JP7385230B2 - 移植用培養細胞または培養組織の調製方法 - Google Patents
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Description
移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記1)および2)から選択される1以上の工程を含む方法:
1)培養組織または培養組織がレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
2)移植用培養細胞または培養組織がHLA-Bw4型リガンド陰性もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性である場合にはHLA-Bw4型HLA分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
(1)HLA-C1型および/またはHLA-C2型のHLA-C分子
(2)HLA-Bw4型のHLA分子
をさらに有する、iPS細胞を提供する。かかるiPS細胞は、レシピエントのHLA-C型型、およびHLA-Bw4リガンドに応じた移植用組織や細胞を製造するために好適に用いられる。
(1)HLA-C1型またはHLA-C2型のHLA-C分子
(2)HLA-Bw4型のHLA分子
をさらに有する、移植用細胞または組織を提供する。かかる細胞や組織はHLA-C1/C2型のレシピエント、および/またはHLA-Bw4リガンド陽性のレシピエントへ移植するために好適に用いられる。
(1)少なくともHLA-A座、HLA-B座およびHLA-DR座のハプロタイプをホモで有するHLAハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたiPS細胞を提供する工程、
(2-1)該ドナーのHLA-C座がHLA-C1/C1型である場合は、HLA-C2型のHLA-C遺伝子を、HLA-C座がHLAC2/C2型である場合はHLA-C1型のHLA-C遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、および/または
(2-2)該ドナーがHLA-Bw4リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、HLA-Bw4型HLA-B遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、
(3)工程(2-1)および/または(2-2)で得られた細胞を、ドナーのHLA情報並びに導入したHLA-Cおよび/またはHLA-Bの情報とひも付けて保存する工程を含む、HLAハプロタイプがヘテロ接合性であるレシピエント用iPS細胞バンクの製造方法を提供する。本発明のiPS細胞バンクから、レシピエントのHLA-C座の型および/またはHLA-Bw4リガンドの有無あるいは種類に応じて最適な細胞を選択することができる。
例えばドナーのHLA-C座がHLA-C1/C1型である場合にはHLA-C2型のHLA-C分子を、ドナーのHLA-C座がHLA-C2/C2型である場合にはHLA-C1型のHLA-C分子を発現させる。ドナーが有していないHLA-C型を発現させることによって、レシピエントのHLA-C座がHLA-C1/C2型である場合にレシピエントのNK細胞上の、HLA-C1型を認識する受容体、およびHLA-C2型を認識する受容体の両方に移植細胞または組織上のHLA-C分子が結合し、移植細胞または組織に対するレシピエントのNK細胞に起因する拒絶を回避または低減することができる。
前駆細胞としては、多能造血前駆細胞、T前駆細胞、単球、赤芽球、巨核芽球、骨芽細胞、神経前駆細胞、肝前駆細胞などの組織前駆細胞が例示される。
(1)少なくともHLA-A座、HLA-B座およびHLA-DRB座がホモ接合性であるHLAハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたiPS細胞を提供する工程、
(2-1)該ドナーのHLA-C座がHLA-C1/C1型である場合は、HLA-C2型のHLA-C遺伝子を、HLA-C座がHLAC2/C2型である場合はHLA-C1型のHLA-C遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、および/または
(2-2)該ドナーがHLA-Bw4リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、HLA-Bw4型HLA-B遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、
(3)工程(2-1)および/または(2-2)で得られた細胞を、ドナーのHLA情報並びに導入したHLA-Cおよび/またはHLA-Bw4の情報とひも付けて保存する工程を含む、HLAハプロタイプがヘテロ接合性であるレシピエント用iPS細胞バンクの製造方法を提供する。本方法において、好ましくはドナーのHLA-C座もホモ接合性である。
即ち、HLAハプロタイプホモ接合性ドナーから誘導されたiPS細胞に加えて、
(1)該ドナーのHLA-C座がHLA-C1/C1型である場合は、HLA-C2型のHLA-C遺伝子を、HLA-C座がHLAC2/C2型である場合はHLA-C1型のHLA-C遺伝子をさらに含むiPS細胞、および/または
(2)該ドナーがHLA-Bw4リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、HLA-Bw4型HLA-B遺伝子さらに含むiPS細胞
がドナーのHLA情報並びに導入したHLA-Cおよび/またはHLA-Bw4の情報とひも付けて保存されたiPS細胞バンクが提供される。
1)移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子に特異的なNK細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
2)移植用培養細胞または培養組織がHLA-Bw4型リガンド陰性型もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性型であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性型である場合にはHLA-Bw4型HLA分子に特異的なNK細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる。
健常人HLAハプロタイプホモ接合性ドナーhomo-AのT細胞よりiPS細胞を樹立した(T-iPS細胞)。得られたiPS細胞からCD8シングルポジティブ細胞を誘導した(再生T細胞)。また、homo-Aのハプロタイプと一方が共通する健常人ハプロタイプヘテロ接合性ドナーhetero-1のT細胞より同様にiPS細胞を樹立し、iPS細胞からCD8シングルポジティブ細胞を誘導した。T細胞からiPS細胞(T-iPS細胞)を誘導した。得られたT-iPSからCD8シングルポジティブ細胞を誘導した(再生T細胞)。T細胞からのiPS細胞の誘導はWO2016/0101535に記載の方法に基づいて行った。homo-Aおよびhetero-1のハプロタイプを表1に示す。HLA-Cの14:03、12:02はC1型、04:01、15:02はC2型に分類される。したがって、homo-AはHLA-CがC1/C1型、hetero-1はC1/C2型である。
使用した培地は下記である。
0.1%ゼラチン/PBS溶液6mlを10cm培養ディッシュに入れ、37℃で30分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量をゼラチンコートした10cm培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを10mlとなるように加えた。
4日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを10ml加え、全量が20mlとなるようにした。
共培養に使用するOP9細胞の培地を吸引し、新しいmedium Aに交換した。またiPS細胞培養ディッシュの培地も同様に吸引し、新しいmedium Aを10ml加えた。EZ-passageローラーでiPS細胞塊を切った。カットしたiPS細胞塊を200ulピペットマンでピペッティングすることで浮遊させ、目視でおおよそ600個のiPS細胞塊をOP9細胞上に播種した。
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A 20mlに交換した。
Day 5 (培地半量交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 9 (培地交換)
半量分の培地を新しいmedium A 10mlに交換した。
Day 13 (誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえる)
培地を吸引し、HBSS(+Mg+Ca)で細胞表面上の培地を洗い流した。その後250U collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液10mlを加え、37℃で45分間培養した。
Collagenase溶液を吸引し、PBS(-)10mlで洗い流した。その後5mlの0.05%トリプシン/EDTA溶液を加え、37℃で20分培養した。培養後、細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。
次いで細胞をOP9/DLL1細胞上に播種した。この工程において、CD34lowCD43+細胞分画の細胞のソーティングは行わなかった。この分画をソーティングした場合、得られる細胞数が減少してしまうことやソーティングによる細胞へのダメージから、ソーティングしなかった場合に比べてT細胞への分化誘導効率が落ちることがある。
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
OP9細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、100μmのメッシュを通して50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで7分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。
DP細胞をCD8陽性細胞へと分化誘導するために、DP細胞をCD4マイクロビーズによって単離し、medium Bに抗CD3抗体(50ng/μl)とIL-2(100U/ml)を加えたもので刺激した。
細胞FACSにより解析し、CD8シングルポジティブ細胞(CD8SP)の生成を確認した。
homo-A T-iPS細胞にhetero-1のHLA-C2遺伝子であるHLA-C*04:01:01遺伝子をレンチウイルスによって導入した。遺伝子導入にはレンチウイルベクターCS-UbC-RfA-IRES-Venusを用い、以下の遺伝子を理化学研究所 (BRC)より入手し、導入した。
上記2)の方法にて、得られたiPS細胞をCD8シングルポジティブ細胞へと誘導した細胞を調製した(homo-A CD8SP+C*04:01:01)。
hetero-1ドナーより、NK細胞を常法により分取した。NK細胞をHLA-C1特異的抑制性受容体であるKIR 2DL3とHLA-C2特異的抑制性受容体であるKIR 2DL1に対する抗体を用い、FACSにより分類した。図1に示すように、R1~R4の4つの分画に分けられた。
1)で得られたhomo-A由来TiPS細胞から再生されたT細胞(homo-A CD8SP)、hetero-1由来TiPS細胞から再生されたT細胞(autoTiPS)、並びにhomo-A由来TiPS細胞のゲノムへHLA-C2型遺伝子を導入したT細胞(homo-A CD8SP+C*04:01:01)に対する、hetero-1のNK細胞の反応を調べた。各細胞を標的細胞とし、標的細胞とNK細胞を1 : 1で混合した後、12時間後にCD107aの発現上昇をFACSで検出した。図1に示すR1~R4各分画にそれぞれにおけるCD107aの発現上昇を解析したところ、R2、R3の分画でauto iPS由来CD8SP細胞に対し、homo-A iPS細胞由来CD8SP細胞で有意にCD107aの発現上昇が認められ、NK細胞活性があることが確認された。
標的細胞として、homo-A CD8SP、autoTiPSおよびhomo-A CD8SP+C*04:01:01の再生T細胞を用いた。NK細胞と再生T細胞の比を2:1、8:1で6時間培養し、死細胞の割合をAnnexinV陽性細胞の割合で評価した。特異的細胞傷害 (specific lysis)は (% sample lysis with effector - % basal lysis without effector) / (100 - % basal lysis without effector ) ×100で算出した。結果を図3に示す。
表1に示すハプロタイプホモ接合性ドナーhomo-A由来のiPS細胞ならびにハプロタイプへテロのドナーhetero-1由来のiPS細胞を調製した。また、実施例1の3)に示すhomo-A由来iPS細胞ゲノムへHLA-C*04:01:01を導入したiPS細胞を調製した。かかるiPS細胞を血管内皮細胞へと誘導した。
0.5×TrypLE selectで細胞を回収し、ラミニン511でコートした6 wellプレートに2×105/wellで再播種した後、100% confluentになるまでStem Fitで4日培養した。
Day4
b-FGF (4ng/ml)入りStem Fitにmatrigel (1/60希釈) を加えた培地5mlで培地交換。
Day5
分化誘導培地 (+10ng/ml BMP4, 10ng/ml b-FGF, Matrigel 1/60希釈)5mlで培地交換。
Day8, 10, 11
分化誘導培地 (+100ng/ml VEGF) 5mlで培地交換。
Day 13 (細胞の回収)
PBS 5mlでwashし、Accumax 1ml加え、37℃, 15分incubation。細胞を回収した。5mM EDTA 5%FBS/PBS 500μlで再懸濁し、α-CD31 Absとα-VE-Cadherin Absを0.5μl/100万細胞の割合で加え、RT 30minインキュベーションした。5mM EDTA 5%FBS/PBS 10mlでwashし、FACS AriaでCD31+VE-Cadherin+細胞をソーティングした。得られた血管内皮細胞(再生血管内皮細胞)は使用するまで-80℃のフリーザーで保存した。
実施例1と同様にしてHLAハプロタイプホモのドナーから誘導されたiPS細胞から分化誘導した再生血管内皮細胞を対象にヘテロのNK細胞が反応性を示すかどうかを評価した。結果を図4に示す。
Claims (13)
- 移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記1)および2)から選択される1以上の工程を含む方法:
1)培養組織または培養組織がレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
2)移植用培養細胞または培養組織がHLA-Bw4型リガンド陰性もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性である場合、HLA-Bw4型HLA分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
ここで移植用培養細胞または培養組織はヒト由来ES細胞またはiPS細胞からインビトロで分化誘導されたものであり、レシピエントはヒトである。 - 移植用培養細胞または培養組織が、HLAハプロタイプホモ接合性iPS細胞から分化誘導されたものである、請求項1記載の方法。
- HLAハプロタイプホモ接合性iPS細胞が、少なくともHLA-A座、HLA-B座およびHLA-DR座についてホモ接合性ドナーの体細胞から誘導されたものである、請求項2に記載の方法。
- さらにドナーのHLA-C座がホモ接合性である、請求項3に記載の方法。
- HLAハプロタイプホモ接合性iPS細胞が、HLAハプロタイプホモ接合性ドナーより採取された細胞から誘導されたiPS細胞がドナーのHLA情報とひも付けて保存されているiPS細胞バンクから取得されたものである、請求項4または5に記載の方法。
- 工程1)または2)において、HLA-C分子またはHLA-Bw4型HLA分子を移植用培養細胞または培養組織に発現させる工程が、目的とするHLA-C遺伝子および/またはHLA-Bw4型HLA遺伝子をiPS細胞に導入し、かかる遺伝子が導入されたiPS細胞を分化誘導する工程を含む、請求項2~5いずれかに記載の方法。
- 工程1)または2)において、HLA-C分子またはHLA-Bw4型分子を移植用細胞または組織に発現させる工程が、目的とするHLA-C遺伝子または遺伝子産物および/またはHLA-Bw4型HLA遺伝子または遺伝子産物を移植用培養細胞または培養組織へ導入する工程を含む、請求項1~5いずれかに記載の方法。
- 工程1)または2)において移植用培養細胞または培養組織へ発現させるHLA-C分子またはHLA-Bw4型のHLA分子が、レシピエントの有するHLA-C分子またはHLA-Bw4型HLA分子と同一である、請求項1~7いずれかに記載の方法。
- 少なくともHLA-A座、HLA-B座、およびHLA-DR座のハプロタイプをホモで有するヒトドナーから誘導され、ドナーが有していない下記(1)および(2)からなる群から選択される1以上のHLA分子:
(1)HLA-C1型および/またはHLA-C2型のHLA-C分子
(2)HLA-Bw4型のHLA-B分子
をさらに有する、レシピエント移植用培養細胞または培養組織を調製するためのiPS細胞であって、下記1)および2)から選択される1以上の工程によって調製されたiPS細胞:
1)ヒトドナーがレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子をiPS細胞に発現させる、
2)ヒトドナーがHLA-Bw4型リガンド陰性もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性である場合、HLA-Bw4型HLA分子をiPS細胞に発現させる。 - 請求項9のiPS細胞が、ドナーのHLA情報並びに導入したHLA分子の情報とひもづけて保存されたiPS細胞を含む、iPS細胞バンク。
- 少なくともHLA-A座、HLA-B座、およびHLA-DR座のハプロタイプをホモで有し、ドナーが有していない下記(1)および(2)からなる群から選択される1以上のHLA分子:
(1)HLA-C1型またはHLA-C2型のHLA-C分子
(2)HLA-Bw4型のHLA分子
をさらに有する、ヒト由来のレシピエント移植用培養細胞または組織であって、下記1)および2)から選択される1以上の工程によって調製された培養細胞または組織:
1)ヒトドナーがレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子を培養細胞または組織に発現させる、
2)ヒトドナーがHLA-Bw4型リガンド陰性もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性である場合、HLA-Bw4型HLA分子を培養細胞または組織に発現させる。 - (1)少なくともHLA-A座、HLA-B座およびHLA-DR座のハプロタイプをホモで有するHLAハプロタイプホモ接合性ヒトドナーから誘導されたiPS細胞を提供する工程、
(2-1)該ドナーのHLA-C座がHLA-C1/C1型である場合は、HLA-C2型のHLA-C遺伝子を、HLA-C座がHLAC2/C2型である場合はHLA-C1型のHLA-C遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、および/または
(2-2)該ドナーがHLA-Bw4リガンド陰性、または比較的弱い陽性である場合には、HLA-Bw4型HLA遺伝子をiPS細胞へ導入する工程、
(3)工程(2-1)および/または(2-2)で得られた細胞を、ドナーのHLA情報並びに導入したHLA-C遺伝子および/またはHLA遺伝子の情報とひも付けて保存する工程を含む、移植用iPS細胞バンクの製造方法。 - 移植用培養細胞または培養組織の調製方法であって、下記1)および2)から選択される1以上の工程を含む方法:
1)移植用培養細胞または培養組織がレシピエントのHLA-C座の型に属するHLA-C分子のいずれかを発現していない場合、当該発現していないHLA-C分子に特異的なNK細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる、
2)移植用培養細胞または培養組織がHLA-Bw4型リガンド陰性型もしくは相対的に弱いBw4型リガンド陽性型であり、レシピエントがHLA-Bw4リガンド陽性型である場合にはHLA-Bw4型HLA分子に特異的なNK細胞抑制性受容体に対する刺激型抗体を移植用培養細胞または培養組織に発現させる
ここで移植用培養細胞または培養組織はヒト由来であり、レシピエントはヒトである。
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