JP2022184879A - 安全な細胞治療薬を生成するためのプラットフォーム - Google Patents

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Abstract

【課題】安全で制御可能な治療薬および／または送達ビヒクルとして使用するための細胞質体を提供する。【解決手段】本明細書では、細胞質体、細胞質体を含む組成物、細胞質体を使用する方法、および対象を治療する方法、例えば、健康なもしくは健康ではない対象に有益性を提供する方法、または対象における疾患もしくは状態を治療もしくは診断する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象を治療する方法は、細胞質体を含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。また、本明細書では、細胞質体を含む組成物（例えば医薬組成物）も提供される。また、本明細書では、組成物または方法を使用するための説明書を含むキットも提供される。【選択図】図１

Description

優先権の主張
本願は、２０１７年８月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５４２，１３３号の
利益を主張する。上記の内容全体は、本明細書に参照により組み込まれる。
連邦政府の支援を受けた研究または開発
本発明は、米国国立がん研究所により授与された助成金番号ＣＡ０９７０２２の下で政
府の支援によりなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本開示は、少なくとも部分的には、バイオテクノロジーの分野に関し、より詳細には、
健康な対象または罹患している対象における疾患の治療、予防、予防的治療、アジュバン
ト療法または免疫調節のために細胞質体（例えば除核細胞）を使用する方法および組成物
に関する。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本
明細書に組み込まれる。２０１８年８月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＳｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１７．１ＭＢである。
細胞ベースの療法の現在の技術およびツールは、多くの場合、望ましくない危険な副作
用、例えば、制御不能の増殖、変異率の増加、および抗ＤＮＡ免疫応答を起こしやすい。
本開示は、少なくとも部分的には、安全で制御可能な治療薬および／または送達ビヒク
ルとして使用するための細胞質体の生成に基づいている。本明細書に記載の方法および組
成物は、いくつかの利点を提供する。細胞を除核して細胞質体を生成する方法、細胞質体
、組成物、および記載の細胞質体を使用する方法は、これまでの細胞ベースの治療薬に比
べていくつかの有益性を提供することができる。第一に、本明細書に記載の細胞質体、組
成物、および方法は、これまでの細胞ベースの治療よりも安全であり得る。いくつかの実
施形態では、例えば、核にコードされたＤＮＡ遺伝子の宿主への移入を含む、遺伝物質を
移入するリスクを低減することができる。さらに可能性のある安全上の利点としては、対
象の微小環境（複数可）に応答しないこと、増殖しないこと、および（例えば、有核の間
葉系幹細胞と比較して）疾患の進行に寄与しないこと、のうちの１つまたは複数が挙げら
れる。
第二に、本明細書に記載の細胞質体は、限定されたまたは定義された（例えば、既知の
、またはプログラム可能な）寿命を有することができる。第三に、本明細書に記載の細胞
質体は、いくつかの他の細胞ベースの治療における細胞と比較してサイズを低減すること
ができる。
第四に、本明細書に記載の細胞質体は、凍結冬眠（cryohibernation）または凍結保存
後に効力を維持することができる。凍結保存は、冷却または凍結、および短期または長期
の生物学的材料（例えば、細胞、細胞質体）の超低温（例えば、固体ＣＯ２で－８０℃、
液体窒素で－１９６℃など）での保存を含む。凍結冬眠は、非凍結温度、例えば４℃での
生物学的材料（例えば、細胞、細胞質体）の仮死状能における短期冷却および保存を含む
。細胞質体の凍結冬眠は、以下の理由のうちの１つまたは複数により有利であり得る：凍
結冬眠は凍結保存よりも労力が少なく、凍結冬眠を経た細胞質体は輸送する（例えば発送
する）ことができる。
第五に、本明細書に記載の細胞質体は、幅広く操作することができる。例えば、細胞質
体は、治療薬本体を生成もしくは発現するように、または特定部位に向かうように操作す
ることができる。現在請求している本発明の他の利点は、本明細書に記載されている。
したがって、本明細書では、細胞質体、細胞質体を含む組成物、細胞質体を使用する方
法、および対象を治療する方法、例えば、健康なもしくは健康ではない対象に有益性を提
供する方法、または対象における疾患もしくは状態（例えば、がんもしくは新生物、感染
症、炎症状態、神経疾患（例えば神経変性疾患）、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患
、虚血性疾患、遺伝性もしくは遺伝的障害、発達障害、眼科疾患、骨疾患、代謝性疾患、
中毒症、特発性状態、もしくはそれらの２つ以上、もしくは本明細書に開示の任意の疾患
）を治療もしくは診断する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象を治療する
方法は、細胞質体（例えば、組換え細胞質体、本明細書に記載の任意の細胞質体）を含む
組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、対象に
投与される細胞質体は、治療薬を生成することができる。いくつかの実施形態では、対象
に投与される細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質（例
えば、酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパク質ホルモン、増殖因子、細胞表
面受容体、もしくはワクチン）、治療用ペプチド（例えば、ペプチドホルモンもしくは抗
原）、小分子治療薬（例えば、ステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒素、抗生物質
、抗ウイルス薬、コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、もしくはエムタンシン）、
または治療用遺伝子編集因子の１つまたは複数を生成することができる。いくつかの実施
形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療
用ペプチド、治療用小分子、または治療用遺伝子編集因子のうちの１つまたは複数を生成
するように操作することができる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ
分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、治療用小分子、または治
療用遺伝子編集因子の１つまたは複数を生成するように操作する必要はない。例えば、い
くつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療
用ペプチド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子の１つまたは複数は、細胞質体
が得られた細胞によって生成され得る。
いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、
治療用ペプチド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子は、ターゲティング部分を
含むことができる。細胞質体によって生成され得るか、または細胞質体に含まれ得る非限
定的な例示としてのターゲティング部分としては、ケモカイン受容体、接着分子、および
抗原が挙げられる。
いくつかの実施形態では、対象に投与される細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用Ｒ
ＮＡ分子、治療用タンパク質（例えば、酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパ
ク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、もしくはワクチン、または現在利用可能なも
しくは開発途中の任意の治療用タンパク質）、治療用ペプチド（例えば、ペプチドホルモ
ンもしくは抗原、または現在利用可能なもしくは開発途中の任意の治療用ペプチド）、小
分子治療薬（例えば、ステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒素、抗生物質、抗ウイ
ルス薬、鎮痛薬、抗凝固薬、抗うつ薬、抗がん剤、抗てんかん薬、抗精神病薬、鎮静薬、
コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、エムタンシン、または現在利用可能なもしく
は開発途中の任意の小分子治療薬）、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子、または別
の治療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス（例えば
、腫瘍溶解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、もしくはイオン）を含有することができ
る。腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例としては、タリモジーン・ラハーパレプベック（
Talimogene laherparepvec）、Ｏｎｙｘ－０１５、ＧＬ－ＯＮＣ１、ＣＶ７０６、Ｖｏｙ
ａｇｅｒ－Ｖｌ、およびＨＳＶ－１７１６が挙げられる。また、いくつかの野生型ウイル
ス、例えば、ワクシニアウイルス（Vaccinia virus）、水疱性口内炎ウイルス（Vesicula
r stomatitis virus）、ポリオウイルス（Poliovirus）、レオウイルス（Reovirus）、セ
ネカウイルス（Senecavirus）、ＥＣＨＯ－７、およびセムリキ森林ウイルス（Semliki F
orest virus）も腫瘍溶解性の挙動を示す。
いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療薬、治療用ペプ
チド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子は、細胞質体によって生成されない。
いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療薬、治療用ペプチ
ド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子は、細胞質体内にパッケージ化される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治
療薬、および／または遺伝子編集因子は、組換えにより発現される。いくつかの実施形態
では、細胞質体が由来するまたは得られる細胞は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質
、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子のうちの１つまたは複数を生
成するように操作される。いくつかの実施形態では、細胞質体が由来するまたは得られる
細胞は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／また
は遺伝子編集因子のうちの１つまたは複数を安定に（例えば永続的に）発現するように操
作される。いくつかの実施形態では、細胞質体が由来するまたは得られる細胞は、ＤＮＡ
分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因
子のうちの１つまたは複数を一過的に発現するように操作される。いくつかの実施形態で
は、細胞質体が由来するまたは得られる細胞は、除核の前に操作される。いくつかの実施
形態では、細胞質体は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬
、および／または遺伝子編集因子のうちの１つまたは複数を一過的に発現するように操作
される（例えば、除核後に操作される）。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治
療薬、および／または遺伝子編集因子は、細胞質体が由来するまたは得られる細胞におい
て自然には（すなわち、操作の非存在下では）発現されない（すなわち、ＤＮＡ分子、Ｒ
ＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子は細胞
質体に対して外因性である）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タン
パク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子は、対象において自然
には発現されない（すなわち、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子
治療薬、および／または遺伝子編集因子は対象にとって外因性である）。いくつかの実施
形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／ま
たは遺伝子編集因子は、対象において目的の治療部位（例えば、腫瘍、または特定の組織
、例えば脳、腸、肺、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、筋肉、眼など）で自然には発現されない
（すなわち、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／
または遺伝子編集因子は、目的の治療部位に対して外因性である）。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治
療薬、および／または遺伝子編集因子は、細胞質体が由来するまたは得られる細胞内で自
然に（すなわち、操作の非存在下で）発現される（すなわち、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、
タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子は、細胞質体に対
して先天的に内因性である）（例えば、細胞質体が由来するまたは得られる細胞の操作の
非存在下で）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチ
ド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子は、対象において自然に発現される（
すなわち、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／ま
たは遺伝子編集因子は、対象に対して内因性である）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ
分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因
子は、対象において目的の治療部位（例えば、腫瘍、または特定の組織、例えば脳、腸、
肺、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、筋肉、眼など）で自然に発現される（すなわち、ＤＮＡ分
子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子
は、目的の治療部位に対して内因性である）。
いくつかの実施形態では、治療薬、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペ
プチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子は合成細胞から誘導され、細胞質
体にロードされる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、細胞質体が由来するまたは得られる細胞と比較
して、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、小分子治療薬、および／または
遺伝子編集因子の修正、短縮型、または非変異型バージョンおよび／またはコピーを発現
する。いくつかの実施形態では、細胞質体は、任意の有核細胞（例えば、真核細胞、哺乳
動物細胞（例えば、ヒト細胞、または本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞）、原生動物
細胞（例えばアメーバ細胞）、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、魚類細
胞、両生類細胞、爬虫類細胞、または鳥類細胞）から得られる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、少なくとも２種（例えば、少なくとも２、３、
４、５種、またはそれ以上）の異なる治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タン
パク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子を任意の組み合わ
せで生成または含有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞質体は、
治療用ＤＮＡ分子および小分子治療薬を生成または含有することができる。例えば、いく
つかの実施形態では、細胞質体は、２種の異なる小分子治療薬を生成または含有すること
ができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞質体は、ケモカイン受容体（例えばタ
ーゲティング用の）および小分子治療薬を生成または含有することができる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、不死化細胞、がん細胞（例えば任意のがん細胞
）、初代（例えば宿主由来）細胞、または細胞株から得られる。任意の非不死性細胞は、
当技術分野で公知の方法を使用して不死化することができる。いくつかの実施形態では、
細胞質体は、対象の自己の細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞質
体は、対象と同種の細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、
免疫細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、ナチュラルキラ
ー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、成体幹細胞（例えば
、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成
体幹細胞、神経堤幹細胞、皮膚幹細胞、もしくは精巣細胞）、マスト細胞、好塩基球、好
酸球、または誘導多能性幹細胞から得られる。
いくつかの実施形態では、除核の前に、２つ以上の細胞（例えば、本明細書に開示の細
胞のいずれか）は、本明細書に開示の、または当技術分野で公知の任意の方法によって融
合される。融合産物を除核することにより細胞質体を得ることができる。
いくつかの実施形態では、第１の細胞質体は、細胞または第２の細胞質体に融合される
。いくつかの実施形態では、細胞は、任意の有核細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えばヒ
ト細胞、または本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞）、原生動物細胞（例えばアメーバ
細胞）、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫
類細胞、または鳥類細胞）である。いくつかの実施形態では、第２の細胞は、合成細胞で
ある。したがって、細胞を本明細書に記載の細胞質体のいずれかと融合させるステップを
含む、細胞の挙動を変化させる方法が提供される。また本明細書では、細胞質体が融合さ
れた細胞の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。
いくつかの実施形態では、第２の細胞質体は、第１の細胞質体と同一のタイプの細胞に
由来する。いくつかの実施形態では、第２の細胞質体は、第１の細胞質体とは異なるタイ
プの細胞に由来する。いくつかの実施形態では、第２の細胞質体は、少なくとも１つの治
療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬
、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子、または第１の細胞質体に含有されるか、もし
くは第１の細胞質体によって発現される治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タ
ンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子と同
じである別の治療剤を含有または発現する。いくつかの実施形態では、第２の細胞質体は
、少なくとも１つの治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペ
プチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子、または第１の細胞質体
に含有される、もしくは第１の細胞質体により発現される治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮ
Ａ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治
療用ナノ粒子とは異なる別の治療剤を含有または発現する。いくつかの実施形態では、第
１の細胞質体は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ウイルスベースの細胞表面ペ
プチドを使用する電気融合またはウイルス融合を使用して、細胞または第２の細胞質体に
融合させることができる。
いくつかの実施形態では、治療用ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲ
ＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、またはＲＮＡウイルスである。いくつかの
実施形態では、治療用ＤＮＡ分子は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド
、プラスミド、細菌ＤＮＡ分子、またはＤＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では
、治療用タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、抗体、小ペプチドベースの
薬物、または酵素である。いくつかの実施形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治
療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または治
療用遺伝子編集因子を一過的に発現する。いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、
治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または
治療用遺伝子編集因子の発現は誘導性である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、治
療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬
、および／または治療用遺伝子編集因子を発現するように永続的に操作される。いくつか
の実施形態では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプ
チド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子の発現。本明細書に記載の方
法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞質体は、治療剤またはナノ粒子を含む。い
くつかの実施形態では、治療剤は、小分子または細菌またはエキソソームである。
いくつかの実施形態では、本方法は、１つまたは複数の追加の療法を対象に施すステッ
プをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の追加の療法は、細胞ベース
の療法、小分子、免疫療法、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、および外科手術からな
る群から選択される。
本明細書では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプ
チド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子、および／または別の治療
剤を含む単離された細胞質体（例えば、組換え細胞質体、または本明細書に記載の任意の
細胞質体）が提供される。いくつかの実施形態では、治療剤は、薬物または化学療法薬ま
たは遺伝子編集剤である。
また本明細書では、組換え細胞質体（例えば、本明細書に記載の任意の細胞質体）を作
製する方法であって、有核細胞を除核するステップと；治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ
分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療
用ナノ粒子、および／または別の治療剤を除核細胞に導入するステップとを含む、方法が
提供される。いくつかの実施形態では、導入するステップは、除核するステップに先行す
る。いくつかの実施形態では、除核するステップは、導入するステップに先行する。いく
つかの実施形態では、導入するステップは、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療
用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、または他の治療
剤の一過的な発現をもたらす。いくつかの実施形態では、（例えば、導入するステップが
除核するステップに先行する場合）、導入するステップは、治療用ＤＮＡ分子、治療用Ｒ
ＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療遺伝子編集因子、ま
たは他の治療剤の永続的な発現をもたらす。いくつかの実施形態では、治療用ＲＮＡ分子
は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分
子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）、
またはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡ分子は、一本鎖Ｄ
ＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミド、細菌ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ
ウイルスである。いくつかの実施形態では、治療用ＤＮＡまたは治療用ＲＮＡは、遺伝子
療法である。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、酵素、抗体、毒素、サイト
カイン、タンパク質ホルモン、増殖因子、またはワクチンである。いくつかの実施形態で
は、有核細胞は、様々な条件下で（例えば、サイトカイン浴中、または低酸素条件下で）
、除核前に、（例えば、懸濁液中で、接着細胞として、３Ｄ（例えば、半懸濁法または他
の非接着法）における接着細胞として）培養することができる。
また本明細書では、有核細胞をベクターでトランスフェクトするステップと；トランス
フェクト細胞を除核するステップとを含む、組換え細胞質体を作製する方法も提供される
。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（例えばレトロウイルスベク
ター（例えばレンチウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、水疱
ウイルスベクター（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター）、またはハイブ
リッドウイルスベクター）である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、細胞
質複製ウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、核複製ウイ
ルスであり得る。いくつかの実施形態では、除核は、ベクターが有核細胞のゲノムに組み
込まれた後に行われる。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞が除核された後にト
ランスフェクトされる。トランスフェクションと除核の順序は、ベクターの選択に影響を
及ぼす可能性がある。例えば、トランスフェクションが除核前に行われる場合、細胞質複
製ウイルスまたは核複製ウイルスのいずれかが許容可能なベクターになり得る。例えば、
トランスフェクションが除核後に行われる場合、細胞質複製ウイルスが核複製ウイルスよ
りも良好なベクターの選択となり得る。一方、核複製ウイルスは、除核された細胞質体に
パッケージ化され、細胞質体が死滅した際に放出され得る。いくつかの実施形態では、ベ
クターは、治療用タンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用タン
パク質は、酵素、抗体、毒素、サイトカイン、タンパク質ホルモン、増殖因子、またはワ
クチンである。
また本明細書では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用
ペプチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子を発現する細胞質体を含
む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象を治療する方法も提供され
る。いくつかの実施形態では、本方法は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用
タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子を発
現する自然由来の細胞質体または操作された細胞質体を含む組成物の治療有効量を対象に
投与するステップを含み得る。
また本明細書では、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用
ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒子、および／または別の
治療剤を含有する細胞質体を含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、
対象を治療する方法も提供される。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、哺乳動物細胞から得られる。いくつかの実施形
態では、細胞質体は、免疫細胞から得られる。
いくつかの実施形態では、組成物は、ターゲティング部分をさらに含む。いくつかの実
施形態では、ターゲティング部分は、細胞表面タンパク質である。
いくつかの実施形態では、ターゲティング部分は、分泌タンパク質、または細胞外マト
リックスに繋留されたタンパク質である。
特段の定義のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本
発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明
で使用するための方法および材料は、本明細書に記載されている。当技術分野で公知の他
の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は単なる例
示であり、限定することを意図しているのではない。本明細書で言及されているすべての
刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、その
全体が参照により組み込まれる。矛盾のある場合、定義を含む本明細書が優先する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求
の範囲から明白であろう。
図１は、出発材料がドナー由来の同種もしくは自己細胞、または設計された機能（複数可）を有する操作された細胞のいずれかである、本開示の一実施形態の概略図である。 図２Ａは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）脂肪由来のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から生成された細胞質体の代表的な蛍光顕微鏡画像である。細胞は、赤色色素（５－（および－６）－（（（４－クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）（ＣＭＴＭＲ）で染色し、核はＶｙｂｒａｎｔ（登録商標） Ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）グリーンで染色した。矢印は正常な有核細胞を指し、矢尻は、除核された細胞質体を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｂは、ＨＬ－６０ヒト好中球細胞（好中球）から生成された細胞質体の代表的な蛍光顕微鏡画像である。細胞は、赤色色素ＣＭＴＭＲで染色し、核はＶｙｂｒａｎｔ（登録商標） Ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）グリーンで染色した。矢印は有核細胞を指し、矢尻は除核された細胞質体を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞（線維芽細胞）から生成された細胞質体の代表的な蛍光顕微鏡画像である。細胞は、赤色色素ＣＭＴＭＲで染色し、核はＶｙｂｒａｎｔ（登録商標） Ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）グリーンで染色した。矢印は有核細胞を指し、矢尻は除核された細胞質体を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｄは、ヒトナチュラルキラー細胞株ＮＫＬ細胞（ＮＫ）から生成された細胞質体の代表的な蛍光顕微鏡画像である。細胞は、緑色色素５－クロロメチルフルオレセインジアセテート（ＣＭＦＤＡ）で染色し、核は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。矢印は有核細胞を指し、矢尻は除核された細胞質体を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図３Ａは、経時的な生細胞または細胞質体の相対的変化倍率を示す代表的なグラフである。 図３Ｂは、凍結貯蔵（凍結保存）から回復した後の生細胞および細胞質体を示す代表的なグラフである。 図３Ｃは、除核の２４時間後の細胞質体（新鮮な細胞質体）または除核後の凍結貯蔵（凍結保存）から回復した２４時間後の相対的生存率を示し、新鮮な細胞質体および凍結保存された細胞質体を除核した４時間後の細胞質体の生存率と比較した代表的なグラフである。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０。 図４は、示した蛍光抗体／マーカー（ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ４５、およびアイソタイプ対照）のシグナル強度に対してカウントされた事象の数を示す代表的なフローサイトメトリーのグラフである。骨髄ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体は、除核の２４時間後に染色し、次いで、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いたフローサイトメトリーにより分析した。緑色（薄い灰色）は有核ＭＳＣを表し、赤色（濃い灰色）は除核された細胞質体を表す。 図５Ａは、２次元（２Ｄ）ガラスボトムチャンバーで培養し、ローダミンファロイジンで染色してＦ－アクチン細胞骨格を可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印は染色された細胞骨格構造を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｂは、２Ｄガラスボトムチャンバーで培養し、ローダミンファロイジンで染色してＦ－アクチン細胞骨格を可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印は染色された細胞骨格構造を指す。矢尻は核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｃは、２Ｄガラスボトムチャンバーで培養し、抗ａ－チューブリン抗体で染色して微小管ネットワークを可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印は染色された細胞骨格構造を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｄは、２Ｄガラスボトムチャンバーで培養し、抗ａ－チューブリン抗体で染色して微小管ネットワークを可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印は染色された細胞骨格構造を指す。矢尻は核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｅは、３次元（３Ｄ）コラーゲンマトリックスで２４時間培養し、ローダミンファロイジンで染色してＦ－アクチン細胞骨格を可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｅ’は、核を可視化するための非マージＤＡＰＩ染色を示す、５Ｅの代表的な共焦点顕微鏡画像である。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｆは、３Ｄコラーゲンマトリックスで２４時間培養し、ローダミンファロイジンで染色してＦ－アクチン細胞骨格を可視化し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢尻は核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｆ’は、核を可視化するための未結合ＤＡＰＩ染色を示す、５Ｆの代表的な共焦点顕微鏡画像である。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ａは、完全培地で１６時間培養し、次いで固定し、クリスタルバイオレットで染色したＭＳＣの代表的な位相差顕微鏡画像である。矢尻は非常に明確なナノチューブを指す。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ｂは、完全培地で１６時間培養し、次いで固定し、ミトコンドリアマーカー抗アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）およびＤＡＰＩで染色して核を可視化したＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢尻は、突出したミトコンドリア染色による非常に明確なナノチューブを指す。緑色（薄い灰色）は、ＡＩＦ標識ミトコンドリアを表す。青色（濃い灰色）は、ＤＡＰＩ染色した核を表す。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ｃは、完全培地で１６時間培養し、次いで固定し、クリスタルバイオレットで染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な位相差顕微鏡画像である。矢尻は、非常に明確なナノチューブを指す。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ｃ’は、図６Ｃ’の拡大画像である。矢尻は、非常に明確なナノチューブを指す。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ｄは、完全培地で１６時間培養し、次いで固定し、ミトコンドリアマーカー抗ＡＩＦおよびＤＡＰＩで染色し、核を可視化したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢尻は、突出したミトコンドリア染色による非常に明確なナノチューブを指す。緑色（薄い灰色）は、ＡＩＦ標識ミトコンドリアを表す。青色（濃い灰色）は、ＤＡＰＩ染色した核を表す。スケールバー＝５０μｍ。 図６Ｄ’は、図６Ｄの拡大画像である。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａは、ミトコンドリアマーカー抗ＡＩＦ（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色した脂肪由来ＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はミトコンドリアを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ａ’は、ミトコンドリアマーカー抗ＡＩＦ（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点画像である。矢印はミトコンドリアを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｂは、リソソームマーカーの抗リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１、薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色した脂肪由来ＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はリソソームを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｂ’は、ＬＡＭＰ１（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はリソソームを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｃは、ＳｉＳｏ細胞（ＲＣＡＳ１、薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で発現されるゴルジマーカー抗受容体結合がん抗原で染色した脂肪由来ＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はゴルジを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｃ’は、ゴルジマーカー抗ＲＣＡＳ１（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はゴルジを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｄは、小胞体（ＥＲ）マーカー抗タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ、薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色した脂肪由来ＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はＥＲを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｄ’は、小胞体（ＥＲ）マーカー抗ＰＤＩ（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はＥＲを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｅは、エンドソームマーカーの抗初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１、薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色した脂肪由来ＭＳＣの代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はリソソームを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図７Ｅ’は、エンドソームマーカーの抗ＥＥＡ１（薄い灰色）およびＤＡＰＩ（濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な共焦点顕微鏡画像である。矢印はリソソームを指す。矢尻は、核を指す。スケールバー＝５０μｍ。 図８Ａは、３時間で８．０μｍの多孔質フィルターの下面にうまく移動し、次いでクリスタルバイオレットで染色したボイデンチャンバーアッセイにおけるＭＳＣまたは細胞質体の代表的な明視野顕微鏡画像である。陰性対照では、細胞および細胞質体は、上部および下部チャンバーの両方において２％ＦＢＳを含有する培養培地で移動した。刺激を受けた群では、上部チャンバーの底面をフィブロネクチンでコーティングし、１００ｎｇ／ｍＬの間質細胞由来因子１アルファ（ＳＤＦ－Ια）を下部チャンバーに加えた。スケールバー＝５０μｍ。 図８Ｂは、図８Ａのように処理した移動ＭＳＣまたは細胞質体の比率を示す代表的な棒グラフであり（陰性または刺激）、各量はローディング対照（ＭＳＣまたはフィブロネクチンコーティングプレートに直接付着した細胞質体）に対して正規化された。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０。 図９Ａは、１００μＭの細胞透過性ペプチド（Ａｒｇ）９－ＦＡＭ（フルオレセインアミダイト、薄い灰色）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核、濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣの代表的な落射蛍光顕微鏡画像である。矢印は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色核を示す。矢尻は、陽性（Ａｒｇ）９－ＦＡＭシグナルを示す。 図９Ｂは、１００μＭの細胞透過性蛍光ペプチド（Ａｒｇ）９－ＦＭ（薄い灰色）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核、濃い灰色の楕円）で染色したＭＳＣ由来の細胞質体の代表的な落射蛍光顕微鏡画像である。矢印は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色核を示す。矢尻は、陽性（Ａｒｇ）９－ＦＡＭ蛍光を示す。 図９Ｃは、１００μＭの化学療法薬ドキソルビシン（薄い灰色）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（かすかに濃い灰色の楕円形）で染色したＭＳＣの代表的な落射蛍光顕微鏡画像である。矢印は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色核を示す。 図９Ｄは、１００μＭの化学療法薬ドキソルビシン（薄い灰色）とともにインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（かすかに濃い灰色の楕円形）で染色したＭＳＣ由来細胞質体の代表的な落射蛍光顕微鏡画像である。矢印は、陽性のドキソルビシン蛍光を示す。 図９Ｅは、面積当たりの細胞および細胞質体の平均補正総細胞蛍光を示す代表的な棒グラフであり、細胞と細胞質体の間のサイズの違いを考慮しながら相対蛍光をモデル化する。補正総細胞蛍光＝統合密度－（選択した細胞の面積＊バックグラウンド測定値の平均蛍光）。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０。 図１０Ａは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、明るい灰色の点）で標識した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とともに２４時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（核、濃淡のない灰色の楕円形）で染色したＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体のマージおよび非マージの共焦点顕微鏡および位相差画像のパネルである。矢尻は、陽性のＦＩＴＣ標識ｓｉＲＮＡ蛍光を示す。矢印は核を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１０Ｂは、細胞と細胞質体の平均補正総細胞蛍光を示す代表的な棒グラフであり、細胞と細胞質体の間のサイズの違いを考慮しながら相対蛍光をモデル化する。補正された総細胞蛍光＝統合密度－（選択した細胞の面積＊バックグラウンド測定値の平均蛍光）。 図１１Ａは、精製強化緑色蛍光タンパク質メッセンジャーＲＮＡ（ＥＧＦＰ－ｍＲＮＡ）でトランスフェクションした２０時間後のＭＳＣおよびＭＳＣ由来の細胞質体の代表的なマージおよび非マージの落射蛍光顕微鏡画像であり、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した。 図１１Ｂは、図１１Ａのように処理したＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体のＥＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクション効率（全細胞中のトランスフェクト細胞のパーセンテージ）を示す代表的な棒グラフである。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。 図１１Ｃは、サイズの違いを説明する、細胞と細胞質体の間の相対的ＥＧＦＰ蛍光強度を示す代表的な棒グラフである。平均±ＳＥＭ；ＭＳＣ群、ｎ＝２７；ＭＳＣ由来細胞質体群、ｎ＝２３。補正した総細胞蛍光＝統合密度－（選択した細胞の面積＊バックグラウンド測定値の平均蛍光）。すべてのデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。 図１２Ａは、対照培地、ＭＳＣ馴化培地（ＭＳＣ ＣＭ）、ＭＳＣ由来細胞質馴化培地（細胞質体 ＣＭ）、または５０ｎｇ／ｍＬの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のいずれかで１０分間処理した細胞の代表的なウェスタンブロットである。免疫ブロット法をプロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）、リン酸化Ａｋｔ（ｐ－Ａｋｔ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｒｋ）、リン酸化Ｅｒｋ（ｐ－Ｅｒｋ）について実施した。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）はローディング対照であった。 図１２Ｂは、Ｇｌｕｅ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭＳＣ（ＭＳＣ－Ｇｌｕｃ）、非トランスフェクトＭＳＣ対照細胞（ＭＳＣ）、Ｇｌｕｅ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭＳＣ由来細胞質体（細胞質体－Ｇｌｕｃ）および非トランスフェクトＭＳＣ由来細胞質体（細胞質体）のプレーティングから４８時間後の培地における相対的ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｅ）活性を示す代表的な棒グラフである。 図１２Ｃは、ボイデンチャンバーアッセイにおいて４時間、示した馴化培地の勾配に向けて移動するＲＡＷ ２６４．７マクロファージの比率を示す代表的な棒グラフである。下部膜表面の移動細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞数をフィールド当たりでカウントし、ローディング対照（フィブロネクチンコーティングプレートに直接付着した細胞）に対して正規化した。コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１）、陽性対照として４０ｎｇ／ｍＬのマウスＣＳＦ－１；ＭＳＣ培地、ＭＳＣからの馴化培地；細胞質体培地、ＭＳＣ由来細胞質体からの馴化培地。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０。 図１３Ａは、ＭＳＣおよび細胞質体にトランスフェクトされたインターロイキン１０（ＩＬ－１０）ｍＲＮＡの概略図である。コザック配列は、ＩＬ－１０ ｍＲＮＡコード領域（ＣＤＳ）の開始コドンの前に付加された。ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、それぞれ、ＩＬ－１０ ＣＤＳの５’および３’末端に付加された。人工５’ＣａｐをＩＬ－１０ ｍＲＮＡの５’末端に付加し、プソイドウリジン修飾を操作してｍＲＮＡの安定性を高めた。 図１３Ｂは、トランスフェクトされた（＋＋）または非トランスフェクトされた（－）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体の培養培地におけるＩＬ－１０濃度を示す棒グラフである。ＭＳＣ由来細胞質体にＩＬ－１０ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで２４ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルで播種した。馴化培地（ＣＭ）をトランスフェクションの２４時間後に回収し、ＩＬ－１０濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。 図１３Ｃは、１時間、図１３Ｂのように処理したＭＳＣまたは細胞質体からの示した馴化培地（ＣＭ）で処理した血清飢餓ＲＡＷマクロファージ細胞におけるＳｔａｔ３およびリン酸化Ｓｔａｔ３（Ｐ－Ｓｔａｔ３、ＩＬ－１０活性化のマーカー）のタンパク質発現を示す免疫ブロットである。未処理＝ＣＭ処理なし対照。完全培地＝ＭＳＣ完全培養培地で処理したＲＡＷ細胞。ＭＳＣ Ｃｔｒｌ＝非トランスフェクトＭＳＣからのＣＭで処理したＲＡＷ細胞。ＭＳＣ ＩＬ－１０＝ＩＬ－１０ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭＳＣからのＣＭで処理したＲＡＷ細胞。細胞質体Ｃｔｒｌ＝非トランスフェクト細胞質体からのＣＭで処理したＲＡＷ細胞。細胞質体ＩＬ－１０＝ＩＬ－１０ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞質体からのＣＭで処理したＲＡＷ細胞。 図１３Ｄは、ＥＬＩＳＡにより決定されたマウス血液中の分泌ＩＬ－１０サイトカインの濃度を示す棒グラフである。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来の細胞質体を図１３Ｂのように処理し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に後眼窩注射した。注射の２時間後、動物を安楽死させ、血液サンプルを心臓穿刺により回収した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。 図１４Ａは、２４時間、化学誘引物質としての１０％ＦＢＳに向けて基底膜抽出物（ＢＭＥ）でコーティングした８．０μｍの多孔質フィルター下面に侵入した、ボイデンチャンバーアッセイにおけるクリスタルバイオレット染色ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体の代表的な明視野顕微鏡画像である。陰性＝ＦＢＳなし（陰性対照）。スケールバー＝５０μｍ。 図１４Ｂは、ローディング対照と比較して、膜の下面に侵入した、図１４Ａのように処理したＭＳＣまたはＭＳＣ由来の細胞質体の比率を示す代表的な棒グラフである。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１８。 図１５Ａは、懸濁培地中のＭＳＣおよび細胞質体の代表的な落射蛍光顕微鏡画像（上のパネル）および位相差顕微鏡画像（下のパネル）である。アクチン皮質はＬｉｆｅａｃｔ ＲＦＰで染色し、細胞核はＶｙｂｒａｎｔ（登録商標） Ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）グリーンで染色した。矢印は細胞質体を指し、矢尻は、ＭＳＣ核を指す。スケールバー＝２０μｍ。 図１５Ｂは、Ｎｉｋｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアで測定したＭＳＣおよび細胞質体のサイズ分布を示す代表的な散布図である。平均±ＳＥＭ；ｎ＝８０。 図１５Ｃは、肺に存在する、検出されたＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ標識ＭＳＣまたは細胞質体を示す代表的な棒グラフである。ＭＳＣまたは細胞質体をＤｉＤ色素で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に眼窩後部注射した。組織を２４時間後に採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。 図１５Ｄは、肝臓に存在する、検出されたＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ標識ＭＳＣまたは細胞質体を示す代表的な棒グラフである。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。ＭＳＣまたは細胞質体をＤｉＤ色素で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に眼窩後部注射した。組織を２４時間後に採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。 図１６Ａは、ＭＳＣおよび細胞質体でＣＸＣＲ４を発現するように操作された代表的なレンチウイルスベクターの概略図である（配列番号１～１５）。 図１６Ｂは、Ｆｌｏｗ Ｊｏによって分析した、操作された細胞質体および操作された親ＭＳＣでの蛍光抗体による細胞表面ＣＸＣＲ４発現のシグナル強度に対してカウントされた事象の数を示す代表的なフローサイトメトリーのグラフである。 図１６Ｃは、ローディング対照と比較して、ボイデンチャンバー膜の下面に移動した移動細胞または細胞質体の比率を示す代表的な棒グラフである。平均±ＳＥＭ；ｎ＝１０。図１６Ａのように操作されたＣＸＣＲ４受容体を有する、および有さないＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体は、ボイデンチャンバーアッセイにおいて２時間、示した濃度のＳＤＦ－Ｉαに向けて移動することができた。 図１７Ａは、ＭＳＣおよび細胞質体でＰＳＧＬ１（Ｐ－セレクチン糖タンパク質リガンド１）およびＦｕｔ７（フコシルトランスフェラーゼ、グリコシレート／ＰＳＧＬ１を活性化）を発現するように操作されたレンチウイルスベクターの概略図である。ＰＳＧＬ１（配列番号１６）およびＦｕｔ７（配列番号１７）のコード配列は、２Ａ配列（配列番号１８）により連結された。 図１７Ｂは、Ｆｌｏｗ Ｊｏによって分析した、操作された細胞質体および操作された親ＭＳＣでの蛍光抗体による細胞表面ＰＳＧＬ１発現のシグナル強度に対してカウントされた事象の数を示す代表的なフローサイトメトリーのグラフである。 図１７Ｃは、フローサイトメトリーによって決定した、操作されたＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体とＰ－セレクチンの細胞表面結合を示す代表的なグラフである。ＭＳＣ対照＝親ＭＳＣ。操作されたＭＳＣ＝ＰＳＧＬ１／Ｆｕｔ７操作されたＭＳＣ。操作された細胞質体＝ＰＳＧＬ１／Ｆｕｔ７操作されたＭＳＣ由来細胞質体。 図１８Ａは、ＭＳＣおよび細胞質体でｍＣＤ４７（配列番号１９）を発現するように操作されたレンチウイルスベクターの概略図である。 図１８Ｂは、Ｆｌｏｗ Ｊｏによって分析した、操作された細胞質体およびＭＳＣでのｍＣＤ４７発現の細胞表面のシグナル強度に対してカウントされた事象の数を示す代表的なフローサイトメトリーのグラフである。 図１８Ｃは、マクロファージ（Ｆ４／８０－およびＣＤ１ ｌｂ－）によって貪食されなかった生存細胞質体（ＤｉＤ＋）の数を示す代表的な棒グラフであって、細胞質体が肺でマクロファージ食作用を免れたことを示している。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。ＤｉＤ色素で標識した対照細胞質体または操作された細胞質体（ｍＣＤ４７細胞質体）は、マウスの血管系に眼窩後部注射した。２４時間後、組織を採取し、２つの異なるパン－マクロファージマーカー（Ｆ４／８０およびＣＤ１ ｌｂ）で染色した。 図１８Ｄは、マクロファージ（Ｆ４／８０－およびＣＤ１ ｌｂ－）によって貪食されなかった生存細胞質体（ＤｉＤ＋）を示す代表的な棒グラフであって、細胞質体が肝臓でマクロファージ食作用を免れたことを示している。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３。ＤｉＤ色素で標識した対照細胞質体または操作された細胞質体（ｍＣＤ４７細胞質体）は、マウスの血管系に眼窩後部注射した。２４時間後、組織を採取し、２つの異なるパン－マクロファージマーカー（Ｆ４／８０およびＣＤ１ ｌｂ）で染色した。 図１９Ａは、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡ設計の概略図である。コザック配列は、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡコード領域（ＣＤＳ）の開始コドンの前に付加された。ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは、それぞれ、ＩＬ－１２ ＣＤＳの５’および３’末端に付加された。人工５’ＣａｐをＩＬ－１２ ｍＲＮＡの５’末端に付加し、プソイドウリジン修飾を実行してｍＲＮＡの安定性を高めた。 図１９Ｂは、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで２４ウェルプレートの２．５×１０４細胞／ウェルでプレートした、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体の馴化培地における経時的な分泌ＩＬ－１２濃度を示す代表的な折れ線グラフである。ＣＭを示した時点で回収し、分泌されたＩＬ－１２濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。ＭＳＣのみ＝非トランスフェクト対照からのＣＭ。ＭＳＣ ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭＳＣからのＣＭ。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞質体。 図１９Ｃは、リン酸化／活性化型Ｓｔａｔ４（Ｐ－Ｓｔａｔ４）の活性化を示すイムノブロットである。マウス脾細胞を完全培地、精製ＩＬ－１２タンパク質標準、または図１９Ｂのように操作したＭＳＣもしくは細胞質体から回収した、示したＣＭで３０分間処理した。ＭＳＣ完全培地＝ＭＳＣ完全培養培地で処理したマウス脾細胞。ＭＳＣ ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭＳＣからのＣＭで処理。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞質体からのＣＭで処理。 図１９Ｄは、腫瘍タンパク質１ｍｇ当たりの分泌ＩＬ－１２サイトカインの濃度を示す代表的な散布図である。図１９Ｂのように処理したＩＬ－１２操作または対照細胞質体を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスで増殖する確立されたＥ０７７１（マウス髄様乳癌）腫瘍に注射した。腫瘍注射の４８時間後、動物を安楽死させ、腫瘍サンプルを回収し、溶解し、ＥＬＩＳＡにより分析した。ＰＢＳ＝ＰＢＳを注射したマウスのサンプル。細胞質体＝非操作の細胞質体が注射されたマウスのサンプル。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２サイトカインを発現するように操作された細胞質体が注射されたマウスのサンプル。 図２０Ａは、インターフェロン－γｍＲＮＡの発現の変化倍率を示す散布図である。ＩＬ－１２を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体またはＩＬ－１２を伴わない対照の細胞質体を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスで増殖する確立されたＥ０７７１腫瘍に注射した。注射の４８時間後、動物を安楽死させ、腫瘍サンプルを回収し、溶解し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより分析した。ＰＢＳ＝ＰＢＳを注射したマウスのサンプル。細胞質体＝非操作の細胞質体が注射されたマウスのサンプル。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２サイトカインを発現するように操作された細胞質体が注射されたマウスの腫瘍サンプル。各ドットは、マウス腫瘍サンプルを表す。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５。 図２０Ｂは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの発現の変化倍率を示す散布図である。ＩＬ－１２を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体またはＩＬ－１２を伴わない対照の細胞質体を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスで増殖する確立されたＥ０７７１腫瘍に注射した。注射の４８時間後、動物を安楽死させ、腫瘍サンプルを回収し、溶解し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより分析した。ＰＢＳ＝ＰＢＳを注射したマウスのサンプル。細胞質体＝非操作の細胞質体が注射されたマウスのサンプル。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２サイトカインを発現するように操作された細胞質体が注射されたマウスの腫瘍サンプル。各ドットは、マウス腫瘍サンプルを表す。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５。 図２０Ｃは、ＣＸＣＬ９ ｍＲＮＡの発現の変化倍率を示す散布図である。ＩＬ－１２を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体またはＩＬ－１２を伴わない対照の細胞質体を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスで増殖する確立されたＥ０７７１腫瘍に注射した。注射の４８時間後、動物を安楽死させ、腫瘍サンプルを回収し、溶解し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより分析した。ＰＢＳ＝ＰＢＳを注射したマウスのサンプル。細胞質体＝非操作の細胞質体が注射されたマウスのサンプル。細胞質体ＩＬ－１２＝ＩＬ－１２サイトカインを発現するように操作された細胞質体が注射されたマウスの腫瘍サンプル。各ドットは、マウス腫瘍サンプルを表す。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５。 図２０Ｄは、腫瘍細胞接種後の１１日目、１４日目および１８日目に、３×１０６個のＩＬ－１２操作された細胞質体（細胞質体ＩＬ１２群）またはＰＢＳ（ＰＢＳ群）を腫瘍内注射したＣ５７Ｂ１／６マウスにおけるＥ０７７１皮下腫瘍サイズの変化倍率を示す棒グラフである。腫瘍サイズの変化倍率＝２０日目の腫瘍体積／１１日目の腫瘍体積。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５。 図２１Ａは、ＧＦＰをコードする腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ－ＧＦＰ）の０．０５ ＭＯＩに感染したＬｉｆｅａｃｔ－ＲＦＰ発現ＭＳＣまたは細胞質体をヌードマウスの皮下Ｕ８７膠芽腫腫瘍に注射した７日後に撮られた落射蛍光顕微鏡画像である。矢尻は、ＲＦＰ陽性細胞を表す（腫瘍内のＭＳＣの生存および増殖を示す）。矢印は、ＧＦＰ陽性腫瘍細胞を表す（ＭＳＣまたは細胞質体から腫瘍細胞へのｏＨＳＶ－ＧＦＰの移入の成功）。スケールバー＝１００ｕｍ。 図２１Ｂは、図２１Ａのように処理した腫瘍に関するＧＦＰ陽性腫瘍面積のパーセンテージを示す棒グラフであり、ｏＨＳＶ－ＧＦＰウイルスを運ぶＭＳＣまたは細胞質体に感染された腫瘍細胞の部分を表す。 図２１Ｃは、フローサイトメトリーにより分析した、操作された細胞質体が注射された腫瘍に存在する総ＣＤ４５＋（免疫細胞）うちのＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球細胞の比率を示す散布図である。Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける確立された皮下Ｅ０７７１腫瘍に、ｏＨＳＶをトランスフェクトし、ＩＬ－１２操作された細胞質体またはＰＢＳのみの注射（陰性対照）を腫瘍内に注射した。 図２２Ａは、Ｃｒｅ操作された細胞質体とうまく融合した有核ＭＳＣ細胞におけるＲＦＰ発現を示す代表的な落射蛍光顕微鏡画像である。ＭＳＣ由来細胞質体は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するように遺伝子操作し、次いでＬｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰを発現するように操作されたｈＴＥＲＴ－ＭＳＣと３：１の比率で電気融合した（３パルスで１００μｓについて５００Ｖ未満）。蛍光画像は、ＲＦＰのソーティングおよびＨｏｅｃｈｓｔによる染色後に撮った。矢尻は、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色核を示し、矢印は、ＲＦＰのＣｒｅ誘導性発現の成功を示す陽性ＲＦＰ蛍光を示す。スケールバー＝１００μｍ。 図２２Ｂは、全細胞のうちのＲＦＰ＋（融合）細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。Ｌｏｘｐ ＭＳＣのみ＝Ｌｏｘｐ－ＧＦＰ－ｓｔｏｐ－Ｌｏｘｐ－ＲＦＰ－ｈＴＥＲＴ－ＭＳＣの単独培養。Ｃｒｅ細胞質体のみ＝Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するように操作された細胞質体の単独培養。共培養＝４８時間のＬｏｘｐ ＭＳＣとＣｒｅ細胞質体の共培養。融合＝Ｌｏｘｐ ＭＳＣおよびＣｒｅ細胞質体の電気融合。平均±ＳＥＭ；ｎ＝４。 図２３は、ＭＳＣおよび細胞質体でｍＣＣＲ２（配列番号２０）を発現するように操作されたレンチウイルスベクターの概略図である。 図２４Ａは、肺において検出されたＤｉＤ標識ＭＳＣまたは細胞質体の数を示す代表的な散布図である。ＭＳＣは、標準接着条件下（２Ｄ）またはハンギングドロップ法（３Ｄ）による懸濁液で培養され、３Ｄ細胞質体を生成した。ＭＳＣおよび細胞質体をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ色素で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に眼窩後部注射した。組織を２４時間後に採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝２。 図２４Ｂは、肝臓において検出されたＤｉＤ標識ＭＳＣまたは細胞質体の数を示す代表的な散布図である。ＭＳＣは、標準接着条件下（２Ｄ）またはハンギングドロップ法（３Ｄ）による懸濁液で培養され、３Ｄ細胞質体を生成した。ＭＳＣおよび細胞質体をＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ色素で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に眼窩後部注射した。組織を２４時間後に採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝２。 図２４Ｃは、脾臓において検出されたＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｉＤ標識ＭＳＣまたは細胞質体の数を示す代表的な散布図である。ＭＳＣは、標準接着条件下（２Ｄ）またはハンギングドロップ法（３Ｄ）による懸濁液で培養され、３Ｄ細胞質体を生成した。ＭＳＣおよび細胞質体をＤｉＤ色素で標識し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血管系に眼窩後部注射した。組織を２４時間後に採取し、細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝２。 図２５Ａは、示した量の時間、摂氏４度の凍結冬眠から回復した直後のＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体の生存率を示す代表的な折れ線グラフである。生存率はトリパンブルー色素排除を使用して自動化された細胞計数（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｓｓ）で評価し、投入細胞数に対する比率として表示した。 図２５Ｂは、示した量の時間、摂氏４度の凍結冬眠から回復した直後のボイデンチャンバーアッセイにおいて、移動したＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体を比較する代表的な棒グラフである。細胞および細胞質体を、血清なし（陰性対照）または底部チャンバーの化学誘引物質としての１０％プレミアムＦＢＳ（Ｐ－ＦＢＳ）のいずれかで３時間移動させ、カウントをローディング対照に対して正規化した。
本開示は、本明細書に記載されている、核が除去された細胞（例えば細胞質体）が治療
機能を示すことを初めて示す。一部の実施形態では、細胞はサイトカラシンＢで処理され
、皮質アクチン細胞骨格が軟化され得る。次いで、核をフィコールの勾配で高速遠心分離
により細胞体から物理的に抽出し、無核（除核）細胞質体を生成することができる。細胞
質体および無傷の有核細胞はフィコール勾配の異なる層に沈澱するので、いくつかの実施
形態では、細胞質体は、治療目的のため、または他の細胞（有核または除核）との融合の
ために容易に単離および調製することができる。除核プロセスは臨床的に拡大して、数千
万の細胞を処理することができる。概念実証データは、細胞質体を、臨床的に関連するカ
ーゴ／ペイロードを送達するホーミングビヒクルとして、健康な個体の処置（例えば、エ
ネルギーの改善、運動からの回復、もしくは天然産物の送達）、または各種疾患（例えば
、本明細書に記載の疾患のいずれか）の治療に使用することができることを示している。
例えば、細胞質体を使用して、サプリメント、抗老化因子、予防的治療などを健康な個体
に、例えば、送達された治療薬が有効である特定の障害を有することが診断されていない
個体に送達することができる。細胞質体は、次の特性のうちの１つまたは複数を有するこ
とが可能であることから、重要な治療的価値を有する：最長１４日間生存を維持する、他
の細胞型に分化しない、生物活性タンパク質を分泌する、物理的に移動／ホーミングする
ことができる、ｅｘ ｖｉｖｏで広範囲に操作して特定の治療機能を果たすことができる
、および同一のまたは他の細胞型に融合させて自然のまたは操作された望ましい細胞機能
を移行することができる。したがって、細胞質体は、治療上重要な生体分子、遺伝子編集
因子、および化学療法薬（例えばドキソルビシン）、遺伝子、ウイルス、細菌、ｍＲＮＡ
、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、プラスミド、およびナノ粒子を含めた疾患ターゲ
ティングカーゴを送達するための新規細胞ビヒクルとして幅広い有用性を有し得る。本開
示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞質体を使用すると望ましくないＤ
ＮＡが対象に移入されないと考えられるため、安全な治療薬の生成を有利に可能にする。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞質体の細胞死が、いくつかの実施形態では、正
確な量の時間、例えば３～４日で起こり得るため、制御可能な治療を有利に可能にする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞質体は、特定の遺伝子編集カーゴ、疾患
ファイティングカーゴ、および健康促進カーゴをヒトまたは動物に送達するように遺伝子
操作できる細胞ベースの担体として作用し得る。最後に、臨床適用に向けた多量の治療用
細胞の製造は制限され、また高価になる可能性があるため、特に幹細胞分野で、多くの細
胞ベースの療法の適用が制限されている。したがって、堅調でコスト効率が良好であり得
るので、（ｈＴＥＲＴ、ウイルス、およびがん遺伝子を使用する）不死化細胞を使用して
製造能力を高めることは有益となり得る。しかし、不死化細胞はがんを引き起こす場合が
あり、したがって、治療適用には危険すぎる可能性がある。有核細胞は投与または使用の
前に除核により安全にすることができるため、本開示は、治療で使用する培養の大規模製
造のために有核細胞（不死化細胞、がん細胞（例えば任意のがん細胞）、初代（例えば宿
主由来）細胞、または細胞株）のタイプを使用することができる。
本開示は、対象において安全で制御可能な細胞ベースの治療薬を、寿命にわたり核を維
持するかまたは自然には除核しない任意の有核細胞タイプから生成する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、正常もしくはがん細胞株のいずれかに由来する（例
えば、それから得られた）任意の有核細胞から、または、限定するものではないが、免疫
系に由来する（例えば、それから得られた）一般的に使用される治療用細胞（例えば、ナ
チュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージ、リンパ球、マスト細胞、好塩基
球、好酸球）、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）、成体幹細胞（例えば間
葉系幹細胞）、および胚性幹細胞）、ならびに線維芽細胞を含めた身体から取り出された
任意の初代細胞から細胞核を除去する（除核ともいう）ための方法を提供する。細胞除核
は、限定された期間、例えば、最長３～４日間、生存可能な治療用細胞質体を作製するこ
とができる。したがって、本開示は、いくつかの態様では、次の作用：増殖、分化、対象
への永久的な生着、がん化、または核にコードされているＤＮＡ／遺伝子の対象への移入
（例えば、核にコードされている危険なＤＮＡ／遺伝子の対象への移入）のうちの１つま
たは複数を達成することができない安全な治療用ビヒクルとしての細胞質体の新規使用を
提供する。
細胞ベースの療法の場合、ＦＤＡの承認は、一部の場合、細胞が安定しているという証
拠に基づいており、それは、対象内部に入ると、細胞が変化することも、危険化すること
もないことを意味する。しかし、初代細胞、照射細胞、または「デススイッチ」制御細胞
を含む現行の細胞産物は、ｉｎ ｖｉｖｏの微小環境において応答または変化する可能性
を依然として有する。重要なことには、現行の療法は、新しい遺伝子を転写する可能性を
依然として保持し得、これはｉｎ ｖｉｖｏでの制御可能な応答ではない。この遺伝子転
写は、規制要件を満たす能力を阻止する。反対に、核を欠損する細胞質体は、一般的には
、著しく異なるｉｎ ｖｉｖｏの微細環境であっても新しい遺伝子転写の可能性はなく、
したがって、より制御された安全な細胞ベースの療法である。
今日まで、細胞ベースの治療薬は、一般的には、正常な、または操作された有核細胞を
使用している。いくつかの細胞ベースの療法は、細胞増殖および誘発性の致命的ＤＮＡ損
傷を防止するため、対象に投与する前に細胞に照射する。しかし、この手法は変異を誘発
し、細胞タンパク質およびＤＮＡを不可逆的に損傷し得る著しい量の活性酸素種を生成し
、損傷／変異した多量のＤＮＡを対象の体内に放出する可能性がある。そのような産物は
、他の細胞に組み込まれ、および／または望ましくない抗ＤＮＡ免疫応答を誘発する場合
、危険になり得る。また照射細胞は、細胞間融合によって宿主細胞にそれらの変異ＤＮＡ
および遺伝子を移入し得るので、危険となる可能性がある。核全体を細胞から除去するこ
とは、対象への核ＤＮＡのいかなる導入も妨げることができる細胞寿命を限定するダメー
ジの少ない、非常に安全性が高い方法である。さらに、多くの幹細胞、例えば間葉系幹細
胞（ＭＳＣ）は放射線誘発による死滅に対して非常に耐性があるので、この方法を使用し
て安全にすることはできない。他の場合では、治療用細胞は、細胞の寿命を限定するよう
に薬物誘発性自殺スイッチを用いて操作されている。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでのスイッ
チの活性化には、望ましくない副作用のある強力で有害な可能性のある薬物を対象に投与
する必要があり得る。この方法は、培養細胞において自殺を誘発し得るが（例えば９５％
超）、臨床で翻訳された場合には非効率になることが予想される。いかなる特定の理論に
も束縛されるものでないが、薬物誘発性自殺スイッチは、対象におけるすべての細胞が薬
物誘発性死滅を受けるわけではないため、臨床診療においては安全対策が不十分な可能性
があると考えられている。したがって、広範に操作された細胞または幹細胞またはがん細
胞の場合、薬物誘発性自殺スイッチは危険である、または臨床診療には不十分であると考
えられ得る。さらに、治療用細胞の死は、多量のＤＮＡ（正常または遺伝的に変化したも
の）を放出する可能性があり、これらが宿主細胞に組み込まれるか、または危険な全身性
抗ＤＮＡ免疫応答を誘発し得る。細胞が自殺スイッチを変異および／または喪失もしくは
不活性化する場合、制御不能な変異細胞になることがある。さらに、これらの細胞は、対
象において宿主細胞と融合する可能性があり、したがって、ＤＮＡ（例えば変異ＤＮＡ）
を移入する。すべての宿主細胞が自殺遺伝子を受け継ぐわけではないが、染色体再編成お
よび細胞ハイブリダイゼーション中に、治療用細胞の遺伝子／ＤＮＡの一部を受け継ぐ可
能性があるので、このような融合細胞は危険となり得る。さらに、同様の理由により、自
殺スイッチを含んだ治療用細胞は、細胞融合パートナーとしてｉｎ ｖｉｔｒｏで使用す
るのに理想的ではないことがある。治療用細胞の寿命を限定する別の方法は熱誘導死であ
り、これは治療的使用においては有益な生物学的機能（例えばタンパク質の翻訳）を終了
させる重度の損傷を引き起こす。細胞質体とは異なり、有核細胞療法、および上記の方法
によって不活性化された一部の細胞であっても、核および遺伝物質は保持しているので依
然としてＤＮＡを対象に移入し得る。化学療法薬およびマイトマイシンＣなどを含む、多
数の化学物質は、治療的使用前に細胞増殖を阻害し、および／または細胞死を引き起こす
。しかし、そのような薬物は、細胞を著しく損傷する重大なオフターゲット効果を有して
いる可能性があり、高毒性により臨床用途には望ましくない。多くの抗増殖薬および死滅
誘導薬は、耐性により１００％の細胞を効果的に阻害することはなく、細胞質体とは異な
り、多くの薬物の効果は可逆的である。したがって、この手法は、不死化細胞またはがん
細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの細胞増殖を阻止するのに適していない。
本開示は、限定するものではないが、ＤＮＡ／遺伝子（例えば、プラスミド）ＲＮＡ（
例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、小
分子治療薬（例、小分子薬）、遺伝子編集コンポーネント、ナノ粒子、および他の治療剤
（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス（例えば、腫瘍溶
解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、またはイオン）を含む、治療機能を有する生体分
子の自然もしくは誘導発現および／または取り込みを伴う治療用細胞質体を生成する方法
を提供する。
本開示は、限定するものではないが、ＤＮＡ／遺伝子（例えば、プラスミド）、ＲＮＡ
（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、
小分子治療薬（例えば、小分子薬）、遺伝子編集コンポーネント、ナノ粒子、および他の
治療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス（例えば腫
瘍溶解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、またはイオン）を含む、治療用カーゴを対象
に送達するためのビヒクルとして細胞質体を使用する方法を提供する。
本開示は、限定するものではないが、ＤＮＡ／遺伝子（例えば、プラスミド）、ＲＮＡ
（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、
小分子治療薬（例えば小分子薬）、遺伝子編集コンポーネント、ナノ粒子、および他の治
療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス、エキソソー
ム、または脂質）を含む、細胞質体を使用してイオン、分子、化合物、複合体または生体
分子を生成するための方法（例えば、分泌型、細胞内型、誘導型、またはそれらの組合せ
であり得る）を提供する。
本開示は、任意の有核細胞タイプ（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、もしく
は本明細書に記載の任意の哺乳動物細胞）、原生動物細胞（例えば、アメーバ細胞）、藻
類細胞、植物細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、ま
たは鳥類細胞）に由来する（例えば、それらから得られる）治療用細胞質体を大規模にｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ生産するための方法を提供する。例えば、細胞は、自然にまたは遺伝子操
作によって不死化および／または発がん的に形質転換されていてもよい。
本開示は、限定するものではないが、ミトコンドリア、リボソーム、エンドソーム、リ
ソソーム、ゴルジ、ＤＮＡ／遺伝子（例えば、プラスミド）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ
、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因
子、およびタンパク質ホルモン）、ペプチド、小分子治療薬（例えば小分子薬）、遺伝子
編集コンポーネント、ナノ粒子、および他の治療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリ
オファージ、細菌成分、ウイルス（例えば腫瘍溶解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、
またはイオン）を含む、オルガネラおよび生体分子（分泌型、細胞内型、および天然型お
よび誘導型）を増強および／または移入するために他の細胞または細胞質体（治療用また
は天然）への融合パートナーとして治療用細胞質体（天然のまたは操作された）を使用す
る方法を提供する。
本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて治療用細胞質体を凍結保存、凍結冬眠、貯蔵、お
よび回復させるための方法を提供する。
本開示は、生物学的プロセスおよび健康状態または疾患状態のバイオセンサーおよびシ
グナル伝達指示薬として細胞質体を使用する方法を提供する。
本開示は、いくつかの実施形態では、治療薬として使用することができる、ならびに／
または安全かつ制御可能な方法で、特定疾患ファイティングカーゴおよび健康促進カーゴ
をヒトもしくは動物対象に送達するように改変もしくは遺伝子操作することができる、新
規な無核の細胞ベース生成物を生成することができる。
効果的な細胞ベースの治療薬の開発では、多くの場合、ｅｘ ｖｉｖｏでの新しい遺伝
物質の細胞ゲノムへの遺伝子操作および導入が必要である。しかし、このプロセスは、特
に操作された細胞が体内に永久的に生着する、または宿主細胞と融合する場合、がんおよ
び他の生命を脅かす疾患を引き起こす危険な変異をゲノムに導入する可能性がある。本開
示は、本質的に生物学的なまたは合成のいずれかの特定のペイロードを送達するための安
全な治療薬として、またはビヒクルとして使用するために、任意の有核細胞型から核全体
（すなわち、すべての核にコードされたＤＮＡ）を除去することができる。細胞質体は、
核にコードされた遺伝子または外来もしくは変異ＤＮＡが対象に移入され、望ましくない
疾患状態を引き起こし、および／または抗ＤＮＡ免疫応答を誘発することがないので、有
核細胞よりも安全であり得る。本開示は、限定するものではないが、ｉＰＳＣ（人工多能
性幹細胞）、任意の不死化細胞、幹細胞、初代細胞（例えば、宿主由来細胞）、細胞株、
任意の免疫細胞、またはがん細胞を含む、正常なまたは操作された任意の有核細胞型に由
来する安全な無核細胞治療薬の新しいプラットフォームを生成することができる。除核の
実際的なプロセスが３０年以上も前に文献で確立されていることには注目すべきである。
しかし、治療薬本体または天然のもしくは操作されたいずれかの任意の治療用カーゴを対
象に送達するためのビヒクルとしての細胞質体の使用または開発は、今日まで明示されて
いない。
多くの既存の細胞ベースの治療薬に関する重大な問題は、身体に送達した後、細胞が制
御不能に増殖し、身体に永久的に生着し、それが生命を脅かす可能性があることである。
また、対象に投与した後の細胞制御の欠如により、正確な用量の治療用細胞およびその
生物活性産物を送達することが困難になり得る（すなわち、不良な薬物動態）。本開示の
いくつかの実施形態では、細胞質体は、それらの有核相当物と同じ生物学的／治療的機能
の多くを果たすことができるが、所定の寿命（例えば１時間～１４日間）を有し得るので
、対象において増殖することも、永久的に生着することもない。したがって、細胞質体ベ
ースの療法の薬物動態は定義可能であり、対象における制御可能で予測可能な応答により
非常に安全である。
本開示のいくつかの実施形態では、細胞質体は、それらの所定の寿命を超えて対象に投
与され得る（例えば「死滅」細胞質体）。例えば、投与された細胞質体の死滅プロセスは
、対象に対する免疫刺激効果を有し得る。
患者または対象への送達前に、従来の細胞ベースの治療薬は、望ましい細胞機能および
治療機能を得るように、ｅｘ ｖｉｖｏで一般的に改変または遺伝的に変更される。しか
し、これらの細胞が対象に導入された場合、新しい宿主環境は著しく再プログラムされ、
マイナスに変化するか、さもなければそれらを無効にし得る。細胞質体は核が欠如してい
るので、新しい遺伝子転写はなく、このことは、いくつかの実施形態では、細胞質体が再
プログラミングおよび有害な外部シグナルに応答できないことを意味している。したがっ
て、細胞質体は、対象に導入された場合、それらの分化した表現型およびｅｘ ｖｉｖｏ
で操作された治療機能を保持することができ、より制御可能で予測可能な治療用ビヒクル
となる。同様に、直接的に除核される正常なドナー細胞は、対象に移植された場合にｉｎ
ｖｉｖｏでプログラム／特質を保持することができる。全体的に、細胞質体は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで表現型および生物学的機能を保持することができるの
で、従来の細胞ベースの治療薬よりも制御可能で予測可能な治療用ビヒクルとなり得る。
そのような特性は、新たに誘導された（例えば、新たに得られた）ドナー細胞、または特
定の治療機能を果たすようにｅｘ ｖｉｖｏで操作された細胞に依存する多くの治療用途
に極めて重要である。
有核細胞とは異なり、無核細胞質体は、いくつかの実施形態では、がんまたは他の疾患
に対する治療剤として対象に送達するための高用量のＤＮＡ損傷／遺伝子ターゲティング
剤を装填することができる。これは、限定するものではないが、ＤＮＡ損傷化学療法薬、
ＤＮＡ組込みウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、ならびに、限定するものではないが、クリ
スパー（cluster regularly interspaced short palindromic repeats）（ＣＲＩＳＰＲ
）、ｃａｓのスモールクラスター（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）、およびプラスミド
を含めた、遺伝子療法適用／送達を含む。
いくつかの実施形態では、細胞質体はまた、細胞質体にいかなるカーゴも装填すること
なく、対象への投与の際に本質的に治療効果をもたらすことができる。いくつかの実施形
態では、細胞質体は、１つまたは複数の治療薬を生成するよう操作されることなく、治療
的であり得る。いくつかの実施形態では、細胞質体は、細胞質体にカーゴが装填されるこ
とも、１つまたは複数の治療薬を生成するよう操作されることもなく治療的であり得る。
例えば、未操作の細胞質体自体は、患者または対象に送達された場合に治療特性を有し得
る。いくつかの実施形態では、未操作の細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分
子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子
のうちの１つまたは複数を生成することができる。いくつかの実施形態では、未操作の細
胞質体（例えば、自己または同種源に由来する）は、次の作用：治療表面タンパク質、免
疫刺激抗原もしくは受容体の発現、サイトカイン、ホルモンもしくはタンパク質の分泌、
エキソソームの放出、膜粒子の脱落、死滅プロセスを通じての免疫刺激性、またはミトコ
ンドリアおよび他の細胞由来の生体分子を移入し得るトンネルナノチューブの生成のうち
の１つまたは複数をもたらす能力を有することができる。いくつかの実施形態では、死滅
した細胞質体は本質的に治療効果をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、細胞質体を細胞（例えば異種培養細胞）に適用し、またはそ
れと培養して、それらの特性を変えることができる。例えば、いくつかの実施形態では、
細胞質体（例えば、未操作の細胞質体または操作された細胞質体）は、異種培養細胞にお
いて健康促進因子をアップレギュレートすることができ、また場合によって、異種培養細
胞を、それらが採取された対象に戻すことができる。
有核細胞とは異なり、細胞質体は、ＤＮＡ損傷誘導性アポトーシス死を受ける可能性は
なく、したがって、がんおよび他の疾患を治療するためのアポトーシス誘導剤および／ま
たはＤＮＡ毒性／ターゲティング剤と組み合わせて使用することができる。
細胞質体は有核相当物よりも小さく、そのため、血管系および組織の実質の小さな開口
部を通って良好に移動することができる。さらに、大きな高密度の核の除去は主要な物理
的障壁を緩和し、細胞が血管および組織の実質の小さな開口部を自由に通過できるように
する。したがって、細胞質体は、改善された体内における生体内分布および標的組織への
移動を有することができる。
有核細胞とは異なり、類似のまたは異なる起源の同一のまたは別の細胞型への細胞質体
の融合は、限定するものではないが、細胞表面タンパク質、シグナル伝達分子、分泌タン
パク質、脂質、およびエピジェネティック変化を含む望ましい治療特質を維持しつつ、問
題の核移入がないユニークな細胞ハイブリッドを生成する。
治療用細胞に由来するエキソソームおよび小細胞膜小胞は、場合によっては、単独で、
または送達器（delivery vessel）として治療効果を有することが示されているが、細胞
質体と顕著に異なり、細胞質体と比較すると制限され得る。同様に、赤血球（ＲＢＣ、赤
血球）は、薬物送達システムとして有用であると仮定されている。ＲＢＣも細胞質体とは
異なり、細胞質体と比較して限界があり得る。エキソソームおよび膜小胞およびＲＢＣと
は異なり、細胞質体は、多くの活性のある生物学的プロセスおよびすべての細胞オルガネ
ラ（例えば、ＥＲ／ゴルジ、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム、細胞骨格など
）を保持し得る生存可能な細胞様の実体であり得る。したがって、細胞質体は有核細胞の
ように機能し、重要な生物学的機能、例えば、接着、トンネルナノチューブ形成、アクチ
ン媒介型拡散（２Ｄおよび３Ｄ）、移動、化学誘引物質勾配感受性、ミトコンドリア移入
、ｍＲＮＡ翻訳、タンパク質合成、ならびにエキソソームおよび他の生物活性分子の分泌
を示し得る。これらの機能のうちの１つまたは複数は、エキソソーム、小細胞膜小胞、ま
たはＲＢＣによって示されない可能性がある。赤芽球に由来するＲＢＣと比較して、細胞
質体は、限定するものではないが、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）、任意の不死化細胞、
幹細胞、初代細胞（例えば、宿主由来細胞）、細胞株、任意の免疫細胞、癌細胞を含む任
意のタイプの有核細胞、または任意の真核細胞に由来し得る。
臨床使用のための細胞ベースの治療薬の開発についての限界は、十分に大量の治療用細
胞、特に幹細胞を生成することが不可能であり非効率である可能性がある。この製造の「
支障」を緩和するため、不死化細胞（ｈＴＥＲＴ、ウイルス、およびがん遺伝子）を使用
して、コスト効率が良い方法で細胞の生成能力を高めることが考えられてきた。しかし、
不死化細胞はがんを引き起こすリスクが高く、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療目的
には危険でありすぎる可能性があり、現在、食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されて
いない。重要なことには、本開示は、不死化細胞、がん細胞（例えば任意のがん細胞）、
初代（例えば宿主由来）細胞、または治療用細胞を大規模生産するための細胞株を使用す
ることができる。その理由は、そのような細胞は、送達前に除核され、安全な治療薬とさ
れるからである。また本開示は、自己または同種療法で使用する大規模製造およびバイオ
バンキングのために、より多くの細胞、細胞株、および／または不死化細胞を個々の対象
から生成することができる（例えば、図１を参照）。このことによって、市販の製品とし
て提供可能な細胞ベースの治療薬の一貫性および品質管理を著しく向上させることができ
る。
さらに、細胞質体は、細胞に由来する（例えば、細胞から得られる）ので、人工的合成
ナノ粒子およびリポソーム製剤と比較して優れた治療用ビヒクルとなることができ、した
がって、完全に機能する細胞実体（核を除外）であることから、対象の毒性を低減しつつ
重要な生理学的機能、細胞特質／オルガネラ、および生物活性分子を生成する生理学的能
力を示す。
本明細書に記載の方法、細胞質体、および組成物のいずれかのいくつかの実施形態では
、有核細胞（例えば、真核細胞、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞
、ウマ細胞、ブタ細胞、霊長類細胞、ウシ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞（例えば、マ
ウス細胞、モルモット細胞、ハムスター細胞、もしくはマウス細胞）、免疫細胞、または
本明細書に記載の任意の有核細胞）をサイトカラシンＢで処理し、皮質アクチン細胞骨格
を軟化させる。次いで、核を細胞体からフィコールの勾配で高速遠心分離により物理的に
抽出し、無核の細胞質体を生成する。本明細書で使用される場合、用語「細胞質体」また
は「組換え細胞質体」は互換的に使用され、細胞の内部塊および細胞オルガネラからなる
前述の有核細胞（例えば、本明細書に記載の任意の細胞）から得られた無核細胞を意味す
る。いくつかの実施形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療
用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子を発現し
得る。いくつかの実施形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治
療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子、ナノ
粒子、または別の治療剤を含有することができる。いくつかの実施形態では、空の細胞質
体（例えば、外因性成分を含まない細胞質体）は、陰性対照として使用される。
いくつかの実施形態では、細胞質体を操作して、例えば、ケモカイン受容体、接着分子
、抗原、あるいは対象内の部位への細胞質体のホーミングを改善し得るか、または所望の
免疫反応を刺激および／もしくはモジュレートし得る他のマーカーを発現させることがで
きる。例えば、細胞質体を操作して抗ＰＤ－Ｌ１抗体を発現させることができる。
いくつかの実施形態では、有核細胞は、（例えば、懸濁液中で、接着細胞として、３Ｄ
中（例えば、半懸濁液もしくは他の非接着方法で）接着細胞として）培養され得るか、ま
たは除核前にクローン的に選択／拡大させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、１時間～１４日未満（例えば、１時間～１時間
未満、１時間～６時間未満、６時間～１２時間、１２時間～１日、１日、２日、３日、４
日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１３日、１４日、１～１４日、１
～１２日、１～１０日、１～９日、１～８日、１～７日、１～６日、１～５日、１～４日
、１～３日、１～２日、２～１４日、２～１２日、２～１０日、２～８日、２～７日、２
～６日、２～５日、２～４日、２～３日、３～１４日、３～１２日、３～１０日、３～８
日、３～７日、３～６日、３～５日、３～４日、４～１４日、４～１２日、４～１０日、
４～８日、４～７日、４～６日、４～５日、４～７日、５～１４日、５～１２日、５～１
０日、５～８日、５～７日、５～６日、６～１４日、６～１２日、６～１０日、６～８日
、６～７日、７～１４日、７～１２日、７～１０日、７～８日、８～１４日、８～１２日
、８～１０日、１０～１４日、１０～１２日、１２～１４日、１４日未満、１２日未満、
１０日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満
、１日未満、１２時間未満、または６時間未満）の所定の寿命を有する。いくつかの実施
形態では、細胞質体の集団の寿命は、細胞質体の集団の一部（例えば、集団の少なくとも
５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、
少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％）が
死滅していると判断される平均時間を決定することにより評価することができる。細胞死
は、当技術分野で公知の任意の方法により決定することができる。いくつかの実施形態で
は、例えば１つまたは複数の時点での細胞質体の生存率は、形態測定パラメーターまたは
機能パラメーターが無傷であるかどうかを（例えば、トリパンブルー色素排除、無傷の細
胞膜の評価、プラスチックへの接着の評価（例えば、接着性細胞質体で）、細胞質体移動
の評価、アポトーシスマーカーを用いたネガティブ染色などにより）判定することにより
評価することができる。いくつかの実施形態では、細胞質体の寿命は、それが得られた細
胞の寿命に関連し得る。例えば、いくつかの実施形態では、マクロファージから得られた
細胞質体は、１２～２４時間生存することができる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、自然に存在する除核細胞ではない。いくつかの
実施形態では、細胞質体は、自然に除核を受けた細胞からは得られない。いくつかの実施
形態では、細胞質体は、対象の体内で除核された細胞ではない。いくつかの実施形態では
、細胞質体は、対象の体内で除核された可能性のある細胞から得られない。いくつかの実
施形態では、細胞質体は、赤芽球からは得られない。いくつかの実施形態では、細胞質体
は、その寿命にわたって核を維持する細胞から得られる（例えば、本明細書に記載の除核
などの操作が存在しない場合）。いくつかの実施形態では、細胞質体は、無核細胞（例え
ば、赤血球（red blood cell）（赤血球（erythrocyte））、血小板、水晶体細胞、また
はその直前有核前駆体）として対象において見出される細胞ではない。いくつかの実施形
態では、細胞質体は、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、リボソーム、プロテアソーム
、またはスプライソソームからなる群から選択される１つまたは複数の成分を含む。いく
つかの実施形態では、細胞質体は、次の特徴：接着、トンネルナノチューブ形成、アクチ
ン媒介性拡散（２Ｄおよび／または３Ｄ）、移動、化学誘引物質勾配感受性、ミトコンド
リア移入、ｍＲＮＡ翻訳、タンパク質合成、ならびにエキソソームおよび／または他の生
物活性分子の分泌のうちの１つまたは複数を特徴とする。いくつかの実施形態では、細胞
質体は、タンパク質を分泌する能力を特徴とする（例えば、エキソソームを使用）。いく
つかの実施形態では、細胞質体は、ｅｘ ｖｉｖｏで除核されている。いくつかの実施形
態では、細胞質体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで除核されている。いくつかの実施形態では、細
胞質体は、（例えば、遠心分離により）物理的に除核されている。いくつかの実施形態で
は、細胞質体は、操作された除核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞質体は、赤
血球ではない。いくつかの実施形態では、細胞質体は、ヘモグロビンを含有しない。いく
つかの実施形態では、細胞質体は、両凹面形状を有さない。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、赤芽球からは得られない。いくつかの実施形態
では、細胞質体は、赤血球（erythrocyte）になる可能性がない細胞から得られる。いく
つかの実施形態では、細胞質体は、リンパ系前駆細胞から得られる。いくつかの実施形態
では、細胞質体は、リンパ球から得られる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、間葉
系幹細胞から（例えば骨髄から）得られる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、内皮
幹細胞から得られる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、神経幹細胞から得られる。
いくつかで実施形態では、細胞質体は、皮膚幹細胞から得られる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、直径が少なくとも１μｍである。いくつかの実
施形態では、細胞質体は、直径が１μｍよりも大きい。いくつかの実施形態では、細胞質
体は、直径が１～１００μｍ（例えば、１～９０μｍ、１～８０μｍ、１～７０μｍ、１
～６０μｍ、１～５０μｍ、１～４０μｍ、１～３０μｍ、１～２０μｍ、１～１０μｍ
、１～５μｍ、５～９０μｍ、５～８０μｍ、５～７０μｍ、５～６０μｍ、５～５０μ
ｍ、５～４０μｍ、５～３０μｍ、５～２０μｍ、５～１０μｍ、１０～９０μｍ、１０
～８０μｍ、１０～７０μｍ、１０～６０μｍ、１０～５０μｍ、１０～４０μｍ、１０
～３０μｍ、１０～２０μｍ、１０～１５μｍ、１５～９０μｍ、１５～８０μｍ、１５
～７０μｍ、１５～６０μｍ、１５～５０μｍ、１５～４０μｍ、１５～３０μｍ、１５
～２０μｍ）である。いくつかの実施形態では、細胞質体は、直径が１０～３０μｍであ
る。いくつかの実施形態では、細胞質体の直径は、５～２５μｍ（例えば、５～２０μｍ
、５～１５μｍ、５～１０μｍ、１０～２５μｍ、１０～２０μｍ、１０～１５μｍ、１
５～２５μｍ、１５～２０μｍ、または２０～２５μｍ）である。いくつかの実施形態で
は、細胞質体は、エキソソームではない。いかなる特定の理論にも束縛されるものではな
いが、場合によっては、いくつかの細胞質体は、生体分布が良好になるように、または対
象の肺に取り込まれる可能性がないように十分に小さいのが有利であり得ると考えられる
。
本明細書で使用される場合、用語「真核細胞」とは、明瞭な膜結合核を有する細胞を意
味する。そのような細胞としては、例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類
、もしくはヒト）、非哺乳動物（例えば、魚類、鳥類、爬虫類、もしくは両生類）、無脊
椎動物、昆虫、真菌類、または植物細胞を挙げることができる。いくつかの実施形態では
、真核細胞は、酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevi
siae）である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、高等真核生物、例えば、哺乳動物
、鳥類、植物、または昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、初代細胞
である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、免疫細胞（例えば、リンパ球（例えば、
Ｔ細胞、Ｂ細胞）、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好中球、マスト細胞、好塩
基球、樹状細胞、単球、骨髄由来サプレッサー細胞、好酸球）である。いくつかの実施形
態では、有核細胞は、食細胞または白血球である。いくつかの実施形態では、有核細胞は
、幹細胞（例えば成体幹細胞（例えば、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細
胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞）、胚性幹細胞
、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ））である。いくつかの実施形態では、有核細胞は前駆細胞
である。いくつかの実施形態では、有核細胞は細胞株に由来する。いくつかの実施形態で
は、有核細胞は懸濁細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は接着細胞である。
いくつかの実施形態では、有核細胞は、がん遺伝子の発現により不死化されている細胞で
ある。いくつかの実施形態では、有核細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ
）または任意のがん遺伝子の発現により不死化されている。いくつかの実施形態では、有
核細胞は、患者または対象由来細胞（例えば、自己患者由来細胞または同種患者由来細胞
）である。いくつかの実施形態では、有核細胞が本明細書に記載され、当技術分野で公知
の除核技術のいずれかを使用して除核される前に、有核細胞はベクター（例えば、ウイル
スベクター（例えばレトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）、アデノ
随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、水疱ウイルスベクター（例えば水疱性口内炎ウイルス
（ＶＳＶ）ベクター）、またはハイブリッドウイルスベクター）、プラスミド）でトラン
スフェクトされる。
細胞（例えば、本明細書に記載の細胞のいずれか）を培養する方法は、当技術分野で周
知である。細胞は、成長、増殖、生存率、分化および／あるいは限定するものではないが
、３次元培養、低酸素環境、所定の細胞外マトリックス成分の培養、化学物質による処理
、サイトカイン、増殖因子、または特定の望ましい細胞応答を誘導する天然もしくは合成
の任意の外因性物質への曝露を含む、治療能力／有益性を有する特定の生物学的機能の誘
導に有利な条件下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで維持することができる。
いくつかの実施形態では、既に使用されているまたは開発中の細胞療法を除核して（例
えば、本明細書に開示の方法のいずれかを使用して）、細胞質体を形成することができる
。既に使用されているまたは開発中の細胞療法の非限定的な例としては、キメラ抗原受容
体操作型Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）、ＮＫまたはマクロファージを使用したがんの治療；がん
、自己免疫（クローン病、関節リウマチ、あらゆる種類の関節炎など）、膵炎を含む炎症
性疾患の治療；再生医療への適用、創傷治癒、骨または軟骨の修復など；アルツハイマー
病、パーキンソン病などの認知疾患の治療；移植片対宿主病の治療；遺伝子療法（例えば
、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ／Ｘ－ＳＣＩＤ）、嚢胞性線
維症、血友病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンチントン病、パーキンソン病、高
コレステロール血症、アルファ－１抗トリプシン、慢性肉芽腫性疾患、ファンコーニ貧血
、またはゴーシェ病）；および感染性疾患、例えば、ＨＩＶ、肝炎、マラリアなどの治療
が挙げられる。
いかなる特定の理論にも縛られることを望むものでないが、既に使用されている、また
は開発中の細胞療法の除核は、例えば、細胞質体が対象の微小環境により受ける影響は少
ないので、細胞療法の安全性プロファイルおよび／または治療有益性にプラスの影響を及
ぼし得ると考えられる。さらに、いくつかの実施形態では、そのような細胞質体は、本明
細書に記載の方法のいずれかを使用して操作することができる。例えば、いくつかの実施
形態では、そのような細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパ
ク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝子編集因子を発現するように
操作することができる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、治療用ＤＮＡ分子、治療
用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または遺伝
子編集因子、ナノ粒子、または別の治療剤を含有することができる。いくつかの実施形態
では、そのような細胞質体は、例えば、ケモカイン受容体、接着分子、抗原、あるいは対
象内の部位への細胞質体のホーミングを改善し、または所望の免疫反応を刺激および／も
しくはモジュレートすることができる他のマーカーを発現するように操作することができ
る。例えば、細胞質体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を発現するように操作することができる。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞質
体は、後で使用するために冷却または凍結される。細胞を保存する各種方法は、限定する
ものではないが、超低温（凍結保存）での血清（例えばウシ胎児血清）およびジメチルス
ルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用、または４℃で貯蔵（凍結冬眠）するための冬眠培地の使
用を含めて、当技術分野で公知である。本明細書で提供される組成物および方法のいずれ
かのいくつかの実施形態では、細胞質体は使用前に解凍される。
生体分子（例えば、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲ
ＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ）、ＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）、タンパク質、遺伝子編集因
子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集因子）、ペプチド、プラスミド）を細胞
質体（例えば、本明細書に記載の任意の細胞に由来する細胞質体）に導入するために使用
することができる様々な方法が当技術分野で公知である。生体分子を細胞質体に導入する
のに使用することができる方法の非限定的な例としては、エレクトロポレーション、マイ
クロインジェクション、リポフェクション、トランスフェクション、リン酸カルシウムト
ランスフェクション、デンドリマーベースのトランスフェクション、カチオン性ポリマー
トランスフェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光トランスフェクショ
ン、インペールフェクション（impalection）、流体力学的送達、マグネトフェクション
、およびナノ粒子トランスフェクションが挙げられる。
本明細書に記載の方法および組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、導入は、生
体分子を細胞質体内で発現させることをさらに含む。様々な発現ベクターが当技術分野で
公知であり、本明細書で使用することができる。発現ベクターの非限定的な例が本明細書
で提供されている。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、図１６Ａ、図１７Ａ、図
１８Ａまたは図２３のいずれか１つに示されたベクターである。各種の遺伝子編集因子が
当技術分野で公知である。遺伝子編集因子の非限定的な例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
ｓ９遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびジ
ンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。
本明細書で提供される組成物および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、治療剤
、ウイルス、抗体、薬物、またはナノ粒子が細胞質体に導入される。いくつかの実施形態
では、治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡ、治療用タンパク質（例えば、酵素、抗体、抗原、毒
素、サイトカイン、タンパク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、もしくはワクチン
、または現在利用可能なもしくは開発中の任意の治療用タンパク質）、治療用ペプチド（
例えば、ペプチドホルモンもしくは抗原、または現在利用可能なもしくは開発中の任意の
治療用ペプチド）、低分子治療薬（例えば、ステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒
素、抗生物質、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗凝固薬、抗うつ薬、抗がん剤、抗てんかん薬、
抗精神病薬、鎮静薬、コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、エムタンシン、または
現在利用可能なもしくは開発中の任意の小分子治療薬）、治療用遺伝子編集因子、治療用
ナノ粒子、または別の治療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分
、ウイルス（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、またはイオンが細胞
質体に導入される。
いくつかの実施形態では、細胞質体を、エキソソームで処理（例えば、刺激または装填
）することができる。いくつかの実施形態では、エキソソームによる処理を使用して、生
体分子、治療薬、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ粒
子、または別の治療剤（例えば、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイ
ルス（例えば腫瘍溶解性ウイルス）、エキソソーム、脂質、またはイオンを細胞質体に導
入することができる。いくつかの実施形態では、エキソソームによる処理を使用して、細
胞質体の挙動、シグナル伝達、分泌因子、または他の特性を変えることができる。
本方法は、対象における疾患（例えば、がん／新生物、感染症、炎症状態、神経疾患（
例えば神経変性疾患）、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、虚血性疾患、遺伝性もし
くは遺伝的障害、発達障害、眼科疾患、骨疾患、代謝性疾患、中毒症、特発性状態、また
はそれらの２つ以上を治療するための細胞質体の使用を含む。
がんの非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病
（ＡＭＬ）、青年期のがん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、異型奇形腫
様／横紋様腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳
がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、未知の原発癌、心臓腫瘍、
子宮頸がん、小児がん、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（Ｃ
ＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ
腫、胆管がん、非浸潤性乳管癌、胚腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽
腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、卵
管がん、骨の線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質
腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、有毛細胞腫
瘍、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞がん、組織球症、ホジキン病リンパ
腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん
、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇および口腔がん、肝臓がん、肺
がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫、骨癌、黒色腫、メル
ケル細胞癌、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、正中線癌、口腔がん、多発性内分泌腫瘍
症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、
骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、
鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔がん
、口唇がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻
腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体がん、形質
細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、妊娠および乳がん、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性腹膜がん
、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、
セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、固形がん、扁平上
皮癌、頸部扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫および
胸腺癌、甲状腺がん、腎盂および尿管の移行上皮がん、未知の原発癌、尿道がん、子宮が
ん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。いくつかの実
施形態では、がんは、原発性（例えば原発性腫瘍）または転移性（例えば転移性腫瘍）で
あり得る。
感染症の非限定的な種類としては、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫
感染症、および原虫感染症が挙げられる。感染症の非限定的な例としては、アシネトバク
ター（Acinetobacter）感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症
）、エイズ（後天性免疫不全症候群）、アメーバ症、アナプラズマ症、住血線虫症、アニ
サキス症、炭疽病、溶血性アルカノバクテリア（Arcanobacterium haemolyticum）感染症
、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、バベシア
症、セレウス菌（Bacillus cereus）感染症、細菌性肺炎、細菌性膣炎、バクテロイデス
（Bacteroides）感染症、バランチジウム症、バルトネラ症、バイリスカリス（Baylisasc
aris）感染症、ＢＫウイルス感染症、ブラック・ピエドラ（Black piedra）、ブラストシ
ストーシス（Blastocystosis）症、ブラストミコシス（Blastomycosis）症、ボリビア出
血熱、ボツリヌス中毒症（および乳児ボツリヌス症）、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺
ペスト、バークホルドリア（Burkholderia）感染症、ブルーリ潰瘍、カリシウイルス感染
症（ノロウイルスおよびサポウイルス）、カンピロバクター症、カンジダ症（モニリア症
、鵞口瘡）、毛細虫症、キャリオン病、ネコ引っ掻き病、蜂巣炎、シャーガス病（アメリ
カトリパノソーマ症）、軟性下疳、水痘、チクングンヤ熱、クラミジア、肺炎クラミジア
（Chlamydophila pneumoniae）感染症（台湾急性呼吸器因子またはＴＷＡＲ）、コレラ、
黒色分芽菌症、ツボカビ症、肝吸虫症、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium
difficile）大腸炎、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱（ＣＴＦ）、風邪（急性ウイ
ルス性鼻咽頭炎；急性鼻感冒）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、クリミア・コ
ンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）、クリプトコックス症、クリプトスポリジウム症、皮膚幼虫移行
症（ＣＬＭ）、シクロスポリア症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、デ
スモデスムス（Desmodesmus）感染症、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジ
ナ虫症、エボラ出血熱、エキノコックス症、エーリキア症、蟯虫症（蟯虫感染症）、腸球
菌（Enterococcus）感染症、エンテロウイルス感染症、流行性発疹チフス、伝染性紅斑（
第５病）、突発性発疹（第６病）、肝蛭症、肥大吸虫症、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）
、フィラリア症、ウェルチ菌（Clostridium perfringens）による食中毒、自由生活性（F
ree-living）アメーバ感染症、紡錘菌（Fusobacterium）感染症、ガス壊疽（クロストリ
ジウム性筋壊死）、ジオトリクム症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症
候群（ＧＳＳ）、ジアルジア鞭毛虫症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径肉芽腫（ドノヴァン
症）、Ａ群連鎖球菌感染症、Ｂ群連鎖球菌感染症、ヘモフィルス（Haemophilus）感染症
、手足口病（ＨＦＭＤ）、ハンタウイルス（Hantavirus）肺症候群（ＨＰＳ）、ハートラ
ンドウイルス病、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）感染症、溶血尿毒症
症候群（ＨＵＳ）、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型
肝炎、Ｅ型肝炎、単純疱疹、ヒストプラスマ症、鉤虫感染症、ヒトボカウイルス感染症、
ヒトエールリヒア症（Human ewingii ehrlichiosis）、ヒト顆粒球性アナプラズマ症（Ｈ
ＧＡ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒ
ト単球性エールリヒア症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、ヒトパラインフル
エンザウイルス感染症、膜様条虫症、エプスタイン・バールウィルス伝染性単核症（Ｍｏ
ｎｏ）、インフルエンザ（ｆｌｕ）、イソスポーラ症、川崎病、角膜炎、キンゲラ・キン
ガエ（Kingella kingae）感染症、クールー病、ラッサ熱、在郷軍人病（レジオネラ症）
、在郷軍人病（ポンティアック熱）、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、
リステリア症、ライム病（ライムボレリア症）、リンパ管フィラリア症（象皮病）、リン
パ球性脈絡髄膜炎、マラリア、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ）、麻疹、中東呼吸症候群（
ＭＥＲＳ）、類鼻疽（ホイットモーア病）、脳膜炎、髄膜炎菌性疾患、メタゴニムス症、
小胞子虫症、伝染性軟疣（ＭＣ）、サル痘、耳下腺炎、発疹熱（地方性発疹チフス）、マ
イコプラズマ肺炎、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）感染症、
菌腫（一義化）、ハエウジ症、新生児結膜炎（新生児眼炎）、ノロウイルス（小児および
乳児）、（新）変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ、ｎｖＣＪＤ）、ノカルジ
ア症、オンコセルカ症（河川盲目症）、オピストルキス症、パラコクシジオイデス症（南
アメリカブラストミセス症）、肺吸虫症、パスツレラ症、アタマジラミ寄生虫症（アタマ
ジラミ）、コロモジラミ寄生虫症（ヒトジラミ）、ケジラミ寄生症（陰部シラミ、ケジラ
ミ）、骨盤炎症性疾患（ＰＩＤ）、疫咳（百日咳）、ペスト、肺炎球菌感染症、ニューモ
システィス性肺炎（ＰＣＰ）、肺炎、ポリオ、プレボテラ（Prevotella）感染症、原発性
アメーバ髄膜脳炎（ＰＡＭ）、進行性多病巣性白質脳症、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、回帰
熱、呼吸合包体ウイルス感染症、リノスポリジウム症、ライノウイルス感染症、リケッチ
ア感染症、リケッチア痘、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、
ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）、疥癬、
猩紅熱、住血吸虫症、敗血症、赤痢（細菌性赤痢）、帯状疱疹（帯状ヘルペス）、天然痘
（痘瘡）、スポロトリクム症、ブドウ球菌食中毒、ブドウ球菌感染症、糞線虫症、亜急性
硬化性全脳炎、梅毒、条虫症、破傷風（開口障害）、白癬性毛瘡（床屋疹）、頭部白癬（
しらくも）、体部白癬（身体の白癬）、股部白癬（陰金）、手白癬（手の白癬）、黒色癬
、足部白癬（水虫）、爪白癬（爪真菌症）、癜風（黒なまず）、トキソカラ症（眼幼虫移
行症（ＯＬＭ））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症（ＶＬＭ））、トキソプラズマ症、ト
ラコーマ、旋毛虫症、トリコモナス症、鞭虫症（鞭虫感染症）、結核、野兎病、腸チフス
、発疹チフス、ウレアプラズマ・ウレアリティカム（Ureaplasma urealyticum）感染症、
渓谷熱、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio v
ulnificus）感染症、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）腸炎、
ウイルス性肺炎、西ナイル熱、白色砂毛症（白癬）、エルシニア・シュードツベルクロー
シス（Yersinia pseudotuberculosis）感染症、エルシニア症、黄熱病、ジカ熱および接
合菌症が挙げられる。
神経疾患の非限定的な例としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病
、ベル麻痺、脳動脈瘤、脳損傷、脳腫瘍、脳性麻痺、慢性疲労症候群、脳震盪、認知症、
てんかん、ギランバレー症候群、頭痛、ハンチントン病片頭痛、多発性硬化症、筋ジスト
ロフィー、神経痛、ニューロパチー、神経筋および関連疾患、パーキンソン病、精神状態
（例えば、うつ病、強迫性障害）、脊柱側弯症、発作、脊髄損傷、脊椎奇形、脊髄障害（
例えば、亜急性複合変性）、脊椎腫瘍、脳卒中、およびめまいが挙げられる。
自己免疫疾患の非限定的な例としては、アカラシア、アディソン病、成人スティル病、
無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗
ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自立神経失調症、自己
免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎
、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、軸索およ
び神経性ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水
疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱
髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ－
ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コ
ガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群
、クローン病、ヘルペス状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、糖尿病（例
えば、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病）、円盤状ループス、ドレッサー症候群
、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、必須混合クリ
オグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側
頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う
肉芽腫症、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・
シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性ヘルペスまたは妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿
性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連
硬化症、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（
ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ラ
ンバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、
線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管
炎（ＭＰＡ）、混合結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ミュシャ・ハーバーマン病
、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症
、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類
天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、腫瘍随伴性小脳変性症（Ｐ
ＣＤ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーズプラニチス
（末梢ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢ニューロパチー、静
脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候
群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発性筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、
心膜切開術後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎
、乾癬、乾癬性関節炎、純赤血球無形成症（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、
反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症
候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミ
ット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直
症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎（Ｓ
Ｏ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロ
サ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病
（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、フォークト・小柳・原田病、およびウェゲナ
ー肉芽腫症（または多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ））が挙げられる。
心血管疾患の非限定的な例としては、急性心筋梗塞、心不全、難治性狭心症、冠動脈疾
患、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、脳卒中、大動脈瘤および／または解離、末梢動脈
疾患、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心臓腫瘍、脳血管腫瘍、心筋症、心臓弁膜症、および
心膜疾患が挙げられる。
眼科疾患の非限定的な例としては、緑内障、白内障、黄斑変性、糖尿病性網膜症、斜視
、網膜剥離、ブドウ膜炎、弱視、ドライアイ症候群、角膜炎、黄斑浮腫、角膜潰瘍、視神
経症、サイトメガロウイルス網膜炎、角膜ジストロフィー、前房出血、トラコーマ、中心
性漿液性網膜症、未熟児網膜症、眼内炎、レーバー先天性黒内障、中心網膜動脈閉塞、睫
毛乱生症、乳頭浮腫、グレーブス眼症、ブドウ膜黒色腫、網膜静脈分枝閉塞症、脈絡膜血
症、および黄斑症が挙げられる。
骨疾患の非限定的な例としては、骨軟骨異形成、軟骨形成不全、低ホスファターゼ血症
、軟骨無形成症、致死性異形成（thanatrophoric dysplasia）、骨軟化症、くる病、骨減
少症、骨粗鬆症、パジェット病、骨髄炎、骨溶解症、ハジュ・チェニー症候群、肥大性肺
性骨関節症、非骨化性線維腫、偽関節症、線維性異形成、過骨症、骨硬化症、およびピク
ノディスストーシスが挙げられる。
代謝性疾患の非限定的な例としては、シスチン尿症、ファブリー病、ガラクトース血症
、ゴーシェ病（Ｉ型）、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ハンター症候群、ハーラー
症候群、レッシュ・ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、マロトー・ラミー症候群、
モルキオ症候群、ニーマンピック病（Ａ型）、フェニルケトン尿症、ポンペ病、ポルフィ
リン症、シャイエ症候群、テイ・サックス病、チロシン血症（肝腎性）、フォンギールケ
病（グリコーゲン貯蔵欠乏症１Ａ型）、およびウィルソン病が挙げられる。
いくつかの実施形態では、対象は、細胞質体治療を必要としている、必要としていると
判定されている、または必要としていると疑われている。いくつかの実施形態では、がん
は、例えば、急性骨髄性白血病、膀胱がん、乳がん、腎臓がん、黒色腫、小細胞肺がん、
非小細胞肺がん、膵臓がん、または前立腺がんであり得る。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、疾患または状態（例えば、がんもしくは新生物
、感染症、炎症状態、神経疾患（例えば神経変性疾患）、変性疾患、自己免疫疾患、心血
管疾患、虚血性疾患、遺伝性もしくは遺伝的障害、発達障害、眼科疾患、骨疾患、代謝性
疾患、中毒症、特発性状態、またはそれらの２つ以上の診断に使用することができる。し
たがって、本明細書では、対象の特定の健康、疾患状態、状態、または毒素レベルを示す
ことができる本明細書に記載の細胞質体（例えば、未操作の細胞質体、あるいは遺伝子操
作されたか、またはバイオレポーター分子もしくは誘導性バイオレポーター分子を外因的
に装填された細胞質体）のいずれかを対象に投与するステップを含む、対象を診断する方
法、または対象における疾患もしくは状態の有無を判定する方法が提供される。いくつか
の実施形態では、細胞質体および／または細胞質体によって発現もしくは分泌される分子
、または細胞質体に含有される分子は、バイオレポーターとして機能し得る。そのような
バイオレポーターは、対象において、またはｅｘ ｖｉｖｏで使用することができる。い
くつかの実施形態では、サンプル（例えば、血液、尿、便、または組織（例えば生検））
は対象から得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、例えば、測定可能
な臨床シグナルを報告する比色分子、蛍光分子、発光分子、化学発光分子または電気化学
分子を発現または含有することができる。シグナルは、化学物質、物理物質、もしくは生
体分子（例えば、増殖因子、インスリン、がん抗原、免疫因子）の濃度に比例し得るか、
または、対象もしくは対象由来のサンプル中の遺伝子転写活性もしくはタンパク質翻訳活
性に比例し得る。
本明細書で使用される場合、用語「対象」とは、任意の生物を意味する。例えば、対象
は、哺乳動物、両生類、魚類、爬虫類、無脊椎動物、鳥類、植物、古細菌、真菌、または
細菌であり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態
では、対象は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、イヌ科
（例えばイヌ）、ネコ科（例えばネコ）、ウマ科（例えばウマ）、ヒツジ、ウシ、ブタ、
非ヒト霊長類、例えばサル科（例えばサル）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、
オランウータン、テナガザル）、またはヒトであり得る。本明細書に記載の方法のいずれ
かのいくつかの実施形態では、対象は、０～１２０歳（例えば生後１か月間）（例えば新
生児）、１か月～２歳（例えば幼児）、２歳から１２歳（例えば小児）、１２歳～１６歳
（例えば青年）、１～１２０歳、１～１１５歳、１～１１０歳、１～１０５歳、１～１０
０歳、１～９５歳、１～９０歳、１～８５歳、１～８０歳、１～７５歳、１～７０歳、１
～６５歳、１～６０歳、１～５０歳、１～４０歳、１～３０歳、１～２５歳、１～２０歳
、１～１５歳、１～１０歳、５～１２０歳、５～１１０歳、５～１００歳、５～９０歳、
５～６０歳、５～５０歳、５～４０歳、５～３０歳、５～２０歳、５～１０歳、１０～１
２０歳、１０～１１０歳、１０～１００歳、１０～９０歳、１０～８０歳、１０～６０歳
、１０～１０歳、１０～５０歳、１０～４０歳、１０～３０歳、１０～２０歳、２０～１
２０歳、２０～１１０歳、２０～１００歳、２０～９０歳、２０～７０歳、２０～６０歳
、２０～５０歳、２０～４０歳、２０～３０歳、３０～１２０歳、３０～１１０歳、３０
～１００歳、３０～９０歳、３０～７０歳、３０～６０歳、３０～５０歳、４０～１２０
歳、４０～１１０歳、４０～１００歳、４０～９０歳、４０～８０歳、４０～６０歳、４
０～５０歳、５０～１２０歳、５０～１１０歳、５０～１００歳、５０～９０歳、５０～
８０歳、５０～７０歳、５０～６０歳、６０～１２０歳、６０～１１０歳、６０～１００
歳、６０～９０歳、６０～８０歳、６０～７０歳、７０～１２０歳、７０～１１０歳、７
０～１００歳、７０～９０歳、７０～８０歳、８０～１２０歳、８０～１１０歳、８０～
１００歳、８０～９０歳、９０～１２０歳、９０～１１０歳、９０～１００歳、１００～
１２０歳、または１１０～１２０歳）である。本明細書に記載の方法のいずれかのいくつ
かの実施形態では、対象は、まだ誕生しておらず、例えば子宮内にいる。本明細書に記載
の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１カ月齢（例えば、少
なくとも２歳、少なくとも１２歳、少なくとも１６歳、または少なくとも１８歳）である
。本明細書に記載の方法のいずれかを使用して、対象、例えば罹患している対象（すなわ
ち、疾患を有する対象、例えば、疾患と診断されている対象）、または無症候性の対象（
すなわち、臨床的に健康であることを示す対象、もしくは疾患と診断されていない対象）
を治療することができる。本明細書で使用される場合、治療には、疾患のリスクがある対
象における疾患の徴候または症状の発生率の低下または予防（またはリスクの低下）を意
味する「予防的治療」と、疾患と診断された対象における疾患の徴候または症状の低下、
疾患の進行の低減、疾患の重症度、再発の低減を意味する「治療的治療」が含まれる。本
明細書で使用される場合、用語「治療する」とは、疾患の少なくとも１つの臨床的パラメ
ーターを改善すること、および／または有益性（例えば、抗老化、抗瘢痕化、創傷治癒、
抗うつ、抗炎症、体重減少）を提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」および「状態」とは、対象における異
常または対象における健康状態からの任意の逸脱を意味する。疾患および／または状態の
非限定的な例としては、がんもしくは新生物、感染症、炎症状態、神経疾患（例えば神経
変性疾患）、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、虚血性疾患、遺伝性または遺伝的障
害、発達障害、眼科疾患、骨疾患、代謝性疾患、中毒、または特発性状態が挙げられる。
本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、期間中、
少なくとも１回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０、１００回）投与される（例えば、毎日、２日ごと、週２回、週１回、毎週、月に３回
、月に２回、月に１回、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、５か月ごと、６か月ごと
、７か月ごと、８か月ごと、９か月ごと、１０か月ごと、１１か月ごと、１年に１回）。
また、毎月の治療、例えば、月に少なくとも１回、少なくとも１か月間（例えば、少なく
とも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か
月以上、例えば１２か月以上）投与すること、および毎年の治療（例えば、１年またはそ
れ以上の間に１年に１回の投与）が考えられる。投与は、当技術分野で公知の任意の経路
、例えば、皮下、静脈内、動脈内、眼内、経口、筋肉内、鼻腔内（例えば吸入）、腹腔内
、局所、粘膜、硬膜外、舌下、皮膚上、羊膜外、関節内、皮内、骨内、くも膜下腔内、子
宮内、膣内、膀胱内、硝子体内、血管周囲、および／もしくは直腸投与、または公知の投
与方法の任意の組み合わせを介して行われ得る。
いくつかの実施形態では、細胞質体の死滅プロセスは、対象に対する治療効果を有し得
る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞質体の死滅プロセスは、免疫賦活性であり得
る。したがって、本明細書では、細胞質体を対象に投与する方法であって、細胞質体の死
滅が対象に対して治療効果を有する、方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象
に投与される細胞質体は死滅している。いくつかの実施形態では、対象に投与される細胞
質体は、投与された場合、５日未満（例えば、４日未満、３日未満、２日未満、３６時間
未満、１日未満、１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、２時間未満、または１時間
未満）の残存寿命を有する。
いくつかの実施形態では、細胞は対象から取り出され、除核され得る。いくつかの実施
形態では、細胞は、除核される前に、（例えば、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、
治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、治療用ナノ
粒子、および／または別の治療剤を生成または含有するように）操作される。いくつかの
実施形態では、対象由来の細胞は除核され、次いで、（例えば、治療用ＤＮＡ分子、治療
用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因
子、治療用ナノ粒子、および／または別の治療剤を生成または含有するように）操作され
る。いくつかの実施形態では、細胞質体（それらが操作されたか否かにかかわらず）は、
細胞が取り出された対象に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞質体が培養および／または保存された培地（「馴化培地
」）は、治療的有益性を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞質が（例えば除核後に
）細胞と共培養および／または保存された培地（「馴化培地」）は、治療的有益性を有し
得る。いくつかの実施形態では、細胞と融合した細胞質体が細胞と培養および／または保
存された培地（「馴化培地」）は、治療的有益性を有し得る。
したがって、本明細書では、対象に馴化培地を投与するステップを含む、対象において
治療、予防、または予防的治療、または健康増進する方法が提供される。いかなる特定の
理論にも束縛されるものではないが、いくつかの実施形態では、培養培地の治療的有益性
は、細胞質体により分泌されるエキソソーム（例えば治療用タンパク質を含有する）が培
地中に存在することによるものであり得ると考えられる。
本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、組成物は、１つまた
は複数の追加の療法（例えば、任意の薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬、抗炎症薬
）または化学療法（例えば、化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、シ
クロホスファミド））または本明細書に記載の小分子療法薬のいずれか）、細胞ベースの
療法、放射線療法、免疫療法、小分子、阻害性核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、アン
チセンスＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ）、エキソソームベースの療法
、遺伝子療法または手術）とともに投与される。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数の追加の療
法（例えば、任意の薬物（例えば、抗生物質、抗ウイルス薬）または化学療法（例えば、
化学療法剤（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、シクロホスファミド））、細胞
ベースの療法、放射線療法、免疫療法、小分子、阻害性核酸（例えば、アンチセンスＲＮ
Ａ、アンチセンスＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ）または手術）をさら
に含む。
また、本明細書では、細胞質体（例えば、本明細書に記載の任意の細胞から得られた細
胞質体）を含む組成物（例えば医薬組成物）も提供される。いくつかの実施形態では、組
成物は、異なる投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、後眼窩、腹腔内）用に製剤化
される。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体（例えばリン酸緩
衝生理食塩水）を含み得る。
治療用細胞の全身投与に関して、罹患組織へのそれらのホーミングの成功には２つの大
きな問題がある。第一に、ほとんどの細胞は肺または他の組織の小さな毛細血管に閉じ込
められる可能性があり、それが重篤な副作用、例えば肺塞栓症を引き起こす可能性がある
。細胞質体は、いくつかの実施形態では、親細胞よりもはるかに小さく（例えば、親細胞
の約６０％の直径および１／８の体積）、硬い核を持たないため、細胞質体は親細胞より
も小さい毛細血管および血管を良好に通過することができる。第二に、罹患組織への細胞
の特異的ホーミングは、ケモカイン受容体シグナル伝達、例えばＳＤＦ－１ａ／ＣＸＣＲ
４、ＣＣＬ２／ＣＣＲ２、および接着分子、例えばＰＳＧＬ－１に依存し得る。本明細書
に示したように、細胞質体を操作して、機能的ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２、およびグリコシル
化ＰＳＧＬ－１を特異的に発現することができ、これによって操作された細胞質体の特異
的ホーミングが著しく促進され得る。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、細胞質体の細胞表面上で発現されるターゲティ
ング部分、例えば、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ２またはＰＳＧＬ－１を（例えば、操作により、
またはそれらが得られた細胞から）さらに含むことができる。細胞質体の細胞表面で発現
され得る細胞表面タンパク質の非限定的な例としては、ケモカイン、例えば、ＣＸＣＲ４
、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ２、およびＣＸＣＲ１が挙げら
れる。いくつかの実施形態では、細胞質体は、細胞質体によって分泌される、または細胞
外マトリックス、例えばＳＤＦｌａもしくはＣＣＬ２に繋留された細胞ターゲティング部
分を（例えば、操作により、またはそれらが得られた細胞から）さらに含むことができる
。細胞ホーミングのための細胞質体によって分泌され得るタンパク質の非限定的な例とし
ては、ＳＤＦｌａ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１、ＣＸＣＬ９、
ＣＸＣＬＩＯ、ＣＣＬ１１およびＣＸＣＬ１２が挙げられる。いくつかの実施形態では、
細胞質体は、対象の免疫系の回避を支援する表面マーカーを（例えば、操作により、また
はそれらが得られた細胞から）さらに含むことができる。例えば、いくつかの実施形態で
は、細胞質体はＣＤ４７マーカーを含み得る。いかなる特定の理論にも縛られるものでは
ないが、ＣＤ４７マーカーは、細胞質体がマクロファージによって貪食されることを阻止
するのに役立つと考えられる。細胞マトリックス受容体および細胞間接着分子の非限定的
な例としては、インテグリン、カドヘリン、糖タンパク質、およびヘパリン硫酸プロテオ
グリカンが挙げられる。治療用分子の非限定的な例としては、腫瘍抗原および免疫調節ペ
プチド、ポリアミン、およびＡＴＰが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞質体は、約１日～約７日の間（例えば、約１日～約６日
、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約７日
、約２日～約６日、約２日～約５日、約２日約４日、約２日～約３日、約３日～約７日、
約３日～約６日、約３日～約５日、約３日～約４日、約４日～約７日、約４日～約６日、
約４日～約５日、約５日～約７日、約５日～約６日、または約６日～約７日の間）、約－
８０℃～約１６℃（例えば、約－８０℃～約１２℃、－８０℃～約１０℃、約－８０℃～
約８℃、約－８０℃～約６℃、約－８０℃～約４℃、約－８０℃～約２℃、約－８０℃～
約０℃、約－８０℃～約－４℃、約－８０℃～約－１０℃、約－８０℃～約－１６℃、約
－８０℃～約－２０℃、約－８０℃～約－２５℃、約－８０℃～約－３０℃、約－８０℃
～約－３５℃、約－８０℃～約－４０℃、約－８０℃～約－４５℃、約－８０℃～約－５
０℃、約－８０℃～約－５５℃、約－８０℃～約－６０℃、約－８０℃～約－６５℃、約
－８０℃～約－７０℃、約－６０℃～約１６℃、約－６０℃～約１２℃、約－６０℃～約
１０℃、約－６０℃～約８℃、約－６０℃～約６℃、約－６０℃～約４℃、約－６０℃～
約２℃、約－６０℃～約０℃、約－６０℃～約－４℃、約－６０℃～約－１０℃、約－６
０℃～約－１０℃、約－６０℃～約－１６℃、約－６０℃～約－２０℃、約－６０℃～約
－２５℃、約－６０℃～約－３０℃、約－６０℃～約－３５℃、約－６０℃～約－４０℃
、約－６０℃～約－５０℃、約－５０℃～約１６℃、約－５０℃～約１２℃、約－５０℃
～約１０℃、約－５０℃～約８℃、約－５０℃～約６℃、約－５０℃～約４℃、約－５０
℃～約２℃、約－５０℃～約０℃、約－５０℃～約－４℃、約－５０℃～約－１０℃、約
－５０℃～約－１６℃、約－５０℃～約－２０℃、約－５０℃～約－３０℃、約－５０℃
～約－４０℃、約－２０℃～約１６℃、約－２０℃～約１２℃、約－２０℃～約１０℃、
約－２０℃～約８℃、約－２０℃～約６℃、約－２０℃～約４℃、約－２０℃～約２℃、
－約２０℃～約０℃、約－２０℃～約－４℃、約－２０℃～約－１０℃、約－２０℃～約
－１５℃、約－１０℃～約１６℃、約－１０℃～約１２℃、約－１０℃～約１０℃、約－
１０℃～約８℃、約－１０℃～約６℃、約－１０℃～約４℃、約－１０℃～約２℃、約－
１０℃～約０℃、約－１０℃～約－４℃、約－１０℃～約－６℃、約－４℃～約１６℃、
約－４℃～約１０℃、約－４℃～約６℃、約－４℃～約４℃、約－４℃～約２℃、約－４
℃～約０℃、約－２℃～約１６℃、約－２℃～約１２℃、約－２℃～約１０℃、約－２℃
～約６℃、約－２℃～約４℃、約－２℃～約２℃、約－２℃～約０℃、約０℃～約１６℃
、約０℃～約１４℃、約０℃～約１２℃、約０℃～約１０℃、約０℃～約８℃、約０℃～
約６℃、約０℃～約４℃、約２℃～約１６℃、約２℃～約１２℃、約２℃～約１０℃、約
２℃～約８℃、約２℃～約６℃、約２℃～約４℃、約４℃～約１６℃、約４℃～約１２℃
、約４℃～約１０℃、約４℃～約８℃、約４℃～約６℃、約６℃～約１６℃、約６℃～約
１２℃、約６℃～約１０℃、約６℃～約８℃、約８℃～約１６℃、約８℃～約１２℃、約
８℃～約１０℃、約１０℃～約１６℃、約１０℃～約１２℃、または約１２℃～約１６℃
）の温度で保存することができる。
また、本明細書では、本明細書に記載の任意の組成物を含むキットも提供される。例え
ば、キットは、本明細書に記載の組成物または方法のいずれかを使用するための説明書を
含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の組成物のいずれかの少
なくとも１用量を含み得る。
いくつかの実施形態を説明してきた。しかしながら、各種変更を本発明の趣旨および範
囲から逸脱することなく行うことができることを理解されたい。
例示的な実施形態：
実施形態１は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプ
チド、小分子治療薬および治療用遺伝子編集因子からなる群から選択される１つまたは複
数の分子を発現または含有する第１の細胞質体を含む組成物の治療的有効量を対象に投与
するステップを含む、方法である。
実施形態２は、第１の細胞質体が哺乳動物細胞、原生動物細胞、藻類細胞、植物細胞、
真菌細胞、無脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、または鳥類細胞からな
る群から選択される細胞から得られる、実施形態１に記載の方法である。
実施形態３は、細胞が対象から採取された細胞であるか、またはそれに由来する、実施
形態２に記載の方法である。
実施形態４は、細胞が細胞株、不死化細胞、またはがん細胞であるか、またはそれらに
由来する、実施形態２から３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５は、第１の細胞質体が免疫細胞から得られる、実施形態１から４のいずれか
１つに記載の方法である。
実施形態６は、第１の細胞質体が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロフ
ァージ、好酸球、好塩基球、好塩基球、樹状細胞、およびリンパ球からなる群から選択さ
れる細胞から得られる、実施形態１から５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態７は、第１の細胞質体が、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞
、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、皮膚幹細胞、精巣細胞、胚
性幹細胞、線維芽細胞、または誘導多能性幹細胞からなる群から選択される細胞から得ら
れる、実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８は、第１の細胞質体が第２の細胞質体に融合される、実施形態１から７のい
ずれか１つに記載の方法である。
実施形態９は、第２の細胞が、哺乳動物細胞、原生動物細胞、藻類細胞、植物細胞、真
菌細胞、無脊椎動物細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、または鳥類細胞からなる
群から選択される細胞から得られる、実施形態８に記載の方法である。
実施形態１０は、治療用ＲＮＡ分子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘ
アピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、長鎖
非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）またはＲＮＡウイルスである、実施形態１から９のいず
れか１つに記載の方法である。
実施形態１１は、治療用ＤＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、プラスミド、細菌ＤＮＡ分子またはＤＮＡウイルスである、実施形態１から１０のい
ずれか１つに記載の方法である。
実施形態１２は、治療用タンパク質が酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパ
ク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、またはワクチンである、実施形態１から１１
のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１３は、細胞質体が治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質
、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子を一過的に発現
する、実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペ
プチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子の発現が誘導可能である、
実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５は、ペプチド治療薬がペプチドホルモンおよび抗原からなる群から選択さ
れる、実施形態１から１４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１６は、小分子治療薬がステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒素、抗生
物質、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗凝固薬、抗うつ薬、抗がん剤、抗てんかん薬、抗精神病
薬、鎮静薬、コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、エムタンシン、または現在利用
可能なもしくは開発途中の任意の小分子治療薬からなる群から選択される、実施形態１か
ら１５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１７は、細胞質体が小分子治療薬または治療用ナノ粒子を含有する、実施形態
１から１６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８は、細胞質体が細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイル
ス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる群から選択される治療剤を含有する、実
施形態１から１６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１９は、ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態１８に記載の方法で
ある。
実施形態２０は、小分子治療薬が抗がん剤、抗生物質、または抗ウイルス薬からなる群
から選択される、実施形態１から１５または１７から１９のいずれか１つに記載の方法で
ある。
実施形態２１は、１つまたは複数の追加の療法を対象に施すステップをさらに含む、実
施形態１から１９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２２は、１つまたは複数の追加の療法が細胞ベースの療法、小分子、免疫療法
、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、および外科手術からなる群から選択される、実施
形態２０に記載の方法である。
実施形態２３は、第１の細胞質体が免疫系回避部分を発現する、実施形態１から２１の
いずれか１つに記載の方法である。
実施形態２４は、免疫系回避部分がＣＤ４７である、実施形態２３に記載の方法である
。
実施形態２５は、第１の細胞質体または第１の細胞質体が得られる細胞が治療用ＤＮＡ
分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、非ペプチド治療薬、およ
び／または治療用遺伝子編集因子を発現するように操作されている、実施形態１から２４
のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２６は、第１の細胞質体または第１の細胞質体が得られる細胞が治療用ＤＮＡ
分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、非ペプチド治療薬、およ
び／または治療用遺伝子編集因子のいずれかを発現するように操作されていない、実施形
態１から２４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態２７は、組成物がターゲティング部分をさらに含む、実施形態１から２６のい
ずれか１つに記載の方法である。
実施形態２８は、ターゲティング部分が細胞表面タンパク質である、実施形態２７に記
載の方法である。
実施形態２９は、ターゲティング部分が、分泌タンパク質または細胞外マトリックスに
繋留されているタンパク質である、実施形態２７に記載の方法である。
実施形態３０は、細胞質体がターゲティング部分をさらに含む、実施形態１から２６の
いずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、ターゲティング部分が細胞表面タンパク質である、実施形態３０に記
載の方法である。
実施形態３２は、ターゲティング部分が、分泌タンパク質または細胞外マトリックスに
繋留されているタンパク質である、実施形態３０に記載の方法である。
実施形態３３は、少なくとも１つの治療剤を含む細胞質体である。
実施形態３４は、治療剤が治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、
治療用ペプチド、小分子治療薬、または治療用遺伝子編集因子である、実施形態３３に記
載の細胞質体である。
実施形態３５は、治療用ＲＮＡ分子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘ
アピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、長鎖
非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）またはＲＮＡウイルスである、実施形態３４に記載の細
胞質体である。
実施形態３６は、治療用ＤＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、プラスミド、細菌ＤＮＡ分子またはＤＮＡウイルスである、実施形態３４から３５の
いずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態３７は、治療用タンパク質が酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパ
ク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、またはワクチンである、実施形態３４から３
６のいずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態３８は、ペプチド治療薬がペプチドホルモンおよび抗原からなる群から選択さ
れる、実施形態３４から３７のいずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態３９は、小分子治療薬がステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒素、抗生
物質、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗凝固薬、抗うつ薬、抗がん剤、抗てんかん薬、抗精神病
薬、鎮静薬、コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、エムタンシン、または現在利用
可能なもしくは開発途中の任意の小分子治療薬からなる群から選択される、実施形態３４
から３８のいずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態４０は、治療剤が、ナノ粒子、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成
分、ウイルス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる群から選択される、実施形態
３３から３８のいずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態４１は、ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態４０に記載の細胞質
体である。
実施形態４２は、小分子治療薬が抗がん剤、抗生物質、または抗ウイルス薬からなる群
から選択される、実施形態３３から４１のいずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態４３は、細胞質体が免疫系回避部分をさらに含む、実施形態３３から４３のい
ずれか１つに記載の細胞質体である。
実施形態４４は、免疫系回避部分がＣＤ４７である、実施形態４３に記載の細胞質体で
ある。
実施形態４５は、
治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治
療薬、治療用遺伝子編集因子、他の治療剤、および／または治療用ナノ粒子を細胞に導入
するステップと；
細胞を除核するステップと
を含む、細胞質体を作製する方法である。
実施形態４６は、導入するステップが除核するステップに先行する、実施形態４５に記
載の方法である。
実施形態４７は、導入するステップが、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用
タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子の永
続的な発現をもたらす、実施形態４６に記載の方法である。
実施形態４８は、除核するステップが導入するステップに先行する、実施形態４５に記
載の方法である。
実施形態４９は、導入するステップが、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用
タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、および／または治療用遺伝子編集因子の一
過的な発現をもたらす、実施形態４５、４６、または４８のいずれか１つに記載の方法で
ある。
実施形態５０は、治療用ＲＮＡ分子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ショートヘ
アピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、長鎖
非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）またはＲＮＡウイルスである、実施形態４５から４９の
いずれか１つに記載の方法である。
実施形態５１は、治療用ＤＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴヌクレオチ
ド、プラスミド、細菌ＤＮＡ分子またはＤＮＡウイルスである、実施形態４５から５０の
いずれか１つに記載の方法である。
実施形態５２は、治療用タンパク質が酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパ
ク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、またはワクチンである、実施形態４５から５
１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５３は、ペプチド治療薬がペプチドホルモンおよび抗原からなる群から選択さ
れる、実施形態４５から５２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５４は、小分子治療薬がステロイド、ポリケチド、アルカロイド、毒素、抗生
物質、抗ウイルス薬、鎮痛薬、抗凝固薬、抗うつ薬、抗がん剤、抗てんかん薬、抗精神病
薬、鎮静薬、コルヒチン、タキソール、マイトマイシン、エムタンシン、または現在利用
可能なもしくは開発途中の任意の小分子治療薬からなる群から選択される、実施形態４５
から５３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５５は、細胞質体が治療用ナノ粒子をさらに含む、実施形態４５から５４のい
ずれか１つに記載の方法である。
実施形態５６は、細胞質体が細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイル
ス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる群から選択される治療剤をさらに含む、
実施形態４５から５４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５７は、ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、実施形態５６に記載の方法で
ある。
実施形態５８は、導入するステップがトランスフェクションを含む、実施形態４５から
５７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態５９は、導入するステップがエレクトロポレーション、マイクロインジェクシ
ョン、細胞スクイージング、ソノポレーション、インペールフェクション、または流体力
学的送達を含む、実施形態４５から５８のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６０は、
細胞をベクターでトランスフェクトするステップと；
細胞を除核するステップと
を含む、細胞質体を作製する方法である。
実施形態６１は、トランスフェクトするステップが除核するステップに先行する、実施
形態６０に記載の方法である。
実施形態６２は、除核するステップが、細胞のゲノムにベクター組み込まれた後に行わ
れる、実施形態６１に記載の方法である。
実施形態６３は、除核するステップがトランスフェクトするステップに先行する、実施
形態６０に記載の方法である。
実施形態６４は、ベクターがウイルスベクターである、実施形態６０から６３のいずれ
か１つに記載の方法である。
実施形態６５は、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（
ＡＡＶ）ベクター、水疱ウイルスベクター、またはハイブリッドウイルスベクターである
、実施形態６４に記載の方法である。
実施形態６６は、ベクターが治療用タンパク質のコード配列を含む、実施形態６０から
６５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態６７は、治療用タンパク質が酵素、抗体、抗原、毒素、サイトカイン、タンパ
ク質ホルモン、増殖因子、細胞表面受容体、またはワクチンである、実施形態６６に記載
の方法である。
実施形態６８は、細胞を除核するステップを含む、細胞質体を作製する方法である。
実施形態６９は、細胞が赤芽球ではない、実施形態６８に記載の方法である。
実施形態７０は、除核するステップが遠心分離を含む、実施形態６８または実施形態６
９に記載の方法である。
実施形態７１は、実施形態３３から４４のいずれか１つに記載の細胞質体の治療的有効
量を対象に投与するステップを含む、対象を治療する方法である。
実施形態７２は、細胞質体の治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法である
。
実施形態７３は、細胞質体が赤芽球から得られたものではない、実施形態７２に記載の
方法である。
実施形態７４は、
実施形態４５から７０のいずれか１つに記載の方法により細胞質体を作製するステップ
と；
細胞質体を保存するステップと
を含む、方法である。
実施形態７５は、保存するステップが凍結保存を含む、実施形態７４に記載の方法であ
る。
実施形態７６は、保存するステップが凍結冬眠を含む、実施形態７４に記載の方法であ
る。
実施形態７７は、
培地で細胞を培養するステップと；
細胞を刺激するステップと；
細胞を除核して細胞質体を形成するステップと
を含む、方法である。
実施形態７８は、培養するステップが３Ｄ培養、接着培養、懸濁培養、および半懸濁培
養のうちの１つまたは複数を含む、実施形態７７に記載の方法である。
実施形態７９は、細胞を刺激するステップが、１つまたは複数の薬物を培地に添加する
こと、１つまたは複数の抗体を培地に添加すること、１つまたは複数のエキソソームを培
地に添加すること、１つまたは複数のケモカインを培地に添加すること、１つまたは複数
の細胞質体を培地に添加すること、２Ｄもしくは３Ｄ条件下で培養すること、または低酸
素条件下で培養することのうちの１つまたは複数を含む、実施形態７７から７８のいずれ
か１つに記載の方法である。
実施形態８０は、細胞または細胞質体を培地から分離するステップをさらに含む、実施
形態７７から８０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８１は、
細胞を培地で培養するステップと；
細胞を刺激するステップと
を含む方法であって、
細胞を刺激するステップが１つまたは複数の細胞質体を培地に加えることを含む、方法
である。
実施形態８２は、培養するステップが３Ｄ培養、接着培養、懸濁培養、および半懸濁培
養のうちの１つまたは複数を含む、実施形態８１に記載の方法である。
実施形態８３は、細胞を刺激するステップが、１つまたは複数の薬物を培地に添加する
こと、１つまたは複数の抗体を培地に添加すること、１つまたは複数のエキソソームを培
地に添加すること、１つまたは複数のケモカインを培地に添加すること、２Ｄもしくは３
Ｄ条件下で培養すること、または低酸素条件下で培養することのうちの１つまたは複数を
さらに含む、実施形態８１から８２のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８４は、細胞を培地から分離するステップをさらに含む、実施形態８１から８
３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８５は、細胞を除核して細胞質体を形成するステップをさらに含む、実施形態
８１から８４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態８６は、実施形態８０または実施形態８４に記載の方法によって調製された培
地の治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象を治療する方法である。
実施形態８７は、実施形態８０または実施形態８６に記載の方法により調製された細胞
質体の治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象を治療する方法である。
実施形態８８は、がん、感染症、神経疾患、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、眼
科疾患、骨疾患、代謝性疾患、またはそれらの２つ以上を治療するための医薬の製造にお
ける実施形態３３から４４のいずれか１つに記載の細胞質体の使用である。
実施形態８９は、がん、感染症、神経疾患、変性疾患、自己免疫疾患、心血管疾患、眼
科疾患、骨疾患、代謝性疾患、またはそれらの２つ以上を治療するための医薬の製造にお
ける実施形態８０または実施形態８４の方法によって調製された培地の使用である。
実施形態９０は、細胞質体を対象に投与するステップを含む、対象における疾患または
状態の有無を判定する方法である。
実施形態９１は、疾患または状態ががん、感染症、炎症状態、神経疾患、変性疾患、自
己免疫疾患、心血管疾患、虚血性疾患、遺伝性もしくは遺伝的状態、発達状態、眼科疾患
、骨疾患、代謝性疾患、中毒症、特発性疾患、またはそれらの２つ以上である、実施形態
９０に記載の方法である。
実施形態９２は、細胞質体がレポーター分子または試薬を発現または含有する、実施形
態９０から９１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９３は、レポーター分子または試薬がバイオレポーター分子または試薬である
、実施形態９２に記載の方法である。
実施形態９４は、
実施形態３３から４４のいずれか１つに記載の細胞質体である第１の細胞質体と；
細胞または第２の細胞質体と
を含む細胞融合産物である。
実施形態９５は、
サンプルを対象から得るステップと；
細胞質体をサンプルに添加するステップと
を含む、対象における疾患または状態の有無を判定する方法である。
実施形態９６は、疾患または状態ががん、感染症、炎症状態、神経疾患、変性疾患、自
己免疫疾患、心血管疾患、虚血性疾患、遺伝性もしくは遺伝的状態、発達状態、眼科疾患
、骨疾患、代謝性疾患、中毒症、特発性疾患、またはそれらの２つ以上である、実施形態
９５に記載の方法である。
実施形態９７は、細胞質体がレポーター分子または試薬を発現または含有する、実施形
態９５から９６のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態９８は、レポーター分子または試薬がバイオレポーター分子または試薬である
、実施形態９７に記載の方法である。
本開示を以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載されている本
開示の範囲を限定するものではない。
[実施例１]
－成功した哺乳動物細胞の除核および生存
図１に示したように、治療用細胞質体は同種のまたは自己のドナー由来細胞から生成す
ることができ、疾患の治療および診断に使用することができる。概念実証として、各種タ
イプの哺乳動物細胞（例えば、間葉系幹細胞、好中球、線維芽細胞、ナチュラルキラー細
胞）の除核効率および回復率を決定した。哺乳動物細胞を細胞培養プレートから取り出し
た後、不連続Ｆｉｃｏｌｌ勾配高速遠心分離を使用した密度勾配遠心分離により哺乳動物
細胞を除核した（図２Ａ～Ｄ）。表１に懸濁プロトコールを使用した除核の結果をまとめ
ている。除核効率および細胞生存率は、ｈＴＥＲＴ形質転換細胞および初代間葉系幹細胞
（ＭＳＣ）の両方で、ならびに線維芽細胞および好中球で最も高かった。表２には接着プ
ロトコールを使用した除核の結果をまとめている。除核効率は、間葉系幹細胞およびマク
ロファージの両方で７０％を超えていた。この実験は、本明細書に記載の方法のいずれか
を使用して、各種タイプの哺乳動物細胞が除核され得ることを示した。
Figure 2022184879000002
Figure 2022184879000003
次に、細胞質の生存率を９６時間にわたり測定した（図３Ａ）。ＭＳＣは経時的に増殖
したが、細胞質体は増殖しなかった。代わりに、生存可能な細胞質体における相対的変化
倍率は、９６時間で低下するまで、７２時間適正に一定を維持した。したがって、細胞質
体の生存は３～４日間に及んだ。ほとんどの細胞ベースの療法は即座に使用されることが
ないので、凍結保存後の細胞質体の生存率を決定した。驚いたことに、凍結保存後の細胞
質体の生存率は、凍結保存後のＭＳＣの生存率よりも高かった（図３Ｂ）。除核直後に播
種された細胞質体および凍結保存から回復させた細胞質体は、２４時間後に同様の相対的
細胞生存率を示した（図３Ｃ）。この実験は、細胞質体の生存率が凍結保存に影響されな
いことを示した。さらに、凍結冬眠後の細胞質体の生存率は、凍結冬眠後のＭＳＣの生存
率と同様であった（図２５Ａ）。様々な長さの時間の凍結冬眠後に回復した細胞質体は、
凍結冬眠後に回復したＭＳＣと同様にボイデン（Boyden）チャンバーアッセイで誘導され
た移動を受けることができた（図２５Ｂ）。
次に、細胞の大規模生産をｅｘ ｖｉｖｏで設定し、続いて大容量密度勾配遠心分離お
よび除核を行い、治療用細胞質体を生成した。一実施形態では、治療用細胞質体は、疾患
を治療するための治療用カーゴ（例えば、ｍＲＮＡ、薬物、ペプチドなど）が装填されて
いる。別の実施形態では、治療用細胞質体は、診断で使用するために、即時使用のために
調製される（例えば、静脈内注射（ＩＶ）、腹腔内注射（ＩＰ）、組織、またはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの適用）。
[実施例２]
－細胞質体は、無傷のオルガネラ、細胞外マトリックスと相互作用する能力を保持し、細
胞－生物学的機能を果たし、治療価値のある送達ビヒクルとして機能することができる
細胞質体が凍結保存後に生存率を維持し得るか否かを判定した後、ＭＳＣ由来の細胞質
体の細胞表面マーカープロファイルが骨髄由来のＭＳＣと異なるか否かを判定するために
、フローサイトメトリー分析を実施した（図４）。図４に示したように、ＭＳＣ由来の細
胞質体および骨髄由来のＭＳＣは両方ともＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１４６、
およびＣＤ１６６の細胞表面発現を維持した。図５Ａ～Ｆ’および図６Ａ～Ｄ’は、細胞
質体が付着し、細胞骨格を再編成し、２Ｄおよび３Ｄ培養システムのマトリックスタンパ
ク質上に広がり、トンネルナノチューブを形成し、これが同一のまたは異なる起源の細胞
間で生物産物を移入し得ることを示した。オルガネラ染色は、ゴルジ、ＥＲ、Ｆ－アクチ
ン細胞骨格、リソソーム、エンドソーム、微小管、およびミトコンドリアが細胞質体内で
無傷のままであることを示した（図７Ａ～Ｅ’）。さらに、細胞質体は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでのホーミングの可能性を示した。細胞質体は、細胞外マトリックスタンパク質上で容
易に移動し、可溶性ケモカイン勾配の方向に移動した（すなわち、化学感受性を介して）
（図８Ａおよび８Ｂ）。特に、精製ｍＲＮＡを外因的にトランスフェクトされた細胞質体
は、機能的細胞内タンパク質を生成し、各種の臨床での使用および疾患状態に向けて開発
されている治療用ｍＲＮＡ適用を模倣し得る。またこれは、ｍＲＮＡ翻訳およびタンパク
質合成に関する仕組みが細胞質体において核の非存在下で正常に機能するので、治療価値
のある生物活性分子を生成するために使用することができることを実証している。
公知の分泌タンパク質をコードする精製ｍＲＮＡを外因的にトランスフェクトした細胞
質体は馴化培養培地で機能的細胞外タンパク質を生成し、このことはＥＲ／ゴルジおよび
分泌経路が核の非存在下で細胞質体において正常に機能することを示している（図１１）
。さらに、分泌タンパク質を含有する細胞質体馴化培地によるマクロファージおよび内皮
細胞の処理は、これらの細胞における重要なシグナル伝達応答を活性化した（図１２）。
これにより、細胞質体が治療的価値のある分泌タンパク質および生体分子を生成および送
達するための新規ビヒクルとして使用できるという概念実証が提供された。細胞質体には
、限定するものではないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡプラスミド、ペ
プチド、および化学療法剤を含む、各種カーゴを装填することができる（例えば、図９お
よび１０を参照）。
[実施例３]
－操作された細胞質体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で機能し得る。
理論に束縛されることを望むものではないが、この実施例は、「カーゴ」、例えば、外
因性ｍＲＮＡ分子を発現するように操作された細胞質体が生成され得ることを示している
。図１３Ｂおよび１３Ｃは、ＭＳＣ由来細胞質体を操作して、治療レベルの機能性抗炎症
性サイトカインインターロイキン１０（ＩＬ－１０）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、および静脈
内注射後の前臨床マウスモデルで生成および分泌できることを示している。図１３Ｂは、
ＩＬ－１０ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞質体が高レベルのＩＬ－１０を分泌し
得ることを示している。分泌されたＩＬ－１０が活性であるかどうかを決定するため、血
清飢餓マクロファージを、未処理ＭＳＣ、ＩＬ－１０を発現するＭＳＣ、未処理細胞質体
、およびＩＬ－１０を発現する細胞質体からの馴化培地（ＣＭ）とインキュベーションし
た。リン酸化ＳＴＡＴ３は、ＩＬ－１０を発現するＭＳＣのＣＭとインキュベーションし
た後、およびＩＬ－１０を発現する細胞質体のＣＭとインキュベーションした後のマクロ
ファージで検出されたが、未処理のＭＳＣおよび未処理の細胞質体からのＣＭとインキュ
ベーションした後のマクロファージではＳＴＡＴ３活性は検出されなかった（図１３Ｃ）
。細胞質体分泌によるＩＬ－１０がｉｎ ｖｉｖｏで検出可能であるか否かを判定するた
め、Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、ＩＬ－１０を発現するＭＳＣまたはＭＳＣ由来の細胞質体
を眼窩後部に注射した。注射の２時間後に血液を採取し、ＩＬ－１０のレベルを決定した
。未処理のＭＳＣを注射したマウスの血液では、ＩＬ－１０はほとんどまたは全く検出さ
れなかった（図１３Ｄ）。図１３Ｄに示すように、未処理のＭＳＣを注射したマウスにお
けるレベルと比較して、より高レベルのＩＬ－１０が、ＩＬ－１０を発現するＭＳＣ由来
細胞質体を注射したマウスにおいて検出された。
これらのデータは、正常組織および罹患組織を治療するための臨床的に関連する治療用
サイトカインを生成および分泌する遺伝子操作された細胞質体ベースの細胞療法の可能性
を示している。
ＭＳＣ由来細胞質体が基底膜に侵入できるか否かを判定するため、ＭＳＣまたはＭＳＣ
由来細胞質体を、基底膜を１０％ＦＢＳに向けて２４時間侵入させた。図１４Ａおよび１
４Ｂに示したように、ＭＳＣ由来細胞質体は、１０％ＦＢＳの存在下で未処理のＭＳＣと
同程度に、基底膜に侵入するのに効率的であった。注目すべきことに、未処理のＭＳＣは
化学誘引物質の非存在下で基底膜に侵入することはできたが、ＭＳＣ処理の細胞質体は化
学誘引物質の非存在下で基底膜に侵入することはほとんどできなかった。これらのデータ
は、ＭＳＣ由来細胞質体が基底膜を消化してそれに侵入できることを示している。これら
のデータは、細胞質体ベースの細胞療法が、複雑な細胞外マトリックス障壁を通過して移
動し、組織内にそれらのカーゴ（複数可）を送達するという固有の可能性を示している。
図１５Ａおよび１５Ｂに示したように、ＭＳＣ由来細胞質体は１２μｍの平均直径を有
するが、ＭＳＣは２０μｍの平均直径を有する。ＭＳＣ由来細胞質体の生体内分布を判定
するため、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞質体をマウスに眼窩後部注射した。図１５Ｃおよ
び１５Ｄに示したように、肝臓で検出されたＭＳＣの数よりも多いＭＳＣ由来細胞質体が
肝臓において検出された。これらのデータは、循環に直接送達される細胞質体ベースの細
胞療法が広範囲の疾患を治療する可能性を示している。
[実施例４]
－操作された細胞質体は機能的な細胞表面タンパク質を発現し得る
図１６Ｂに示すように、ＣＸＣＲ４を発現する操作されたＭＳＣおよびＣＸＣＲ４を発
現する操作されたＭＳＣ由来細胞質体は、フローサイトメトリーにより決定された同等の
レベルのＣＸＣＲ４を発現する。操作された細胞質体が機能的な細胞表面タンパク質を発
現できるか否かを判定するため、ＣＸＣＲ４受容体を発現するＭＳＣおよびＭＳＣ由来細
胞質体を各種濃度のＳＤＦ－１αに向けて移動させた。図１６Ｃに示したように、機能性
ＣＸＣＲ４を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体はＳＤＦ－１αに向けて移動
することができ、ＳＤＦ－１αの濃度の増加と共に細胞移動が増加する。さらに、移動す
るＭＳＣ由来細胞質体の数は、ＣＸＣＲ４を発現する、移動するＭＳＣの数よりも多かっ
た（図１６Ｃ）。
図１７Ａ～Ｃは、ＭＳＣ由来細胞質体を操作して、炎症が起きた血管系への細胞接着を
媒介することが知られている機能的な細胞接着タンパク質を発現することができることを
示している。図１８Ａ～Ｄは、ＭＳＣ由来細胞質体を操作して、マクロファージ相互作用
および治療用細胞の食作用をモジュレートすることが知られている細胞タンパク質を発現
することができることを示している。
[実施例５]
－細胞質体を操作して機能的ＩＬ－１２を分泌させることができ、また乳がんの同系マウ
スモデルにおいて炎症性遺伝子の発現を誘導し、腫瘍増殖を抑制することができる
ＭＳＣおよびＭＳＣ由来細胞質体にＩＬ－１２ ｍＲＮＡをトランスフェクトした。馴
化培地（ＣＭ）を、トランスフェクションの２４時間後、４８時間後、および７２時間後
に回収した。図１９Ｂに示したように、ＭＳＣ由来の細胞質体はＩＬ－１２を分泌する。
ＭＳＣ由来の細胞質体が機能性ＩＬ－１２を分泌し得るか否かを判定するため、マウス脾
細胞を完全培地、ＩＬ－１２を発現するＭＳＣからのＣＭ、ＩＬ－１２を発現するＭＳＣ
由来細胞質体からのＣＭ、および精製ＩＬ－１２で処理した。ＩＬ－１２を発現するＭＳ
Ｃ由来細胞質体およびＩＬ－１２を発現するＭＳＣは、マウス脾細胞においてＳＴＡＴ４
のリン酸化を引き起こし得る機能性ＩＬ－１２を分泌する（図１９Ｃ）。
実施例３に示したように、細胞質体の眼窩後部投与はマウスにおいて十分に許容された
。細胞質体の腫瘍内投与が許容されるか否かを判定するため、マウスに眼窩後部または腫
瘍内投与のいずれかにより注射した。死亡数を記録し、注射方法および死因に従って分類
した（表３）。下記の表に示したように、細胞質体の腫瘍内投与は、優れた安全性プロフ
ァイルとともに十分に許容された。
Figure 2022184879000004
次に、ＩＬ－１２を発現するＭＳＣ由来細胞質体および空のＭＳＣ由来細胞質体を確立
されたＥ０７７１皮下腫瘍に注射した。注射の４８時間後にすべてのマウスを安楽死させ
、腫瘍サンプルを回収した。図１９Ｄに示したように、腫瘍ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２を
発現するＭＳＣ由来細胞質体を注入したマウスから単離した腫瘍において検出されたが、
空のＭＳＣ由来細胞質体を注射したマウスから単離した腫瘍においては、腫瘍ＩＬ－１２
はほとんど、または全く検出されなかった。まとめると、これらの結果は、ＭＳＣ由来細
胞質体が前臨床マウスモデルにおける罹患組織に、臨床的に関連するレベルの治療用サイ
トカインを生成、分泌、送達することができることを示している。
図２０Ａ～Ｃは、ＩＬ－１２サイトカインを発現するように操作された細胞質体を注射
したマウスから採取したサンプルがインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、ＰＤ－Ｌ１お
よびＣＸＣＬ９を発現し、一方、ＰＢＳ単独または空の細胞質体を受けたマウスから採取
したサンプルが低レベルのＩＦＮγ、ＰＤ－Ｌ１およびＣＸＣＬ９を発現したことを示し
ている。これらのデータは、ＩＬ－１２を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体
が、注射された腫瘍内で炎症反応を誘発したことを示している。図２０Ｄは、ＩＬ－１２
を発現するように操作されたＭＳＣ由来細胞質体を注射した後の腫瘍サイズの減少を示し
ている。
図２１Ａ～Ｃは、ＭＳＣ由来細胞質体に腫瘍溶解性ウイルスを装填することができ、そ
のようなウイルスを免疫不全および免疫適格マウスで増殖する腫瘍に送達することが可能
であり、それはＩＬ－１２分泌と組み合わせて細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤
を促進することを示している。図２１Ａに関しては、７日後に非常に少ない細胞質体が腫
瘍において検出され得るが、増殖している腫瘍の中心（注射部位）および外縁においては
、多数のＭＳＣが存在することに注目されたい。
図２２Ａ～Ｂは、遺伝子操作したＭＳＣ由来細胞質体が遺伝子編集タンパク質を送達し
て、細胞質体－宿主細胞融合後に、宿主細胞において遺伝子機能を制御することができる
ことを示している。これらのデータは、細胞内の正常または変異遺伝子を改変する遺伝子
編集コンポーネントを送達する細胞質体ベースの細胞療法の可能性を示している。
間葉系幹細胞の除核（ＭＳＣ）
このプロトコールは、Cell Biology Volume 14, 1976, Pages 87-93 Chapter 7 Enucle
ation of Mammalian Cells in Suspension (Michael H. Wigler, Alfred I. Neugut, I.
Bernard Weinstein)の方法を変更した。
５０％Ｆｉｃｏｌｌ溶液の調製：光を遮断したガラスビーカーにおいて、数グラムのＦ
ｉｃｏｌｌ（ＰＭ４００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－０３００－５００）を同
ミリリットル数の超純水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０９７７－０１５）に、室温で２４
時間、連続磁気撹拌により溶解した。次いで、混合物を３０分間オートクレーブした。混
合物を冷却した際、再度撹拌して確実に均一な粘稠度となるようにした。屈折率を屈折計
（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ １３９４００００）で測定したところ、１．４２３０～１．４２９
０の範囲であった。アリコートを摂氏－２０度で保存した。
２Ｘ ＭＥＭの調製：各５０ｍｌ量に対し、１０ｍＬ １０Ｘ ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、
１１４３０－０３０）、正確には２．９４ｍＬ 重炭酸ナトリウム（７．５％、Ｇｉｂｃ
ｏ、２５０８０－０９４）、１ｍＬ １００Ｘ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ １５
１４０－１２２）および３６ｍＬ 超純水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０９７７－０１５
）を使用した。次いで、溶液を０．２２ｕｍの膜フラスコ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ２５－２２
７）で濾過し、摂氏４度で保存した。
除核の前日に、ＭＳＣを、１５ｃｍプレート（Ｏｌｙｍｐｕｓ ２５－２０３）当たり
２．５Ｍで、２０ｍＬ ＭＳＣ培地［ＭＥＭ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ １２５６１－０５６）
；１６．５％ プレミアムＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＳＩ １５０
）；１％ ＨＥＰＥＳ １Ｍ（Ｇｉｂｃｏ １５６３０－８０）；１％ Ａｎｔｉ－Ａｎ
ｔｉ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ １５２４０－０６２）；１％ グルタマックス １００Ｘ
（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０－０６１）］に播種した。次に、サイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍ
ａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ６７６２）を２Ｘ ＭＥＭに添加した（最終濃度２μΜ／ｍＬ）
。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配の調製：２Ｘ ＣｙｔｏＢを５０％Ｆｉｃｏｌｌアリコートに１：１
希釈で添加し、２５％Ｆｉｃｏｌｌストック濃度を作製した。次に、１７％、１６％、１
５％、および１２．５％Ｆｉｃｏｌｌを、適量の１Ｘ ＭＥＭバッファー（サイトカラシ
ンＢを含有する２Ｘ ＭＥＭを１：１希釈で超純水に添加）で２５％Ｆｉｃｏｌｌを希釈
することにより作製した。希釈液は、少なくとも１時間ＣＯ２インキュベーター内で、ゆ
るくキャップで覆い平衡化した。次いで、Ｆｉｃｏｌｌ勾配を１３．２ｍＬの超透明チュ
ーブ（Ｂｅｃｋｍａｎ、３４４０５９）に注ぎ入れ、ＣＯ２インキュベーター内で一晩（
６～１８時間）インキュベートした。
除核の当日、１２～２５Ｍ ＭＳＣ（理想的には２０Ｍ）を除核のために各チューブに
回収した。培地を吸引し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ １４１
９０－１４４）で１回洗浄した。５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ－Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ、１
２５６３０１１）を各プレートに添加し、５分までインキュベートした。９０％の細胞が
分離された場合、５ｍＬの完全ＭＳＣ培地を添加し、細胞を５０ｍｌチューブ（３～４プ
レート／チューブ）に回収した。次いで、チューブを１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。細胞をカウントし、ペレット化し、１
２．５％Ｆｉｃｏｌｌで再懸濁した。次に、細胞－フィコール混合物を４０ｕｍの細胞濾
過器（Ｆａｌｃｏｎ ３５２３４０）に通し、新しい５０ｍＬチューブに滴下した。シリ
ンジを使用して、３．２ｍＬの細胞懸濁液を事前に作製した勾配にゆっくりとロードした
。１ｍＬの１Ｘ ＭＥＭバッファーをシリンジにより最終（上部）層に加えた。次いで、
チューブをローターバケットに装填し、バランスをとり、超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ
、Ｌ８Ｍ）で６０分間、２６，０００ｒｐｍ、３１℃、Ａｃｃｅｌ ７、Ｄｅｃｅｌ ７
で実施した。遠心分離の終了時に３つの層が存在した：１つは１２．５％（細胞質体およ
び破片）の上部付近、１つは１２．５／１５％の界面付近（細胞質体）、および２５％の
下部のペレット（核体）。１５％Ｆｉｃｏｌｌ溶液の上層を１５ｍｌコニカルチューブに
回収した。次いで、回収した層を、４容量より多い加温した無血清ＭＳＣ培地で希釈した
（すなわち、３ｍＬのＦｉｃｏｌｌおよび１５ｍＬ以下の培地で満たした）。穏やかに混
合した後、混合物を１０分間１，２００ｒｐｍでペレット化した。加温した無血清ＭＳＣ
培地で３回洗浄した後、細胞を実験プロトコールに従って培地に、例えば、トランスフェ
クション培地ｖｓ移動培地ｖｓ無血清培地ｖｓ完全培地に再懸濁した。除核効率は、１：
２０００希釈のＶｙｂｒａｎｔ（登録商標） Ｄｙｅｃｙｃｌｅ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｖ３５００４）または１：５０００希釈のＨｏｅｃｈ
ｓｔ ３３３４２を含む完全ＭＳＣ培地を添加することにより１２ウェルプレートで決定
した。少量の各層を各ウェルに追加し、１０分間インキュベーターで付着／染色させた。
集団あたりの陰性細胞質体のパーセンテージは、落射蛍光顕微鏡法によって決定した。
細胞質体ｍＲＮＡトランスフェクション
１Ｍの細胞質体を、加温した１ｍｌのアミノ酸非含有のａ－ＭＥＭ完全培地（Ｔｈｅｒ
ｍｏＦｉｓｈｅｒ １２５６１０５６；１６．５％プレミアムウシ胎児血清（ＦＢＳ）、
１％グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ ３５０５００６１）、１％ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ
１５６３００８０））で懸濁した。１μｇのｍＲＮＡを加温したｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈
し、少なくとも２０回ピペットで混合した。４μｌのリポフェクタミン－３０００（Ｔｈ
ｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｌ３０００１５）を４６μｌの加温したｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈ
ｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３１９８５０６２）に添加し、少なくとも２０回ピペットで混合
した。ｍＲＮＡとリポフェクタミン－３０００の比は１：４（ｗ／ｖ）であった。ｍＲＮ
Ａおよびリポフェクタミン－３０００希釈液をピペットで少なくとも２０回混合し、室温
で１５分間インキュベートした。ｍＲＮＡおよびリポフェクタミン－３０００混合物を細
胞質体懸濁液に添加し、十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。懸濁液を
５分毎に振盪し、細胞の凝集を防止した。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、通
常のａ－ＭＥＭ完全培地（１６．５％プレミアムＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａ
ｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１％グルタマックス、１％ＨＥＰＥＳ）またはＰＢＳに再懸濁し
た。
細胞質体ｓｉＲＮＡトランスフェクション
１Ｍの細胞質体を、加温した１ｍｌのＡ／Ａ非含有ａ－ＭＥＭ完全培地（１６．５％プ
レミアムＦＢＳ、１％グルタマックス、１％ＨＥＰＥＳ）で懸濁した。２μｌのｓｉＲＮ
Ａを加温したｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、少なくとも２０回ピペットで混合した。８μｌ
のリポフェクタミン－３０００を９２μｌの加温したｏｐｔｉ－ＭＥＭで希釈し、少なく
とも２０回ピペットで混合した。ｓｉＲＮＡとリポフェクタミン－３０００の比は１：４
（ｖ／ｖ）であった。ｓｉＲＮＡおよびリポフェクタミン－３０００希釈液をピペットで
少なくとも２０回混合し、室温で１５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡおよびリポフ
ェクタミン３０００混合物を細胞質体懸濁液に添加し、十分に混合し、３７℃で２０分間
インキュベートした。懸濁液を５分毎に振盪し、細胞の凝集を防止した。２０分間のイン
キュベーション後、細胞を遠心分離し、通常のａ－ＭＥＭ完全培地（１６．５％プレミア
ムＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１％グルタマックス、
１％ＨＥＰＥＳ）で再懸濁した。
腫瘍溶解性ウイルス感染細胞質体の生成
除核の１日前（通常、除核の１８時間前）に、２．５＊１０６個のｈＴＥＲＴ－ＭＳＣ
を１５ｃｍ皿に播種した。播種の約２時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細
胞に、異なるＭＯＩ（例えば０．０５または０．５）のｏＨＳＶ－ＧＦＰ（Ｉｍａｎｉｓ
ＯＶ３００１）を、８ｍＬの無血清ｏｐｔｉ－ＭＥＭを使用して感染させた。次に、細
胞を３７℃で２時間、時々振盪しながらインキュベートした。次いで、ウイルス接種物は
廃棄した。２０ｍＬの予め加温した完全培養培地（ａ－ＭＥＭ、１６．５％プレミアムＦ
ＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１％グルタマックス、１％
ＨＥＰＥＳ）を各ウェルに添加した。細胞を除核まで３７℃でインキュベートした。
細胞質体において機能性タンパク質を過剰発現するレンチウイルス
標的細胞を６ウェルプレートの１つのウェルに１～２×１０５細胞／ウェルの密度で、
または０．５～１Ｍ ＭＳＣを含む１０ｃｍプレートに播種した。翌日、濃縮した組換え
レンチウイルスを３７℃の水浴で解凍し、解凍後すぐに浴から取り出した。次いで、細胞
をＰＢＳで３回洗浄した。２００μＬの無血清培地または２ｍＬの無血清培地（１：１２
５０ ＳｕｒｅＥＮＴＲＹ）を添加した。標的細胞を６ウェルプレートにおいてＭＯＩ
１０：１で感染させた。翌日、ウイルス上清を除去し、適切な完全増殖培地を細胞に添加
した。７２時間のインキュベーション後、細胞を２×１００ｍｍ皿に継代培養した。適量
の選択薬（すなわちピューロマイシン）を安定した細胞株生成のために添加した。選択の
１０～１５日後、クローンを拡大のために選び、陽性クローンをスクリーニングした。選
択した陽性クローンを除核のために拡大した。操作された細胞質体を上記のように調製し
た。細胞質体上の標的タンパク質の発現は、通常の生化学的方法または機能アッセイ、例
えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、またはボイデンチャンバ
ーアッセイにより決定した。
細胞質体へのペプチド装填
１ウェルあたり１×１０５／ｍｌを、完全ＭＳＣ培地［ＭＥＭ １Ｘ（Ｇｉｂｃｏ １
２５６１－０５６）；１６．５％プレミアムＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ
ｓ ＳＩ １５０）；１％ＨＥＰＥＳ １Ｍ（Ｇｉｂｃｏ １５６３０－８０）；１％Ａ
ｎｔｉ－Ａｎｔｉ １００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ １５２４０－０６２）；１％グルタマックス
１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０－０６１）］の４チャンバーガラススライド（Ｌａ
ｂＴｅｋ ＩＩ ４チャンバーガラススライド、１５５３８３）に播種した。細胞を少な
くとも１時間または一晩付着させた。次いで、細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０－
１４４）ですすいだ。Ａｒｇ９（ＦＡＭ）（１０ｍＭ、Ａｎａｓｐｅｃ、ＡＳ－６１２０
７）を完全培地で希釈して、総濃度を１：１００（１００ｕＭ）にした。次いで、細胞質
体を１～２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回すすいだ。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：５０００希釈で完全培地に少なくとも１０分間添加した
。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、落射蛍光顕微鏡法により画像化した。
免疫適格マウスにおける前臨床同系腫瘍モデルの生成
マウス脇腹両側の小区画の毛（肘レベルからももの上部までと、ちょうど腹部から背中
の中間まで）を剃った。過剰の毛はアルコールワイプで拭き取った。２７Ｇ １／２”針
を備えた１ｍＬツベルクリン注射器を使用して、１Ｍ／１００μＬ Ｅ０７７１細胞をマ
ウスの両側に注射した。約１０～２０日後に腫瘍が直径０．７～１．０ｃｍに達するまで
、マウスをモニターした。
治療用細胞質体の腫瘍内送達
操作された細胞質体（すなわち、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡが装填されたもの）を、所望の
濃度、例えば３Ｍ／５０ｕＬでＰＢＳに再懸濁した。注射当日、動物の体重および腫瘍の
寸法を測定した。操作された細胞質体を腫瘍の中心に注射した。マウスをモニターした。
腫瘍および体重は、２～３日毎に測定した。
治療用細胞質の静脈内送達
操作された細胞質体（すなわち、ＩＬ－１２ ｍＲＮＡが装填されたもの）を、所望の
濃度、例えば３Ｍ／５０μＬでＰＢＳに再懸濁した。推奨最大注射量は１００μＬであっ
た。注射は、１ｍＬツベルクリン注射器および２７Ｇ １／２”または２８Ｇ １／２”
針で実施した。静脈内（ＩＶ）注射については、施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ
）のプロトコールに従った。眼窩後部注射は、ケタミン／キシラジン腹腔内（ＩＰ）注射
またはイソフルオラン吸入による麻酔下で実施した。尾静脈注射は、拘束器具を使用して
実施した。
[実施例６]
－３Ｄ培養ＭＳＣは除核することができ、３Ｄ由来細胞質体はｉｎ ｖｉｖｏでより良好
な生体内分布を示す。
ＭＳＣを３Ｄハンギングドロップ（３Ｄ ＭＳＣ）で培養し、次いで除核して３Ｄ細胞
質体を生成した。ハンギングドロップによるＭＳＣの３Ｄ培養プロトコールは、Curr Pro
toc Stem Cell Biol. 2014 Feb 6; 28: Unit-2B.6.(Thomas J. Bartosh1 and Joni H. Yl
ostalo)を変更した。
健康なＭＳＣをトリプシンによって２Ｄ培養プレートから採取し、新鮮なａ－ＭＥＭ（
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １２５６１０５６）完全培地（１６．５％プレミアムＦＢＳ
、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１％グルタマックス、１％ＨＥ
ＰＥＳ）に１４３万細胞／ｍｌで再懸濁した。１５ｃｍプレートの蓋を完全に開き、２０
ｍｌのＰＢＳをプレートに加えた。マルチチャネルピペットを使用して、プレートの蓋に
液滴あたり３５μｌの液滴を作製した（約５０，０００細胞／液滴）。約１００～１２０
個の液滴が各蓋に置かれた。蓋を閉め、プレートをインキュベーターに戻した。液滴を２
日間培養し、次いで、セルリフターで採取し、１５ｍｌチューブに回収した（チューブ当
たり約３００液滴）。チューブを１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し
、チューブをＰＢＳで２回洗浄した。次いで、すべてのＰＢＳを除去し、７．５ｍｌの新
しく解凍した０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ２５２００
１１４）を各チューブに添加した。チューブを水浴で４分間インキュベートした。液滴を
、低貯留チップ付きの１ｍｌピペットで約１０～２０回穏やかにピペッティングし、水浴
でさらに４分間インキュベートした。ほとんどの液滴が解離するまで、液滴を、低貯留チ
ップ付きの１ｍｌピペットで約１０～２０回再び穏やかにピペッティングした。７．５ｍ
ｌの完全血清培地（グルタマックス Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５００
６１）；胎児ウシ血清－プレミアムセレクト（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ
ＳＩ １５５０）；ＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ １５６３００８０）；Ａｎｔｉ
ｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（１００Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ １５２４００６２）
）を各チューブに加え、チューブを１０分間１，２００ｒｐｍで遠心分離した。解離した
細胞を１０ｍｌの完全血清培地で洗浄し、細胞を５ｍｌの完全血清培地で再懸濁した。細
胞を７０μｍ細胞フィルターに通し、次いで、フィルターを５ｍｌ完全血清培地で洗浄し
た。細胞をカウントし、１０Ｍ／ｍｌより高い予備処理した１２．５％フィコールで再懸
濁した。３０～４０Ｍの細胞を各除核チューブに使用した。続いて、上記の除核プロトコ
ールに従った。
ＤｉＤ標識した通常の２Ｄ培養ＭＳＣ（２Ｄ ＭＳＣ）、３Ｄ ＭＳＣ、または３Ｄ細
胞質体をそれぞれＢａｌＢ／Ｃマウスに眼窩後部注射した。示した組織を注射の２４時間
後に採取し、ＤｉＤ標識細胞をＦＡＣＳにより分析した。図２４は、３Ｄ培養ＭＳＣから
の３Ｄ由来細胞質体の生成の成功を示し、３Ｄ由来細胞質体が循環に注射した後の２Ｄ培
養細胞よりも肺トラップが少なく、末梢器官への良好な生体内分布を有することも示して
いる。これにより、カーゴの位置を特定して組織に送達する治療能力が顕著に改善するこ
とが期待される。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と関連づけて説明したが、前述の説明は添付の特許請求の範囲
によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことを理
解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と関連づけて説明したが、前述の説明は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
少なくとも１つの治療剤を発現または含有する第１の細胞質体を含む組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。
［２］
前記治療剤が、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、小分子治療薬、ナノ粒子、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］
細胞が、前記対象から採取された細胞であるか、もしくはそれに由来する、または細胞株、不死化細胞、もしくはがん細胞に由来する、［１］または［２］のいずれか一項に記載の方法。
［４］
前記第１の細胞質体が第２の細胞質体に融合される、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記対象に１つまたは複数の追加の療法を施すステップをさらに含む、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］
前記第１の細胞質体が免疫系回避部分を発現する、［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
前記免疫系回避部分がＣＤ４７である、［６］記載の方法。
［８］
前記第１の細胞質体または前記第１の細胞質体が得られる細胞が、前記治療剤を発現するように操作されている、［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記第１の細胞質体または前記第１の細胞質体が得られる細胞が、前記治療剤を発現するように操作されていない、［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
少なくとも１つの治療剤を含む細胞質体。
［１１］
前記治療剤が治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、小分子治療薬、ナノ粒子、細菌、細菌胞子、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる群から選択される、［１０］に記載の細胞質体。
［１２］
前記細胞質体が免疫系回避部分をさらに含む、［１０］または［１１］のいずれか一項に記載の細胞質体。
［１３］
細胞に治療剤を導入するステップと；
前記細胞を除核するステップと
を含む、細胞質体を作製する方法。
［１４］
前記導入するステップが前記除核するステップに先行する、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記導入するステップが、前記治療剤の永続的な発現をもたらす、［１４］記載の方法。
［１６］
前記除核するステップが前記導入するステップに先行する、［１３］に記載の方法。
［１７］
前記導入するステップが前記治療剤の一過的発現をもたらす、［１３］、［１４］、または［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
導入するステップがトランスフェクションを含む、［１３］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
導入するステップがエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞スクイージング、ソノポレーション、インペールフェクション、または流体力学的送達を含む、［１３］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］
対象を治療する方法であって、［１０］から［１２］のいずれか一項に記載の細胞質体の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。

Claims (20)

  1. 少なくとも１つの治療剤を発現または含有する第１の細胞質体を含む組成物の治療有効
    量を対象に投与するステップを含む方法。
  2. 前記治療剤が、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプ
    チド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、小分子治療薬、ナノ粒子、細菌、細菌胞子
    、バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス、エキソソーム、脂質、およびイオンからな
    る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 細胞が、前記対象から採取された細胞であるか、もしくはそれに由来する、または細胞
    株、不死化細胞、もしくはがん細胞に由来する、請求項１または２のいずれか一項に記載
    の方法。
  4. 前記第１の細胞質体が第２の細胞質体に融合される、請求項１から３のいずれか一項に
    記載の方法。
  5. 前記対象に１つまたは複数の追加の療法を施すステップをさらに含む、請求項１から４
    のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第１の細胞質体が免疫系回避部分を発現する、請求項１から５のいずれか一項に記
    載の方法。
  7. 前記免疫系回避部分がＣＤ４７である、請求項６記載の方法。
  8. 前記第１の細胞質体または前記第１の細胞質体が得られる細胞が、前記治療剤を発現す
    るように操作されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１の細胞質体または前記第１の細胞質体が得られる細胞が、前記治療剤を発現す
    るように操作されていない、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの治療剤を含む細胞質体。
  11. 前記治療剤が治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、治療用タンパク質、治療用ペプチ
    ド、小分子治療薬、治療用遺伝子編集因子、小分子治療薬、ナノ粒子、細菌、細菌胞子、
    バクテリオファージ、細菌成分、ウイルス、エキソソーム、脂質、およびイオンからなる
    群から選択される、請求項１０に記載の細胞質体。
  12. 前記細胞質体が免疫系回避部分をさらに含む、請求項１０または１１のいずれか一項に
    記載の細胞質体。
  13. 細胞に治療剤を導入するステップと；
    前記細胞を除核するステップと
    を含む、細胞質体を作製する方法。
  14. 前記導入するステップが前記除核するステップに先行する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記導入するステップが、前記治療剤の永続的な発現をもたらす、請求項１４記載の方
    法。
  16. 前記除核するステップが前記導入するステップに先行する、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記導入するステップが前記治療剤の一過的発現をもたらす、請求項１３、１４、また
    は１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 導入するステップがトランスフェクションを含む、請求項１３から１７のいずれか一項
    に記載の方法。
  19. 導入するステップがエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞スクイ
    ージング、ソノポレーション、インペールフェクション、または流体力学的送達を含む、
    請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 対象を治療する方法であって、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の細胞質体の
    治療有効量を前記対象に投与するステップを含む、方法。
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