮断抗体、骨髄抑制／混合キメリズム、ＨＬＡ適合幹細胞のレパートリー、及び自家幹細胞療法が含まれる。

細胞療法に関連する免疫拒絶反応を克服するための新規の手法、組成物、及び方法に対する必要性が残っている。

一態様では、操作された細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、操作された細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子に作動可能に連結された誘導性デグロンエレメントをコードする配列、または（ｉｉ）誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された免疫抑制因子をコードする配列を含む、核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、誘導性デグロンエレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって操作された細胞の免疫原性を制御することとを含む。

別の態様では、操作された細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１の構築物、（ｉｉ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２の構築物、ならびに（ｉｉ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３の構築物を導入することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって操作された細胞の免疫原性を制御することとを含む。

なおも別の態様では、操作された細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって操作された細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一部の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）の前に、操作された細胞を対象に投与することをさらに含む。

一部の実施形態では、これらの方法のうちのいずれかのステップ（ｂ）は、単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及び（ｉｉ）トランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む、単一の核酸構築物を導入することを含む。一部の実施形態では、構築物は、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｓｈＲＮＡ配列、プロモーター、及びトランス活性化因子エレメントを含む。

一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、単離された細胞に、（ｉ）免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及び（ｉｉ）トランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む、単一の核酸構築物を導入することを含む。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、プロモーター、及びトランス活性化因子エレメントを含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、免疫抑制因子を外因的に発現するように操作される。一部の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化する外因性因子の不在下で免疫抑制因子を過剰発現する。

一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである。一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔリプレッサーエレメントであり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＴＲＥプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔ－Ｏｎエレメントであり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、柔軟なリンカーが、誘導性デグロンエレメントを免疫抑制因子につなげる。一部の実施形態では、柔軟なリンカーは、（ＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、配列中、ｎは、１～１０である。

一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、単離された細胞に、該核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む単一の核酸構築物を導入することを含む。

一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。一部の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び／または第３のプロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から各々独立して選択される構成的プロモーターである。

一部の実施形態では、免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含み、該外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、リガンド誘導性デグロンエレメント、ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される。一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｈｕｔｏｆｆ）（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される。一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメントであり、外因性因子は、アスナプレビルである。

一部の実施形態では、該構築物は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性であり、幹細胞またはその分化細胞のいずれかであり、該幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞からなる群から選択され、該分化細胞は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

別の態様では、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列、構成的プロモーター、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物が本明細書で提供される。

一態様では、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、プロモーター、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである。多くの実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＴＲＥプロモーターである。

一部の実施形態では、該構築物の免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。一部の実施形態では、該構築物の免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物のプロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＴＲＥプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔ－Ｏｎエレメントを含む。

また、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを含む単離された細胞を含む、組成物も提供される。

また、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを含む単離された細胞を含む、組成物も提供され、該単離された細胞は、免疫抑制因子を外因的に発現するように操作される。一部の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化する外因性因子の不在下で免疫抑制因子を過剰発現する。一部の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露される。一部の実施形態では、単離された細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される幹細胞である。

一部の実施形態では、組成物は、本明細書に概説される幹細胞のうちのいずれかを心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む。

一部の態様では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）本明細書に概説されるいずれかの組成物を患者に投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡ、ＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメント、またはＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントからなる群から選択される因子を含む、多能性幹細胞が提供される。

また、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡ、ＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメント、またはＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントからなる群から選択される因子を含む、多能性幹細胞も本明細書で提供される。

追加として、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびに（ｉｖ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書に概説される。

また、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびに（ｉｖ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書に概説される。

さらに、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞が本明細書に概説される。

その上、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞が本明細書に概説される。

（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。一部の実施形態では、誘導性システムは、細胞におけるＣＤ４７の発現を減少または低減する。

また、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性システムを含む、多能性幹細胞も本明細書で提供される。一部の実施形態では、誘導性システムは、ＣＤ４７の発現を減少または低減する。

一部の事例では、概説される多能性幹細胞のうちのいずれかに由来する分化細胞が提供され、該分化細胞は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。

一態様では、５’末端から３’末端に、プロモーター、誘導性デグロンエレメント、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び免疫抑制因子遺伝子を含む、構築物が概説される。

別の態様では、５’末端から３’末端に、プロモーター、免疫抑制因子遺伝子、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び誘導性デグロンエレメントを含む、構築物が概説される。

一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。

多くの実施形態では、柔軟なリンカーは、（ＧＳＧ）_ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１）、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）からなる群から選択され、配列中、ｎは、１～１０である。

一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、リガンド誘導性デグロンエレメント、誘導性ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される。一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるゲノム内セーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む。

記載される構築物のうちのいずれかを含む単離された細胞を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

記載される幹細胞のうちのいずれかを心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物が提供される。

一部の態様では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）記載される組成物を患者に投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性デグロンエレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一部の態様では、細胞の免疫原性を制御するためのＤＮＡ標的ヌクレアーゼシステムを含む単離された細胞を含む、組成物が本明細書で提供され、該組成物は、（ａ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１のエレメントと、（ｂ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２のエレメントと、（ｃ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター、及び誘導性プロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３のエレメントとを含む。ある特定の実施形態では、該細胞の免疫原性は、トランス活性化因子エレメントの活性を誘導するための外因性因子に細胞を曝露した際に制御可能である。一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔリプレッサーエレメントであり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、第１のプロモーター、第２のプロモーター、及び／または第３のプロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から各々独立して選択される構成的プロモーターである。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

記載される幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。

一態様では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供され、該方法は、（ａ）上述の組成物を投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、１つまたは複数の免疫抑制因子の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む修飾を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物が提供される。

一態様では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物が提供される。

一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現は、外因性因子によって制御可能である。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の発現は、外因性因子によって制御可能である。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子のタンパク質レベルを低減するための誘導性タンパク質分解システムを含む。一部の実施形態では、誘導性タンパク質分解システムは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される。一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子のＲＮＡレベルを制御可能に低減するためのＲＮＡ制御システムを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ制御システムは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡ制御システムは、リガンド誘導性転写因子、ＳｙｎＮｏｔｃｈ受容体、またはリガンド制御型リボスイッチによって制御可能である。

一部の実施形態では、該システムは、組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現レベルを低減するためのＤＮＡ制御システムを含む。

一部の実施形態では、誘導性プロモーター発現システムは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のタンパク質レベルを増加させるための誘導性タンパク質安定化システムを含む。

一部の実施形態では、誘導性タンパク質安定化システムは、リガンド誘導性タンパク質安定化システム及び低分子誘導性タンパク質安定化システムを含む。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のＲＮＡレベルを増加させるためのＲＮＡ制御システムを含む。

一部の実施形態では、ＲＮＡ制御システムは、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを含む。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の発現レベルを増加させるためのＤＮＡ制御システムを含む。

一部の実施形態では、ＤＮＡ制御システムは、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システム、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び分子制御型リボスイッチシステムからなる群から選択される１つを含む。

一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、心臓細胞特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、膵臓細胞特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、免疫細胞特異的プロモーター、間葉系細胞特異的プロモーター、及び内皮細胞特異的プロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯｎシステムを含む。

一部の実施形態では、分子制御型リボスイッチシステムは、テオフィリン制御型リボスイッチまたはグアニン制御型リボスイッチを含む。

一部の実施形態では、誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲゲノム編集、誘導性ＴＡＬＥＮゲノム編集、誘導性ＺＦＮゲノム編集、及び低分子向上型（ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｅｎｈａｎｃｅｄ）ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集からなる群から選択される１つを含む。

一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。

一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＡ（ＭＩＣ－Ａ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＢ（ＭＩＣ－Ｂ）、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離された哺乳類細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。

別の態様では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が概説され、該方法は、（ａ）概説される組成物を投与することと、（ｂ）組成物を、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現を制御するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（３）低免疫遺伝子を含む、構築物が概説される。別の態様では、５’から３’末端に、（１）低免疫遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物が概説される。

一部の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される。

一部の実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む。

一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。

一部の実施形態では、低免疫遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び低免疫遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列、または低免疫遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び安全スイッチ導入遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列をさらに含む。

一部の実施形態では、該構築物の転写制御エレメントは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離された細胞に、概説されるいずれかの構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を保有する操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が提供される。

記載される構築物を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書で提供される。一部の実施形態では、該構築物は、標的遺伝子座に導入されている。一部の実施形態では、遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座、またはＢ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座のいずれかである。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。

また、幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団も提供される。

患者に、記載される分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。記載される分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、患者を処置する方法が提供される。

一態様では、５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。一態様では、５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。一態様では、５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。別の態様では、５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、及び（６）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、免疫シグナル伝達内への相同性指向修復のための構築物が提供される。なおも別の態様では、５’から３’末端に、（１）必須細胞因子遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）リンカーをコードする配列、（３）安全スイッチ導入遺伝子、及び（４）必須細胞因子遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、必須細胞因子遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される。

一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択される。

一部の実施形態では、免疫シグナル伝達遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥ１１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される。

一部の実施形態では、免疫シグナル伝達遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、及びＨＬＡ－Ｅからなる群から選択される。

一部の実施形態では、２Ａコード配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、標的化ヌクレアーゼがセーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座を切断することを可能にし、それによって該構築物が相同性指向修復により該遺伝子座内に組み換えられるようにする。

一部の実施形態では、該構築物は、標的化ヌクレアーゼが必須細胞因子遺伝子座を切断することを可能にし、それによって該構築物が相同性指向修復により該遺伝子座内に組み換えられるようにする。

一部の実施形態では、該構築物は、安全スイッチ導入遺伝子の５’末端に位置する、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む。

セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書に概説され、上記の構築物のうちのいずれかが、細胞の内在性セーフハーバー遺伝子座内に組み換えられているか、または上記の構築物のうちのいずれかが、細胞の内在性免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み換えられている。セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び必須細胞因子遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書に概説され、上記の構築物のうちのいずれかが、細胞の内在性セーフハーバー遺伝子座内に組み換えられているか、または上記の構築物のうちのいずれかが、細胞の内在性免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み換えられており、該細胞または該その集団は、内在性遺伝子座から必須細胞因子を発現することができない。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

本明細書に概説されるいずれかの幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が提供される。

患者に、概説される分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が開示される。また、概説される分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、患者を処置する方法も開示される。

５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が提供される。

５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）必須細胞因子遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が提供される。

５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）必須細胞因子遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）安全スイッチ導入遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が提供される。

一部の実施形態では、該構築物は、単離された細胞の標的遺伝子座内に組み込まれて、標的遺伝子の発現を妨害するように構成される。

一部の実施形態では、標的遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座である。一部の実施形態では、標的遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、及びＨＬＡ－Ｅからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座である。一部の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。

記載される構築物のうちのいずれかを含む、単離された細胞またはその集団が本明細書に概説され、該構築物は、単離された細胞において標的遺伝子の発現を妨害するように内在性標的遺伝子内に組み込まれている。単離された細胞またはその集団が本明細書に概説され、該単離された細胞は、内在性遺伝子座から必須細胞因子を発現することができない。

一部の実施形態では、該構築物は、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼ標的部位にて標的遺伝子内に組み込まれている。一部の実施形態では、標的遺伝子の一方のアレルが、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼによる標的化によって破壊される。一部の実施形態では、標的遺伝子の両方のアレルが、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼによる標的化によって破壊される。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

一部の態様では、概説される幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書で提供される。一部の実施形態では、患者に、分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、患者を処置する方法が提供される。

安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されているリンカーをコードする配列に作動可能に連結された必須細胞因子遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。

一部の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ３０導入遺伝子、及びＣＤ１６導入遺伝子からなる群から選択される。

一部の態様では、（１）ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される低免疫因子、ならびに（２）ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質が本明細書で提供される。

一部の態様では、（１）ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される低免疫因子をコードする配列、ならびに（２）ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、低免疫因子及び／またはペプチドエピトープは、融合タンパク質のＮ末端にある。

一部の実施形態では、該タンパク質は、低免疫因子及びペプチドエピトープをつなげる、及び／または融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に位置するリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。

一部の実施形態では、該構築物の低免疫因子をコードする配列は、ペプチドエピトープをコードする配列の５’にあり、及び／またはペプチドエピトープをコードする配列は、低免疫因子をコードする配列の５’にある。

一部の実施形態では、該構築物は、低免疫因子をコードする配列及びペプチドエピトープをコードする配列をつなげる、及び／または融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に位置するリンカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

また、単離された細胞に、本明細書に記載の構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法も提供される。一部の実施形態では、単離された細胞に、記載される構築物のうちのいずれかを形質導入することと、該構築物によってコードされる組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現する単離された細胞を選択することとを含む、方法が提供される。

また、本明細書に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団も提供される。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

さらに、記載される幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書に概説される。

場合によっては、患者に、記載される分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。場合によっては、分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

一部の態様では、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片、（２）第１のリンカー、（３）異種ペプチドエピトープ、（４）第２のリンカー、及び（５）ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインを含む、組換えＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質が概説される。

一部の実施形態では、ＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインは、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む。一部の実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬｉｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

別の態様では、５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列、（３）第１のリンカー、（４）ペプチドエピトープをコードする配列、（５）第２のリンカー、ならびに（６）膜貫通型ドメイン及びＣ末端を含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列を含む、構築物が開示される。

一部の実施形態では、ＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７を含む。一部の実施形態では、膜貫通型ドメイン及びＣ末端を含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む。一部の実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、該構築物の（４）の配列によってコードされるペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬｉｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、転写制御エレメントは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

単離された細胞に、構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、ＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が提供される。一部の実施形態では、該方法は、単離された細胞に、記載される構築物のうちのいずれかを形質導入することと、該構築物によってコードされるＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質を発現する単離された細胞を選択することとを含む。また、該構築物を含む、単離された細胞またはその集団も提供される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞である。

場合によっては、患者に、記載される分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。場合によっては、患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、分化細胞またはその集団を前もって投与された患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

一態様では、（１）転写制御エレメント、（２）必須細胞因子遺伝子、（３）転写後または翻訳後制御エレメント、及び（４）ポリアデニル化配列を含む、構築物が提供される。

一部の実施形態では、転写制御エレメントは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、転写後制御エレメントは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるＲＮＡ制御システムである。一部の実施形態では、翻訳後制御エレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される誘導性タンパク質分解システムである。

また、転写後または翻訳後制御エレメントの制御下にある組換え必須細胞因子を含む、単離された細胞も提供され、内在性の必須細胞因子遺伝子が不活性化され、組換え必須細胞因子の発現が外因性因子によって制御可能である。一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される。一部の実施形態では、転写後制御エレメントは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるＲＮＡ制御システムである。一部の実施形態では、翻訳後制御エレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される誘導性タンパク質分解システムである。一部の実施形態では、単離された細胞は、自家ヒト細胞または同種他家ヒト細胞である。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞及び分化細胞からなる群から選択される。

なおも別の態様では、５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列、（３）リボソームスキッピング配列、及び（４）低免疫因子をコードする配列を含む、バイシストロン性構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。一部の実施形態では、該構築物の（２）の配列によってコードされる表面に露出したペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、単離された細胞に、記載される構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、低免疫因子及びペプチドエピトープを発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が概説される。一部の実施形態では、該方法は、単離された細胞に、記載される構築物を形質導入することと、いずれも該構築物によってコードされる低免疫因子及びペプチドエピトープを発現している単離された細胞を選択することとを含む。また、記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団も提供される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、記載される幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が提供される。一部の事例では、患者に、分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。一部の事例では、分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法が提供される。場合によっては、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

一態様では、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）安全スイッチ導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）低免疫遺伝子を含む、多能性幹細胞が提供され、安全スイッチ導入遺伝子の発現が、低免疫遺伝子の発現を調節する。

別の態様では、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）安全スイッチ導入遺伝子、ならびに（ｉｖ）低免疫遺伝子を含む、多能性幹細胞が提供され、安全スイッチ導入遺伝子の発現が、低免疫遺伝子の発現を調節する。

なおも別の態様では、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）安全スイッチ、ならびに（ｉｉｉ）低免疫因子を含む、多能性幹細胞が提供され、安全スイッチの発現が、低免疫因子の発現を調節する。

別の態様では、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）安全スイッチ、ならびに（ｉｖ）低免疫因子を含む、多能性幹細胞が提供され、安全スイッチの発現が、低免疫因子の発現を調節する。

一態様では、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ならびに（ｉｉ）表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含む、多能性幹細胞が提供され、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択され、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

一態様では、（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含む、多能性幹細胞が提供され、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択され、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

一態様では、５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、ならびに（３）必須細胞因子遺伝子を含む、構築物が提供される。一部の態様では、５’から３’末端に、（１）必須細胞因子遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、及び（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物が提供される。

単離された細胞に、記載される構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を保有する操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が概説される。一部の実施形態では、単離された細胞に、記載される構築物（例えば、レンチウイルス構築物）を形質導入することと、該構築物の安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を保有する単離された細胞を選択することとを含む、方法が提供される。また、記載される構築物のうちのいずれか１つを含む、単離された細胞またはその集団も提供される。

一部の実施形態では、該構築物は、標的遺伝子座に導入されている。一部の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座、ならびにＢ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座からなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む操作されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞から選択される。

別の態様では、いずれかの幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が開示される。

一部の実施形態では、患者に、開示される分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、患者において安全スイッチを活性化することを含む、開示される分化細胞またはその集団を前もって投与された患者を処置する方法が提供される。

別の態様では、（１）必須細胞因子、及び（２）必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質が提供される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、スプライセオソームサブユニットタンパク質、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態では、該タンパク質は、必須細胞因子及びペプチドエピトープをつなげるリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、該タンパク質は、ペプチドエピトープのＮ末端に位置するリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。

別の態様では、（１）必須細胞因子をコードする配列、及び（２）必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質をコードする構築物が提供される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、スプライセオソームサブユニットタンパク質、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、必須細胞因子をコードする配列は、ペプチドエピトープをコードする配列の５’にある。

一部の実施形態では、ペプチドエピトープをコードする配列は、必須細胞因子をコードする配列の５’にある。

一部の実施形態では、該構築物は、必須細胞因子をコードする配列及びペプチドエピトープをコードする配列をつなげるリンカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置するリンカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、該構築物は、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントを含む。

一部の実施形態では、単離された細胞に、記載される構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が概説される。他の実施形態では、該方法は、単離された細胞に、記載されるレンチウイルス構築物を形質導入することと、該構築物における組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している単離された細胞を選択することとを含む。一部の実施形態では、単離された細胞またはその集団は、本明細書で言及される構築物を含む。

一部の実施形態では、記載される幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が提供される。一部の事例では、患者に、分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。一部の事例では、分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法が提供される。場合によっては、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）転写制御エレメント、（３）ＨＳＶｔｋ安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（５）ＣＤ４７低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、ならびに（７）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）転写制御エレメント、（３）ＨＳＶｔｋ安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（５）ＣＤ４７低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、ならびに（７）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が提供される。

一部の実施形態では、転写制御エレメントは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団が提供され、本明細書に記載の構築物が、単離された細胞の内在性セーフハーバー遺伝子座内、または単離された細胞の内在性標的遺伝子座内に組み換えられている。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性であり、幹細胞である。一部の事例では、幹細胞は、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

記載される幹細胞を幹細胞のうちのいずれかの膵臓細胞への分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書で提供される。一部の実施形態では、膵臓細胞は、ベータ島細胞である。

患者に、開示される分化細胞またはその集団を投与することと、記載されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することとを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が概説される。

低免疫原性細胞、その生産方法、及びその使用方法の詳細な説明は、２０１５年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１及び２０１８年１月１４日に出願されたＷＯ２０１８１３２７８３に見出され、配列表及び図を含めたこれらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

本技術の他の目的、利点、及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。

異なるｓｈＲＮＡ構築物の種々のノックダウン効率を示す、マウスＣＤ４７を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞株におけるデータを図示する。外因性ＣＤ４７の下方制御には、ＴｅｔＯシステムによって制御される誘導性ｓｈＲＮＡを用いた。ＣＤ４７分解を誘導するための低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム（Ｈａｎｎａｈｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ１１６３７－６３８（２０１５）を参照されたい）の概略図を提供する。ＳＭＡＳＨは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）のプロテアーゼ及びＮＳ４Ａタンパク質におけるエレメントを使用して、臨床試験されたＨＣＶプロテアーゼ阻害剤により、ＳＭＡＳＨタグに融合されたＣＤ４７タンパク質の発現を有効に遮断するシステムである。プロテアーゼ阻害剤（アスナプレビル）の不在下では、隠れた（ｃｒｙｐｔｉｃ）デグロン配列が切除され、未修飾の遺伝子産物をもたらす。アスナプレビルの添加により、ＮＳ３プロテアーゼは阻害されて、デグロン配列に融合された新たに合成されたＣＤ４７タンパク質の分解を引き起こす。Ａ～Ｂは、ＡＡＶＳ１ゲノム内セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナー鋳型の概略図を提供する。Ａは、ＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）及びヒトＣＤ４７遺伝子に融合されたＳＭＡＳＨタグを含有し、ＡＡＶＳ１ゲノム内セーフハーバー遺伝子座に対する２つの１０００ｂｐの相同性アーム間に挿入されたカセット（これ以降、ＡＡＶＳ１－ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７－ＡＡＶＳ１ドナー鋳型と称される）を示す。Ｂは、ＣＤ４７の過剰発現が、ＡＡＶＳ１ゲノム内セーフハーバー遺伝子座内へのＡＡＶＳ１－ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７－ＡＡＶＳ１カセットのノックインによって達成されることを示す。ＳＭＡＳＨシステムがＣＤ４７分解を促進する能力を評定するための研究の要約を提供する。（上）ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７発現カセットを含む発現構築物の概略図。この発現構築物は、ＳＭＡＳＨタグをコードする核酸に融合されたヒトＣＤ４７遺伝子に作動可能に連結されたＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）を含む。（下）ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７発現カセットまたは対照ＥＦＳ－ＣＤ４７発現カセットのいずれかを形質導入されたｉＰＳＣを、異なる濃度のアスナプレビルの存在下で４８時間、ＣＤ４７発現に関して評定した。ＣＤ４７分解を誘導するためのリガンド誘導分解（ＬＩＤ）システムの概略図を提供する（Ｂｏｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ．７（８）：５３１－５３７（２０１２）を参照されたい）。ＬＩＤシステムにおいては、目的のタンパク質（ＰＯＩ、例えば、ＣＤ４７）が、ＬＩＤドメインに融合される。ＬＩＤドメインは、ＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ならびにＦＫＢＰのＣ末端に融合されたペプチドデグロンを含む。ＦＫＢＰは、シス／トランスプロリルイソメラーゼ活性をもつ酵素であり、広範囲の基質ポリペプチドに対して活性をもつことができる。ペプチドデグロンは、ＦＫＢＰ活性部位に結合することができ、活性部位において隔離された場合、細胞分解タンパク質によって検出されず、こうしてそれは隠れたデグロンとなる。低分子シールド－１の不在下では、ＰＯＩ－ＬＩＤ融合タンパク質は、安定している。しかしながら、シールド－１の存在下では、シールド－１は、ＦＫＢＰに緊密に結合し、それによってペプチドデグロンを置き換えるとともに、ＬＩＤ及び任意の融合パートナータンパク質（例えば、ＣＤ４７）の迅速な分解を誘導する。ＬＩＤシステムがＣＤ４７分解を促進する能力を評定するための研究の要約を提供する。（上）研究で使用されたＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤ発現カセットを含む発現構築物の概略図。この発現構築物は、ＬＩＤドメインをコードする核酸に融合されたヒトＣＤ４７遺伝子に作動可能に連結されたＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）を含む。（下）ｉＰＳＣにＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤ発現カセットまたは対照ＥＦＳ－ＣＤ４７発現カセットのいずれかを形質導入し、異なる濃度のシールド－１の存在下で２４時間、ＣＤ４７発現に関して評定した実験の要約。活性化された安全スイッチにより、結果として生じる低免疫因子をもはや発現しない細胞が免疫細胞によって認識されて、免疫系によって排除される、低免疫細胞の略図を提供する。Ａ～Ｄは、低免疫細胞が、細胞標的化（Ａ）、タンパク質制御（Ｂ）、ＲＮＡ制御（Ｃ）、及びＤＮＡ制御（Ｄ）を経て修飾された場合、低免疫を有するように操作され得ることを概略的に示す。タンパク質制御、ＲＮＡ制御、及びＤＮＡ制御は、誘導性であり得、それによって誘導性低免疫細胞を生成する。免疫抑制因子の発現が、制御された分解またはノックダウンによって制御されることを概略的に示す。例えば、Ｌｉａｎｇ，Ｑｉｎ，ｅｔａｌ．“Ｌｉｎｋｉｎｇａｃｅｌｌ－ｄｉｖｉｓｉｏｎｇｅｎｅａｎｄａｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅｔｏｄｅｆｉｎｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙｓａｆｅｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ５６３．７７３３（２０１８）：７０１を参照されたい。外因性ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡを内部にもつレンチウイルスベクターを、０．３超のＭＯＩで形質導入した細胞が、ＣＤ４７の効率的なノックダウンを示したことを示す。共依存性の安全スイッチ－低免疫分子構築物のアーキテクチャを図示する。安全スイッチ及び低免疫分子の共発現は、低免疫分子及び安全スイッチがＩＲＥＳ等のリボソームスキッピング配列、または２Ａ自己切断型ペプチドによって分離される、ポリシストロン性転写物の発現により得られる。カセットの発現は、ゲノム位置に依存しない転写制御のためのプロモーター、または標的組み込みに次ぐ内在性プロモーターによるペイロードの制御を可能にするためのスプライスアクセプターによって制御される。Ｂ２Ｍの破壊及び安全スイッチカセットの発現の同時発生のための、Ｂ２Ｍ遺伝子座内へのＣＤ４７－ＨＳＶｔｋ融合構築物の標的ゲノム組み込みを概略的に例示する。ＨＳＶｔｋ及びＣＤ４７は、ポリシストロン性カセット内でＰ２Ａ自己切断型ペプチドを介して遺伝子が連結されている。カセットの両側には、Ｂ２Ｍ遺伝子座に相補的な相同性アームが位置することにより、Ｃａｓ９誘導ＨＤＲを介してカセットが組み込まれることが可能となる。必須遺伝子と合成必須遺伝子－安全スイッチ融合体との置き換えを概略的に示す。安全スイッチの発現を必須遺伝子のそれに連結することにより、生細胞内でのスイッチの発現が確実となる。内在性の必須遺伝子座の遺伝子産物に依存することなく必須遺伝子の発現を安全スイッチに直接連結するために、必須遺伝子のｃＤＮＡ（「合成必須遺伝子（ＳｙｎＥｓｓｅｎｔｉａｌＧｅｎｅ）」）をカセット内に位置させ、安全スイッチに融合する。カセットの存在を必要とし、かつそれを適正な転写制御下に配置するために、カセットは、内在性プロモーターを利用するためのスプライスアクセプター２Ａ配列を内部にもち、必須遺伝子座への組み込みを容易にする当該遺伝子座に対する相同性アームを含有する。必須遺伝子座に標的化されたＣａｓ９－ｓｇＲＮＡを用意することによって、Ｃａｓ９誘導ＨＤＲは、当該遺伝子座の遺伝子産物の破壊及びカセットの組み込みの同時発生を可能にして、天然遺伝子を有効に置き換える。ＣＤ４７－ＡＤＣＣ／ＣＤＣアミノ末端依存性安全スイッチのアーキテクチャを概略的に示す。ＡＤＣＣ及びＣＤＣは、細胞の細胞外表面に結合した抗体を認識する免疫系エフェクター細胞を介して機能する。抗体が結合するエピトープの発現は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを活性化するのに十分であり、安全スイッチとしての役目を果たすことができる。エピトープをＣＤ４７等の低免疫分子に遺伝子融合することで、操作された低免疫細胞の排除に対する二重安全装置がコードされる。リツキシマブによって認識されるＣＤ２０断片等のペプチド性エピトープを、ＣＤ４７のような細胞外低免疫分子に連結することができる。具体的に述べると、ＣＤ２０エピトープをＣＤ４７にＮ末端で融合することは、ＣＤ４７機能を破壊することなくリツキシマブ結合のためにエピトープを立体的に利用可能にする。この同じ設計を、他の低免疫分子に適用することができる。内部ＣＤ２０エピトープを内部にもつＣＤ４７バリアントのアーキテクチャを概略的に示す。ＣＤ２０エピトープをＩｇＶドメインの下流でＣＤ４７に直接挿入して、エピトープをＩｇＶドメインと膜貫通型ドメインの新生との間に配置することができる。ＩｇＶドメインの下流でのＣＤ２０エピトープの下流での配置は、ＩｇＶの四次構造を無傷にする。シトシンデアミナーゼ（ｄｅｍａｎｉｓｅ）スイッチが免疫系依存的様態で細胞死を誘導する能力を評定するための研究の要約を提供する。（上）研究で使用されたＥＦＳ－シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）－ＣＤ４７バイシストロン性カセットの概略図。このカセットにおいて、ＣＤをコードする核酸は、ＣＤ４７をコードする核酸の上流に位置する。２Ａ配列をＣＤ核酸とＣＤ４７核酸との間に挿入して、これら２つのタンパク質が翻訳後に別々であることを確実にする。これら２つのタンパク質の発現のために、ＥＦＳプロモーターをカセットにさらに含める。（中央のチャート）ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞及びＥＦＳ－ＣＤを形質導入された細胞（「ＣＤ」；自殺遺伝子のみ、ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞に対する対照）の、様々な濃度の５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）の存在下での生存能を示すチャート。（下チャート）ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞及びＣＤ細胞におけるＣＤ４７発現をフローサイトメトリーによって比較する。安全スイッチまたは必須細胞因子分子をそれぞれ、または組み合わせたペイロードとしてコードする、ＤＮＡカセットの構成要素及びアーキテクチャを図示する概略図である。一部の実施形態では、ペイロードは、必須細胞因子に連結された安全スイッチを指す。安全スイッチ及び必須細胞因子のｃＤＮＡを内部にもつ異種遺伝子は、いくつかの構成要素、すなわち、遍在性プロモーターまたはスプライスアクセプター等の転写制御配列、安全スイッチまたは必須細胞因子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ポリアデニル化配列、及び必須遺伝子またはペイロードのアミノまたはカルボキシ末端における転写後または翻訳後制御エレメントを含有する。とりわけ、制御エレメントの例は、翻訳の制御のためのリボスイッチ、またはペイロードとの融合タンパク質として存在する化学的に不安定化可能なデグロンモチーフであり得る。共依存性の安全スイッチ－必須細胞因子構築物のアーキテクチャを例示する概略図である。安全スイッチ及び必須細胞因子分子の共発現は、必須細胞因子及び安全スイッチがＩＲＥＳ等のリボソームスキッピング配列、または２Ａ自己切断型ペプチドによって分離される、ポリシストロン性転写物の発現により得られる。カセットの発現は、ゲノム位置に依存しない転写制御のためのプロモーター、または標的組み込みに次ぐ内在性プロモーターによるペイロードの制御を可能にするためのスプライスアクセプターによって制御される。スイッチ発現を安全に保つための内在性の必須遺伝子座内への安全スイッチの組み込み、すなわち、標的化後の遺伝子座の構成を例示する概略図である。安全スイッチは、安全スイッチの発現を確実にするために、リボソームまたはプロテアソーム遺伝子等の必須遺伝子のＣ末端にて組み込まれる。安全スイッチ及び必須遺伝子タンパク質産物の適正な分離を可能にするために、スイッチの上流は、ｉＲＥＳまたは２Ａをコードするリンカー配列である。終止コドンは、安全スイッチの下流に移動させられる。セーフハーバー遺伝子座内への安全スイッチ及び必須遺伝子の共発現のためのペイロード（例えば、安全スイッチ及び必須遺伝子）の標的組み込みを例示する概略図である。上述したような安全スイッチペイロードをコードするドナーＤＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体等の標的ヌクレアーゼ活性を介して、ＡＡＶＳ１等のセーフハーバー遺伝子座内に組み込まれる。組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）を介して起こる。一部の実施形態では、必須遺伝子は、その内在性遺伝子座においてノックアウトされる。免疫関連の遺伝子座の破壊及び必須細胞因子または安全スイッチの挿入の同時発生を例示する概略図である。Ｂ２Ｍ等の免疫関連の遺伝子座の破壊は、安全スイッチをコードするカセットまたは必須細胞因子カセットを組み込むＣａｓ９誘導ＨＤＲを介して起こる。カセットの組み込みは、内在性遺伝子産物をフレーム外にし、カセットの発現をもたらす。カセットの発現は、カセット内のプロモーターによって、またはスプライスアクセプター２Ａ配列の利用により内在性プロモーターを介して付与される。必須遺伝子のカルボキシ末端への安全スイッチまたは必須細胞因子カセットの組み込みを例示する概略図である。図３に記載されるように、必須細胞因子に連結された安全スイッチをコードするカセットは、外因性ＤＮＡを必須遺伝子のカルボキシ末端での挿入に向けて標的化する２つの相同性アームを含有するように構築される。組み込みは、Ｃａｓ９誘導ＤＮＡ修復によって媒介されるＨＤＲを介して起こる。安全スイッチまたは必須細胞因子の標的化された相同性非依存性の組み込みを例示する概略図である。相同性アームを欠いた安全スイッチ及び必須細胞因子ペイロードをコードするドナーＤＮＡは、相同性非依存性のＤＮＡ修復プロセスを介した組み込みを容易にする、レンチウイルスゲノムまたはトランスポゾンとしてパッケージされる。外因性ＤＮＡのライゲーションは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼ標的配列にて起こり、カセットの発現は、スプライスアクセプター２Ａ配列を使用して内在性プロモーターによって制御される。ヌクレアーゼ活性を介した必須遺伝子座の標的遺伝子破壊を例示する概略図である。タンパク質産物の適正な転写または翻訳を妨害するフレームシフト変異の導入を容易にするために、Ｃａｓ９等のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＰＳＭＡ３遺伝子座、または目的の別の遺伝子座に標的化される。一部の実施形態では（安全スイッチ及び共発現構築物の、セーフハーバー遺伝子座、免疫シグナル伝達遺伝子座への送達、またはレンチウイルス組み込みを使用した送達等、このスイッチの機能は、操作された細胞の生存がセーフハーバー遺伝子座からの必須遺伝子の発現に依存するように、内在性遺伝子座における必須遺伝子の全てのコピーの不活性化を必要とする。下パネルは、ＣＲＩＳＰＲを使用して二本鎖切断を導入する、内在性遺伝子座の不活性化のための戦略を図示する。ＮＨＥＪまたはＭＭＥＪによるこれらの切断の修復は、内在性遺伝子座における必須遺伝子を不活性化する挿入または欠失につながる。必須遺伝子のアミノまたはカルボキシ末端における転写後または翻訳後制御エレメントの組み込みを例示する概略図である。この構築物は、必須遺伝子の発現に対する外因性制御を提供することによって安全スイッチとして作用する。

Ｉ．序論
免疫レギュレータータンパク質を発現するとともに宿主免疫系による拒絶反応を回避するように操作された、低免疫多能性幹細胞（本明細書で「ＨＩＰ細胞」とも称される）及びその分化細胞は、同種他家細胞療法に対して大きな有望性をもつ。レシピエント対象への投与に際してかかる細胞の活性を調節するための安全スイッチの導入は、これらの細胞療法の安全性を改善するための重要な技術である。操作された細胞における免疫抑制因子（例えば、低免疫因子）の発現の制御に基づく安全スイッチの実施形態が本明細書に記載される。免疫抑制因子の発現をタンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルのいずれかで制御し、それによって細胞に対する安全スイッチ（例えば、条件付きまたは誘導性発現システム）として機能する方法が本明細書で提供される。また、低分子または生物学的薬剤等の外因性シグナルに応答性である免疫抑制因子の条件付き発現のための修飾を含む、多能性幹細胞及びその誘導体も提供される。

ＨＩＰ細胞の主要な特徴は、移植された細胞集団に対する宿主細胞の免疫応答を抑制するように機能する、それらの免疫抑制因子の発現である。一実施形態では、この安全スイッチは、ＣＤ４７の制御可能な発現に基づく。ＣＤ４７は、マクロファージによる食作用を遮断するために自然免疫系の一部として「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔｅａｔｍｅ）」シグナルとして機能する、自然免疫系の構成要素である。他の実施形態では、この安全スイッチ。

任意の移植可能な細胞種のための実用可能な供給源を代表する、条件付きまたは誘導性低免疫原性細胞（例えば、条件付き低免疫原性多能性細胞）が本明細書で提供される。かかる細胞は、１つまたは複数の免疫原性因子の条件付き発現を用いて、レシピエント対象への投与に際して適応免疫及び自然免疫による拒絶反応から保護される。かかる免疫原性因子の発現は、条件付き発現システムの活性によって制御される。条件付き発現システムの非限定的な例としては、誘導性タンパク質分解システム、誘導性ＲＮＡ制御システム、及び誘導性ＤＮＡ制御システムが挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導前に自然免疫細胞による拒絶反応の対象とならない。一部の事例では、低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導前にＮＫ細胞媒介性溶解に感受性がない。一部の事例では、低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導前にマクロファージの貪食に感受性がない。一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導時に自然免疫細胞による拒絶反応の対象となる。一部の事例では、低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導時にＮＫ細胞媒介性溶解に感受性がある。一部の事例では、低免疫原性細胞は、条件付き発現システムの誘導時にマクロファージの貪食に感受性がない。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、免疫抑制剤をほとんどから全く必要とすることなくレシピエント対象に移植される、普遍的に適合性の細胞または組織（例えば、普遍的ドナー細胞または組織）の供給源として有用である。かかる低免疫原性細胞は、移植時に細胞特異的特性及び特徴を保持する。

一部の実施形態では、ＭＨＣ不適合の同種他家レシピエントにおいて免疫拒絶反応を条件付きで回避する、幹細胞及び／またはその分化した誘導体が本明細書で提供される。一部の事例では、本明細書に概説される幹細胞から生産される分化細胞は、ＭＨＣ不適合の同種他家レシピエントに投与された（例えば、移植された（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）または移植された（ｇｒａｆｔｅｄ））ときに免疫拒絶反応を条件付きで回避する。換言すれば、幹細胞及び／またはかかる幹細胞に由来する分化細胞は、該細胞によって発現される外因性免疫原性因子を標的とする条件付き発現システムの活性を制御する外因性因子の不在下で低免疫原性である。外因性因子の存在下では、外因性免疫原性因子は、条件付き発現システムに従って下方制御または分解される。かくして、幹細胞及び／またはかかる幹細胞に由来する分化細胞は、もはや低免疫原性でなくなる。場合によっては、該細胞は、野生型または操作されていない細胞と比較して低減された免疫原性（少なくとも２．５％～９９％低い免疫原性等）を有しない。場合によっては、該細胞は、免疫原性を有する。換言すれば、かかる細胞は、レシピエント対象にとって免疫原性となり、故に、レシピエント対象の免疫系によって排除され、及び／または細胞死の標的となる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の幹細胞は、多能性幹細胞の潜在能力及び分化能力を保持する。

ＩＩ．定義
本明細書で使用される「安全スイッチ」という用語は、下方制御または上方制御されたときに、例えば、宿主の免疫系による認識を通して、細胞の排除または死を引き起こす、目的の遺伝子またはタンパク質の発現を制御するためのシステムを指す。安全スイッチは、有害臨床事象の際に外因性分子によって発動されるように設計することができる。安全スイッチは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質レベルで発現を制御することによって操作することができる。安全スイッチには、有害事象に応答して細胞活性の制御を可能にするタンパク質または分子が含まれる。一実施形態では、安全スイッチは、不活性状態で発現される「殺傷スイッチ」であり、外部から提供される選択的な薬剤によるスイッチの活性化時に、安全スイッチを発現している細胞にとって致死的である。一実施形態では、安全スイッチ遺伝子は、構築物における目的の遺伝子に対してシス作用型である。安全スイッチの活性化は、細胞にそれ自体のみ、またはそれ自体及び隣接する細胞をアポトーシスまたは壊死により殺傷させる。

本明細書で細胞を特徴付けるために使用されるとき、「低免疫原性」という用語は、一般に、かかる細胞が、かかる細胞を移植される対象による免疫拒絶反応を受けにくいことを意味する。例えば、未改変または未修飾の野生型細胞と比べて、かかる低免疫原性細胞は、かかる細胞を移植される対象による免疫拒絶反応を約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、またはそれを超えて、受けにくい可能性がある。一部の態様では、ゲノム編集技術を使用して、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ遺伝子の発現が調節され、ひいては低免疫原性細胞が生成される。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ不適合の同種他家レシピエントにおいて免疫拒絶反応を回避する。一部の事例では、本明細書に概説される低免疫原性幹細胞から生産される分化細胞は、ＭＨＣ不適合の同種他家レシピエントに投与された（例えば、移植された（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）または移植された（ｇｒａｆｔｅｄ））ときに免疫拒絶反応を回避する。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性の適応免疫による拒絶反応及び／または自然免疫細胞による拒絶反応から保護される。

細胞の低免疫原性は、細胞が適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力等の細胞の免疫原性を評価することによって決定することができる。かかる免疫応答は、当業者に認識されるアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態では、免疫応答アッセイは、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞殺傷、ＮＫ細胞増殖、ＮＫ細胞活性化、及びマクロファージ活性に対する低免疫原性細胞の効果を測定する。場合によっては、低免疫原性細胞及びその誘導体は、対象に投与されるとＴ細胞及び／またはＮＫ細胞による殺傷の減少を経る。一部の事例では、該細胞及びその誘導体は、未修飾または野生型細胞と比較してマクロファージの貪食の減少を示す。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、対応する未修飾の野生型細胞と比較してレシピエント対象において免疫応答の低減または減弱を誘発する。一部の実施形態では、低免疫原性細胞は、レシピエント対象において非免疫原性であるか、または免疫応答を誘発しない。

本明細書で使用される「必須細胞因子」という用語は、細胞生存及び／または細胞増殖に必要であるタンパク質または分子を指す。必須細胞因子または必須遺伝子の追加の説明は、例えば、Ｋａｂｉｒｅｔａｌ．，ＰｌｏＳＯｎｅ，２０１７，１２，５ｅ０１７８２７３、Ｈａｒｔｅｔａｌ．，Ｇ３，２０１７，７，２７１９－２７２７、Ｍａｉｒｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２０１９，２７，５９９－６１５、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，３５０（６２６４），１０９６－１１０１、Ｙｉｌｍａｚｅｔａｌ．，ＮａｔＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１８，２０，６１０－６１９、Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ａｇｉｎｇ，２０１９，１１（１２）：４０１１－４０３１、Ｉｈｒｙｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，２０１９，２７，６１６－６３０、Ｂｅｒｔｏｍｅｕｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１８，３８（１）：ｅ００３０２－１７、及びＨａｒｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３，１５１５－１５２６に見出すことができる。

本明細書で使用される「免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）因子」または「免疫制御（ｉｍｍｕｎｅｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）因子」とは、低免疫因子を含み、場合によっては、補体インヒビターもまた含む。本明細書で使用されるとき、「免疫抑制因子」及び「低免疫因子」という用語は、互換的に使用される。

本明細書で使用される「免疫シグナル伝達因子」とは、場合によっては、免疫シグナル伝達経路を活性化する分子、タンパク質、ペプチド等を指す。

本明細書で使用される「誘導性発現システム」とは、リガンド、低分子、ペプチド、因子、薬剤等によって制御または誘導され得る遺伝子発現を指す。場合によっては、条件付き遺伝子発現システムは、リガンド、低分子、ペプチド、因子、薬剤等の存在下で転写をオンにするか、またはオフにすることができる。場合によっては、条件付き遺伝子発現システムは、リガンド、低分子、ペプチド、因子、薬剤等の存在に応答してタンパク質分解経路を活性化することができる。

本明細書で使用される「デグロンエレメント」とは、タンパク質の分解を制御するタンパク質のサブユニットを指す。一部の事例では、デグロンは、ポリペプチドを細胞分解に導く分解シグナルを提供するアミノ酸の配列を含む。デグロンは、プロテアソーム経路またはオートファジー－リソソーム経路のいずれかを介して、結合したポリペプチドの分解を促進し得る。融合タンパク質において、デグロンは、目的のポリペプチドに作動可能に連結されなければならないが、デグロンが目的のポリペプチドの分解を導くように依然として機能する限り、それと連続している必要はない。好ましくは、デグロンは、目的のポリペプチドの迅速な分解を誘導する。タンパク質分解におけるデグロン及びそれらの機能の考察については、例えば、Ｋａｎｅｍａｋｉｅｔａｌ．（２０１３）ＰｆｌｕｇｅｒｓＡｒｃｈ．４６５（３）：４１９－４２５、Ｅｒａｌｅｓｅｔａｌ．（２０１４）ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１８４３（１）：２１６－２２１、Ｓｃｈｒａｄｅｒｅｔａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：８１５－８２２、Ｒａｖｉｄｅｔａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（９）：６７９－６９０、Ｔａｓａｋｉｅｔａｌ．（２００７）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ．３２（１１）：５２０－５２８、Ｍｅｉｎｎｅｌｅｔａｌ．（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８７（７）：８３９－８５１、Ｋｉｍｅｔａｌ．（２０１３）Ａｕｔｏｐｈａｇｙ９（７）：１１００－１１０３，Ｖａｒｓｈａｙｓｋｙ（２０１２）ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．８３２：１－１１、及びＦａｙａｄａｔｅｔａｌ．（２００３）ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ．１４（３）：１２６８－１２７８を参照されたく、これらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

本明細書で使用される「セーフハーバー遺伝子座」とは、導入遺伝子または外因性遺伝子の安全な発現を可能にする遺伝子座を指す。例となる「セーフハーバー」遺伝子座には、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒｌ２Ｃ（別名、ＡＡＶＳ１）遺伝子、アルブミン遺伝子、及びＲｏｓａ遺伝子が含まれる。

「外因性」分子とは、細胞内に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入され得る分子、構築物、因子等である。「細胞内での通常の存在」は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に対して決定される。故に、例えば、ニューロンの胚発生中にのみ存在する分子は、成体ニューロン細胞に対して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内在性分子の機能バージョン、または正常に機能している内在性分子の機能不全バージョンを含み得る。

外因性分子または因子は、とりわけ、例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成される低分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類等の高分子、上記の分子の任意の修飾された誘導体、または上記の分子のうちの１つもしくは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖状、分岐状、または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができる核酸、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、及びヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。

外因性分子または構築物は、内在性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。かかる事例では、外因性分子は、細胞内の内在性分子の濃度よりも高い濃度で細胞に導入される。一部の事例では、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または細胞内に通常は存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、これには脂質媒介性移入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、及びウイルスベクター媒介性移入が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の目的において、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域（かかる制御配列がコード配列及び／または転写された配列に隣接するか否かにかかわらず）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集等のプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。調節はまた、完全であってもよく（すなわち、遺伝子発現が完全に不活性化されるか、または野生型のレベル以上まで活性化される）、またはそれは部分的であってもよい（遺伝子発現が部分的に低減されるか、または野生型のレベルの何らかの割合まで部分的に活性化される）。

「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並置に関して互換的に使用され、これらの構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぼす機能を媒介し得るという可能性を許容するように配置される。例示説明として、プロモーター等の転写制御配列は、その転写制御配列が１つまたは複数の転写制御因子の存否に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に作動的に連結されている。転写制御配列は、一般に、シスでコード配列と作動的に連結されるが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に、それらが連続していない場合であっても、作動的に連結されている転写制御配列である。

「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子移入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を導くことができ、遺伝子配列を標的細胞に移入し得る、任意の核酸構築物を意味する。故に、この用語は、クローニング、及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。ベクターまたは構築物を細胞に導入するための方法は、当業者に既知であり、これには脂質媒介性移入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入、及びウイルスベクター媒介性移入が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、内胚葉（例えば、胃壁、消化管、肺等）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器系組織等）、または外胚葉（例えば、上皮組織及び神経系組織）の３種の胚葉のうちのいずれかへと分化する潜在能力を有する。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語はまた、非多能性細胞に由来する多能性幹細胞の一種である「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」も包含する。親細胞の例としては、種々の手段によって多能性で未分化の表現型を誘導するように再プログラミングされた体細胞が挙げられる。かかる「ｉＰＳ」または「ｉＰＳＣ」細胞は、ある特定の制御遺伝子の発現を誘導することによって、またはある特定のタンパク質の外因性の適用によって作出することができる。ｉＰＳ細胞の誘導のための方法は、当該技術分野で既知であり、下記にさらに記載される（例えば、Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）、Ｈｕａｎｇｆｕｅｔａｌ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）、Ｗｏｌｔｊｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）、及びＺｈｏｕｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ８：３８１－３８４（２００９）を参照されたく、同文献の各々は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成は、下記に概説される。本明細書で使用されるとき、「ｈｉＰＳＣ」とは、ヒト人工多能性幹細胞である。

「ＨＬＡ」または「ヒト白血球抗原」複合体とは、ヒトにおいて主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の制御を担う。ヒトにおいては、クラスＩ及びクラスＩＩの２種のＭＨＣ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」が存在する。ＨＬＡ－Ｉには、細胞の内側からペプチドを提示するＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの３種のタンパク質が含まれ、ＨＬＡ－Ｉ複合体によって提示される抗原が、キラーＴ細胞（別名、ＣＤ８＋Ｔ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞）を引き付ける。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）に会合している。ＨＬＡ－ＩＩには、細胞の外側から抗原をＴリンパ球に提示するＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲの５種のタンパク質が含まれる。これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞（別名、ヘルパーＴ細胞）を刺激する。「ＭＨＣ」または「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）またはマウス（ＭＨＣ）のどちらに由来するかに依存するため、限定することは意図されないことを理解されたい。故に、それが哺乳類細胞に関するとき、これらの用語は、本明細書で互換的に使用され得る。

単離された細胞に適用される「処置する」、「処置すること」、「処置」等という用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供するか、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実施することを含む。対象に適用されるとき、これらの用語は、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、Ｂ２Ｍ）が本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで改変された細胞または細胞集団を、個体に投与することを指す。個体は、通常、病気であるか、もしくは損傷しているか、または集団の平均成員と比べて病気になる増加したリスクがあり、かかる手当て、介護、または管理を必要とする。

本明細書で使用されるとき、「処置すること」及び「処置」という用語は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、標的ポリヌクレオチド配列が本明細書に記載の方法に従ってエクスビボで改変された有効量の細胞を対象に投与することを指す。本技術の目的において、有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分的か完全かにかかわらず）が含まれるが、これらに限定されない。処置することは、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを指し得る。故に、当業者は、処置が病状を改善し得るが、疾患に対する完全な治療法ではない場合があることを認識している。本明細書で使用されるとき、「処置」という用語は、予防を含む。代替として、処置は、疾患の進行が低減または停止する場合、「有効」である。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味し得る。処置を必要とする者には、ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害であると既に診断された者、ならびに遺伝的感受性または他の因子に起因してかかる障害を発症する可能性がある者が含まれる。

疾患または障害の「処置」または「予防」とは、かかる疾患または障害の発症を遅延または予防するか、かかる疾患または障害に関連する病態の進行、悪化（ａｇｇｒａｖａｔｉｏｎ）または悪化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）、その重症度の進行を逆戻りさせるか、緩和するか、改善させるか、阻害するか、減速させるか、または停止することを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。

本明細書で使用されるとき、「投与すること」、「導入すること」、及び「移植すること」という用語は、導入された細胞の所望の部位での少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、細胞、例えば、本技術の方法に従って改変された標的ポリヌクレオチド配列を含む本明細書に記載の細胞の、対象内への配置の文脈において互換的に使用される。細胞は、対象内の所望の部位に直接埋め込まれ得るか、または代替として、所望の箇所への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、ここで、埋め込まれた細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部分は、生存したままである。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、２４時間ほどの短期間から、数日、数年ほどの長期間であり得る。一部の事例では、細胞はまた、例えば、埋め込まれた細胞を埋め込み箇所に維持するとともに、埋め込まれた細胞の移動を回避するためにカプセル中で、肝臓内または皮下等の、所望の部位以外の箇所に投与することもできる。

追加のまたは代替の態様では、本技術は、当業者に利用可能な任意の様態で、例えば、ＴＡＬＥＮシステムを利用して、標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａ）及びＴＡＬＥＮを利用した方法の例が本明細書に詳述されているが、本技術は、これらの方法／システムの使用に限定されないことを理解されたい。標的細胞における発現を低減または消失させるために、例えばＢ２Ｍを標的化する、当業者に既知の他の方法を本明細書で利用することができる。

本明細書に概説される方法を使用して、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。本技術は、任意の目的で細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。一部の実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、変異細胞を生産するように改変される。本明細書で使用されるとき、「変異細胞」とは、結果として生じる遺伝型がその元の遺伝型とは異なる細胞を指す。一部の事例では、「変異細胞」は、例えば、正常に機能している遺伝子が本技術のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して改変される場合、変異表現型を示す。他の事例では、「変異細胞」は、例えば、本技術のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して変異遺伝型が補正される場合、野生型表現型を示す。一部の実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を補正または修復するように（例えば、細胞に正常な表現型を取り戻すように）改変される。一部の実施形態では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列は、遺伝子変異を誘導するように（例えば、遺伝子またはゲノムエレメントの機能を破壊するように）改変される。

一部の実施形態では、改変は、インデルである。本明細書で使用されるとき、「インデル」とは、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせからもたらされる変異を指す。当業者には理解されようが、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすことになる。一部の実施形態では、改変は、点変異である。本明細書で使用されるとき、「点変異」とは、ヌクレオチドのうちの１つを置き換える置換を指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、標的ポリヌクレオチド配列において任意の長さのインデルまたは点変異を誘導することができる。

本明細書で使用されるとき、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げる方式で、標的ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分を欠失させることを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列におけるインデルを誘導することにより標的ポリヌクレオチド配列を改変することによって、達成され得る。当業者であれば、本明細書に記載の詳細に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをどのように使用して、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分をノックアウトするかについて容易に理解しよう。

一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分のノックアウトをもたらす。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した標的ポリヌクレオチド配列またはその一部分のノックアウトは、様々な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトを研究目的のためにインビトロで実施することができる。エクスビボ目的では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、（例えば、細胞における変異アレルをエクスビボでノックアウトし、ノックアウトされた変異アレルを含むそれらの細胞を対象に導入することによって）標的ポリヌクレオチド配列の発現に関連する障害を処置または予防するのに有用であり得る。

本明細書における「ノックイン」とは、遺伝子機能を宿主細胞に付加するプロセスを意味する。これは、一部の実施形態では、ノックインされた遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはコードされたタンパク質のレベルの増加または減少を引き起こす。当業者には理解されようが、これは、遺伝子の１つもしくは複数の追加のコピーを宿主細胞に付加すること、または内在性遺伝子の制御構成要素を改変することにより、作製されるタンパク質の発現を増加させることを含めた、いくつかの方式で遂行することができる。これは、プロモーターを修飾すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を修飾することによって遂行されてもよい。

一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチド配列の発現の低減をもたらす。「減少する」、「低減された」、「低減」、及び「減少」という用語は全て、統計学的に有意な量の減少を一般に意味するように本明細書で使用される。しかしながら、疑義を回避するために、「減少する」、「低減された」、「低減」、「減少」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の減少、または最大１００％かつこれを含む減少（すなわち、参照試料と比較して不在のレベル）、または１０～１００％の任意の減少を意味する。

「増加した」、「増加」、または「強化する」もしくは「活性化する」という用語は全て、本明細書で統計学的に有意な量の増加を一般に意味するように使用される。疑義を回避するために、「増加した」、「増加」、または「強化する」もしくは「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加、または最大１００％かつこれを含む増加、または１０～１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍もしくはそれを超える任意の増加を意味する。

本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、指示対象の分子または指示対象のポリペプチドが目的の細胞に導入されることを意味することが意図される。ポリペプチドは、例えば、コーディング核酸を、染色体内への組み込みによって、またはプラスミドもしくは発現ベクター等の非染色体遺伝物質として等で、細胞の遺伝物質に導入することによって導入され得る。したがって、この用語は、コーディング核酸の発現に関して使用されるとき、発現可能な形態でのコーディング核酸の細胞への導入を指す。

「内在性」という用語は、細胞内に存在する指示対象の分子またはポリペプチドを指す。同様に、コーディング核酸の発現に関して使用される場合のこの用語は、細胞内に含まれる、外因的に導入されたのではないコーディング核酸の発現を指す。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一性」パーセントという用語は、下記に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用してまたは目視検査によって測定したとき、最大限に対応するように比較及びアライメントした場合に同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較されている配列のある領域にわたって、例えば、機能的ドメインにわたって存在し得るか、または代替として、比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のために、典型的には、一方の配列は、試験配列の比較対象となる参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを算出する。

比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実施することができる（全般的にはＡｕｓｕｂｅｌら（下記）を参照されたい）。

配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して一般に利用可能である。

「対象」及び「個体」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞を得ることができる及び／または本明細書に記載されるような細胞による処置（予防的処置を含む）が提供される、動物、例えば、ヒトを指す。ヒト対象等の特定の動物に特有である感染症、病態、または病状の処置の場合、対象という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される「非ヒト動物」及び「非ヒト哺乳動物」は、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類等の哺乳動物を含む。「対象」という用語はまた、哺乳動物、爬虫類、両生類、及び魚類を含むがこれらに限定されない、任意の脊椎動物も包含する。しかしながら、有利には、対象は、ヒト等の哺乳動物、または、例えば、イヌ、ネコ、ウマ等の飼育哺乳動物、もしくは、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ等の生産哺乳動物等の他の哺乳動物である。

特許請求の範囲は、いずれの任意選択的な要素も除外するように起草され得ることに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」等のような排他的な専門用語の使用のため、または「否定的な」制限の使用のための先行詞として役立つよう意図される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態の各々は、本技術の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離されるか、またはそれと組み合わされる別々の構成要素及び特徴を有する。いずれの列挙される方法も、列挙される事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で実施され得る。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意の方法及び材料が、本技術の実施または試験においても使用され得るが、代表的な例示的方法及び材料が次に記載される。

本技術に記載されるとき、以下の用語を用いることになり、これらは下記に示されるように定義される。

本技術をさらに説明する前に、本技術が記載される特定の実施形態に限定されず、かくして当然のことながら、様々であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本技術の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。値の範囲が提供される場合、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本技術内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的に除外される限界値を条件として、本技術内に包含されてもよい。表示範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の片方または両方を除外する範囲もまた、本技術に含まれる。ある特定の範囲は、本明細書で、数値の前に「約」という用語を付けて提示される。「約」という用語は、それが前に付く数そのもの、ならびにこの用語が前に付く数に近いまたはそれに近似する数に文字通りの支持を提供するように本明細書で使用される。ある数が具体的に列挙される数に近いまたはそれに近似するかどうかを決定する際、その近いまたは近似する列挙されていない数は、提示される文脈において、具体的に列挙される数の実質的な同等値を提供する数であり得る。

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により援用されることが明確かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に援用される。さらに、引用される各刊行物、特許、または特許出願は、それらの刊行物が関連して引用される発明の主題を開示及び説明するために、参照により本明細書に援用される。いずれの刊行物の引用も、出願日より前のその開示のためのものであり、本明細書に記載の本技術が、先行技術に基づいてかかる刊行物に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行物の日付とは異なる場合があり、独立して確認する必要があり得る。

ＩＩＩ．発明を実施するための形態
Ａ．条件付きＨＩＰ細胞、及び免疫抑制因子の条件付き下方制御のための方法
安全スイッチの導入は、低免疫原性細胞（ＨＩＰ細胞）を使用して開発された細胞療法の安全性を改善する。本明細書に記載のＨＩＰ細胞の特徴は、１つまたは複数の免疫制御（免疫抑制）因子の誘導性発現である。一部の実施形態では、免疫抑制因子（本明細書で「低免疫因子」とも称される）には、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、免疫抑制因子は、ＣＤ４７である。免疫抑制因子の制御可能な発現または誘導性発現は、移植された低免疫原性細胞に対するレシピエント対象による免疫応答を制御するように機能する。

免疫制御タンパク質の発現を制御された様態で「オフにする」ための機構を必要とする、免疫抑制因子の発現のための方法が本明細書に記載される。また、１つまたは複数の免疫抑制因子の制御可能な発現をもつＨＩＰ細胞も記載される。場合によっては、細胞は、１つまたは複数の免疫抑制因子を過剰発現しており、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現を下方制御するように誘導され得る。かくして、細胞は、もはや低免疫原性でなく、細胞死に向けてレシピエントの免疫細胞によって認識される。

一部の実施形態では、レシピエント対象に導入される細胞の低免疫は、低免疫因子及び補体インヒビターを含む免疫抑制分子の過剰発現と、それに伴うＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遺伝子座の抑制または遺伝子破壊を介して達成される。これらの修飾は、細胞を、感染細胞、悪性細胞、または非自己細胞の排除を担うＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ等のレシピエント免疫系のエフェクター細胞から覆い隠す（ｃｌｏａｋ）。免疫系からの細胞の覆い隠しは、体内での同種他家細胞の存在及び存続を許容する。身体からの操作された細胞の制御された除去は、患者の安全に必要不可欠であり、免疫系からの細胞の覆いの除去（ｕｎｃｌｏａｋｉｎｇ）によって達成され得る。覆いの除去は、安全スイッチとしての役目を果たし、免疫抑制分子の下方制御または免疫シグナル伝達分子の上方制御を介して達成され得る。記載される免疫抑制分子のうちのいずれかの発現レベルは、細胞においてタンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、またはＤＮＡレベルで制御され得る。同様に、記載される免疫シグナル伝達分子のうちのいずれかの発現レベルは、細胞においてタンパク質レベル、ｍＲＮＡレベル、またはＤＮＡレベルで制御され得る。

一部の実施形態では、記載される安全スイッチ法（例えば、タンパク質レベル、ＲＮＡレベル、及びＤＮＡレベルの安全スイッチ）のうちのいずれかを使用して、細胞における免疫抑制因子のレベルが、より低レベルの免疫抑制因子が閾値レベルよりも低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、細胞における免疫抑制因子のレベルは、発現の閾値レベルよりも約１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１倍、または０．５倍低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、細胞における免疫抑制因子のレベルは、発現の閾値レベルよりも約１０倍～５倍、１０倍～３倍、９倍～１倍、８倍～１倍、７倍～０．５倍、６倍～１倍、５倍～０．５倍、４倍～０．５倍、３倍～０．５倍、２倍～０．５倍、または１倍～０．５倍低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、免疫抑制因子の発現の閾値レベルは、人工多能性幹細胞におけるかかる因子の発現に基づいて確立される。一部の実施形態では、免疫抑制因子発現の閾値レベルは、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩノックアウト細胞またはＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩ／ＴＣＲノックアウト細胞等の対応する低免疫細胞における免疫抑制因子の発現レベルに基づいて確立される。

１．タンパク質レベルの制御
一部の実施形態では、免疫抑制タンパク質の制御分解は、デグロンを免疫抑制因子のアミノ酸配列に組み込み、これにより内在性タンパク質の代謝回転機構への動員を可能にすることによって確立される。標的タンパク質分解のための機構には、ユビキチン化及びその後のプロテアソーム分解のためのＥ３リガーゼへの動員、プロテアソームへの直接動員、ならびにリソソームへの動員が含まれるが、これらに限定されない。

誘導性デグロンモチーフと免疫抑制分子との融合は、低分子の添加または除去により、デグロン、ひいては免疫抑制分子を安定化または不安定化することを通して、分子の安定性に対する外因性制御を可能にする。

一部の実施形態では、デグロンによる誘導性タンパク質分解のための方法には、ＳＭＡＳＨタグを使用したリガンド誘導分解（ＬＩＤ）、シールド－１を使用したリガンド誘導分解、オーキシンを使用したリガンド誘導分解、ラパマイシンを使用したリガンド誘導分解、ペプチド性デグロン（例えば、ＩＫＺＦ３ベースのデグロン）、及びタンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。リガンド誘導分解法の一部の実施形態では、不活性な立体構造で保有されるが、限定されないがシールド－１分子等の特定の分子が結合するとプロテアソームによる認識が可能な立体構造をとるように誘導される、デグロンタグ。例えば、Ｒｏｔｈｅｔａｌ．，ＣｅｌｌｕｌａｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９，７６（１４），２７６１－２７７７を参照されたく、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。ＳＭＡＳＨデグロン技術の詳細な説明は、ＨａｎｎａｈａｎｄＺｈｏｕ，ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１５，１１：６３７－６３８及びＣｈｕｎｇｅｔａｌ．，ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１５，１１：７１３－７２０に見出すことができ、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。ＬＩＤデグロン技術の詳細な説明は、Ｂｏｎｇｅｒｅｔａｌ．，ＮａｔＣｈｅｍＢｉｏｌ，２０１１，７（８）：５３１－７に見出すことができ、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。

一部の態様では、単離された細胞を得ることと、免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された構成的プロモーターを含有する、構築物を導入することとによって、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の免疫原性を制御するための方法が提供される。一部の実施形態では、該構築物は、免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、柔軟なリンカーをコードする核酸配列に作動可能に連結されている誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された構成的プロモーターを含む。一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結されている、免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含む、該構築物。一部の実施形態では、該構築物は、誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結されている、柔軟なリンカーをコードする配列に連結されている、免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含む。かくして、デグロンは、該細胞をデグロンリガンドまたは分子に接触させた際に分解に向けて免疫抑制因子を標的化する。

一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメント等のリガンド誘導性デグロンエレメント；ペプチド性デグロンエレメント；ならびにペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される。有用な実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメントであり、免疫原性を制御するための外因性因子は、アスナプレビルである。一部の実施形態では、免疫抑制因子遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。多くの実施形態では、免疫抑制因子遺伝子は、ＣＤ４７である。一部の事例では、該構築物の構成的プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。一部の事例では、任意選択的な柔軟なリンカーは、（ＧＳＧ）_ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１）、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）からなる群から選択され、配列中、ｎは、１～１０である。一部の実施形態では、該構築物は、限定されないがＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座等のセーフハーバー遺伝子座内に組み込まれるように、細胞に導入される。一部の実施形態では、該構築物は、相同性指向組換えを経て、細胞におけるＡＡＶＳ遺伝子座に導入される。かくして、該構築物は、標的セーフハーバー遺伝子座に特異的な５’及び３’相同性アームを含む。一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する５’相同性アーム、外因性構成的プロモーター、誘導性デグロンエレメント、免疫抑制因子をコードする遺伝子、及びＡＡＶＳ１遺伝子座に対する３’相同性アームを含む。他の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＡＡＶＳ１遺伝子座に対する５’相同性アーム、外因性構成的プロモーター、誘導性デグロンエレメント、柔軟なリンカーをコードする配列、免疫抑制因子をコードする遺伝子、及びＡＡＶＳ１遺伝子座に対する３’相同性アームを含む。有用な実施形態では、操作された細胞は、免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列に作動可能に連結されている誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された構成的プロモーターを含む、外因性核酸配列を含む。操作された細胞は、免疫抑制因子に融合または連結された誘導性デグロンエレメントを発現する。一部の実施形態では、該細胞は、免疫抑制因子を分解するようにデグロンエレメントを活性化する、限定されないがリガンド、分子、ペプチド、または低分子等の因子または薬剤に接触させられる。

ペプチド性デグロンの一部の実施形態では、Ｅ３リガーゼへの低分子媒介性動員を付与するペプチドタグが使用される。一部の実施形態では、ペプチドタグは、Ｋｏｄｕｒｉｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，２０１９，１１６（７），２５３９－２５４４（同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるような、免疫調節薬（ＩＭｉＤ）依存的様態でＥ３リガーゼ受容体（ＣＲＢＮ）に動員されるリンパ系制限転写因子ＩＫＺＦ３を含む。ある特定の実施形態では、デグロンは、分解（例えば、ユビキチン化経路を介して）に向けて免疫抑制因子を標的化して、タンパク質分解を誘導するか、またはタンパク質を分解することができる。

一部の態様では、単離された細胞を得ることと、構成的プロモーター、誘導性ペプチド性デグロンエレメント、及び免疫抑制因子をコードする遺伝子を含む、構築物を導入することとによって、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の免疫原性を制御するための方法が提供される。一部の実施形態では、該構築物は、構成的プロモーター、誘導性ペプチド性デグロンエレメント、柔軟なリンカーをコードする核酸配列、及び免疫抑制因子をコードする遺伝子を含む。本明細書に記載の構成的プロモーター、免疫抑制因子、柔軟なリンカー、及び細胞のうちのいずれも、該方法に適用可能である。

ＰＲＯＴＡＣの一部の実施形態では、二機能性分子を使用して、免疫抑制因子が細胞のタンパク質分解機構に動員される。一部の実施形態では、二機能性分子は、二機能性分子に高い親和性で結合するドメインを発現している免疫抑制タンパク質または免疫抑制タンパク質の操作バージョンの天然または野生型配列に結合する。一部の実施形態では、二機能性分子は、低分子または生物学的薬剤（例えば、抗体またはその断片）を含む。例えば、Ｂｕｒｓｌｅｍｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０１８，２５，６７－７７及びＲｏｔｈｅｔａｌ．，ＣｅｌｌｕｌａｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９，７６（１４），２７６１－２７７７を参照されたく、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

二機能性抗体の一部の実施形態では、抗体は、免疫抑制因子及び第２の内在性受容体を標的とし、これにより内部移行及び分解を引き起こす。１つまたは複数の免疫抑制因子の制御可能な発現は、二機能性抗体（例えば、化学的に再プログラミングされた二機能性抗体）、デグロンによる誘導性タンパク質分解、誘導性ＲＮＡ制御、誘導性ＤＮＡ制御、及び誘導性発現法を用いて提供され得る。例えば、ＮａｔｓｕｍｅａｎｄＫａｎｅｍａｋｉ，ＡｎｎｕＲｅｖＧｅｎｅｔ，２０１７，５１，８２－１０２、ＢｕｒｓｌｅｍａｎｄＣｒｅｗｓ，ＣｈｅｍＲｅｖ，２０１７，１１７，１１２６９－１１３０１、Ｂａｎｉｋｅｔａｌ．，ＣｈｅｍＲｘｉｖ，２０１９を参照されたく、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。一部の実施形態では、免疫抑制因子を発現している細胞が、分解に向けて該細胞に結合する抗体に接触させられる。

一部の事例では、低免疫細胞は、細胞の細胞外表面上のエピトープに結合する抗体を添加することにより、免疫系によって利用可能となり、排除される。エピトープは、過剰発現した免疫抑制因子に対して天然であることもできるし、または免疫抑制因子内部に位置するもしくは細胞外表面に明確に位置する別のエピトープであることもできる。表面への抗体の結合は、細胞の覆いを除去し、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を引き起こす。

一部の実施形態では、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ安全スイッチエピトープは、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＣＲ４、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ならびにそれらの断片、誘導体、及びバリアントからなる群から選択される。一部の事例では、本明細書に記載の細胞のうちのいずれかは、ＥＧＦＲエピトープ、ＣＤ２０エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ３０エピトープ、またはＣＤ１６エピトープから選択されるエピトープを発現する。一部の実施形態では、該細胞は、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＣＲ４、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＣＤ３０、またはＣＤ１６に特異的な抗体に結合し、これがＡＤＣＣ／ＣＤＣを引き起こす。

本明細書に記載されるようなタンパク質レベルの安全スイッチを対象とする方法は、本明細書に記載の操作された細胞（例えば、低免疫細胞）において制御可能な様態で免疫抑制因子（例えば、ＣＤ４７）のレベルを減少させるための手段を提供する。本明細書に記載の安全スイッチ法のうちのいずれかを使用して、細胞におけるＣＤ４７等の免疫抑制因子のレベルを、閾値レベルよりも低くなるように低下させることによって、レシピエント対象の免疫系は、かかる細胞に対して免疫応答を開始することができる。一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７のレベルは、安全スイッチによって、発現の閾値レベルよりも約１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１倍、または０．５倍低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７のレベルは、発現の閾値レベルよりも約１０倍～５倍、１０倍～３倍、９倍～１倍、８倍～１倍、７倍～０．５倍、６倍～１倍、５倍～０．５倍、４倍～０．５倍、３倍～０．５倍、２倍～０．５倍、または１倍～０．５倍低くなるように減少させられる。一部の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、人工多能性幹細胞におけるＣＤ４７の外因性発現に基づいて確立される。他の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩノックアウト細胞またはＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩ／ＴＣＲノックアウト細胞等の対応する低免疫細胞におけるＣＤ４７の発現レベルに基づいて確立される。一部の事例では、ＣＤ４７のレベルは、限定されないがＳＭＡＳＨデグロンまたはＬＩＤデグロン等の、デグロンベースの安全スイッチを使用して低減される。一部の実施形態では、外因性ＣＤ４７導入遺伝子に連結されたＳＭＡＳＨデグロンを発現している細胞は、低分子アスナプレビル（デグロン誘導剤）に曝露され、それによって低分子アスナプレビルが、該細胞による外因性ＣＤ４７の発現の低減を誘導する。

２．ＲＮＡレベルの制御
免疫抑制因子は、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによって標的化され得、それによって該因子をコードする転写物の分解が引き起こされる。ｓｉＲＮＡは、外因的に提供されるか、または遺伝子にコードされて、阻害性ＲＮＡの転写に対する制御を提供することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、免疫抑制因子の転写物にアニーリングして、ＲＩＳＣ複合体による分解をもたらすことができる。

一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡ制御により免疫抑制因子の発現を下方制御するための方法には、低分子または生物学的薬剤によって誘導されるｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、誘導性ｍｉＲＮＡ、誘導性ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及び誘導性ＲＮＡ標的化ヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、該方法は、免疫抑制因子のＲＮＡを標的化するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む。一部の事例では、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの発現は、低分子または生物学的薬剤によって誘導される。

一部の態様では、単離された細胞を得ることと、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを制御することができるトランス活性化因子エレメントに連結されている構成的プロモーターに作動可能に連結されている、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する、構築物を導入することとによって、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の免疫原性を制御するための方法が提供される。一部の実施形態では、該構築物は、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ、構成的プロモーター、及びテトラサイクリンまたはその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）に応答性であるＴｅｔリプレッサーエレメントを含む。他の事例では、ｓｈＲＮＡは、免疫抑制因子の発現を排除する。他の事例では、ｓｈＲＮＡは、免疫抑制因子の発現を、約９９％以下、例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９０％、８５％以下減少させる。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーターである。本明細書に記載の構成的プロモーター、免疫抑制因子、及び細胞のうちのいずれかも、該方法に適用可能である。

多くの実施形態では、操作された細胞は、免疫抑制因子を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡを発現する。一部の実施形態では、該細胞はまた、細胞の低免疫原性を媒介する外因性免疫抑制因子も発現する。一部の実施形態では、該細胞は、免疫抑制因子を分解するようにｓｈＲＮＡの発現を活性化する、限定されないがリガンド、分子、ペプチドまたは低分子等の因子に接触させられる。

一部の実施形態では、該方法は、免疫抑制因子のプロモーターを標的化してその転写を下方制御するためのＣＲＩＳＰＲ干渉システム（ＣＲＩＳＰＲｉ）を含む。一部の事例では、免疫抑制因子を標的とするＣＲＩＳＰＲｉ及び／またはｇＲＮＡの発現は、低分子または生物学的薬剤によって誘導される。ＣＲＩＳＰＲｉ法の詳細な説明は、例えば、Ｅｎｇｒｅｉｔｚｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｅｒｓｐｅｃｔＢｉｏｌ，２０１９，１１：ａ０３５３８６に見出され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、構成的プロモーターによって制御されるｄＣａｓ９－リプレッサー融合タンパク質、及び誘導性プロモーターの制御下にある免疫抑制因子に特異的なｇＲＮＡを利用する。

一部の態様では、単離された細胞を得ることと、該細胞に、（ｉ）免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含有する、第１の構築物、（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはｄＣａｓ９－リプレッサー融合タンパク質等のそのバリアントをコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含有する、第２の構築物、及び（ｉｉｉ）免疫抑制因子をコードする配列を標的とするｇＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、ｇＲＮＡ配列が、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されるように含む、第３の構築物を導入することとによって、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の免疫原性を制御するための方法が提供される。一部の事例では、第１の構築物、第２の構築物、及び第３の構築物は、単一のベクターに見出される。一部の事例では、第１の構築物、第２の構築物、及び第３の構築物は、２つのベクターに見出される。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲベースの方法には、限定されないがＣａｓ１３、Ｃａｓ７、またはＣｓｘ１等の、免疫抑制因子に対応するｍＲＮＡ配列を標的化するためのヌクレアーゼが含まれる。一部の事例では、免疫抑制因子を標的とするヌクレアーゼ及び／またはｇＲＮＡの発現は、低分子または生物学的薬剤によって誘導される。

一部の態様では、単離された細胞を得ることと、該細胞に、（ｉ）免疫抑制因子をコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含む、第１の構築物、（ｉｉ）Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ、そのバリアント、またはその融合タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターを含む、第２の構築物、及び（ｉｉｉ）免疫抑制因子をコードする配列を標的とするｇＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを、ｇＲＮＡ配列が、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されるように含む、第３の構築物を導入することとによって、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）の免疫原性を制御するための方法が提供される。

一部の実施形態では、免疫抑制因子のＲＮＡレベルの制御に有用である誘導性発現システムには、リガンド誘導性転写因子システム、受容体媒介性発現制御システム、及びリガンド制御型リボスイッチが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、誘導性発現システムには、テトラサイクリン制御性オペレーターシステム、合成Ｎｏｔｃｈベース（ＳｙｎＮｏｔｃｈ）のシステム（例えば、Ｍｏｒｓｕｔｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１６，１６４：７８０－７９１及びＹａｎｇｅｔａｌ．，ＣｏｍｍｕｎＢｉｏｌ，２０２０，３：１１６を参照されたい）、及び結果として生じるｐｒｅ－ｍＲＮＡのリガンド（例えば、アプタマー、ペプチド、または低分子）媒介性選択的スプライシングによって免疫抑制因子遺伝子の発現を制御するリボスイッチが含まれる。有用なリボスイッチは、リガンドの存在を感知して、標的免疫抑制因子遺伝子のスプライシングを変更するセンサー領域及びエフェクター領域を含む。リボスイッチｇＲＮＡの詳細な説明及び例は、例えば、ＵＳ９，２２８，２０７、ＵＳ９，９９３，４９１、及びＵＳ１０，４２１，９８９、ならびにＳｅｅｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１２，７（１）：ｅ２９２６６に見出され、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７等の免疫抑制因子のレベルは、ＲＮＡレベルの安全スイッチによって、発現の閾値レベルよりも約１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１倍、または０．５倍低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７のレベルは、発現の閾値レベルよりも約１０倍～５倍、１０倍～３倍、９倍～１倍、８倍～１倍、７倍～０．５倍、６倍～１倍、５倍～０．５倍、４倍～０．５倍、３倍～０．５倍、２倍～０．５倍、または１倍～０．５倍低くなるように減少させられる。一部の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、人工多能性幹細胞におけるＣＤ４７の外因性発現に基づいて確立される。他の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩノックアウト細胞またはＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩ／ＴＣＲノックアウト細胞等の対応する低免疫細胞におけるＣＤ４７の発現レベルに基づいて確立される。

３．ＤＮＡレベルの制御
誘導性プロモーターを用いることによる免疫抑制因子の転写制御は、限定されないがドキシサイクリン等の低分子の添加または除去により、スイッチの発現を随意にオンまたはオフにする能力を提供する。標的ヌクレアーゼ活性を介した遺伝子破壊もまた、免疫抑制因子の発現を排除して、細胞の覆いを除去することができる。

一部の実施形態では、誘導性ＤＮＡ制御のための方法には、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、制御可能なリボスイッチ、及び誘導性ヌクレアーゼ（例えば、誘導性ＣＲＩＳＰＲ、誘導性ＴＡＬＥＮ、誘導性ジンクフィンガーヌクレアーゼ、誘導性ホーミングエンドヌクレアーゼ、誘導性メガヌクレアーゼ等）を使用したノックアウトを使用して、１つまたは複数の免疫抑制因子のＤＮＡ配列を標的化することが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、誘導性ヌクレアーゼは、その発現が低分子の存在によって制御されるようなヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、誘導性ヌクレアーゼは、細胞へのヌクレアーゼＲＮＡまたはタンパク質の送達が低分子の存在によって制御されるようなヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼの発現は、低分子または生物学的薬剤によって誘導される。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及び／またはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の発現は、低分子または生物学的薬剤によって誘導される。

一部の実施形態では、誘導性発現のための方法には、リガンド誘導性転写因子システム（例えば、テトラサイクリン制御性オペレーターシステム）、発現システム（例えば、ＳｙｎＮｏｔｃｈシステム）の受容体媒介性制御、及びｍＲＮＡまたはｇＲＮＡ活性の制御のためのリガンド制御型リボスイッチシステムが含まれるが、これらに限定されない。誘導性発現法の詳細な説明は、例えば、Ｋａｌｌｕｎｋｉｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌｓ，２０１９，７９６（ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ８０８０７９６）に見出され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。

一部の実施形態では、免疫抑制因子は、誘導性発現ベクターを使用して細胞において発現される。発現ベクターは、限定されないがレンチウイルスベクター等のウイルスベクターであり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の誘導性免疫抑制因子は、レンチウイルス形質導入によって細胞に導入される。

一部の実施形態では、免疫抑制因子をコードする構築物のサイレンシングは、レシピエント対象の免疫系による操作された細胞の排除をもたらす。さらに、この内在性遺伝子のサイレンシングは操作された細胞を排除することになるため、免疫抑制因子及び誘導性発現システムを含有する構築物を、カセットの発現を安全に保つために内在性遺伝子座内に組み込むことができる。一部の実施形態では、組み込みに有用な内在性遺伝子座は、コア必須遺伝子座または免疫シグナル伝達因子遺伝子座である。かかる組み込みのためのコア必須遺伝子座の非限定的な例としては、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ１１、Ｐｓｍｄ１４、及びＰＳＭＡ３が挙げられる。かかる組み込みのための免疫シグナル伝達因子遺伝子座の非限定的な例としては、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ／Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、及びＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３）が挙げられる。

例となる実施形態では、免疫抑制因子の条件付き発現は、免疫制御因子ＣＤ４７の発現の制御に基づく。ＣＤ４７は、マクロファージによる食作用を遮断するために自然免疫系の一部として「私を食べないで（ｄｏｎｏｔｅａｔｍｅ）」シグナルとして機能する、自然免疫系の構成要素である。制御された発現のために操作され得る有用な免疫抑制因子には、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣＬ２１、及びＭｆｇｅ８が含まれるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣＬ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される免疫抑制因子のうちのいずれか１つを条件付きで発現するように修飾された、幹細胞（例えば、低免疫原性多能性幹細胞または低免疫原性人工多能性幹細胞）またはその分化細胞の生産方法を提供する。他の実施形態では、免疫抑制因子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＮＦＹ－Ｂ、ＰＤ－Ｌ１、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、ＴＡＰ１、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、ＣＤ４７、Ｂ７－２、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＬＦＡ－１、ＳＴ２、ＨＬＡ－Ｆ、ＣＤ３０、Ｂ７－Ｈ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＬＴ、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ５８、ＣＤ２、及びＨＥＬＩＯＳからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該細胞は、外因性制御シグナルの不在下で、該細胞が低免疫原性であるか、または低減された低免疫原性を有するように、免疫抑制因子のうちの１つまたは複数を条件付きで発現する。外因性制御シグナルの存在下では、該細胞は、免疫細胞によって認識され、細胞死または排除の標的となる。一部の事例では、ＨＩＰ細胞は、免疫抑制因子を発現し、その免疫抑制因子の機能が、ＨＩＰ細胞がレシピエント対象の免疫応答を回避することを可能にする。ＨＩＰ細胞が外因性制御シグナルに曝露されると、免疫抑制因子の発現（例えば、ＤＮＡレベルの発現、ＲＮＡレベルの発現、またはタンパク質レベルの発現）は、下方制御され、故に、ＨＩＰ細胞は、レシピエント対象における自然免疫系によって認識される。かくして、ＨＩＰ細胞は、レシピエントにおいて細胞死及び／または細胞排除を経る。

一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７等の免疫抑制因子のレベルは、ＤＮＡレベルの安全スイッチによって、発現の閾値レベルよりも約１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、５倍、４倍、３倍、２倍、１倍、または０．５倍低くなるように減少させられる。一部の実施形態では、操作された細胞におけるＣＤ４７のレベルは、発現の閾値レベルよりも約１０倍～５倍、１０倍～３倍、９倍～１倍、８倍～１倍、７倍～０．５倍、６倍～１倍、５倍～０．５倍、４倍～０．５倍、３倍～０．５倍、２倍～０．５倍、または１倍～０．５倍低くなるように減少させられる。一部の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、人工多能性幹細胞におけるＣＤ４７の外因性発現に基づいて確立される。他の事例では、ＣＤ４７発現の閾値レベルは、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩノックアウト細胞またはＭＨＣＩ／ＭＨＣＩＩ／ＴＣＲノックアウト細胞等の対応する低免疫細胞におけるＣＤ４７の発現レベルに基づいて確立される。

Ｂ．条件付きＨＩＰ細胞、及び免疫シグナル伝達因子の条件付き上方制御方法
細胞の低免疫原性を改変するために免疫シグナル伝達因子の発現を増加させることに関する、この因子の制御可能な様態での発現のための方法が本明細書に記載される。また、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の制御可能な発現をもつＨＩＰ細胞も記載される。一部の態様では、免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ／Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、及びＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３）からなる群から選択される。

１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の制御可能な発現は、デグロンを使用した誘導性リガンド安定化システム、誘導性ＲＮＡ上方制御システム（例えば、誘導性ＣＲＩＳＰＲ活性化）、及び誘導性ＤＮＡ上方制御システムを用いて提供され得る。一部の実施形態では、誘導性ＤＮＡ上方制御システムは、誘導性ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及びリボスイッチを含む。

ＣＲＩＳＰＲａ法の詳細な説明は、例えば、Ｅｎｇｒｅｉｔｚｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｅｒｓｐｅｃｔＢｉｏｌ，２０１９，１１：ａ０３５３８６に見出され、同文献は参照によりその全体が本明細書に援用される。誘導性リボスイッチの詳細な説明及び例は、例えば、ＵＳ９，２２８，２０７、ＵＳ９，９９３，４９１、及びＵＳ１０，４２１，９８９、ならびにＳｅｅｌｉｇｅｒｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１２，７（１）：ｅ２９２６６に見出され、同文献の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

Ｃ．安全スイッチ及び標的因子を発現させるためのバイシストロン性構築物
細胞において安全スイッチの発現を標的因子（例えば、低免疫因子または必須細胞因子）の発現と関連付け、それによって安全スイッチの発現のサイレンシングによる細胞の排除を確実にするためのシステムが本明細書に記載される。安全スイッチを、標的因子（例えば、低免疫因子または必須細胞因子）をコードする遺伝子の５’側に配置することによって、サイレンシング事象または安全スイッチの発現を妨害する変異が、標的因子（例えば、低免疫因子または必須細胞因子）の発現も妨害し、それによって変異した細胞を生存不能にし、アポトーシスを経るようにする。

本技術のバイシストロン性構築物の主要な構成要素は、薬物またはプロドラッグの存在下で該構築物を含む細胞を殺傷する安全スイッチである。一部の実施形態では、本開示は、「自殺遺伝子」（または「自殺スイッチ」）を含む、低免疫原性細胞（例えば、ＨＩＰ幹細胞またはその分化細胞）を提供する。自殺遺伝子は、低免疫原性細胞が望まれない様態で増殖及び分裂するようなことがあれば、それらの細胞の死を引き起こすことができる、「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。自殺遺伝子による除去手法は、特定の化合物によって活性化されたときにのみ細胞殺傷をもたらすタンパク質をコードする、遺伝子移入ベクター内の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、無毒の化合物を毒性の高い代謝産物へと選択的に変換する酵素をコードすることができる。

安全スイッチ（例えば、安全タンパク質）及び低免疫因子または必須細胞因子等の標的因子の共発現のための、バイシストロン性構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、安全スイッチ及び低免疫分子の共発現は、標的因子及び安全スイッチがリボソームスキッピング配列によって分離される、ポリシストロン性転写物の発現により得られる。一部の実施形態では、該構築物（例えば、カセット）の発現は、ゲノム位置に依存しない転写制御の場合にはプロモーターによって、または選択された標的遺伝子への該構築物の組み込みに次ぐ内在性プロモーターによるペイロード（例えば、安全スイッチ及び標的因子）の制御を可能にするためのスプライスアクセプターによってのいずれかで制御される。

一部の実施形態では、該構築物の安全スイッチ導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、またはＣＤ３０導入遺伝子は、それらのエピトープを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択されるエピトープをコードする遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬｉｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＣＤ２０治療用抗体、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＣＣＲ４治療用抗体、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＨＥＲ２治療用抗体、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＣＤ１９治療用抗体、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＭＵＣ１治療用抗体、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＥＧＦＲ治療用抗体、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬｌｃ、及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＧＤ２治療用抗体、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＰＳＭＡ治療用抗体、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＣＤ３０もしくは抗ＣＤ１６治療用抗体、または（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される抗ＣＤ２０もしくは抗ＣＤ１６治療用抗体によって認識される、ＣＤ２０遺伝子産物に結合するエピトープを含む。

安全スイッチ及びその使用の説明は、Ｄｕｓｇｕｎｅｓ，Ｎ．（２０１９）ＯｒｉｇｉｎｓｏｆＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：ＤｕｚｇｕｎｅＮ．（ｅｄｓ）ＳｕｉｃｉｄｅＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ１８９５．ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ（ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼについて）、ＺｈｏｕａｎｄＢｒｅｎｎｅｒ，ＥｘｐＨｅｍａｔｏｌ，２０１６，４４（１１）：１０１３－１０１９（ｉＣａｓｐａｓｅ９について）、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００１，１８（５），１２５５－１２６３（ｈｕＥＧＦＲについて）、ＵＳ２０１８０００２３９７（ＨＥＲ１について）、及びＰｈｉｌｉｐｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１４，１２４（８），１２７７－１２８７（ＲＱＲ８について）に記載される。

一部の事例では、チミジル酸シンターゼ遺伝子またはその変異体が、該構築物に含められる。例えば、チミジル酸シンターゼを発現している細胞は、ガンシクロビルを含めたある特定のプロドラッグに感受性がある。細胞内のチミジル酸シンターゼの発現は、細胞をプロドラッグガンシクロビルに対して感受性にする。別の実施形態では、ＣＤ２０遺伝子が含められる。ＣＤ２０陽性である細胞は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブまたはそのバイオ後続品もしくは代用薬）での処置により殺傷され得る。場合によっては、ＨＳＶｔｋ導入遺伝子は、外因性因子ガンシクロビルによって制御される。場合によっては、シトシンデアミナーゼ導入遺伝子は、外因性因子５－フルオロシトシンによって制御される。場合によっては、ニトロレダクターゼ導入遺伝子は、外因性因子ＣＢ１９５４によって制御される。場合によっては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ導入遺伝子は、外因性因子６－メチルプリンデオキシリボシドまたはフルダラビンによって制御される。場合によっては、西洋ワサビペルオキシダーゼ導入遺伝子は、外因性因子インドール３－酢酸によって制御される。

場合によっては、ｉＣａｓｐａｓｅ９導入遺伝子は、外因性因子リミデュシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）（ＡＰ１９０３）、ＡＰ２０１８７、またはラパマイシンによって制御される。場合によっては、ヒト短縮型ＥＧＦＲ導入遺伝子（例えば、ＥＧＦＲｔ）は、外因性抗体セツキシマブ、または同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアントによって制御される。場合によっては、ヒトＨＥＲ１導入遺伝子は、外因性抗体セツキシマブ、または同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアントによって制御される。場合によっては、ヒトＲＱＲ８導入遺伝子は、外因性抗体リツキシマブ、または同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアントによって制御される。

一部の実施形態では、ＣＤ２０遺伝子産物は、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬｉｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４遺伝子産物は、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２遺伝子産物は、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９遺伝子産物は、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１遺伝子産物は、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲ遺伝子産物は、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２遺伝子産物は、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬｌｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡ遺伝子産物は、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０もしくはＣＤ１６遺伝子産物は、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０もしくはＣＤ１６遺伝子産物は、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部分を含む。多くの実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。一部の事例では、ｉＣａｓｐ９は、一続きのアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子につなげられた、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質の配列ＦＫＢＰ１２とＦ３６Ｖ変異を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤であるリミデュシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）またはＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。故に、ｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によって発動される。一部の実施形態では、ＣＩＤは、低分子薬ＡＰ１９０３である。二量体化は、アポトーシスの迅速な誘導を引き起こす。例えば、ＷＯ２０１１１４６８６２、Ｓｔａｓｉｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙｅｔａｌ，Ｂｉｏｌ．ＢｌｏｏｄＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたく、同文献の各々は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

一部の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）依存性安全スイッチである。一部の事例では、安全スイッチ導入遺伝子は、ＥＧＦＲ断片またはエピトープ、ＣＤ２０断片またはエピトープ、またはＣＤ１９断片またはエピトープを含む。

場合によっては、ヒトＥＧＦＲ安全スイッチは、抗体セツキシマブ、同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアント、または別の抗ＥＧＦＲ抗体によって制御される。場合によっては、ヒトＣＤ１９安全スイッチは、抗体ベバシズマブ、同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアント、または別の抗ＣＤ１９抗体によって制御される。場合によっては、ヒトＣＤ２０安全スイッチは、抗体リツキシマブ、同じもしくは類似のエピトープを認識するそのバリアント、または別の抗ＣＤ２０抗体によって制御される。

一部の実施形態では、安全スイッチは、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される低免疫因子と共発現させられる。ある特定の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７である。

一部の事例では、バイシストロン性構築物はまた、天然または合成のターミネーターも含む。例えば、本開示の構築物において使用するために包含されるものには、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，２０１３，１０，６５９－６６４に特定され、記載されるターミネーターのうちのいずれか１つが含まれ、同文献の内容は参照により本明細書に援用される。一部の実施形態では、ターミネーターは、発現構築物の３’末端に位置する。一部の実施形態では、ターミネーターは、標的因子遺伝子（例えば、低免疫因子遺伝子または必須細胞因子遺伝子）に作動可能に連結されている。

一部の事例では、バイシストロン性構築物は、限定されないがＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列等の、リボソームスキッピング配列を含む。自己切断型２Ａコード配列の非限定的な例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａが挙げられる。例となるＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａペプチドの配列が、表２に示される。

一部の事例では、バイシストロン性構築物は、安全スイッチと標的因子との間に位置するリンカー、例えば、ペプチドリンカー、柔軟なリンカー等を含む。例となるリンカーが、表２で提供される。

一部の実施形態では、バイシストロン性構築物は、転写制御エレメントを含む。一部の事例では、転写制御エレメントは、安全スイッチ及び低免疫因子の発現を制御する。一部の実施形態では、転写制御エレメントは、プロモーターまたはスプライスアクセプターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである。例となる構成的プロモーターの配列が、表４で提供される。

一部の実施形態では、バイシストロン性構築物は、レンチウイルス発現用に設計される。概説されるようなバイシストロン性構築物を含むレンチウイルスベクターが本明細書で提供される。有用なレンチウイルスベクターバックボーンは、形質導入される細胞種に従って選択される。

標的因子（例えば、低免疫因子または必須細胞因子）をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列に作動可能に連結された安全スイッチ導入遺伝子を含む、バイシストロン性構築物が本明細書で提供される。例えば、バイシストロン形式で安全スイッチを低免疫因子遺伝子の５’側に位置付けることにより、安全スイッチを不活性化するフレームシフト変異等のサイレンシング事象が低免疫因子遺伝子も不活性化することが確実となることに留意されたい。一部の実施形態では、バイシストロン性構築物の発現は、低免疫因子遺伝子に作動可能に連結されている、リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列に作動可能に連結された安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されている構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、該構築物はまた、３’末端にポリアデニル化配列も含む。一部の実施形態では、該構築物は、天然または合成のターミネーターを含む。

また、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されているリボソームスキッピング配列またはリンカーに作動可能に連結された低免疫因子遺伝子（または必須細胞因子遺伝子）を含む、バイシストロン性構築物も提供される。一部の事例では、このバイシストロン形式において、安全スイッチにおけるフレームシフト変異は、低免疫因子（または必須細胞因子）を不活性化しない。一部の実施形態では、バイシストロン性構築物の発現は、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されているリボソームスキッピング配列またはリンカーに作動可能に連結された標的因子遺伝子に作動可能に連結されている構成的プロモーターによって制御される。一部の実施形態では、該構築物はまた、３’末端にポリアデニル化配列も含む。一部の実施形態では、該構築物は、天然または合成のターミネーターを含む。

これらの技術の全てについて、周知の組換え技法を使用して、本明細書に概説されるような組換え核酸が生成される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の因子のうちのいずれかをコードする組換え核酸は、発現構築物において１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結されてもよい。制御ヌクレオチド配列は、一般に、処置される宿主細胞及び対象に適切であろう。様々な宿主細胞に対して、数多くの種類の適切な発現ベクター及び好適な制御配列が当該技術分野で既知である。典型的には、１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当該技術分野で既知であるような構成的または誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然型プロモーター、または１つよりも多くのプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。発現構築物は、細胞においてプラスミド等のエピソーム上に存在してもよいし、または発現構築物は、染色体に挿入されてもよい。具体的な実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能マーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを含む。本明細書で使用するための制御配列には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントが含まれる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞、発現させることが望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、またはベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカーの発現の選定に対して設計される。

好適な哺乳類プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーター、すなわち、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長鎖末端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。他の異種哺乳類プロモーターの例としては、アクチン、免疫グロブリン、または熱ショックプロモーター（複数可）が挙げられる。追加の実施形態では、哺乳類細胞において使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得ることができる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片として好都合に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙｅｔａｌ，Ｇｅｎｅ１８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。

本明細書に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。ひとたび改変されると、本明細書に記載の分子のうちのいずれかの発現の存在について、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ等といった既知の技法を使用してアッセイすることができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、単離された哺乳類細胞及び単離されたヒト細胞等の単離された細胞に導入される。一部の実施形態では、該細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、またはそれらの分化細胞である。一部の事例では、該細胞は、低免疫原性である。低免疫原性細胞及びかかる細胞の生成方法は、本明細書に記載される。

Ｄ．安全スイッチ及び標的因子の相同性指向修復（ＨＤＲ）
一部の態様では、安全スイッチ（例えば、デグロン等）及び標的因子（例えば、免疫抑制因子または必須細胞因子）の単一のｍＲＮＡ転写物としての共発現用に設計される構築物が、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって内在性遺伝子座にて挿入される。この構成において、挿入されたエレメントは、内在性コード配列を破壊する。一部の実施形態では、内在性遺伝子座は、必須細胞因子遺伝子座である。かかる実例では、内在性プロモーターの制御下で発現される導入されたタンデム構築物は、必須細胞因子遺伝子の欠失を補い、安全スイッチの発現に対する共依存を作り出す。一部の事例では、必須遺伝子内への安全スイッチのノックインは、発現圧力の回避を可能にする。

一部の実施形態では、プロモーター及びバイシストロン性発現構築物を含有する構築物は、セーフハーバー遺伝子座、免疫シグナル伝達遺伝子座、または必須細胞因子遺伝子座等のゲノム遺伝子座にてＨＤＲによって導入され、続いて標的ヌクレアーゼを使用して内在性の必須細胞因子遺伝子（または場合によっては、免疫抑制因子をコードする遺伝子）の両アレルのノックアウトが行われる。この構成において、ヌクレアーゼ切断に対する耐性を付与するように、必須細胞因子遺伝子をコードする配列におけるサイレント変異がバイシストロン性構築物に導入される。導入されたタンデム発現構築物は、必須細胞因子遺伝子の欠失を補い、安全スイッチの発現に対する共依存を作り出す。

一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座内へのＨＤＲのための構築物は、セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、安全スイッチ導入遺伝子、リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、免疫抑制因子遺伝子（または必須細胞遺伝子）、ポリアデニル化配列、ならびにセーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む。一部の実施形態では、免疫シグナル伝達遺伝子座内へのＨＤＲのための構築物は、免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、安全スイッチ導入遺伝子、リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、免疫抑制因子遺伝子、ポリアデニル化配列、ならびに免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む。一部の実施形態では、必須細胞因子遺伝子座内へのＨＤＲのための構築物は、必須細胞因子遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、安全スイッチ導入遺伝子、リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、免疫抑制因子遺伝子、ポリアデニル化配列、ならびに必須細胞因子遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む。一部の事例では、転写制御エレメントが、安全スイッチ導入遺伝子の５’に位置する。

一部の実施形態では、転写制御エレメントは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター（別名、ＣＡＧプロモーター）、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物の安全スイッチ導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される。

上述したように、免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８であり得るが、これらに限定されない。一部の事例では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニット、プロテアソームサブユニット、及びスプライセオソームサブユニットであり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、必須細胞因子遺伝子のサイレンシングが軽減されるように、安全スイッチ導入遺伝子とともにしたＣＤ４７等の免疫抑制因子が、必須細胞因子をコードする遺伝子に導入される。場合によっては、該遺伝子は、プロテアソームサブユニットＰｓｍｄ１４、リボソームサブユニットＲｐｓ２、及びリボソームサブユニットＲｐＬ３２からなる群から選択される必須細胞因子をコードする。

一部の実施形態では、リンカーは、安全スイッチと低免疫因子との間に位置するペプチドリンカー、柔軟なリンカー等である。一部の実施形態では、リンカーは、安全スイッチと必須細胞因子との間に位置するペプチドリンカー、柔軟なリンカー等である。例となるリンカーが、表２で提供される。

一部の実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む。自己切断型２Ａコード配列の非限定的な例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａが挙げられる。例となるＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａペプチドの配列が、表２に示される。

標的組み込みに関する一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択される。多くの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＣＬＢＹＬ遺伝子座またはＣＣＲ５遺伝子座である。一部の実施形態では、免疫シグナル伝達遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、及びＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３）からなる群から選択される。一部の実施形態では、必須細胞因子遺伝子座は、ＲｐＳ２遺伝子座、ＲｐＳ９遺伝子座、ＲｐＳ１１遺伝子座、ＲｐＳ１３遺伝子座、ＲｐＳ１８遺伝子座、ＲｐＬ８遺伝子座、ＲｐＬ１１遺伝子座、ＲｐＬ３２遺伝子座、ＲｐＬ３６遺伝子座、Ｒｐｎ２２遺伝子座、Ｐｓｍｄ１４遺伝子座、ＰＳＭＡ３遺伝子座、リボソームサブユニットの遺伝子座、プロテアソームサブユニットの遺伝子座、及びスプライセオソームサブユニットの遺伝子座からなる群から選択される。

選択された遺伝子座内への安全スイッチ及び免疫抑制因子の標的組み込みは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲベース及び非ＣＲＩＳＰＲベースの方法等の標的ヌクレアーゼ技術を使用して遂行することができる。

セーフハーバー遺伝子座において安全スイッチ及び免疫抑制因子を発現している細胞が本明細書に概説される。また、免疫シグナル伝達遺伝子座において安全スイッチ及び免疫抑制因子を発現している細胞も提供される。安全スイッチの発現は、生細胞内の免疫抑制因子の発現に関連付けられる。一部の実施形態では、該細胞は、哺乳類細胞及び単離されたヒト細胞である。一部の実施形態では、該細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、またはそれらの分化細胞である。一部の事例では、該細胞は、低免疫原性である。低免疫原性細胞及びかかる細胞の生成方法は、本明細書に記載される。

一部の態様では、５’から３’末端に、左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、安全スイッチ導入遺伝子、リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、免疫抑制因子遺伝子、ポリアデニル化配列、及び右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が提供される。一部の実施形態では、該構築物は、Ｃａｓ９誘導ＨＤＲを経て細胞に導入される。一部の実施形態では、該構築物は、相同性非依存性の組み込みを経て細胞に導入される。

また、５’から３’末端に、左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、低免疫因子遺伝子、リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、安全スイッチ導入遺伝子、ポリアデニル化配列、及び右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物も提供される。一部の実施形態では、該構築物は、Ｃａｓ９誘導ＨＤＲを経て細胞に導入される。一部の実施形態では、該構築物は、相同性非依存性の組み込みを経て細胞に導入される。

一部の実施形態では、記載される構築物のうちのいずれか１つは、単離された哺乳類細胞及び単離されたヒト細胞等の単離された細胞に導入される。一部の実施形態では、該細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞、またはそれらの分化細胞である。一部の事例では、該細胞は、低免疫原性である。低免疫原性細胞及びかかる細胞の生成方法は、本明細書に記載される。

Ｅ．低免疫因子－安全スイッチ融合タンパク質
ＡＤＣＣ及びＣＤＣは、細胞の細胞外表面に結合した抗体を認識することによって免疫エフェクター細胞を介して機能する。ＡＤＣＣ／ＣＤＣは、抗体により認識されるエピトープの発現によって活性化される。かくして、このシステムは、有効な安全スイッチとして作用し得る。エピトープ及び低免疫分子を含む、融合タンパク質が本明細書で提供される。融合タンパク質は、操作された低免疫細胞の排除に対する二重安全装置を提供する。リツキシマブによって認識されるＣＤ２０断片等のペプチド性エピトープ（「ＣＤ２０ミモトープ」と称される）が、限定されないがＣＤ４７等の細胞外または膜結合型低免疫分子に連結される。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、低免疫因子及びペプチド性エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、低免疫因子、ペプチド性エピトープ、及びリンカーを含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子及びペプチド性エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ペプチド性エピトープ及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子、リンカー、及びペプチド性エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ペプチド性エピトープ、リンカー、及び低免疫因子を含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、リンカー、低免疫因子、リンカー、及びペプチド性エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子、リンカー、ペプチド性エピトープ、及びリンカーを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、リンカー、ペプチド性エピトープ、リンカー、及び低免疫因子、及びリンカーを含む。

一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープ、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープ、リンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、リンカー、表面に露出したＣＤ２０エピトープ、リンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、表面に露出したＣＤ２０エピトープ、リンカー、低免疫因子、及びリンカーを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子及び表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子、リンカー、及び表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、リンカー、低免疫因子、リンカー、及び表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、低免疫因子、リンカー、表面に露出したヒトＣＤ２０エピトープ、及びリンカーを含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＣＤ２０エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ２０エピトープは、リツキシマブ、そのバリアント、または別の抗ＣＤ２０抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＣＤ１９エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１９エピトープは、ベバシズマブ、そのバリアント、または別の抗ＣＤ１９抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＥＧＦＲエピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＥＧＦＲエピトープは、セツキシマブ、そのバリアント、または別の抗ＥＧＦＲ抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＣＣＲ４エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＣＲ４エピトープは、抗ＣＣＲ４抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＭＵＣ１エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＭＵＣ１エピトープは、抗ＭＵＣ１抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＣＤ１６エピトープまたはヒトＣＤ３０エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ３０エピトープは、抗ＣＤ３０抗体またはその二重特異性抗体によって認識される。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１６エピトープは、抗ＣＤ１６抗体またはその二重特異性抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＣＤ２０エピトープまたはヒトＣＤ１６エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ２０エピトープは、抗ＣＤ２０抗体またはその二重特異性抗体によって認識される。一部の実施形態では、ヒトＣＤ１６エピトープは、抗ＣＤ１６抗体またはその二重特異性抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＰＳＭＡエピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＰＳＭＡエピトープは、抗ＰＳＭＡ抗体によって認識される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、任意選択的なリンカー、ヒトＧＤ２エピトープ、任意選択的なリンカー、及び低免疫因子を含む。一部の実施形態では、ヒトＧＤ２エピトープは、抗ＧＤ２抗体によって認識される。他の実施形態では、ペプチドエピトープ及び低免疫因子の順序は、逆にされる。

他の実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片、リンカー、ペプチド性エピトープ、リンカー、及びヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインを含む。

別の態様では、５’から３’末端に、転写制御エレメント、ペプチド性エピトープをコードする配列、リボソームスキッピング配列、及び低免疫因子をコードする配列を含む、バイシストロン性構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ペプチド性エピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

一部の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７である。一部の実施形態では、リンカーは、表２にある１つから選択される。

一部の実施形態では、ペプチドエピトープのうちのいずれか１つは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＣＤ３０またはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。一部の実施形態では、ＣＤ２０またはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

記載される構築物のうちのいずれか１つは、単離された哺乳類細胞及び単離されたヒト細胞等の単離された細胞に導入され得る。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、またはそれらの分化細胞である。一部の事例では、該細胞は、低免疫原性である。低免疫原性細胞及びかかる細胞の生成方法は、本明細書に記載される。

Ｆ．ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、及びＴＣＲ複合体の発現が修飾された条件付きＨＩＰ細胞
一態様では、本明細書に開示される本技術は、多能性幹細胞（例えば、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、かかる多能性幹細胞に由来する分化細胞（例えば、低免疫Ｔ細胞）、及び初代Ｔ細胞における標的因子の発現を制御するための安全スイッチの使用に関する。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞、それに由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現の低減または発現の欠失に向けて操作される。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞、それに由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の発現の低減または発現の欠失、ならびに１つまたは複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の発現の低減または発現の欠失に向けて操作される。一部の事例では、ＭＨＣクラスＩ抗原、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、及び／または１つもしくは複数のＴＣＲ複合体の発現の欠失または低減は、誘導性遺伝子修飾システムを使用して達成される。

一部の態様では、本開示は、遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続した連なりを欠失するように編集されており、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ分子の表面発現が低減または排除されたゲノムを含む、多能性幹細胞（例えば、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、かかる多能性幹細胞に由来する分化細胞（例えば、低免疫Ｔ細胞）、初代Ｔ細胞、及びそれらの集団を提供する。ある特定の態様では、本開示は、遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続した連なりを欠失するように編集されており、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現が低減または排除されたゲノムを含む、多能性幹細胞（例えば、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、かかる多能性幹細胞に由来する分化細胞（例えば、低免疫Ｔ細胞）、初代Ｔ細胞、及びそれらの集団を提供する。特定の態様では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続した連なりを欠失するように編集されており、それによって細胞またはその集団におけるＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の表面発現が低減または排除されたゲノムを含む、多能性幹細胞（例えば、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、かかる多能性幹細胞に由来する分化細胞（例えば、低免疫Ｔ細胞）、初代Ｔ細胞、及びそれらの集団を提供する。さらなる態様では、本開示は、１つまたは複数の遺伝子が、ゲノムＤＮＡの連続した連なりを欠失するように編集されており、それによって細胞またはその集団における１つまたは複数のＴＣＲ複合体の表面発現が低減または排除されたゲノムを含む、多能性幹細胞（例えば、多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、かかる多能性幹細胞に由来する分化細胞（例えば、低免疫Ｔ細胞）、初代Ｔ細胞、及びそれらの集団を提供する。

一部の実施形態では、該細胞は、ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩの発現を制御する１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。一部の態様では、遺伝子編集システムを使用して、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド配列が修飾される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、細胞のゲノムは、ＨＬＡ発現の必要不可欠な構成要素を低減または欠失させるように改変されている。追加の実施形態では、該細胞は、１つまたは複数のＴＣＲ複合体の発現を制御する１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド配列のゲノム修飾を含む。一部の態様では、遺伝子編集システムを使用して、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチド配列が修飾される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣ及びＴＲＢからなる群から選択される１つまたは複数である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＣＩＩＴＡ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびに、限定されないがＢ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢ等の、１つまたは複数の追加の標的ポリヌクレオチド配列を改変するようにかかる細胞のゲノムを編集することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびに、限定されないがＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢ等の、１つまたは複数の追加の標的ポリヌクレオチド配列を改変するようにかかる細胞のゲノムを編集することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＮＬＲＣ５遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびに、限定されないがＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢ等の、１つまたは複数の追加の標的ポリヌクレオチド配列を改変するようにかかる細胞のゲノムを編集することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＴＲＡＣ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびに、限定されないがＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、及びＴＲＢ等の、１つまたは複数の追加の標的ポリヌクレオチド配列を改変するようにかかる細胞のゲノムを編集することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞及び方法は、ＴＲＢ遺伝子配列を切断するようにヒト細胞をゲノム編集すること、ならびに、限定されないがＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＮＬＲＣ５、及びＴＲＡＣ等の、１つまたは複数の追加の標的ポリヌクレオチド配列を改変するようにかかる細胞のゲノムを編集することを含む。

一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、ＴＲＢ遺伝子のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＲＡＣ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＴＲＢ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、多能性幹細胞、かかる細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢ遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数のゲノム修飾を含む。一部の実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－細胞である。多くの実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＴＲＡＣ^－／－細胞である。多くの実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＴＲＢ^－／－細胞である。一部の実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}細胞である。一部の実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＴＲＡＣ^{インデル／インデル}細胞である。一部の実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＴＲＢ^{インデル／インデル}細胞である。一部の実施形態では、該細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＴＲＡＣ^{インデル／インデル}、ＴＲＢ^{インデル／インデル}細胞である。一部の実施形態では、記載される修飾された細胞は、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、かかる多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞から分化した細胞、または初代Ｔ細胞である。初代Ｔ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、非制御性Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、濾胞性ヘルパーＴ（Ｔｆｈ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）、組織常在メモリー（Ｔｒｍ）細胞、仮想メモリーＴ細胞、自然メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞（Ｔｓｅ）、γδ Ｔ細胞、及びＴ細胞の任意の他のサブタイプが挙げられる。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子が、該細胞において不活性化される。該遺伝子は、相同性依存性修復または部位間特異的ヌクレアーゼを使用して不活性化され得る。一部の実施形態では、該遺伝子の一方または両方のアレルが不活性化される。

１．ＣＩＩＴＡ
ある特定の態様では、本技術は、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）発現を標的化し、調節すること（例えば、低減または排除すること）によって、ＭＨＣＩＩ遺伝子の発現を調節する（例えば、低減または排除する）。一部の態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＣＩＩＴＡは、ＬＲ、またはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによってＭＨＣＩＩの転写を制御する。

一部の実施形態では、本技術の標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのホモログである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。

一部の態様では、ＣＩＩＴＡの発現の低減または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ、すなわちＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つまたは複数の発現を低減または排除する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ＣＩＩＴＡタンパク質をコードする遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。換言すれば、該細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。一部の事例では、ＣＩＩＴＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照配列番号ＮＭ＿０００２４６．４及びＮＣＢＩＧｅｎｂａｎｋ番号Ｕ１８２５９に定められる。一部の事例では、ＣＩＩＴＡ遺伝子座は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号４２６１に記載される。ある特定の実例では、ＣＩＩＴＡのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＡ８８８６１．１として示される。ＣＩＩＴＡタンパク質及び遺伝子座の追加の説明は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ３３０７６、ＨＧＮＣ参照番号７０６７、及びＯＭＩＭ参照番号６００００５に見出すことができる。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、レアカット（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼによってＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６１８３０４１の表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択され、同文献は参照により本明細書に援用される。一部の実施形態では、該細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低減されている。

ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＰＣＲによるＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子修飾、及びＨＬＡ－ＩＩ発現の低減は、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体によりプロービングされる細胞ライセートのウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化する遺伝子修飾の存在が確認される。

２．Ｂ２Ｍ
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される技術は、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍの発現を標的化し、調節すること（例えば、低減または排除すること）によって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節する（例えば、低減または排除する）。一部の態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。Ｂ２Ｍの発現を調節すること（例えば、低減または欠失させること）によって、ＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送が遮断され、細胞を低免疫原性にする。一部の実施形態では、該細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低減されている。

一部の実施形態では、本技術の標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのホモログである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。

一部の態様では、Ｂ２Ｍの発現の減少または排除は、以下のＭＨＣＩ分子、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数の発現を低減または排除する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、Ｂ２Ｍタンパク質をコードする遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。換言すれば、該細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。一部の事例では、Ｂ２Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照配列番号ＮＭ＿００４０４８．４及びＧｅｎｂａｎｋ番号ＡＢ０２１２８８．１に定められる。一部の事例では、Ｂ２Ｍ遺伝子座は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５６７に記載される。ある特定の実例では、Ｂ２Ｍのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＡ３５１８２．１として示される。Ｂ２Ｍタンパク質及び遺伝子座の追加の説明は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ６１７６９、ＨＧＮＣ参照番号９１４、及びＯＭＩＭ参照番号１０９７００に見出すことができる。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによってＢ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６１８３０４１の表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、同文献は参照により本明細書に援用される。

Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＰＣＲによるＢ２Ｍ遺伝子の遺伝子修飾、及びＨＬＡ－Ｉ発現の低減は、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体によりプロービングされる細胞ライセートのウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化する遺伝子修飾の存在が確認される。

３．ＮＬＲＣ５
ある特定の態様では、本技術は、ＮＬＲファミリー、ＣＡＲＤドメイン含有５／ＮＯＤ２７／ＣＬＲ１６．１（ＮＬＲＣ５）の発現を標的化し、調節すること（例えば、低減または排除すること）によって、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子の発現を調節する（例えば、低減または排除する）。一部の態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ媒介性免疫応答の必要不可欠なレギュレーターであり、ＣＩＩＴＡと同様に、ＮＬＲＣ５は、ＩＦＮ－γによって高度に誘導可能であり、核内に移行することができる。ＮＬＲＣ５は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子のプロモーターを活性化し、ＭＨＣ－Ｉ、ならびにＭＨＣ－Ｉ抗原提示に関与する関連遺伝子の転写を誘導する。

一部の実施形態では、本技術の標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のホモログである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＮＬＲＣ５のオルソログである。

一部の態様では、ＮＬＲＣ５の発現の減少または排除は、以下のＭＨＣＩ分子、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃうちの１つまたは複数の発現を低減または排除する。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによってＮＬＲＣ５遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＲＣ５遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、本明細書とともに提供される付録３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１４）の配列番号３６３５３～８１２３９からなる群から選択される。一部の実施形態では、該細胞は、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力が低減されている。

ＮＬＲＣ５遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＰＣＲによるＮＬＲＣ５遺伝子の遺伝子修飾、及びＨＬＡ－Ｉ発現の低減は、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＮＬＲＣ５タンパク質発現は、ＮＬＲＣ５タンパク質に対する抗体によりプロービングされる細胞ライセートのウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化する遺伝子修飾の存在が確認される。

４．ＴＲＡＣ
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される技術は、Ｔ細胞受容体アルファ鎖の定常領域の発現を標的化し、調節すること（例えば、低減または排除すること）によって、ＴＲＡＣ遺伝子を含むＴＣＲ遺伝子の発現を調節する（例えば、低減または排除する）。一部の態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＴＲＡＣの発現を調節すること（例えば、低減または欠失させること）によって、ＴＣＲ分子の表面輸送が遮断される。一部の実施形態では、該細胞はまた、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力も低減されている。

一部の実施形態では、本技術の標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣのホモログである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＡＣのオルソログである。

一部の態様では、ＴＲＡＣの発現の減少または排除は、ＴＣＲ表面発現を低減または排除する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ＴＲＡＣタンパク質をコードする遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。換言すれば、該細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。一部の事例では、ＴＲＡＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ０２５９２．１に定められる。一部の事例では、ＴＲＡＣ遺伝子座は、参照配列番号ＮＧ＿００１３３２．３及びＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号２８７５５に記載される。ある特定の実例では、ＴＲＡＣのアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８４８として示される。ＴＲＡＣタンパク質及び遺伝子座の追加の説明は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８４８、ＨＧＮＣ参照番号１２０２９、及びＯＭＩＭ参照番号１８６８８０に見出すことができる。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによってＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択され、同文献は参照により本明細書に援用される。

ＴＲＡＣ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＰＣＲによるＴＲＡＣ遺伝子の遺伝子修飾、及びＴＣＲ発現の低減は、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＴＲＡＣタンパク質発現は、ＴＲＡＣタンパク質に対する抗体によりプロービングされる細胞ライセートのウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化する遺伝子修飾の存在が確認される。

５．ＴＲＢ
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される技術は、Ｔ細胞受容体ベータ鎖の定常領域の発現を標的化し、調節すること（例えば、低減または排除すること）によって、Ｔ細胞抗原受容体、ベータ鎖をコードする遺伝子（例えば、ＴＲＢまたはＴＣＲＢ遺伝子）を含むＴＣＲ遺伝子の発現を調節する（例えば、低減または排除する）。一部の態様では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して起こる。ＴＲＢの発現を調節すること（例えば、低減または欠失させること）によって、ＴＣＲ分子の表面輸送が遮断される。一部の実施形態では、該細胞はまた、レシピエント対象において免疫応答を誘導する能力も低減されている。

一部の実施形態では、本技術の標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＢのバリアントである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＢのホモログである。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＴＲＢのオルソログである。

一部の態様では、ＴＲＢの発現の減少または排除は、ＴＣＲ表面発現を低減または排除する。

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ＴＲＢタンパク質をコードする遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。換言すれば、該細胞は、ＴＲＢ遺伝子座にて遺伝子修飾を含む。一部の事例では、ＴＲＢタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０ＤＳＥ２に定められる。一部の事例では、ＴＲＢ遺伝子座は、参照配列番号ＮＧ＿００１３３３．２及びＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号６９５７に記載される。ある特定の実例では、ＴＲＢのアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８４８として示される。ＴＲＢタンパク質及び遺伝子座の追加の説明は、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ３６０９２．２、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０ＤＳＥ２、及びＨＧＮＣ参照番号１２１５５に見出すことができる。

一部の実施形態では、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、ＴＲＢ遺伝子を標的とする遺伝子修飾を含む。一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによってＴＲＢ遺伝子を標的とする遺伝子修飾は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＢ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＲＢ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択され、同文献は参照により本明細書に援用される。

ＴＲＢ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載される。一実施形態では、結果として生じるＰＣＲによるＴＲＢ遺伝子の遺伝子修飾、及びＴＣＲ発現の低減は、ＦＡＣＳ解析によってアッセイすることができる。別の実施形態では、ＴＲＢタンパク質発現は、ＴＲＢタンパク質に対する抗体によりプロービングされる細胞ライセートのウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、不活性化する遺伝子修飾の存在が確認される。

Ｇ．ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、及び／またはＴＣＲ発現を低減または排除する方法
ＭＨＣＩ抗原、ＭＨＣＩＩ抗原、及び／または１つもしくは複数のＴＣＲ複合体の発現が低減するように細胞を修飾または操作するための方法が本明細書で提供される。ＭＨＣＩ及び／またはＭＨＣＩＩ発現の低減は、例えば、以下のうちの１つまたは複数によって遂行することができる：（１）多型ＨＬＡアレル（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）及びＭＨＣ－ＩＩ遺伝子を直接標的化すること、（２）Ｂ２Ｍの除去により、全てのＭＨＣ－Ｉ分子の表面輸送を阻止すること、（３）ＣＩＩＴＡの除去により、全てのＭＨＣ－ＩＩ分子の表面輸送を阻止すること、及び／または（４）ＨＬＡ発現に必要不可欠である、ＬＲＣ５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＩＲＦ１、ＮＦ－Ｙ（ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃを含む）、及びＣＩＩＴＡ等のＭＨＣエンハンセオソームの構成要素の欠失。

一部の態様では、ＨＬＡ発現は、個々のＨＬＡを標的化すること（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及び／またはＨＬＡ－ＤＲの発現をノックアウトすること）、ＨＬＡ発現の転写レギュレーターを標的化すること（例えば、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、及び／またはＩＲＦ－１の発現をノックアウトすること）、ＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送を遮断すること（例えば、Ｂ２Ｍ及び／またはＴＡＰ１の発現をノックアウトすること）、及び／またはＨＬＡ－Ｒａｚｏｒで標的化すること（例えば、ＷＯ２０１６１８３０４１を参照されたい）によって妨げられる。

ある特定の態様では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、かかる幹細胞に由来する分化細胞、及び初代Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない、本明細書に開示される細胞は、ＭＨＣ－Ｉ及び／またはＭＨＣ－ＩＩに対応する１つまたは複数のヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及び／またはＨＬＡ－ＤＲ）を発現せず、故に低免疫原性であるとして特徴付けられる。例えば、ある特定の態様では、開示される多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞は、該幹細胞またはそれから調製される分化した幹細胞が以下のＭＨＣ－Ｉ分子、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数を発現しないか、またはその発現の低減を示すように修飾されている。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つまたは複数が、細胞から「ノックアウト」され得る。ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、及び／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ノックアウトされた各遺伝子の発現の低減または排除を示し得る。

ある特定の実施形態では、ＨＬＡ遺伝子における保存領域を標的とすることによって全てのＭＨＣクラスＩアレルの同時欠失を可能にするｇＲＮＡは、ＨＬＡＲａｚｏｒとして特定される。一部の態様では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。代替の態様では、ｇＲＮＡは、ＴＡＬＥＮシステムの一部である。一態様では、ＨＬＡにおける特定された保存領域を標的とするＨＬＡＲａｚｏｒが、ＷＯ２０１６１８３０４１に記載される。他の態様では、特定された保存領域を標的とする複数のＨＬＡＲａｚｏｒが利用される。一般に、ＨＬＡにおける保存領域を標的とする任意のガイドがＨＬＡＲａｚｏｒとして作用し得ることが理解される。

下記で提供される方法は、限定されないが多能性幹細胞、多能性幹細胞、その分化細胞、及び初代Ｔ細胞等の細胞における、ＭＨＣクラスＩ発現、ＭＨＣクラスＩＩ発現、及び／またはＴＣＲ発現の不活性化または除去に有用である。一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用したゲノム編集技術を使用して、ヒト幹細胞において必要不可欠な免疫遺伝子の発現もまた（例えば、必要不可欠な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）低減または排除される。ある特定の実施形態では、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術を使用して、ヒト細胞において耐性誘導因子が挿入されて、それら及びそれらから調製される分化細胞を低免疫原性細胞にする。かくして、低免疫原性細胞は、ＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ発現が低減または排除されている。一部の実施形態では、該細胞は、レシピエント対象において非免疫原性である（例えば、免疫応答を誘導しない）。

ゲノム編集技法は、所望の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡ切断を可能にする。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位にて相同組換えを促進する。このプロセスは、当該配列を認識してそれに結合し、当該核酸分子における二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼによる、染色体等の核酸分子の特定の配列の標的化に焦点を当てる。二本鎖切断は、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。

特定の実施形態の実施は、特にそれとは反対の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらのうちの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄＪｕｌｙ２００８）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｏｍｐｌｅｘＧｅｎｏｍｅｓ，（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＱ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＭ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈａｎｄＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の刊行物における研究論文を参照されたい。

一部の実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼは、レアカットエンドヌクレアーゼをコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような修飾ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような修飾ｍＲＮＡ（例えば、合成の修飾ｍＲＮＡ）を含む。

本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用して、当業者に利用可能である任意の様態で標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが使用され得る。かかるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を用いることができる（Ｈａｆｔｅｔａｌ．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を改変することを可能にするかかるＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＩ型システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＩＩ型システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＶ型システムである。

本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を改変することができる。当業者であれば、任意の特定の細胞において改変されるのに望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列の発現が障害に関連するかまたはさもなければ細胞内への病原体の進入を容易にする、任意のゲノム配列に対応してもよいことを容易に理解しよう。例えば、細胞において改変するのに望ましい標的ポリヌクレオチド配列は、疾患に関連する単一ポリヌクレオチド多型を含有するゲノム配列に対応するポリヌクレオチド配列であってもよい。かかる例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して、細胞において疾患に関連するＳＮＰを、それを野生型アレルと置き換えることによって補正することができる。別の例では、細胞内への病原体の進入または増殖の原因となる標的遺伝子のポリヌクレオチド配列が、標的遺伝子の機能を破壊して、病原体が該細胞に進入するかまたは該細胞の内部で増殖することを阻止するための欠失または挿入に向けた好適な標的であり得る。

一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳類ゲノム配列である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質、及びＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズすることができる少なくとも１～２つのリボ核酸を含む。本明細書で使用されるとき、「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって接合された一続きのアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸のポリマー）を指して互換的に使用され、修飾されたアミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）及びアミノ酸類似体を含む。例となるポリペプチドまたはタンパク質には、遺伝子産物、天然型タンパク質、ホモログ、パラログ、断片、ならびに上記のものの他の同等物、バリアント、及び類似体が含まれる。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換または修飾を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。一部の事例では、置換及び／または修飾は、細胞においてタンパク質分解を阻止もしくは低減する、及び／またはポリペプチドの半減期を延長することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合の置き換え（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素等）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然型アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替のアミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリン等）を含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ある部分（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピング等）を含めるような修飾を含み得る。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例となるＣａｓコアタンパク質には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、及びＣａｓ９が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ２）を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、及びＣａｓ５ｅが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ３）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＣｓｙ４が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ４）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ１）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、及びＣａｓ５ｄが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ７）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、及びＣａｓ５ｈが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ５）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、及びＣａｓ５ａが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（別名、ＣＡＳＳ６）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例となるＣａｓタンパク質には、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例となるＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質には、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、及びＣｍｒ６が含まれるが、これらに限定されない。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のＣａｓタンパク質のうちのいずれか１つまたはその機能的部分を含む。本明細書で使用されるとき、「機能的部分」または「機能断片」とは、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体化して、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドまたはタンパク質因子の一部分を指す。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。一部の実施形態では、機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ１２ａタンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。一部の実施形態では、機能的ドメインは、複合体を形成する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。

一部の実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過ポリペプチドまたは細胞透過ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用されるとき、「細胞透過ポリペプチド」及び「細胞透過ペプチド」とは、細胞内への分子の取り込みを容易にするポリペプチドまたはペプチドをそれぞれ指す。細胞透過ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電タンパク質（例えば、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を保有する）にコンジュゲートまたは融合され得る。かかる連結は、共有結合性であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が細胞を透過する能力を顕著に増加させるために、正に超陽性荷電したＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎｅｔａｌ．ＡＣＳＣｈｅｍＢｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞内へのその進入を容易にするためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例となるＰＴＤには、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、正に超陽性荷電したＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、正に超陽性荷電したＧＦＰに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技法によって達成され得る。好適な技法には、リン酸カルシウムまたは脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が含まれる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような修飾ＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような修飾ｍＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような修飾核酸（例えば、合成の修飾ｍＲＮＡ）によってコードされる。

本技術の方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズすることができる、任意のリボ核酸の使用を企図する。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも一方は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも一方は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、単一のリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、リボ核酸のうちの少なくとも一方は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者には理解されようが、本技術のリボ核酸は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択され得る。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるようにも選択され得る。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較したときに少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々が、標的モチーフ間に位置する変異アレルの両側に位置する、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。

一部の実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに導くとともにそれにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の反対の鎖上の配列には相補的でなく、及び／またはそれにはハイブリダイズしない。一部の実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。一部の実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体化される。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、修飾核酸によってコードされる。

本明細書に記載の遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な例となるｇＲＮＡ配列が、表１で提供される。これらの配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６／１８３０４１及び２０１６年３月２８日に出願されたＵＳ２０１６／０３４８０７３に見出すことができ、表、付録、及び配列表を含めた同文献の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

一部の態様では、該細胞は、非ＣＲＩＳＰＲベースの方法を使用して修飾される。一部の実施形態では、かかる方法には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ホーミングエンドヌクレアーゼ、配列特異的エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉、及びＲＮＡ誘導型トランスポザーゼが含まれるが、これらに限定されない。

「ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に典型的に由来する核酸結合ドメイン及び核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ、及びＦｏｋ－Ｉのような、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－Ｏｎｕｌまたはそれらの機能的バリアントのような、メガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい実施形態では、該ヌクレアーゼは、モノマーＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。モノマーＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載される操作されたＴＡＬ反復配列とｌ－ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合体等の、特異的認識及び切断のために二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復配列が、１２位及び１３位において核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である二残基（ＲＶＤ）を含む。類似のモジュール式塩基対塩基核酸結合特性（ｍｏｄｕｌａｒｂａｓｅ－ｐｅｒ－ｂａｓｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を有する結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）もまた、出願人によって最近発見された異なる細菌種における新たなモジュール式タンパク質に由来し得る。この新たなモジュール式タンパク質は、ＴＡＬ反復配列よりも大きな配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ及びＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴ、ならびにＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、必要不可欠なアミノ酸１２及び１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧに対するそれらの特異性を調節するため、ならびに特にこの特異性を強化するために、他のアミノ酸残基に向けて変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは、市販されている。

一部の実施形態では、該細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」とは、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、好ましくは配列特異的様態で、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／またはタンパク質に結合するタンパク質またはポリペプチドである。「ジンクフィンガー結合タンパク質」という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される場合が多い。個々のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、「フィンガー」と称される。ＺＦＰは、少なくとも１つのフィンガー、典型的には２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。各フィンガーは、ＤＮＡの２～４つの塩基対、典型的にはＤＮＡの３～４つの塩基対に結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的には、およそ３０アミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合サブドメインを含む。このクラスの単一のジンクフィンガーは、単一のベータターンの２つのシステイン残基とともに亜鉛と配位結合した２つの不変のヒスチジン残基を含むアルファヘリックスからなることが、研究により実証されている（例えば、Ｂｅｒｇ＆Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照されたい）。

一部の実施形態では、本開示の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。かかるホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さ１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は長さ１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本開示によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。場合によっては、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントである。

一部の実施形態では、本明細書に概説される細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄＢ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは、生細胞において固有の部位を切断し、それによって切断部位の近傍で遺伝子の標的化を１０００倍以上強化することができる（Ｐｕｃｈｔａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。

一部の実施形態では、記載される細胞は、寛容原性因子等のポリペプチドの発現をノックダウンする（例えば、減少させる、排除する、または阻害する）ためのＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法は、合成ＲＮＡｉ分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び当業者に認識される他の一過性ノックダウン法を利用するものを含む。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等を含めたＲＮＡｉのための試薬は、市販されている。例えば、多能性幹細胞において、細胞にＣＩＩＴＡｓｉＲＮＡを導入するかまたはＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ発現ウイルスを形質導入することによって、ＣＩＩＴＡをノックダウンすることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉を用いて、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される少なくとも１つの発現が低減または阻害される。

一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型トランスポザーゼを利用して、本明細書に記載される細胞のゲノム内にＤＮＡが組み込まれる。有用なＲＮＡ誘導型トランスポザーゼ及びその使用方法の詳細な説明は、例えば、Ｋｌｏｍｐｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５７１，２１９－２２５（２０１９）及びＳｔｒｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３６５，４８－５３（２０１９）に開示され、同文献の内容は参照により本明細書に援用される。

Ｈ．低免疫原性多能性幹細胞の生成
本開示は、低免疫原性多能性細胞の生産方法を提供する。一部の実施形態では、該方法は、多能性幹細胞を生成することを含む。マウス及びヒト多能性幹細胞（ｉＰＳＣと総称される；マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣ、またはヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣ）の生成は、一般に当該技術分野で既知である。当業者には理解されようが、ｉＰＳＣの生成のための様々な異なる方法が存在する。元々の誘導は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４の４つの転写因子のウイルスによる導入を使用してマウス胚性または成体線維芽細胞から行われた。ＴａｋａｈａｓｈｉａｎｄＹａｍａｎａｋａＣｅｌｌ１２６：６６３－６７６（２００６）を参照されたい（参照によりその全体が、特にその中で概説される技法に関して本明細書に援用される）。それ以来、いくつかの方法が開発されてきた。概観についてはＳｅｋｉｅｔａｌ，ＷｏｒｌｄＪ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ７（１）：１１６－１２５（２０１５）、及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙａｎｄＶｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ２０１３を参照されたく、同文献はいずれも、参照によりそれらの全体が、とりわけｈｉＰＳＣを生成するための方法（例えば、後者の参考文献の第３章を参照されたい）に関して本明細書に明示的に援用される。

一般に、ｉＰＳＣは、通常はエピソームベクターを使用して導入される、宿主細胞における１つまたは複数の再プログラミング因子の一過性発現によって生成される。これらの条件下では、少量の細胞が誘導されて、ｉＰＳＣとなる（一般に、このステップの効率は低いため、選択マーカーは使用されない）。ひとたび細胞が「再プログラミング」され、多能性となると、それらはエピソームベクター（複数可）を喪失し、内在性遺伝子を使用して当該因子を産生する。

同じく当業者には理解されようが、使用され得るまたは使用される再プログラミング因子の数は、様々であり得る。一般的に、より少数の再プログラミング因子が使用される場合、多能性状態への細胞の形質転換の効率、ならびに「多能性」は下がり、例えば、より少数の再プログラミング因子は、完全に多能性でないが、より少数の細胞種に分化することのみ可能であり得る細胞をもたらし得る。

一部の実施形態では、単一の再プログラミング因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つの再プログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ、すなわちＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０ＬＴ抗原から選択される５、６、または７つの再プログラミング因子が使用され得る。一般に、これらの再プログラミング因子遺伝子は、当該技術分野で既知であり、市販されているようなエピソームベクター上で提供される。

一般に、当該技術分野で既知であるように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載されるような再プログラミング因子を一過性で発現させることによって、限定されないが血液細胞、線維芽細胞等といった非多能性細胞から作製される。

Ｉ．低免疫原性表現型及び多能性の保持に関するアッセイ
ひとたび低免疫原性細胞が生成されると、それらは、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されるように、それらの低免疫原性及び／または多能性の保持に関してアッセイされてもよい。

一部の実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例として挙げられるようないくつかの技法を使用してアッセイされる。これらの技法は、同種他家宿主への移植、及び宿主免疫系を回避する低免疫原性多能性細胞の増殖（例えば、奇形腫）に対する監視を含む。一部の事例では、低免疫原性多能性細胞の誘導体が、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、次いで生物発光イメージングを使用して追跡され得る。同様に、かかる細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞応答が、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認するために試験される。Ｔ細胞機能は、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評定される。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはルミネックスを使用して評定される。追加としてまたは代替として、細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に一般に示されるように、それらが自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞による殺傷を回避する能力に関してアッセイされてもよい。

一部の実施形態では、細胞の免疫原性は、当業者に認識されるＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＴ細胞殺傷アッセイ等のＴ細胞イムノアッセイを使用して評価される。場合によっては、Ｔ細胞増殖アッセイは、細胞をインターフェロン－ガンマで前処置することと、細胞を標識したＴ細胞と共培養し、あらかじめ選択された一定時間後にＴ細胞集団（または増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることとを含む。場合によっては、Ｔ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞を本明細書に概説される細胞と共培養することと、Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することとを含む。

本明細書に概説される細胞の免疫原性を評定するために、インビボアッセイを実施することができる。一部の実施形態では、低免疫原性細胞の生存及び免疫原性は、同種他家ヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。一部の事例では、低免疫原性多能性幹細胞は、同種他家ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植され、細胞拒絶反応、細胞生存、及び奇形腫形成に関してアッセイされる。一部の事例では、移植された低免疫原性多能性幹細胞またはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。

細胞の低免疫原性を含めた免疫原性を決定するための追加の技法は、例えば、Ｄｅｕｓｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載され、図、図の凡例、及び方法の説明を含めたこれらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

同様に、多能性の保持は、いくつかの方式で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書に一般に記載されるとともに、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２９に示されるように、ある特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。追加としてまたは代替として、多能性細胞は、多能性の指標として１つまたは複数の細胞種に分化させられる。

当業者には理解されようが、多能性細胞におけるＭＨＣＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡＩ）の低減は、当該技術分野で既知であるとともに下記に記載されるような技法、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用した、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用したＦＡＣＳ技法を使用して、測定することができる。

加えて、ＨＬＡＩ複合体が細胞表面上で発現しないことを確認するために、細胞を試験することができる。これは、上記で考察したようなＨＬＡ細胞表面の１つまたは複数の構成要素に対する抗体を使用してＦＡＣＳ解析によってアッセイされてもよい。

多能性細胞またはその誘導体におけるＭＨＣＩＩ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡＩＩ）の成功裏の低減は、当該タンパク質に対する抗体を使用したウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技法、ＲＴ－ＰＣＲ技法等といった、当該技術分野で既知の技法を使用して測定することができる。

加えて、ＨＬＡＩＩ複合体が細胞表面上で発現しないことを確認するために、細胞を試験することができる。ここでもまた、このアッセイは、当該技術分野で既知であるように行われ（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１）、一般には、ヒトＨＬＡクラスＩＩＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づくウェスタンブロッティングまたはＦＡＣＳ解析のいずれかを使用して行われる。

ＨＬＡＩ及びＩＩ（またはＭＨＣＩ及びＩＩ）の低減に加えて、本明細書に概説される低免疫原性細胞は、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対して低減された感受性を有する。結果として生じる低免疫原性細胞は、１つまたは複数のＣＤ４７導入遺伝子の発現に起因して免疫マクロファージ及び自然経路を「回避する」。

Ｊ．低免疫原性多能性幹細胞の維持
ひとたび低免疫原性多能性幹細胞が生成されると、それらは、ｉＰＳＣの維持に関して既知であるように、未分化状態で維持され得る。例えば、細胞は、分化を防止するとともに多能性を維持する培養基を使用してマトリゲル上で培養され得る。加えて、それらは、多能性を維持するような条件下で培養基中にあることができる。

Ｋ．低免疫原性多能性幹細胞の分化
本技術は、対象へのその後の移植用に異なる細胞種に分化させられる低免疫原性多能性細胞を提供する。当業者には理解されようが、分化のための方法は、既知の技法を使用して所望の細胞種に依存する。細胞は、懸濁液中で分化させ、次いで細胞生存を容易にするためにマトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン／トロンビン形態等のゲルマトリックス形態に入れることができる。場合によっては、分化が、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされる。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処するために肝細胞に分化させられる。低免疫原性多能性細胞を肝細胞に分化させるために使用され得るいくつかの技法が存在する。例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ６９８：３０５－３１４（２０１１）、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂｅｔａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５１：２９７－３０５（２０１０）、及びＡｓｇａｒｉｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｖ（：４９３－５０４（２０１３）を参照されたく、同文献の全ては参照によりそれらの全体が、特に分化のための手法及び試薬に関して本明細書に明示的に援用される。分化は、一般にアルブミン、アルファフェトプロテイン、及びフィブリノゲンを含むがこれらに限定されない肝細胞関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされる。分化はまた、アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取り込み、ＩＣＧ取り込み及び放出、ならびにグリコーゲン貯蔵等、機能的に測定することもできる。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、Ｉ型真性糖尿病（ＴｌＤＭ）に対処するための移植用に膵臓ベータ様細胞または島オルガノイドに分化させられる。細胞システムは、ＴｌＤＭに対処するための有望な方法である。例えば、Ｅｌｌｉｓｅｔａｌ．，ｄｏｉ／１０．１０３８／ｎｒｇａｓｔｒｏ．２０１７．９３を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。追加として、Ｐａｇｌｉｕｃａらは、ヒトｉＰＳＣからのβ細胞の成功裏の分化に関して報告している（ｄｏｉ／１０．１０６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０４０を参照されたい（参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模生産について同文献で概説される方法及び試薬に関して本明細書に援用される）。さらに、Ｖｅｇａｓらは、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の生産、続いて宿主による免疫拒絶反応を回避するための封入について示している（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４０３０（参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模生産について同文献で概説される方法及び試薬に関して本明細書に援用される）。

分化は、一般にインスリンを含むがこれらに限定されないβ細胞関連または特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る。分化はまた、グルコース代謝の測定等、機能的に測定することもできる。一般に、Ｍｕｒａｒｏｅｔａｌ，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１６．０９．００２を参照されたい（参照によりその全体が、特に同文献で概説されるバイオマーカーに関して本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、視力を脅かす眼疾患に対処するために網膜色素上皮（ＲＰＥ）に分化させられる。ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ２０１４：２：２０５－１８に概説される技法を使用して、ＲＰＥ細胞に分化させられた（参照によりその全体が、特に分化技法及び試薬について同文献で概説される方法及び試薬に関して本明細書に援用される）。また、Ｍａｎｄａｉｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１６０８３６８も参照されたい（同じく参照によりその全体が、ＲＰＥ細胞のシートの生成及び患者への移植のための技法に関して援用される）。

分化は、一般にＲＰＥ関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る。例えば、Ｋａｍａｏｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１３．１２．００７を参照されたい（参照によりその全体が、特に結果の節の第１段落に概説されるマーカーに関して本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、心血管疾患に対処するために心筋細胞に分化させられる。ｈｉＰＳＣの心筋細胞への分化のための技法は、当該技術分野で既知である。分化は、一般に心筋細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る。例えば、Ｌｏｈｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０６．００１を参照されたい（参照によりその全体が、特に心筋細胞を含む幹細胞を分化させる方法に関して本明細書に援用される）。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するために新たな血管を形成させるための内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化させられる。内皮細胞への分化のための技法は、既知である。例えば、Ｐｒａｓａｉｎｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照されたい（参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞からの内皮細胞の生成のための方法及び試薬に関して、また移植技法に関して援用される）。分化は、一般に内皮細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る。

一部の実施形態では、低免疫原性多能性細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌することができる甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞オルガノイドに分化させられる。甲状腺細胞への分化のための技法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｋｕｒｍａｎｎｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１５．０９．００４を参照されたい（参照によりその全体が、特にヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞の生成のための方法及び試薬に関して、また移植技法に関して本明細書に明示的に援用される）。分化は、一般に甲状腺細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって、当該技術分野で既知であるようにアッセイされ得る。

低免疫原性多能性細胞を分化させるための方法の追加の説明は、例えば、Ｄｅｕｓｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に見出すことができる。

Ｌ．分化した低免疫原性細胞の投与
当業者には理解されようが、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞種及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当該技術分野で既知の技法を使用して移植することができる。一般に、概説される細胞は、患者において静脈内からまたは特定の箇所での注射によってのいずれかで移植することができる。特定の箇所で移植する場合、細胞は、それらが定着する間の分散を防止するためにゲルマトリックス中に縣濁させてもよい。

一部の実施形態では、外因性免疫抑制因子を条件付きで発現している幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供される。有用な実施形態では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供され、外因性ヒトＣＤ４７を条件付きで発現している幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む。

一部の実施形態では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法は、低免疫因子を条件付きで発現している幹細胞から生成された分化細胞を含む分化細胞の集団を投与することを含む。多くの実施形態では、分化細胞は、必須因子を条件付きで発現している幹細胞から生成される。

当業者には理解されようが、分化した低免疫原性多能性細胞誘導体は、細胞種及びこれらの細胞の最終的用途の両方に依存する当該技術分野で既知の技法を使用して移植することができる。一般に、本明細書に概説される細胞は、患者において静脈内からまたは特定の箇所での注射によってのいずれかで移植することができる。特定の箇所で移植する場合、細胞は、それらが定着する間の分散を防止するためにゲルマトリックス中に縣濁させてもよい。

Ｍ．例となる実施形態
１．免疫抑制因子の制御のための安全スイッチ
一部の態様では、細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的プロモーター）を含む核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって細胞の免疫原性を制御することとを含む。一部の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）の前に、操作された細胞を対象に投与することをさらに含む。

一部の実施形態では、該方法は、単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的プロモーター）を含む、単一の構築物を導入することを含む。一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列、プロモーター（例えば、構成的プロモーター）、及びトランス活性化因子エレメントを含む。

一部の実施形態では、第１の構築物は、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸を含み、第２の構築物は、トランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的プロモーター）を含む核酸を含む。

一部の実施形態では、該構築物の誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである。

一部の実施形態では、免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫抑制因子は、ＣＤ４７である。

一部の実施形態では、上述のプロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、該構築物の構成的プロモーターは、真核生物翻訳伸長因子１ α１（ＥＦ１Ａ）プロモーター、真核生物翻訳伸長因子１ α１短鎖型（ＥＦＳ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、修飾ニワトリβ－アクチンに融合されたＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧＳ）プロモーター（ＣＡＧプロモーターとも称される）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、コピアトランスポゾン（ＣＯＰＩＡ）プロモーター、アクチン５Ｃ（ＡＣＴ５Ｃ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥプロモーター）、修飾ニワトリβ－アクチンに融合されたＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＢｈ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含み、該外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、本明細書に概説される構築物のうちのいずれか１つは、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、単離された哺乳類細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、単離されたヒト細胞である。

一部の実施形態では、上述の単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、及び分化細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、分化細胞は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。

別の態様では、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列、構成的プロモーター、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物が本明細書で提供される。該構築物の一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである。

一部の実施形態では、該構築物の構成的プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、核酸または構築物はまた、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンも含む。

また、記載される構築物のうちのいずれか１つを含む単離された細胞を含む、組成物も本明細書で提供される。該組成物の一部の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露される。一部の実施形態では、上述の単離された細胞は、免疫抑制因子を外因的に発現するように操作される。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化する外因性因子の不在下で免疫抑制因子を過剰発現する。

また、本明細書に記載のいずれかの幹細胞を分化細胞の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物も提供される。一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）記載される組成物のうちのいずれか１つを患者に投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一部の態様では、細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、免疫抑制因子に作動可能に連結された誘導性デグロンエレメントをコードする核酸、または誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された免疫抑制因子をコードする核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、誘導性デグロンエレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一部の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）の前に、操作された細胞を対象へと投与することをさらに含む。一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、柔軟なリンカーによって免疫抑制因子に連結されている。

一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、免疫抑制因子のＮ末端にある。一部の実施形態では、誘導性デグロンエレメントは、免疫抑制因子のＣ末端にある。一部の実施形態では、記載される核酸の転写は、構成的プロモーター等のプロモーターによって制御される。一部の実施形態では、上記に概説される核酸を含む構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、該構築物における構成的プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、柔軟なリンカーは、（ＧＳＧ）_ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１）、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）からなる群から選択され、配列中、ｎは、１～１０である。

一部の実施形態では、免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫抑制因子遺伝子は、ＣＤ４７である。

一部の実施形態では、デグロンエレメントは、リガンド誘導性デグロンエレメント、ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される。

一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される。一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメントであり、外因性因子は、アスナプレビルである。

一部の実施形態では、該構築物は、セーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む。一部の実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。

一態様では、５’末端から３’末端に、プロモーター（例えば、構成的プロモーター）、誘導性デグロンエレメント、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び免疫抑制因子遺伝子を含む、構築物が本明細書で提供される。別の態様では、５’末端から３’末端に、プロモーター（例えば、構成的プロモーター）、免疫抑制因子遺伝子、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び誘導性デグロンエレメントを含む、構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、構成的プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、デグロンエレメントは、リガンド誘導性デグロンエレメント、ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される。一部の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される。ある特定の実施形態では、リガンド誘導性デグロンエレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメントである。

一部の実施形態では、該構築物は、ゲノム内セーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む。一部の実施形態では、ゲノム内セーフハーバー遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択される。

記載される構築物のうちのいずれか１つを含む単離された細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、単離された細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）記載される組成物のうちのいずれか１つを患者に投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性デグロンエレメントプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１の構築物、（ｉｉ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２の構築物、ならびに（ｉｉ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３の構築物を導入することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって細胞の免疫原性を制御することとを含む。一部の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）の前に、操作された細胞を対象に投与することをさらに含む。

一部の実施形態では、第３の構築物の誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔリプレッサーエレメント（Ｔｅｔ－Ｏｎトランス活性化因子とも称される）であり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、第１の構成的プロモーター、第２の構成的プロモーター、及び第３の構成的プロモーターは、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

別の態様では、細胞の免疫原性を制御するためのＤＮＡ標的ヌクレアーゼシステムを含む単離された細胞を含む、組成物が本明細書で提供され、該組成物は、（ａ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１のエレメントと、（ｂ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２のエレメントと、（ｃ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター（例えば、構成的プロモーター）、及び誘導性プロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３のエレメントとを含む。一部の実施形態では、該細胞の免疫原性は、トランス活性化因子エレメントの活性を誘導するための外因性因子に細胞を曝露した際に制御可能である。

一部の実施形態では、第３のエレメントの誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔリプレッサーエレメント（Ｔｅｔ－Ｏｎトランス活性化因子とも称される）であり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、該組成物の単離された細胞は、単離された哺乳類細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、単離されたヒト細胞である。

本明細書に記載の幹細胞のうちのいずれか１つを分化細胞の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

また、細胞療法を必要とする患者を処置する方法も提供され、該方法は、（ａ）本明細書に概説される組成物のうちのいずれか１つを投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、１つまたは複数の免疫抑制因子の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む修飾を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現は、外因性因子によって制御可能である。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子のタンパク質レベルを低減するための誘導性（または制御可能な）タンパク質分解システムを含む。一部の実施形態では、誘導性タンパク質分解システムは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子のＲＮＡレベルを制御可能に低減するためのＲＮＡ制御システムを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ制御システムは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現レベルを低減するためのＤＮＡ制御システムを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ制御システムは、組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される。一部の実施形態では、誘導性プロモーター発現システムは、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、心臓細胞特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、膵臓細胞特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、免疫細胞特異的プロモーター、間葉系細胞特異的プロモーター、及び内皮細胞特異的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、分子制御型リボスイッチシステムは、テオフィリン制御型リボスイッチまたはグアニン制御型リボスイッチを含む。

一部の実施形態では、誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムは、１つまたは複数の免疫抑制因子を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲゲノム編集、誘導性ＴＡＬＥＮゲノム編集、誘導性ＺＦＮゲノム編集、及び低分子向上型ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集からなる群から選択される１つを含む。

一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫抑制因子は、ＣＤ４７である。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。一部の実施形態では、単離された哺乳類細胞または単離されたヒト細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

本明細書に概説されるいずれかの幹細胞を分化細胞の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

また、細胞療法を必要とする患者を処置する方法も提供され、該方法は、（ａ）本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することと、（ｂ）組成物を、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現を制御するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子（例えば、免疫シグナル伝達タンパク質）の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の発現は、外因性因子によって制御可能である。

一部の実施形態では、条件付き発現のためのシステムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のタンパク質レベルを増加させるために誘導される誘導性安定化システムを含む。誘導性タンパク質安定化システムは、リガンド誘導性タンパク質安定化システム及び低分子誘導性タンパク質安定化システムを含む。

一部の実施形態では、条件付き発現のためのシステムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のＲＮＡレベルを増加させるためのＲＮＡ制御システムを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ制御システムは、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを含む。

一部の実施形態では、条件付き発現のためのシステムは、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の発現レベルを増加させるためのＤＮＡ制御システムを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ制御システムは、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システム、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び分子制御型リボスイッチシステムからなる群から選択される１つを含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、心臓細胞特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、膵臓細胞特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、免疫細胞特異的プロモーター、間葉系細胞特異的プロモーター、及び内皮細胞特異的プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、ＴｅｔＯｎシステムを含む。一部の実施形態では、分子制御型リボスイッチシステムは、テオフィリン制御型リボスイッチまたはグアニン制御型リボスイッチを含む。

一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子は、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＡ（ＭＩＣ－Ａ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＢ（ＭＩＣ－Ｂ）、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンドからなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。一部の実施形態では、単離された哺乳類細胞または単離されたヒト細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

本明細書に記載のいずれかの幹細胞を分化細胞の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

また、細胞療法を必要とする患者を処置する方法も提供され、該方法は、（ａ）本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つを患者に投与することと、（ｂ）組成物を、１つまたは複数の免疫抑制因子の発現を制御するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

一態様では、細胞の免疫原性を制御するための方法が本明細書で提供され、該方法は、（ａ）単離された細胞を得ることと、（ｂ）単離された細胞に、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、プロモーター（例えば、構成的プロモーター）、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む核酸構築物を導入して、操作された細胞を生産することと、（ｃ）操作された細胞を、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって細胞の免疫原性を制御することとを含む。一部の実施形態では、該方法は、ステップ（ｃ）の前に、操作された細胞を対象に投与することをさらに含む。

別の実施形態では、細胞の免疫原性を制御するための方法は、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的プロモーター）を導入して、操作された細胞を生産することを含む。

なおも別の実施形態では、細胞の免疫原性を制御するための方法は、（ｂ）単離された細胞に、（ｉ）免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーター（例えば、構成的プロモーター）を含む、単一の構築物を導入して、操作された細胞を生産することを含む。

一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＴＲＥプロモーターであり、トランス活性化因子エレメントは、Ｔｅｔ－Ｏｎエレメントであり、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ／Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、及びＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３）からなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＴＲＥプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔ－Ｏｎエレメントを含み、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＴＲＥプロモーター、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔ－Ｏｎエレメントを含み、外因性因子は、テトラサイクリンまたはその誘導体である。

一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、低免疫原性である。

また、５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、構成的プロモーター、及び誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物も本明細書に記載される。一部の実施形態では、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＴＲＥプロモーターである。

一部の実施形態では、免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ／Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、及びＮＫＧ２Ｄのリガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、及びＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３）からなる群から選択される。一部の実施形態では、免疫シグナル伝達因子は、Ｂ２Ｍである。

一部の実施形態では、該構築物は、５’末端から３’末端に、ＴＲＥプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む。

一部の実施形態では、概説される構築物のうちのいずれか１つは、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンを含む。

記載される構築物のうちのいずれか１つを含む単離された細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、単離された細胞は、トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露される。一部の実施形態では、単離された細胞は、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される。

別の態様では、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供され、該方法は、（ａ）記載される組成物のうちのいずれか１つを患者に投与することと、（ｂ）組成物を、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって組成物の細胞の免疫原性を制御することとを含む。

また、免疫抑制因子（例えば、低免疫因子及び補体インヒビター）を制御可能に過剰発現する、操作されたｉＰＳＣも本明細書で提供される。とりわけ、低免疫から抜け出すための機構は、感染または対象間の細胞伝播に対する安全機能として必要とされる。一実施形態では、免疫抑制因子の制御された発現は、免疫抑制因子をノックダウンするためのｓｈＲＮＡの誘導性発現によって達成される。別の実施形態では、制御された発現は、プロテアソーム分解に向けて免疫抑制因子を標的化する、低分子ベースのデグロンシステムを使用して達成される。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメントを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメントを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびにＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびにＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該誘導性タンパク質分解システムは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該誘導性タンパク質分解システムは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される。

さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該ＲＮＡ制御システムは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該ＲＮＡ制御システムは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される。

さらなる実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該ＤＮＡ制御システムは、組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される。

さらなる実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、該ＤＮＡ制御システムは、組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される。

一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７の発現を調節する（例えば、減少させる）ための誘導性システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、ならびにＣＤ４７の発現を調節する（例えば、減少させる）ための誘導性システムを含む、多能性幹細胞が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、本明細書に概説される多能性幹細胞のうちのいずれか１つに由来する分化細胞が本明細書で提供される。一部の実施形態では、分化細胞は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される。

一部の実施形態では、本技術は、免疫抑制因子のＤＮＡ下方制御、免疫抑制因子のＲＮＡ下方制御、免疫抑制因子のタンパク質下方制御、免疫シグナル伝達因子のＤＮＡ上方制御、免疫シグナル伝達因子のＲＮＡ上方制御、及び免疫シグナル伝達因子のタンパク質上方制御のためのシステム等の「安全スイッチ」を含む、低免疫原性多能性細胞を提供する。これらは、低免疫原性多能性細胞または低免疫原性分化細胞がレシピエント対象及び生着部位において望まれない様態で増殖及び分裂するようなことがあれば、それらの細胞の死を引き起こすことができる、「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。一部の実施形態では、本技術はまた、ＥＧＦＲｔ、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ｉＣａｓｐａｓｅ９、及びＮＴＲから選択される自殺遺伝子の利用も含む。

２．安全スイッチ及び免疫抑制因子の共依存性
一態様では、５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（３）低免疫遺伝子を含む、構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、該構築物はまた、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び低免疫遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列も含む。一部の実施形態では、該構築物のうちのいずれかはまた、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンも含む。

別の態様では、５’から３’末端に、（１）低免疫遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、該構築物はまた、低免疫遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び安全スイッチ導入遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列も含む。一部の実施形態では、該構築物のうちのいずれかはまた、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンも含む。

該構築物の一部の実施形態では、転写制御エレメントは、真核生物翻訳伸長因子１ α１（ＥＦ１Ａ）プロモーター、真核生物翻訳伸長因子１ α１短鎖型（ＥＦＳ）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター（ＣＭＶプロモーター）、修飾ニワトリβ－アクチンに融合されたＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧＳ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、コピアトランスポゾン（ＣＯＰＩＡ）プロモーター、アクチン５Ｃ（ＡＣＴ５Ｃ）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーターエレメント（ＴＲＥプロモーター）、修飾ニワトリβ－アクチンに融合されたＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＢｈ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターからなる群から選択される。

構築物を単離された細胞内に送達する方法が本明細書で提供される。該方法は、単離された細胞に、上述の構築物のうちのいずれかを含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を保有する操作された細胞を選択することとを含む。

また、上述の構築物のうちのいずれかを含む、単離された細胞またはその集団も提供される。

一部の実施形態では、該構築物は、標的遺伝子座に導入されている。

一部の実施形態では、標的遺伝子座は、セーフハーバー遺伝子座及び免疫シグナル伝達遺伝子座からなる群から選択される。

一部の実施形態では、免疫シグナル伝達遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。特定の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性である。

上述の幹細胞のうちのいずれか１つを分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

追加として、患者に、概説されるような分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書に記載される。

本明細書に記載されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、患者を処置する方法が本明細書で提供される。

一部の態様では、５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

一部の態様では、５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む。ある特定の実施形態では、２Ａコード配列は、表２に示されるもの等の、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。

一部の実施形態では、リンカーは、表３にあるいずれか１つから選択される。

別の態様では、セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書で提供され、請求項２９～３９のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の内在性セーフハーバー遺伝子座内に組み換えられているか、または請求項３０～３９のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の内在性標的遺伝子座内に組み換えられている。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性である。

また、上述の幹細胞のうちのいずれか１つを分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団も提供される。

また、患者に、概説されるいずれかの分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法も提供される。

また、本明細書に記載されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、患者を処置する方法も本明細書で提供される。

一部の態様では、５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、低免疫因子または遺伝子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される。

一部の実施形態では、標的遺伝子座は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座である。

一部の実施形態では、標的遺伝子座は、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である。

単離された細胞またはその集団が本明細書で提供され、上記の構築物のうちのいずれか１つは、細胞において標的遺伝子の発現を妨害するように内在性標的遺伝子内に組み込まれている。

一部の実施形態では、該構築物は、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼ標的部位にて標的遺伝子内に組み込まれている。一部の実施形態では、標的遺伝子の両方のアレルが、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼによる標的化によって破壊される。

また、単離された細胞に、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を保有する操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法も提供される。

他の態様では、記載される構築物のうちのいずれか１つは、細胞において標的遺伝子の発現を妨害するように内在性標的遺伝子内に組み込まれる。一部の実施形態では、該構築物は、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼ標的部位にて標的遺伝子内に組み込まれる。

なおも別の態様では、本開示は、（１）低免疫因子、及び（２）低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を提供する。

一部の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

一部の実施形態では、ＣＤ２０エピトープは、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＣＲ４エピトープは、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＨＥＲ２エピトープは、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ１９エピトープは、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＭＵＣ１エピトープは、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＥＧＦＲエピトープは、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＧＤ２エピトープは、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＰＳＭＡエピトープは、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、ＣＤ３０エピトープもしくはＣＤ１６エピトープは、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、またはＣＤ２０エピトープもしくはＣＤ１６エピトープは、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される。

一部の実施形態では、低免疫因子は、融合タンパク質のＮ末端にある。他の実施形態では、ペプチドエピトープは、融合タンパク質のＮ末端にある。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、低免疫因子及びペプチドエピトープをつなげるリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する別のリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表２にあるいずれか１つから選択される。

別の態様では、（１）低免疫因子をコードする配列、及び（２）低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質をコードする構築物が提供される。

該構築物の一部の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物のペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

一部の実施形態では、低免疫因子をコードする配列は、ペプチドエピトープをコードする配列の５’にある。一部の実施形態では、ペプチドエピトープをコードする配列は、低免疫因子をコードする配列の５’にある。

一部の実施形態では、該構築物は、低免疫因子をコードする配列及びペプチドエピトープをコードする配列をつなげるリンカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する別のリンカーをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、表２にあるいずれか１つである。

一部の実施形態では、該構築物は、表４に示されるもの等の、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む。

一部の実施形態では、該構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。

さらなる実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンを含む。

単離された細胞に、上述のいずれかの構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、低免疫因子－ペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が本明細書で提供される。

追加として、上述のいずれかの構築物を含む、単離された細胞またはその集団が本明細書に記載される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、単離されたヒト細胞である。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性である。

本明細書に概説されるいずれかの幹細胞を分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書で提供される。

一部の態様では、患者に、上記に概説されるようないずれかの分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。

一態様では、上記に概説されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片、（２）第１のリンカー、（３）異種ペプチドエピトープ（例えば、異種ヒトペプチドエピトープ）、（４）第２のリンカー、及び（５）ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインを含む、組換えＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質を提供する。

融合タンパク質の一部の実施形態では、ＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７を含む。一部の実施形態では、ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインは、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む。

一部の実施形態では、融合タンパク質の第１のリンカー及び第２のリンカーは、表２にあるいずれか１つから選択される。

一部の実施形態では、融合タンパク質のペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

別の態様では、５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）ＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列、（３）第１のリンカー、（４）異種ペプチドエピトープ（例えば、異種ヒトペプチドエピトープ）をコードする配列、（５）第２のリンカー、ならびに（６）膜貫通型ドメイン及びＣ末端を含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列を含む、構築物が提供される。

該構築物の一部の実施形態では、ＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７を含む。一部の実施形態では、膜貫通型ドメイン及びＣ末端を含むヒトＣＤ４７断片は、ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む。一部の実施形態では、第１のリンカー及び第２のリンカーは、表２にあるいずれか１つから選択される。一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される。

一部の実施形態では、該構築物の転写制御エレメントは、表４に示されるもの等の、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

一部の態様では、単離された細胞に、上述のいずれかの構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、ＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が提供される。

一部の態様では、上記に概説される構築物を含む、単離された細胞またはその集団が提供される。

ある特定の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。他の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、該細胞は、低免疫原性である。

一部の態様では、上記に概説される幹細胞を分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書に記載される。

一部の態様では、患者に、本明細書に記載されるような分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。

一態様では、本明細書に記載されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

なおも別の態様では、５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）ペプチドエピトープ（例えば、表面に露出したペプチドエピトープ）をコードする配列、（３）リボソームスキッピング配列、及び（４）低免疫因子をコードする配列を含む、バイシストロン性構築物が提供される。

バイシストロン性構築物の一部の実施形態では、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

バイシストロン性構築物の一部の実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む。

一部の実施形態では、２Ａコード配列は、表２に示されるもの等の、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される。

一部の実施形態では、転写制御エレメントは、表４に示されるもの等の、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

一部の実施形態では、バイシストロン性構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。ある特定の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む。

一部の実施形態では、単離された細胞に、上記に概説される構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、低免疫因子及びペプチドエピトープを発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法が本明細書で提供される。

一部の態様では、上記に概説される構築物を含む、単離された細胞またはその集団が記載される。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性である。

一部の態様では、上記に概説されるような幹細胞を分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が本明細書に記載される。

一部の態様では、患者に、概説されるような分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が記載される。

一態様では、概説されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、処置方法が記載される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、安全スイッチ導入遺伝子、ならびに低免疫遺伝子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、安全スイッチ導入遺伝子の発現が、低免疫遺伝子の発現を調節する。

Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、安全スイッチ導入遺伝子、ならびに低免疫遺伝子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、安全スイッチ導入遺伝子の発現が、低免疫遺伝子の発現を調節する。

ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、安全スイッチ、ならびに低免疫因子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、安全スイッチの発現が、低免疫因子の発現を調節する。

Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現、安全スイッチ、ならびに低免疫因子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、安全スイッチの発現が、低免疫因子の発現を調節する。

ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ならびに表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ３０エピトープ、及びＣＤ１６エピトープからなる群から選択され、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、ＣＤ４７の過剰発現を含み、また表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含む、多能性幹細胞が本明細書で提供され、ペプチドエピトープは、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択され、低免疫因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される。

３．安全スイッチ及び必須細胞因子の共依存性
一態様では、５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、ならびに（３）必須細胞因子遺伝子を含む、構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、該構築物は、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び必須細胞因子遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列をさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。他の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンを含む。

一部の態様では、５’から３’末端に、（１）必須細胞因子遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、及び（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、該構築物は、必須細胞因子遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び安全スイッチ導入遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列をさらに含む。一部の実施形態では、該構築物は、ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む。他の実施形態では、該構築物は、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンを含む。

一態様では、５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

別の態様では、５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）必須細胞因子遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）安全スイッチ導入遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

一態様では、５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、免疫シグナル伝達内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

一態様では、５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）必須細胞因子遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）安全スイッチ導入遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、免疫シグナル伝達内への相同性指向修復のための構築物が本明細書で提供される。

一部の態様では、５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）必須細胞因子遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が本明細書で提供される。

一態様では、５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）必須細胞因子遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）安全スイッチ導入遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物が本明細書で提供される。

一部の態様では、本明細書に記載の共発現構築物のうちのいずれかの一部としての必須遺伝子の発現に生存が依存する、単離された細胞が本明細書で提供される。一部の実施形態では、単離された細胞またはその集団は、組換え必須細胞因子及び安全スイッチを含み、内在性の必須細胞因子遺伝子が不活性化（切除等）されている。一部の実施形態では、単離された細胞は、必須細胞因子遺伝子のホモ接合型ノックアウトである。一実施形態では、必須細胞因子導入遺伝子及び安全スイッチ導入遺伝子は、レンチウイルス送達を経て、単離された細胞に導入される。別の実施形態では、必須細胞因子導入遺伝子及び安全スイッチ導入遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座に導入される。

一部の実施形態では、記載される細胞のうちのいずれかは、内在性遺伝子座から必須細胞因子を発現することができない。一部の実施形態では、必須遺伝子座を切断及び不活性化し、それによって細胞の生存を、共発現構築物の一部としての必須遺伝子の発現に依存させる、標的化ヌクレアーゼ（本明細書に記載されるもの等）が本明細書で提供される。

また、安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されているリンカーをコードする配列に作動可能に連結された必須細胞因子遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団も本明細書で提供される。一部の実施形態では、安全スイッチは、必須細胞因子遺伝子の内在性遺伝子座に直接連結されている。かかる事例では、必須細胞因子の発現は、未修飾である。

該構築物、該細胞、及び該方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ３０導入遺伝子、及びＣＤ１６導入遺伝子からなる群から選択される。

他の実施形態では、安全スイッチ導入遺伝子は、ナトリウム／ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）をコードする。ＮＩＳ特異的放射性同位体（例えば、Ｉ－１２５及びＩ－１３１）を使用して、ＮＩＳ発現細胞を標的化し、殺傷することができる。

該構築物、該細胞、及び該方法の一部の実施形態では、必須細胞因子は、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される。

該構築物、該細胞、及び該方法の一部の実施形態では、必須細胞因子は、機能的ゲノムスクリーンに基づいて必須遺伝子として特定される群から選択される。

該構築物のうちのいずれも、当業者に認識される方法に従って、単離された細胞に導入され得る。

一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された細胞は、自家または同種他家細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、単離された哺乳類細胞である。一部の実施形態では、単離された細胞は、単離されたヒト細胞である。

患者に、概説される細胞のうちのいずれかを投与することを含む、細胞ベースの療法を必要とする患者を処置する方法が本明細書に記載される。

一部の態様では、（１）転写制御エレメント、（２）必須細胞因子遺伝子、（３）転写後または翻訳後制御エレメント、及び（４）ポリアデニル化配列を含む、構築物が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、転写後制御エレメントは、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるＲＮＡ制御システムである。

一部の実施形態では、翻訳後制御エレメントは、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される誘導性タンパク質分解システムである。

別の態様では、転写後または翻訳後制御エレメントの制御下にある組換え必須細胞因子を含む、単離された細胞が本明細書で提供され、内在性の必須細胞因子遺伝子が不活性化され、組換え必須細胞因子の発現が外因性因子によって制御可能である。

一部の実施形態では、単離された細胞は、単離されたヒト細胞である。一部の実施形態では、単離されたヒト細胞は、自家細胞または同種他家細胞である。

一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾の細胞と比較してＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＣＩＩＴＡの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、Ｂ２Ｍの欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、ＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む。一部の実施形態では、単離された細胞は、低免疫原性である。

また、本明細書に記載されるような分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において制御性を活性化することを含む、患者を処置する方法も本明細書で提供される。

一態様では、（１）必須細胞因子、及び（２）必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質が本明細書で提供される。

一部の実施形態では、必須細胞因子は、融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態では、ペプチドエピトープは、融合タンパク質のＮ末端にある。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、必須細胞因子及びペプチドエピトープをつなげるリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する別のリンカーをさらに含む。

一部の態様では、（１）必須細胞因子をコードする配列、及び（２）必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質をコードする構築物が本明細書で提供される。

該構築物の一部の実施形態では、必須細胞因子をコードする配列は、ペプチドエピトープをコードする配列の５’にある。ある特定の実施形態では、ペプチドエピトープをコードする配列は、必須細胞因子をコードする配列の５’にある。

一部の実施形態では、該構築物は、必須細胞因子をコードする配列及びペプチドエピトープをコードする配列をつなげるリンカーをコードする配列をさらに含む。

一部の実施形態では、該構築物は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する別のリンカーをコードする配列をさらに含む。

一部の実施形態では、該構築物は、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む。

また、単離された細胞に、本明細書に概説される構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している操作された細胞を選択することとを含む、構築物を単離された細胞内に送達する方法も本明細書で提供される。

また、上述の構築物を含む、単離された細胞またはその集団も本明細書で提供される。

一態様では、本明細書に記載の幹細胞を分化細胞またはその集団の生産のための分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団が提供される。一部の実施形態では、分化条件は、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切である。

一部の態様では、患者に、上述の分化細胞またはその集団を投与することを含む、細胞療法を必要とする患者を処置する方法が提供される。

また、本明細書に概説される分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、患者を処置する方法も記載される。一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する。

ＩＶ.実施例
Ａ．実施例１：ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡを使用したＣＤ４７下方制御
この実施例は、レンチウイルス形質導入によって導入されたＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡの生成及び評定を説明する。

低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ヘアピン構造を含むＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡ分子は、細胞内でプロセシングされてｓｉＲＮＡを形成し、これが今度は遺伝子発現をノックダウンする。次いで、この産物がプロセシングされ、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。プロセシングされたｓｈＲＮＡは、相補的配列を有するｍＲＮＡにＲＩＳＣを導く。ＣＤ４７ｍＲＮＡに完全に相補的である場合、ＲＩＳＣはそのｍＲＮＡを切断し、それによって遺伝子の発現をサイレンシングする。マウス及びヒトＣＤ４７ｍＲＮＡを標的とするように誘導性ｓｈＲＮＡライブラリーを設計し、それにより、低分子によるｓｈＲＮＡ発現の誘導時に、ＣＤ４７発現が下方制御されるようにした。

誘導性レンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物：誘導性レンチウイルスベクター構築物を生成するために、ｐＲＳＩＴ第３世代レンチウイルスプラスミドをバックボーンとして使用した。ｓｈＲＮＡ－ＥＦ１ａ－Ｔｅｔリプレッサー－２Ａ－ＴａｇＧＦＰ－２Ａ－ハイグロマイシンを含有するカセットを、堅牢なｓｈＲＮＡ発現を可能にするＵ６ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのｔｅｔ誘導性誘導体である、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターの下流に組み込んだ（図１を参照されたい）。Ｔｅｔリプレッサー配列は、ドキシサイクリン誘導剤に対してより高い感受性を示すように進化した、修飾Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇトランス活性化因子である。Ｔｅｔリプレッサーを、Ｔ２ＡペプチドによりＴａｇＧＦＰ及び選択用のハイグロマイシンに融合した。マウスＣＤ４７を標的とするかかる構築物を１０個、及びヒトＣＤ４７を標的とする構築物を１０個設計した。

ウイルス産生及び細胞の形質導入：ウイルス粒子の産生のために、ＨＥＫ２９３ＬＸ細胞（Ｔａｋａｒａ）を５×１０^５で１０ｃｍディッシュにプレートした。プレートから２４時間後、細胞に、ポリブレンを使用して以下のプラスミドをトランスフェクトした：ＶＳＶ－Ｇでシュードタイピングした１．５μｇのベクター、空のバックボーン、ＨＩＶ－１ｐｏｌ、ＨＩＶ－１ｇａｇ、ＨＩＶ－１Ｒｅｖ、ＨＩＶ－１Ｔａｔ、ＡｍｐＲプロモーター、及びＳＶ４０プロモーターを含有する３．２μｇのパッケージングプラスミド（ｐｓＰＡＸ２）、ならびにＵ６Ｔｅｔ－ｓｈＲＮＡ－ＥＦ１ａ－Ｔｅｔリプレッサー－２Ａ－ＴａｇＧＦＰ－２Ａ－ハイグロマイシンカセットを含有する５．２μｇの上述のレンチウイルス移入ベクター。トランスフェクションから４８時間後、ウイルス上清を収集し、０．４５μｍフィルターに通して濾過した。

低免疫細胞株の操作：ＣＤ４７下方制御に向けた標的細胞は、寛容原性因子ＣＤ４７を発現するように修飾された幹細胞（例えば、多能性幹細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））（マウスまたはヒト）である。ヒトｉＰＳＣは、２つの遺伝子修飾ステップを経る。第１のステップでは、ヒトＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子を、ＳｐＣａｓ９及びこれら２つの遺伝子を標的とするガイドＲＮＡによりノックアウトする。ヒトＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子ノックアウト細胞及び方法の詳細な説明は、例えば、２０１５年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１及び２０１８年１月１４日に出願されたＷＯ２０１８１３２７８３に見出すことができ、配列表及び図を含めたこれらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。一部の事例では、マウスまたはヒトＣＤ４７の過剰発現は、レンチウイルス形質導入により２０のＭＯＩで、伸長因子１α短鎖（ＥＦＳ）プロモーター及びＣＤ４７遺伝子及びピューロマイシンを安定に組み込むことによって達成される。

ｓｈＲＮＡによる細胞株の形質導入及びドキシサイクリン処理：５×１０^５個の上述のｉＰＳＣを６ウェルプレートにプレートし、翌日、ウイルス上清を含有する２ｍｌの培地及び１０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンとともに８００ｒｐｍで３０分間スピンすることによって形質導入する。翌日、培地を交換する。４８時間後、細胞を継代し、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理する。ドキシサイクリンを含有する培地を調製し、２日毎に交換する。３日後、形質導入効率をフローサイトメトリーによってＣＤ４７発現に基づいて測定する。

フローサイトメトリーによるＣＤ４７発現解析：インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ４７の表面発現を検出するためにＡｌｅｘａ－６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体で染色する。より具体的には、１×１０^６個の細胞を採取し、１００μｌの細胞染色バッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させ、５μｌのＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ＣＤ４７抗体とともに氷上で３０分間インキュベートする。細胞を細胞染色バッファー中で洗浄し、その後、フローサイトメトリーによって解析する。

図１は、ｓｈＲＮＡ番号５の９８％のノックダウン効率を示す、マウスＣＤ４７を発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞株におけるデータを図示する。

Ｂ．実施例２：低分子の添加に応答したＣＤ４７分解
この実施例は、標的ＣＤ４７分解のための、ＣＤ４７に融合された自己切断可能なＳＭＡＳＨデグロン及びＣＤ４７に融合された誘導性リガンド誘導分解（ＬＩＤ）ドメインの生成及び評定を説明する。

１．ＳＭＡＳＨデグロンを使用したＣＤ４７分解
ＳＭＡＳＨシステムにおいて、分解は、低分子誘導剤アスナプレビルによって誘導される。低免疫原性誘導多能性（ＨＩＰ）細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座内への、ＳＭＡＳＨタグ及びリンカーを含むように修飾されたＣＤ４７のＨＤＲ送達のための方法が本明細書に記載される。また、ＳＭＡＳＨタグ構築物の設計、及びＣＤ４７の分解を誘導するための低分子処理についての例となる方法も記載される。

低分子補助遮断、すなわちＳＭＡＳＨは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非構造タンパク質３（ＮＳ３）のプロテアーゼ及びＮＳ４Ａタンパク質におけるエレメントを使用して、臨床試験されたＨＣＶプロテアーゼ阻害剤により、ＳＭＡＳＨタグに融合されたＣＤ４７タンパク質の発現を有効に遮断するシステムである（図２）。プロテアーゼ阻害剤（アスナプレビル）の不在下では、隠れたデグロン配列が切除され、未修飾の遺伝子産物をもたらす。アスナプレビルの添加により、ＮＳ３プロテアーゼは阻害されて、デグロン配列に融合された新たに合成されたＣＤ４７タンパク質の分解を引き起こす。

デグロン構築物：相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナー鋳型を生成するために、ｐＳＦプラスミドをバックボーンとして使用する。ＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）及びヒトＣＤ４７遺伝子に融合されたＳＭＡＳＨを含有するカセットを、ＡＡＶＳ１ゲノム内セーフハーバー遺伝子座に対する２つの１０００ｂｐの相同性アーム間に挿入する（図３Ａ）（これ以降、ＡＡＶＳ１－ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７－ＡＡＶＳ１ドナー鋳型と称される）。ＥＦＳは、ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７構築物の強力な発現を駆動する構成的プロモーターである。ＳＭＡＳＨタグの設計（例えば、Ｃｈｕｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔ．ＣｈｅｍＢｉｏ，２０１５，１１：７１３－７２０を参照されたい）は、ＮＳ３プロテアーゼ－ＮＳ４ＡカセットがＣＤ４７のＮ末端にて隠れたデグロンに融合されており、プロテアーゼ認識配列の切断を介してそれ自体を除去することができるようなものである。

二重ノックアウト操作：ＣＤ４７下方制御に向けた標的細胞は、ＭＨＣ分子クラスＩ及びＩＩを発現しないように修飾された幹細胞（例えば、多能性幹細胞または人工多能性幹細胞）である。ヒトｉＰＳＣは、２つの遺伝子修飾ステップを経る。第１のステップでは、ヒトＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子を、ＳｐＣａｓ９及びこれら２つの遺伝子を標的とするガイドＲＮＡによりノックアウトする。ヒトＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ二重ノックアウト細胞及び方法の詳細な説明は、例えば、２０１５年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１及び２０１８年１月１４日に出願されたＷＯ２０１８１３２７８３に見出すことができ、配列表及び図を含めたこれらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ二重ノックアウト細胞は、当業者に認識される標準的方法に従って培養する。

二重ノックアウトヒトｉＰＳＣのリボ核タンパク質ヌクレオフェクション：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックアウトに次いで、ＣＤ４７の過剰発現を、ＣＬＹＢＬゲノム内セーフハーバー遺伝子座、またはＡＡＶＳ１もしくはＣＣＲ５等の他の周知のゲノム内セーフハーバー遺伝子座内へのＣＬＹＢＬ－ＣＡＧ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７－ＣＬＹＢＬカセットのノックインによって達成する（図３Ｂ）。ＣＬＹＢＬ－ＣＡＧ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７－ＣＬＹＢＬプラスミドは、ＢｓｔＢＩによる制限消化によって最初に線状化する。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ミックスを以下のように調製する：２５ｐｍｏｌのＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を７５ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ及び１～２ｕｇの線状化ドナープラスミドとともにして５μｌの最終体積とする。次いで、１×１０^６個のｉＰＳＣをアクターゼにより解離させ、２０μｌのＰ３ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）及びＲＮＰミックス中に再懸濁させる。ＤＮ－１００またはＣＡ－１３７プログラムを使用して細胞をヌクレオフェクトし（ＬｏｎｚａＡｍａｘａヌクレオフェクター）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ＋ＣｌｏｎｅＲ中に回収し、ビトロネクチンでコーティングした２４ウェルプレート上にプレートする。１０日後、編集されたバルク集団を、Ａｌｅｘａ－６４７、ＰＥ、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体により高ＣＤ４７発現に関して分取する（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａまたはＨａｎａのシングルセルプリンター）。

アスナプレビル処理及びＣＤ４７下方制御：分取した細胞を約１～３μＭのアスナプレビルで処理する。アスナプレビルを含有する培地を調製し、約２日毎に交換する。１日後、次いで３日後、一部の実施形態では、形質導入効率をフローサイトメトリーによってＣＤ４７発現に基づいて測定する。

ＣＤ４７発現解析：インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＣＤ４７の表面発現を検出するためにＡｌｅｘａ－６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体で染色する。より具体的には、１×１０^６個の細胞を採取し、１００μｌの細胞染色バッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中に再懸濁させ、５μｌのＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ＣＤ４７抗体とともに氷上で３０分間インキュベートする。細胞を細胞染色バッファー中で洗浄し、その後、フローサイトメトリーによって解析する。

２．ＳＭＡＳＨを使用したＣＤ４７分解の評定
ＳＭＡＳＨシステムがＣＤ４７分解を促進する能力を評定するために、以下の発現カセットを含有する発現構築物を作製した：ａ）ＳＭＡＳＨタグをコードする核酸に融合されたヒトＣＤ４７遺伝子に作動可能に連結されたＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）（ＥＦＳ－ＣＤ４７－ＳＭＡＳＨ、図４、上を参照されたい）、及びｂ）ヒトＣＤ４７遺伝子単独に作動可能に連結されたＥＦＳプロモーターを含有する対照（ＥＦＳ－ＣＤ４７）。レンチウイルス形質導入によってｉＰＳＣにＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７発現カセットまたは対照ＥＦＳ－ＣＤ４７発現カセットのいずれかを形質導入した。ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７を形質導入された細胞、ＥＦＳ－ＣＤ４７を形質導入された細胞、及び野生型対照細胞を０～１０μＭのアスナプレビルの存在下で４８時間インキュベートし、上記で説明したように、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４７発現を評定した。図４（下）に示されるように、ＥＦＳ－ＳＭＡＳＨ－ＣＤ４７を形質導入された細胞は、アスナプレビルの用量増加に伴ってＣＤ４７発現の少なくとも５０％の低減を示した。ＳＭＡＳＨを含まなかった、ＥＦＳ－ＣＤ４７（「ＣＤ４７のみ」）細胞におけるＣＤ４７の発現は、アスナプレビルの用量増加によって概して未変化のままであった。ＥＦＳ－ＣＤ４７細胞は、いずれの顕著なＣＤ４７ノックダウンも示さず、このことは、ＣＤ４７発現に対するアスナプレビルのオフターゲット効果が存在しないことを示していた。同様に、野生型細胞におけるＣＤ４７の発現（「ＷＴ」）は、ベースライン（例えば、バックグラウンド）レベルのままであった。

３．リガンド誘導分解（ＬＩＤ）を使用したＣＤ４７分解
ＬＩＤシステムにおいては、目的のタンパク質（ＰＯＩ、例えば、ＣＤ４７）が、ＬＩＤデグロンドメイン（「ＬＩＤドメイン」または「ＬＩＤデグロン」とも称される）に融合される。ＬＩＤデグロンドメインは、ＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ならびにＦＫＢＰのＣ末端に融合されたペプチドデグロン（例えば、ＴＲＧＶＥＥＶＡＥＧＶＶＬＬＲＲＲＧＮ）（図５）を含む。ＦＫＢＰは、シス／トランスプロリルイソメラーゼ活性をもつ酵素であり、広範囲の基質ポリペプチドに対して活性をもつことができる。ペプチドデグロンは、ＦＫＢＰ活性部位に結合することができ、活性部位において隔離された場合、細胞分解タンパク質によって検出されず、こうしてそれは隠れたデグロンとなる。低分子であるシールド－１の不在下では、ＰＯＩ－ＬＩＤ融合タンパク質は、安定している。存在する場合、シールド－１は、ＦＫＢＰに緊密に結合し、それによってペプチドデグロンを置き換えるとともに、ＬＩＤ及び任意の融合パートナータンパク質（例えば、ＣＤ４７）の迅速な分解を誘導する。

ＬＩＤシステムがＣＤ４７分解を促進する能力を評定するために、以下の発現カセットを含有する発現構築物を作製した：ａ）ＬＩＤデグロンドメインをコードする核酸に融合されたヒトＣＤ４７遺伝子に作動可能に連結されたＥＦ１ａコアプロモーター（ＥＦＳ）（ＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤ、図６、上を参照されたい）、及びｂ）ヒトＣＤ４７遺伝子単独に作動可能に連結されたＥＦＳプロモーターを含有する対照（ＥＦＳ－ＣＤ４７）。レンチウイルス形質導入によってｉＰＳＣにＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤ発現カセットまたは対照ＥＦＳ－ＣＤ４７発現カセットのいずれかを形質導入した。

ＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤを形質導入された細胞、ＥＦＳ－ＣＤ４７を形質導入された細胞、及び野生型対照細胞を０～１，０００ｎＭのシールド－１の存在下で２４時間インキュベートし、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４７発現を評定した。図６（下）に示されるように、ＥＦＳ－ＣＤ４７－ＬＩＤを形質導入された細胞は、シールド－１の用量増加に伴ってＣＤ４７発現の少なくとも５０％の低減を示した。ＬＩＤを含まなかった、ＥＦＳ－ＣＤ４７（「ＣＤ４７のみ」）細胞におけるＣＤ４７の発現は、Ｓｍａｓｈ－Ｉの用量増加によって概して未変化のままであった。ＥＦＳ－ＣＤ４７細胞は、いずれの顕著なＣＤ４７ノックダウンも示さず、このことは、ＣＤ４７発現に対するシールド－１のオフターゲット効果が存在しないことを示していた。同様に、野生型細胞におけるＣＤ４７の発現（「ＷＴ」）は、ベースライン（例えば、バックグラウンド）レベルのままであった。

Ｃ．実施例３：遺伝子、転写後、及び翻訳後制御を介した低免疫細胞の覆いの除去
低免疫は、ＣＤ４７、補体インヒビター等の低免疫分子の過剰発現と、それに伴うＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ遺伝子座の抑制または遺伝子破壊を介して達成される。これらの修飾は、細胞を、感染細胞、悪性細胞、または非自己細胞の排除を担うＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ等の免疫系のエフェクター細胞から覆い隠す。免疫系からの細胞の覆い隠しは、体内での同種他家細胞の存在及び存続を許容する。身体からの操作された細胞の除去は、患者の安全に必要不可欠であり、免疫系からの細胞の覆いの除去によって達成され得る。覆いの除去は、安全スイッチとしての役目を果たし、低免疫分子の下方制御または免疫シグナル伝達分子の上方制御を介して達成され得る（図７）。これらの活性のいずれかは、細胞を天然エフェクター細胞にとって利用可能にして、同種他家細胞の排除をもたらす。

図８Ａ～図８Ｄは、遺伝子、転写後、及び翻訳後制御を介して低免疫細胞の覆いを除去するための方法を例示する。一部の実施形態では、低免疫細胞は、細胞の細胞外表面上のエピトープに結合する抗体を添加することにより、免疫系によって利用可能となり、排除され得る（図８Ａ）。エピトープは、過剰発現した低免疫分子に対して天然であることもできるし、または低免疫分子内部に位置するもしくは細胞外表面に明確に位置する別のエピトープであることもできる。表面への抗体の結合は、細胞の覆いを除去し、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を引き起こす。誘導性デグロンモチーフと低免疫分子との融合は、低分子の添加または除去により、デグロン、ひいては低免疫分子を安定化または不安定化することを通して、分子の安定性に対する外因性制御を可能にする（図８Ｂ）。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡによる低免疫分子の標的化は、タンパク質をコードする転写物の分解を引き起こす。ｓｉＲＮＡは、外因的に提供されるか、または遺伝子にコードされて、阻害性ＲＮＡの転写に対する制御を提供することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、低免疫分子の転写物にアニーリングして、ＲＩＳＣ複合体による分解をもたらす（図８Ｃ）。誘導性プロモーターを用いることによる低免疫分子の転写制御は、ドキシサイクリン等の低分子の添加または除去により、スイッチの発現を随意にオンまたはオフにする能力を提供する（図８Ｄ）。標的ヌクレアーゼ活性を介した遺伝子破壊もまた、低免疫分子の発現を排除して、細胞の覆いを除去する。

安全スイッチの発現を低免疫分子と結びつけることにより、安全スイッチの発現を確実にするための二重安全装置が提供される。低免疫分子をコードするカセットのサイレンシングは、免疫系による細胞の排除をもたらすことになる。さらに、この必須遺伝子のサイレンシングは操作された細胞を排除することになるため、低免疫分子及び安全スイッチを含有するカセットを、カセットの発現を安全に保つために内在性の必須遺伝子座内に組み込むことができる（図９）。場合によっては、低免疫細胞における誘導性のＣＤ４７下方制御は、安全スイッチとして作用し、それによって低免疫細胞が免疫系によって除去されるようにする。

誘導性ｓｈＲＮＡを使用した低免疫分子の標的分解を例示するために、マウスＣＤ４７を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞に９つのｓｈＲＮＡ候補をそれぞれ形質導入し、ｓｈＲＮＡの発現を制御するドキシサイクリン誘導性Ｕ６プロモーターをコードする異種ＤＮＡの組み込みをもたらした。研究において、ＨＥＫ２９３ＷＴは、マウスＣＤ４７発現についての陰性対照としての役目を果たした。誘導性ｓｈＲＮＡは、レンチウイルス形質導入を介して細胞に提供した。細胞に、マウスＣＤ４７転写物１を標的とする９つの異なるｓｈＲＮＡ構築物を１．８のＭＯＩで形質導入した。また、非標的化対照も使用した。１μｇ／ｍｌで７２時間のドキシサイクリンの添加は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７にコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体との細胞のインキュベーションに次いでフローサイトメトリー解析によって測定したとき、ＣＤ４７タンパク質の下方制御を付与した。データは、９つの誘導性ｓｈＲＮＡのうち８つがマウスＣＤ４７の発現をノックダウンしたことを示す。試験品ｓｈＲＮＡ番号５は、ＣＤ４７発現の完全なノックダウンを提供し、試験品ｓｈＲＮＡ番号２、３、４、７、８、及び９は、部分的ノックダウンを提供した（図１を参照されたい）。

最も有効なｓｈＲＮＡ（図１０の番号５）を内部にもつウイルスを様々なＭＯＩで形質導入に使用し、続いてｓｈＲＮＡ発現を誘導した。その後、図１０に記載されるように、フローサイトメトリーを介したＣＤ４７レベルの解析を実施した。データは、０．３超のＭＯＩがＣＤ４７の効率的なノックダウンを可能にしたことを示す（図１０、下）。誘導性ｓｈＲＮＡ構築物は、ＣＤ４７下方制御においてｓｈＲＮＡの構成的発現バージョンと同程度に効率的であることが認められた。

この実施例は、低免疫因子の制御可能な発現または誘導性発現を有する低免疫細胞を生成するための方法を説明する。かかる細胞は、低免疫因子の制御された下方制御または分解を可能にする安全スイッチをもち、故に、これらの細胞は、対象の免疫系によって除去され得る。

Ｄ．実施例４：安全スイッチとのＣＤ４７共発現
この実施例は、免疫細胞または免疫系構成要素による抗体依存性及び補体依存性細胞傷害作用の誘導を可能にする、ＣＤ４７へのエピトープの連結を説明する。

ＣＤ４７の発現は、免疫系からの同種他家細胞の覆い隠しに寄与する。標的細胞を溶解することができる非細胞ベースの免疫系構成要素は、抗体が表面に結合した細胞を認識する補体媒介性プロセスである。原形質膜の細胞外表面でのエピトープの発現は、抗体結合のためにエピトープを利用可能にし、ＣＤ４７等の他の細胞表面タンパク質へのエピトープの融合の関連において利用することができる。リツキシマブに結合するＣＤ２０のＣＰＹＳＮＰＳＬＣＳ断片等の既知のエピトープを有するモノクローナル抗体を、ＣＤ４７のＮ末端、または残基１９～１２７間に位置するＩｇＶドメイン内部もしくは残基１２７の直後に融合することができる。エピトープの両側には、ＣＤ４７の構造的完全性を維持するために、ＧＳリンカー（例えば、ＧＧＧＳまたはＧＧＧＳＧＧＧＳ）等の柔軟なリンカーを配置することができる。ＣＤ４７内部の残基１２７の直後にエピトープを配置することにより、エピトープが原形質膜に隣接するとともに球状ＩｇＶドメイン間にある、融合タンパク質が生成される。

別の実施形態では、ＣＤ４７及びエピトープは、２Ａまたは内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）によって分離されたバイシストロン性転写物として発現される。バイシストロン性構築物において、ＣＤ４７は、独立型の分子であると同時にエピトープであり、このエピトープが膜貫通型ドメイン及びシグナル配列に融合され、これにより膜貫通型ドメインを通して膜中に係留された状態でエピトープを原形質膜の細胞外表面に局在化させる。

ＣＤ４７－エピトープカセットは、レンチウイルス形質導入または目的の遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ媒介性の相同性指向修復を介して細胞のゲノム内に組み込まれる。組み込みを内部にもつ細胞の単離は、細胞をエピトープまたはＣＤ４７に対する抗体とともにインキュベートし、続いてフロー補助サイトメトリー分取（ｆｌｏｗａｓｓｉｓｔｅｄｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）を行うことにより実施される。殺傷スイッチ活性を介した細胞の排除は、ＣＤ２０に結合するリツキシマブ等の、エピトープに結合するモノクローナル抗体の添加、続いてＡＤＣＣまたはＣＤＣ媒介性細胞溶解により起こる。

ＣＤ４７－ＣＤ２０エピトープ融合及びバイシストロン性構築物の設計：以下のいくつかの構成要素を内部にもつ構築物を作出するようにＤＮＡを開発業務受託機関によって合成する：ＥＦＳプロモーター、５’ＧＧＧＳリンカー及び３’ＧＧＧＳＧＧＧＳリンカーが両側に位置するアミノ酸配列ＣＰＹＳＮＰＬＳＬＣＳを含むＣＤ２０エピトープ（これ以降、Ｎ末端ＣＤ２０ミモトープと称される）、ヒトＣＤ４７、ならびにバイシストロン性カセット用のＰ２Ａ。

融合構築物：融合タンパク質カセットをｐＳＦレンチウイルスバックボーンにクローニングし、これはＥＦＳプロモーター、続いてヒトＣＤ４７ＯＲＦに直接融合されたＣＤ２０ミモトープＯＲＦを含有する。別の融合タンパク質カセットは、ＥＦＳプロモーター、続いてヒトＣＤ４７アミノ酸１～１２７、続いてＣＤ２０ミモトープ、続いて下流ＣＤ４７ＯＲＦを含有し、これをレンチウイルス媒介性ゲノム組み込みのためにｐＳＦバックボーンにクローニングする。換言すれば、ｐＳＦバックボーンにクローニングされた融合カセットは、５’から３’末端に、ＥＦＳプロモーター、ヒトＣＤ４７アミノ酸１～１２７、本明細書に記載のＣＤ２０ミモトープ、及びＣＤ４７ＯＲＦを含む。

バイシストロン性構築物：ＣＤ４７及びＣＤ２０ミモトープを含有するバイシストロン性カセットのために、２ＡまたはＩＲＥＳ配列を使用することによって２つの別個のペプチドを生成する。ＣＤ２０ミモトープを、膜貫通型ドメイン配列及びシグナル配列に融合して、原形質膜の細胞外表面におけるその局在化を可能にする。ＣＤ４７は、ヒトコドン最適化ＣＤ４７である。全てのカセットを、レンチウイルス媒介性組み込みのためにｐＳＦバックボーンにクローニングする。

相同性指向修復ドメインＤＮＡ構築物：ＣＲＩＳＰＲ媒介性の相同性指向修復（ＨＤＲ）のために、カセットの上流及び下流に、ＣａｓエフェクターヌクレアーゼのためのｓｇＲＮＡ標的化配列の両側に位置する領域に相補的である１０００塩基対の相同性アームを隣接させる。Ｂ２Ｍの標的化のために、１０００ｂｐの相同性アームが、エクソン２を標的とするガイドＲＮＡの両側に位置する。

ゲノム組み込みのための方法：構築物のレンチウイルスパッケージング：ＨＥＫ２９３ＬＸ細胞に、安全スイッチ－ＣＤ４７の組み合わせを内部にもつｐＳＦベースのプラスミド、ならびにレンチウイルスをパッケージするためのパッケージングプラスミドをトランスフェクトする。簡潔に述べると、１ウェル当たり１６０，０００個のＨＥＫ２９３ＬＸ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ番号２６１４００７９）を含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号１０５６０４４）中、２４ウェルプレートに播種する。播種から２２時間後、１００ｎｇのＶＳＶＧエンベローププラスミド、１５０ｎｇのパッケージングプラスミド、及び２５０ｎｇの移入プラスミドを含有するトランスフェクションを５０ｕｌのＯｐｔｉｍｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ番号１１０５８０２１）中で混合し、続いて１．５ｕｌのＴｒａｎｓＩＴ（ＭｉｒｕｓＢｉｏ番号ＭＩＲ２３００）を添加する。トランスフェクションミックスを１５分間インキュベートし、次いで各ウェルに滴加する。トランスフェクションから２４時間後、培地を交換する。トランスフェクションから４８時間後、培地を遠心分離適合管に移し、３００ｒｃｆで４分間遠心分離して、細胞破片をペレット状にする。遠心分離後、粗レンチウイルス上清を新たな管に移し、次いでこれを、スクロース勾配を使用して超遠心分離によって濃縮し、続いてレンチウイルスペレットをＰＢＳ中に再懸濁させる。

ゲノム組み込みを内部にもつ細胞の形質導入及び単離のために、形質導入の２４時間前に１２５，０００個のｉＰＳ細胞をビトロネクチンでコーティングしたプレート上に播種する。形質導入の直前に、培地を吸引し、４５０ｕｌの培地、続いて５０ｕｌの濃縮レンチウイルスを添加する。細胞をレンチウイルスとともに３６時間インキュベートしてから、培地を交換する。形質導入から７２時間後、細胞を解離させ、Ａｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体とのインキュベーションに供し、続いてＡｌｅｘａ－６４７細胞に関してＦＡＣＳ分取を行う。

ＣＲＩＳＰＲ媒介性の相同性指向修復を介してＣＤ４７－安全スイッチカセットをＢ２Ｍに組み込むために、Ｂ２Ｍ相同性アームを内部にもつプラスミドを、ＢｓｔＢＩによる制限消化によって線状化する。次に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ミックスを以下のように調製する：２５ｐｍｏｌのＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を７５ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ及び１～２ｕｇの線状化ドナープラスミドとともにして５ｕｌの最終体積とする。次いで、１×１０^６個のｉＰＳＣをアクターゼにより解離させ、２０ｕｌのＰ３ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）及びＲＮＰミックス中に再懸濁させる。ＤＮ－１００またはＣＡ－１３７プログラムを使用して細胞をヌクレオフェクトし（ＬｏｎｚａＡｍａｘａヌクレオフェクター）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ＋ＣｌｏｎｅＲ中に回収し、ビトロネクチンでコーティングした２４ウェルプレート上にプレートする。１０日後、編集されたバルク集団を、Ａｌｅｘａ－６４７、ＰＥ、またはＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体により高ＣＤ４７発現に関して分取する（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａまたはＨａｎａのシングルセルプリンター）。

細胞溶解を誘導するためのリツキシマブ及び補体によるＣＤ２０－ＣＤ４７細胞の処理：ＣＤ２０－ＣＤ４７を内部にもつ細胞に対して補体依存性細胞死を誘導するために、２００，０００個の細胞を１２ウェルプレートのウェル中に播種し、続いて５０ｕｇ／ｍｌのリツキシマブ（ＲｎＤｓｙｓｔｅｍｓ番号ＭＡＢ９５７５）を添加する。細胞を抗体とともに３７℃で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ中で１：４に希釈したヒト血清（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ番号Ｈ４５２２）を添加し、これを標的細胞培養物に１：１比で添加して、１００ｕｌの最終体積を得る。１２０分間にわたって１５分毎に、試料を採取して、解離、ペレット化、及びＤｒａｑ７生死判定用色素（ＡｂＣａｍ番号ａｂ１０９２０２）中の再懸濁を介して細胞死のフローサイトメトリー解析を行う。

Ｅ．実施例５：安全スイッチとのＣＤ４７共発現、すなわちＣＤ４７－ＨＳＶｔｋスイッチ
この実施例は、免疫系から独立して機能する安全スイッチにＣＤ４７を連結するＣＤ４７－ＨＳＶｔｋバイシストロン性カセットを説明する。

ＣＤ４７は、ＨＳＶｔｋ、ｉＣａｓｐａｓｅ９、またはシトシンデアミナーゼ等の、免疫系非依存的様態で細胞死を誘導する安全スイッチに連結することができる。これらの安全スイッチは、２Ａ配列またはＩＲＥＳの間に位置するＣＤ４７の上流または下流に位置させて、これら２つのタンパク質が翻訳後に別々であることを確実することができる。ＨＳＶｔｋは、ガンシクロビルから、ＤＮＡ複製中に組み込まれる毒性のヌクレオシドへの触媒作用を引き起こし、この蓄積が毒性のＤＮＡ損傷を与えることによって細胞死を媒介する。

ＨＳＶｔｋ－ＣＤ４７バイシストロン性構築物の設計：ＨＳＶｔｋ及びヒトＣＤ４７のＯＲＦを２ＡまたはＩＲＥＳ配列によって分離して、バイシストロン性遺伝子構築物を作出する。具体的には、ＥＦＳプロモーターをＨＳＶｔｋの上流に配置し、続いてＰ２Ａ、続いてＣＤ４７、続いてポリアデニル化配列を配置して、構築物を作出する。かくして、バイシストロン性構築物は、５’から３’末端に、ＥＦＳプロモーター、ＨＳＶｔｋ、２ＡまたはＩＲＥＳ配列、ヒトＣＤ４７またはその断片もしくはバリアント、及びポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列を欠いたカセットを、レンチウイルス媒介性組み込みのためにｐＳＦバックボーン中にパッケージする。

Ｃａｓ９によって媒介される相同性指向修復を可能にするために、ポリアデニル化配列を含有するカセットの両側に、標的遺伝子に対する相同性アームを位置させる。Ｂ２Ｍの標的化のために、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン２を標的とするガイドＲＮＡの両側に位置する１０００ｂｐの相同性アームを用いる。

ＣＲＩＳＰＲ媒介性の相同性指向修復を介してＣＤ４７－安全スイッチカセットをＢ２Ｍに組み込むために、Ｂ２Ｍ相同性アームを内部にもつプラスミドを、ＢｓｔＢＩによる制限消化によって線状化する。次に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ミックスを以下のように調製する：２５ｐｍｏｌのＳｐＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を７５ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ及び１～２ｕｇの線状化ドナープラスミドとともにして５ｕｌの最終体積とする。次いで、１×１０^６個のｉＰＳＣをアクターゼにより解離させ、２０ｕｌのＰ３ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）及びＲＮＰミックス中に再懸濁させる。ＤＮ－１００またはＣＡ－１３７プログラムを使用して細胞をヌクレオフェクトし（ＬｏｎｚａＡｍａｘａヌクレオフェクター）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ＋ＣｌｏｎｅＲ中に回収し、ビトロネクチンでコーティングした２４ウェルプレート上にプレートする。１０日後、編集されたバルク集団を、Ａｌｅｘａ－６４７、ＦＩＴＣ、またはＰＥにコンジュゲートされた抗ＣＤ４７抗体により高ＣＤ４７発現に関して分取する（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａまたはＨａｎａのシングルセルプリンター）。

細胞死を誘導するためのガンシクロビルによるＨＳＶｔｋ－ＣＤ４７細胞の処理：ＨＳＶｔｋ－ＣＤ４７含有細胞の細胞死を誘導するために、ガンシクロビル（Ｇ２５３６）を細胞培養物に１ｕＭで添加する。解離、ペレット化、及びＤｒａｑ７生死判定用色素（ＡｂＣａｍ番号ａｂ１０９２０２）中の再懸濁を介した細胞死のフローサイトメトリー解析により、細胞死を２４時間毎に解析する。

全ての見出し及び節の表記は、明確化及び参照目的で使用されるにすぎず、いかようにも限定するものと見なされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って、適宜、異なる見出し及び節からの種々の態様を組み合わせることの有用性を理解しよう。

Ｆ．実施例６：安全スイッチ－シトシンデアミナーゼとのＣＤ４７共発現
シトシンデアミナーゼが免疫系依存的様態で細胞死を誘導する能力を評定するために、ＥＦＳ－シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）－ＣＤ４７バイシストロン性カセットを、レンチウイルスウイルス形質導入によって野生型ｉＰＳＣに形質導入した（図１６、上を参照されたい）。このカセットにおいて、ＣＤをコードする核酸は、ＣＤ４７をコードする核酸の上流に位置する。２Ａ配列をＣＤ核酸とＣＤ４７核酸との間に位置させて、これら２つのタンパク質が翻訳後に別々であることを確実にする。ＥＦＳプロモーターが、ＣＤ及びＣＤ４７の発現を制御する。

ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞及び対照ＥＦＳ－ＣＤを形質導入された細胞を、０．０１～１０００μＭの濃度の５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）（「５ＦＣ」）に接触させた。シトシンデアミナーゼは、５－ＦＣを毒性の５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）へと脱アミノ化して、それによって細胞を殺傷する。図１６（中央）に示されるように、５－ＦＣの濃度増加に伴って、ＣＤ４７発現ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞の殺傷が観察された。フローサイトメトリー解析は、ＥＦＳ－ＣＤ－ＣＤ４７を形質導入された細胞がＣＤ４７を発現していることを示した（図１６、下）。ＣＤとＣＤ４７とのかかる共発現は、対照細胞と比較したときにＣＤの機能性に顕著な影響を及ぼさなかった。

全ての見出し及び節の表記は、明確化及び参照目的で使用されるにすぎず、いかようにも限定するものと見なされるべきではない。例えば、当業者であれば、本明細書に記載の本技術の趣旨及び範囲に従って、適宜、異なる見出し及び節からの種々の態様を組み合わせることの有用性を理解しよう。

本明細書で引用される全ての参考文献は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許もしくは特許出願が、参照によりその全体が全目的で援用されることが明確かつ個別に示された場合と同じ程度に、本明細書での参照によりそれらの全体が全目的で本明細書に援用される。

当業者には明らかであろうが、本願の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本願の多くの修正及び変形を行うことができる。本明細書に記載の具体的な実施形態及び実施例は、例として提供されるにすぎず、本願は、添付の特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、特許請求の範囲の条件によってのみ限定されるべきである。

Claims

操作された細胞の免疫原性を制御するための方法であって、前記方法が、
（ａ）単離された細胞を得ることと、
（ｂ）前記単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、
（ｃ）前記操作された細胞を、前記トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記操作された細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
操作された細胞の免疫原性を制御するための方法であって、前記方法が、
（ａ）単離された細胞を得ることと、
（ｂ）前記単離された細胞に、（ｉ）免疫抑制因子に作動可能に連結された誘導性デグロンエレメントをコードする配列、または（ｉｉ）誘導性デグロンエレメントに作動可能に連結された免疫抑制因子をコードする配列を含む、核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、
（ｃ）前記操作された細胞を、前記誘導性デグロンエレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記操作された細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
操作された細胞の免疫原性を制御するための方法であって、
（ａ）単離された細胞を得ることと、
（ｂ）前記単離された細胞に、
（ｉ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１の構築物、
（ｉｉ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２の構築物、ならびに
（ｉｉ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、前記免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター、及び前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３の構築物、
を導入することと、
（ｃ）前記操作された細胞を、前記トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記操作された細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
操作された細胞の免疫原性を制御するための方法であって、前記方法が、
（ａ）単離された細胞を得ることと、
（ｂ）前記単離された細胞に、（ｉ）免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む核酸、及び（ｉｉ）前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントに作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸を導入して、操作された細胞を生産することと、
（ｃ）前記操作された細胞を、前記トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記操作された細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
ステップ（ｃ）の前に、前記操作された細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
ステップ（ｂ）が、前記単離された細胞に、（ｉ）前記免疫抑制因子を標的とする前記ｓｈＲＮＡ配列に作動可能に連結された前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及び（ｉｉ）前記トランス活性化因子エレメントに作動可能に連結された前記プロモーターを含む、単一の核酸構築物を導入することを含む、請求項１または５に記載の方法。
前記構築物が、５’末端から３’末端に、前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、前記ｓｈＲＮＡ配列、前記プロモーター、及び前記トランス活性化因子エレメントを含む、請求項６に記載の方法。
ステップ（ｂ）が、前記単離された細胞に、（ｉ）前記免疫シグナル伝達因子遺伝子に作動可能に連結された前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、及び（ｉｉ）前記トランス活性化因子エレメントに作動可能に連結された前記プロモーターを含む、単一の核酸構築物を導入することを含む、請求項４または５に記載の方法。
前記構築物が、５’末端から３’末端に、前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、前記免疫シグナル伝達因子遺伝子、前記プロモーター、及び前記トランス活性化因子エレメントを含む、請求項４、５、または８のいずれか１項に記載の方法。
前記単離された細胞が、前記免疫抑制因子を外因的に発現するように操作される、請求項１または５～７のいずれか１項に記載の方法。
前記単離された細胞が、前記トランス活性化因子エレメントを活性化する前記外因性因子の不在下で前記免疫抑制因子を過剰発現する、請求項１または５～７または１０のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである、請求項１または５～７または１０～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、前記トランス活性化因子エレメントが、Ｔｅｔリプレッサーエレメントであり、前記外因性因子が、テトラサイクリンまたはその誘導体である、請求項３または５に記載の方法。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＴＲＥプロモーターであり、前記トランス活性化因子エレメントが、Ｔｅｔ－Ｏｎエレメントであり、前記外因性因子が、テトラサイクリンまたはその誘導体である、請求項４、５、または８～９のいずれか１項に記載の方法。
柔軟なリンカーが、前記誘導性デグロンエレメントを前記免疫抑制因子につなげる、請求項２または５に記載の方法。
前記柔軟なリンカーが、（ＧＳＧ）_ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１）、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）からなる群から選択され、配列中、ｎが、１～１０である、請求項１５に記載の方法。
ステップ（ｂ）が、前記単離された細胞に、前記核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む単一の核酸構築物を導入することを含む、請求項１、５、または１５～１６のいずれか１項に記載の方法。
前記プロモーターが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、請求項１～４または１７のいずれか１項に記載の方法。
前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、及び／または前記第３のプロモーターが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から各々独立して選択される構成的プロモーターである、請求項３、５、または１３のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫抑制因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項１～３または５～１９のいずれか１項に記載の方法。
前記構築物が、５’末端から３’末端に、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含み、前記外因性因子が、テトラサイクリンまたはその誘導体である、請求項１、５～１４、または１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記構築物が、レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項１、６～１４、または１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記誘導性デグロンエレメントが、リガンド誘導性デグロンエレメント、ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される、請求項２、５、または８～２０のいずれか１項に記載の方法。
前記リガンド誘導性デグロンエレメントが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される、請求項２３に記載の方法。
前記リガンド誘導性デグロンエレメントが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメントであり、前記外因性因子が、アスナプレビルである、請求項２３または２４に記載の方法。
前記構築物が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む、請求項１７～１８、２０、または２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である、請求項１～４及び５～２６のいずれか１項に記載の方法。
前記単離されたヒト細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項１～４及び５～２７のいずれか１項に記載の方法。
前記単離されたヒト細胞が、低免疫原性であり、幹細胞またはその分化細胞のいずれかであり、前記幹細胞が、胚性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択され、前記分化細胞が、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される、請求項１～４及び５～２８のいずれか１項に記載の方法。
前記分化細胞が、膵臓細胞である、請求項２９に記載の方法。
５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫抑制因子を標的とするｓｈＲＮＡ配列、構成的プロモーター、及び前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物。
５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、プロモーター、及び前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、構築物。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターである、請求項３１に記載の構築物。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、ＴＲＥプロモーターである、請求項３２に記載の構築物。
前記免疫抑制因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項３１または３３に記載の構築物。
前記免疫シグナル伝達因子が、Ｂ２Ｍ、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される、請求項３２または３４に記載の構築物。
前記構成的プロモーターが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の構築物。
５’末端から３’末端に、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター、ＣＤ４７を標的とするｓｈＲＮＡ配列、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む、請求項３１、３３、３５、または３７のいずれか１項に記載の構築物。
５’末端から３’末端に、ＴＲＥプロモーター、免疫シグナル伝達因子遺伝子、ＥＦ１ａプロモーター、及びＴｅｔ－Ｏｎエレメントを含む、請求項３２、３４、３６、または３７のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項３１～３９のいずれか１項に記載の構築物。
請求項３１～４０のいずれか１項に記載の構築物を含む単離された細胞を含む、組成物。
前記単離された細胞が、前記免疫抑制因子を外因的に発現するように操作される、請求項３１、３３、または３５～３８のいずれか１項に記載の構築物を含む単離された細胞を含む、組成物。
前記単離された細胞が、前記トランス活性化因子エレメントを活性化する前記外因性因子の不在下で前記免疫抑制因子を過剰発現する、請求項４２に記載の組成物。
前記単離された細胞が、前記トランス活性化因子エレメントを活性化するための外因性因子に曝露される、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の組成物。
前記単離された細胞が、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の組成物。
請求項４５に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、
（ａ）請求項４６に記載の組成物を患者に投与することと、
（ｂ）前記組成物を、前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記組成物の前記細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡ、ＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメント、またはＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントからなる群から選択される因子を含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ｓｈＲＮＡ、ＣＤ４７を制御する誘導性デグロンエレメント、またはＣＤ４７を制御するＳＭＡＳＨデグロンエレメントからなる群から選択される因子を含む、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびに（ｉｖ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９またはそのバリアント、ならびに（ｉｖ）ＣＤ４７を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性タンパク質分解システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＲＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、ＣＤ４７の発現を調節するためのＤＮＡ制御システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性システムを含む、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ４７の発現を調節するための誘導性システムを含む、多能性幹細胞。
請求項４８～５９のいずれか１項に記載の多能性幹細胞に由来する分化細胞であって、心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される、前記分化細胞。
５’末端から３’末端に、プロモーター、誘導性デグロンエレメント、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び免疫抑制因子遺伝子を含む、構築物。
５’末端から３’末端に、プロモーター、免疫抑制因子遺伝子、柔軟なリンカーをコードする任意選択的な配列、及び誘導性デグロンエレメントを含む、構築物。
前記プロモーターが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される構成的プロモーターである、請求項６１または６２に記載の構築物。
前記柔軟なリンカーが、（ＧＳＧ）_ｎ（配列番号３）、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１）、及び（ＧＧＧＳＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）からなる群から選択され、配列中、ｎが、１～１０である、請求項６１～６３のいずれか１項に記載の構築物。
前記免疫抑制因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項６１～６４のいずれか１項に記載の構築物。
前記誘導性デグロンエレメントが、リガンド誘導性デグロンエレメント、誘導性ペプチド性デグロンエレメント、及びペプチド性タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）エレメントからなる群から選択される、請求項６１～６５のいずれか１項に記載の構築物。
前記リガンド誘導性デグロンエレメントが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）デグロンエレメント、シールド－１応答性デグロンエレメント、オーキシン応答性デグロンエレメント、及びラパマイシン応答性デグロンエレメントから選択される、請求項６６に記載の構築物。
ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるゲノム内セーフハーバー遺伝子座に対する標的組み込みのための５’相同性アーム及び３’相同性アームをさらに含む、請求項６１～６７のいずれか１項に記載の構築物。
請求項６１～６８のいずれか１項に記載の構築物を含む単離された細胞を含む、組成物。
前記単離された細胞が、幹細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、及び成体幹細胞からなる群から選択される幹細胞である、請求項６９に記載の組成物。
請求項７０に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、
（ａ）請求項７１に記載の組成物を前記患者に投与することと、
（ｂ）前記組成物を、前記誘導性デグロンエレメントを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記組成物の前記細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
前記細胞の免疫原性を制御するためのＤＮＡ標的ヌクレアーゼシステムを含む単離された細胞を含む、組成物であって、
（ａ）５’末端から３’末端に、第１のプロモーター及び免疫抑制因子遺伝子を含む、第１のエレメントと、
（ｂ）５’末端から３’末端に、第２のプロモーター及びＣａｓ９またはそのバリアントをコードする核酸配列を含む、第２のエレメントと、
（ｃ）５’末端から３’末端に、誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、前記免疫抑制因子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列、第３のプロモーター、及び前記誘導性プロモーターに対応するトランス活性化因子エレメントを含む、第３のエレメントと、
を含む、前記組成物。
前記細胞の免疫原性が、前記トランス活性化因子エレメントの活性を誘導するための外因性因子に前記細胞を曝露した際に制御可能である、請求項７３に記載の組成物。
前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、Ｕ６Ｔｅｔプロモーターであり、前記トランス活性化因子エレメントが、Ｔｅｔリプレッサーエレメントであり、前記外因性因子が、テトラサイクリンまたはその誘導体である、請求項７３または７４に記載の組成物。
前記免疫抑制因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の組成物。
前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、及び／または前記第３のプロモーターが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から各々独立して選択される構成的プロモーターである、請求項７３～７６のいずれか１項に記載の組成物。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項７３～７７のいずれか１項に記載の組成物。
前記単離されたヒト細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項７８に記載の組成物。
前記単離されたヒト細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項７８または７９に記載の組成物。
請求項８０に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、
（ａ）請求項８１に記載の組成物を投与することと、
（ｂ）前記組成物を、前記誘導性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを活性化するための外因性因子に曝露し、それによって前記組成物の前記細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
１つまたは複数の免疫抑制因子の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む修飾を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物。
１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の条件付き発現のためのシステムをコードする組換え核酸配列を含む、単離された哺乳類細胞を含む、組成物。
前記１つまたは複数の免疫抑制因子の前記発現が、外因性因子によって制御可能である、請求項８３に記載の組成物。
前記１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の前記発現が、外因性因子によって制御可能である、請求項８４に記載の組成物。
前記システムが、前記１つまたは複数の免疫抑制因子のタンパク質レベルを低減するための誘導性タンパク質分解システムを含む、請求項８３または８５に記載の組成物。
前記誘導性タンパク質分解システムが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される、請求項８７に記載の組成物。
前記システムが、前記１つまたは複数の免疫抑制因子のＲＮＡレベルを制御可能に低減するためのＲＮＡ制御システムを含む、請求項８３または８５に記載の組成物。
前記ＲＮＡ制御システムが、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択される、請求項８９に記載の組成物。
前記ＲＮＡ制御システムが、リガンド誘導性転写因子、ＳｙｎＮｏｔｃｈ受容体、またはリガンド制御型リボスイッチによって制御可能である、請求項９０に記載の組成物。
前記システムが、組織特異的プロモーター発現システム、誘導性プロモーター発現システム、分子制御型リボスイッチシステム、及び誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムからなる群から選択される、前記１つまたは複数の免疫抑制因子の発現レベルを低減するためのＤＮＡ制御システムを含む、請求項８３または８５に記載の組成物。
前記誘導性プロモーター発現システムが、Ｕ６Ｔｅｔプロモーター及びＴｅｔリプレッサーエレメントを含む、請求項９２に記載の組成物。
前記システムが、前記１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のタンパク質レベルを増加させるための誘導性タンパク質安定化システムを含む、請求項８４または８６に記載の組成物。
前記誘導性タンパク質安定化システムが、リガンド誘導性タンパク質安定化システム及び低分子誘導性タンパク質安定化システムを含む、請求項９４に記載の組成物。
前記システムが、前記１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子のＲＮＡレベルを増加させるためのＲＮＡ制御システムを含む、請求項８４または８６に記載の組成物。
前記ＲＮＡ制御システムが、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システムを含む、請求項９６に記載の組成物。
前記システムが、前記１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子の発現レベルを増加させるためのＤＮＡ制御システムを含む、請求項８４または８６に記載の組成物。
前記ＤＮＡ制御システムが、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）システム、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び分子制御型リボスイッチシステムからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ制御システムを含む、請求項９８に記載の組成物。
前記組織特異的プロモーターが、心臓細胞特異的プロモーター、肝細胞特異的プロモーター、腎臓細胞特異的プロモーター、膵臓細胞特異的プロモーター、神経細胞特異的プロモーター、免疫細胞特異的プロモーター、間葉系細胞特異的プロモーター、及び内皮細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項９２または９９に記載の組成物。
前記誘導性プロモーターが、ＴｅｔＯｎシステムを含む、請求項９９に記載の組成物。
前記分子制御型リボスイッチシステムが、テオフィリン制御型リボスイッチまたはグアニン制御型リボスイッチを含む、請求項９２または９９に記載の組成物。
前記誘導性ヌクレアーゼベースのゲノム編集システムが、前記１つまたは複数の免疫抑制因子を標的とする誘導性ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲゲノム編集、誘導性ＴＡＬＥＮゲノム編集、誘導性ＺＦＮゲノム編集、及び低分子向上型ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集からなる群から選択される１つを含む、請求項９２に記載の組成物。
前記１つまたは複数の免疫抑制因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１－インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項８３、８５、８７～９３、１００、または１０２～１０３のいずれか１項に記載の組成物。
前記１つまたは複数の免疫シグナル伝達因子が、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＡ（ＭＩＣ－Ａ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連プロテインＢ（ＭＩＣ－Ｂ）、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される、請求項８４、８６、または９４～１０２のいずれか１項に記載の組成物。
前記単離された哺乳類細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項８３～１０５のいずれか１項に記載の組成物。
前記単離され、操作されたヒト細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項１０６に記載の組成物。
前記単離され、操作されたヒト細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項１０６～１０７のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１０８に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、単離された分化細胞を含む、組成物。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、
（ａ）請求項１０９に記載の組成物を投与することと、
（ｂ）前記組成物を、前記１つまたは複数の免疫抑制因子の発現を制御するための外因性因子に曝露し、それによって前記組成物の前記細胞の免疫原性を制御することと、
を含む、前記方法。
５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（３）低免疫遺伝子を含む、構築物。
５’から３’末端に、（１）低免疫遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１１１または１１２に記載の構築物。
前記リボソームスキッピング配列が、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む、請求項１０１～１０３のいずれか１項に記載の構築物。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項１１１～１１４のいずれか１項に記載の構築物。
前記低免疫遺伝子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項１１１～１１５のいずれか１項に記載の構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び前記低免疫遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列、または前記低免疫遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び前記安全スイッチ導入遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列をさらに含む、請求項１１１または１１３～１１６のいずれか１項に記載の構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１１１～１１７のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項１１１～１１８のいずれか１項に記載の構築物。
構築物を単離された細胞内に送達する方法であって、単離された細胞に、請求項１１９に記載の構築物を含むレンチウイルス構築物を形質導入することと、前記安全スイッチ導入遺伝子及び前記低免疫遺伝子を保有する操作された細胞を選択することとを含む、前記方法。
請求項１１１～１１９のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記構築物が、標的遺伝子座に導入されている、請求項１２１に記載の単離された細胞またはその集団。
前記標的遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座、またはＢ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座のいずれかである、請求項１２１または１２２に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項１２１～１２３のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項１２１～１２４のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項１２１～１２５のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項１２６に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項１２７に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項１２７に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、前記方法。
５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）前記セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（４）低免疫遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）前記免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、ならびに（６）前記セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）安全スイッチ導入遺伝子、（３）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（４）必須細胞因子遺伝子、（５）ポリアデニル化配列、及び（６）前記免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、免疫シグナル伝達内への相同性指向修復のための構築物。
５’から３’末端に、（１）必須細胞因子遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）リンカーをコードする配列、（３）安全スイッチ導入遺伝子、及び（４）前記必須細胞因子遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、必須細胞因子遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
前記低免疫遺伝子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項１３０または１３１に記載の構築物。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項１３２または１３３に記載の構築物。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項１３４に記載の構築物。
前記セーフハーバー遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択される、請求項１３０、１３２、または１３５～１３６のいずれか１項に記載の構築物。
前記免疫シグナル伝達遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥ１１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される、請求項１３１、１３３、または１３５～１３６のいずれか１項に記載の構築物。
前記免疫シグナル伝達遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、及びＨＬＡ－Ｅからなる群から選択される、請求項１３３、１３６、または１３９のいずれか１項に記載の構築物。
前記リボソームスキッピング配列が、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む、請求項１３０～１３３、１３５～１３６、または１３８～１４０のいずれか１項に記載の構築物。
前記２Ａコード配列が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａからなる群から選択される、請求項１４１に記載の構築物。
前記構築物が、標的化ヌクレアーゼが前記セーフハーバー遺伝子座または前記免疫シグナル伝達遺伝子座を切断することを可能にし、それによって前記構築物が相同性指向修復により前記遺伝子座内に組み換えられるようにする、請求項１３０～１３３、１３５～１３６、または１３８～１４２のいずれか１項に記載の構築物。
前記構築物が、標的化ヌクレアーゼが前記必須細胞因子遺伝子座を切断することを可能にし、それによって前記構築物が相同性指向修復により前記遺伝子座内に組み換えられるようにする、請求項１３４または１３７のいずれか１項に記載の構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子の５’末端に位置する、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む、請求項１３０～１４４のいずれか１項に記載の構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１３０～１４５のいずれか１項に記載の構築物。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項１３０～１４６のいずれか１項に記載の構築物。
セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団であって、請求項１３０、１３５、１３８、１４１～１４３、もしくは１４５～１４７のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の前記内在性セーフハーバー遺伝子座内に組み換えられているか、または請求項１３１、１３５、もしくは１３５～１４７のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の前記内在性免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み換えられている、前記単離された細胞または前記その集団。
セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び必須細胞因子遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団であって、請求項１３２、１３６、１３８、１４１、１４３、もしくは１４５～１４７のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の前記内在性セーフハーバー遺伝子座内に組み換えられているか、または請求項１３３、１３６、１３９～１４３、もしくは１４５～１４７のいずれか１項に記載の構築物が、細胞の前記内在性免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み換えられており、前記細胞または前記その集団が、前記内在性遺伝子座から前記必須細胞因子を発現することができない、前記単離された細胞または前記その集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項１４８または１４９に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、請求項１４８～１５０のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項１４８～１５１のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項１５２に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項１５３に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項１５３に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において安全スイッチを活性化することを含む、前記方法。
５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物。
５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）必須細胞因子遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物。
５’から３’末端に、（１）左側エレメント（ＬＥ）を含む５’長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、（２）スプライスアクセプター－ウイルス２Ａペプチド（ＳＡ－２Ａ）エレメント、（３）必須細胞因子遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列またはリンカーをコードする配列、（５）安全スイッチ導入遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、及び（７）右側エレメント（ＲＥ）を含む３’ＬＴＲを含む、相同性非依存性ドナー構築物。
前記低免疫遺伝子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項１５６に記載の構築物。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項１５７または１５８に記載の構築物。
前記構築物が、単離された細胞の標的遺伝子座内に組み込まれて、前記標的遺伝子の発現を妨害するように構成される、請求項１５６～１６０のいずれか１項に記載の構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１５６～１６１のいずれか１項に記載の構築物。
前記標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座である、請求項１５６～１６２のいずれか１項に記載の構築物。
前記標的遺伝子座が、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、及びＨＬＡ－Ｅからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座である、請求項１５６～１６２のいずれか１項に記載の構築物。
前記標的遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座である、請求項１５６～１６４のいずれか１項に記載の構築物。
前記構築物が、前記単離された細胞において標的遺伝子の発現を妨害するように内在性標的遺伝子内に組み込まれている、請求項１５６～１６５のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、前記内在性遺伝子座から前記必須細胞因子を発現することができない、請求項１６６に記載の単離された細胞または集団。
前記構築物が、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼ標的部位にて前記標的遺伝子内に組み込まれている、請求項１６７に記載の単離された細胞またはその集団。
前記標的遺伝子の一方のアレルが、ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼによる標的化によって破壊される、請求項１６６～１６８のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記標的遺伝子の両方のアレルが、前記ヌクレアーゼまたは前記トランスポザーゼによる標的化によって破壊される、請求項１６６～１６９のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項１６６～１７０のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項１７１に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項１６６～１７２のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項１７３に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項１７４に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項１７４または１７５に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された前記患者において前記安全スイッチを活性化することを含む、前記方法。
安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結されているリンカーをコードする配列に作動可能に連結された必須細胞因子遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項１７７に記載の単離された細胞またはその集団。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項１７７または１７８に記載の単離された細胞またはその集団。
前記安全スイッチ導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ３０導入遺伝子、及びＣＤ１６導入遺伝子からなる群から選択される、請求項１７７～１７９のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
（１）ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される低免疫因子、ならびに（２）ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、前記低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質。
（１）ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される低免疫因子をコードする配列、ならびに（２）ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、前記低免疫因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質をコードする構築物。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項１８１に記載のタンパク質または請求項１８２に記載の構築物。
前記低免疫因子及び／または前記ペプチドエピトープが、前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項１８１または１８３に記載のタンパク質。
前記低免疫因子及び前記ペプチドエピトープをつなげる、及び／または前記融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に位置するリンカーをさらに含み、前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項１８１または１８３のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記低免疫因子をコードする前記配列が、前記ペプチドエピトープをコードする前記配列の５’にあり、及び／または前記ペプチドエピトープをコードする前記配列が、前記低免疫因子をコードする前記配列の５’にある、請求項１８２または１８３のいずれか１項に記載の構築物。
前記低免疫因子をコードする前記配列及び前記ペプチドエピトープをコードする前記配列をつなげる、及び／または前記融合タンパク質のＮ末端もしくはＣ末端に位置するリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項１８２または１８３のいずれか１項に記載の構築物。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項１８７に記載の構築物。
ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む、請求項１８２～１８４または１８６～１８８のいずれか１項に記載の構築物。
ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む、請求項１８２～１８４または１８６～１８９のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項１８２～１８４または１８６～１９０のいずれか１項に記載の構築物。
単離された細胞に、請求項１９１に記載の構築物を形質導入することと、前記組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現する前記単離された細胞を選択することとを含む、方法。
請求項１８２～１８４または１８６～１９１のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である、請求項１９３に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項１９３～１９４のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項１９３～１９５のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項１９６に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項１９７に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項１９７に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、前記ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、前記方法。
前記抗体が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する、請求項１９９に記載の方法。
Ｎ末端からＣ末端に、（１）ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片、（２）第１のリンカー、（３）異種ペプチドエピトープ、（４）第２のリンカー、及び（５）ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインを含む、組換えＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質。
前記ＩｇＶドメインを含む前記ヒトＣＤ４７断片が、前記ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７を含む、請求項２０１に記載のタンパク質。
前記ヒトＣＤ４７膜貫通型ドメインが、前記ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む、請求項２０１または２０２に記載のタンパク質。
前記第１のリンカー及び前記第２のリンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項２０１～２０３のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、請求項２０１～２０４のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項２０５に記載のタンパク質。
５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）ＣＤ４７のＩｇＶドメインを含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列、（３）第１のリンカー、（４）ペプチドエピトープをコードする配列、（５）第２のリンカー、ならびに（６）膜貫通型ドメイン及びＣ末端を含むヒトＣＤ４７断片をコードする配列を含む、構築物。
前記ＩｇＶドメインを含む前記ヒトＣＤ４７断片が、前記ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１～１２７をコードする、２０７に記載の構築物。
前記膜貫通型ドメイン及び前記Ｃ末端をコードする前記ヒトＣＤ４７断片が、前記ヒトＣＤ４７タンパク質のアミノ酸残基１２８～３４８を含む、請求項２０７または２０８に記載の構築物。
前記第１のリンカー及び前記第２のリンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項２０７～２０９のいずれか１項に記載の構築物。
前記構築物の（４）の前記配列によってコードされる前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、請求項２０７～２１０のいずれか１項に記載の構築物。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項２１１に記載の構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項２０７～２１２のいずれか１項に記載の構築物。
ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む、請求項２０７～２１３のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項２０７～２１４のいずれか１項に記載の構築物。
単離された細胞に、請求項２１５に記載の構築物を形質導入することと、前記ＣＤ４７内部ペプチドエピトープ融合タンパク質を発現する前記単離された細胞を選択することとを含む、方法。
請求項２０７～２１５のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項２１７に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項２１７～２１８のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項２１７～２１９のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項２２０に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項２２１に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
請求項２２１に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者を処置する方法であって、前記患者に、前記ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、前記方法。
前記抗体が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する、請求項２２３に記載の方法。
（１）転写制御エレメント、（２）必須細胞因子遺伝子、（３）転写後または翻訳後制御エレメント、及び（４）ポリアデニル化配列を含む、構築物。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項２２５に記載の構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項２２５または２２６に記載の構築物。
前記転写後制御エレメントが、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるＲＮＡ制御システムである、請求項２２５～２２７のいずれか１項に記載の構築物。
前記翻訳後制御エレメントが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される誘導性タンパク質分解システムである、請求項２２５～２２７のいずれか１項に記載の構築物。
転写後または翻訳後制御エレメントの制御下にある組換え必須細胞因子を含む、単離された細胞であって、前記内在性の必須細胞因子遺伝子が不活性化され、前記組換え必須細胞因子の発現が外因性因子によって制御可能である、前記単離された細胞。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、及びスプライセオソームサブユニットタンパク質からなる群から選択される、請求項２３０に記載の単離された細胞。
前記転写後制御エレメントが、誘導性ｓｈＲＮＡ、誘導性ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、及びＲＮＡ標的化ヌクレアーゼシステムからなる群から選択されるＲＮＡ制御システムである、請求項２３０～２３１に記載の単離された細胞。
前記翻訳後制御エレメントが、低分子補助遮断（ＳＭＡＳＨ）システム、シールド－１誘導性デグロン、オーキシン誘導性デグロン、ＩＭｉｄ誘導性デグロン、ペプチド性デグロン、タンパク質分解誘導キメラ分子、及び標的分解のための抗体からなる群から選択される誘導性タンパク質分解システムである、請求項２３０～２３２のいずれか１項に記載の単離された細胞。
前記単離された細胞が、自家ヒト細胞または同種他家ヒト細胞である、請求項２３０～２３３のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離され、操作されたヒト細胞である、請求項２３４に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項２３４または２３５に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞及び分化細胞からなる群から選択される、請求項２３４～２３６のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
５’から３’末端に、（１）転写制御エレメント、（２）表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列、（３）リボソームスキッピング配列、及び（４）低免疫因子をコードする配列を含む、バイシストロン性構築物。
前記低免疫因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される、請求項２３８に記載の構築物。
前記構築物の（２）の前記配列によってコードされる前記表面に露出したペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、請求項２３８または２３９に記載の構築物。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項２４０に記載の構築物。
前記リボソームスキッピング配列が、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む、請求項２３８～２４１のいずれか１項に記載の構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項２３８～２４２のいずれか１項に記載の構築物。
ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む、請求項２３８～２４３のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項２３８～２４４のいずれか１項に記載の構築物。
単離された細胞に、請求項２４５に記載の構築物を形質導入することと、前記低免疫因子及び前記ペプチドエピトープを発現する前記単離された細胞を選択することとを含む、方法。
請求項２３８～２４５のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト操作細胞である、請求項２４７に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項２４７～２４８のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項２４７～２４９のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項２５０に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項２５１に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項２５１に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、前記ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、前記方法。
前記抗体が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する、請求項２５３に記載の方法。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）安全スイッチ導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）低免疫因子遺伝子を含み、前記安全スイッチ導入遺伝子の発現が、前記低免疫因子遺伝子の発現を調節する、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）安全スイッチ導入遺伝子、ならびに（ｉｖ）低免疫因子遺伝子を含み、前記安全スイッチ導入遺伝子の発現が、前記低免疫因子遺伝子の発現を調節する、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）安全スイッチ、ならびに（ｉｖ）低免疫因子を含み、前記安全スイッチの発現が、前記低免疫因子の発現を調節する、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、（ｉｉｉ）安全スイッチ、ならびに（ｉｖ）低免疫因子を含み、前記安全スイッチの発現が、前記低免疫因子の発現を調節する、多能性幹細胞。
（ｉ）ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低減またはサイレンシング、ならびに（ｉｉ）表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含み、前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択され、前記低免疫因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される、多能性幹細胞。
（ｉ）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低減またはサイレンシング、（ｉｉ）ＣＤ４７の過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）表面に露出したペプチドエピトープに連結された低免疫因子を含み、前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択され、前記低免疫因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、Ｍｆｇｅ８、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される、多能性幹細胞。
５’から３’末端に、（１）安全スイッチ導入遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、ならびに（３）必須細胞因子遺伝子を含む、構築物。
５’から３’末端に、（１）必須細胞因子遺伝子、（２）リボソームスキッピング配列またはリンカー、及び（３）安全スイッチ導入遺伝子を含む、構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子が、ＨＳＶｔｋ遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子、ＨＥＲ１導入遺伝子、ＲＱＲ８導入遺伝子、ＣＤ２０導入遺伝子、ＣＣＲ４導入遺伝子、ＨＥＲ２導入遺伝子、ＣＤ１９導入遺伝子、ＭＵＣ１導入遺伝子、ＥＧＦＲ導入遺伝子、ＧＤ２導入遺伝子、ＰＳＭＡ導入遺伝子、ＣＤ１６導入遺伝子、及びＣＤ３０導入遺伝子からなる群から選択される、請求項２６１または２６２に記載の構築物。
前記リボソームスキッピング配列が、ＩＲＥＳ配列をコードする配列または２Ａコード配列をコードする配列を含む、請求項２６１～２６３のいずれか１項に記載の構築物。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項２６１～２６４のいずれか１項に記載の構築物。
前記低免疫遺伝子が、ＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＣｌ２１、及びＭｆｇｅ８からなる群から選択される、請求項２６１～２６５のいずれか１項に記載の構築物。
前記安全スイッチ導入遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び前記低免疫遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列、または前記低免疫遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント及び前記安全スイッチ導入遺伝子の３’末端におけるポリアデニル化配列をさらに含む、請求項２６１または２６３～２６６のいずれか１項に記載の構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項２６１～２６７のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項２６１～２６８のいずれか１項に記載の構築物。
単離された細胞に、請求項２６９に記載の構築物を形質導入することと、前記安全スイッチ導入遺伝子及び前記低免疫遺伝子を保有する前記単離された細胞を選択することとを含む、方法。
請求項２６１～２６９のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記構築物が、標的遺伝子座に導入されている、請求項２７１に記載の単離された細胞またはその集団。
前記標的遺伝子座が、ＡＡＶＳ１遺伝子座、ＣＬＢＹＬ遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、及びＣＣＲ５遺伝子座からなる群から選択されるセーフハーバー遺伝子座、ならびにＢ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｄ、ＨＬＡ－Ｅ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、及びＮＫＧ２Ｄの他のリガンドからなる群から選択される免疫シグナル伝達遺伝子座からなる群から選択される、請求項２７１または２７２に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、請求項２７１～２７３のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項２７１～２７４のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項２７１～２７５のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項２７６に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項２７７に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
請求項２７７に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者を処置する方法であって、前記患者において安全スイッチを活性化することを含む、前記方法。
（１）必須細胞因子、及び（２）前記必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープを含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、スプライセオソームサブユニットタンパク質、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される、請求項２８０に記載のタンパク質。
前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、請求項２８０または２８１に記載のタンパク質。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項２８２に記載のタンパク質。
前記必須細胞因子が、前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項２８０～２８３のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ペプチドエピトープが、前記融合タンパク質のＮ末端にある、請求項２８０～２８４のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記必須細胞因子及び前記ペプチドエピトープをつなげるリンカーをさらに含む、請求項２８０～２８５のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記ペプチドエピトープのＮ末端に位置するリンカーをさらに含む、請求項２８０～２８６のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項２８６または２８７に記載のタンパク質。
（１）必須細胞因子をコードする配列、ならびに（２）前記必須細胞因子とは異種の表面に露出したペプチドエピトープをコードする配列を含む、組換えペプチドエピトープ融合タンパク質をコードする構築物。
前記必須細胞因子が、ＲｐＳ２、ＲｐＳ９、ＲｐＳ１１、ＲｐＳ１３、ＲｐＳ１８、ＲｐＬ８、ＲｐＬ１１、ＲｐＬ３２、ＲｐＬ３６、Ｒｐｎ２２、Ｐｓｍｄ１４、ＰＳＭＡ３、リボソームサブユニットタンパク質、プロテアソームサブユニットタンパク質、スプライセオソームサブユニットタンパク質、及びそれらの膜結合型からなる群から選択される、請求項２８９に記載の構築物。
前記構築物の（２）の前記配列によってコードされる前記ペプチドエピトープが、ＣＤ２０エピトープ、ＣＣＲ４エピトープ、ＨＥＲ２エピトープ、ＣＤ１９エピトープ、ＭＵＣ１エピトープ、ＥＧＦＲエピトープ、ＧＤ２エピトープ、ＰＳＭＡエピトープ、ＣＤ１６エピトープ、及びＣＤ３０エピトープからなる群から選択される、請求項２８９または２９０に記載の構築物。
前記ＣＤ２０エピトープが、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－ＲＬＩｂ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＣＲ４エピトープが、モガムリズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＨＥＲ２エピトープが、マルゲツキシマブ、トラスツズマブ、ＴｒａｓＧＥＸ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ１９エピトープが、ＭＯＲ２０８及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＭＵＣ１エピトープが、ガチポツズマブ及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＥＧＦＲエピトープが、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＧＤ２エピトープが、Ｈｕ１４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕ１４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－ＲＬＩｃ、及びそれらのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＰＳＭＡエピトープが、ＫＭ２８１２及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識され、前記ＣＤ３０もしくはＣＤ１６エピトープが、ＡＦＭ１３及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識されるか、または前記ＣＤ２０もしくはＣＤ１６エピトープが、（ＣＤ２０）２ｘＣＤ１６及びそのバイオ後続品からなる群から選択される治療用抗体によって認識される、請求項２９１に記載の構築物。
前記必須細胞因子をコードする前記配列が、前記ペプチドエピトープをコードする前記配列の５’にある、請求項２８９～２９２のいずれか１項に記載の構築物。
前記ペプチドエピトープをコードする前記配列が、前記必須細胞因子をコードする前記配列の５’にある、請求項２８９～２９３のいずれか１項に記載の構築物。
前記必須細胞因子をコードする前記配列及び前記ペプチドエピトープをコードする前記配列をつなげるリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項２８９～２９４のいずれか１項に記載の構築物。
前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置するリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項２８９～２９５のいずれか１項に記載の構築物。
前記リンカーが、表３で提供されるリンカーのうちのいずれか１つから選択される、請求項２９５～２９６のいずれか１項に記載の構築物。
ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される転写制御エレメントをさらに含む、請求項２８９～２９７のいずれか１項に記載の構築物。
ＣＲＩＳＰＲベースの相同性指向修復に向けた標的遺伝子座に相同な第１の相同性アーム及び第２の相同性アームをさらに含む、請求項２８９～２９８のいずれか１項に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項２８９～２９９のいずれか１項に記載の構築物。
単離された細胞に、請求項３００に記載の構築物を形質導入することと、前記組換えペプチドエピトープ融合タンパク質を発現している前記単離された細胞を選択することとを含む、方法。
請求項２８９～３００のいずれか１項に記載の構築物を含む、単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、単離されたヒト細胞である、請求項３０２に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項３０２～３０３のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項３０２～３０４のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項３０５に記載の幹細胞を心細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、神経細胞、免疫細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞からなる群から選択される細胞種への前記幹細胞の分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項３０６に記載の分化細胞またはその集団を投与することを含む、前記方法。
患者を処置する方法であって、請求項３０７に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者に、前記ペプチドエピトープに結合する抗体を投与することを含む、前記方法。
前記抗体が、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを媒介する、請求項３０８に記載の方法。
５’から３’末端に、（１）セーフハーバー遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）転写制御エレメント、（３）ＨＳＶｔｋ安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（５）ＣＤ４７低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、ならびに（７）前記セーフハーバー遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
５’から３’末端に、（１）免疫シグナル伝達遺伝子座の第１の内在性配列に相同な第１の相同性アーム、（２）転写制御エレメント、（３）ＨＳＶｔｋ安全スイッチ導入遺伝子、（４）リボソームスキッピング配列及び／またはリンカーをコードする配列、（５）ＣＤ４７低免疫遺伝子、（６）ポリアデニル化配列、ならびに（７）前記免疫シグナル伝達遺伝子座の第２の内在性配列に相同な第２の相同性アームを含む、セーフハーバー遺伝子座内への相同性指向修復のための構築物。
前記転写制御エレメントが、ＥＦ１Ａプロモーター、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＯＰＩＡプロモーター、ＡＣＴ５Ｃプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ＰＧＫプロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項３１０または３１１に記載の構築物。
レンチウイルス発現のためのベクターバックボーンをさらに含む、請求項３１０～３１２のいずれか１項に記載の構築物。
セーフハーバー遺伝子座または免疫シグナル伝達遺伝子座内に組み込まれた安全スイッチ導入遺伝子及び低免疫遺伝子を含む、単離された細胞またはその集団であって、請求項３１０～３１３のいずれか１項に記載の構築物が、前記単離された細胞の前記内在性セーフハーバー遺伝子座内、または前記単離された細胞の前記内在性標的遺伝子座内に組み換えられている、前記単離された細胞または前記その集団。
前記単離された細胞が、未修飾のヒト細胞と比較してＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減及び／またはＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原の欠失もしくは発現の低減をさらに含む、請求項３１４に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及び／またはＮＬＲＣ５の欠失または発現の低減をさらに含む、請求項３１４または３１５に記載の単離された細胞またはその集団。
前記単離された細胞が、低免疫原性であり、幹細胞である、請求項３１４～３１６のいずれか１項に記載の単離された細胞またはその集団。
請求項３１７に記載の幹細胞を膵臓細胞への分化に適切な分化条件下で培養することによって調製される、分化細胞またはその集団。
前記膵臓細胞が、ベータ島細胞である、請求項３１８に記載の分化細胞またはその集団。
細胞療法を必要とする患者を処置する方法であって、患者に、請求項３１８または３１９に記載の分化細胞またはその集団を投与することと、請求項３１８または３１９に記載の分化細胞またはその集団を前もって投与された患者において前記安全スイッチを活性化することとを含む、前記方法。