JP2020505418A

JP2020505418A - 受動抗体依存性細胞媒介活性化

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Publication number: JP2020505418A
Application number: JP2019541246A
Authority: JP
Inventors: マイケルカリジューリ，; ジャンファユー，; ホンシェンダイ，
Original assignee: オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション; マイケルカリジューリ，; ジャンファユー，; ホンシェンダイ，
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2020-02-20
Also published as: US11459378B2; US20200040064A1; WO2018140974A1; EP3573640A1; EP3573640A4; CN110536699A; AU2018213418A1

Abstract

本明細書には、抗原特異的抗体を必要としない免疫エフェクター細胞活性化をモジュレートするための方法、試薬、および医薬組成物が開示される。本明細書では、ＩｇＧＦｃ領域が、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合することができる非重複領域またはドメインを両方とも包含し、抗体の抗原結合領域（Ｆａｂ）を使用せずに、免疫エフェクター細胞およびＦｃ結合タンパク質を発現する標的細胞を架橋することが可能であることが示されている。したがって、対象の受動的ＡＤＣＣを増強または阻害する方法も開示される。

Description

連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所により授与された補助金第５Ｐ０１ＣＡ１６３２０５号に基づく連邦政府の支援によりなされたものである。連邦政府は、本発明に対してある権利を有する。

背景
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、生殖系免疫グロブリン遺伝子を再編成して適応免疫応答を生成する能力を欠如し、以前に抗原曝露されていなくてもウイルス感染細胞またはがん細胞を認識することができる自然リンパ球細胞である（Orrら、２０１０年、Cell、１４２巻、８４７〜８５６頁）。ＮＫ細胞の機能的ステータスは、種々様々なＮＫ細胞活性化／阻害性受容体およびサイトカインからのシグナル入力により調節される。また、ＮＫ細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の主要なエフェクター細胞であり、ＩｇＧ分子にその分子のヒンジ領域で結合し、その結果生じる抗原−抗体複合体を介してＮＫ細胞活性化を開始させる低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＣＤ１６ａタンパク質（以降、ＣＤ１６ａ）を発現する（Sondermannら、２０００年、Nature、４０６巻、２６７〜２７３頁）。ＣＤ１６ａは、ＮＫ細胞において、シグナル伝達タンパク質ＣＤ３ζとカップリングする（Andersonら、１９９０年、Proc Natl Acad Sci USA ８７巻、２２７４〜２２７８頁；Lanierら、１９８９年、Nature ３４２巻、８０３〜８０５頁）。ＣＤ１６ａによるＮＫ細胞活性化は、そのリン酸化が、引いてはＮＫ細胞の活性化、および抗体で被覆された標的細胞の溶解をもたらすＣＤ３ζのクラスター化に十分な程度に物理的に近接した最低でも２つのＣＤ１６ａ結合部位を必要とする（O'Sheaら、１９９１年、Proc Natl Acad Sci USA ８８巻、３５０〜３５４頁）。

マウスおよびヒトでは、ＮＫ細胞が、幅広い感染性病原体に対するおよび悪性転換に対する防御の最前線としての役目を果たすことができることを示す実質的な証拠が存在する。「防御の最前線」とは、Ｔ細胞およびＢ細胞の適応性抗原特異的免疫系が、病原体または腫瘍それ自体が後に再び体内に存在した場合に、病原体を検出し、それを攻撃し、迅速にその応答を呼び出すことができるようになる数日から数週間前に生じる防御を意味する。ＮＫ細胞および他の自然免疫細胞による病原体および腫瘍細胞のこのような初期認識の背後にある機序は、完全にというわけはないが大部分が判明していない（Daiら、２０１７年、Immunity ４７巻（１号）、１５９〜１７０頁）。ＮＫ細胞および他の自然免疫細胞が、そのような危険をどのようにして発見することができるのかを理解することにより、そのような疾患を初期に処置する方法に関する理解が向上し、したがってより多くの命が救われることになるだろう。

一例として、ＮＫ細胞は、ヘルペスウイルス感染に対する防御の最前線を構成し、ＮＫ細胞欠損を有する患者は、重度で、再発性の、時には致死性のＨＳＶ感染を罹患することが多い（Orange、２０１２年、Journal of Clinical Investigation １２２巻、７９８〜８０１頁）。ヘルペスウイルス科は、まだワクチンが承認されていない多数の重要なヒト病原体を含み（Gildenら、２００７年、Nat Clin Pract Neurol ３巻、８２〜９４頁）、最近では、腫瘍溶解性ＨＳＶ１が、黒色腫の処置に臨床認可されている（治療効果は中程度ではあるが；Andtbackaら、２０１５年、J Clin Oncol、Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma」）。したがって、当技術分野には、効果的な抗ウイルス処置を提供し、腫瘍溶解性ＨＳＶ１治療の効力を最大化するための試薬、方法、および医薬組成物を開発する必要性が依然として存在する。

Orrら、２０１０年、Cell、１４２巻、８４７〜８５６頁 Sondermannら、２０００年、Nature、４０６巻、２６７〜２７３頁 Andersonら、１９９０年、Proc Natl Acad Sci USA ８７巻、２２７４〜２２７８頁 Lanierら、１９８９年、Nature ３４２巻、８０３〜８０５頁 O'Sheaら、１９９１年、Proc Natl Acad Sci USA ８８巻、３５０〜３５４頁 Daiら、２０１７年、Immunity ４７巻（１号）、１５９〜１７０頁

要旨
本開示は、免疫エフェクター細胞の免疫学的活性化を促進するための試薬、方法、および医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書には、免疫エフェクター細胞上のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合するドメインおよび標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドが提供される。本明細書に記載のポリペプチドは、抗体の抗原結合領域（いわゆるＩｇＧＦａｂ領域）を使用せずに、免疫エフェクター細胞と標的細胞との間の架橋を形成することが可能である。このタイプの免疫エフェクター細胞活性化は、本明細書では、受動的抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ぶ。受動的ＡＤＣＣは、Ｆｃ結合タンパク質をコードする病原体に感染した対象、ＦｃγＲ以外のＦｃ結合タンパク質をコードする遺伝子を発現する対象、および抗体による処置を受けている対象に有益効果および有害効果の両方を示すことができる。したがって、対象の受動的ＡＤＣＣを増強または阻害する方法も開示される。

特定の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質をコードする病原体に感染した対象を処置するための医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、組成物は、免疫エフェクター細胞上のＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合するドメインおよび病原体によりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体、および特にＩｇＧ抗体のＦｃ断片である。ＩｇＧ含有抗血清も、そのような免疫学的ポリペプチドの範囲内である。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

また、特定の実施形態では、本発明は、ＨＳＶ１感染を有する対象の神経学的損傷を予防するための試薬、方法、および医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＨＳＶ１感染を有する対象の死亡を予防するための試薬、方法、および医薬組成物をさらに提供する。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよびＨＳＶ１によりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体、および特にＩｇＧ抗体のＦｃ断片である。ＩｇＧ含有抗血清も、そのような免疫学的ポリペプチドの範囲内である。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

一部の実施形態では、本明細書には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のＦｃ領域を含むが、抗体のＦａｂ領域を含まないポリペプチドが提供される。例えば、ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンの断片であってもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ免疫グロブリンの単一のＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数のＩｇＧ免疫グロブリンの２つまたはそれよりも多くのＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を増強するように修飾されているＦｃガンマ受容体結合部位を含み、一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を欠失するように、またはＦｃガンマ受容体以外のＦｃ結合タンパク質に対する結合を欠失するように修飾されているＦｃガンマ受容体結合部位を含む。

一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｆｃガンマ受容体を発現する免疫細胞である。Ｆｃガンマ受容体としては、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２、およびＣＤ６４が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好中球、または樹状細胞である。

一部の実施形態では、本開示の試薬、方法、および医薬組成物は、Ｆｃ結合タンパク質を発現する病原体に感染した対象を処置するために使用することができ、本方法は、対象に、治療有効量の本明細書で開示される医薬組成物を投与することを含む。一部の場合では、病原体は、ウイルスである。非限定的な例では、病原体は、Ｆｃ結合タンパク質糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）を発現する単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）またはＨＳＶ２である。他の実施形態では、病原体は、Ｆｃ結合タンパク質を発現し、６８ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ６８）を含むヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である。他の実施形態では、病原体は、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）である。

一部の場合では、病原体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどの細菌である。そのような実施形態では、病原体により発現されるＦｃ結合タンパク質は、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨ、またはＭ１タンパク質を含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、腫瘍溶解性ウイルス治療を受けている対象に適用される。腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスに感染させた後、早期に受動的ＡＤＣＣを阻害して、ウイルスが他の腫瘍細胞へと蔓延することを可能にすることが有利である場合があるが、腫瘍細胞が感染して腫瘍細胞の死滅およびクリアランスが増強された後で受動的ＡＤＣＣを増強させるために、本開示の方法を使用することもできる。

また、受動的ＡＤＣＣを低減または阻害するための試薬、方法、および医薬組成物も開示される。そのような実施形態では、ポリペプチドは、Ｆｃ結合タンパク質に結合するが、ＦｃγＲには結合しないように修飾されたＩｇＧ免疫グロブリンの断片であり、それらと標的細胞のＦｃ結合タンパク質との結合を引き起こし、それらがＦｃγＲと架橋を形成すること、および受動的ＡＤＣＣを活性化することを防止することになる。例えば、ポリペプチドは、ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２、またはＣＤ６４結合部位を欠如するか、または欠如するように操作されているＩｇＧ断片であってもよい。ＨＳＶ１ｇＥのＦｃ結合部位、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、およびプロテインＧ、およびＭ１タンパク質は、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３インターフェースであることが公知である。したがって、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧのＣＨ２−ＣＨ３インターフェースを含むが、ＦｃγＲ結合領域を含まないＩｇＧ免疫グロブリンの断片である。

他の実施形態では、ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンの断片であってもよい。一部の実施形態では、ポリペプチドは、抗体の１つよりも多くのサブクラスに由来する断片である。Ｆｃとの結合に関与するＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａの領域は、配列番号２４）のＢ／Ｃループ（Ｔｒｐ１３１〜Ａｌａ１３５）、Ｆ／Ｇループ（Ｖａｌ１７６〜Ｌｙｓ１７９）、Ｃストランド（Ｈｉｓ１３７〜Ｔｈｒ１４０）、およびＣ’ストランド（Ａｓｐ１４７〜Ｈｉｓ１５３）である。加えて、Ａｒｇ１７３およびコネクター（Ｉｌｅ１０６〜Ｔｒｐ１０８）領域も、結合に関与する。その一方で、Ｃγ２ヒンジ（Ｌｅｕ２３５〜Ｓｅｒ２３９）およびＦｃの残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９は、ＣＤ１６ａの主要な接触残基であることが公知である（Sondermannら、２０００年、Nature ４０６巻、２６７〜２７３頁））。したがって、相互作用インターフェースを修飾することにより、ＣＤ１６ａとＩｇＧとの結合を変化させることができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＦＧ−ループを、ＦｃγＲＩのループ（ＭＧＫＨＲＹ；配列番号１１）に置き換えることにより、ＩｇＧ１結合親和性の１５倍増加がもたらされた（Luら、２０１１年、JBC ２８６巻、４０６０８〜４０６１３頁）。別の例は、配列番号１０のヒトＩｇＧ１Ｆｃアミノ酸２６２〜４７０を含むＦｃ断片であり、これは、ＨＳＶ１ｇＥ、プロテインＡ、およびプロテインＧに結合するが、ヒトＦｃγ受容体（ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２、ＣＤ６４）には全く結合しなかった。

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、抗体に結合し、受動的ＡＤＣＣによる免疫エフェクター細胞および標的細胞の架橋を防止することになる、プロテインＡまたはプロテインＧなどのＦｃ結合タンパク質を投与することを含む。

一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞に結合し、それらが架橋抗体と相互作用することを防止することになる、ＦｃγＲに結合するが、Ｆｃ結合タンパク質には結合しないように修飾されたＩｇＧ免疫グロブリンの断片である。例えば、ポリペプチドは、ＦｃγＲに結合するが、それをＨＳＶ１ｇＥ、プロテインＡ、およびプロテインＧとは結合させないＣＨ２−ＣＨ３インターフェースの突然変異を有するＩｇＧ免疫グロブリンの断片であってもよい。例えば、ヒトＩｇＧ４は、ｇＥに結合するが、ＩｇＧ４突然変異体Ｈ４３５Ｒは、ｇＥに結合することができない。

特定の実施形態では、本発明は、抗がん治療を受けている対象の炎症を低減するための試薬、方法、および医薬組成物を提供する。こうした実施形態は、Ｆｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、ＦｃγＲに結合する領域を含まない治療有効量のポリペプチドを投与すること、およびモノクローナル抗体薬物を含む抗がん治療を投与することを含む。特定の実施形態では、抗体薬物は、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、ダラツムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、またはペムブロリズマブである。他の実施形態では、医薬組成物は、モノクローナル抗体薬物による処置の前に投与される。

一部の実施形態では、対象は、治療用抗体で処置されている。ほとんどの治療用モノクローナル抗体薬物は、哺乳動物宿主細胞株から産生され、特異的抗原を標的とする。患者に内因的に存在する種々のＦｃ結合タンパク質による抗体の隔離および受動的ＡＤＣＣを介したＦｃγＲ保持免疫細胞との相互作用により、副作用および治療効力の低減が引き起こされる場合がある。本開示の方法は、抗体媒介性注入毒性（antibody mediated infusion toxicity）のそのような副作用（いわゆる、初回投与効果）を減少させるが、抗体に基づく免疫療法を増強することができる。

また、本開示の方法は、Ｆｃ結合タンパク質を有する生物に由来する感染を有する患者における、ＦｃγＲ保持免疫細胞からのサイトカイン放出、低血圧、および多臓器不全を予防するために使用することができる。

本明細書で開示される試薬、方法、および医薬組成物のこの使用の一部の実施形態では、対象は、Ｆｃ結合タンパク質をコードするウイルスによるウイルス血症を有するかまたは有するリスクがある。こうした本開示の方法を使用して、Ｆｃ結合タンパク質および／またはＦｃγＲに対して通常よりも高い親和性を有するＩｇＧＦｃ断片または抗体を使用して、およびクリアランスのために受動的ＡＤＣＣを利用して、ＦｃγＲ保持免疫細胞によるウイルスクリアランスを増強することによって、ウイルス血症を処置または予防することができる。

一部の実施形態では、本明細書には、腫瘍溶解性ウイルス治療を受けている対象のがんを処置するための試薬、方法、および医薬組成物が提供される。本方法は、腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスに感染させた後、早期に受動的ＡＤＣＣを阻害して、腫瘍溶解性ウイルスが他の腫瘍細胞へと蔓延することを可能にするために使用することができる。特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、腫瘍溶解性ウイルス治療剤による処置の前に投与してもよく、他の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、腫瘍溶解性ウイルス治療剤と同時投与してもよい。特定の実施形態では、標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、ＦｃγＲに結合する領域を含まないポリペプチドを含む医薬組成物は、腫瘍溶解性ウイルス治療を受けている患者の受動的ＡＤＣＣを阻害するために提供される。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

腫瘍細胞をウイルスに感染させた後、本明細書で提供されている受動的ＡＤＣＣを増強するための試薬、方法、および医薬組成物を使用して、ＦｃγＲ保持免疫細胞によるウイルス感染腫瘍細胞の破壊を向上させることができる。例えば、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物を使用して、受動的ＡＤＣＣを増強し、ウイルス感染腫瘍細胞の破壊を向上させることができる。ある特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体、および特にＩｇＧ抗体のＦｃ断片である。ＩｇＧ含有抗血清も、そのような免疫学的ポリペプチドの範囲内である。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

本明細書には、ウイルス感染細胞および免疫エフェクター細胞の相互作用をモジュレートするウイルス遺伝子を特定するための方法も開示される。本開示の方法は、発現制御配列に作動可能に連結した候補ウイルス遺伝子およびレポーター遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすること、トランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞を、細胞傷害性免疫エフェクター細胞に曝露させること、および曝露させたトランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞をアッセイして、レポーター遺伝子発現または活性の関数として細胞死を測定することを含んでいてもよい。こうした方法では、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による細胞死が減少することは、ウイルス遺伝子が、宿主細胞を免疫エフェクター細胞から保護したことを示し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による細胞死が増加することは、ウイルス遺伝子が、宿主細胞を免疫エフェクター細胞に対して感受性にしたことを示す。こうした方法は、細胞傷害性である任意の免疫エフェクター細胞と共に使用することができる。例えば、細胞傷害性免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球、または樹状細胞であってもよい。

特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光遺伝子であり、曝露させたトランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞を、特にフローサイトメトリーでアッセイして、細胞死を蛍光の関数として測定し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、蛍光性トランスフェクト宿主細胞のパーセンテージが増加することは、ウイルス遺伝子が、宿主細胞を免疫エフェクター細胞から保護したことを示し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による平均蛍光が減少することは、ウイルス遺伝子が、宿主細胞を免疫エフェクター細胞に対して感受性にしたことを示す。

本プロセスは、ウイルスゲノムの各遺伝子で繰り返すことができる。例えば、本方法は、ウイルスゲノムの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれよりも多くの遺伝子の組合せについて、本プロセスを繰り返すことをさらに含んでいてもよい。

宿主細胞は、好ましくは、ウイルスが感染したときの免疫エフェクター細胞による死滅に対する既知の感受性または耐性に基づいて選択される。

また、本明細書には、Ｕｓ８遺伝子（配列番号１８）における１つまたは複数の活性化突然変異、ＵＬ１２遺伝子（配列番号１２）における１つまたは複数の活性化突然変異、ＵＬ３０遺伝子（配列番号１３）における１つまたは複数の活性化突然変異、Ｕｓ３遺伝子（配列番号１５）における１つまたは複数の活性化突然変異、Ｕｓ５遺伝子（配列番号１４）における１つまたは複数の活性化突然変異、Ｕｓ１２遺伝子（配列番号１６）における１つまたは複数の活性化突然変異、またはそれらの任意の組合せを含む組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）が開示される。

また、ＨＳＶ１Ｕｓ７およびＨＳＶ１Ｕｓ８のプロモーターの上流にＣＭＶ前初期エンハンサーを含む組換えＨＳＶ１ベクターが開示される。

また、本明細書には、特定のＩｇＧ結合タンパク質、特にプロテインＡおよびプロテインＧを使用して、単球を捕捉し、樹状細胞およびマクロファージを生成する効力をｉｎｖｉｔｒｏで増加させるための方法が開示される。本開示の方法は、培養プレートを組換えプロテインＡまたはプロテインＧでコーティングすること、プロテインＡまたはＧコーティングプレートでヒト（またはマウス）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製単球をサイトカインと共に培養して、マクロファージまたは樹状細胞を生成することを含んでいてもよい。また、本開示の方法は、ヒト（またはマウス）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製単球を、プロテインＡ、プロテインＧ、または他のＩｇＧ結合タンパク質の任意の重合形態と共に培養することを含んでいてもよい。同様に、こうした方法は、培養プレートを組換えプロテインＡまたはプロテインＧでコーティングすること、プロテインＡまたはＧコーティングプレートでヒト（またはマウス）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または精製単球をサイトカインと共に培養して、マクロファージまたは樹状細胞を生成することを含んでいてもよい。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の記載に示されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および図面、ならびに特許請求の範囲から明白であろう。

図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１Ａ〜１Ｉは、ＨＳＶ１ｇＥをＮＫ細胞活性化分子であると識別した異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ、differential cytolysis mediated by ectopic gene expression）を示す。図１Ａは、ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイのフローダイヤグラムである。図１Ｂは、代表的なＨＳＶ１遺伝子のＤＣ−ＭＥＧＥアッセイの代表的なグラフを示す。図１Ｃは、６５個のＨＳＶ１遺伝子すべてのＤＣ−ＭＥＧＥ結果を示す棒グラフであり（ｎ≧４）、ＨＳＶ１遺伝子ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２の発現は、ＮＫ細胞溶解を促進し、ＵＬ４８、Ｕｓ５、およびＵｓ６の発現は、ＮＫ細胞溶解を阻害した。図１Ｄは、指定のエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ、ｘ軸）でトランスフェクトしたヒト神経膠腫細胞株に対する細胞傷害性を示す。図１Ｅは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に２０時間培養した後で、初代ヒトＮＫ細胞によりＩＦＮγが分泌されることを示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。図１Ｆおよび１Ｇは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図１Ｈは、アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体の存在下でＵｓ８を発現する神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図１Ｉは、不活化された純粋な野生型Ｆ株またはＵｓ８欠損Ｆ株でプレコーティングされたプレートで７時間培養した後の、またはアイソタイプもしくはｇＥ−特異的抗体の存在下で培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す（ｎ＝７）。図１Ｃ、１Ｄ、および１Ｈのデータは、平均±ｓｅｍとして示される。図１Ｅ、１Ｈ、および１Ｉの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。

図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２Ａ〜２Ｇは、ＩｇＧ連結ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を示す。図２Ａは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。ＣＤ６９発現またはＣＤ１０７ａ発現を獲得したＮＫ細胞、またはＣＤ１６ａ発現およびＣＤ６２Ｌ発現を両方とも喪失したＮＫ細胞のパーセンテージが、１４人のドナーについて要約されている。図２Ｂは、図２Ａと同様に処置された初代ヒトＮＫ細胞を示す。２０時間で上清を収集し、ヒトＩＦＮγを測定した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図２Ｃおよび２Ｄは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後系統マーカーおよびヒトＩｇＧＦｃ抗体で染色したヒトＰＢＭＣを示す。細胞マーカーおよびＦｃの平均強度が示されており、少なくとも５人のドナーの１つの代表が示されている。図２Ｅは、ヒトドナーに由来するＮＫ細胞上にヒトＩｇＧが存在することを示す。図２Ｆは、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、図２Ｅのドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図２Ｇは、対応するヒトドナーの表面ＩｇＧ強度に対してプロットした、神経膠腫細胞またはＫ５６２と共培養した後のＣＤ６９またはＣＤ１０７ａに陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。線形回帰を使用して相関性分析を実施した（ｎ≧２０）。図２Ａおよび２Ｂの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。

図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。図３Ａ〜３Ｋは、ＩｇＧ架橋が、ＨＳＶｇＥによるＮＫ細胞活性化に不可欠であったことを示す。図３Ａは、ｇＥ−ＩｇＧＦｃ−ＣＤ１６ａ三成分複合体のモデル構造を示す。それぞれ正面視、側面視、および平面視が示されている。ＣＤ１６ａはスティックとして示されており、ｇＥはスフェアとして示されており、ＩｇＧＦｃダイマーの２つのモノマーはリボンとして示されている。図３Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する、ヒトＩｇＧ産物の結合（図３Ｂ）またはヒトＩｇＧ産物を有するかもしくは有してないＣＤ１６ａの結合（図３Ｃ）を示す。図３Ｄは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での感染神経膠腫細胞に対するＣＤ１６ａの結合を示す。図３Ｅは、１Ｈに記載されているようなＮＫ細胞刺激後のＣＤ３ζのリン酸化を示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地による簡単な洗浄後のヒトＰＢＭＣでの、系統マーカーとプロテインＡ（図３Ｆ）またはプロテインＧとの染色（図３Ｇ）を示す。これらの図の数値は、各染色の平均強度である。図３Ｈは、まずプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、トランスフェクト神経膠腫細胞、Ｋ５６２、またはインターロイキンＩＬ１２＋ＩＬ１８で７時間培養した後で表現型を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（ｎ＝７〜８）。図３Ｉは、プロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートし、その後、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性を評価した初代ヒトＮＫ細胞を示す（図３Ｉ）。図３Ｊは、（図３Ｈ）と同様に処置したＮＫ細胞を示す。培養の２０時間でＩＦＮγ分泌を評価した（三重重複の平均、ｎ＝５）。図３Ｋは、ＩｇＧＦｃにより媒介される免疫刺激（例として、ＡＤＣＣ）の作用モデルを示す。図３Ｈおよび３Ｊの各点線は、同じドナーから獲得したデータを連結している。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、および３Ｇは、少なくとも３回繰り返した。＊ｐ＜０．０１。

図４Ａ〜４Ｆは、受動的ＡＤＣＣが、ｉｎｖｉｖｏでウイルスクリアランスを促進することを示す。図４Ａは、ヒトＩｇＧ産物の存在下または非存在下での、感染神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｂは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する初代マウスＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｄは、ヒトＩｇＧ産物による致死的ＨＳＶ１感染に対するマウスの保護を示す。図４Ｅおよび４Ｆは、感染の１８時間後および８４時間後のＨＳＶ１ウイルス負荷を示す（ｎ＝５）。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃのデータは、平均±ｓｅｍとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。図４Ａ〜４Ｆは、受動的ＡＤＣＣが、ｉｎｖｉｖｏでウイルスクリアランスを促進することを示す。図４Ａは、ヒトＩｇＧ産物の存在下または非存在下での、感染神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｂは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する初代マウスＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｄは、ヒトＩｇＧ産物による致死的ＨＳＶ１感染に対するマウスの保護を示す。図４Ｅおよび４Ｆは、感染の１８時間後および８４時間後のＨＳＶ１ウイルス負荷を示す（ｎ＝５）。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃのデータは、平均±ｓｅｍとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。図４Ａ〜４Ｆは、受動的ＡＤＣＣが、ｉｎｖｉｖｏでウイルスクリアランスを促進することを示す。図４Ａは、ヒトＩｇＧ産物の存在下または非存在下での、感染神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｂは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、トランスフェクト神経膠腫細胞に対する初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｃは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下または非存在下での、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する初代マウスＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図４Ｄは、ヒトＩｇＧ産物による致死的ＨＳＶ１感染に対するマウスの保護を示す。図４Ｅおよび４Ｆは、感染の１８時間後および８４時間後のＨＳＶ１ウイルス負荷を示す（ｎ＝５）。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃのデータは、平均±ｓｅｍとして示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。

図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。図５Ａ〜５Ｈは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、ＩｇＧ架橋によりＮＫ細胞を活性化することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、可溶性プロテインＡと共に、またはプロテインＡでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＡコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図５Ａ）およびＩＦＮγ産生（図５Ｂ）を示す。図５Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図５Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。示されている結果は平均±ｓｅｍである。図５Ｄは、初代ヒトＮＫ細胞を、図に示されている刺激に１時間曝露させた後の、ＣＤ３ζのリン酸化を示す。図５Ｅは、細菌と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。一部の場合では、ＮＫ細胞を、可溶性プロテインＡまたはプロテインＧで前処置したか、または可溶性プロテインＡを、マウス血清もしくはヒトＩｇＧと共にプレインキュベートした。図５Ｆは、細菌と共に培養した後の、マウスＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を示す（三重重複の平均、ｎ＝５）。各点線は、１匹のマウスを表す。図５Ｇは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養した後の、マウスＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ｈは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図５Ａ、５Ｄ、および５Ｅは、最低でも４匹のドナーで繰り返した。

図６は、不活化された純粋な野生型またはＵｓ８欠損ＨＳＶ１Ｆ株ウイルスでコーティングされたプレートで７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。アイソタイプまたはＵｓ８／ｇＥ−特異的抗体を添加して、ＮＫ細胞とコーティングされたＦ株ウイルスとの相互作用に干渉した。７人のドナーの代表的な等高線染色が示されている。

図７は、様々なＨＳＶ１遺伝子を発現する神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。８人のドナーの１人に由来する代表的な等高線プロットが示されている。

図８は、トランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞と共に７時間培養した後の、様々なドナーに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。

図９Ａおよび９Ｂは、プロテインＡまたはプロテインＧで処置し、その後、Ｋ５６２細胞、ＩＬ１２＋ＩＬ１８、またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に培養した初代ヒトＮＫ細胞を示す。培養の７時間で、表現型決定を実施した。８人のドナーのうちの１人に由来する代表的な等高線プロットが示されている。図９Ａおよび９Ｂは、プロテインＡまたはプロテインＧで処置し、その後、Ｋ５６２細胞、ＩＬ１２＋ＩＬ１８、またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に培養した初代ヒトＮＫ細胞を示す。培養の７時間で、表現型決定を実施した。８人のドナーのうちの１人に由来する代表的な等高線プロットが示されている。

図１０Ａおよび１０Ｂは、培地のみ、プロテインＡ、またはプロテインＧで処置し、その後、不活化野生型ＨＳＶ１Ｆ株でコーティングされたプレートで培養したヒトＮＫ細胞を示す。培養の７時間後に、表現型決定を実施した。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１０Ａ）および５人のドナーの統計的概要（図１０Ｂ）が示されている。図１０Ａおよび１０Ｂは、培地のみ、プロテインＡ、またはプロテインＧで処置し、その後、不活化野生型ＨＳＶ１Ｆ株でコーティングされたプレートで培養したヒトＮＫ細胞を示す。培養の７時間後に、表現型決定を実施した。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１０Ａ）および５人のドナーの統計的概要（図１０Ｂ）が示されている。

図１１Ａ〜１１Ｄは、培地のみ、ＨＳＶ１非免疫血漿（（−）血漿）、もしくはヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下で、感染神経膠腫細胞と共に（図１１Ａ、１１Ｂ）またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に（図１１Ｃ、１１Ｄ）培養し、培養の７時間後に染色したＮＫ細胞を示す。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１１Ａおよび１１Ｃ）および７〜９人のドナーの統計的概要（図１１Ｂおよび１１Ｄ）が示されている。図１１Ａ〜１１Ｄは、培地のみ、ＨＳＶ１非免疫血漿（（−）血漿）、もしくはヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下で、感染神経膠腫細胞と共に（図１１Ａ、１１Ｂ）またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に（図１１Ｃ、１１Ｄ）培養し、培養の７時間後に染色したＮＫ細胞を示す。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１１Ａおよび１１Ｃ）および７〜９人のドナーの統計的概要（図１１Ｂおよび１１Ｄ）が示されている。図１１Ａ〜１１Ｄは、培地のみ、ＨＳＶ１非免疫血漿（（−）血漿）、もしくはヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下で、感染神経膠腫細胞と共に（図１１Ａ、１１Ｂ）またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に（図１１Ｃ、１１Ｄ）培養し、培養の７時間後に染色したＮＫ細胞を示す。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１１Ａおよび１１Ｃ）および７〜９人のドナーの統計的概要（図１１Ｂおよび１１Ｄ）が示されている。図１１Ａ〜１１Ｄは、培地のみ、ＨＳＶ１非免疫血漿（（−）血漿）、もしくはヒトＩｇＧ１Ｆｃの存在下で、感染神経膠腫細胞と共に（図１１Ａ、１１Ｂ）またはトランスフェクト神経膠腫細胞と共に（図１１Ｃ、１１Ｄ）培養し、培養の７時間後に染色したＮＫ細胞を示す。１人のドナーに由来する代表的な等高線プロット（図１１Ａおよび１１Ｃ）および７〜９人のドナーの統計的概要（図１１Ｂおよび１１Ｄ）が示されている。

図１２Ａは、ＰＢＳまたはＩｇＧ産物と混合し、室温で３０分間インキュベートし、感染性についてベロ細胞で力価測定した系列希釈ＨＳＶ１Ｆ株を示す。数値はすべて、ＰＢＳ処置（陰性対照）に対して正規化されている。ヒトＩｇＧは、抗ＨＳＶ１ＩｇＧ（陽性対照）を含有していた。図１２Ｂは、２４時間、ヒトＩｇＧＦｃまたはリツキシマブを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。図１２Ａは、ＰＢＳまたはＩｇＧ産物と混合し、室温で３０分間インキュベートし、感染性についてベロ細胞で力価測定した系列希釈ＨＳＶ１Ｆ株を示す。数値はすべて、ＰＢＳ処置（陰性対照）に対して正規化されている。ヒトＩｇＧは、抗ＨＳＶ１ＩｇＧ（陽性対照）を含有していた。図１２Ｂは、２４時間、ヒトＩｇＧＦｃまたはリツキシマブを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。

図１３Ａは、細菌に対するマウスＩｇＧ２ａの結合を示す。図１３Ｂは、ヒトＩｇＧ産物の存在下での、細菌に対するＣＤ１６ａの結合を示す。

図１４Ａおよび１４Ｂは、可溶性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓプロテインＧと共に、またはプロテインＧでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＧコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図１４Ａ）およびＩＦＮγ産生（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図１４Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。これらの結果は、平均±ｓｅｍとして示されている。図１４Ａおよび１４Ｂは、可溶性ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓプロテインＧと共に、またはプロテインＧでコーティングされたプレートで、またはＮＫ細胞培養前にマウス血清でブロッキングしたプロテインＧコーティングプレートで培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型（図１４Ａ）およびＩＦＮγ産生（図１４Ｂ）を示す。図１４Ｂの各点線は、１人のドナーを示す（三重重複の平均、ｎ＝６）。図１４Ｃは、培地またはプロテインＡでコーティングされたプレートで３０分間培養したヒトＮＫ細胞を示す。神経膠腫細胞に対する細胞傷害性を評価した。これらの結果は、平均±ｓｅｍとして示されている。

図１５Ａは、細菌と共に２４時間培養した後の、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃに由来するマウス脾臓ＮＫ細胞の表現型を示す。これは、３回の実験の１つを表す。図１５Ｂは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養し、培養の２４時間で染色した、マウス脾臓から単離されたＮＫ細胞を示す。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７強度は、培地コーティングプレートに対してである（ｎ＝１２）。図１５Ｃは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。統計的概要（ｎ＝５）が示されている。図１５Ｄは、２４時間、可溶性プロテインＡを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。これらの図は、３回の実験の１つを表す。図１５Ａは、細菌と共に２４時間培養した後の、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃに由来するマウス脾臓ＮＫ細胞の表現型を示す。これは、３回の実験の１つを表す。図１５Ｂは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養し、培養の２４時間で染色した、マウス脾臓から単離されたＮＫ細胞を示す。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７強度は、培地コーティングプレートに対してである（ｎ＝１２）。図１５Ｃは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。統計的概要（ｎ＝５）が示されている。図１５Ｄは、２４時間、可溶性プロテインＡを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。これらの図は、３回の実験の１つを表す。図１５Ａは、細菌と共に２４時間培養した後の、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃに由来するマウス脾臓ＮＫ細胞の表現型を示す。これは、３回の実験の１つを表す。図１５Ｂは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養し、培養の２４時間で染色した、マウス脾臓から単離されたＮＫ細胞を示す。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７強度は、培地コーティングプレートに対してである（ｎ＝１２）。図１５Ｃは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。統計的概要（ｎ＝５）が示されている。図１５Ｄは、２４時間、可溶性プロテインＡを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。これらの図は、３回の実験の１つを表す。図１５Ａは、細菌と共に２４時間培養した後の、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃに由来するマウス脾臓ＮＫ細胞の表現型を示す。これは、３回の実験の１つを表す。図１５Ｂは、培地またはプロテインＡでプレコーティングされたプレートで培養し、培養の２４時間で染色した、マウス脾臓から単離されたＮＫ細胞を示す。ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２７強度は、培地コーティングプレートに対してである（ｎ＝１２）。図１５Ｃは、対照シリコーンビーズまたはプロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。統計的概要（ｎ＝５）が示されている。図１５Ｄは、２４時間、可溶性プロテインＡを注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに由来するＮＫ細胞の表現型を示す。これらの図は、３回の実験の１つを表す。

図１６は、プロテインＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ９９１３４）、プロテインＧ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０６６５４）、およびＨＳＶ１ｇＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０４４８８）の配列アラインメントを示す。

図１７Ａ〜１７Ｃは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質で処置したヒト単球の形態学的および機能的変化を示す。図１７Ａは、培地、プロテインＡ、またはプロテインＧでプレコーティングされたプレートで３時間または１８時間培養したヒト単球の形態学を示す。図１７Ｂは、単球呼吸バーストアッセイの結果を示す。このアッセイでは、ヒト初代単球を、ウシ血清（ＢＳＡ）もしくはプロテインＡでコーティングされたプレートで培養するか、または指定の時間にわたってホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；陽性対照）で刺激した。図１７Ｃは、図１７Ｂで処置した単球の細胞内ＩＬ１ベータ染色を示す。図１７Ａ〜１７Ｃは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質で処置したヒト単球の形態学的および機能的変化を示す。図１７Ａは、培地、プロテインＡ、またはプロテインＧでプレコーティングされたプレートで３時間または１８時間培養したヒト単球の形態学を示す。図１７Ｂは、単球呼吸バーストアッセイの結果を示す。このアッセイでは、ヒト初代単球を、ウシ血清（ＢＳＡ）もしくはプロテインＡでコーティングされたプレートで培養するか、または指定の時間にわたってホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；陽性対照）で刺激した。図１７Ｃは、図１７Ｂで処置した単球の細胞内ＩＬ１ベータ染色を示す。図１７Ａ〜１７Ｃは、細菌ＩｇＧ結合タンパク質で処置したヒト単球の形態学的および機能的変化を示す。図１７Ａは、培地、プロテインＡ、またはプロテインＧでプレコーティングされたプレートで３時間または１８時間培養したヒト単球の形態学を示す。図１７Ｂは、単球呼吸バーストアッセイの結果を示す。このアッセイでは、ヒト初代単球を、ウシ血清（ＢＳＡ）もしくはプロテインＡでコーティングされたプレートで培養するか、または指定の時間にわたってホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ；陽性対照）で刺激した。図１７Ｃは、図１７Ｂで処置した単球の細胞内ＩＬ１ベータ染色を示す。

図１８は、プロテインＡおよびプロテインＧでプレコーティングされた培養プレートが、ヒト単球から樹状細胞を生成する効力を増加させたことを示す。１００万個の精製ヒト単球を、０日目にプレートに播種し、２０ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４（１０ｎｇ／ｍｌ）で補完された培地で培養して、樹状細胞を生成した。プレートに付着しなかった細胞を１日目に除去した。プレートに付着した細胞を、１日目、４日目、および７日目に計数した。

図１９は、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧが、初代ヒト単球で呼吸バーストを誘導したことを示す。新たに単離されたヒト単球を、１０分間または３０分間、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ１２３）の存在下の表示条件下で培養した。細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析した。

図２０は、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧが、初代ヒト単球でのＩＬ１β産生を誘導したことを示す。新たに単離されたヒト単球を、表示条件下で６時間培養し、ＩＬ１βを染色した。

図２１は、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧが、初代ヒト単球の表現型を変化させたことを示す。新たに単離されたヒト単球を、表示条件下で６時間培養し、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ１４を染色した。

図２２は、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧが、初代ヒト好中球で呼吸バーストを誘導したことを示す。新しく単離されたヒト好中球を、１０分間または３０分間、ＤＨＲ１２３の存在下の表示条件下で培養した。細胞を、フローサイトメトリーを使用して分析した。

図２３Ａおよび２３Ｂは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓに対するヒトＦｃγ受容体ＣＤ３２およびＣＤ６４の結合が、ヒトＩｇＧおよびプロテインＡの存在を必要としたことを示す。野生型（ｗｔ）またはプロテインＡ欠損（Ｓｐａ−）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ細菌を、ヒト化抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕ）の非存在下または存在下で、図２３Ａに示されている蛍光標識ヒトＦｃγ受容体ＣＤ３２および図２３Ｂに示されているＣＤ６４と共にインキュベートした。塗り潰し灰色ヒストグラムは、未染色細菌を表す。

図２４は、固定化されたプロテインＡ、プロテインＧ、およびヒトＩｇＧが、単球由来樹状細胞の表現型を変化させたことを示す。新たに単離されたヒト単球を、処置プレート中でＩＬ４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下にて指定の時間にわたって培養し、ＣＤ８６およびＣＤ１ｃを染色した。

図２５は、固定化されたプロテインＡ、プロテインＧ、およびヒトＩｇＧが、単球由来樹状細胞の機能を変化させたことを示す。樹状細胞を、プレートで５日間培養した単球から生成し、活性化し、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製活性化因子ＢａｍＨＩＺ左方向リーディングフレーム１（ＢＺＬＦ１）ペプチドを２４時間負荷し、自己由来Ｔ細胞と共に１０日間培養した。ＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を、テトラマー染色により決定した。

図２６Ａおよび２６Ｂは、様々な種に由来するＩｇＧ分子に対するヒトおよび病原体ＩｇＧ結合タンパク質の結合を示す。使用した実験手順は、図２６Ａに示されており、フローサイトメトリーを使用して様々なＩｇＧとＩｇＧ結合タンパク質との間の相互作用を決定した代表的な結果は、図２６Ｂに示されている。ＩｇＧ結合タンパク質を、個々にクローニングして、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルスに由来する２Ａタンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合させた。ＧＦＰは、ＩｇＧ結合タンパク質の発現を報告する。ＩｇＧとＩｇＧ結合タンパク質との間の相互作用を決定するために、神経膠腫細胞にＩｇＧ結合タンパク質をトランスフェクトし、様々な種に由来する蛍光標識ＩｇＧと共にインキュベートした。試料を、フローサイトメトリーにより読み出し、ＧＦＰ^＋細胞（濃黒色線）およびＧＦＰ⁻細胞（塗り潰し灰色ヒストグラム）を、蛍光シグナル強度について分析し、互いに重ねて示した。

図２７Ａおよび２７Ｂは、ヒト初代ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、および顆粒球が、プロテインＡ結合のために接近可能であるヒトＩｇＧ分子で天然に被覆されていることを示す。ヒトＰＢＭＣを、ｐＨ７．４またはｐＨ４の培地で洗浄し、その後、図２７Ａに示されている蛍光標識系統マーカーおよびマウス抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体、または図２７Ｂに示されている蛍光標識系統マーカーおよびプロテインＡで染色した。細胞マーカー、ヒトＦｃ、およびプロテインＡの平均強度が示されている。

図２８Ａ〜２８Ｅは、ＣＭＶＩｇＧ結合タンパク質ｇｐ６８が、ヒトＩｇＧ１ＦｃおよびＣＤ１６ａと三成分複合体を形成することが可能であることを示す。図２８Ａは、個々のＩｇＧ結合タンパク質をトランスフェクトし、蛍光標識リツキシマブと共にインキュベートした神経膠腫細胞から得られた結果を例示する。図２８Ｂは、個々のＩｇＧ結合タンパク質をトランスフェクトし、ヒトＩｇＧ１Ｆｃと共にインキュベートした神経膠腫細胞から得られた結果を例示する。図２８Ｃ、２８Ｄ、および２８Ｅは、蛍光標識ＣＤ１６ａのみ（図２８Ｃ）で、またはリツキシマブ（図２８Ｄ）もしくはヒトＩｇＧ１Ｆｃ（図２８Ｅ）の存在下でインキュベートしたトランスフェクト神経膠腫細胞から得られた結果を例示する。塗り潰し灰色区域は、ＩｇＧ結合タンパク質を発現しない細胞を表す。濃黒色線は、ＩｇＧ結合タンパク質を発現する細胞を表す。

図２９Ａおよび２９Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図２９Ａは、ＣＤ６９またはＣＤ１０７ａの発現を獲得したＮＫ細胞のパーセンテージ、ならびにＣＤ１６ａおよびＣＤ６２Ｌを両方とも喪失した細胞のパーセンテージを示す。図２９Ｂは、６人のドナーの結果のグラフ概要である。＊ｐ＜０．０５。図２９Ａおよび２９Ｂは、トランスフェクト神経膠腫細胞と共に７時間培養した後の、初代ヒトＮＫ細胞の表現型を示す。図２９Ａは、ＣＤ６９またはＣＤ１０７ａの発現を獲得したＮＫ細胞のパーセンテージ、ならびにＣＤ１６ａおよびＣＤ６２Ｌを両方とも喪失した細胞のパーセンテージを示す。図２９Ｂは、６人のドナーの結果のグラフ概要である。＊ｐ＜０．０５。

図３０は、マウスサイトメガロウイルス感染が、非免疫マウスＩｇＧに対する３Ｔ３細胞の結合を可能にすることを実証する。３Ｔ３細胞を、感染させなかったか（塗り潰し灰色）、または２４時間にわたってマウスサイトメガロウイルスに感染させ（ＭＣＭＶ；濃黒色）、蛍光標識ＩｇＧと共にインキュベートした。細胞を、フローサイトメトリーを使用して収集した。

詳細な説明
定義
本明細書および以下の特許請求の範囲では、多くの用語が言及されることになるが、それらは、以下の意味を有すると定義されるものとする。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、状況が明白にそうではないと示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「組成物」への言及は、２つまたはそれよりも多くのそのような組成物の混合物を含み、「化合物」への言及は、２つまたはそれよりも多くのそのような化合物の混合物を含み、「作用剤」への言及は、２つまたはそれよりも多くのそのような作用剤の混合物を含み、他も同様である。

「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載されている事象もしくは状況が生じてもよく、または生じなくともよいこと、ならびに本明細書は、事象または状況が生じる場合および生じない場合を含むことを意味する。

本明細書では範囲を表記することができ、そのような範囲が表記されている場合、別の態様は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似として表記されている場合、特定の値は、別の態様を形成することが理解されるだろう。範囲の各々の終点は、他の終点との関連でおよび他の終点に関わらず、有効であることがさらに理解されるだろう。また、値が開示されている場合、当業者により適切に理解されるように、その値と「等しいかまたはそれ未満の」値、その値と「等しいかまたはそれよりも大きな」値、および値間の考え得る範囲も開示されることが理解される。また、本出願の全体にわたって、データは、多くの異なる形式で提供されており、そうしたデータは、終点、および開始点、ならびにデータポイントの任意の組合せの範囲を表すことが理解される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されていることが理解される。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。

用語「対象」または「患者」は、本発明の医薬組成物の投与または本明細書で開示されている方法を使用した処置の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物であってもよい。したがって、対象は、ヒトであってもよく、または獣医学的患者であってもよい。用語「患者」は、特に、臨床医、例えば内科医の処置下にある対象を指す。

「予防する」または「予防すること」もしくは「予防」などのこの単語の他の形態は、特定の事象もしくは特徴を停止させること、特定の事象もしくは特徴の発達または進行を安定または遅延させること、あるいは特定の事象または特徴が生じることになる可能性を最小限に抑えることを意味する。予防するは、典型的には、用語「低減する」よりも絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用される場合、あるものは低減できても予防できないが、低減されるものを、予防することができる場合もある。同様に、あるものは予防できても低減できないが、予防されるものを、低減することができる場合もある。低減するまたは予防するが使用される場合、特に別様の指示がない限り、他方の単語の使用も明示的に開示されていることが理解される。

用語「処置」または「処置すること」は、疾患、病理学的状態、または障害を治癒、寛解、安定、または予防することを目的とした、対象の医学的管理を指す。この用語は、積極的処置、すなわち、具体的には疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けられる処置を含み、また、原因処置、すなわち、関連する疾患、病理学的状態、または障害の原因の除去に向けられる処置を含む。加えて、この用語は、対症処置、すなわち疾患、病理学的状態、または障害の治癒ではなく症状を軽減するために設計された処置；予防処置、すなわち関連する疾患、病理学的状態、または障害の発症を最小限に抑えるかまたは部分的にもしくは完全に阻害することに向けられる処置；および補助的処置、すなわち関連する疾患、病理学的状態、または障害の改善に向けられた別の特定の治療を補完するために採用される処置を含む。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、Ｆｃ結合タンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の標的を指す。この用語は、ウイルス感染細胞ならびに細菌および真菌などの微生物も含む。

「宿主細胞」は、ウイルスおよび／またはウイルスベクターのレシピエントであり得るまたはレシピエントである個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞としては、単一の宿主細胞の後代を含み、後代は、自然発生的、偶発的、もしくは意図的な突然変異および／または変化のため、元の親細胞と必ずしも完全には同一ではない（形態学的に、または全ＤＮＡ補完性が）場合がある。

用語「遺伝子」は、当技術分野では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味することが十分に理解されている。遺伝子は、ポリペプチドコード領域に加えて、これらに限定されないが、イントロン、転写されるが翻訳されないセグメント、ならびにコードセグメントの上流および下流の調節エレメントを含む、非コード領域を含んでいてもよい。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。また、こうした用語は、グリコシル化、アセチル化、ミリストイル化、およびリン酸化を含む反応により翻訳後修飾されているタンパク質を含む。

用語「抗体」は、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。

「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１）を含むが、天然に存在するＦｃ領域および断片は、特に人口関連遺伝的異質性の結果として、（種特異的な「標準」配列が導出されているものの、アミノ酸配列が異質性であり得ることに留意されたい。ヒト免疫グロブリン、具体的にはそのＩｇＧ実施形態が、古典的にはアロタイプと名付けられている配列多型を示すことは公知である。JefferisおよびLefranc、209、Human immunoglobulin allotypes: Possible implications for immunogenicity、mAbs １巻、１〜７頁を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）は、それらの組合せおよび混合物ならびにそのようなアイソタイプの単離および精製アロタイプを含む、天然に存在する変異性の範囲の全体にわたるそのようなアロタイプを含む。

当業者であれば理解するように、「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つの「アミノ酸修飾」により天然配列Ｆｃ領域の配列と異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１から約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５個のアミノ酸置換を有する。変異体Ｆｃ領域は、本明細書では、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／また親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％配列同一性、より好ましくはそれらと少なくとも約９０％配列同一性、より好ましくはそれらと少なくとも約９５％配列同一性、さらにより好ましくはそれらと少なくとも約９９％配列同一性を有するだろう。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。ＦｃγＲは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合する受容体である。ＦｃγＲとしては、こうした受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライス形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）（例えば、配列番号２１）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）（例えば、配列番号２２）が挙げられ、それらは、主にそれらの細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。

用語「Ｆｃ結合タンパク質」は、ＦｃγＲ結合部位の外部にあるＩｇＧＦｃ領域に結合する任意のタンパク質を指す。特定の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、ＩｇＧＦｃに対するＦｃγＲの結合に干渉せずに、ＩｇＧのＦｃ領域の領域に結合する。

「有効量」とは、有益なまたは所望の臨床結果（例えば、臨床状態の改善）を引き起こすのに十分な量を意味する。

「プロモーター」は、一般的には、転写開始部位に対して比較的一定の位置にある場合に機能する１つまたは複数のＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の塩基相互作用に必要なコアエレメントを含有しており、上流エレメントおよび応答エレメントを含有していてもよい。

「エンハンサー」は、一般的には、転写開始部位から一定の距離になくとも機能し、転写単位の５’または３’のいずれにあってもよいＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内およびコード配列自体内にあってもよい。エンハンサーは、通常、長さが１０〜３００ｂｐであり、シスで機能する。エンハンサーは、付近のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。また、エンハンサーは、プロモーターと同様に、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する場合が多い。エンハンサーは、発現の調節を決定することが多い。

受動的ＡＤＣＣの増強
本明細書には、対象の受動的ＡＤＣＣを増強するための試薬、方法、および医薬組成物が開示されている。特定の実施形態では、本明細書には、Ｆｃ結合タンパク質をコードする病原体に感染した対象を処置するための方法であって、対象に、免疫エフェクター細胞上にあるＦｃγＲに結合するドメインおよび病原体によりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む本発明の医薬組成物が投与される、方法が提供される。他の実施形態では、ＨＳＶ１感染を有する対象の神経学的損傷を予防するための、およびＨＳＶ１感染を有する対象の死亡を予防するための試薬、方法、および医薬組成物が提供される。ある特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体、および特にＩｇＧ抗体のＦｃ断片である。ＩｇＧ含有抗血清も、そのような免疫学的ポリペプチドの範囲内である。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

Ｆｃ断片
一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のＦｃ領域を含むが、抗体の抗原結合領域、例えばＦａｂ領域を含まない。例えば、免疫学的ポリペプチドは、ＩｇＧ１（例えば、配列番号６）、ＩｇＧ２（例えば、配列番号７）、ＩｇＧ３（例えば、配列番号８）、またはＩｇＧ４（例えば、配列番号９）免疫グロブリンの断片であってもよい。本明細書に示されている配列は例示である。また、当業者であれば、特許請求されている試薬、方法、および医薬組成物は、ＩｇＧアイソタイプのアロタイプ変異を含むことを認識するだろう。一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域、またはＦｃγＲおよびＦｃ結合タンパク質に同時に結合することが可能なその断片、またはＦｃγＲもしくはＦｃ結合タンパク質のいずれかに結合することが可能であるが、両方には結合しないその断片（例えば、ＩｇＧ３）を含み、抗体の抗原結合領域、例えばＦａｂ領域を含まない。特定の実施形態では、本開示の免疫学的ポリペプチドは、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに対して、自然界に見出されるＩｇＧよりも高い親和性で結合するように変更されている（自然に、遺伝子工学により、または別様に）ドメインおよび／または病原体によりコードされるＦｃ結合タンパク質に対して、自然界に見出されるＩｇＧよりも高い親和性で結合する非重複ドメインを含む。免疫学的ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１の断片（Ｓ６Ｂ２９１；配列番号１０）を含有する組換えタンパク質であってもよい。例えば、特定の実施形態では、組換えタンパク質は、ヒトＩｇＧ１の残基２３５〜４６６（Ｓ６Ｂ２９１）（配列番号２）、またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の相当する相同体配列を含む。また、免疫学的ポリペプチドは、当技術分野で公知であるように、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のパパインまたはプラスミン消化により製作することができる（例えば、Goding, J.（１９８３年）、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、Academic Press Inc.、London, U Kを参照）。

ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１の残基２６２〜４６６（Ｓ６Ｂ２９１）（配列番号１）、またはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４の相当する相同体配列を含有する組換えタンパク質であってもよい。

Ｆｃ変異体
また、ＦｃγＲおよびＦｃ結合タンパク質に同時に結合することが可能な合成または組換えポリペプチドが開示される。一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、ＩｇＧ免疫グロブリンの２つまたはそれよりも多くのＦｃ領域を含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＰＥＧ化またはミリストイル化により修飾されている。

一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を増強するように修飾されているＦｃガンマ受容体結合部位を含む。一部の実施形態では、これは、ＩｇＧ−Ｆｃγ受容体インターフェースを構造誘導設計（structure-guided design）して、より高い結合親和性をもたらすことを含む。一部の実施形態では、これは、ＩｇＧ分子のＡｓｎ２９７に連結されているフコースを除去することを含む。一部の実施形態では、これは、Ｆｃγ受容体結合を増強するようにポリペプチドを化学的に修飾することを含む（例えば、Kamihira M.、Katakura Y.、Ito A.（編）Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects. Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects、１６巻、Springer, Dordrechtの、Konnoら（２０１０年）Controlling Fucosylation Levels of Antibodies with Osmolality during Cell Cultureを参照）。

一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｆｃガンマ受容体を発現する免疫細胞である。Ｆｃガンマ受容体としては、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２、およびＣＤ６４が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球もしくは顆粒球、または樹状細胞である。

疾患／障害
本明細書で開示される方法は、Ｆｃ結合タンパク質を発現する標的細胞もしくは病原体の死滅または妨害が望ましい任意の疾患または状態に幅広く適用可能である。

一部の実施形態では、ウイルスまたはウイルスに感染した感染標的細胞は、Ｆｃ結合タンパク質を発現する。例えば、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）およびＨＳＶ２は、受動的ＡＤＣＣを誘導することができるＦｃ結合タンパク質糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）（配列番号５）を発現する。ヘルペスウイルスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、受動的ＡＤＣＣを誘導することができるＦｃ結合タンパク質６８ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ６８）を発現する。なお、ＣＭＶｇｐ３２も、ＩｇＧＦｃに結合するが、ＩｇＧＦｃの同じ結合部位をＣＤ１６ａと競合するため、受動的ＡＤＣＣを誘導しない。加えて、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、ＨＳＶ１ｇＥの相同体であるＩｇＧ結合タンパク質ｇＥを発現する（参照ＰＭＣ２４１１４７およびＰＭＩＤ：２１６７５５４）。

本発明の試薬、方法、および医薬組成物により標的とすることができるウイルスとしては、一般的には、これらに限定されないが、以下の科のウイルスが挙げられる：ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、およびｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ。

一部の実施形態では、病原体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉなどの細菌である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓは、Ｆｃ結合プロテインＡを発現し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは、Ｆｃ結合タンパク質プロテインＧ、プロテインＨ、およびＭ１タンパク質を発現し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉは、Ｆｃ結合タンパク質Ｍ１タンパク質を発現する。したがって、一部の実施形態では、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＧ、プロテインＨ、またはＭ１タンパク質を含む。

細菌としては、一般的には、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍａｎａｓｓｐ．、Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐ．、ＮｅｉｓｓｅｒｉａＳｐ．、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｐ．、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｉａｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａｓｐ．、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、
Ｐｒｏｔｅｕｓｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．、Ｌｅｓｔｅｒｉａｓｐ．、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍｓｐ．、Ｆｕｓｏｓｐｉｒｏｃｈｅｔａｓｐ．、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａｓｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、
Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｓｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓｐ．、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｓｐ．、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｒａｓｓｐ．、およびＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ。

寄生動物としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｍａｊｏｒ、Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ、Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓ．ｊａｐｏｎｉｕｍ；Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ；Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａｂａｎｃｒｏｆｔｉ；Ｂｒｕｇｉａｍａｌａｙｌｉ；Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ；Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓｖｅｒｍｉｃｕｌｏａｒｕｓ；Ｔａｅｎｉａｓｏｌｉｕｍ、Ｔ．ｓａｇｉｎａｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｔｉｓ、Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｔ．ｔｅｎａｘ；Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ、Ｂａｂｅｓｉａｂｏｖｉｓ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｉｓｏｓｐｏｒｅｂｅｌｌｉ、Ｌｈｏｍｉｎｉｓ；Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａｆｒａｇｉｌｅｓ；Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｖｏｌｖｕｌｕｓ；Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｎｅｃａｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｉｓ；Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａｄｕｏｄｅｎａｌｅ；Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ；Ｃａｐｉｌｌａｒｉａｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ；Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ；Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓｎａｎａ；Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍｌａｔｕｍ；Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｅ．ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ；Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ、Ｐ．ｃａｌｉｅｎｓｉｓ；Ｃｈｌｏｎｏｒｃｈｉｓｓｉｎｅｎｓｉｓ；Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓｆｅｌｉｎｅａｓ、Ｇ．Ｖｉｖｅｒｉｎｉ、ＦａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａＳａｒｃｏｐｔｅｓｓｃａｂｉｅｉ、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓｈｕｍａｎｕｓ；Ｐｈｔｈｉｒｉｕｓｐｕｂｉｓ；およびＤｅｒｍａｔｏｂｉａｈｏｍｉｎｉｓ。

真菌としては、一般的に、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ；Ａｉｅｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ；Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｆｒｉａｃａｐｓｕｌａｔｕｍ；Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｉｍｍｉｔｉｓ；Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、およびＣ．ｋｒｕｓｅｉを含むＣａｎｄｉｄｓｓｐｅｃｉｅｓ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｆｌａｖｕｓ、およびＡ．ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｐｅｃｉｅｓ；Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒｓｐｅｃｉｅｓ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｍｅｌｌａｓｐｅｃｉｅｓ；Ａ．ｓａｋｓｅｎａｅａ、Ａ．ｍｕｃｏｒ、およびＡ．ａｂｓｉｄｉａを含むＡｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｉｅｓ；Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａｂｏｙｄｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｇｌａｂｒａｔａ；およびＤｅｒｍａｔｏｐｈｙｒｅｓｓｐｅｃｉｅｓ。

受動的ＡＤＣＣの阻害
また、受動的ＡＤＣＣを阻害または低減するための方法、試薬、および医薬組成物が開示される。こうした方法は、受動的ＡＤＣＣを阻害することにより、対象の免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を低減する。

一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合しないように修飾されたＩｇＧ免疫グロブリンの断片である。例えば、免疫学的ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２３５〜２６２またはその機能的等価物を含まない。例えば、ポリペプチドは、ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２、またはＣＤ６４結合部位を欠如するＩｇＧ断片であってもよい。例えば、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４免疫グロブリンの断片であってもよい。一部の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体の１つよりも多くのサブクラスに由来する断片である。

一部の実施形態では、本明細書には、抗がん治療を受けている対象の炎症を低減するための試薬、方法、および医薬組成物が提供されている。本明細書で開示される方法は、Ｆｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合する領域を含まない治療有効量の免疫学的ポリペプチドを投与すること；およびモノクローナル抗体薬物を含む抗がん治療を施すことを含み、免疫学的ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２３５〜２６２またはその機能的等価物を含まない。

一部の実施形態では、対象は、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、ダラツムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、またはペムブロリズマブなどの治療用抗体で処置されている。ほとんどの治療用モノクローナル抗体薬物は、哺乳動物宿主細胞株から産生され、特異的抗原を標的とする。副作用および治療効力の低減は、種々の天然Ｆｃ結合タンパク質により抗体が隔離されることに起因する場合がある。本開示の方法は、抗体媒介性注入毒性の副作用（いわゆる、「初回投与効果」）を減少させることができるが、さらに抗体に基づく免疫療法を増強することができる。

一部の実施形態では、本明細書には、腫瘍溶解性ＨＳＶ１ウイルス治療を受けている対象を処置するための試薬、方法、および医薬組成物が提供されている。他の実施形態では、本明細書には、標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、ＦｃγＲに結合する領域を含まないポリペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の腫瘍溶解性ウイルス治療を増強するための方法、試薬、および医薬組成物が提供されている。例えば、免疫学的ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２３５〜２６２またはその機能的等価物を含まない。

本方法は、腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスに感染させた後、早期に受動的ＡＤＣＣを阻害して、ウイルスが他の腫瘍細胞へと蔓延することを可能にするために使用することができる。腫瘍を腫瘍溶解性ウイルスに感染させた後、早期に受動的ＡＤＣＣを阻害して、ウイルスが他の腫瘍細胞へと蔓延することを可能にすることが有利である場合があるが、本開示の方法を使用して、腫瘍細胞が感染して腫瘍細胞の死滅が増強された後で受動的ＡＤＣＣを増強させることもできる。

したがって、一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、免疫学的ポリペプチドは、抗体、より具体的にはＩｇＧ抗体、および特にＩｇＧ抗体のＦｃ断片である。ＩｇＧ含有抗血清も、そのような免疫学的ポリペプチドの範囲内である。本方法に有用な、本明細書で開示される医薬組成物を構成する免疫学的ポリペプチドの特徴は、前記ＩｇＧ抗体の効力および有用性が、それらの抗原特異性に依存しないということである。

上述のように、免疫エフェクター細胞は、Ｆｃガンマ受容体を発現する任意の免疫細胞であってもよい。Ｆｃガンマ受容体としては、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ３２、およびＣＤ６４が挙げられる。したがって、一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球もしくは顆粒球、または樹状細胞である。

異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ）
また、本明細書には、ウイルス感染細胞および免疫エフェクター細胞の相互作用をモジュレートする遺伝子を特定するための方法が開示される。この方法は、本明細書では、異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ）と呼ばれる。この方法は、ヒトリンパ球と、ウイルスに感染した標的細胞により発現される各遺伝子との間の相互作用に関する包括的な理解を提供する。

本開示の方法は、発現制御配列に作動可能に連結した候補ウイルス遺伝子およびレポーター遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすること、トランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞を、細胞傷害性免疫エフェクター細胞に曝露させること、および曝露させたトランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞をアッセイして、レポーター遺伝子発現または活性の関数として細胞死を測定することを含んでいてもよい。こうした方法では、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による細胞死が減少することは、ウイルス遺伝子が、免疫エフェクター細胞を抑制したこと、または言い換えれば、トランスフェクト宿主細胞を免疫エフェクター細胞から保護したことを示し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による細胞死が増加することは、ウイルス遺伝子が、免疫エフェクター細胞を活性化したこと、または言い換えれば、トランスフェクト宿主細胞を免疫エフェクター細胞に対して感受性にしたことを示す。

特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、蛍光遺伝子であり、曝露させたトランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞をフローサイトメトリーによりアッセイして、細胞死を蛍光の関数として測定し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、蛍光性トランスフェクト宿主細胞のパーセンテージが増加することは、ウイルス遺伝子が、トランスフェクト宿主細胞を免疫エフェクター細胞から保護したことを示し、非トランスフェクト宿主細胞と比較して、トランスフェクト宿主細胞による平均蛍光が減少することは、ウイルス遺伝子が、トランスフェクト宿主細胞を免疫エフェクター細胞に対して感受性にしたことを示す。

例えば、未感染の非蛍光性細胞のみが死滅し、蛍光の増加を示す蛍光読み取り値は、トランスフェクト標的細胞が、死滅から保護されたことを示す。感染した蛍光性細胞のみが死滅し、蛍光の減少を示す蛍光読み取り値は、トランスフェクト標的細胞が、死滅に対して感受性だったことを示す。蛍光に変化がないことを示す蛍光読み取り値は、標的細胞が、細胞傷害性リンパ球死滅に対して変化がないままだったことを示す。

蛍光タンパク質遺伝子の例としては、以下のものが挙げられる：ＡｃＧＦＰ１、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＡｚｕｒｉｔｅＢＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｃｌｏｖｅｒ、ＣｏｐＧＦＰ、Ｃｙｃｌｅ３ＧＦＰ、ＣｙＯＦＰ１、ＣｙＰｅｔ、ｄ１ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＣＦＰ、ｄ２ＥＧＦＰ、ｄ２ＥＹＦＰ、ｄ４ＥＧＦＰ、ｄａＧＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、ｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｄＫｅｉｍａ５７０、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ１、Ｄｒｏｎｐａ−Ｇｒｅｅｎ３、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍａｘ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＤｓＲｅｄ．Ｔ３、ＤｓＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ２、ｄＴｏｍａｔｏ、Ｅ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、Ｅ２−Ｏｒａｎｇｅ、Ｅ２−Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、ＥＣＦＰ、ｅｃｌｉｐｔｉｃｐＨｌｕｏｒｉｎ、ＥＧＦＰ、ＥｍｅｒａｌｄＧＦＰ、ＥｏｓＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｆａｓｔ−ＦＴ、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＴｉｍｅｒ、ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ、ＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＨｃＲｅｄ１、ｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｈｄＫｅｉｍａ５７０、ｈＫｉｋＧＲ１、ｈＫＯ、ｈｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｈＭＧＦＰ、ｈｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｈｍＫｅｉｍａ８．５、ｈｍＫｉｋＧＲ１、ｈｍＫＯ、ｈｍＫＯ２、ｈｍＭｉＣｙ１、ｈｍＵｋＧ１、ｈｒＧＦＰ、ＩＦＰ１．１、ＩＦＰ１．４、ＩＦＰ２．０、ｉＲＦＰ６７０、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ７２０、Ｋａｅｄｅ、ＫｉｋＧＲ１、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｋｏｈｉｎｏｏｒ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ＬａｎＹＦＰ、ＬＳＳｍＫａｔｅ１、ＬＳＳｍＫａｔｅ２、ＬＳＳｍＯｒａｎｇｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ１．１、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＡｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ｍＣａｒｄｉｎａｌ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ２、ｍＣｌａｖＧＲ２、ｍＣｌｏｖｅｒ２、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ｍＥＣＦＰ、Ｍｅｄｉｕｍ−ＦＴ、ｍＥＧＦＰ、ｍＥｍｅｒａｌｄ、ｍＥｏｓ２、ｍＥｏｓ３．２、ｍＥｏｓ４ａ、ｍＥｏｓ４ｂ、ｍＥＹＦＰ、ｍｇｆｐ５、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉＣｙ、ｍＩＦＰ、ｍｉｎｉＳＯＧ、ｍＫａｌａｍａ１、ｍＫａｔｅ２、ｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ、ｍＫｉｋＧＲ１、ｍＫＯ、ｍＫＯ２、ｍＭａｐｌｅ、ｍＭｉＣｙ１、ｍＮｅｃｔａｒｉｎｅ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ２．５、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＰａｐａｙａ１、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＲｕｂｙ３、ｍｓｅＣＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ２、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＴＦＰ１、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍＵｋＧ１、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＷａｓａｂｉ、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡ−ＴａｇＲＦＰ、ｐＡｃＧＦＰ１、ｐＡｃＧＦＰ１−１、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ１、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ２、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｃ３、ｐＡｃＧＦＰ１−ＣＩｎＦｕｓｉｏｎＲｅａｄｙ、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｎ１、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｎ２、ｐＡｃＧＦＰ１−Ｎ３、ｐＡｃＧＦＰ１−ＮＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＲｅａｄｙ、ｐＡＧ−Ｓ１、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ｐＡｍＣｙａｎ、ｐＡｍＣｙａｎ１−Ｃ１、ｐＡｍＣｙａｎ１−Ｎ１、ＰＡｍＫａｔｅ、ｐＡｓＲｅｄ２、ｐＡｓＲｅｄ２−Ｃ１、ｐＡｓＲｅｄ２−Ｎ１、ｐｄ１ＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐｄ２ＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐｄ２ＥＹＦＰ−Ｎ１、ｐｄ４ＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＤｅｎｄｒａ２、ｐＤｅｎｄｒａ２−Ｃ、ｐＤｅｎｄｒａ２−Ｎ、ｐＤＧ１−Ｓ１、ｐＤＧ３−Ｓ１、ｐｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１、ｐｄＫｅｉｍａ５７０−Ｓ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｎ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２−１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ２−Ｎ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−ＣＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＲｅａｄｙ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−Ｎ１、ｐＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ−ＮＩｎ−ＦｕｓｉｏｎＲｅａｄｙ、ｐＤｓＲｅｄ２、ｐＤｓＲｅｄ２−１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１、ｐＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ、ｐＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ−Ｃ１、ｐＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ−Ｎ１、ｐＥＣＦＰ、ｐＥＣＦＰ−１、ｐＥＣＦＰ−Ｃ１、ｐＥＣＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２、ｐＥＧＦＰ−Ｃ３、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３、ｐＥＹＦＰ、ｐＥＹＦＰ−１、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１、ｐＥＹＦＰ−Ｎ１、ｐＦｕｓｉｏｎＲｅｄ−Ｂ、ｐＦｕｓｉｏｎＲｅｄ−Ｃ、ｐＦｕｓｉｏｎＲｅｄ−Ｎ、ｐＧＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＬＯ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐＨｃＲｅｄ１−１、ｐＨｃＲｅｄ１−Ｃ１、ｐＨｃＲｅｄ１−Ｎ１＿１、ｐｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１、ｐｈｄＫｅｉｍａ５７０−Ｓ１、ｐｈＫｉｋＧＲ１−Ｓ１、ｐｈＫＯ１−Ｓ１、ｐｈｍＡＧ１−Ｓ１、ｐｈＭＧＦＰ、ｐｈｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１、ｐｈｍＫＯ１−Ｓ１、ｐｈｍＵｋＧ１−Ｓ１、ｐＨＴｏｍａｔｏ、ｐＨｕｊｉ、ｐＫａｅｄｅ−Ｓ１、ｐＫｉｋＧＲ１−Ｓ１、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｂ、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｃ、ｐＫｉｌｌｅｒＲｅｄ−Ｎ、ｐＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ−Ｂ、ｐＫｉｎｄｌｉｎｇ−Ｒｅｄ−Ｎ、ｐＫＯ１−Ｓ１、ｐＬＳＳｍＯｒａｎｇｅ−Ｃ１、ｐＬＳＳｍＯｒａｎｇｅ−Ｎ１、ｐｍＡＧ１−Ｓ１、ｐｍＢａｎａｎａ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−１、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１、ｐＭｉＣｙ１−Ｓ１、ｐｍＫａｔｅ２−Ｃ、ｐｍＫａｔｅ２−Ｎ、ｐｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−Ｓ１、ｐｍＫｉｋＧＲ１−Ｓ１、ｐｍＫＯ１−Ｓ１、ｐｍＫＯ２−Ｓ１、ｐｍＭｉＣｙ１−Ｓ１、ｐｍＯｒａｎｇｅ、ｐｍＯｒａｎｇｅ２、ｐｍＯｒａｎｇｅ２−Ｃ１、ｐｍＯｒａｎｇｅ２−Ｎ１、ｐｍＰｌｕｍ、ｐｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｐｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｐｍＵｋＧ１−Ｓ１、ｐＮｉｒＦＰ−Ｃ、ｐＮｉｒＦＰ−Ｎ、ｐＰＡ−ＴａｇＲＦＰ−Ｃ、ｐＰＡ−ＴａｇＲＦＰ−Ｎ、ｐＰＡｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１、ｐＰＡｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１、ｐＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１−Ｃ１、ｐＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１−Ｎ１、ｐＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ−Ｂ、ｐＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ−Ｃ、ｐＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ−Ｎ、ｐＰｈｉ−Ｙｅｌｌｏｗ−ＰＲＬ、ｐＰＳ−ＣＦＰ２−Ｃ、ｐＰＳ−ＣＦＰ２−Ｎ、ｐＰＳｍＯｒａｎｇｅ−Ｃ１、ｐＰＳｍＯｒａｎｇｅ−Ｎ１、ｐＲＳＥＴ−ＢＦＰ、ｐＲＳＥＴ−ＣＦＰ、ｐＲＳＥＴ−ＥｍＧＦＰ、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ２、ｐＴａｇＢＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＢＦＰ−Ｎ、ｐＴａｇＣＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＣＦＰ−Ｎ、ｐＴａｇＧＦＰ２−Ｃ、ｐＴａｇＧＦＰ２−Ｎ、ｐＴａｇＲＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＲＦＰ−Ｎ、ｐＴａｇＹＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＹＦＰ−Ｎ、ｐｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ−Ｎ１、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐｔｄＴｏｍａｔｏ−Ｃ１、ｐＴｉｍｅｒ、ｐＴｉｍｅｒ−１、ｐＴｕｒｂｏＦＰ６０２−Ｂ、ｐＴｕｒｂｏＦＰ６０２−Ｃ、ｐＴｕｒｂｏＦＰ６０２−Ｎ、ｐＴｕｒｂｏＦＰ６０２−ＰＲＬ、ｐＴｕｒｂｏＧＦＰ−Ｂ、ｐＴｕｒｂｏＧＦＰ−Ｃ、ｐＴｕｒｂｏＧＦＰ−Ｎ、ｐＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＰＲＬ、ｐＴｕｒｂｏＲＦＰ−Ｂ、ｐＴｕｒｂｏＲＦＰ−Ｃ、ｐＴｕｒｂｏＲＦＰ−Ｎ、ｐＴｕｒｂｏＲＦＰ−ＰＲＬ、ｐＴｕｒｂｏＹＦＰ−Ｂ、ｐＴｕｒｂｏＹＦＰ−Ｃ、ｐＴｕｒｂｏＹＦＰ−Ｎ、ｐＴｕｒｂｏＹＦＰ−ＰＲＬ、ｐＺｓＧｒｅｅｎ、ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−１、ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｃ１、ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ１−Ｃ１、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ１−Ｎ１、ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃｐＨｌｕｏｒｉｎ、ＲｈａｃｏｓｔｏｍａＧＦＰ、ｒｓＥＧＦＰ、ｒｓＥＧＦＰ２、ｒｓＴａｇＲＦＰ、Ｓｌｏｗ−ＦＴ、ｓｕｐｅｒ−ｅｃｌｉｐｔｉｃｐＨｌｕｏｒｉｎ、ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒＧＦＰ、ＴａｇＢＦＰ、ＴａｇＣＦＰ、ＴａｇＧＦＰ２、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＹＦＰ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ＴｕｒｂｏＦＰ６３５、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ｙｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＹＰｅｔ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ１、およびＺｓＹｅｌｌｏｗ１。特定の実施形態では、遺伝子は、緑色蛍光タンパク質をコードする（Chalfieら、１９９４年、Science ２６３巻、８０２〜８０５頁を参照）。

本プロセスは、ウイルスゲノムの各遺伝子で繰り返すことができる。例えば、本方法は、ウイルスゲノムの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれよりも多くの遺伝子の各遺伝子について個々にまたは組合せについて、本プロセスを繰り返すことをさらに含んでいてもよい。

こうした方法は、細胞傷害性であるか、または活性化もしくは抑制を示すあるバイオマーカー（例えば、サイトカイン）を分泌する任意の免疫エフェクター細胞と共に使用することができる。例えば、細胞傷害性免疫エフェクター細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、顆粒球、または樹状細胞であってもよい。上記の方法は、各候補免疫エフェクター細胞のみで、または他の免疫細胞もしくは生物活性剤と組み合わせて繰り返すことができる。

また、本開示の方法は、細胞溶解性に影響を及ぼす遺伝子の能力に対する候補薬物の効果をアッセイするために使用することができる。例えば、遺伝子が、免疫エフェクター細胞による死滅から細胞を保護することが見出された場合、一連の候補薬物を、将来のアッセイに加えて、その遺伝子の保護を阻害する薬物を見出すことができる。

宿主細胞は、好ましくは、ウイルス感染、外来性タンパク質の発現、または自然状態時の、免疫エフェクター細胞による死滅に対する公知の感受性または耐性に基づいて選択される。宿主細胞は、動物またはヒト対象から単離された初代細胞であってもよい。宿主細胞は、不死化細胞株などの細胞株であってもよい。宿主細胞は、単一の細胞タイプを含んでいてもよく、または細胞の混合物を含んでいてもよい。宿主細胞は、懸濁で培養してもよく、表面（二次元）で培養してもよく、または三次元マトリックスで培養してもよい。

本明細書で開示される方法は、トランスフェクト宿主細胞および非トランスフェクト宿主細胞を細胞傷害性免疫エフェクター細胞に曝露させることを含む。このステップは、宿主細胞および細胞傷害性免疫エフェクター細胞を、標準的培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）下で、または免疫細胞および宿主細胞の機能を増強もしくは阻害する関連実験設定下で共培養することを含んでいてもよい。

組換え腫瘍溶解性ＨＳＶ
多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、利用可能な併用療法を適用しても、一貫して致死性の疾患である。腫瘍溶解性ＨＳＶ（「ｏＨＳＶ」）ベクターを含む複製コンピテントウイルスは、有望な治療選択肢である。

本明細書で開示されているように、ＨＳＶＵｓ８、ＵＬ１２、ＵＬ３０、ＵＳ３、およびＵｓ１２遺伝子は、ＮＫ細胞による死滅に対して神経膠腫細胞をより感受性にする。したがって、本明細書には、Ｕｓ８遺伝子における１つもしくは複数の活性化突然変異、ＵＬ１２遺伝子における１つもしくは複数の活性化突然変異、ＵＬ３０遺伝子における１つもしくは数の活性化突然変異、Ｕｓ３遺伝子における１つもしくは複数の活性化突然変異、Ｕｓ１２遺伝子における１つもしくは複数の活性化突然変異、またはそれらの任意の組合せを含む組換え腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）も開示されている。ＨＳＶ遺伝子の活性化突然変異は、当技術分野で公知である。例えば、ＵＳ８，０９２，７９１；ＵＳ９，６２３，０５９；ＷＯ２００７０５２０２９；ＷＯ２００９０５２４２６；ＷＯ２０１７０１３４１９；ＷＯ２０１７１３２５５２；VargheseおよびRabkin、２００２年、Cancer Gene Ther.９巻、９６７〜９７８頁；Grandiら、２００９年、Expert Rev Neurother.９巻、５０５〜５１７頁；およびSokolowskiら、２０１５年、Oncolytic Virother.４巻、２０７〜２１９頁を参照されたい。ＨＳＶ腫瘍溶解性ウイルスに対するこのような修飾は、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍死滅を増強することができる。

本開示のｏＨＳＶは、いくつかの異なるタイプのヘルペスウイルスに由来してもよい。Herpesviridaeは、ヒトおよび動物に疾患を引き起こすＤＮＡウイルスの大きな科である。ヘルペスウイルスは、３つの亜科：アルファ、ベータ、およびガンマに分割される。ヘルペスウイルスはすべて、共通の構造を共有し、エンベロープと呼ばれる脂質二分子膜でそれ自体が包まれているカプシドと呼ばれる二十面体タンパク質ケージ内に内包された１００〜２００個の遺伝子をコードする比較的大型の二本鎖線形ＤＮＡゲノムで構成されている。大型ゲノムは、ウイルスを不活化せずに（例えば、感染または複製を完全に阻害せずに）１つまたは複数の導入遺伝子を導入するための、多数の非必須部位を提供する。しかしながら、ウイルスベクターは、好ましくは、それらが望ましくない効果（例えば、正常細胞を死滅させる、疾患を引き起こす）を示さないように修飾されている（例えば、条件付き複製、弱毒化）ことが理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスは、がん細胞、特にがん幹細胞の死滅、および／または例えば腫瘍のがん幹細胞を死滅させることによる腫瘍の成長阻害に有用なヘルペスウイルス由来を有する多くの治療用ウイルスのいずれか１つを指す。典型的には、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスは、野生型ヘルペスウイルスの突然変異型である。一部の場合では、野生型ヘルペスウイルスが、亜科アルファである（つまり、単純ヘルペスウイルスである）場合、腫瘍溶解性ヘルペスウイルスは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ｏＨＳＶ）と呼ばれる場合がある。一部の場合では、ｏＨＳＶは、条件付き複製ヘルペスウイルスである。条件付き複製ヘルペスウイルスは、がん細胞、特にがん幹細胞などの、活発に分裂する細胞中で優先的に複製するように設計されている。したがって、こうした条件付き複製ウイルスは、腫瘍溶解しようとするがん細胞を標的とし、ウイルスが他のがん細胞に蔓延することができるように、こうした細胞中で複製する。好ましい実施形態では、条件付き複製ヘルペスウイルスは、腫瘍溶解しようとするがん幹細胞を標的とし、ウイルスが他のがん幹細胞に蔓延することができるように、こうした細胞中で複製する。

本開示のｏＨＳＶは、ウイルス遺伝子の発現に影響を及ぼす多くの突然変異のいずれか１つを含んでいてもよい。ほとんどの場合、突然変異は、宿主生物に対するウイルスの病原性に寄与する病原性遺伝子における突然変異である。突然変異は、点突然変異、欠失、逆位、または挿入であってもよい。典型的には、突然変異は、不活性化突然変異である。本明細書で使用される場合、用語「不活化突然変異」は、遺伝子への突然変異または変更を幅広く示し、その遺伝子の発現は、著しく減少されるか、または遺伝子産物が非機能的にされるか、またはその機能能力が著しく減少されることが意図されている。

いくつかのタイプの条件付き複製ヘルペスウイルス突然変異体が開発されており、本明細書で開示される方法の態様に有用である。例えば、１つの態様は、チミジンキナーゼ（Martuzaら、１９９１年、Science ２５２巻：８５４〜８５６頁）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）（GoldsteinおよびWeller、１９８８年、J. Virol.６２巻：１９６〜２０５頁；Boviatsisら、１９９４年、Gene Ther.１巻：３２３〜３３１頁；Boviatsisら、１９９４年、Cancer Res.５４巻：５７４５〜５７５１頁；Minetaら、１９９４年、Cancer Res．５４巻：３３６３〜３３６６頁）、またはウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（PylesおよびThompson、１９９４年、J. Virol.６８巻：４９６３〜４９７２頁）などの、核酸代謝に必要なウイルス遺伝子の機能が欠損したウイルス突然変異体を含む。別の態様は、宿主タンパク質合成の停止を抑制することにより感染細胞のウイルスバーストサイズを顕著に増強することによって病原性因子として機能するγ−３４．５遺伝子の機能（Chambersら、１９９５年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９２巻：１４１１〜１４１５頁）を欠損したウイルス突然変異を含む（Chouら、１９９０年、Science ２５０巻：１２６２〜１２６６頁；ChouおよびRoizman、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ８９巻：３２６６〜３２７０頁）。他の例としては、Ｇ２０７（Minetaら、１９９５年、Nat. Med １巻：９３８〜９４３頁；米国特許第５，５８５，０９６号、Martuzaらに対して１９９６年１２月１７日に交付）、およびγ−３４．５のコピーおよびＲＲの挿入突然変異の両方の欠失を有するＭＧＨ１（Krammら、１９９７年、Hum. Gene Ther.８巻：２０５７〜２０６８頁）が挙げられる。

本開示のｏＨＳＶは、病原性遺伝子に不活性化突然変異を含む単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、例えば、ＨＳＶ−１（例えば、ＨＳＶ−１Ｆ株もしくはＰａｔｔｏｎ株）またはＨＳＶ−２などの、ヘルペスウイルスに基づくウイルスを含んでいてもよい。単純ヘルペスウイルスの場合、この突然変異は、主要なＨＳＶ神経毒性決定因子であるγ−３４．５遺伝子中の不活性化突然変異であってもよい。

上記、および本明細書、ならびに他所に記載されているウイルスはいずれも、野生型へのウイルスの復帰突然変異を防止するためになされている追加の突然変異または修飾を含んでいてもよい。例えば、ウイルスは、リボヌクレオチドレダクターゼの大型サブユニットをコードするＩＣＰ６遺伝子（配列番号２６）に突然変異を含んでいてもよい。

また、本開示のｏＨＳＶは、ワクチン抗原または免疫調節タンパク質などの異種性遺伝子産物をコードする配列を含んでいてもよい。異種性遺伝子産物を保有するウイルスは、増強ウイルスと呼ばれる場合もある。

本開示のｏＨＳＶの効果は、ウイルスが、１つもしくは複数の治療剤、例えば、細胞毒素、免疫調節タンパク質（つまり、抗原に対する宿主免疫応答を増強するかまたは抑制するかのいずれかであるタンパク質）、腫瘍抗原、低分子干渉核酸、アンチセンスＲＮＡ分子、またはリボザイムをコードする異種性核酸配列も含有している場合、増強される場合がある。

免疫調節タンパク質の例としては、以下のものが挙げられる：例えば、サイトカイン（例えば、インターロイキン、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））、ケモカイン（例えば、好中球活性化タンパク質（ＮＡＰ）、マクロファージ化学誘引物質および活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、ならびにマクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−１ａおよびＭＩＰ−１ｂ）、補体成分およびそれらの受容体、免疫系アクセサリー分子（例えば、Ｂ７．１およびＢ７．２）、接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１、２、および３）、ならびに接着受容体分子。

本方法を使用して産生することができる腫瘍抗原の例としては、非限定的な例では、以下のものが挙げられる：ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７抗原、ＥＢＶ由来タンパク質（Van der Bruggenら、１９９１年、Science ２５４巻：１６４３〜１６４７頁）、ＭＩＪＣ１（Burchellら、１９８９年、Int. J. Cancer ４４巻：６９１〜６９６頁）などのムチン（Livingstonら、１９９２年、Curr. Opin. Immun.４巻（５号）：６２４〜６２９頁）、黒色腫チロシナーゼ、およびＭＺ２−Ｅ（Van der Bruggenら、上記参照）。

また、治療剤は、ハイブリダイゼーション相互作用により細胞または病原体ｍＲＮＡの発現を阻止するために使用することができるアンチセンスＲＮＡ分子などの、ＲＮＡ分子であってもよい。あるいは、ＲＮＡ分子は、欠損細胞ＲＮＡを修復するか、または望ましくない細胞性ＲＮＡもしくは病原体コードＲＮＡを破壊するかのいずれかのために設計されたリボザイム（例えば、ハンマーヘッドもしくはヘアピンに基づくリボザイム）であってもよい（例えば、Sullenger、１９９５年、Chem. Biol.２巻（５号）：２４９〜２５３頁；Czubaykoら、１９９７年、Gene Ther.４巻（９号）：９４３〜９４９頁；Rossi、１９９７年、Ciba Found. Symp.２０９巻：１９５〜２０４頁；Jamesら、１９９８年、Blood ９１巻（２号）：３７１〜３８２頁；Sullenger、１９９６年、Cytokines Mol. Ther.２巻（３号）：２０１〜２０５頁；Hampel、１９９８年、Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Bio.５８巻：１〜３９頁；およびCurcioら、１９９７年、Pharmacol. Ther.７４巻（３号）：３１７〜３３２頁を参照）。

一部の実施形態では、治療剤は、オンコジーンなどのがん関連遺伝子の発現を阻害することが可能な低分子干渉核酸分子であってもよい。こうした遺伝子およびそれらの相同体の発現を阻害する低分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、本方法のある特定の実施形態の治療剤として有用である。種々のがんに関連するオンコジーンは、当技術分野で周知であり、非限定的な例では、Cooper、１９９５年、Oncogenes、Jones and Bartlett Publishers、ならびにVogelsteinおよびKinzler、１９９８年、The Genetic Basis of Human Cancer、McGraw-Hillに開示されており、これら文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

異種性核酸配列は、ウイルスの調節配列の制御下に入るような位置に、本開示のｏＨＳＶに挿入することができる。あるいは、異種性核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節エレメントを含む発現カセットの一部として挿入することができる。適切な調節エレメントは、当業者であれば、例えば、所望の組織特異性および発現レベルに基づいて選択することができる。例えば、細胞タイプ特異的または腫瘍特異的プロモーターを使用して、遺伝子産物の発現を特定の細胞タイプに限定することができる。これは、例えば、細胞傷害性の、免疫調節性の、または腫瘍抗原性の遺伝子産物が、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞中で産生されている場合、特に有用である。組織特異的プロモーターの使用に加えて、本発明のウイルスの局所投与は、局所的な発現および効果をもたらすことができる。

本開示のｏＨＳＶで使用することができる非組織特異的プロモーターの例としては、初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号）およびラウス肉腫ウイルスプロモーター（Nortonら、１９８５年、Molec. Cell. Biol.５巻：２８１頁）が挙げられる。また、ＨＳＶ−１ＩＥおよびＩＥ４／５プロモーターなどのＨＳＶプロモーターを使用することができる。

本開示のｏＨＳＶで使用することができる組織特異的プロモーターの例としては、以下のものが挙げられる：例えば、前立腺の細胞に特異的である前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター；筋細胞に特異的であるデスミンプロモーター（Liら、１９８９年、Gene ７８巻：２４３頁；Liら、１９９１年、J. Biol. Chem.２６６巻：６５６２頁；Liら、１９９３年、J. Biol. Chem.２６８巻：１０４０３頁）；ニューロンに特異的であるエノラーゼプロモーター（Forss-Petterら、１９８６年、J. Neuroscience Res.１６巻（１号）：１４１〜１５６頁）；赤血球系細胞に特異的であるベータ−グロビンプロモーター（Townesら、１９８５年、EMBO J.４巻：１７１５頁）；同じく赤血球系細胞に特異的であるタウ−グロビンプロモーター（Brinsterら、１９８０年、Nature ２８３巻：４９９頁）；下垂体細胞に特異的である成長ホルモンプロモーター（Behringerら、１９８８年、Genes Dev.２巻：４５３頁）；膵臓ベータ細胞に特異的であるインスリンプロモーター（Seldenら、１９８６年、Nature ３２１巻：５４５頁）；星状細胞に特異的であるグリア線維酸性タンパク質プロモーター（Brennerら、１９９４年、J. Neurosci.１４巻：１０３０頁）；カテコールアミン作動性ニューロンに特異的であるチロシンヒドロキシラーゼプロモーター（Kimら、１９９３年、J. Biol. Chem.２６８巻：１５６８９頁）；ニューロンに特異的であるアミロイド前駆体タンパク質プロモーター（Salbaumら、１９８８年、EMBO J.７巻：２８０７頁）；ノルアドレナリン作動性およびアドレナリン作動性ニューロンに特異的であるドーパミンベータ−ヒドロキシラーゼプロモーター（Hoyleら、１９９４年、J. Neurosci.１４巻、２４５５頁）；セロトニン／松果腺細胞に特異的であるトリプトファンヒドロキシラーゼプロモーター（Boularandら、１９９５年、J. Biol. Chem.２７０巻：３７５７頁）；コリン作動性ニューロンに特異的であるコリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター（Hershら、１９９３年、J. Neurochem.６１巻：３０６頁）；カテコールアミン作動性／５−ＨＴ／Ｄ型細胞に特異的である芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター（Thaiら、１９９３年、Mol. Brain Res.１７巻：２２７頁）；ニューロン細胞／精子形成精巣上体細胞に特異的であるプロエンケファリンプロモーター（Borsookら、１９９２年、Mol. Endocrinol.６巻：１５０２頁）；結腸および直腸腫瘍ならびに膵臓および腎臓細胞に特異的であるｒｅｇ（膵石タンパク質）プロモーター（Watanabeら、１９９０年、J Biol. Chem.２６５巻：７４３２頁）；ならびに肝臓および盲腸腫瘍、ならびに神経鞘腫、腎臓、膵臓、および副腎細胞に特異的である副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）プロモーター（Camposら、１９９２年、Mol. Endocrinol.６巻：１６４２頁）。

腫瘍細胞で特異的に機能するプロモーターの例としては、以下のものが挙げられる：乳がん細胞に特異的であるストロメライシン３プロモーター（Bassetら、１９９０年、Nature ３４８巻：６９９頁）；非小細胞肺がん細胞に特異的であるサーファクタントタンパク質Ａプロモーター（Smithら、１９９４年、Hum. Gene Ther.５巻：２９〜３５頁）；ＳＬＰＩ発現癌腫に特異的である分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）プロモーター（Garverら、１９９４年、Gene Ther.１巻：４６〜５０頁）；黒色腫細胞に特異的であるチロシナーゼプロモーター（Vileら、１９９４年、Gene Therapy １巻：３０７頁；ＷＯ９４／１６５５７）；線維肉腫／腫瘍形成性細胞に特異的であるストレス誘導可能なｇｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター（Gazitら、１９９５年、Cancer Res.５５巻（８号）：１６６０頁）；脂肪細胞に特異的であるＡＰ２脂肪エンハンサー（Graves、１９９２年、J. Cell. Biochem.４９巻：２１９頁）；肝細胞に特異的であるａ−１抗トリプシントランスサイレチンプロモーター（Graysonら、１９８８年、Science ２３９巻：７８６頁）；多形性膠芽腫細胞に特異的であるインターロイキン−１０プロモーター（Nittaら、１９９４年、Brain Res.６４９巻：１２２頁）；膵臓細胞、胸腺細胞、胃細胞、卵巣細胞、および非小細胞肺細胞に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Harrisら、１９９４年、Gene Ther.１巻：１７０頁）；脳腫瘍細胞に特異的であるａ−Ｂクリスタリン／ヒートショックタンパク質２７プロモーター（Aoyamaら、１９９３年、Int. J. Cancer ５５巻：７６０頁）；神経膠腫細胞および髄膜腫細胞に特異的である塩基性線維芽細胞増殖因子プロモーター（Shibataら、１９９１年、Growth Fact.４巻：２７７頁）；扁平上皮癌細胞、神経膠腫細胞、および胸腺腫瘍細胞に特異的である上皮増殖因子受容体プロモーター（Ishiiら、１９９３年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.９０巻：２８２頁）；乳癌細胞に特異的であるムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター（Abeら、１９９３年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.９０巻：２８２頁）；転移性腫瘍に特異的であるｍｔｓ１プロモーター（Tulchinskyら、１９９２年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８９巻：９１４６頁）；小細胞肺がん細胞に特異的であるＮＳＥプロモーター（Forss-Petterら、１９９０年、Neuron ５巻：１８７頁）；小細胞肺がん細胞に特異的であるソマトスタチン受容体プロモーター（Bombardieriら、１９９５年、Eur. J. Cancer ３１巻Ａ：１８４頁；Kohら、１９９５年、Int. J. Cancer ６０巻：８４３頁）；乳がん細胞に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ−３およびｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター（Quinら、１９９４年、Histopathology ２５巻：２４７頁）；乳がん細胞および胃がん細胞に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター（Rajkumarら、１９９４年、Breast Cancer Res. Trends ２９巻：３頁）；甲状腺癌細胞に特異的であるチログロブリンプロモーター（Mariottiら、１９９５年、J. Clin. Endocrinol. Meth.８０巻：４６８頁）；肝癌細胞に特異的であるａ−フェトプロテインプロモーター（Zuibelら、１９９５年、J. Cell. Phys.１６２巻：３６頁）；胃がん細胞に特異的であるビリンプロモーター（Osbomら、１９８８年、Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol.４１３巻：３０３頁）；ならびに肝癌細胞に特異的であるアルブミンプロモーター（Huber、１９９１年、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.８８巻：８０９９頁）。

本開示のｏＨＳＶは、がん幹細胞（ＣＳＣ）および／もしくはＣＳＣを有する腫瘍（例えば、持続的成長がＣＳＣに依存する腫瘍；そのような腫瘍は、ＣＳＣ依存性腫瘍と呼ばれる場合もある）を有するか（例えば、内包する）または有するリスクのある対象を処置するために使用することができる。対象が、ＣＳＣまたはＣＳＣを有する腫瘍を有する「リスクがある」とみなされるか否かは、その対象をケアする熟練の開業医の裁量内にあり得る決定である。任意の好適な診断試験および／または基準を使用することができる。例えば、対象は、以下の場合に、ＣＳＣまたはＣＳＣを有する腫瘍を有する「リスクがある」とみなすことができる：（ｉ）対象が、突然変異または遺伝子多型を有していない一般集団の他のメンバーと比べて、がんを発症または有するリスク増加に関連する突然変異、遺伝子多型、遺伝子もしくはタンパク質発現プロファイル、および／または血中における特定の物質の存在を示す場合；（ｉｉ）対象が、がんの家族歴を有すること、発癌物質または腫瘍を促進する作用剤もしくは条件、例えば、石綿、タバコ煙、アフラトキシン、放射線、慢性感染症／炎症などに曝されていること、高齢などの１つまたは複数のリスク要因を有する場合；（ｉｉｉ）対象が、がんなどの１つまたは複数の症状を有する場合。

一部の実施形態では、がんは、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、子宮頸がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、黒色腫、または精巣腫瘍である。一実施形態では、がんは、神経膠腫である。一実施形態では、がんは、乳癌または前立腺癌である。当業者には、他のがんが公知であろう。

特定の実施形態では、がんは、脳がんである。一部の実施形態では、がんは、神経膠腫である。神経膠腫は、膠細胞から生じる原発性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍の１種である。神経膠腫は、脳に加えて、脊髄または視神経などのＣＮＳの任意の他の部分にも影響を及ぼす場合がある。本発明の方法による処置が有用な神経膠腫としては、脳室上衣細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、および乏突起星細胞腫などの混合神経膠腫が挙げられる。一部の実施形態では、神経膠腫は、ＣＤ１３３＋であるがん幹細胞を含有する。一部の実施形態では、神経膠腫は、神経膠芽腫である。

神経膠腫は、腫瘍の病理学的評価により決定されるそれらの悪性度に従って、さらに分類される。低悪性度神経膠腫は、高分化型である（低分化ではない）。これらは良性であり、患者の予後はより良好であることが予想される。高悪性度神経膠腫は、未分化または低分化である。これらは悪性であり、予後はより不良である。使用されている多数の評価方式の中で、最も一般的なものは、星状細胞腫用の世界保健機構（ＷＨＯ）評価方式である。ＷＨＯ方式では、１〜４の悪性度が割り当てられ、最も低い侵襲性が１であり、最も高い侵襲性が４である。種々のタイプの星状細胞腫には、対応するＷＨＯ悪性度が与えられている。ＷＨＯ悪性度１は、例えば、毛様細胞性星状細胞腫を含み、ＷＨＯ悪性度２は、例えば、びまん性または低悪性度星状細胞腫を含み、ＷＨＯ悪性度３は、例えば、低分化（悪性）星状細胞腫を含み、ＷＨＯ悪性度４は、例えば、多形性神経膠芽腫（成体で最も一般的な神経膠腫）を含む。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、ＷＨＯ悪性度１、悪性度２、悪性度３、または悪性度４の神経膠腫を有する患者（対象）の処置に有用である。

また、対象のがんに対する全身性免疫応答を誘導する方法であって、本明細書で開示されるｏＨＳＶを対象に投与することを含む方法が開示される。ヘルペスウイルスを、例えば、対象の腫瘍に投与することができる。加えて、患者は、転移性がんを有するかまたは発症するリスクを有していてもよく、処置は、そのようながんを処置または予防するために実施することができる。

組換えＨＳＶワクチン
また、本明細書で開示されているように、ＨＳＶｇＥおよびｇＩは、受動的ＡＤＣＣを増強し、ＦｃγＲ保持免疫細胞によるＨＳＶ１感染のクリアランスを促進する。したがって、ｇＥおよびｇＩをコードするＨＳＶＵｓ７およびＵｓ８遺伝子を含むウイルスベクターを含むＨＳＶワクチンが開示される。こうした遺伝子は、感染細胞におけるｇＥおよびｇＩのより初期のならびに／またはより高度な発現を促進して受動的ＡＤＣＣを促進する発現制御配列に、一緒にまたは独立して作動可能に接続されていてもよい。

一部の実施形態では、ベクターは、弱毒化ＨＳＶベクターである。遺伝子配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築するための方法は、十分に確立されており、以前に記載されている（Kambaraら、２００５年、Cancer Res.６５巻、２８３２〜９頁）。こうした方法としては、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技法は、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press、Plainview, N.Y.、１９８９年）、およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons、New York, N.Y.、１９８９年）に記載されている。

発現ベクターは、一般的には、挿入されたコード配列を翻訳および／または転写するためのエレメントに必要な調節配列を含有する。例えば、コード配列は、所望の遺伝子産物の発現制御を支援するために、好ましくは、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されている。

バイオテクノロジーで使用されるプロモーターは、目的とするタイプの遺伝子発現の制御によってタイプが異なる。それらは、一般的には、構成的プロモーター、組織特異的または発生段階特異的プロモーター、誘導可能なプロモーター、および合成プロモーターに分割することができる。エンハンサーは、転写開始部位から一定の距離になくとも機能し、転写単位の５’または３’のいずれにあってもよいＤＮＡの配列である。さらに、エンハンサーは、同様にコード配列自体内にあってもよい。それらは、通常は、長さが１０〜３００ｂｐであり、シスで機能する。エンハンサーは、付近のプロモーターからの転写を増加させるように機能する。また、エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する場合が多い。プロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する場合が多い。エンハンサーは、遺伝子発現の調節を決定することが多い。今では、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）に由来する多数のエンハンサー配列が公知であるが、一般的な発現には、典型的には、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーが使用されるだろう。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。

好ましい実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーなどの前初期（ＩＥ）プロモーター、またはＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチンプロモーターなどである。

処置
本開示の組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたは別様に望ましくないわけでない材料を意味し、つまり、そうした材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こさずに、またはそれが含有されている医薬組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに、対象に投与することができる。担体は、当業者であれば周知であるように、活性成分のあらゆる分解を最小限に抑え、対象でのあらゆる有害副作用を最小限に抑えるように選択される。

本明細書で開示されるポリペプチドまたはウイルスベクターを、投与用に調製する場合、それを、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、医薬製剤または単位剤形を形成することができる。そのような製剤中の合計活性成分は、製剤の０．１から９９．９重量％までを含む。「薬学的に許容される」物質は、製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに有害ではない担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩である。投与するための活性成分は、粉末として、または顆粒として、溶液として、懸濁物として、またはエマルジョンとして存在してもよい。

ベクターまたはポリペプチド（活性成分）は、生物の体内で活性成分と作用剤の作用部位との接触を生成する任意の手段により様々な疾患状態を処置するために、製剤化および投与することができる。それらは、個々の治療活性成分または治療活性成分の組合せのいずれかとして、医薬品との併用に利用可能な任意の従来手段により投与することができる。それらは単独で投与してもよいが、一般的には、選択された投与経路および標準的医薬慣習に基づき選択される医薬担体と共に投与される。

一般的には、水、好適な油、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）、および関連糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、非経口溶液に好適な担体である。非経口投与用の溶液は、活性成分、好適な安定化剤、および必要に応じて緩衝物質を含有する。重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、またはアスコルビン酸などの抗酸化剤は、単独でまたは組合せのいずれでも、好適な安定化剤である。また、クエン酸およびその塩ならびにエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）が使用される。加えて、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、およびクロロブタノールなどの保存剤を含有していてもよい。好適な医薬担体は、当分野における標準的参考教科書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。

加えて、標準的な薬学的方法を採用して、作用持続時間を制御することができる。それらは、当技術分野で周知であり、制御放出調製物が挙げられ、適切な巨大分子、例えば、ポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミンを挙げることができる。巨大分子の濃度および組込み法を調整して、放出を制御することができる。加えて、作用剤は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、またはエチレンビニルアセテートコポリマーなどのポリマー材料の粒子に組み込むことができる。組込みに加えて、こうした作用剤を使用して、化合物をマイクロカプセル内に封入することもできる。

本明細書で開示される治療剤を含む医薬製剤は、周知であり容易に入手可能な成分を使用して、当技術分野で公知の手順により調製することができる。また、治療剤は、例えば、筋肉内、皮下、または静脈内経路により非経口投与に適切な溶液として製剤化することができる。また、治療剤の医薬製剤は、水溶液もしくは無水溶液または分散物の形態で、あるいはその代わりにエマルジョンまたは懸濁物の形態を取ることができる。

医薬組成物を含む、本明細書で開示される組成物は、局所的処置が所望であるかまたは全身性処置が所望であるか、および処置しようとする面積に応じて、様々な様式で投与することができる。こうした非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、局所的、経皮的、および経口投与は、単一用量または反復投与で行われてもよい。本明細書で開示されるベクターまたはポリペプチドは、モノクローナル抗体および静脈内ＩｇＧなどの他の治療剤と組み合わせて投与してもよい。

本明細書で使用される場合、処置、処置する、または処置することという用語は、疾患もしくは状態または疾患もしくは状態の症状の影響を低減する方法を指す。したがって、本開示の方法では、処置は、確立されている疾患もしくは状態または疾患もしくは状態の症状の重症度の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減を指す場合がある。例えば、疾患を処置するための方法は、対照と比較して、対象の疾患の１つまたは複数の症状に１０％低減がある場合、処置であるとみなされる。したがって、低減は、天然または対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意のパーセントの低減であってもよい。処置は、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の治癒あるいは完全な消失を、必ずしも指すとは限らないことが理解される。

本明細書で使用される場合、疾患または障害を予防する、予防すること、および予防という用語は、対象が、疾患または障害の１つもしくは複数の症状を示し始める前、または示し始めるのとほぼ同時に生じ、疾患または障害の１つもしくは複数の症状の発症または悪化を阻害あるいは遅延させる行為、例えば、治療剤の投与を指す。本明細書で使用される場合、減少、低減、または阻害への言及は、対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きな変化を含む。そのような用語は、完全な消失を含む場合があるが、必ずしも含むとは限らない。

医薬組成物は、対象における他の治療後に、治療前に、治療の代わりに、または治療と組み合わせて与えてもよい。対象には、免疫応答を刺激するために、ワクチンまたは他の組成物が投与されていてもよい。

ポリペプチドを製作する方法
本明細書で開示されるポリペプチドを発現するように操作された細胞が提供される。操作された細胞は、細胞培養で増幅させることができる（例えば、生体動物の一部であること（「ｉｎｖｉｖｏ」）とは対照的に）。例えば、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、またはヒト細胞、またはマウスハイブリドーマ細胞であってもよい。本明細書で開示されるポリペプチドの発現に使用することができる他のタイプの細胞の例としては、以下のものが挙げられる：マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳＯ）、ヒト胚腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）、サル腎細胞（例えば、ＣＯＳ）、ヒト上皮癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト線維肉腫細胞（例えば、ＨＴ−１０８０）、ベビーハムスター腎細胞、酵母細胞、および昆虫細胞など（例えば、Fernandezら（編）、Gene Expression Systems、Academic Press、１９９９年を参照）。本開示のポリペプチドおよび適切な培養条件と適合する任意の細胞を使用することができる。

ＦｃγＲおよびＦｃ結合ドメインタンパク質に同時に結合するものなどのポリペプチドを製作する方法は、当技術分野で公知である。採用することができる１つの方法は、Kohler, G.ら、（１９７５年）Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity」、Nature ２５６巻：４９５〜４９７頁の方法、またはその変法である。一実施形態では、そのような活性化受容体を発現する免疫エフェクター細胞または免疫エフェクター細胞の表面に存在するタンパク質と相互作用する所望のポリペプチドは、そのような分子を過剰発現する宿主細胞を使用して得られる。

また、本開示のポリペプチドに対する、それらの特性に著しい影響を及ぼさない修飾、および活性を増強または減少させている変異体が開示される。ポリペプチドの修飾は、当技術分野の日常的な業務であり、本明細書で詳細に記述する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能的活性を著しく有害には変化させないアミノ酸の１つもしくは複数の欠失または追加を有するポリペプチド、あるいは化学類似体の使用が挙げられる。互いに保存的に置換することができるアミノ酸残基としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リジン／アルギニン；およびフェニルアラニン／チロシン（tryosine）。また、こうしたポリペプチドとしては、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに例えば、様々な糖によるグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの他の翻訳後修飾を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は、保存的であろう。つまり、置換されるアミノ酸は、元のアミノ酸の化学的特性と同様の化学的特性を有するだろう。そのような保存的置換は、当技術分野で公知であり、例は、上記に提供されている。他の修飾方法としては、これらに限定されないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含む、当技術分野で公知のカップリング技法を使用することが挙げられる。修飾は、例えば、ラジオイムノアッセイのための放射性部分の付着など、イムノアッセイのための標識の付着に使用することができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立されている手順を使用して製作し、当技術分野で公知の標準的アッセイを使用してスクリーニングすることができる。

また、本発明は、本開示のポリペプチドに由来する１つもしくは複数の断片または領域を含む融合タンパク質を包含する。一実施形態では、ＩｇＧＦｃ領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。

本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を使用して便利に調製することができる（Merrifield, B.（１９８６年）「Solid Phase Synthesis」、Science ２３２巻（４７４８号）：３４１〜３４７頁；Houghten, R.A.（１９８５年）General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids」、Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)８２巻（１５号）：５１３１〜１３５頁；Ganesan, A.（２００６年）「Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century」、Mini Rev. Med. Chem.６巻（１号）：３〜１０頁）。

本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を採用したトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、ベクターが、ワクシニアウイルスなどの感染因子である場合）を含む、多くの適切な手段のいずれかにより、宿主細胞に導入することができる。ベクターを導入するかまたはポリヌクレオチドを導入するかの選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存することになる。

異種性ＤＮＡを過剰発現することが可能な任意の宿主細胞を、本開示のポリペプチドをコードする遺伝子を単離する目的に使用することができる。好適な哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。

本発明の多くの実施形態が記載されている。しかしながら、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、種々の改変をなすことができることが理解されるだろう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

（実施例１）免疫認識における免疫グロブリンＧの新規機能。
物質および方法
ウイルス、細菌、抗体、およびタンパク質。ＨＳＶ１Ｆ株は、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．から購入した。Ｕｓ８欠損ＨＳＶ１Ｆの生成は、以前に記載されている（Suenagaら、２０１４年、Microbiology and Immunology ５８巻、５１３〜５２２頁）。Ｒ８４１１、ルシフェラーゼを発現するＨＳＶ１Ｆ株は、Bernard Roizmanにより提供された（Zerboniら、２０１３年、J Virol ８７巻、２７９１〜２８０２頁）。野生型（ＷＴ）ｎｅｗｍａｎ株（ＡＴＣＣ、２５９０４）およびプロテインＡ欠損（Ｓｐａ−）ｎｅｗｍａｎは、Timothy Frost博士（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）から譲り受け、トリプシン大豆ブロス中で増殖した（Patelら、１９８７年、Infect Immun ５５巻、３１０３〜３１１０頁）。ＣＤ３（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ１４（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１９（ＨＩＢ１９）、ＣＤ５６（Ｎ９０１）、ＣＤ１６ａ（３Ｇ８）、ＣＤ２５３（ＲＩＫ２）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ５６）、ＣＤ１０７ａ（Ｈ４ａ３）、ＣＤ３ζ（ｐＹ１４２）（Ｋ２５−４０７．６９）、ＣＤ３ζ（６Ｂ１０．２）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ２７（ＬＧ．３Ａ１０）ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＮＫｐ４６（２９Ａ１．４）、抗ＨＳＶ１ｇＥ（９Ｈ３）、抗ＨＳＶ１ｇＣ（１Ｃ８）、および抗ＨＳＶ１ｇＢ（Ｔ１１１）に特異的な抗体は、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ；ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡから購入した。抗ＨＳＶ１ｇＤ（ＩＤ３）は、Roselyn J. EisenbergおよびGary Cohenにより提供された。抗ＨＳＶ１ｇＥ（９Ｈ３）は、Ａｂｃａｍから購入した。ビオチン化ＣＤ１６ａおよびＨｕＩｇＧ１Ｆｃは、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａから購入し、ＩｇＧ１Ｆｃ（ΔＣＤ１６）は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃａａ２６２〜４６６（配列番号２）を、ＩＬ２シグナルペプチドの後にｐＦｕｓｅベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローニングし、ＢＨＫ細胞で発現させ、プロテインＡアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して精製することにより製作した。ＨＳＶ１特異的抗体を含有する、プールされたヒトＩｇＧ（ＧａｍａＳｔａｎ、ＧｒｉｆｏｌｓＵＳＡ、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ）は、オハイオ州立大学薬局、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨから購入した。

ヒトＩｇＧＦｃ（１２７２４、ＳｃｒｉｐｐｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）は、Ｆａｂを含有せず、Ｕｓ８−ＨＳＶ１ウイルスに感染した細胞に結合しないことが検証された。リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）およびダラザレックス（ＪａｎｓｓｅｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）は、オハイオ州立大学薬局から購入した。

ＨＳＶ１遺伝子のクローニング。個々のＨＳＶ１遺伝子を、それぞれ５’末端がＳｐｅＩ部位および３’末端がＰａｃＩ部位に隣接する遺伝子特異的プライマーを用いて、ＨＳＶ１Ｆ株ＤＮＡ（配列受託番号：ＧＵ７３４７７１）から増幅し（例えば、配列番号２５、２７〜１７０）、従来法を使用してｐＣＤＨベクター（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、ＣＤ５１０Ｂ）にクローニングした。

ヒト神経膠腫スフェアの培養およびトランスフェクション。神経膠腫細胞は、原発性ヒト脳腫瘍に由来し、Ｂ２７（１：５０）、ヘパリン（５ｕｇ／ｍＬ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）（２０ｎｇ／ｍＬ）、およびＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）で補完されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、以前に記載されているように増殖した（Maoら、２０１３年、Proc Natl Acad Sci USA １１０巻、８６４４〜８６４９頁）。別様に注記されていない限り、本研究の全体にわたって＃８３神経膠腫細胞を使用した（Maoら、２０１３年、Proc Natl Acad Sci USA １１０巻、８６４４〜８６４９頁）。１回の単一トランスフェクション毎に、１０００万個の神経膠腫細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１回洗浄し、１００μｌの塩基性ヌクレオフェクター溶液（ＬｏｎｚａＩｎｃ．、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）に再懸濁した。その後、細胞懸濁物を、６μｇのＨＳＶ１遺伝子発現用プラスミドと混合し、プログラムＡ３３（ＡｍａｘａＧｍＢＨ、Ｋｏｅｌｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を、直ちに１ｍｌ培地と混合し、補完剤をすべて有する４ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する６−ウェルプレートのうちの１つのウェルに移した。

異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解。トランスフェクションの２４時間後、神経膠腫細胞を再懸濁し、５０ｇで５分間遠心分離して、細胞残屑および死細胞を除去した。その後、１×１０^４個の神経膠腫細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に再懸濁し、Ｕ底９６−ウェルプレートの各ウェルに播種した。精製ヒトＮＫ細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で補完されたＲＰＭＩ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に、５×１０^６／ｍｌ培地の終濃度になるように再懸濁し、１００μｌのＮＫ細胞を、トランスフェクト神経膠腫細胞を有する培養に添加した。並列対照実験では、ヒトＮＫ細胞の代わりに、１０％ＦＢＳで補完された１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地を、播種した神経膠腫細胞に添加した。培養の５時間で、ＬＳＲＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して培養試料を収集した。生神経膠腫細胞を、それらの前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）に基づいてゲート制御して取り込み、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを測定した。

個々のウイルス遺伝子の発現が寄与する示差的細胞傷害を、下記式で算出した。
式中、ΔＧＦＰ＝ＧＦＰの変化、
ＧＦＰ％（＋ｎｋ）＝ＮＫ細胞の存在下でのＧＦＰのパーセンテージ、
ＧＦＰ％（−ｎｋ）＝ＮＫ細胞の非存在下でのＧＦＰのパーセンテージ

ウイルス産生、精製、および不活化。ベロ細胞を、１００ｍｍの１皿当たり７×１０^６細胞の密度で播種し、１細胞当たり２．５ｐｆｕのＨＳＶ−１Ｆ株または＃３０突然変異体を接種した（Suenagaら、２０１４年、Microbiology and Immunology ５８巻、５１３〜５２２頁）。接種の２４時間後に、培養培地および細胞残屑を収集した。凍結融解サイクルを３回行ってウイルスを放出させた後、細胞残屑を、低速遠心分離（２，０００×ｇで５分間）により除去し、試料を、５ｍｌの３５％スクロース勾配に負荷し、ＢｅｃｋｍａｎＳＷ２７ローターにて、２５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。ウイルスペレットを収集し、洗浄し、ＰＢＳで濃縮した。ウイルスを不活化するため、精製ＨＳＶ１ウイルスを、０．２％Ｔｒｉｔｉｏｎ−１００で３０分間処置した。不活化ウイルスを、プレートにコーティングするために、０．１ｕｇ／ｍｌに希釈した。

プラークアッセイ。手短に言えば、連続希釈したウイルスを単層のベロ細胞に負荷し、３７℃でインキュベートし、１時間後に、プールしたヒトＩｇＧ（終濃度０．１％）を添加して、ウイルス蔓延を制限した。培養４８時間後に、プラークを計数した。ＨＳＶ１の感染性に対するヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧＦｃ、リツキシマブ、ダラツムマブ、およびヒトＩｇＧの効果を決定するために、１ｕｇ／ｍｌのこうした試薬を、連続希釈したウイルスに添加し、プラークアッセイする前に室温で３０分間インキュベートした。処置したウイルスを、標準的プラークアッセイで力価測定し、結果をすべて、ＰＢＳ対照に対して正規化した。

ヒトＮＫ細胞単離および刺激条件。本明細書で使用されるＮＫ細胞はすべて、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐカクテル（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、以前に記載されているように使用して（Yuら、２０１０年、Blood １１５巻、２７４〜２８１頁）、健康なドナーの末梢血ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（ＡｍｅｒｉｃａｎＲｅｄＣｒｏｓｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から新たに濃縮した。５０万個の単離ヒトＮＫ細胞を、培地で、または５ｕｇ／ｍｌプロテインＡまたはプロテインＧで補完された培地で、刺激の前に３０分間インキュベートした。１×１０^５個の感染もしくはトランスフェクト神経膠腫細胞またはＫ５６２細胞を、５×１０^５個のＮＫ細胞との培養に使用した。ＣＤ１０７ａ染色はすべて、細胞培養の開始時にＣＤ１０７ａ抗体を添加した。平底９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、４℃にて一晩、５０ｕｌのプロテインＡ（０．１ｕｇ／ｕｌ）、プロテインＧ（０．１ｕｇ／ｕｌ）、またはｗｔ、またはＵｓ８−ＨＳＶ１Ｆ（０．１ｕｇ／ｕｌ）でコーティングした。

クロム放出細胞傷害性アッセイ。神経膠腫細胞を、３７℃で９０分間、５０μＣｉ^５１Ｃｒ中で５×１０^５細胞をインキュベートすることにより標識した。放射性同位体標識細胞を、３回洗浄し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、５×１０^４細胞／ｍｌの濃度にてＵ底９６−ウェルプレートに三重重複で播種した。一部の場合では、抗体またはＩｇＧ産物（５ｕｇ／ｍｌ）を、放射性同位体標識標的細胞に添加し、ある特定の相互作用を結合または阻止するために氷上で３０分間インキュベートした。エフェクター細胞を、指定のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ、図１Ｄのｘ軸）で添加し、３７℃で４〜６時間インキュベートした。その後、細胞溶解を、以前に記載されているように（Daiら、２０１７年、Immunity、４７巻、１５９〜１７０頁））測定および算出した。

ＣＤ３ζリン酸化染色。５０万個のＮＫ細胞を、３７℃で１時間休止させ、その後、Ｈ_２Ｏ_２（１１ｍＭ）、ＩＬ１２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ１８（１０ｎｇ／ｍｌ）、２×１０^５個のトランスフェクト神経膠腫細胞、または１×１０^８ｃｆｕの細菌で１時間刺激した。ＮＫ細胞を、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ固定緩衝液Ｉ（ＢＤ）を使用して固定し、Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）で透過処理し、通常のマウス免疫グロブリンでブロッキングし、その後、抗ＣＤ３ζ（ｐＹ１４２）および抗ＣＤ３ζ抗体で染色した。すべての染色ステップで、ホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を補完した。

ｇＥ−Ｆｃ−ＣＤ１６ａ複合体およびプロテインＡ−Ｆｃ−ＣＤ１６ａ複合体のモデル化構造。ｇＥ−Ｆｃ（ＲＣＳＢＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋＩＤ：ＰＤＢＩＤ：２ＧＪ７）およびＣＤ１６ａ−Ｆｃ（ＲＣＳＢＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋＩＤ：ＰＤＢＩＤ：ＩＥ４Ｋ）のドッキング予測を、ＺＤＯＣＫオンラインサーバーで実施した。ｇＥ−Ｆｃの場合、ｇＥサブユニットのみをサーバーにアップロードし、残基２２５、２４５〜２４７、２４９〜２５０、２５６、２５８、３１１、３１６、３１８〜３２２、３２４、および３３８〜３４２を、接触残基として指定した（Patelら、１９８７年、Infect Immun ５５巻、３１０３〜３１１０頁）。ＣＤ１６ａ−Ｆｃの場合、Ｆｃ（配列番号１１）の残基２５２〜２５８、３０７、３０９〜３１１、３１４〜３１５、３８２、４２８、および４３３〜４３６を、接触残基として指定した（Patelら、１９８７年、Infect Immun ５５巻、３１０３〜３１１０頁）。

ＣＤ１６ａ結合。トランスフェクト神経膠腫細胞または細菌を、まず、ＩｇＧ１Ｆｃ（ΔＣＤ１６）、ＩｇＧ１Ｆｃ（ＳｃｒｉｐｐｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、リツキシマブ、またはｈｕＩｇＧ（ＧａｍａＳｔａｎ、Ｇｒｉｆｏｌｓ）を含むまたは含まないＰＢＳと共に氷上で３０分間それぞれインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、試料をビオチン化ＣＤ１６ａと共に氷上でインキュベートし、２０分後にａｐｃ−ストレプトアビジン（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）を添加し、試料をさらに２０分間氷上で維持した。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、細胞または細菌を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）で直ちに調べた。

マウス実験。８〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣＩＴＹ）を、すべての研究に使用した。生存研究の場合、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３×１０^６ｐｆｕＨＳＶ１Ｆ株ウイルスを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ウイルス負荷の４時間前、ならびにウイルス負荷の２４時間後および７２時間後に、ＰＢＳ、２００μｇヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２００ｕｇヒトＩｇＧＦｃ（ＳｃｒｉｐｐｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、２００μｇリツキシマブ、または２００μｇダラザレックスを、ｉ．ｐ．注射で与えた。ウイルス量を追跡するための生物発光イメージングのため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１．２×１０^５ｐｆｕのＲ８４１１ウイルスをｉ．ｐ注射した（Zerboni, Lら、J Virol ８７巻、２７９１〜２８０２頁（２０１３年））。ヒトＩｇＧ１によるＨＳＶ１のクリアランスを研究するために、ウイルス負荷の４時間前に、およびウイルス負荷の２４時間後に、２００μｇリツキシマブをＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｐ注射した。イソフルラン麻酔の１０分前に、３ｍｇルシフェリンカリウムを各マウスに与え、一貫した光子フラックスを保証した。感染の１８時間後および８４時間後に、ＩＶＩＳスペクトル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して画像を得た。各群の４つの区画を２分間の露出で記録した。全マウスの生物発光値を測定し、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ４．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、光子フラックス（光子／ｓ）として算出した。ｉｎｖｉｖｏでのＮＫ細胞に対するプロテインＡの効果を研究するため、４０μｇのシリコーンビーズおよびプロテインＡコンジュゲートビーズ（ＡｌｐｈａＢｉｏ、ＲａｃｈｏＳａｎｔａＭａｒｇａｒｉｔａ、ＣＡ）をマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。このビーズ接種が完了した２４〜４８時間後、血液、脾臓、および肺を収集し、これら組織から単核細胞を単離し、マウス抗原に対する抗体を使用して染色した。ｉｎｖｉｔｒｏマウスＮＫ細胞刺激および細胞傷害性の場合、ＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を、製造業者の使用説明書に従って使用して、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓からＮＫ細胞を濃縮した。

統計。２試料ｔ検定を使用して、２つの独立群を比較し、対応ｔ検定を使用して、２つの対応群を比較した。原分布が非正規だった場合、データ変換を実施した。３つまたはそれよりも多くの群を比較する場合、線形混合モデルを使用して、同じドナーからの反復測定による共分散構造を考慮に入れた。多重比較の場合、Ｈｏｌｍの手順によりＰ値を調整した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。実験は、少なくとも３回またはそれよりも多く繰り返した。データは、平均±ＳＥＭとして表示されている。

結果
異所性遺伝子発現により媒介される示差的細胞溶解（ＤＣ−ＭＥＧＥ）により、ＨＳＶ１ｇＥが、ヒトＮＫ細胞活性化因子であると特定された。

ＨＳＶ１ゲノムは、７４個の固有ウイルスタンパク質をコードする８４個のオープンリーディングフレームを含有する（Szparaら、２０１０年、J Virol ８４巻、５３０３〜５３１３頁）。しかしながら、免疫認識または回避におけるそれらの役割については、それらのごく少数しか研究されていない（Imaiら、２０１３年、PLoS One ８巻、ｅ７２０５０頁；Chisholmら、２００７年、The Journal of Infectious Diseases １９５巻、１１６０〜１１６８頁；HuardおよびFruh、２０００年、Eur J Immunol ３０巻、５０９〜５１５頁）。ヒトＮＫ細胞とＨＳＶ１との間の相互作用に関する包括的な理解を獲得するために、単一のＨＳＶ１遺伝子を発現する神経膠腫細胞に対して、ＮＫ細胞がどのように応答するかを測定するためにＤＣ−ＭＥＧＥを開発した（図１Ａ）。各ＨＳＶ１遺伝子を、「自己切断性」Ｔ２ａ配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流にクローニングした。その結果として、蛍光は、ウイルスタンパク質発現を明らかにする（Szymczakら、２００４年、Nat Biotechnol ２２巻、５８９〜５９４頁）。神経膠腫細胞に、個々のＨＳＶ１遺伝子をトランスフェクトし、その後、新たなヒトＮＫ細胞を用いてまたは用いずに培養した。ＧＦＰ＋生神経膠腫細胞のパーセンテージを、ＮＫ細胞が存在する場合はＧＦＰ（＋ＮＫ）％として、または神経膠腫細胞が単独で培養された場合はＧＦＰ（−ＮＫ）％として、並行して記録した。ＨＳＶ１ウイルスタンパク質の発現が、神経膠腫細胞をＮＫ細胞細胞溶解に対して感受性にした場合、ＧＦＰ＋神経膠腫細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞により死滅されるため、ＧＦＰ（＋ＮＫ）％は、ＧＦＰ（−ＮＫ）％よりも低くなり、またはＨＳＶ１ウイルスタンパク質が、神経膠腫細胞をＮＫ細胞細胞溶解に対して耐性にした場合は、その逆である（図１Ａ）。ＤＣ−ＭＥＧＥアッセイを適用して、６５個のＨＳＶ１遺伝子をスクリーニングし、ＵＬ１２、ＵＬ３０、Ｕｓ３、Ｕｓ８、およびＵｓ１２を発現する神経膠腫細胞は、ＮＫ細胞細胞溶解に対してより感受性だったが、ＵＬ４８、Ｕｓ５、またはＵｓ６の発現は、神経膠腫細胞をＮＫ細胞細胞溶解に対して耐性にしたことを実証した（図１Ｂおよび１Ｃ）。

ＨＳＶ１Ｕｓ８は、単独では、低親和性ヒトＩｇＧＦｃ受容体であり、ＣＨ２−ＣＨ３インターフェースでヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４に結合するｇＥをコードする（Spragueら、２００６年、PLoS Biol ４巻、ｅ１４８頁）。ＤＣ−ＭＥＧＥ結果を、図１Ｄに示されているように、ヒト間葉神経膠腫細胞株＃１１２３およびヒト前神経神経膠腫細胞株＃８４に対する^５１Ｃｒ放出アッセイを使用して検証した（Maoら、２０１３年、Proc Natl Acad Sci USA １１０巻、８６４４〜８６４９頁）。また、Ｕｓ８を発現する神経膠腫細胞（以降、神経膠腫Ｕｓ８と呼ぶ）は、ヒト初代ＮＫ細胞を誘導して、ＩＦＮ−γを分泌し（図１Ｅ）、ＣＤ６９およびＣＤ１０７ａを発現し（図１Ｆ）、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６ａを切断した（図１Ｇ）。これらは、活性化ヒトＮＫ細胞の特徴的な表現型である。神経膠腫Ｕｓ８に対するＮＫ細胞傷害性は、ｇＥ特異的マウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）により弱毒化された（図１ｈ）。野生型（ｗｔ）ＨＳＶ１Ｆ株ウイルス（ｇＥは、その主なタンパク質成分である）およびＵｓ８が標的化欠失された突然変異体ＨＳＶ１Ｆ株（Ｕｓ８⁻）（Suenagaら、２０１４年、Microbiology and Immunology ５８巻、５１３〜５２２頁）を精製した。ＮＫ細胞を、不活化純粋ウイルスでコーティングされたプレートで培養した。ＮＫ細胞は、野生型（ｗｔ）によってのみ活性化され、Ｕｓ８⁻Ｆ株ウイルスでは活性化されなかった（図１Ｉ、６）。また、ｗｔＨＳＶ１によるＮＫ細胞の活性化も、抗Ｕｓ８抗体により阻害された（図１Ｉ、６）。まとめると、こうした結果は、ｇＥとヒトＮＫ細胞との間の直接的相互作用が、ＮＫ細胞の機能増強に寄与したことを実証した。

ヒトＩｇＧは、ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を関連付ける。ＨＳＶ１ｇＥは、ＨＳＶ１Ｕｓ７によりコードされる糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）とヘテロダイマーを形成することができる。その結果生じるｇＥ／ｇＩ複合体は、ヒトＩｇＧに対する高親和性ウイルスＦｃ受容体である（Spragueら、２００６年、PLoS Biol ４巻、ｅ１４８頁；Johnsonら、１９８８年、J Virol ６２巻、１３４７〜１３５４頁）。Ｕｓ７（以降、神経膠腫Ｕｓ７）を発現する神経膠腫細胞は、ＮＫ細胞を活性化しなかった（図１Ｂ、１Ｃ、２Ａ、２Ｂ）。しかしながら、Ｕｓ７およびＵｓ８を両方とも発現する神経膠腫（神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８）は、神経膠腫Ｕｓ８よりも非常により強力にＮＫ細胞を活性化した（図２Ａ、２Ｂ、７）。これは、ｇＥのＩｇＧ結合機能が、ＮＫ細胞活性化に関与し得ることを示唆する。

神経膠腫−ＮＫ細胞共培養には、ヒトＩｇＧを補完しなかったが、ＩｇＧ分子は、初代ヒトＮＫ細胞の表面に天然で存在することが示された（図２Ｃ）。ＮＫ細胞を、酢酸）でｐＨ４．０に調整した酸性培地（１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０）で手短に洗浄することにより、表面ＩｇＧが減少し（図２Ｃ）、ＣＤ１６ａの同じ結合部位をヒトＩｇＧと競合する抗ヒトＣＤ１６抗体（３Ｇ８）（Perussiaら、１９８４年、J Immunol １３３巻、１８０〜１８９頁）の結合が増加した（図２Ｄ）。これは、ＩｇＧ分子が、ＣＤ１６ａを介してヒトＮＫ細胞に係留されることを実証する。ＮＫ細胞に加えて、Ｂ細胞、単球、および顆粒球は、細胞表面からほとんどのＩｇＧが除去された酸性培地処置により明らかにされたように、天然では非共有結合によりヒトＩｇＧ分子で被覆されていることが示された（図２７Ａ）。こうした表面ＩｇＧ分子は、プロテインＡ結合のための相互作用部位を提供する（図２７Ｂ）。様々な健康ヒトドナーに由来する初代ＮＫ細胞は、非常に異なるレベルの表面ＩｇＧを有し（図２Ｅ）、刺激に対するそれらの応答は様々だった（図２Ｆおよび８）。神経膠腫Ｕｓ８に対するヒトＮＫ細胞の応答（ＣＤ６９＋またはＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞のパーセンテージにより測定された）は、表面ＩｇＧのレベルと相関した。この相関性は、ＮＫ細胞を神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８と共に培養した場合、さらにより強くなった（図２Ｇ）。対照的に、ＭＨＣＩ分子に陰性の白血病細胞であり、ＮＫ細胞の活性化制御に広く使用されているＫ５６２細胞に対するＮＫ細胞の応答は、表面ＩｇＧとの相関性を示さなかった（図２Ｇ）。まとめると、ヒトＩｇＧは、ｇＥおよびＮＫ細胞活性化を関連付けることが示された。

ＣＤ１６ａ、ＩｇＧＦｃ、およびＨＳＶ１ｇＥは、ＮＫ細胞活性化に不可欠な三成分複合体を形成する。ＩｇＧＦｃ上のヒトＣＤ１６ａ結合部位は、ｇＥがＩｇＧに結合するＣＨ２−ＣＨ３インターフェースから遠く離れて位置しており（Sondermannら、２０００年、Nature ４０６巻、２６７〜２７３頁；Spragueら、２００６年、PLoS Biol ４巻、ｅ１４８頁）、ＩｇＧ、ｇＥ、およびＣＤ１６ａが三成分複合体を形成することができるという仮説に結び付く。公知のｇＥ−ＩｇＧＦｃおよびＣＤ１６ａ−ＩｇＧＦｃ結晶構造を使用した構造モデル化は、ｇＥおよびＣＤ１６ａが、互いに干渉せずに同じＩｇＧＦｃ分子に結合することができるという結論を支持した（図３Ａ）。そのようなＣＤ１６ａ−ＩｇＧＦｃ−ｇＥ複合体の存在を検証するため、実験を実施して、ＣＤ１６ａの細胞外ドメインが、様々なヒトＩｇＧ産物の存在下で神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に結合することができるか否かを決定した。ＩｇＧ１Ｆｃ（ΔＣＤ１６）は、ＣＤ１６ａ結合部位を有していない組換えヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片であり、ＩｇＧ１Ｆｃは、インタクトなＣＤ１６ａ結合部位を有する。結晶構造（図３Ａ）と一致して、ＣＤ１６ａ結合部位は、ＩｇＧ１Ｆｃ（ΔＣＤ１６）およびＩｇＧ１Ｆｃが両方とも神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に効率的に結合したため、ＦｃとＨＳＶ１ｇＥとの結合に役割を果たさなかった（図３Ｂ、左および中央左）。ＣＤ１６ａと神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８との間には直接的相互作用は存在しなかったが（図３Ｃ左）、ＣＤ１６ａは、ＩｇＧ１Ｆｃが存在した場合、神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に結合することが見出された。この相互作用は、ＩｇＧ１Ｆｃ上のＣＤ１６ａ結合部位に依存していた（図３Ｃ中央左および中央）。したがって、ＣＤ１６ａ−ＩｇＧＦｃ−ｇＥ複合体の形成が証明された。

ヒトＨＳＶ１特異的ＩｇＧは、ｇＥまたはｇＩを特異的に認識する抗体を含有し（図３Ｂ、中央右）、その存在は、ＣＤ１６ａが、ＣＤ１６ａと抗原−抗体複合体との間の古典的相互作用を介して、ＨＳＶ１遺伝子を発現する神経膠腫細胞と結合することを可能にした（図３Ｃ、中央右）。また、リツキシマブ（ヒトＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）（Edwardsら、２００４年、N Engl J Med ３５０巻、２５７２〜２５８１頁）（図３Ｂおよび３Ｃ、右）またはＵｓ８−ＨＳＶ１もしくは野生型ＨＳＶ１に感染した神経膠腫細胞（図３Ｄ）を使用して、同様のＣＤ１６ａ結合試験を実施した。それにより、ＣＤ１６ａ、ＩｇＧＦｃ、およびＨＳＶ１ｇＥが三成分複合体を形成したことが再び確認された。さらに、ＮＫ細胞をＨ_２Ｏ_２で刺激したか（陽性対照）、または神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８を用いたが、ＩＬ１２＋ＩＬ１８を用いずに培養した場合、ＣＤ３ζのリン酸化が特異的に生じた（図３Ｅ）。これにより、ｇＥが、ＣＤ１６ａ−ＣＤ３ζ軸を介してＮＫ細胞を活性化したことが実証された。

ＩｇＧ結合タンパク質であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡおよびＧ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のプロテインＧは、主に、ＣＨ２−ＣＨ３インターフェースでＩｇＧに結合する（Sauer-Erikssonら、１９９５年、Structure ３巻、２６５〜２７８頁；Deisら、２０１５年、Proc Natl Acad Sci USA １１２巻、９０２８〜９０３３頁）。プロテインＡおよびプロテインＧは、ＮＫ細胞の膜に存在するＩｇＧを介して初代ヒトＮＫ細胞にも結合することが示された（図３Ｆおよび３Ｇ）。これは、初代ＮＫ細胞を被覆する表面ＩｇＧが、ｇＥの結合に十分にアクセス可能だったことも示唆する。ＨＳＶ１ｇＥによるＮＫ細胞活性化にＩｇＧが不可欠であることを試験するため、初代ヒトＮＫ細胞を、過剰量のプロテインＡまたはプロテインＧと共にインキュベートして、様々な刺激と共にＮＫ細胞を培養する前に、ＣＨ２−ＣＨ３インターフェースをすべて塞いだ。プロテインＡまたはプロテインＧと共にプレインキュベーションすることにより、ｇＥによるＮＫ細胞の機能増強がすべて阻害された（図３Ｈ〜３Ｊおよび９）。この処置は、Ｋ５６２細胞またはＩＬ１２＋ＩＬ１８に対するヒトＮＫ細胞の応答を変化させなかった（図９）。加えて、純粋な不活化ｗｔＨＳＶ１ウイルスでコーティングされたプレートは、プロテインＡまたはプロテインＧでプレインキュベートしたＮＫ細胞をもはや活性化することができなかった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。まとめると、こうした結果は、ＩｇＧＦｃが、ＮＫ細胞と、ＨＳＶ１ｇＥを発現する標的細胞との間の相互作用を架橋して、ＮＫ細胞活性化をもたらしたという結論を支持した。

受動的ＡＤＣＣは、ｉｎｖｉｖｏでＨＳＶ１感染のクリアランスを促進する。ｇＥによるヒトＮＫ細胞活性化は、もっぱらＩｇＧＦｃにより架橋され、抗原特異的抗体を必要としない点で古典的ＩｇＧ機能とは異なる、これまで認識されていない免疫刺激機序である（図３Ｋ）。このタイプのＮＫ細胞活性化を、受動的ＡＤＣＣと命名した（図３Ｋ）。上記の実験はすべて、ヒトＩｇＧを相互作用に添加せずに実施し、ｇＥによるＮＫ細胞活性化は、初代ＮＫ細胞に既に存在するＩｇＧにより媒介された（図３Ｈ〜３Ｊ）。一次ＨＳＶ１感染中、感染細胞は、ｇＥが発現されるため、およびヒト血清中にＩｇＧが豊富に存在するため、ｉｎｖｉｖｏではヒトＩｇＧで被覆されている可能性が高い。感染細胞を被覆する非免疫ＩｇＧが、ＣＤ１６ａ（＋）ＮＫ細胞の追加の係留／活性化部位を提供することができるか否かを試験するため、非ＨＳＶ１非免疫血漿［（−）血漿］またはＩｇＧ１Ｆｃ断片を、培養に添加した。（−）血漿およびＩｇＧ１Ｆｃは両方とも、感染したまたはトランスフェクトした神経膠腫細胞によるＮＫ細胞の活性化を、ｇＥ依存的様式でさらに増強した（図１１Ａ〜１１Ｄ）。ｗｔまたはｕｓ８⁻Ｆに感染した神経膠腫細胞に対するＮＫ細胞傷害性は、ＨＳＶ１特異的ＩｇＧにより増強された（古典的ＡＤＣＣ、図３Ｋ）。しかしながら、ヒトＩｇＧ１Ｆｃおよび無関連抗原を標的とする抗体（つまり、リツキシマブ）は、ｗｔＦに感染させたがＵｓ８⁻Ｆ種（図４Ａ）またはｇＥを発現する神経膠腫細胞（図４Ｂ）には感染させなかった神経膠腫細胞に対するＮＫ細胞細胞傷害性も増強した。

ＨＳＶ１ｇＥは、マウスＩｇＧに結合しないが（Chapmanら、１９９９年、J Biol Chem ２７４巻、６９１１〜６９１９頁）、マウスＦｃγＲは、高親和性でヒトＩｇＧに結合する（Oberら、２００１年、Int Immunol １３巻、１５５１〜１５５９頁）。したがって、ヒトＩｇＧを補完すると、マウスＮＫ細胞およびＨＳＶ１感染細胞に架橋し、免疫活性化およびＨＳＶ１感染のクリアランスを促進することができるはずである。この仮説と一致して、Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されたＮＫ細胞は、ヒトＩｇＧＦｃ断片の存在下で神経膠腫Ｕｓ７＋Ｕｓ８に対する細胞傷害性の増強を示した（図４Ｃ）。受動的ＡＤＣＣが、ｉｎｖｉｖｏでのＨＳＶ１感染のクリアランスの重要な機序であり得ることを実証するため、ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧＦｃ断片、ダラツムマブ（ヒトＣＤ３８に対するヒトＩｇＧ１抗体）、またはリツキシマブを、ウイルス負荷の４時間前ならびにウイルス負荷の２４時間後および７２時間後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した（図４Ｄ）。こうした試薬の各々は、ＮＫ細胞が存在しなかった場合、ＨＳＶ１ウイルスの感染性に影響を及ぼさず（図１２Ａ）、ｉｎｖｉｖｏ投与単独でも、ＮＫ細胞の表現型をｉｎｖｉｖｏで変化させなかった（図１２Ｂ）。ヒトＩｇＧＦｃ断片、ダラツムマブ、およびリツキシマブは、ＨＳＶ１感染症状を緩和し、マウスに対して、致死的ＨＳＶ１感染からの完全な保護を提供した（図４Ｄ）。ＨＳＶ１がｉｎｖｉｖｏで細胞間に蔓延するためには、ＨＳＶ１ｇＥが必要であるため（Polcicovaら、２００５年、J Virol ７９巻、１１９９０〜１２００１頁）、この種の保護がｇＥに依存することを確認するために、Ｕｓ８⁻Ｆ株をｉｎｖｉｖｏでは使用しなかった。しかしながら、ヒトＩｇＧ３は、ＨＳＶ１ｇＥに結合しないため（Spragueら、２００６年、PLoS Biol ４巻、ｅ１４８頁）、ＨＳＶ１感染に対するいかなる保護も提供しなかった（図４Ｆ）。これは、ｇＥ−ＩｇＧ相互作用が、ヒトＩｇＧ産物による致死的ＨＳＶ１感染からの保護に重要であることを示唆する。さらに、ルシフェラーゼを発現するＨＳＶ１Ｆ株（Zerboniら、２０１３年、J Virol ８７巻、２７９１〜２８０２頁）を使用して、ｉｎｖｉｖｏでウイルス感染を追跡することにより、リツキシマブが、ＨＳＶ１感染のクリアランスを増加させたことを明らかにした（図４Ｅ、４Ｆ）。まとめると、ＩｇＧＦｃがウイルスＦｃ受容体および免疫Ｆｃ受容体を架橋することにより、病原体特異的抗体が利用可能でない場合でも、ＨＳＶ１感染に対するロバストな保護が提供される。

細菌ＩｇＧ結合タンパク質は、ＩｇＧＦｃ媒介性架橋によりＮＫ細胞を活性化する。他の病原体に由来するＩｇＧ結合タンパク質が、同じ機序によりＮＫ細胞を活性化することができるか否かを試験するために実験を実施した。プロテインＡは、ヒトＮＫ細胞の表面に存在するＩｇＧＦｃに結合したが（図３Ｆおよび３Ｇ）、純粋なプロテインＡを培養に直接添加しても、ヒトＮＫ細胞は活性化されなかった（図５Ａ）。これは、モノマー形態のプロテインＡが、ＣＤ３ζ自己リン酸化の必要条件であるＣＤ１６ａの蓄積を引き起こさなかったためである。しかしながら、初代ヒトＮＫ細胞は、プロテインＡコーティングプレートでの培養後に活性化され（図５Ａ）、ＩＦＮ−γを産生し（図５Ｂ）、ＮＫ細胞傷害性の増強を示した（図５Ｃ）。こうしたＮＫ細胞機能増強は、プロテインＡコーティングプレートをマウス血清でブロッキングすると、無効にされた（図５Ａ）。これは、マウスＩｇＧにより、ヒトＩｇＧとプロテインＡ／Ｇとの間のあらゆる考え得る相互作用がブロッキングされたためである。

ＣＤ１６ａ−ＦｃプロテインＡ複合体の形成を、野生型Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．Ａ．）ｎｅｗｍａｎ株（ｗｔ）およびプロテインＡ欠損ｎｅｗｍａｎ株（Ｓｐａ）（Patelら、１９８７年、Infect Immun ５５巻、３１０３〜３１１０頁）を使用して試験した（図１３Ａ）。ＣＤ１６ａは、完全ヒトＩｇＧ（リツキシマブ）またはＩｇＧ１Ｆｃ断片のいずれかが存在した場合にＳ．Ａに結合し、プロテインＡは、この相互作用に不可欠だった（図１３Ｂ）。プロテインＡ欠損またはマウス血清によるプロテインＡのブロッキングが、ＣＤ３ζリン酸化を打ち消したため、Ｓ．ＡによるＣＤ３ζのリン酸化は、プロテインＡに依存していた。さらに、Ｓ．ＡをヒトＩｇＧとプレインキュベートすると、ＣＤ３ζリン酸化はわずかに増強された（図５Ｄ）。Ｓ．Ａと共に培養したＮＫ細胞の表現型は、ＣＤ３ζリン酸化の結果と同様だった。ｗｔＳ．ＡによるＮＫ細胞の活性化は、ｗｔＳ．Ａをマウス血清とプレインキュベートすることにより阻害され、ヒトＩｇＧにより増強された（図５Ｅ）。また、ｗｔＳ．ＡによるＮＫ細胞活性化は、初代ヒトＮＫ細胞を、可溶性モノマープロテインＡまたはプロテインＧのいずれかで前処置した場合、無効にされた（図５Ｅ）。さらに、ヒトＮＫ細胞は、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓプロテインＧにより同様の様式で活性化された（図１４Ａ〜１４Ｃ）。まとめると、こうした結果は、細菌ＩｇＧ結合タンパク質が、Ｆｃ架橋およびＣＤ１６ａによりヒトＮＫ細胞を活性化したことを実証する。

加えて、野生型Ｓ．Ａと共に培養したマウスＮＫ細胞は、ｓｐａ−Ｓ．Ａよりも多くのＩＦＮγを産生し（図５Ｆ）、より多くの初期活性化マーカーＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌを発現した（活性化ヒトＮＫ細胞でのＣＤ６２Ｌの喪失とは対照的に）（Peng, H.ら、J Immunol １９０巻、４２５５〜４２６２頁（２０１３年）；HayakawaおよびSmyth、２００６年、J Immunol １７６巻、１５１７〜１５２４頁）（図１５Ａ）。マウスＮＫ細胞をプロテインＡコーティングプレートで培養したところ、同様の表現型が観察された（図５Ｇおよび１５Ｂ）。Ｓ．Ａは、多数の炎症性因子を産生する（FournierおよびPhilpott、２００５年、Clin Microbiol Rev １８巻、５２１〜５４０頁（２００５年））。バイスタンダー活性化による結果との混同を回避するため、プロテインＡコーティングシリコーンビーズをマウスに注射して、オリゴマープロテインＡがｉｎｖｉｖｏでＮＫ細胞を活性化することができるか否かを研究した。プロテインＡコンジュゲートシリコーンビーズを注射したマウスに由来するＮＫ細胞は、対照シリコーン（silicon）ビーズを注射したマウスに由来するＮＫ細胞と比較して、より活性化表現型を示した（図５Ｈおよび１５Ｃ）。しかしながら、可溶性プロテインＡの注射は、ＰＢＳ対照と比較して、マウスＮＫ細胞のいかなる表現型変化も引き起こさなかった（図１５Ｄ）。まとめると、こうした結果は、プロテインＡが、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで、マウスＮＫ細胞を活性化したことを実証する。

考察
上記に示されている結果により実証されたように、不偏性の細胞傷害性アッセイであるＤＣ−ＭＥＧＥにより、ＨＳＶ１感染後のヒトＮＫ細胞と宿主腫瘍細胞との相互作用が明らかにされた（図１Ａ）。これは、Ｕｓ１２（HuardおよびFruh、２０００年、Eur J Immunol ３０巻、５０９〜５１５頁）およびＵｓ３（Imaiら、２０１３年、PLoS One ８巻、ｅ７２０５０頁）を除いて、残りのウイルス遺伝子が、ＮＫ細胞細胞傷害性の調節に重要であることを報告した初めてのものである。したがって、ＤＣ−ＭＥＧＥは、ＮＫ細胞が他の病原体とどのように相互作用するのかを研究するのに有用である。

ＨＳＶ１ｇＥ／ｇＩ複合体は、単一のＨＳＶ１−特異的ＩｇＧ抗体が、そのＦａｂ領域を使用してＨＳＶ１抗原と、およびそのＦｃ領域を介してｇＥ／ｇＩとに同時に結合する「抗体二極性架橋（antibody bipolar bridging）」に参加することが示されている（FrankおよびFriedman、１９８９年、Journal of virology ６３巻、４４７９〜４４８８頁）。そのような抗体二極性架橋は、抗体のＦｃ部分が、自然免疫エフェクター細胞上に発現されるＦｃγＲに接近することを阻止することができ、したがって古典的ＡＤＣＣを低減し、ＨＳＶ１感染後の免疫回避の機序を提供すると考えられることが提唱されている（Dubinら、１９９１年、Journal of virology ６５巻、７０４６〜７０５０頁；Corrales-Aguilarら、２０１４年、PLoS Pathog １０巻、ｅ１００４１３１頁）。これは、ｇＥまたはｇＥ／ｇＩ複合体が、ヒトＮＫ細胞の活性化および細胞傷害性を促進するという本開示の知見と矛盾するように思われる（図２Ａ、２Ｂ）。しかしながら、ＨＳＶ１ｇＥ／ｇＩのＮＫ阻害を示唆する以前の研究はすべて、ＨＳＶ１−特異的抗体の存在下で実施されており（FrankおよびFriedman、１９８９年、Journal of virology ６３巻、４４７９〜４４８８頁；Dubinら、１９９１年、Journal of virology ６５巻、７０４６〜７０５０頁；Corrales-Aguilarら、２０１４年、PLoS Pathog １０巻、ｅ１００４１３１頁）、したがって、こうした結果はすべて古典的ＡＤＣＣに関するものであり、一次ウイルス感染の条件下でのＨＳＶ１ｇＥ結合性非免疫ＩｇＧの実際の機能は、評価されなかった。

本明細書には、ＨＳＶ１ｇＥ／ｇＩの認識されていなかった免疫刺激役割が開示されている。結晶構造、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ機能検証により、ＩｇＧＦｃが、ｇＥおよびＣＤ１６ａを架橋し（図３Ｃ）、その結果生じる三成分複合体が、ＮＫ細胞を活性化する細胞内シグナルを伝達し（図３Ｅ）、ＨＳＶ１感染のクリアランスを促進したことが実証された。本開示の研究は、抗ＨＳＶ１抗体がまだ利用可能でない一次ＨＳＶ１感染中、ＮＫ細胞が、「受動的ＡＤＣＣ」を利用して、ＨＳＶ１感染細胞をクリアリングすることができることを示唆する（図４Ｄ〜４Ｆ）。この結果は、ヒトにおけるほとんどの一次ＨＳＶ１感染は、臨床的に無症候性であるという観察と一致する。また、受動的ＡＤＣＣは、少なくとも部分的には、悪性神経膠腫の設定での腫瘍溶解性ＨＳＶ１の迅速なＮＫ細胞クリアランスの要因である可能性が非常に高い（Alvarez-Breckenridgeら、２０１２年、Nat Med １８巻、１８２７〜１８３４頁（２０１２年））。

また、本開示は、ＮＫ細胞表面に発現されるＣＤ１６ａにそのＦｃドメインを介して係留される表面ＩｇＧに対する機能的役割、およびＮＫ細胞が特異性抗原認識の非存在下で病原体を認識することができる新しい機序を確立している。本明細書で実証されるように、ＨＳＶ１感染宿主細胞ならびにプロテインＡおよびプロテインＧは、ＮＫ細胞表面ＩｇＧに結合することによりヒトＮＫ細胞を活性化することが可能である。プロテインＡは、長らくＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｎｅｗｍａｎ株の病原性因子であると提案されており、Ｓｐａ⁻Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｎｅｗｍａｎ株は、マウスにおいて、ｗｔＳ．Ａよりも軽度の症状を引き起こす（Palmqvistら、２００２年、Microb Pathog ３３巻、２３９〜２４９頁）。コーティングされたプロテインＡおよびｗｔＳ．Ａ．はＮＫ細胞を活性化し、Ｓｐａ⁻Ｓ．Ａ．はＮＫ細胞を活性化しなかったという本開示の知見は、この表現型の機序論的説明を提供する。自然免疫細胞活性化のこの新しい機序は、多数のウイルスおよび細菌が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに結合することが可能なタンパク質をコードすることを考慮すると、感染中に観察される臨床毒性に幅広い適用可能性を有する（Litwinら、１９９２年、J Virol ６６巻、３６４３〜３６５１頁；Spragueら、２００８年、Journal of Virology ８２巻、３４９０〜３４９９頁；Loukasら、２００１年、Infect Immun ６９巻、３６４６〜３６５１頁；De Miranda-SantosおよびCampos-Neto、１９８１年、J Exp Med １５４巻、１７３２〜１７４２頁）。

（実施例２）単球を捕捉し、ｉｎｖｉｔｒｏで樹状細胞およびマクロファージを生成する効力を増加させるための、ＩｇＧ結合性タンパク質プロテインＡおよびプロテインＧの使用。

樹状細胞およびマクロファージは、高度に特殊化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ヒト血液単核細胞の非常に少ないパーセンテージを占める（約０．２％）。したがって、樹状細胞およびマクロファージは、多数の治療目的のために、単球のｉｎｖｉｔｒｏ培養から生成される。

樹状細胞およびマクロファージを生成するための従来手順は、（１）ＰＢＭＣまたは単球を培養皿にプレーティングすること、（２）細胞を３７℃で数時間インキュベートして、プレートに対する単球の付着を可能にすること、（３）プレートを培地でよく洗浄することにより、非接着細胞を除去すること、および（４）接着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（マクロファージの場合）またはＧＭＣＳＦおよびＩＬ４（樹状細胞の場合）で１週間処置することを含む。このプロトコールは、一貫した結果をもたらすが、ステップ２および３中に細胞が失われ、下流で使用するための十分な樹状細胞およびマクロファージを生成するには、比較的大量の単球またはＰＢＭＣが必要だった。

ナチュラルキラー細胞と同様に、初代単球も、ＣＤ６４、ＣＤ３２、およびＣＤ１６ａを含むＦｃγ受容体により単球に係留され、プロテインＡが結合するための相互作用部位を提供するＩｇＧ分子で表面が被覆されている。ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ（Ｓ．Ａ）に対するヒトＦｃγ受容体ＣＤ３２およびＣＤ６４の結合は、ヒトＩｇＧおよびプロテインＡの存在を必要とした。野生型（ｗｔ）またはプロテインＡ欠損（Ｓｐａ−）Ｓ．Ａ細菌を、ヒト化抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕ）の非存在下または存在下で、蛍光標識ヒトＦｃγ受容体ＣＤ３２およびＣＤ６４と共にインキュベートした（図２３Ａおよび２３Ｂ）。こうした結果により、プロテインＡ、ＩｇＧ、およびＣＤ３２／ＣＤ６４が、プロテインＡ／ＩｇＧ／ＣＤ１６複合体と同様の様式で三成分複合体を形成したことが確認された。高親和性ＦｃγＲであるＣＤ６４は、主に単球、マクロファージ、および樹状細胞により発現される。

プロテインＡおよびプロテインＧは、ＮＫ細胞および単球に被覆されているＩｇＧに結合することができる。したがって、プレートにコーティングされたプロテインＡまたはプロテインＧ分子は、単球の表面ＩｇＧに結合し、したがって単球の接着を増加させることができるはずである。異なるプレートに同じ量の単球をプレーティングすることにより、単球は、最初の数時間中、ウシ血清処置プレートよりも、プロテインＡまたはプロテインＧ処置プレートに対してより強固に付着したことが見出され、プロテインＡまたはプロテインＧコーティングプレートでの単球培養は、活性化の徴候であるコロニーを形成し始めた（図１７Ａ）。プロテインＡコーティングプレートを使用したさらなる実験により、プロテインＡコーティングプレートが、単球の接着増加以外に、単球の代謝活性も増加させ、単球を誘導してＩＬ１βを産生し、６時間後に初代ヒト単球の表現型を変化させたことが示された（図１７Ｂ、１７Ｃ、図１９、図２０、および図２１）。同様に、固定化されたプロテインＡおよびプロテインＧは、初代ヒト好中球で呼吸バーストを誘導した（図２２）。したがって、樹状細胞またはマクロファージを生成するために、通常プレートで単球を培養する代わりに、プロテインＡまたはプロテインＧでコーティングされたプレートで、単球またはＰＢＭＣを培養した。これにより、ステップ２および３における細胞の喪失が低減され、同量の樹状細胞およびマクロファージを生成するために、はるかにより少量の開始単球およびＰＢＭＣしか必要でなかった（図１８）。

プロテインＡ、プロテインＧ、またはヒトＩｇＧでプレコーティングされたプレートから生成された樹状細胞は、より多くの量の共刺激分子ＣＤ８６を発現した（図２４）。また、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）抗原性ペプチドを負荷して、自己由来Ｔ細胞と共培養すると、こうした樹状細胞は、より多くのＥＢＶ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する傾向があった（図２５）。

従来の研究では、プロテインＡは、ＴＮＦＲ１に結合し、上皮細胞を活性化し、プロテインＧは、ＴＮＦＲ１に結合せず、上皮細胞を活性化しないことが報告されていた（参照ＰＭＩＤ：１５２４７９１２）。プロテインＡによる単球付着および活性化が、単球上に発現されるＴＮＦＲ１との結合に部分的に寄与し得る可能性があり、プロテインＧ−ＩｇＧ−ＣＤ１６の三成分複合体が存在し、プロテインＧが、表面ＩｇＧとの結合によりＮＫ細胞を活性化することを示す本研究のデータが存在するため、プロテインＧにより増加される単球付着は、単球上の表面ＩｇＧとの結合により説明することができる。

（実施例３）ＣＭＶを使用したＮＫ細胞の活性化
ＣＭＶｇｐ３４およびｇｐ６８は両方とも、それらのＦｃの部分を介して、ヒト化抗体リツキシマブおよびヒトＩｇＧの両方に結合することが可能なＩｇＧ結合タンパク質である（図２８Ａおよび２８Ｂ）。ＣＤ１６ａは、ｇｐ３４またはｇｐ６８のいずれかを発現する神経膠腫細胞と直接的には相互作用しない（図２８Ｃ）。しかしながら、ＣＤ１６ａは、リツキシマブまたはヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片の存在下で、ｇｐ６８を発現する神経膠腫細胞に結合することができるものの、ヒトＩｇＧＦｃが存在する場合にさえ、ｇｐ３４を発現する神経膠腫細胞には結合しない（図２８Ｄおよび２８Ｅ）。したがって、ｇｐ６８は、ヒトＩｇＧ１ＦｃおよびＣＤ１６ａとの三成分複合体を形成することが可能である。加えて、ｇｐ６８を発現する神経膠腫細胞と共に培養した初代ヒトＮＫ細胞は、ＣＤ６９およびＣＤ１０７ａの増加ならびにＣＤ６２ＬおよびＣＤ１６ａの減少により表される活性化表現型を示した（図２９Ａおよび２９Ｂ）。

また、ＭＣＭＶ感染は、３Ｔ３が、非免疫マウスＩｇＧに結合することを可能にし（図３０）、ＭＣＭＶがＩｇＧ結合タンパク質を産生することを示した。

別様に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はすべて、本開示の発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用されている刊行物、およびそれらが引用する材料は、参照により具体的に組み込まれる。

当業者であれば、単なる日常的な実験作業を使用して、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多数の等価物を認識または確認することができるだろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図されている。

Claims

Ｆｃ結合タンパク質をコードする病原体に感染した対象を処置するための医薬組成物であって、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび前記病原体によりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物。
前記免疫エフェクター細胞が、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球もしくは顆粒球、Ｔ細胞、または樹状細胞である、請求項１に記載の医薬組成物。
Ｆｃ結合タンパク質をコードする前記病原体が、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス、または水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）である、請求項１に記載の医薬組成物。
前記病原体によりコードされるＦｃ結合タンパク質が、ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）またはサイトメガロウイルス６８ｋＤａ糖タンパク質（ｇｐ６８）を含む、請求項３に記載の医薬組成物。
免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインを含む前記免疫学的ポリペプチドが、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片である、請求項１に記載の医薬組成物。
Ｆｃ結合タンパク質をコードする病原体に感染した対象を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインを含む前記免疫学的ポリペプチドが、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片である、請求項６に記載の方法。
ＨＳＶ１感染を有する対象の神経学的損傷を予防するための医薬組成物であって、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび単純ヘルペスウイルスによりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物。
ＨＳＶ１感染を有する対象の神経学的損傷を予防するための方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項８に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
ＨＳＶ１感染を有する対象の死亡を予防するための医薬組成物であって、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび単純ヘルペスウイルスによりコードされるＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物。
ＨＳＶ１感染を有する対象の死亡を予防するための方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
腫瘍溶解性ウイルス治療を受けている対象のがんを処置するための医薬組成物であって、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインおよび標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する非重複ドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む医薬組成物。
腫瘍溶解性ウイルス治療を受けている対象のがんを処置するための方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１２に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
対象の腫瘍溶解性ウイルス治療を増強するための医薬組成物であって、標的細胞上のＦｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合する領域を含まないポリペプチドを含む組成物。
対象の腫瘍溶解性ウイルス治療を増強するための方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
前記医薬組成物が、腫瘍溶解性ウイルス治療剤による処置の前に投与される、請求項１５に記載の方法。
抗がん治療を受けている対象の炎症を低減する方法であって、
（ａ）Ｆｃ結合タンパク質に結合する領域を含むが、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に結合する領域を含まない治療有効量のポリペプチドを投与すること、および
（ｂ）モノクローナル抗体薬物を含む抗がん治療を施すこと
を含む方法。
前記モノクローナル抗体薬物が、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブベドチン、セツキシマブ、ダラツムマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ、またはペムブロリズマブである、請求項１７に記載の方法。
医薬組成物が、前記モノクローナル抗体薬物による処置の前に投与される、請求項１７に記載の方法。
医薬組成物が、ＩｇＧ抗体のＦｃ断片である免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲに結合するドメインを含む免疫学的ポリペプチドを含む、請求項１７に記載の方法。
ＰＢＭＣまたは単球から樹状細胞またはマクロファージを生成する効率を増加させるための方法であって、プロテインＡまたはプロテインＧでプレコーティングされたプレートで、または重合されたプロテインＡまたはプロテインＧと共に、ＰＢＭＣまたは単球を培養することを含む方法。