CN110536699A - 被动抗体依赖性细胞介导的活化 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于调节免疫效应细胞活化的方法、试剂和药物组合物，其不需要抗原特异性抗体。本文显示了IgG Fc区包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和能够结合靶细胞上的Fc结合蛋白的非重叠区域或结构域，并且其能够桥接免疫效应细胞和表达Fc结合蛋白的靶细胞而不使用抗体的抗原结合区(Fab)。因此，还公开了增强或抑制受试者中的被动ADCC的方法。

Description

被动抗体依赖性细胞介导的活化
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的批准号为5P01CA163205的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是先天性淋巴细胞，其缺乏重新排列种系免疫球蛋白基因以产生适应性免疫应答的能力，并且可以在没有先前抗原暴露的情况下识别病毒感染的细胞或癌细胞(Orr等人，2010，“Cell”142，847-856)。NK细胞的功能状态由来自各种NK细胞活化/抑制受体和细胞因子的信号输入调节。NK细胞也是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的主要效应细胞，并且表达低亲和力FcγR-IIIA/CD16a蛋白(下文中称为CD16a)，该蛋白结合该分子铰链区的IgG分子，并通过所得抗原-抗体复合物启动NK细胞活化(Sondermann等人，2000，Nature 406，267-273))。CD16a在NK细胞中与信号转导蛋白CD3ζ结合(Anderson等人，1990，Proc Natl Acad Sci USA 87,2274-2278；Lanier等人，1989，Nature 342，803-805)。通过CD16a的NK细胞活化最低需要两个CD16a结合位点物理上足够接近簇CD3ζ，其磷酸化进而导致NK细胞的活化和抗体涂覆的靶细胞的裂解(O'Shea等人，1991，Proc NatlAcad Sci 88,350-354)。
在小鼠和人类中有大量证据表明NK细胞可以作为抵抗多种传染性病原体和抵抗恶性转化的第一道防线。“第一道防线”意味着在T细胞和B细胞的适应性抗原特异性免疫系统能够检测到病原体并对其进行攻击之前数天到数周的保护，并且在当病原体或肿瘤本身在以后再次出现在体内时，很快就会回想起它的反应。NK细胞和其他先天免疫细胞早期识别病原体和肿瘤细胞之后的机制在很大程度上但并非完全未知(Dai等人，2017，Immunity47(1)，159-170)。了解NK细胞和其他先天免疫细胞如何看到这种危险将提高对如何及早治疗此类疾病的理解，从而挽救更多生命。
作为一个实例，NK细胞构成针对疱疹病毒感染的第一道防线，并且具有NK细胞缺陷的患者经常遭受严重的、复发的且有时致命的HSV感染(Orange，2012，Journal ofClinical Investigation 122,798-801)。疱疹病毒科包括许多尚未批准疫苗的重要人类病原体(Gilden等人，2007，Nat Clin Pract Neurol 3,82-94)，并且最近临床上批准了溶瘤HSV1用于治疗黑素瘤(尽管具有中等治疗效果；Andtbacka等人，2015，J ClinOncol.Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in PatientsWith Adcanced Melanoma)。因此，本领域仍需要开发用于提供有效的抗病毒治疗和最大化溶瘤HSV1疗法功效的试剂、方法和药物组合物。
发明内容
本公开提供了用于促进免疫效应细胞的免疫活化的试剂、方法和药物组合物。在具体的实施方式中，本文提供了免疫多肽，其包含结合免疫效应细胞上的Fcγ受体(FcγR)的结构域和结合靶细胞上的Fc结合蛋白的非重叠结构域。本文所述的多肽能够在免疫效应细胞和靶细胞之间形成桥，而不使用抗体的抗原结合区(所谓的IgG Fab区)。这种类型的免疫效应细胞活化在本文中称为被动抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。被动ADCC对于感染编码Fc结合蛋白的病原体的受试者、表达编码除FcγR之外的Fc结合蛋白的基因的受试者以及经历抗体治疗的受试者中可以具有有益和有害作用。因此，还公开了增强或抑制受试者中的被动ADCC的方法。
在具体的实施方式中，提供了一种用于治疗感染编码Fc结合蛋白的病原体的受试者的药物组合物。在具体的实施方式中，所述组合物包含免疫多肽，其包含结合免疫效应细胞上的Fcγ受体(FcγR)的结构域和结合病原体编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。在某些实施方式中，免疫多肽是抗体，更具体地是IgG抗体，特别是IgG抗体的Fc片段。在这种免疫多肽的范围内还有含IgG的抗血清。可用于所述方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
在具体的实施方式中，本发明还提供了用于预防患有HSV1感染的受试者的神经损伤的试剂、方法和药物组合物。在具体的实施方式中，本发明还提供了用于预防患有HSV1感染的受试者的死亡的试剂、方法和药物组合物。在具体的实施方式中，提供了药物组合物，其包含免疫多肽，免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合HSV1编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。在某些实施方式中，免疫多肽是抗体，更具体地是IgG抗体，特别是IgG抗体的Fc片段。在这种免疫多肽的范围内还有含IgG的抗血清。可用于该方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
在一些实施方式中，本文提供了多肽，其包含免疫球蛋白G(IgG)抗体的Fc区但不包含抗体的Fab区。例如，多肽可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的片段。在一些实施方式中，多肽包含IgG免疫球蛋白的单个Fc区。在一些实施方式中，多肽包含一个或多个IgG免疫球蛋白的两个或更多个Fc区。在一些实施方式中，多肽包含Fcγ受体结合位点，该位点已被修饰以增强与Fcγ受体的结合，并且在一些实施方式中，多肽包含Fcγ受体结合位点，Fcγ受体结合位点已被修饰以缺失与Fcγ受体的结合或缺失与Fcγ受体之外的Fc结合蛋白的结合。
在一些实施方式中，免疫效应细胞是表达Fcγ受体的免疫细胞。Fcγ受体包括CD16a、CD16b、CD32和CD64。因此，在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞。
在一些实施方式中，所公开的试剂、方法和药物组合物可用于治疗感染表达Fc结合蛋白的病原体的受试者，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的药物组合物。在某些情况下，病原体是病毒。在非限制性实例中，病原体是表达Fc结合蛋白糖蛋白E(gE)的单纯疱疹病毒1(HSV1)或HSV2。在其他实施方式中，病原体是表达包含68kDa-糖蛋白(gp68)的Fc结合蛋白的人巨细胞病毒(CMV)。在其他实施方式中，病原体是水痘带状疱疹病毒(VZV)。
在一些情况下，病原体是细菌，例如金黄色葡萄球菌、链球菌或大肠杆菌。在此类实施方式中，由病原体表达的Fc结合蛋白包含蛋白A、蛋白G、蛋白H或M1蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的方法应用于经历溶瘤病毒治疗的受试者。尽管在溶瘤病毒感染肿瘤使病毒扩散到其他肿瘤细胞后尽早抑制被动ADCC可能是有利的，但所公开的方法还可用于在肿瘤细胞被感染后增强被动ADCC以增强肿瘤细胞的杀伤和清除。
还公开了用于减少或抑制被动ADCC的试剂、方法和药物组合物。在此类实施方式中，多肽是经修饰以结合Fc结合蛋白但不结合FcγR的IgG免疫球蛋白的片段，其将使它们结合靶细胞的Fc结合蛋白并防止它们交联FcγR并活化被动ADCC。例如，多肽可以是缺乏或已被改造为缺乏CD16a、CD32或CD64结合位点的IgG片段。已知HSV1gE、蛋白A和蛋白G和链球菌的M1蛋白的Fc结合位点是IgG分子的CH2-CH3界面。因此，在一些实施方式中，多肽是IgG免疫球蛋白的片段，其包含IgG的CH2-CH3界面但不包含FcγR结合区。
在其他实施方式中，多肽可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的片段。在一些实施方式中，多肽是来自多于一个抗体亚类的片段。参与结合Fc的FcγRIIIa/CD16a的区域是SEQ ID NO：24的B/C环(Trp 131至Ala 135)、F/G环(Val 176至Lys 179)、C链(His 137至Thr 140)和C链(Asp 147至His 153)。另外，Arg 173和连接(Ile 106至Trp 108)区域也参与结合。另一方面，已知Fc的Cy2铰链(Leu 235至Ser 239)和残基Asp 265至Glu 269是CD16a的主要接触残基(Sondermann等人，2000，Nature 406,267-273))。因此，对相互作用界面的修饰可以改变CD16a和IgG之间的结合。例如，用FcγRI(MGKHRY；SEQ ID NO：11)替换FcγRIII FG-环导致IgG1结合亲和力增加15倍(Lu等人，2011，JBC 286，40608-40613)。另一个实例是包含SEQ ID NO：10的人IgG1 Fc氨基酸262-470的Fc片段，其结合HSV1gE、蛋白A和蛋白G，但完全不结合人Fcγ受体(CD16a、CD32、CD64)。
在一些实施方式中，本文公开的方法涉及施用Fc结合蛋白，例如蛋白A或蛋白G，其将结合抗体并防止通过被动ADCC桥接免疫效应细胞和靶细胞。
在一些实施方式中，多肽是经修饰以结合FcγR但不结合Fc结合蛋白的IgG免疫球蛋白的片段，其将结合免疫效应细胞并阻止它们与桥接抗体相互作用。例如，多肽可以是IgG免疫球蛋白的片段，该片段结合FcγR但在CH2-CH3界面具有突变，导致其不结合HSV1gE、蛋白A和蛋白G。例如，人IgG4结合gE，而IgG4突变体H435R不能结合gE。
在具体的实施方式中，本发明提供了用于减少接受抗癌治疗的受试者的炎症的试剂、方法和药物组合物。这些实施方式可包括施用治疗有效量的多肽，该多肽包含结合Fc结合蛋白但不包含结合FcγR的区域；以及施用包含单克隆抗体药物的抗癌治疗。在具体的实施方式中，抗体药物是利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、阿仑单抗或派姆单抗。在其他实施方式中，在用单克隆抗体药物治疗之前施用药物组合物。
在一些实施方式中，用治疗性抗体治疗受试者。大多数治疗性单克隆抗体药物由哺乳动物宿主细胞系产生以靶向特异性抗原。副作用和治疗功效的降低可由抗体通过患者内源性存在的各种Fc结合蛋白的隔离，以及通过被动ADCC与携带FcγR的免疫细胞相互作用而引起。所公开的方法可以减少抗体介导的输注毒性(所谓的第一剂量效应)的这种副作用，但是增强基于抗体的免疫疗法。
所公开的方法还可用于防止被具有Fc结合蛋白的生物感染的患者的细胞因子从携带FcγR的免疫细胞中释放、低血压和多器官衰竭。
在本文公开的试剂、方法和药物组合物的这种用途的一些实施方式中，受试者患有病毒血症(病毒编码Fc结合蛋白)或具有患有病毒血症的风险。这些公开的方法可用于通过使用IgG Fc片段或对Fc结合蛋白和/或FcγR具有高于正常亲和力的抗体来增强载有FcγR的免疫细胞的病毒清除，并利用被动ADCC进行清除来治疗或预防病毒血症。
在本文提供的一些实施方式中，提供了用于治疗经历溶瘤病毒治疗的受试者中的癌症的试剂、方法和药物组合物。该方法可用于在肿瘤的溶瘤病毒感染因此溶瘤病毒可能扩散到其他肿瘤细胞后早期抑制被动ADCC。在具体的实施方式中，免疫多肽可以在用溶瘤病毒治疗剂治疗之前施用，而在其他实施方案中，免疫多肽可以与溶瘤病毒治疗剂共同施用。在具体的实施方式中，提供了用于在经历溶瘤病毒治疗的患者中抑制被动ADCC的包含多肽的药物组合物，多肽包含与靶细胞上的Fc结合蛋白结合的区域但不包含与FcγR结合的区域。可用于该方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
在病毒感染肿瘤细胞之后，本文提供的用于增强被动ADCC的试剂、方法和药物组合物可用于改善载有FcγR的免疫细胞对病毒感染的肿瘤细胞的破坏。例如，包含免疫多肽的药物组合物可用于增强被动ADCC以改善病毒感染的肿瘤细胞的破坏，该免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合靶细胞上的Fc结合蛋白的非重叠结构域。在某些实施方式中，免疫多肽是抗体，更具体地是IgG抗体，特别是IgG抗体的Fc片段。在这种免疫多肽的范围内还有含IgG的抗血清。可用于该方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
本文还公开了用于识别调节病毒感染细胞和免疫效应细胞相互作用的病毒基因的方法。所公开的方法可以包括：用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含候选病毒基因和与表达控制序列可操作地连接的报告基因；将转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞暴露于细胞毒性免疫效应细胞；以及测定暴露的转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞，以根据报告基因表达或活性测定细胞死亡。在这些方法中，与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的细胞死亡减少表明病毒基因保护宿主细胞免受免疫效应细胞，并且与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的细胞死亡增加表明病毒基因使宿主细胞对免疫效应细胞敏感。这些方法可以与细胞毒性的任何免疫效应细胞一起使用。例如，细胞毒性免疫效应细胞可以是CD4+T细胞、CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、粒细胞或树突细胞。
在特定的实施方式中，报告基因是荧光基因，其中暴露的转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞尤其通过流式细胞术测定以根据荧光性测量细胞死亡，其中与未转染的宿主细胞相比，荧光转染的宿主细胞百分比的增加表明病毒基因保护宿主细胞免受免疫效应细胞，并且其中与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的平均荧光减少表明病毒基因使宿主细胞对免疫效应细胞敏感。
可以对病毒基因组中的每个基因重复该过程。例如，该方法可以进一步包括重复病毒基因组中2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多基因的组合的过程。
优选基于宿主细胞在病毒感染时对免疫效应细胞的已知易感性或抗杀伤性来选择所述宿主细胞。
本文还公开了重组溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)，其包含Us8基因(SEQ ID NO：18)中的一个或多个活化突变、UL12基因(SEQ ID NO：12)中的一个或多个活化突变、UL30基因(SEQ ID NO：13)中的一个或多个活化突变、Us3基因(SEQ ID NO：15)中的一个或多个活化突变、Us5基因(SEQ ID NO：14)中的一个或多个活化突变、Us12基因(SEQ ID NO：16)中的一个或多个活化突变、或其任何组合。
还公开了重组HSV1载体，其包含HSV1 Us7和HSV1 Us8的启动子上游的CMV即刻早期增强子。
本文还公开了使用特定IgG结合蛋白，特别是蛋白A和蛋白G捕获单核细胞并增加体外产生树突细胞和巨噬细胞的功效的方法。所公开的方法可包括：用重组蛋白A或蛋白G涂覆培养板；用蛋白A或G涂覆的板中的细胞因子培养人(或小鼠)外周血单核细胞(PBMC)或纯化的单核细胞以产生巨噬细胞或树突细胞。所公开的方法还可包括用任何聚合形式的蛋白A、蛋白G或其他IgG结合蛋白培养人(或小鼠)外周血单核细胞(PBMC)或纯化的单核细胞。这些方法可以类似地包括：用重组蛋白A或蛋白G涂覆培养板；用蛋白A或G涂覆的板中的细胞因子培养人(或小鼠)外周血单核细胞(PBMC)或纯化的单核细胞以产生巨噬细胞或树突细胞。
在附图和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方式的细节。从说明书和附图以及从权利要求中本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
图1A至1I示出了由识别HSV1gE作为NK细胞活化分子的异位基因表达(DC-MEGE)介导的差异细胞裂解。图1A是DC-MEGE测定的流程图。图1B示出了代表性HSV1基因的DC-MEGE测定的代表性图。图1C是示出了所有65个HSV1基因(n>4)的DC-MEGE结果的条形图，其中HSV1基因UL12、UL30、Us3、Us8和Usl2的表达促进NK细胞裂解，而UL48、Us5和Us6的表达抑制NK细胞裂解。图1D示出了在指定的效应物：目标比率(E：T，x轴)下针对转染的人神经胶质瘤细胞系的细胞毒性。图1E示出了在用转染的神经胶质瘤细胞培养20小时后，IFNγ由原代人NK细胞分泌(三份样本的平均值，n＝5)。图1F和1G示出了用转染的神经胶质瘤细胞培养7小时后原代人NK细胞的表型。图1H示出了在同种型或Us8/gE特异性抗体存在下，原代人NK细胞对表达Us8的神经胶质瘤细胞的细胞毒性。图1I示出了在用灭活的纯野生型F菌株或Us8缺乏型F菌株预涂覆7小时的板中或存在同种型或gE特异性抗体(n＝7)的情况下培养后的原代人NK细胞的表型。图1C、1D和1H中的数据表示为平均值±sem。图1E、1H和1I中的每条虚线链接从同一供体获得的数据。*p<0.05，**pO.01。
图2A至2G示出了IgG连接的gE和NK细胞活化。图2A示出了用转染的神经胶质瘤细胞培养7小时后原代人NK细胞的表型。针对14个供体总结了NK细胞获得CD69或CD107a表达或NK细胞丧失CD16a和CD62L表达的百分比。图2B示出了如图2A中处理的原代人NK细胞，其中在20小时时收集上清液并测量人IFNγ(三次重复的平均值，n＝5)。图2C和2D示出了用pH7.4或pH4培养基洗涤的人PBMC，随后用谱系标记物和人IgG Fc抗体染色；示出了细胞标记物和Fc的平均强度，并示出了至少五个供体的一个代表。图2E示出了来自人供体的NK细胞上存在人IgG。图2F示出了用转染的神经胶质瘤细胞或K562细胞培养7小时后图2E中来自供体的NK细胞的表型。图2G示出了与神经胶质瘤细胞或K562共培养后相对于相应人供体的表面IgG强度作图，对CD69或CD107a阳性的NK细胞的百分比。使用线性回归(n>20)进行相关分析。图2A和2B中的每条虚线链接从同一供体获得的数据。*p<0.05，**pO.01。
图3A至3K示出了IgG桥接对于HSV gE的NK细胞活化是必需的。图3A示出了gE-IgGFc-CD16a三元复合物的模型结构。分别示出了正视图、侧视图和俯视图。CD16a显示为棒状，gE显示为球状，以及IgG Fc二聚体的两个单体显示为带状。图3B示出了人IgG产物(图3B)或在或不在人IgG产物的存在下CD16a(图3C)与转染的神经胶质瘤细胞的结合。图3D示出了在人IgG产物存在下CD16a与感染的神经胶质瘤细胞的结合。图3E示出了如1H所述的NK细胞刺激后CD3ζ的磷酸化。图3F和3G示出了在用pH 7.4或pH 4培养基短暂洗涤后，人PBMC中谱系标记物和蛋白A(图3F)或蛋白G(图3G)的染色。这些图中的数字是每次染色的平均强度。图3H示出了首先用蛋白A或蛋白G孵育，然后在用转染的神经胶质瘤细胞、K562或白细胞介素IL12+IL18培养7小时后评估表型(n＝7-8)的原代人NK细胞。图3I示出了用蛋白A或蛋白G孵育，随后评估对神经胶质瘤Us7+Us8的细胞毒性的原代人NK细胞(图3I)。图3J示出了如(图3H)所处理的NK细胞，其中在培养20小时时评估IFNγ分泌(三份样本的平均值，n＝5)。图3K示出了由IgG Fc介导的免疫刺激的作用模型(ADCC作为实例)。图3H和3J中的每条虚线链接从同一供体获得的数据。图3B、3C、3D、3E、3F和3G重复至少3次。*pO.01。
图4A至4F示出了被动ADCC促进体内病毒清除。图4A示出了在存在或不存在人IgG产物的情况下原代人NK细胞对感染的神经胶质瘤细胞的细胞毒性。图4B示出了在存在或不存在人IgG1 Fc的情况下原代人NK细胞对感染的神经胶质瘤细胞的细胞毒性。图4C示出了在存在或不存在人IgG1 Fc的情况下原代小鼠NK细胞对神经胶质瘤Us7+Us8的细胞毒性。图4D示出了小鼠对人IgG产物的致死性HSV1感染的保护。图4E和4F示出了感染后18小时和84小时的HSV1病毒载量(n＝5)。图4A、4B和4C中的数据以平均值±sem表示。*p<0.05，**p<0.001。
图5A至5H示出了细菌IgG结合蛋白通过IgG桥接活化NK细胞。图5A和5B示出了用可溶性蛋白A培养后或在用蛋白A涂覆的板中培养后或在用NK细胞培养前用小鼠血清阻断的蛋白A涂覆的板中培养后原代人NK细胞的表型(图5A)和IFNγ产生(图5B)。图5B中的每条虚线表示一个供体(三次重复的平均值，n＝6)。图5C示出了在涂覆有培养基或蛋白A的板中培养30分钟的人NK细胞，其中评估了针对神经胶质瘤细胞的细胞毒性；显示的结果是平均值±sem。图5D示出了在将原代人NK细胞暴露于图1中所示的刺激1小时后的CD3ζ的磷酸化。图5E示出了用细菌培养7小时后原代人NK细胞的表型。在一些情况下，NK细胞用可溶性蛋白A或蛋白G预处理，或可溶性蛋白A与小鼠血清或人IgG预孵育。图5F示出了用细菌培养后小鼠NK细胞中IFNγ的产生(三份样本的平均值，n＝5)，每条虚线代表一只小鼠。图5G示出了在预先涂覆有培养基或蛋白A的板中培养后小鼠NK细胞的表型。图5H示出了注射有对照硅酮珠或蛋白A结合的硅酮珠的BALB/c小鼠的NK细胞的表型。图5A、5D和5E在4个供体上最低限度重复。
图6示出了在用灭活的纯野生型或Us8缺乏型HSV1 F菌株病毒涂覆的板中培养7小时后原代人NK细胞的表型。添加同种型或Us8/gE特异性抗体以干扰NK细胞和涂覆的F菌株病毒之间的相互作用。示出了7个供体的代表性轮廓染色。
图7示出了用表达不同HSV1基因的神经胶质瘤细胞培养7小时后原代人NK细胞的表型。示出了来自8个供体之一的代表性轮廓图。
图8示出了用转染的神经胶质瘤细胞或K562细胞培养7小时后来自不同供体的NK细胞的表型。
图9A和9B示出了用蛋白A或蛋白G处理以及随后用K562细胞、IL12+IL18或转染的神经胶质瘤细胞培养的原代人NK细胞。在培养7小时时进行表型分型。示出了来自8个供体之一的代表性轮廓图。
图10A和10B示出了用单独的培养基、蛋白质A或蛋白质G处理以及随后在涂有灭活的野生型HSV1 F菌株的板中培养的人NK细胞。在培养7小时后进行表型分型。示出了来自一个供体的代表性轮廓图(图10A)和5个供体的统计概要(图10B)。
图11A至11D示出了在单独培养基、HSV1非免疫血浆((-)血浆)或人IgG1 Fc存在下，用感染的神经胶质瘤细胞(图11A，11B)或转染的神经胶质瘤细胞(图11C，11D)培养，并在培养7小时后染色的NK细胞。显示了来自一个供体的代表性轮廓图(图11A和11C)和7-9个供体的统计概要(图11B和11D)。
图12A示出了与PBS或IgG产物混合，在室温下孵育30分钟，并在Vero细胞上滴定以获得感染性的连续稀释的HSV1 F菌株。将所有数字标准化为PBS处理(阴性对照)。人IgG含有抗HSV1 IgG(阳性对照)。图12B示出了来自用人IgG Fc或利妥昔单抗注射24小时的BALB/c小鼠的NK细胞的表型。
图13A示出了小鼠IgG2a与细菌的结合。图13B示出了在人IgG产物存在下CD16a与细菌的结合。
图14A和14B示出了在用可溶性链球菌蛋白G培养后、或在用蛋白G涂覆的板中培养后、或在用NK细胞培养前用小鼠血清阻断的蛋白A涂覆的板中培养后，原代人NK细胞的表型(图14A)和IFNγ产生(图14B)。图14B中的每条虚线表示一个供体(三次重复的平均值，n＝6)。图14C示出了在涂有培养基或蛋白A的板中培养30分钟的人NK细胞，其中评估了针对神经胶质瘤细胞的细胞毒性。以平均值±sem显示结果。
图15A示出了用细菌培养24小时后来自C57BL/6和BALB/c的小鼠脾NK细胞的表型。这代表三个实验之一。图15B示出了从预先涂覆有培养基或蛋白A的板中培养，并在培养24小时时染色的小鼠脾中分离的NK细胞。CD62L和CD27强度是相对于培养基涂覆的板(n＝12)。图15C示出了来自注射有对照硅酮珠或蛋白A-结合的硅酮珠的BALB/c小鼠的NK细胞的表型。示出了统计汇总(n＝5)。图15D显示了来自注射可溶性蛋白A 24小时的BALB/c小鼠的NK细胞的表型。图代表3个实验之一。
图16示出了蛋白A(UniProtKB：P99134)、蛋白G(UniProtKB：P06654)和HSV1gE(UniProtKB：P04488)的序列比对。
图17A-17C示出了用细菌IgG结合蛋白处理的人单核细胞的形态和功能变化。图17A示出了在预先涂覆培养基、蛋白A或蛋白G的板中培养3小时或18小时的人单核细胞的形态。图17B示出了单核细胞呼吸爆发测定的结果，其中人原代单核细胞在涂有牛血清(BSA)或蛋白A的板中培养，或用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA；阳性对照)刺激特定时间。图17C示出了如图17B中处理的单核细胞的细胞内IL1β染色。
图18示出了预先涂覆有蛋白A和蛋白G的培养板增加了从人单核细胞产生树突细胞的功效。在第0天将100万纯化的人单核细胞接种在板中，并用补充有20ng/ml GM-CSF和IL4(10ng/ml)的培养基培养以产生树突细胞。在第1天除去未附着于板的细胞。在第1天、第4天和第7天对附着于板的细胞计数。
图19示出了固定化蛋白A和蛋白G诱导原代人单核细胞中的呼吸爆发。在指定条件下，在二氢罗丹明23(DHR123)存在下培养新鲜分离的人单核细胞10分钟或30分钟。使用流式细胞术分析细胞。
图20示出了固定化蛋白A和蛋白G诱导原代人单核细胞中IL1β的产生。将新鲜分离的人单核细胞在指定条件下培养6小时并对IL1β染色。
图21示出了固定化蛋白A和蛋白G改变了原代人单核细胞的表型。将新鲜分离的人单核细胞在指定条件下培养6小时并对HLA-DR和CD14染色。
图22示出了固定化蛋白A和蛋白G诱导原代人嗜中性粒细胞中的呼吸爆发。在DHR123存在下，在指定条件下培养新鲜分离的人嗜中性粒细胞10分钟或30分钟。使用流式细胞术分析细胞。
图23A和23B示出了人Fcγ受体CD32和CD64与金黄色葡萄球菌的结合需要人IgG和蛋白A的存在。野生型(wt)或蛋白A缺乏型(Spa-)金黄色葡萄球菌细菌在人源化抗体利妥昔单抗(Ritu)不存在或存在的情况下用荧光标记的人Fcγ受体CD32(如图23A所示)和CD64(如图23B所示)孵育。填充的灰色直方图表示未染色的细菌。
图24示出了固定化蛋白A、蛋白G和人IgG改变了单核细胞衍生的树突细胞的表型。将新鲜分离的人单核细胞在IL4和GM-CSF存在下在处理的板中培养特定时间并对CD86和CDlc染色。
图25示出了固定化蛋白A、蛋白G和人IgG改变了单核细胞衍生的树突细胞的功能。在板中培养5天由单核细胞产生树突细胞，活化并加载Epstem-Barr病毒(EBV)复制活化剂BamHI Z向左阅读框1(BZLF1)肽24小时，并与自体T细胞一起培养10天。通过四聚体染色测定EBV特异性细胞毒性T细胞。
图26A和26B示出了人和病原体IgG结合蛋白与来自不同物种的IgG分子的结合。使用的实验程序显示在图26A中，并且代表性结果显示在图26B中，用于使用流式细胞术确定不同IgG和IgG结合蛋白之间的相互作用。单独克隆IgG结合蛋白以与来自Thata asigna病毒的2A蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)融合，其中GFP报告IgG结合蛋白的表达。为了确定IgG和IgG结合蛋白之间的相互作用，用IgG结合蛋白转染神经胶质瘤细胞，并用来自不同物种的荧光标记的IgG孵育。通过流式细胞术读取样品，分析GFP+细胞(重黑线)和GFP-细胞(填充的灰色直方图)的荧光信号强度并相互重叠。
图27A和27B示出了人原代NK细胞、B细胞、单核细胞和粒细胞天然涂覆有人IgG分子，其可用于蛋白A结合。用pH7.4或pH4培养基洗涤人PBMC，随后用荧光标记的谱系标记物和小鼠抗人IgG Fc抗体染色(如图27A所示)，或荧光标记的谱系标记物和蛋白A染色(如图27B所示)。显示了细胞标记物、人Fc和蛋白A的平均强度。
图28A-28E示出了CMV IgG结合蛋白gp68能够与人IgG1 Fc和CD16a形成三元复合物。图28A示出了从用单个IgG结合蛋白转染并用荧光标记的利妥昔单抗孵育的神经胶质瘤细胞获得的结果。图28B说明从用单个IgG结合蛋白转染并与人IgG1 Fc孵育的神经胶质瘤细胞获得的结果。图28C、28D和28E说明了从单独用荧光标记的CD16a(图28C)或在利妥昔单抗(图28D)或人IgG1 Fc(图28E)存在下孵育的转染的神经胶质瘤细胞获得的结果。填充的灰色区域代表不表达IgG结合蛋白的细胞。重黑线代表表达IgG结合蛋白的细胞。
图29A和29B示出了用转染的神经胶质瘤细胞培养7小时后原代人NK细胞的表型。图29A示出了获得CD69或CD107a表达的NK细胞和失去CD16a和CD62L的细胞的百分比。图29B是6个供体的结果的图形总结。*p<0.05。
图30表明小鼠巨细胞病毒感染允许3T3细胞结合非免疫小鼠IgG。3T3细胞未感染(填充的灰色)或用鼠巨细胞病毒感染(MCMV；重黑)24小时，并用荧光标记的IgG孵育。使用流式细胞术收集细胞。
具体实施方式
定义
在本说明书和随后的权利要求中，将提及许多术语，其应被定义为具有以下含义：
如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。
因此，例如，提及“一种组合物”包括两种或更多种此类组合物的混合物，提及“该化合物”包括两种或更多种此类化合物的混合物，提及“一种试剂”包括两种或更多种这样的试剂的混合物等。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或情况发生的实例和不发生的实例。
范围可以在本文中表达，并且当表达这样的范围时，另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一方面。将进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。还应理解，当公开一个值时，则还公开了“小于或等于”该值，“大于或等于该值”，以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的。还应理解，在整个应用程序中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点和数据点的任何组合的范围。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
术语“受试者”或“患者”是指使用本文公开的方法施用本发明的药物组合物或治疗的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”具体是指在临床医生(例如，医生)的治疗下的受试者。
通过“预防(prevent)”或该词的其他形式如“用于预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指停止特定事件或特征以稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或最小化特定事件或特征将发生的可能性。预防不需要与对照进行比较，因为它通常比例如术语“减少”更绝对。如本文所使用的，可以减少但不能预防某些事情，但也可以预防减少的事情。同样，可以预防某些事情，但不能减少，但也可以减少预防的事情。应当理解，在使用减少或预防的情况下，除非另外特别指出，否则还明确地公开了另一个词的使用。
术语“治疗(treatment)”或“在治疗(动词)”是指对象的医学管理，旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即涉及为缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即旨在最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症发展的治疗；和支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理状况或病症的特定疗法的治疗。
如本文所用，“靶细胞”是指表达Fc结合蛋白的免疫效应细胞的靶标。这包括病毒感染的细胞以及微生物，如细菌和真菌。
“宿主细胞”包括可以是或已经是病毒和/或病毒载体的受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或变化，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或总DNA互补物中)。
术语“基因”在本领域中被充分理解为意指编码多肽的多核苷酸。除多肽编码区外，基因还可包括非编码区，包括但不限于内含子、转录但未翻译的区段，以及编码区段的上游和下游的调节元件。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过包括糖基化、乙酰化、豆蔻酰化和磷酸化的反应进行翻译后修饰的蛋白质。
术语“抗体”特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性。
“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1)，需要注意的是，天然存在的Fc区和片段在氨基酸序列中可以是异质的，尤其是由于与群体相关的遗传异质性(尽管已经衍生出物种特异性的“规范”序列)。已知人免疫球蛋白，特别是其IgG实施方式表现出典型地称为同种异型的序列多态性。参见，Jefferis和Lefranc，209，Human immunoglobulin allotypes：Possible implications forimmunogenicity，mAbs 1：1-7。如本文所用，IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在整个天然存在的可变性范围内包含此类同种异型，包括其组合和混合物以及这些同种型的分离和纯化的同种异型。
如本领域普通技术人员所理解的“变体Fc区”包含通过至少一个“氨基酸修饰”而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸取代基，例如，约1至约10个氨基酸取代基，以及优选在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1至约5个氨基酸取代基。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区具有至少约80％的序列一致性，更优选至少约90％的序列一致性，更优选至少约95％的序列一致性，甚至更优选至少约99％的序列一致性。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。FcγR是与IgG抗体的Fc区结合的受体。FcγR包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可替换地剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)(例如，SEQ ID NO：21)和FcγRIIB(“抑制受体”)(例如，SEQ ID NO：22)，其具有相似的氨基酸序列，其主要区别在于其细胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
术语“Fc结合蛋白”是指结合FcγR结合位点外的IgG Fc区的任何蛋白。在特定实施方式中，Fc结合蛋白结合IgG的Fc区的区域而不干扰FcγR与IgG Fc的结合。
“有效量”是指足以产生有益或期望的临床结果(例如临床病症的改善)的量。
“启动子”通常是DNA的一个或多个序列，其在相对于转录起始位点的相对固定的位置起作用。“启动子”包含RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可含有上游元件和响应元件。
“增强子”通常是指在与转录起始位点没有固定距离的情况下起作用的DNA序列，并且可以是转录单元的5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列本身内。它们通常长度在10到300bp之间，并且它们以顺式作用。增强子的功能是增加附近启动子的转录。增强子，与启动子一样，也经常含有介导转录调节的反应元件。增强子通常决定表达的调节。
增强被动ADCC
本文公开了用于增强受试者中的被动ADCC的试剂、方法和药物组合物。在具体实施方式中，本文提供了用于治疗感染编码Fc结合蛋白的病原体的受试者的方法，其中给受试者施用本发明的药物组合物，其包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合病原体编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。在其他实施方式中，提供了用于预防患有HSV1感染的受试者的神经损伤和用于预防患有HSV1感染的受试者中的死亡的试剂、方法和药物组合物。在某些实施方式中，免疫多肽是抗体，更具体地是IgG抗体，以及特别是IgG抗体的Fc片段。在这种免疫多肽的范围内还有含IgG的抗血清。可用于该方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
Fc片段
在一些实施方式中，免疫多肽包含免疫球蛋白G(IgG)抗体的Fc区但不包含抗体的抗原结合区，例如Fab区。例如，免疫多肽可以是IgG1的片段(例如，SEQ ID NO：6)、IgG2(例如，SEQ ID NO：7)、IgG3(例如，SEQ ID NO：8)或IgG4(例如，SEQ ID NO：9)免疫球蛋白；本文给出的序列是示例性的，并且技术人员将认识到要求保护的试剂、方法和药物组合物包含IgG同型的异型变体。在一些实施方式中，免疫多肽包含IgG免疫球蛋白的Fc区、或其能够同时结合FcγR和Fc结合蛋白的片段、或其能够结合FcγR或Fc结合蛋白而非两者的片段(例如，IgG3)，并且不包含抗体的抗原结合区，例如Fab区。在具体的实施方式中，本公开的免疫多肽包含已经改变(天然地、通过基因工程或其他)以与比天然存在的IgG更高的亲和力结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域，和/或以与天然存在的IgG相比更高的亲和力结合病原体编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。免疫多肽可以是含有人IgG1片段的重组蛋白(S6B291；SEQ ID NO：10)。例如，在特定实施方式中，重组蛋白包含人IgG1的残基235-466(S6B291)(SEQ ID NO：2)，或IgG2、IgG3或IgG4的等同同源序列。免疫多肽也可以通过本领域已知的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的木瓜蛋白酶或纤溶酶消化来制备(参见，例如，CodingJ.(1983)；单克隆抗体：Principles and Practice.Academic Press Inc.,伦敦，英国)。
多肽可以是重组蛋白，含有人IgG1的残基262-466(S6B291)(SEQ ID NO：1)，或IgG2、IgG3或IgG4的等同同源序列。
Fc变体
还公开了能够同时结合FcγR和Fc结合蛋白的合成或重组多肽。在一些实施方式中，免疫多肽包含IgG免疫球蛋白的两个或更多个Fc区。在特定实施方式中，通过例如PEG化或豆蔻酰化来修饰Fc区。
在一些实施方式中，免疫多肽包含Fcγ受体结合位点，其已被修饰以增强与Fcγ受体的结合。在一些实施方式中，这涉及IgG-Fcγ受体界面的结构指导设计以产生更高的结合亲和力。在一些实施方式中，这涉及去除与IgG分子的Asn297连接的岩藻糖。在一些实施方式中，这涉及化学修饰多肽以增强Fcγ受体结合(参见，例如，Konno等人，(2010)“Controlling Fucosylation Levels of Antibodies with Osmolality during CellCulture”；In：Kamihira M.，Katakura Y.，Ito A.(eds)Animal Cell Technology:Basic&Applied Aspects.Animal Cell Technology:Basic&Applied Aspects,vol16.Springer,Dordrecht)。
在一些实施方式中，免疫效应细胞是表达Fcγ受体的免疫细胞。Fcγ受体包括CD16a、CD16b、CD32和CD64。因此，在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞或树突细胞。
疾病/病症
本文公开的方法广泛适用于需要杀死或中断靶细胞或表达Fc结合蛋白的病原体的任何疾病或病症。
在一些实施方式中，用病毒感染的病毒或感染的靶细胞表达Fc结合蛋白。例如，单纯疱疹病毒1(HSV1)和HSV2表达可以诱导被动ADCC的Fc结合蛋白糖蛋白E(gE)(SEQ ID NO：5)。疱疹病毒巨细胞病毒(CMV)表达可诱导被动ADCC的Fc结合蛋白68kDa-糖蛋白(gp68)。需注意的是，CMV gp32也结合IgG Fc，但它与IgG Fc上与CD16a相同的结合位点竞争，因此它不会诱导被动ADCC。另外，水痘带状疱疹病毒(VZV)表达IgG结合蛋白gE，其是HSV1 gE的同源物(参考PMC241147和PMID：2167554)。
可由本发明的试剂、方法和药物组合物靶向的病毒通常包括但不限于以下家族中的那些：小核糖核酸病毒科；杯状病毒科；披膜病毒科；黄病毒科；冠状病毒科；炮弹状病毒科；丝状病毒科；副粘病毒科；正粘病毒科；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；呼肠孤病毒科；逆转录病毒科；肝病毒科；细小病毒科；乳多空病毒科；腺病毒科；疱疹病毒科和痘病毒科。
在一些实施方式中，病原体是细菌，例如金黄色葡萄球菌、链球菌或大肠杆菌。金黄色葡萄球菌表达Fc结合蛋白A，链球菌表达Fc结合蛋白蛋白G、蛋白H和M1蛋白，并且大肠杆菌表达Fc结合蛋白M1蛋白。因此，在一些实施方式中，Fc结合蛋白包含蛋白G、蛋白H或M1蛋白。
细菌通常包括但不限于：铜绿假单胞菌；大肠杆菌；克雷伯氏菌属；沙雷氏菌属；假单胞菌属；不动杆菌属；表皮葡萄球菌；粪肠球菌；肺炎链球菌；金黄色葡萄球菌；嗜血杆菌属；奈瑟氏菌属；脑膜炎奈瑟菌；拟杆菌属；柠檬酸杆菌属；布兰汉氏球菌属；沙门氏菌属；志贺氏杆菌属；化脓性链球菌；梭菌属；丹毒丝菌属；李斯特菌属；多杀巴斯德菌；链杆菌属；螺菌属；梭旋菌属；梅毒螺旋菌；包柔氏螺旋体菌属；放线菌属；支原体属；衣原体属；立克次氏体菌属；螺旋体菌属；军团菌属；分支杆菌属；尿素原体菌属；链霉菌属；毛滴虫属；和奇异变形杆菌。
寄生虫通常包括但不限于：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫；弓形虫；墨西哥利什曼原虫、热带利什曼原虫、硕大利什曼原虫、埃塞俄比亚利什曼原虫、杜氏利什曼原虫克氏锥虫、布氏锥虫、曼氏裂体吸虫、埃及血吸虫、日本血吸虫；旋毛虫；班氏丝虫；马来丝虫；痢疾变形虫、蛲虫；猪带绦虫、牛带绦虫、阴道毛滴虫、人毛滴虫、口腔毛滴虫、蓝氏贾第鞭毛虫；微小隐孢子虫、卡氏肺孢子虫、卡氏肺孢子虫、分歧巴贝虫、田鼠巴贝虫、贝氏等孢子球虫、L hominis、脆双核阿米巴、旋盘尾丝虫；人蛔虫、美洲钩虫、十二指肠钩口线虫、粪类圆线虫、菲律宾毛细线虫、广州管圆线虫、微小膜壳绦虫、阔节裂头绦虫、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫；卫氏并殖吸虫、卡利并殖吸虫、中华枝睾吸虫、猫后睾吸虫、G.Viverini、肝片吸虫、疥螨、人虱、阴虱；和人肤蝇。
真菌通常包括但不限于：新型隐球菌、皮炎芽生菌、皮炎阿耶洛霉、荚膜组织孢浆菌；粗球袍子菌(Coccidioides immitis)、念珠菌属菌种，包括白色念珠菌、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、季也蒙假丝酵母和克鲁斯假丝酵母；曲霉属菌株，包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉；根霉属菌种；根毛霉属菌种；小克银汉霉属菌种；节壶霉属菌种，包括A.saksenaea、A.mucor和A.absidia；申克孢子丝菌、巴西副球孢子菌；假阿利什霉菌、光滑球拟酵母；以及皮癣菌属菌种。
抑制被动ADCC
还公开了用于抑制或减少被动ADCC的方法、试剂和药物组合物。这些方法通过抑制被动ADCC来降低受试者中免疫效应细胞的细胞毒性。
在一些实施方式中，免疫多肽是经修饰以不结合Fcγ受体(FcγR)的IgG免疫球蛋白的片段。例如，免疫多肽不包含SEQ ID No.10的氨基酸235-262，或其功能等同物。例如，多肽可以是缺乏CD16a、CD32或CD64结合位点的IgG片段。例如，多肽可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的片段。在一些实施方式中，免疫多肽是来自多于一个抗体亚类的片段。
在本文的一些实施方式中，提供了用于减少接受抗癌治疗的受试者中的炎症的试剂、方法和药物组合物。本文公开的方法包括：施用治疗有效量的免疫多肽，所述免疫多肽包含结合Fc结合蛋白的区域但不包含结合Fcγ受体(FcγR)的区域；以及施用包含单克隆抗体药物的抗癌治疗，其中免疫多肽不包含SEQ ID No.10的氨基酸235-262，或其功能等同物。
在一些实施方式中，采用治疗性抗体治疗受试者，治疗性抗体例如利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、阿仑单抗或派姆单抗。大多数治疗性单克隆抗体药物由哺乳动物宿主细胞系产生以靶向特异性抗原。副作用和治疗功效的降低可能由各种天然Fc结合蛋白复合(sequestration)抗体引起。所公开的方法可以减少抗体介导的输注毒性(所谓的“第一剂量效应”)的副作用，但是增强基于抗体的免疫疗法。
在一些实施方式中，本文提供了用于治疗经历溶瘤HSV1病毒疗法的受试者的试剂、方法和药物组合物。在其他实施方式中，提供了用于增强受试者的溶瘤病毒治疗的方法、试剂和药物组合物，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含多肽，所述多肽包含结合靶细胞上的Fc结合蛋白的区域，但不包含结合FcγR的区域。例如，其中免疫多肽不包含SEQ ID No.10的氨基酸235-262，或其功能等同物。
该方法可用于在肿瘤的溶瘤病毒感染(因此该病毒可能扩散到其他肿瘤细胞)后早期抑制被动ADCC。尽管在溶瘤病毒感染肿瘤(因此该病毒可能扩散到其他肿瘤细胞)后尽早抑制被动ADCC可能是有利的，但所公开的方法还可用于在肿瘤细胞被感染后增强被动ADCC以增强肿瘤细胞的杀伤。
因此，在一些实施方式中，本文公开的方法提供了药物组合物，所述组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合靶细胞上的Fc结合蛋白的非重叠结构域。在某些实施方式中，免疫多肽是抗体，更具体地是IgG抗体，以及特别是IgG抗体的Fc片段。在这种免疫多肽的范围内还有含IgG的抗血清。可用于所述方法并包含在本文公开的药物组合物中的免疫多肽的特征是所述IgG抗体的功效和效用与其抗原特异性无关。
如上，免疫效应细胞可以是表达Fcγ受体的任何免疫细胞。Fcγ受体包括CD16a、CD16b、CD32和CD64。因此，在一些实施方式中，免疫效应细胞是T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞、或者树突细胞。
由异位基因表达介导的差异细胞裂解(DC-MEGE)
本文还公开了用于识别调节病毒感染细胞和免疫效应细胞相互作用的基因的方法。该方法在本文中称为由异位基因表达(DC-MEGE)介导的差异细胞裂解。该方法提供了对人淋巴细胞与被病毒感染的靶细胞表达的每个基因之间相互作用的全面理解。
所公开的方法可以包括：用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含候选病毒基因和与表达控制序列可操作地连接的报告基因；将转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞暴露于细胞毒性免疫效应细胞；以及测定暴露的转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞，以根据报告基因表达或活性测定细胞死亡。在这些方法中，与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的细胞死亡减少表明病毒基因抑制免疫效应细胞，或换句话说，保护转染的宿主细胞免受免疫效应细胞；并且与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的细胞死亡增加表明病毒基因活化免疫效应细胞，或换句话说，使转染的宿主细胞对免疫效应细胞敏感。
在特定的实施方式中，报告基因是荧光基因，其中暴露的转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞通过流式细胞术测定以根据荧光性测量细胞死亡，其中与未转染的宿主细胞相比，荧光转染的宿主细胞百分比的增加表明病毒基因保护转染的宿主细胞免受免疫效应细胞，并且其中与未转染的宿主细胞相比，转染的宿主细胞的平均荧光减少表明病毒基因使转染的宿主细胞对免疫效应细胞敏感。
例如，其中仅杀死未感染的非荧光细胞并且荧光度增加的荧光读数表明转染的靶细胞被保护免于杀死。其中仅杀死感染的荧光细胞并且荧光度降低的荧光读数表明转染的靶细胞易于被杀死。其中荧光度没有变化的荧光读数表明靶细胞对细胞毒性淋巴细胞杀伤保持不变。
荧光蛋白基因的实例包括：AcGFPl、Azami-Green、Azurite BFP、BFP、CFP、Citrine、Clover、CopGFP、Cycle 3 GFP、CyOFPl、CyPet、dlEGFP、d2ECFP、d2EGFP、d2EYFP、d4EGFP、daGFP、Dendra2、dKeima-Red、dKeima570、Dronpa-Greenl、Dronpa-Green3、DsRed-Express、DsRed-Express2、DsRed-Max、DsRed-Monomer、DsRed.T3、DsRedl、DsRed2、dTomato、E2-Crimson、E2-Orange、E2-Red/Green、EBFP、EBFP2、ECFP、ecliptic pHluorin、EGFP、Emerald GFP、EosFP、EYFP、Fast-FT、Fluorescent Timer、FusionRed、GFP、GFPuv、HcRedl、hdKeima-Red、hdKeima570、hKikGRl、hKO、hmAzami-Green、hMGFP、hmKeima-Red、hmKeima8.5、hmKikGRl、hmKO、hmK02、hmMiCyl、hmUkGl、hrGFP、IFP1.1、IFP1.4、IFP2.0、iRFP670、iRFP682、iRFP702、iRFP713、iRFP720、Kaede、KikGRl、KillerRed、Kohinoor、Kusabira-Orange、LanYFP、LSSmKatel、LSSmKate2、LSSmOrange、mAmetrine、mAmetrinel.l、mApple、mAzami-Green、mCardinal、mCerulean、mCherry、mCherry2、mClavGR2、mClover2、mClover3、mECFP、Medium-FT、mEGFP、mEmerald、mEos2、mEos3.2、mEos4a、mEos4b、mEYFP、mgfp5、mHoneydew、MiCy、mIFP、miniSOG、mKalamal、mKate2、mKeima-Red、mKikGRl、mKO、mK02、mMaple、mMiCyl、mNectarine、mNeonGreen、mNeptune、mNeptune2、mNeptune2.5、mOrange、mOrange2、mPapayal、mPlum、mRaspberry、mRFPl、mRuby、mRuby2、mRuby3、mseCFP、mTagBFP2、mTangerine、mTFPl、mTurquoise、mTurquoise2、mUkGl、mVenus、mWasabi、PA-GFP、PA-TagRFP、pAcGFPl、pAcGFPl-1、pAcGFPl-Cl、pAcGFPl-C2、pAcGFPl-C3、pAcGFPl-C In-Fusion Ready、pAcGFPl-Nl、pAcGFPl-N2、pAcGFPl-N3、pAcGFPl-N In-Fusion Ready、pAG-Sl、PAmCherry、PAmCherryl、pAmCyan、pAmCyanl-Cl、pAmCyanl-Nl、PAmKate、pAsRed2、pAsRed2-Cl、pAsRed2-Nl、pdlEGFP-Nl、pd2ECFP-Nl、pd2EGFP-Nl、pd2EYFP-Nl、pd4EGFP-Nl、pDendra2、pDendra2-C、pDendra2-N、pDGl-Sl、pDG3-Sl、pdKeima-Red-Sl、pdKeima570-Sl、pDsRed-Express、pDsRed-Express-1、pDsRed-Express-Cl、pDsRed-Express-Nl、pDsRed-Express2、pDsRed-Express2-1、pDsRed-Express2-Cl、pDsRed-Express2-Nl、pDsRed-Monomer-Cl、pDsRed-Monomer-C In-Fusion Ready、pDsRed-Monomer-Nl、pDsRed-Monomer-N In-Fusion Ready、pDsRed2、pDsRed2-l、pDsRed2-Cl、pDsRed2-Nl、pE2-Crimson、pE2-Crimson-Cl、pE2-Crimson-Nl、pECFP、pECFP-1、pECFP-Cl、pECFP-Nl、pEGFP、pEGFP-1、pEGFP-Cl、pEGFP-C2、pEGFP-C3、pEGFP-Nl、pEGFP-N2、pEGFP-N3、pEYFP、pEYFP-1、pEYFP-Cl、pEYFP-Nl、pFusionRed-B、pFusionRed-C、pFusionRed-N、pGFP、pGFPuv、pGLO、pHcRedl、pHcRedl-1、pHcRedl-Cl、pHcRedl-Nl_l、phdKeima-Red-Sl、phdKeima570-Sl、phKikGRl-Sl、phKOl-Sl、phmAGl-Sl、phMGFP、phmKeima-Red-Sl、phmKOl-Sl、phmUkGl-Sl、pHTomato、pHuji、pKaede-Sl、pKikGRl-Sl、pKillerRed-B、pKillerRed-C、pKillerRed-N、pKindling-Red-B、pKindling-Red-N、pKOl-Sl、pLSSmOrange-Cl、pLSSmOrange-Nl、pmAGl-Sl、pmBanana、pmCherry、pmCherry-1、pmCherry-Cl、pmCherry-Nl、pMiCyl-Sl、pmKate2-C、pmKate2-N、pmKeima-Red-Sl、pmKikGRl-Sl、pmKOl-Sl、pmK02-Sl、pmMiCyl-Sl、pmOrangepmOrange2、pmOrange2-Cl、pmOrange2-Nl、pmPlum、pmRaspberry、pmStrawberry、pmUkGl-Sl、pNirFP-C、pNirFP-N、pPA-TagRFP-C、pPA-TagRFP-N、pPAmCherry-Cl、pPAmCherry-Nl、pPAmCherryl-Cl、pPAmCherryl-Nl、pPhi-Yellow-B、pPhi-Yellow-C、pPhi-Yellow-N、pPhi-Yellow-PRL、pPS-CFP2-C、pPS-CFP2-N、pPSmOrange-Cl、pPSmOrange-Nl、pRSET-BFP、pRSET-CFP、pRSET-EmGFP、PS-CFP2、PSmOrange、PSmOrange2、pTagBFP-C、pTagBFP-N、pTagCFP-C、pTagCFP-N、pTagGFP2-C、pTagGFP2-N、pTagRFP-C、pTagRFP-N、pTagYFP-C、pTagYFP-N、ptd-Tomato-Nl、ptdTomato、ptdTomato-Cl、pTimer、pTimer-1、pTurboFP602-B、pTurboFP602-C、pTurboFP602-N、pTurboFP602-PRL、pTurboGFP-B、pTurboGFP-C、pTurboGFP-N、pTurboGFP-PRL、pTurboRFP-B、pTurboRFP-C、pTurboRFP-N、pTurboRFP-PRL、pTurboYFP-B、pTurboYFP-C、pTurboYFP-N、pTurboYFP-PRL、pZsGreen、pZsGreenl-1、pZsGreenl-Cl、pZsGreenl-Nl、pZsYellow、pZsYellowl-Cl、pZsYellowl-Nl、ratiometric pHluorin、Rhacostoma GFP、rsEGFP、rsEGFP2、rsTagRFP、Slow-FT、super-ecliptic pHluorin、superfolder GFP、TagBFP、TagCFP、TagGFP2、TagRFP、TagRFP-T、TagRFP657、TagYFP、tdTomato、TurboFP602、TurboFP635、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、yeGFP、YFP、YPet、ZsGreen、ZsGreenl、和ZsYellowl。在特定的实施方式中，该基因编码绿色荧光蛋白(参见Chalfie等人，1994，Science 263,802-805)。
可以对病毒基因组中的每个基因重复该过程。例如，该方法可以进一步包括分别对病毒基因组中的每个基因重复该过程，或者对病毒基因组中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多基因的组合重复该过程。
这些方法可以与任何具有细胞毒性或者分泌一些指示活化或抑制的生物标记物(例如，细胞因子)的免疫效应细胞一起使用。例如，细胞毒性免疫效应细胞可以是CD4+T细胞、8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、粒细胞或树突细胞。可以对每个候选免疫效应细胞单独或与其他免疫细胞或生物活性剂组合重复上述方法。
所公开的方法还可用于测定候选药物对基因影响细胞裂解的能力的影响。例如，如果发现基因保护细胞免受免疫效应细胞的杀伤，则可以在将来的测定中添加一系列候选药物以找到抑制基因保护的药物。
基于宿主细胞在病毒感染、表达外源蛋白质或天然状态时对免疫效应细胞的已知易感性或抗杀伤性来选择宿主细胞。宿主细胞可以是从动物或人类受试者分离的原代细胞。宿主细胞可以是细胞系，例如永生化细胞系。宿主细胞可包括单细胞类型或细胞混合物。宿主细胞可以在悬浮液中、在表面上(二维)或在三维基质中培养。
本文公开的方法包括将转染的宿主细胞和未转染的宿主细胞暴露于细胞毒性免疫效应细胞。该步骤可包括在标准培养条件(37℃，5％CO2)或增强或抑制免疫细胞和宿主细胞功能的相关实验设置下共培养宿主细胞和细胞毒性免疫效应细胞。
重组溶瘤HSV
尽管应用了可用的联合疗法，但是多形性胶质母细胞瘤(GBM)仍是一致致命的疾病。包含溶瘤HSV(“oHSV”)载体的复制型病毒代表了有前景的治疗选择。
如本文所公开的，HSV Us8、UL12、UL30、US3和Us12基因使得神经胶质瘤细胞更容易被NK细胞杀死。因此，本文还公开了重组溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)，其包含Us8基因中的一个或多个活化突变、UL12基因中的一个或多个活化突变、UL30基因中的一个或多个活化突变、Us3基因中的一个或多个活化突变、Us12基因中的一个或多个活化突变，或其任何组合。HSV基因的活化突变在本领域中是已知的。参见或例如，US 8,092,791；US 9,623,059；WO 2007052029；WO 2009052426；WO 2017013419；WO 2017132552；Varghese&Rabkin，2002，Cancer Gene Ther.9,967-978；Grandi等人，2009，Expert Rev Neurother.9,505-517；和Sokolowski等人，2015，Oncolytic Virother.4,207-219。对HSV溶瘤病毒的这些修饰可以增强溶瘤病毒的肿瘤杀伤。
所公开的oHSV可以源自几种不同类型的疱疹病毒。疱疹病毒科是一大类DNA病毒，其可引起人类和动物的疾病。疱疹病毒分为三个亚科，α、β和γ。疱疹病毒都享有共同的结构，并且由相对较大的双链线性DNA基因组组成，该基因组编码100-200个基因，这些基因被包裹在称为衣壳的二十面体蛋白笼内，该衣壳本身被包裹在称为包膜的脂质双层膜中。大基因组提供许多非必需位点用于引入一种或多种转基因而不灭活病毒(例如，不完全抑制感染或复制)。然而，应该理解的是，优选修饰(例如，复制条件、减毒等)病毒载体，使得它们不具有不想要的作用(例如，杀死正常细胞、引起疾病等)。
如本文所用，溶瘤疱疹病毒是指许多具有疱疹病毒来源的治疗性病毒中的任何一种，其可用于杀死癌细胞，特别是癌症干细胞，和/或抑制肿瘤的生长，例如通过杀死肿瘤中的癌症干细胞。通常，溶瘤疱疹病毒是野生型疱疹病毒的突变形式。在一些情况下，当野生型疱疹病毒属于亚家族α(即，是单纯疱疹病毒)时，溶瘤疱疹病毒可被称为溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)。在某些情况下，oHSV是复制条件性疱疹病毒。复制条件性疱疹病毒被设计成优先在活跃分裂的细胞，例如癌细胞，特别是癌症干细胞中复制。因此，这些复制条件病毒靶向癌细胞用于溶瘤作用，并在这些细胞中复制，使病毒可以传播到其他癌细胞。在优选实施方式中，复制条件性疱疹病毒靶向癌干细胞用于溶瘤作用，并在这些细胞中复制，使病毒可以传播到其他癌干细胞。
所公开的oHSV可包含影响病毒基因表达的许多突变中的任何一种。在大多数情况下，突变是毒力基因，气有助于病毒对宿主生物的致病性。突变可以是点突变、缺失、倒位或插入。通常，突变是失活突变。如本文所用，术语“失活突变”旨在广义地指基因的突变或改变，其中该基因的表达显著降低，或其中基因产物无功能或其功能能力显著降低。
已经开发了几种类型的复制条件性疱疹病毒突变体，并且可用于本文公开的方法的方面。例如，一方面涉及病毒突变体，其具有核酸代谢所需的病毒基因功能缺陷，例如胸苷激酶(Martuza等人，1991，Science 252：854-856)、核糖核苷酸还原酶(RR)(Goldstein&Weller，1988，J.Virol.62：196-205；Boviatsis等人,1994,Gene Ther.1:323-331；Boviatsis等人,1994,Cancer Res.54:5745-5751；Mineta等人,1994,Cancer Res.54:3363-3366),或尿嘧啶-N-糖基化酶(Pyles and Thompson,1994,J.Virol.68:4963-4972)。另一方面涉及具有γ-34.5基因功能缺陷的病毒突变体(Chambers等人,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1411-1415)，其通过抑制宿主蛋白质合成的关闭显著增强感染细胞的病毒爆发大小起到毒力因子的作用(Chou等人，1990，Science 250：1262-1266；Chou and Roizman,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:3266-3270)。其他实例包括G207(Mineta等人，1995，Nat.Med 1：938-943；1996年12月17日授予Martuza等人的美国专利No.5,585,096)和MGH1(Kramm等人，1997，Hum.Gene Ther.8：2057-2068)，其具有γ-34.5的两个拷贝和RR的插入突变的缺失。
所公开的oHSV可以包含基于疱疹病毒的病毒，例如单纯疱疹病毒(HSV)，例如HSV-1(例如，HSV-1菌株F或菌株Patton)或HSV-2，其包括毒力基因中的失活突变。在单纯疱疹病毒的情况下，该突变可以是γ-34.5基因中的失活突变，其是主要的HSV神经毒力决定因素。
以上和本文及其他地方描述的任何病毒可包括另外的突变或修饰，突变或修饰用于防止病毒逆转为野生型。例如，病毒可以包括ICP6基因(SEQ ID NO：26)中的突变，其编码核糖核苷酸还原酶的大亚基。
所公开的oHSV还可以包括编码异源基因产物的序列，例如疫苗抗原或免疫调节蛋白。携带异源基因产物的病毒也可称为增强病毒。
如果病毒还含有编码一种或多种治疗剂的异源核酸序列，例如细胞毒素、免疫调节蛋白(即增强或抑制宿主对抗原的免疫应答的蛋白质)、肿瘤抗原、小干扰核酸、反义RNA分子或核酶，则可以增强所公开的oHSV的效果。
免疫调节蛋白的实例包括，例如，细胞因子(例如，白细胞介素、α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF))、趋化因子(例如，中性粒细胞活化蛋白(NAP)、巨噬细胞化学引诱物和活化因子(MCAF)、RANTES和巨噬细胞炎症肽MIP-1a和MIP-1b)、补体成分及其受体、免疫系统辅助分子(例如，B7.1和B7.2)、粘附分子(例如，ICAM-1、2和3)，以及粘附受体分子。
在非限制性实例中，可以使用本方法产生的肿瘤抗原的实例包括人乳头瘤病毒的E6和E7抗原、EBV衍生的蛋白质(Van der Bruggen等人，1991，Science 254：1643-1647)，粘蛋白(Livingston等人,1992,Curr.Opin.Immun.4(5):624-629),例如MIJC1(Burchell等人,1989,Int.J.Cancer 44:691-696)，黑素瘤酪氨酸酶和MZ2-E(Van der Bruggen等人，同上)。
治疗剂也可以是RNA分子，例如反义RNA分子，其通过杂交相互作用可用于阻断细胞或病原体mRNA的表达。或者，RNA分子可以是核酶(例如，锤头状核酶或发夹状核酶)，其设计用于修复缺陷型细胞RNA，或用于破坏不需要的细胞或病原体编码的RNA(参见，例如，Sullenger，1995,Chem.Biol.2(5):249-253；Czubayko等人,1997,Gene Ther.4(9):943-949；Rossi,1997,Ciba Found.Symp.209：195-204；James等人,1998,Blood 91(2):371-382；Sullenger,1996,Cytokines Mol.Ther.2(3):201-205；Hampel,1998,Prog.NucleicAcid Res.Mol.Bio.58：1-39；和Curcio等人,1997，Pharmacol.Ther.74(3):317-332)。
在一些实施方式中，治疗剂可以是能够抑制与癌症相关的基因(例如致癌基因)表达的小干扰核酸分子。抑制这些基因及其同源物表达的小干扰核酸(例如，shRNA、miRNA)可用作该方法的某些实施方式中的治疗剂。与各种癌症相关的癌基因是本领域熟知的，并且在非限制性实例中，在Cooper，1995，Oncogenes.Jones and Bartlett Publishers和Vogelstein和Kinzler，1998，The Genetic Basis of Human Cance中公开。McGraw-Hill的内容通过引用整体并入本文。
可以将异源核酸序列插入公开的oHSV中使其处于病毒调控序列控制之下的位置。或者，异源核酸序列可以作为表达盒的一部分插入，所述表达盒包括调节元件，例如启动子或增强子。本领域普通技术人员可基于例如所需的组织特异性和表达水平选择合适的调节元件。例如，细胞类型特异性或肿瘤特异性启动子可用于限制基因产物向特定细胞类型的表达。这是特别有用的，例如，当在肿瘤细胞中产生细胞毒性、免疫调节或肿瘤抗原基因产物以促进其破坏时。除了使用组织特异性启动子之外，本发明病毒的局部施用可导致局部表达和作用。
可用于所公开的oHSV的非组织特异性启动子的实例包括早期巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号No.4,168,062)和劳斯肉瘤病毒启动子(Norton等人，1985，Molec.Cell.Biol.5：281)。此外，可以使用HSV启动子，例如HSV-1 IE和IE4/5启动子。
可用于所公开的oHSV的组织特异性启动子的实例包括，例如，前列腺特异性抗原(PSA)启动子，其对前列腺细胞是特异的；结蛋白启动子，其对肌肉细胞是特异的(Li等人，1989，Gene 78：243；Li et al,1991,J.Biol.Chem.266：6562；Li等人,1993,J.Biol.Chem.268：10403)；烯醇酶启动子，其对神经元是特异的(Forss-Petter等人，1986，J.Neurosicience Res.16(1):141-156)；β-球蛋白启动子，其对红系细胞是特异的(Townes等人，1985，EMBO J.4：1715)；tau-球蛋白启动子，其也同样对红系细胞是特异的(Brinster等人，1980，Nature 283：499)；生长激素启动子，其对垂体细胞是特异的(Behringer等人，1988，Genes Dev.2：453)；胰岛素启动子，其对胰岛β细胞是特异的(Selden等人，1986，Nature 321：545)；胶质原纤维酸性蛋白启动子，其对星形胶质细胞是特异的(Brenner等人，1994，J.Neurosci.14：1030)；酪氨酸羟化酶启动子，其对儿茶酚胺能神经元是特异的(Kim等人，1993，J.Biol.Chem.268：15689)；淀粉样蛋白前体蛋白启动子，其对神经元是特异的(Salbaum等人，1988，EMBO J.7：2807)；多巴胺β-羟化酶启动子，其对去甲肾上腺素能神经元和肾上腺素能神经元是特异的(Hoyle等人，1994，J.Neurosci.14：2455)；色氨酸羟化酶启动子，其对5-羟色胺/松果腺细胞是特异的(Boularand等人，1995，J.Biol.Chem.270：3757)；胆碱乙酰转移酶启动子，其对胆碱能神经元是特异的(Hersh等人，1993，J.Neurochem.61：306)；芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)启动子，其对儿茶酚胺能/5-HT/D-型细胞是特异的(Thai等人，1993，Mol.Brain Res.17：227)；脑啡肽原启动子，其对神经元/生精附睾细胞是特异的(Borsook等人，1992，Mol.Endocrinol.6：1502)；reg(胰腺结石蛋白)启动子，其对结肠和直肠肿瘤以及胰腺和肾细胞是特异的(Watanabe等人，1990，JBiol.Chem.265：7432)；和甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)启动子，其对肝和盲肠肿瘤，以及神经鞘瘤、肾、胰腺和肾上腺细胞是特异的(Campos等人，1992，Mol.Endocrinol.6：1642)。
在肿瘤细胞中特异性起作用的启动子的实例包括溶基质素3启动子，其对乳腺癌细胞是特异的(Basset等人，1990，Nature 348：699)；表面活性蛋白A启动子，其对非小细胞肺癌细胞是特异的(Smith等人，1994，Hum.Gene Ther.5：29-35)；分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)启动子，其对表达SLPI的癌症是特异的(Garver等人，1994，Gene Ther.1：46-50)；酪氨酸酶启动子，其对黑素瘤细胞是特异的(Vile等人，1994，Gene Therapy1：307；WO94/16557)；应力诱导的grp78/BiP启动子，其对纤维肉瘤/致瘤细胞是特异的(Gazit等人，1995，Cancer Res.55(8):1660)；AP2脂肪增强剂，其对脂肪细胞是特异的(Graves，1992，J.Cell.Biochem.49：219)；a-1抗胰蛋白酶转甲状腺素蛋白启动子，其对肝细胞是特异的(Grayson等人，1988，Science 239：786)；白细胞介素-10启动子，其对多形性胶质母细胞瘤细胞是具有特异的(Nitta等人，1994，Brain Res.649：122)；c-erbB-2启动子，其对胰腺细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、卵巢癌细胞和非小细胞肺细胞是特异的(Harris等人，1994，Gene Ther.1：170)；a-B-晶状体蛋白/热休克蛋白27启动子，其对脑肿瘤细胞是特异的(Aoyama等人，1993，Int.J.Cancer 55：760)；碱性成纤维细胞生长因子启动子，其对神经胶质瘤和脑膜瘤细胞是特异的(Shibata等人，1991，Growth Fact.4：277)；表皮生长因子受体启动子，其对鳞状细胞癌、神经胶质瘤和乳腺肿瘤细胞是特异的(Ishii等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：282)；粘蛋白样糖蛋白(DF3，MUC1)启动子，其对乳腺癌细胞是特异的(Abe等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.90：282)；mtsl启动子，其对转移性肿瘤是特异的(Tulchinsky等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9146)；NSE启动子，其对小细胞肺癌细胞是特异的(Forss-Petter等人，1990，Neuron 5：187)；生长抑素受体启动子，其对小细胞肺癌细胞是特异的(Bombardieri等人，1995，Eur.J.Cancer 31A：184；Koh等人，1995，Int.J.Cancer 60：843)；c-erbB-3和c-erbB-2启动子，其对乳腺癌细胞是特异的(Quin等人，1994，Histopathology 25：247)；c-erbB4启动子，其对乳腺癌细胞和胃癌细胞是特异的(Rajkumar等人，1994，Breast Cancer Res.Trends 29：3)；甲状腺球蛋白启动子，其对甲状腺癌细胞是特异的(Mariotti等人，1995，J.Clin.Endocrinol.Meth.80：468)；甲胎蛋白启动子，其对肝细胞瘤细胞是特异的(Zuibel等人，1995，J.Cell.Phys.162：36)；绒毛蛋白启动子，其对胃癌细胞是特异的(Osbom等人，1988，VirchowsArch.A.pathol.Anat.Histopathol,413：303)；和白蛋白启动子，其对肝细胞瘤细胞是特异的(Huber，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：8099)。
所公开的oHSV可用于治疗患有(例如，隐藏)或具有患癌症干细胞(CSC)和/或具有CSC的肿瘤(例如，肿瘤持续生长依赖于CSC；这种肿瘤也可称为CSC依赖性肿瘤)的风险的受试者。受试者是否被认为具有CSC或具有CSC的肿瘤的“风险”是可以由照顾受试者的专业医师确定的。可以使用任何合适的诊断测试和/或标准。例如，在下列情况下受试者可被认为处于患有CSC或具有CSC的肿瘤的“风险”：如果(i)受试者具有突变、遗传多态性基因或蛋白质表达谱，和/或血液中特定物质的存在，与没有突变或遗传多态性的一般人群的其他成员相比，该特定物质与发展或患癌症的风险增加有关；(ii)受试者具有一种或多种风险因素，例如具有癌症家族史、暴露于致癌物质或肿瘤促进剂或病症，例如石棉、烟草烟雾、黄曲霉毒素、辐射、慢性感染/炎症等、高龄；(iii)受试者有一种或多种癌症症状等。
在一些实施方式中、癌症是结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、宫颈癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、黑色素瘤或睾丸肿瘤。在一个实施方式中，癌症是神经胶质瘤。在一个实施例中，癌症是乳腺癌或前列腺癌。其他癌症对于本领域普通技术人员来说是已知的。
在特定的实施方式中，癌症是脑癌。在一些实施方式中，癌症是神经胶质瘤。神经胶质瘤是一种源自神经胶质细胞的原发性中枢神经系统(CNS)肿瘤。除大脑外，神经胶质瘤还可以影响脊髓或CNS的任何其他部分，如视神经。本发明方法可用于治疗的神经胶质瘤包括室管膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和混合神经胶质瘤，例如少突星型细胞瘤。在一些实施方式中，神经胶质瘤含有为CD133+的癌症干细胞。在一些实施方式中，神经胶质瘤是胶质母细胞瘤。
神经胶质瘤根据其等级进一步分类，其通过肿瘤的病理学评估来确定。低级别神经胶质瘤分化良好(非间变性)；这些都是良性的并且预示着患者的预后更好。高级别神经胶质瘤是未分化的或间变性的；这些都是恶性的并且预后较差。在使用的众多分级系统中，最常见的是世界卫生组织(WHO)星形细胞瘤分级系统。WHO系统指定的等级从1到4，其中1为最不具攻击性且4为最具攻击性。各种类型的星形细胞瘤给予相应的WHO等级。WHO1级包括例如毛细胞星形细胞瘤；世界卫生组织2级包括例如弥漫性或低级星形细胞瘤；WHO3级包括例如间变性(恶性)星形细胞瘤；以及WHO4级包括例如多形性胶质母细胞瘤(成人中最常见的神经胶质瘤)。因此，在一些实施方式中，本发明的方法可用于治疗患有WHO1级、2级、3级或4级神经胶质瘤的患者(受试者)。
还公开了在受试者中诱导针对癌症的系统性免疫应答的方法，其包括向受试者施用本文公开的oHSV。疱疹病毒可以例如施用于受试者的肿瘤。另外，患者可能患有或有发展转移性癌症的风险，并且可以进行治疗以治疗或预防这种癌症。
重组HSV疫苗
同样如本文所公开的，HSV gE和gl增强被动ADCC并促进携带FcγR的免疫细胞对HSV1感染的清除。因此，公开了一种HSV疫苗，其包含含有编码gE和gl的HSV Us7和Us8基因的病毒载体。这些基因可以共同或独立地与表达控制序列可操作地连接，所述表达控制序列促进感染细胞中gE和gl的早期和/或更高表达以促进被动ADCC。
在一些实施方式中，载体是减毒的HSV载体。构建含有遗传序列和适当的转录和翻译控制元件的表达载体的方法已经很好地建立并且之前描述过(Kambara等人，2005，Cancer Res.65,2832-9)。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。这些技术在Sambrook等人，Molecular Cloning，实验室手册(Cold Spring Harpor Press，Plainview，N.Y.，1989)和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons，New York，N.Y.，1989)中均有描述。
表达载体通常含有调节序列，用于翻译和/或转录插入的编码序列必须的元件。例如，编码序列优选与启动子和/或增强子可操作地连接，以帮助控制所需基因产物的表达。
根据基因表达的预期控制类型，生物技术中使用的启动子具有不同的类型。它们通常可分为组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子和合成启动子。增强子通常是指在与转录起始位点没有固定距离的情况下起作用的DNA序列，并且可以是转录单元的5’或3’。此外，增强子可以在内含子内以及编码序列内。它们通常长度在10到300bp之间，并且它们以顺式作用。增强子的功能是增加附近启动子的转录。增强子也通常含有介导转录调节的反应元件。启动子还可以包含介导转录调节的响应元件。增强子通常决定基因表达的调节。虽然现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中已知许多增强子序列，但通常会使用来自真核细胞病毒的增强子用于一般表达。优选的实例是复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
在优选的实施方式中，启动子是即刻早期(IE)启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子，或EFla、CAG、SV40、PGK1、Ubc、人β肌动蛋白启动子等。
治疗
公开的组合物可以在治疗上与药学上可接受的载体组合使用。“药学上可接受的”是指在生物学上或其他方面合乎需要的材料，即，该材料可以施用于受试者而不会引起任何不希望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，选择载体以使活性成分的任何降解最小化并使受试者中的任何不良副作用最小化。
当制备本文公开的多肽或病毒载体用于施用时，其可以与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。此类制剂中的总活性成分包括制剂重量的0.1至99.9％。“药学上可接受的”物质是载体、稀释剂、赋形剂和/或盐，其与制剂的其他成分相容，并且对其接受者无害。给药的活性成分可以粉末或颗粒、作为溶液、悬浮液或乳液存在。
可以配制和施用载体或多肽(活性成分)以通过任何产生活性成分与药剂在生物体内的作用部位接触的方式来治疗多种疾病状态。它们可以通过任何可用于与药物联合使用的常规方法给药，作为单独的治疗活性成分或治疗活性成分的组合。它们可以单独给药，但通常与基于所选给药途径和标准药学实践选择的药物载体一起给药。
通常，水、合适的油、盐水、右旋糖(葡萄糖)水溶液和相关的糖溶液和二醇如丙二醇或聚乙二醇是肠胃外溶液的合适载体。用于肠胃外给药的溶液含有活性成分、合适的稳定剂和必要时的缓冲物质。单独或组合的抗氧化剂如硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和乙二胺四乙酸钠(EDTA)。此外，肠胃外溶液可含有防腐剂，例如苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯和氯丁醇。合适的药物载体在Remington's Pharmaceutical Sciences(该领域的标准参考文献)中有描述。
另外，可以采用标准的制药方法来控制作用的持续时间。这些是本领域公知的并且包括控制释放制剂，并且可以包括合适的大分子，例如聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白。可以调节大分子的浓度以及掺入方法以控制释放。另外，该试剂可以掺入聚合物材料的颗粒中，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。除掺入外，这些试剂也可用于将化合物捕获在微胶囊中。
含有本文公开的治疗剂的药物制剂可以通过本领域已知的方法使用熟知且容易获得的成分制备。治疗剂也可以配制成适合肠胃外给药的溶液，例如通过肌肉内、皮下或静脉内途径。治疗剂的药物制剂也可以采用水溶液或无水溶液或分散液的形式，或者可替换地采用乳液或悬浮液的形式。
本文公开的组合物(包括药物组合物)可以以多种方式给药，这取决于是否需要局部或全身治疗，以及待治疗的区域。这些给药方式包括肠胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)、局部、透皮和口服。给药可以单剂量或重复给药进行。本文公开的载体或多肽可以与其他治疗剂例如单克隆抗体和静脉内IgG组合施用。
如本文所用，术语治疗(treatment)、治疗(treat)或在治疗(treating)是指降低疾病或病症或疾病或病症的症状的影响的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指已确定的疾病或病症或疾病或病症的症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，与对照相比，如果受试者中疾病的一种或多种症状减少10％，则认为治疗疾病的方法是一种治疗。因此，与原生或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％和100％之间的任何百分比。应理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病、病症或疾病或病症的症状。
如本文所用，术语预防(prevent)、在预防和预防(prevention)疾病或病症是指在受试者开始显示疾病或病症的一种或多种症状之前或几乎同时发生的例如治疗剂的施用的动作，其抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或恶化。如本文所用，与对照水平相比，提及降低、减少或抑制包括10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化。这些术语可以包括但不一定包括完全消除。
药物组合物可以在受试者中的其他疗法之后、之前、代替或与其组合给予。可以给受试者施用疫苗或其他组合物以刺激免疫应答。
制备多肽的方法
提供了经工程改造以表达本文公开的多肽的细胞。工程细胞可以在细胞培养物中繁殖(例如，与活体动物的一部分(“体内”)相反)。例如，细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO细胞或人细胞或小鼠杂交瘤细胞。可用于表达本文公开的多肽的其他类型细胞的实例包括小鼠骨髓瘤细胞(例如，NSO)、人胚肾细胞(例如，HEK293)、猴肾细胞(例如COS)、人上皮癌细胞(例如，HeLa)、人纤维肉瘤细胞(例如，HT-1080)、幼仓鼠肾细胞、酵母细胞、昆虫细胞等(参见例如Fernandez等人(编辑)Gene Expression Systems，Academic Press，1999)。可以使用与公开的多肽相容的任何细胞和适当的培养条件。
制备多肽例如同时结合FcγR和Fc结合域蛋白的多肽的方法，是本领域已知的。可以采用的一种方法是Kohler，G.等人的方法(1975)，Continuous Cultures Of FusedCells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,Nature 256：495-497，或其修改。在一个实施方式中，使用过表达此类分子的宿主细胞获得与免疫效应细胞相互作用的所需多肽或表达这种活化受体的免疫效应细胞表面上存在的蛋白质。
还公开了对公开的多肽及具有增强或降低的活性的变体的修饰，其不显著影响它们的性质。多肽的修饰是本领域的常规实践，不需要在此详细描述。修饰多肽的实例包括具有氨基酸残基的保守取代、一种或多种氨基酸的缺失或添加(其不显著有害地改变功能活性)的多肽或化学类似物的使用。可以彼此保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽还包括糖基化和非糖基化多肽，以及具有其他后翻译修饰的多肽，例如，利用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代是保守的，即取代的氨基酸将具有与原始氨基酸相似的化学性质。这种保守取代是本领域已知的，并且上面已经提供了实例。其他修饰方法包括使用本领域已知的结合技术，包括但不限于酶促方法、氧化取代和螯合。例如，可以使用修饰来附着用于免疫测定的标记，例如用于放射免疫测定的放射性部分的附着。使用本领域已建立的方法制备修饰的多肽，并且可以使用本领域已知的标准测定法筛选。
本发明还涵盖融合蛋白，其包含来自所公开的多肽的一个或多个片段或区域。在一个实施方式中，提供了融合多肽，其包含IgG Fc区的至少10个连续氨基酸。
可以使用固相肽合成方便地制备本发明的多肽(Merrifield，B.(1986)“SolidPhase Synthesis”，Science 232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)General MethodFor The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:SpecificityOf Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-135；Ganesan,A.(2006)“Solid-PhaseSynthesis In The Twenty-First Century”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
含有编码所公开多肽的多核苷酸的载体可以通过许多适当的方法中的任何一种引入宿主细胞，适当的方法包括电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(例如，其中载体是感染试剂如痘苗病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
能够过表达异源DNA的任何宿主细胞可用于分离编码所公开多肽的基因的目的。合适的哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。
已经描述了本发明的许多实施方式。然而，应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。因此，其他实施方式在以下权利要求的范围内。
实施例
实施例1：免疫球蛋白G在免疫识别中的新功能
材料和方法
病毒、细菌、抗体和蛋白质。HSV1 F菌株购自ATCC，Manassas，VA。先前描述了产生Us8缺乏型HSV1 F(Suenaga等人，2014，Microbiology and Immunology 58,513-522)。表达荧光素酶的R8411，HSV1 F菌株由Bernard Roizman提供(Zerboni等人，2013，J Virol 87,2791-2802)。野生型(WT)纽曼菌株(ATCC，25904)和蛋白A缺乏型(Spa-)纽曼是来自TimothyFrost博士(爱尔兰都柏林)的馈赠，并在胰蛋白酶大豆肉汤中生长(Patel等人，1987，Infect Immun 55，3103-3110)。对CD3(HIT3a)、CD14(M5E2)、CD19(HIB19)、CD56(N901)、CD16a(3G8)、CD253(RIK2)、CD69(FN50)、CD62L(DREG56)、CD107a(H4a3)、CD3C(pY142)(K25-407.69)、CD3ζ(6B10.2)、CD3(17A2)、CD62L(MEL-14)、CD27(LG.3A10)、CD69(H1.2F3)、NKp46(29A1.4)特异性的抗体、抗-HSVl gE(9H3)、抗-HSV1 gC(1C8)，和抗-HSVl gB(Tl 11)购自BD Biosciences,Franklin Lakes，NJ；Biolegend，San Diego，CA；Beckman Coulter，Brea，CA；Abeam，Cambridge，MA；R&D Systems,Minneapolis,MN；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；和Millipore，Burlington，VA。抗HSV1 gD(ID3)由Roselyn J.Eisenberg和Gary Cohen提供。抗HSV1 gE(9H3)购自Abcam。生物素化的CD16a和HulgG1 Fc购自Sino Biological，北京，中国。IgG1Fc(ACD16)通过在IL2信号肽之后将人IgG1 Fc aa262-466(SEQ ID NO：2)克隆到pFuse载体(InvivoGen，San Diego，CA)中来制备，在BHK细胞中表达并使用蛋白A琼脂糖珠纯化(Thermofisher)。合并的人IgG(GamaStan，Grifols USA，洛杉矶，CA)，其含有HSV1特异性抗体，购自Ohio State University Pharmacy,Columbus,OH。
将人IgG Fc(12724，Scripps Laboratories，San Diego，CA)验证为不含Fab，并且不与用Us8-HSV1病毒感染的细胞结合。利妥昔单抗(Genentech，South San Francisco，CA)和Darzalex(Janssen Pharmaceuticals，Fremont，CA)购自Ohio State UniversityPharmacy。
克隆HSV1基因。利用基因特异性引物将HSV1 F菌株DNA扩增单个HSV1基因(序列登录号：GU734771)，其分别位于5'的SpeI位点和3'末端的Pad位点(例如，SEQ ID NO：25，27-170)，并使用常规方法克隆到pCDH载体中(System Bioscience，Palo Alto，CA，CD510B)。
人神经胶质瘤球的培养和转染。神经胶质瘤细胞来源于原发性人脑肿瘤，并在补充有如前所述的B27(1:50)、肝素(5ug/mL)、碱性FGF(bFGF)(20ng/mL)和EGF(20ng/mL)的DMEM/F12(Life Technology，Carsbad，CA)中生长(Mao等人，2013，Proc Natl Acad SciUSA 110,8644-8649)。除非另有说明，否则在整个研究中均使用#83神经胶质瘤细胞(Mao等人，2013，Proc Natl Acad Sci USA 110,8644-8649)。对于一次单次转染，用DMEM/F12培养基洗涤一千万个神经胶质瘤细胞一次，并重悬于100μl碱性核转染溶液(Lonza Inc.，Allendale，NJ)中。随后，将细胞悬浮液与6μg表达HSV1基因的质粒混合，并使用程序A33(Amaxa GmBH，Koeln，德国)进行核转染。核转染后，立即将细胞与1ml培养基混合，并转移到含有4ml含有具有补充物的DMEM/F12的6孔板的一个孔中。
由异位基因表达介导的差异细胞裂解。转染后24小时，将神经胶质瘤细胞重新悬浮并以50g离心5分钟以除去细胞碎片和死细胞。随后，用100μl DMEM/F12培养基重悬1×104个神经胶质瘤细胞，并接种到U形底96孔板的每个孔中。将纯化的人NK细胞重悬浮于补充有10％热灭活的FBS(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的RPMI培养基(Life Technology，Carlsbad，CA)中至终浓度为5×10 6/ml的培养基，并且100μl NK细胞加入到具有转染的神经胶质瘤细胞的培养基中。在平行对照实验中，将100μl补充有10％FBS而不是人NK细胞的RPMI 1640培养基加入到接种的神经胶质瘤细胞中。使用LSRII(BD Biosciences，FranklinLakes，NJ)在培养5小时时收集培养物样品。基于它们的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)对活的神经胶质瘤细胞进行门控，并测量GFP+细胞的百分比。
通过以下公式计算由个体病毒基因表达贡献的差异细胞毒性：
其中AGFP＝GFP的变化；
GFP％(+nk)＝存在NK细胞时GFP的百分比；
GFP％(-nk)＝不存在NK细胞时GFP的百分比。
病毒产生、纯化和灭活。将Vero细胞以每100mm培养皿7×106个细胞的密度接种，并用每细胞2.5pfu的HSV-1F菌株或#30突变体接种(Suenaga等人，2014，Microbiology andImmunology 58,513-522)。在接种后24小时，收集培养基和细胞碎片。在三次冻融循环以释放病毒后，通过低速离心(2,000*g，5分钟)除去细胞碎片，将样品加载到5ml 35％蔗糖梯度上，并在Beckman SW27转子中以25,000rpm离心1小时。收集病毒沉淀，洗涤并在PBS中浓缩。为了灭活病毒，将纯化的HSV1病毒用0.2％Trition-100处理30分钟。将灭活的病毒稀释至0.1ug/ml用于涂覆板。
噬斑试验。简而言之，将依次稀释的病毒负载到单层Vero细胞上并在37℃下孵育；在1小时后加入合并的人IgG(终浓度0.1％)以抑制病毒扩散。培养48小时后对噬斑计数。为了确定人IgG3、人IgG Fc、利妥昔单抗、达拉珠单抗和人IgG对HSV1感染性的影响，将1ug/ml这些试剂加入到顺序稀释的病毒中，并在噬斑测定前在室温下孵育30分钟。用标准噬斑测定法滴定处理的病毒，并将所有结果标准化为PBS对照。
人NK细胞分离和刺激条件。本文使用的所有NK细胞均使用如前所述的RosetteSepcocktail(StemCell Technologie，剑桥大学，MA)从健康供体(American Red Cross，哥伦布，OH)的外周血白细胞中新鲜富集(Yu等人，2010，Blood 115,274-281)。在刺激之前，将50万个分离的人NK细胞用培养基或补充有5ug/ml蛋白A或蛋白G的培养基补充物孵育30分钟。将1x105个感染或转染的神经胶质瘤细胞或K562细胞用于5x105 NK细胞的培养物中。对于所有CD107a染色，在细胞培养开始时加入CD107a抗体。将平96孔板(MaxiSorp，Thermo FisherScientific，Waltham，MA)用50ul蛋白A(o.lug/ul)、蛋白G(o.lug/ul)或wt或Us8-HSV1 F(o.1ug/ul)在4℃下涂覆过夜。
铬释放细胞毒性测定。通过在50μCi×5 1Cr中将5×105个细胞在37℃孵育90分钟来标记神经胶质瘤细胞。将放射性标记的细胞洗涤3次并重悬于完全RPMI 1640培养基中，并以5×104个细胞/ml的浓度以三份样本接种于U底96孔板中。在一些情况下，将抗体或IgG产物(5ug/ml)加入放射性标记的靶细胞中并在冰上孵育30分钟以结合或阻断某些相互作用。以指定的效应物与靶标比率(E：T，图1D中的x轴)添加效应细胞，并在37℃下孵育4-6小时。然后如前所述测量和计算细胞裂解(Dai等人，2017，Immunity，47，159-170))。
CD3C，磷酸化染色。将50万个NK细胞在37℃静置1小时，然后用H2O2(11mM)、IL12(10ng/ml)+IL18(10ng/ml)、2x105转染的神经胶质瘤细胞或1x108cfu的细菌刺激1小时。使用Phosflow Fix Buffer I(BD)固定NK细胞，用PhosflowTM Perm Buffer III(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)透化，用正常小鼠免疫球蛋白阻断，然后用抗CD3ζ(pY142)和抗CD3ζ抗体染色。在所有染色步骤中补充磷酸酶抑制剂(Roche，South SanFrancisco，CA)。
gE-Fc-CD16a复合物和蛋白A-Fc-CD16a复合物的建模结构。对gE-Fc(RCSB蛋白数据库ID：PDB ID：2GJ7)和CD16a-Fc(RCSB蛋白数据库ID：PDB ID：IE4K)的对接预测是在ZDOCK在线服务器上进行的。对于gE-Fc，仅将gE亚基上传至服务器，并将残基225、245-247、249-250、256、258、311、316、318-322、324和338-342指定为接触残基(Patel等人，1987，Infect Immun 55，3103-3110)。在CD16a-Fc的情况下，Fc(SEQ ID NO：11)上的残基252-258、307、309-311、314-315、382、428和433-436被指定为接触残基(Patel等人，1987'，Infect Immun 55，3103-3110)。
CD16a结合。首先将转染的神经胶质瘤细胞或细菌在冰上分别用含有或不含有IgG1Fc(ACD16)、IgG1Fc(Scripps Laboratories，San Diego，CA)、利妥昔单抗或hu IgG(GamaStan，Grifols)的PBS孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤一次后，将样品在冰上用生物素化的CD16a孵育，20分钟后加入apc-链霉抗生物素蛋白(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ)并将样品在冰上再保持20分钟。用FACS缓冲液洗涤两次后，立即在LSRII流式细胞仪(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ)上检查细胞或细菌。
小鼠实验。将8至12周龄雌性C57BL/6和BALB/c小鼠(Jackson Laboratory，CITY)用于所有研究。对于存活研究，BALB/c小鼠腹膜内(i.p.)注射3x106 pfu HSV1 F菌株病毒。在病毒攻击前4小时以及在病毒攻击后24小时和72小时，通过腹膜内注射给予PBS，200μg人IgG3(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、200ug人IgG Fc(Scripps Laboratories，San Diego，CA)、200μg利妥昔单抗或200μg Darzalex。对于追踪病毒载量的生物发光成像，用1.2×105pfu的R8411病毒腹膜内注射BALB/c小鼠(Zerboni，L.等人，J Virol 87，2791-2802(2013))。为了研究人IgG1对HSV1的清除，在病毒攻击前4小时和病毒攻击后24小时，用200μg利妥昔单抗腹膜内注射BALB/c小鼠。在异氟醚麻醉前10分钟给每只小鼠3mg荧光素钾以确保一致的光子通量。在感染后18小时和84小时使用IVIS Spectrum(Perkin Elmer，Waltham，MA)拍摄图像。记录每组暴露2分钟的4个部分。从整个小鼠测量生物发光值，并使用Living Image 4.0(Perkin Elmer，Waltham，MA)计算为光子通量(光子/秒)。为了研究蛋白A在体内对NK细胞的作用，给小鼠静脉注射(i.v.)40μg硅酮珠和蛋白A结合的珠(AlphaBio，Racho Santa Margarita，CA)。在珠完成这种接种后24-48小时，收集血液、脾脏和肺以及从这些组织中分离单核细胞并用抗小鼠抗原的抗体染色。对于体外小鼠NK细胞刺激和细胞毒性，按照制造商的说明，使用NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Cambridge，MA)从8至12周龄C57BL/6和BALB/c小鼠的脾中富集NK细胞。
统计。双样本t检验用于比较两个独立组以及配对t检验用于比较两个配对组。如果原始分布是非正常的，则进行数据转换。当比较三个或更多个组时，由于来自相同供体的重复测量，使用线性混合模型来解释协方差结构。通过Holm程序调整P值以进行多重比较。p值<0.05被认为是显著的。重复实验至少三次或更多次。数据显示为平均值±SEM。
结果
由异位基因表达介导的差异细胞裂解(DC-MEGE)识别出HSV1gE作为人NK细胞活化剂。
HSV1基因组包含84个开放阅读框，编码74种独特的病毒蛋白(Szpara等人，2010，JVirol 84,5303-5313)，然而，它们中很少因其在免疫识别或逃避中的作用而被研究过(Imai等人，2013，PLoS One 8，e72050；Chisholm等人，2007，The Journal of InfectiousDiseases 195,1160-1168；Huard&Fruh，2000，Eur J Immunol 30,509-515)。为了获得人NK细胞与HSV1之间的相互作用的全面了解，开发了DC-MEGE以测量NK细胞如何响应表达单个HSV1基因的神经胶质瘤细胞(图1A)。将每个HSV1基因克隆到“自切割”T2a序列和绿色荧光蛋白(GFP)的上游；结果，荧光揭示了病毒蛋白的表达(Szymczak等人，2004，NatBiotechnol 22,589-594)。用单个HSV1基因转染神经胶质瘤细胞，随后在有或没有新鲜人NK细胞的情况下培养。当NK细胞存在时，GFP+活神经胶质瘤细胞的百分比平行记录为GFP(+NK)％，或当单独培养神经胶质瘤细胞时平行记录为GFP(-NK)％。当HSV1病毒蛋白的表达使得神经胶质瘤细胞对NK细胞裂解敏感时，GFP+神经胶质瘤细胞优选被NK细胞杀死，因此，GFP(+NK)％将小于GFP(-NK)％，或当HSV1病毒蛋白使得神经胶质瘤细胞对NK细胞裂解具有抗性时，反之亦然(图1A)。应用DC-MEGE测定，筛选出65个HSV1基因，证明表达UL12、UL30、Us3、Us8和Usl2的神经胶质瘤细胞对NK细胞裂解更敏感，而UL48、Us5或Us6的表达使得神经胶质瘤细胞对NK细胞细胞裂解具有抗性(图1B和1C)。
HSV1 Us8编码gE，其单独是低亲和力人IgG Fc受体，在CH2-CH3界面处结合人IgG1、IgG2和IgG4(Sprague等人，2006，PLoS Biol 4，el48)。使用针对人间充质神经胶质瘤细胞系#1123和人类神经胶质瘤细胞系#84(Mao等人，2013，Proc Natl Acad Sci USA 110,8644-8649)的51Cr释放测定验证DC-MEGE结果，如图1D所示。表达Us8的神经胶质瘤细胞(下文称为神经胶质瘤Us8)也诱导人原代NK细胞分泌IFN-γ(图1E)，表达CD69和CD107a(图1F)，并切割CD62L和CD16a(图1G)，其是活化的人NK细胞的特征性表型。通过gE特异性小鼠单克隆抗体(Abeam)减弱NK对神经胶质瘤Us8的细胞毒性(图1h)。纯化野生型(wt)HSV1F菌株病毒(其中gE是主要蛋白质成分)和具有靶向缺失Us8的突变型HSV1F菌株(Us8)(Suenaga等人，2014，Microbiology and Immunology 58,513-522)。在涂有灭活的纯病毒的板中培养NK细胞。NK细胞仅由野生型(wt)而非Us8-F菌株病毒活化(图II，6)，并且wt-HSV1对NK细胞的活化也被抗-US8抗体抑制(图II，6)。总之，这些结果证明gE和人NK细胞之间的直接相互作用有助于NK细胞的功能增强。
人IgG连接gE和NK细胞活化。HSV1 gE可以与HSV1 Us7编码的糖蛋白I(gl)形成异二聚体，并且所得的gE/gl复合物是人IgG的高亲和力病毒Fc受体(Sprague等人，2006，PLoSBiol 4，el48；Johnson等人，1988，J Virol 62,1347-1354)。表达Us7(神经胶质瘤Us7，下文)的神经胶质瘤细胞不活化NK细胞(图1B、1C、2A、2B)；然而，表达Us7和Us8(神经胶质瘤Us7+Us8)的神经胶质瘤细胞比神经胶质瘤Us8更有效地活化NK细胞(图2A、2B、7)，这表明gE的IgG结合功能可能参与NK细胞活化。
尽管在神经胶质瘤-NK细胞共培养物中未补充人IgG，但显示IgG分子天然存在于原代人NK细胞的表面上(图2C)。用酸性培养基(RPMI1640加10％FBS)(用乙酸调节至pH4.0)短暂洗涤NK细胞减少了表面IgG(图2C)并且增加了抗人CD16抗体(3G8)的结合(Perussia等人，1984，J Immunol 133,180-189)，抗人CD16抗体与人IgG竞争CD16a上的相同结合位点(图2D)，这证明IgG分子通过CD16a锚定在人NK细胞上。除NK细胞外，显示B细胞、单核细胞和粒细胞均通过非共价结合天然涂覆有人IgG分子，通过酸性介质处理表明，其从细胞表面除去大部分IgG(图27A)。这些表面IgG分子为蛋白A结合提供相互作用位点(图27B)。来自各种健康人供体的原代NK细胞具有非常不同水平的表面IgG(图2E)以及它们对刺激的反应是变化的(图2F和8)。人NK细胞对神经胶质瘤Us8的反应(通过CD69+或CD107a+NK细胞的百分比测量)与表面IgG水平相关；并且当NK细胞用神经胶质瘤Us7+Us8培养时，相关性变得甚至更强(图2G)。相反，NK细胞对K562细胞的反应(其是MHC I分子阴性的白血病细胞并且广泛用作NK细胞的活化对照)显示与表面IgG无相关性(图2G)。总之，显示人IgG与gE和NK细胞活化有关。
CD16a、IgG Fc和HSV1 gE形成NK细胞活化必需的三元复合物。IgG Fc上的人CD16a结合位点远离CH2-CH3界面，在界面处gE结合IgG(Sondermann等人，2000，Nature 406,267-273；Sprague等人，2006，PLoS Biol 4，el 48)，导致IgG、gE和CD16a可形成三元复合物的假设。使用已知的gE-IgG Fc和CD16a-IgG Fc晶体结构的结构建模支持gE和CD16a可以结合相同的IgG Fc分子而不相互干扰的结论(图3A)。为了验证这种CD16a-IgGFc-gE复合物的存在，进行实验以确定CD16a的细胞外结构域是否可以在不同的人IgG产物存在下结合神经胶质瘤Us7+Us8。IgG1 Fc(ACD16)是不含CD16a结合位点的重组人IgG1 Fc片段；而IgG1 Fc具有完整的CD16a结合位点。与晶体结构一致(图3A)，CD16a结合位点在Fc和HSV1 gE之间的结合中不起作用，因为IgG1 Fc(ACD16)和IgG1Fc均有效地结合到神经胶质瘤Us7+Us8上(图3B，左和左中间)。尽管CD16a和神经胶质瘤Us7+Us8之间不存在直接相互作用(图3C左)，但当IgG1Fc存在时，发现CD16a结合神经胶质瘤Us7+Us8，并且这种相互作用依赖于IgG1Fc上的CD16a结合位点(图3C中左和中间)，从而证明CD16a-IgGFc-gE复合物的形成。
人HSV1特异性IgG含有特异性识别gE或gl的抗体(图3B，中右)，并且其存在允许CD16a通过CD16a和抗原-抗体复合物之间的经典相互作用结合表达HSV1基因的神经胶质瘤细胞(图3C，中右)。使用利妥昔单抗(针对人CD20的人IgG1单克隆抗体)(Edwards等人，2004，N EnglJ Med 350,2572-2581)(图3B和3C，右)或用Us8-HSV1或野生型HSV1感染的神经胶质瘤细胞(图3D)进行类似的CD16a结合试验，其再次证实CD16a、IgG Fc和HSV1 gE形成三元复合物。此外，当用H2O2(阳性对照)或用神经胶质瘤Us7+Us8培养而不用IL12+IL18(图3E)刺激NK细胞时，CD3ζ的磷酸化特异性地发生，这证明gE活化通过CD16a-CD3ζ轴的NK细胞。
IgG结合蛋白，来自金黄色葡萄球菌的蛋白A和来自G组链球菌的蛋白G主要在CH2-CH3界面结合IgG(Sauer-Eriksson等人，1995，Structure3,265-278；Deis等人，2015，ProcNatl Acad Sci USA\\2,902-9033)。显示蛋白A和蛋白G也通过NK细胞膜上存在的IgG结合原代人NK细胞(图3F和3G)，这也表明涂覆在原代NK细胞上的表面IgG完全可接近gE以进行结合。为了测试通过HSV1 gE的IgG细胞活化的IgG的必要性，在用不同刺激物培养NK细胞之前，将原代人NK细胞用过量的蛋白A或蛋白G孵育以占据所有CH2-CH3界面。用蛋白A或蛋白G预孵育完全抑制通过gE的NK细胞的所有功能增强(图3H-3J和9)。该处理不改变人NK细胞对K562细胞或IL12+IL18的反应(图9)。另外，涂有纯的和灭活的wt HSV1病毒的板不再能够活化用蛋白A或蛋白G预孵育的NK细胞(图10A和10B)。总之，这些结果支持以下结论：IgG Fc桥接NK细胞和表达HSV1 gE的靶细胞之间的相互作用，并导致NK细胞活化。
被动ADCC促进体内HSV1感染的清除。通过gE活化人NK细胞代表先前未被认可的免疫刺激机制，其仅由IgG Fc桥接，并且通过不需要抗原特异性抗体而不同于经典IgG功能(图3K)。这种类型的NK细胞活化被称为被动ADCC(图3K)。上述实验均在不添加人IgG至相互作用的情况下进行，并且gE的NK细胞活化由已经存在于原代NK细胞上的IgG介导(图3H-3J)。在体内原代HSV1感染期间，由于gE的表达和人血清中IgG的丰度，感染的细胞可能被人IgG涂覆。为了测试感染细胞上的非免疫IgG涂覆是否可以为CD16a(+)NK细胞提供额外的锚定/活化位点，在培养物中加入非HSV1非免疫血浆[(-)血浆]或IgG1 Fc片段。(-)血浆和IgG1 Fc均以gE依赖性方式进一步增强感染或转染的神经胶质瘤细胞对NK细胞的活化(图11A-11D)。通过HSV1特异性IgG(经典ADCC，图3K)增强对用wt或us8-F感染的神经胶质瘤细胞的NK细胞毒性，然而，人IgG1 Fc和靶向无关抗原的抗体(即利妥昔单抗)也增强了对用wtF但不用Us8-F菌株感染的神经胶质瘤细胞(图4A)或表达gE的神经胶质瘤细胞的NK细胞(图4B)的细胞毒性。
HSV1 gE不结合小鼠IgG(Chapman等人，1999，J Biol Chem274,6911-6919)，然而小鼠FcγR以高亲和力结合人IgG(Ober等人，2001，Int Immunol 13,1551-1559)，因此，补充人IgG应该能够桥接小鼠NK细胞和HSV1感染的细胞，促进免疫活化和HSV1感染的清除。与该假设一致，从C57BL/6和BALB/c小鼠分离的NK细胞在人IgG Fc片段存在下显示出对神经胶质瘤Us7+Us8的增强的细胞毒性(图4C)。为了证明被动ADCC可能是体内清除HSV1感染的重要机制，在病毒攻击4小时之前和之后的24小时和72小时，对BALB/c小鼠注射PBS、人IgG3、人IgG Fc片段，达雷木单抗(针对人CD38的人IgG1抗体)或利妥昔单抗(图4D)。当NK细胞不存在时，这些试剂中的每一种都不影响HSV1病毒的感染性(图12A)，也没有单独的体内给药改变体内NK细胞的表型(图12B)，人IgGFc片段，达雷木单抗和利妥昔单抗减轻了HSV1感染症状并为小鼠提供完全保护免受致命的HSV1感染(图4D)。HSV1 gE是体内HSV1细胞间传播所必需的(Polcicova等人，2005，J Virol 79,11990-12001)，因此，Us8-F菌株未在体内用于确认对这种保护的gE依赖性。然而，不结合HSV1 gE的人IgG3(Sprague等人，2006，PLoS Biol 4，el48)未能提供针对HSV1感染的任何保护(图4F)，这表明gE-IgG相互作用对于保护人IgG产物免受致命的HSV1感染至关重要。此外，使用表达荧光素酶的HSV1 F菌株体内跟踪病毒感染(Zerboni等人，2013，J Virol 87,2791-2802)显示利妥昔单抗增加HSV1感染的清除(图4E、4F)。总之，当病原体特异性抗体不可用时，桥接病毒Fc受体和免疫Fc受体的IgG Fc提供针对HSV1感染的强力保护。
细菌IgG结合蛋白通过IgG Fc介导的桥接活化NK细胞。进行实验以测试来自其他病原体的IgG结合蛋白是否可以通过相同的机制活化NK细胞。尽管蛋白A结合存在于人NK细胞表面上的IgG Fc(图3F和3G)，但直接在培养物中加入纯蛋白A未能活化人NK细胞(图5A)，因为蛋白A的单体形式不会引起CD16a的积累，CD16a的积累是CD3ζ自身磷酸化的先决条件。然而，在蛋白A涂覆的板中培养后，原代人NK细胞被活化(图5A)，产生IFN-γ(图5B)并显示出增强的NK细胞毒性(图5C)。当用小鼠血清阻断蛋白A涂覆的板时，这些NK细胞功能增强被消除(图5A)，因为小鼠IgG阻断了人IgG和蛋白A/G之间的所有潜在相互作用。
使用野生型金黄色葡萄球菌(SA)纽曼菌株(wt)和蛋白A缺乏的纽曼菌株(Spa)测试CD16a-Fc-蛋白A复合物的形成(Patel等人，1987，Infect Immun 55,3103-3110)(图13A)。当存在完整的人IgG(利妥昔单抗)或IgG1 Fc片段时CD16a结合S.A并且蛋白A对于这种相互作用必不可少(图13B)。S.A对CD3ζ的磷酸化由于蛋白A缺乏而依赖于蛋白A，或用小鼠血清阻断蛋白A消除了CD3ζ磷酸化。此外，用人IgG预孵育S.A略微增强了CD3ζ磷酸化(图5D)。用S.A培养的NK细胞的表型反映了CD3ζ磷酸化的结果。通过将wt S.A用小鼠血清预孵育来抑制wt S.A对NK细胞的活化，并通过人IgG增强(图5E)。如果用可溶性单体蛋白A或蛋白G预处理原代人NK细胞，则wt S.A的NK细胞活化也被消除(图5E)。此外，人类NK细胞以类似的方式被链球菌蛋白G活化(图14A-14C)。总之，这些结果证明细菌IgG结合蛋白通过Fc桥和CD16a活化人NK细胞。
另外，用野生型S.A培养的小鼠NK细胞比spa-SA产生更多的IFNγ(图5F)，并且表达更多的早期活化标记物CD27和CD62L(与活化的人NK细胞中CD62L的丧失相反)(Peng，H.等人，J Immunol 190,4255-4262(2013)；Hayakawa&Smyth，2006，J Immunol 176,1517-1524)(图15A)。当在蛋白A涂覆的板中培养小鼠NK细胞时观察到类似的表型(图5G和15B)。S.A产生许多炎性因子(Fournier&Philpott，2005，Clin Microbiol Rev18,521-540(2005))。为了避免其他活化引起的混淆，给小鼠注射蛋白A涂覆的硅酮珠以研究寡聚蛋白A是否可以在体内活化NK细胞。与来自注射对照硅酮珠的小鼠的NK细胞相比，来自注射蛋白A结合的硅酮珠的小鼠的NK细胞采用更活化的表型(图5H和15C)。然而，与PBS对照相比，注射可溶性蛋白A不会引起小鼠NK细胞的任何表型变化(图15D)。总之，这些结果证明蛋白A在体外和体内活化小鼠NK细胞。
讨论
如以上给出的结果所证明的，无偏细胞毒性测定DC-MEGE表明了HSV1感染后人NK细胞和宿主肿瘤细胞的相互作用(图1A)。除Usl2(Huard&Fruh，2000，Eur J Immunol 30,509-515)和Us3(Imai等人，2013，PLoS One 8，e72050)外，这是第一次报道保留的病毒基因对其NK细胞细胞毒性的调节具有重要意义。因此，DC-MEGE可用于研究NK细胞如何与其他病原体相互作用。
已显示HSV1 gE/gl复合物参与“抗体双极桥接”，从而单个HSV1特异性IgG抗体使用其Fab区域同时结合HSV1-抗原，并通过其Fc区域同时结合gE/gl(Frank&Friedman，1989，Journal of virology 63,4479-4488)。已经提出这样的抗体双极桥接可以阻止抗体的Fc部分进入先天免疫效应细胞上表达的FcγR，从而减少经典ADCC并且可能提供HSV1感染后免疫逃避的机制(Dubin等人，1991，Journal of virology 65,7046-7050；Corrales-Aguilar等人，2014，PLoS Pathog 10，e 10041 31)。这似乎与公开的发现相矛盾，公开的发现为gE或gE/gl复合物促进人NK细胞的活化和细胞毒性(图2A、2B)。然而，之前的研究表明HSV1 gE/gl的NK抑制均在HSV1特异性抗体的存在下进行(Frank&Friedman，1989，Journalof virology 63,4479-4488；Dubin等人，1991，Journal of virology 65)，7046-7050；Corrales-Aguilar等人，2014，PLoS Pathog 10，el004131)；因此，这些结果均与经典ADCC相关，而未评估在原发性病毒感染条件下HSV1 gE结合非免疫IgG的实际功能。
本文公开了HSV1 gE/gl的未被认可的免疫刺激作用。晶体结构、体外和体内功能验证证明了IgG Fc桥接gE和CD16a(图3C)，并且所得的三元复合物转导活化NK细胞的细胞内信号(图3E)，并促进HSV1感染的清除。所公开的工作表明，在初级HSV1感染期间，当尚未获得抗HSV1抗体时，NK细胞可利用“被动ADCC”来清除HSV1感染的细胞(图4D-4F)。该结果与人类大多数原发性HSV1感染在临床上无症状的观察结果一致。在恶性神经胶质瘤的情况下，被动ADCC至少部分地负责溶瘤HSV1的快速NK细胞清除(Alvarez-Breckenridge等人，2012，Nat Med18,1827-1834(2012))。
本公开还建立了表面IgG的功能性作用，其通过其Fc结构域锚定在NK细胞表面上表达的CD16a，以及NK细胞能够在不存在特异性抗原识别的情况下识别病原体的新机制。如本文所证明的，HSV1感染的宿主细胞以及蛋白A和蛋白G能够通过结合NK细胞表面IgG来活化人NK细胞。长期以来已经提出蛋白A作为金黄色葡萄球菌新生菌株的毒力因子，并且Spa-金黄色葡萄球菌新生菌株在小鼠中引起比wt S.A更温和的症状(Palmqvist等人，2002，Microb Pathog 33,239-249)。所公开涂覆蛋白A和wt S.A.活化NK细胞以及Spa-S.A.不活化NK细胞的发现为该表型提供了机制解释。鉴于许多病毒和细菌编码能够结合人IgG的Fc结构域的蛋白，这种先天免疫细胞活化的新机制对感染期间观察到的临床毒性具有广泛的意义(Litwin等人，1992，J Virol 66,3643-3651；Sprague等人，2008，Journal ofVirology 82,3490-3499；Loukas等人，2001，Infect Immun69,3646-3651；De Miranda-Santos&Campos-Neto，1981，J Exp Med154,1732-1742)。
实施例2：使用IgG结合蛋白蛋白A和蛋白G来捕获单核细胞并增加体外产生树突细胞和巨噬细胞的功效。
树突细胞和巨噬细胞是高度专业的抗原呈递细胞(APC)，其占人血液单核细胞的非常小的百分比(-0.2％)。因此，树突细胞和巨噬细胞由用于许多治疗目的的单核细胞的体外培养产生。
用于产生树突细胞和巨噬细胞的常规方法包括：(1)在培养皿上对PBMC或单核细胞铺板；(2)在37℃下孵育细胞数小时以使单核细胞附着于板上；(3)通过用培养基剧烈洗涤板除去非粘附细胞；和(4)用GM-CSF(用于巨噬细胞)或GMCSF和IL4(用于树突细胞)处理贴壁细胞一周。虽然该方案产生一致的结果，但是在步骤2和3期间丢失细胞，并且需要相对大量的单核细胞或PBMC来产生用于下游用途的足够的树突细胞和巨噬细胞。
与天然杀伤细胞一样，原代单核细胞也在表面上涂覆有IgG分子，其通过Fey受体(包括CD64、CD32和CD16a)锚定在单核细胞上，并提供供蛋白A结合的相互作用位点。人Feγ受体CD32和CD64与金黄色葡萄球菌(S.A)的结合需要人IgG和蛋白A的存在。野生型(wt)或蛋白A缺乏型(Spa-)S.A细菌用荧光标记的人Feγ受体CD32和CD64在人源化抗体利妥昔单抗(Ritu)不存在或存在的情况下孵育(图23A和23B)这些结果证实蛋白A、IgG和CD32/CD64以类似于蛋白A/IgG/CD16复合物的方式形成三元复合物。CD64，高亲和力FcγR，主要由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表达。
蛋白A和蛋白G可以结合NK细胞和单核细胞上涂覆的IgG。因此，涂覆在板上的蛋白A或蛋白G分子应该能够结合单核细胞的表面IgG，从而增加单核细胞的粘附。通过在不同的板中对相同量的单核细胞铺板，发现与牛血清处理的板的附着相比，单核细胞在最初的几个小时内对蛋白A或蛋白G处理的板的附着更牢固，并且在板A或蛋白G涂覆的板中的单核细胞培养物开始形成菌落，这指示活化(图17A)。使用蛋白A涂覆的板的进一步实验表明，除了增加单核细胞的粘附外，蛋白A涂覆的板还增加单核细胞的代谢活性，诱导单核细胞产生IL1β并在6小时后改变原代人单核细胞的表型(图17B、17C、图19、图20和图21)。类似地，固定化蛋白A和蛋白G在原代人嗜中性粒细胞中诱导呼吸爆发(图22)。因此，代替在常规板中培养单核细胞，在涂有蛋白A或蛋白G的板中培养单核细胞或PBMC，以产生树突细胞或巨噬细胞。这减少了步骤2和3中的细胞损失，并且需要更少的起始单核细胞和PBMC以产生等量的树突细胞和巨噬细胞(图18)。
由预涂覆有蛋白A、蛋白G或人IgG的板产生的树突细胞表达更高量的共刺激分子CD86(图24)。在加载埃伯斯坦-巴尔病毒(EBV)抗原肽并与自体T细胞共培养后，这些树突细胞也倾向于诱导更多EBV特异性细胞毒性T细胞(图25)。
先前的研究报道蛋白A结合TNFR1并活化上皮细胞，以及蛋白G不结合TNFR1且不活化上皮细胞(参考PMID：15247912)。虽然蛋白A的单核细胞附着和活化可能部分有助于结合在单核细胞上表达的TNFR1，但蛋白G增加的单核细胞附着可以通过结合单核细胞上的表面IgG来解释，因为蛋白质G-IgG-CD16的三元复合物的存在和现有数据显示蛋白质G通过结合表面IgG来活化NK细胞。
实施例3：使用CMV活化NK细胞
CMV gp34和gp68都是能够通过其Fc部分结合人源化抗体利妥昔单抗和人IgG的IgG结合蛋白(图28 A和28B)。CD16a不直接与表达gp34或gp68的神经胶质瘤细胞相互作用(图28C)，然而，它可以在利妥昔单抗或人IgG1 Fc片段存在下结合表达gp68的神经胶质瘤细胞，但即使存在人IgG Fc，也不结合表达gp34的神经胶质瘤细胞(图28D和28E)。因此，gp68能够与人IgG1 Fc和CD16a形成三元复合物。另外，与表达gp68的神经胶质瘤细胞一起培养的原代人NK细胞显示了活化的表型，其由CD69和CD107a的增加以及CD62L和CD16a的减少表示(图29A和29B)。
MCMV感染还允许3T3结合非免疫小鼠IgG(图30)，这表明MCMV产生IgG结合蛋白。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。本文引用的出版物和引用它们的材料通过引用明确地并入本文。
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方式的许多等同物。这些等同物旨在由以下权利要求涵盖。
序列表
<110> 俄亥俄州立创新基金会
<120> 被动抗体依赖性细胞介导的活化
<130> 16-1848-WO
<160> 170
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
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<210> 2
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
1 5 10 15
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
20 25 30
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
35 40 45
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
50 55 60
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
65 70 75 80
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
100 105 110
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
115 120 125
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
130 135 140
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
145 150 155 160
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
165 170 175
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
180 185 190
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
195 200 205
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
Met Lys Lys Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Arg Lys Leu Gly Val Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Val Thr Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser Gly Gly Val Thr Pro
20 25 30
Ala Ala Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr
35 40 45
Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe
50 55 60
Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly
65 70 75 80
Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln
85 90 95
Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
100 105 110
Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
115 120 125
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys
130 135 140
Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys
145 150 155 160
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
165 170 175
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
180 185 190
Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln
195 200 205
Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe
210 215 220
Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
225 230 235 240
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu
245 250 255
Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Glu Asp
260 265 270
Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp
275 280 285
Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp
290 295 300
Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp
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Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp
325 330 335
Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp
340 345 350
Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile
355 360 365
Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys
370 375 380
Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp
385 390 395 400
Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu
405 410 415
Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly
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Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg
435 440 445
Glu Leu
450
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> 链球菌
<400> 4
Met Glu Lys Glu Lys Lys Val Lys Tyr Phe Leu Arg Lys Ser Ala Phe
1 5 10 15
Gly Leu Ala Ser Val Ser Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser Thr Val Phe
20 25 30
Ala Val Asp Ser Pro Ile Glu Asp Thr Pro Ile Ile Arg Asn Gly Gly
35 40 45
Glu Leu Thr Asn Leu Leu Gly Asn Ser Glu Thr Thr Leu Ala Leu Arg
50 55 60
Asn Glu Glu Ser Ala Thr Ala Asp Leu Thr Ala Ala Ala Val Ala Asp
65 70 75 80
Thr Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Asn Ala Gly Ala Ala Ala Trp Glu
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Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Leu
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Lys Glu Phe Asn Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile
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Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Ile Lys Asp Leu Gln Ala Gln Val
130 135 140
Val Glu Ser Ala Lys Lys Ala Arg Ile Ser Glu Ala Thr Asp Gly Leu
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Ser Asp Phe Leu Lys Ser Gln Thr Pro Ala Glu Asp Thr Val Lys Ser
165 170 175
Ile Glu Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys
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Tyr Gly Val Ser Asp Tyr His Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr
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Lys Thr Asp Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly
225 230 235 240
Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe
245 250 255
Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp
275 280 285
Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn
290 295 300
Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu
305 310 315 320
Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp
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Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
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Met Val Thr Glu Val Pro Gly Asp Ala Pro Thr Glu Pro Glu Lys Pro
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Glu Ala Ser Ile Pro Leu Val Pro Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ile Ala
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Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Asp Thr Lys Lys Glu Asp Ala Lys Lys
385 390 395 400
Pro Glu Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Ala Glu Thr Leu Pro Thr
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Thr Gly Glu Gly Ser Asn Pro Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Ala Val
420 425 430
Met Ala Gly Ala Gly Ala Leu Ala Val Ala Ser Lys Arg Lys Glu Asp
435 440 445
<210> 5
<211> 548
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 2
<400> 5
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Ser Cys Leu Ala Ala Ala Pro Arg Thr Ser Trp Lys Arg Val Thr Ser
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Gly Glu Asp Val Val Leu Leu Pro Ala Pro Ala Gly Pro Glu Glu Arg
35 40 45
Thr Arg Ala His Lys Leu Leu Trp Ala Ala Glu Pro Leu Asp Ala Cys
50 55 60
Gly Pro Leu Arg Pro Ser Trp Val Ala Leu Trp Pro Pro Arg Arg Val
65 70 75 80
Leu Glu Thr Val Val Asp Ala Ala Cys Met Arg Ala Pro Glu Pro Leu
85 90 95
Ala Ile Ala Tyr Ser Pro Pro Phe Pro Ala Gly Asp Glu Gly Leu Tyr
100 105 110
Ser Glu Leu Ala Trp Arg Asp Arg Val Ala Val Val Asn Glu Ser Leu
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Val Ile Tyr Gly Ala Leu Glu Thr Asp Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Ser
130 135 140
Val Val Gly Leu Ser Asp Glu Ala Arg Gln Val Ala Ser Val Val Leu
145 150 155 160
Val Val Glu Pro Ala Pro Val Pro Thr Pro Thr Pro Asp Asp Tyr Asp
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Pro Pro Thr Pro Pro Arg Arg Pro Pro Val Ala Pro Pro Thr His Pro
195 200 205
Arg Val Ile Pro Glu Val Ser His Val Arg Gly Val Thr Val His Met
210 215 220
Glu Thr Pro Glu Ala Ile Leu Phe Ala Pro Gly Glu Thr Phe Gly Thr
225 230 235 240
Asn Val Ser Ile His Ala Ile Ala His Asp Asp Gly Pro Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Val Val Trp Met Arg Phe Asp Val Pro Ser Ser Cys Ala Glu Met
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Arg Ile Tyr Glu Ala Cys Leu Tyr His Pro Gln Leu Pro Glu Cys Leu
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Ser Pro Ala Asp Ala Pro Cys Ala Val Ser Ser Trp Ala Tyr Arg Leu
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Ala Val Arg Ser Tyr Ala Gly Cys Ser Arg Thr Thr Pro Pro Pro Arg
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Cys Phe Ala Glu Ala Arg Met Glu Pro Val Pro Gly Leu Ala Trp Leu
325 330 335
Ala Ser Thr Val Asn Leu Glu Phe Gln His Ala Ser Pro Gln His Ala
340 345 350
Gly Leu Tyr Leu Cys Val Val Tyr Val Asp Asp His Ile His Ala Trp
355 360 365
Gly His Met Thr Ile Ser Thr Ala Ala Gln Tyr Arg Asn Ala Val Val
370 375 380
Glu Gln His Leu Pro Gln Arg Gln Pro Glu Pro Val Glu Pro Thr Arg
385 390 395 400
Pro His Val Arg Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ser Ala Arg Gly Pro Leu
405 410 415
Arg Leu Gly Ala Val Leu Gly Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu Gly
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Leu Ser Ala Trp Ala Cys Met Thr Cys Trp Arg Arg Arg Ser Trp Arg
435 440 445
Ala Val Lys Ser Arg Ala Ser Ala Thr Gly Pro Thr Tyr Ile Arg Val
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<210> 6
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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195 200 205
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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 7
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 8
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 9
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 10
<211> 466
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Thr Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Gly Ile Gly Asp Ser Gly His Ser Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Thr Gly Ser Gln Trp Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Gly Lys His Arg Tyr
1 5
<210> 12
<211> 626
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 12
Met Glu Ser Thr Val Gly Pro Ala Cys Pro Pro Gly Arg Thr Val Thr
1 5 10 15
Lys Arg Pro Trp Ala Leu Ala Glu Asp Thr Pro Arg Gly Pro Asp Ser
20 25 30
Pro Pro Lys Arg Pro Arg Pro Asn Ser Leu Pro Leu Thr Thr Thr Phe
35 40 45
Arg Pro Leu Pro Pro Pro Pro Gln Thr Thr Ser Ala Val Asp Pro Ser
50 55 60
Ser His Ser Pro Val Asn Pro Pro Arg Asp Gln His Ala Thr Asp Thr
65 70 75 80
Ala Asp Glu Lys Pro Arg Ala Ala Ser Pro Ala Leu Ser Asp Ala Ser
85 90 95
Gly Pro Pro Thr Pro Asp Ile Pro Leu Ser Pro Gly Gly Thr His Ala
100 105 110
Arg Asp Pro Asp Ala Asp Pro Asp Ser Pro Asp Leu Asp Ser Met Trp
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ile Pro Asn Ala Leu Pro Ser His Ile Leu Ala Glu
130 135 140
Thr Phe Glu Arg His Leu Arg Gly Leu Leu Arg Gly Val Arg Ala Pro
145 150 155 160
Leu Ala Ile Gly Pro Leu Trp Ala Arg Leu Asp Tyr Leu Cys Ser Leu
165 170 175
Ala Val Val Leu Glu Glu Ala Gly Met Val Asp Arg Gly Leu Gly Arg
180 185 190
His Leu Trp Arg Leu Thr Arg Arg Gly Pro Pro Ala Ala Ala Asp Ala
195 200 205
Val Ala Pro Arg Pro Leu Met Gly Phe Tyr Glu Ala Ala Thr Gln Asn
210 215 220
Gln Ala Asp Cys Gln Leu Trp Ala Leu Leu Arg Arg Gly Leu Thr Thr
225 230 235 240
Ala Ser Thr Leu Arg Trp Gly Pro Gln Gly Pro Cys Phe Ser Pro Gln
245 250 255
Trp Leu Lys His Asn Ala Ser Leu Arg Pro Asp Val Gln Ser Ser Ala
260 265 270
Val Met Phe Gly Arg Val Asn Glu Pro Thr Ala Arg Ser Leu Leu Phe
275 280 285
Arg Tyr Cys Val Gly Arg Ala Asp Asp Gly Gly Glu Ala Gly Ala Asp
290 295 300
Thr Arg Arg Phe Ile Phe His Glu Pro Ser Asp Leu Ala Glu Glu Asn
305 310 315 320
Val His Thr Cys Gly Val Leu Met Asp Gly His Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Ser Leu Asp Ile Leu Val Cys Pro Arg Asp Ile His Gly Tyr Leu
340 345 350
Ala Pro Val Pro Lys Thr Pro Leu Ala Phe Tyr Glu Val Lys Cys Arg
355 360 365
Ala Lys Tyr Ala Phe Asp Pro Met Asp Pro Ser Asp Pro Thr Ala Ser
370 375 380
Ala Tyr Glu Asp Leu Met Ala His Arg Ser Pro Glu Ala Phe Arg Ala
385 390 395 400
Phe Ile Arg Ser Ile Pro Lys Pro Ser Val Arg Tyr Phe Ala Pro Gly
405 410 415
Arg Val Pro Gly Pro Glu Glu Ala Leu Val Thr Gln Asp Gln Ala Trp
420 425 430
Ser Glu Ala His Ala Ser Gly Glu Lys Arg Arg Cys Ser Ala Ala Asp
435 440 445
Arg Ala Leu Val Glu Leu Asn Ser Gly Val Val Ser Glu Val Leu Leu
450 455 460
Phe Gly Ala Pro Asp Leu Gly Arg His Thr Ile Ser Pro Val Ser Trp
465 470 475 480
Ser Ser Gly Asp Leu Val Arg Arg Glu Pro Val Phe Ala Asn Pro Arg
485 490 495
His Pro Asn Phe Lys Gln Ile Leu Val Gln Gly Tyr Val Leu Asp Ser
500 505 510
His Phe Pro Asp Cys Pro Pro His Pro His Leu Val Thr Phe Ile Gly
515 520 525
Arg His Arg Thr Ser Ala Glu Glu Gly Val Thr Phe Arg Leu Glu Asp
530 535 540
Gly Ala Gly Ala Leu Gly Ala Ala Gly Pro Ser Lys Ala Ser Ile Leu
545 550 555 560
Pro Asn Gln Ala Val Pro Ile Ala Leu Ile Ile Thr Pro Val Arg Ile
565 570 575
Asp Pro Glu Ile Tyr Lys Ala Ile Gln Arg Ser Ser Arg Leu Ala Phe
580 585 590
Asp Asp Thr Leu Ala Glu Leu Trp Ala Ser Arg Ser Pro Gly Pro Gly
595 600 605
Pro Ala Ala Ala Glu Thr Thr Ser Ser Ser Pro Thr Thr Gly Arg Ser
610 615 620
Ser Arg
625
<210> 13
<211> 1235
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 13
Met Phe Ser Gly Gly Gly Gly Pro Leu Ser Pro Gly Gly Lys Ser Ala
1 5 10 15
Ala Arg Ala Ala Ser Gly Phe Phe Ala Pro Ala Gly Pro Arg Gly Ala
20 25 30
Ser Arg Gly Pro Pro Pro Cys Leu Arg Gln Asn Phe Tyr Asn Pro Tyr
35 40 45
Leu Ala Pro Val Gly Thr Gln Gln Lys Pro Thr Gly Pro Thr Gln Arg
50 55 60
His Thr Tyr Tyr Ser Glu Cys Asp Glu Phe Arg Phe Ile Ala Pro Arg
65 70 75 80
Val Leu Asp Glu Asp Ala Pro Pro Glu Lys Arg Ala Gly Val His Asp
85 90 95
Gly His Leu Lys Arg Ala Pro Lys Val Tyr Cys Gly Gly Asp Glu Arg
100 105 110
Asp Val Leu Arg Val Gly Ser Gly Gly Phe Trp Pro Arg Arg Ser Arg
115 120 125
Leu Trp Gly Gly Val Asp His Ala Pro Ala Gly Phe Asn Pro Thr Val
130 135 140
Thr Val Phe His Val Tyr Asp Ile Leu Glu Asn Val Glu His Ala Tyr
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Gly Met Arg Ala Ala Gln Phe His Ala Arg Phe Met Asp Ala Ile Thr
165 170 175
Pro Thr Gly Thr Val Ile Thr Leu Leu Gly Leu Thr Pro Glu Gly His
180 185 190
Arg Val Ala Val His Val Tyr Gly Thr Arg Gln Tyr Phe Tyr Met Asn
195 200 205
Lys Glu Glu Val Asp Arg His Leu Gln Cys Arg Ala Pro Arg Asp Leu
210 215 220
Cys Glu Arg Met Ala Ala Ala Leu Arg Glu Ser Pro Gly Ala Ser Phe
225 230 235 240
Arg Gly Ile Ser Ala Asp His Phe Glu Ala Glu Val Val Glu Arg Thr
245 250 255
Asp Val Tyr Tyr Tyr Glu Thr Arg Pro Ala Leu Phe Tyr Arg Val Tyr
260 265 270
Val Arg Ser Gly Arg Val Leu Ser Tyr Leu Cys Asp Asn Phe Cys Pro
275 280 285
Ala Ile Lys Lys Tyr Glu Gly Gly Val Asp Ala Thr Thr Arg Phe Ile
290 295 300
Leu Asp Asn Pro Gly Phe Val Thr Phe Gly Trp Tyr Arg Leu Lys Pro
305 310 315 320
Gly Arg Asn Asn Thr Leu Ala Gln Pro Ala Ala Pro Met Ala Phe Gly
325 330 335
Thr Ser Ser Asp Val Glu Phe Asn Cys Thr Ala Asp Asn Leu Ala Ile
340 345 350
Glu Gly Gly Met Ser Asp Leu Pro Ala Tyr Lys Leu Met Cys Phe Asp
355 360 365
Ile Glu Cys Lys Ala Gly Gly Glu Asp Glu Leu Ala Phe Pro Val Ala
370 375 380
Gly His Pro Glu Asp Leu Val Ile Gln Ile Ser Cys Leu Leu Tyr Asp
385 390 395 400
Leu Ser Thr Thr Ala Leu Glu His Val Leu Leu Phe Ser Leu Gly Ser
405 410 415
Cys Asp Leu Pro Glu Ser His Leu Asn Glu Leu Ala Ala Arg Gly Leu
420 425 430
Pro Thr Pro Val Val Leu Glu Phe Asp Ser Glu Phe Glu Met Leu Leu
435 440 445
Ala Phe Met Thr Leu Val Lys Gln Tyr Gly Pro Glu Phe Val Thr Gly
450 455 460
Tyr Asn Ile Ile Asn Phe Asp Trp Pro Phe Leu Leu Ala Lys Leu Thr
465 470 475 480
Asp Ile Tyr Lys Val Pro Leu Asp Gly Tyr Gly Arg Met Asn Gly Arg
485 490 495
Gly Val Phe Arg Val Trp Asp Ile Gly Gln Ser His Phe Gln Lys Arg
500 505 510
Ser Lys Ile Lys Val Asn Gly Met Val Asn Ile Asp Met Tyr Gly Ile
515 520 525
Ile Thr Asp Lys Ile Lys Leu Ser Ser Tyr Lys Leu Asn Ala Val Ala
530 535 540
Glu Ala Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Asp Leu Ser Tyr Arg Asp Ile
545 550 555 560
Pro Ala Tyr Tyr Ala Ala Gly Pro Ala Gln Arg Gly Val Ile Gly Glu
565 570 575
Tyr Cys Ile Gln Asp Ser Leu Leu Val Gly Gln Leu Phe Phe Lys Phe
580 585 590
Leu Pro His Leu Glu Leu Ser Ala Val Ala Arg Leu Ala Gly Ile Asn
595 600 605
Ile Thr Arg Thr Ile Tyr Asp Gly Gln Gln Ile Arg Val Phe Thr Cys
610 615 620
Leu Leu Arg Leu Ala Asp Gln Lys Gly Phe Ile Leu Pro Asp Thr Gln
625 630 635 640
Gly Arg Phe Arg Gly Ala Gly Gly Glu Ala Pro Lys Arg Pro Ala Ala
645 650 655
Ala Arg Glu Asp Glu Glu Arg Pro Glu Glu Glu Gly Glu Asp Glu Asp
660 665 670
Glu Arg Glu Glu Gly Gly Gly Glu Arg Glu Pro Glu Gly Ala Arg Glu
675 680 685
Thr Ala Gly Arg His Val Gly Tyr Gln Gly Ala Arg Val Leu Asp Pro
690 695 700
Thr Ser Gly Phe His Val Asn Pro Val Val Val Phe Asp Phe Ala Ser
705 710 715 720
Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Gln Ala His Asn Leu Cys Phe Ser Thr Leu
725 730 735
Ser Leu Arg Ala Asp Ala Val Ala His Leu Glu Ala Gly Lys Asp Tyr
740 745 750
Leu Glu Ile Glu Val Gly Gly Arg Arg Leu Phe Phe Val Lys Ala His
755 760 765
Val Arg Glu Ser Leu Leu Ser Ile Leu Leu Arg Asp Trp Leu Ala Met
770 775 780
Arg Lys Gln Ile Arg Ser Arg Ile Pro Gln Ser Ser Pro Glu Glu Ala
785 790 795 800
Val Leu Leu Asp Lys Gln Gln Ala Ala Ile Lys Val Val Cys Asn Ser
805 810 815
Val Tyr Gly Phe Thr Gly Val Gln His Gly Leu Leu Pro Cys Leu His
820 825 830
Val Ala Ala Thr Val Thr Thr Ile Gly Arg Glu Met Leu Leu Ala Thr
835 840 845
Arg Glu Tyr Val His Ala Arg Trp Ala Ala Phe Glu Gln Leu Leu Ala
850 855 860
Asp Phe Pro Glu Ala Ala Asp Met Arg Ala Pro Gly Pro Tyr Ser Met
865 870 875 880
Arg Ile Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Ser Ile Phe Val Leu Cys Arg Gly
885 890 895
Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Ala Val Gly Asp Lys Met Ala Ser His
900 905 910
Ile Ser Arg Ala Leu Phe Leu Pro Pro Ile Lys Leu Glu Cys Glu Lys
915 920 925
Thr Phe Thr Lys Leu Leu Leu Ile Ala Lys Lys Lys Tyr Ile Gly Val
930 935 940
Ile Tyr Gly Gly Lys Met Leu Ile Lys Gly Val Asp Leu Val Arg Lys
945 950 955 960
Asn Asn Cys Ala Phe Ile Asn Arg Thr Ser Arg Ala Leu Val Asp Leu
965 970 975
Leu Phe Tyr Asp Asp Thr Val Ser Gly Ala Ala Ala Ala Leu Ala Glu
980 985 990
Arg Pro Ala Glu Glu Trp Leu Ala Arg Pro Leu Pro Glu Gly Leu Gln
995 1000 1005
Ala Phe Gly Ala Val Leu Val Asp Ala His Arg Arg Ile Thr Asp
1010 1015 1020
Pro Glu Arg Asp Ile Gln Asp Phe Val Leu Thr Ala Glu Leu Ser
1025 1030 1035
Arg His Pro Arg Ala Tyr Thr Asn Lys Arg Leu Ala His Leu Thr
1040 1045 1050
Val Tyr Tyr Lys Leu Met Ala Arg Arg Ala Gln Val Pro Ser Ile
1055 1060 1065
Lys Asp Arg Ile Pro Tyr Val Ile Val Ala Gln Thr Arg Glu Val
1070 1075 1080
Glu Glu Thr Val Ala Arg Leu Ala Ala Leu Arg Glu Leu Asp Ala
1085 1090 1095
Ala Ala Pro Gly Asp Glu Pro Ala Pro Pro Ala Ala Leu Pro Ser
1100 1105 1110
Pro Ala Lys Arg Pro Arg Glu Thr Pro Ser Pro Ala Asp Pro Pro
1115 1120 1125
Gly Gly Ala Ser Lys Pro Arg Lys Leu Leu Val Ser Glu Leu Ala
1130 1135 1140
Glu Asp Pro Ala Tyr Ala Ile Ala His Gly Val Ala Leu Asn Thr
1145 1150 1155
Asp Tyr Tyr Phe Ser His Leu Leu Gly Ala Ala Cys Val Thr Phe
1160 1165 1170
Lys Ala Leu Phe Gly Asn Asn Ala Lys Ile Thr Glu Ser Leu Leu
1175 1180 1185
Lys Arg Phe Ile Pro Glu Val Trp His Pro Pro Asp Asp Val Ala
1190 1195 1200
Ala Arg Leu Arg Thr Ala Gly Phe Gly Ala Val Gly Ala Gly Ala
1205 1210 1215
Thr Ala Glu Glu Thr Arg Arg Met Leu His Arg Ala Phe Asp Thr
1220 1225 1230
Leu Ala
1235
<210> 14
<211> 92
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 14
Met Ser Leu Arg Ala Val Trp His Leu Gly Leu Leu Gly Ser Leu Val
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Ala Ala Thr His Arg Gly Pro Ala Ala Asn Thr Thr
20 25 30
Asp Pro Leu Thr His Ala Pro Val Ser Pro His Pro Ser Pro Leu Gly
35 40 45
Gly Phe Ala Val Pro Leu Val Val Gly Gly Leu Cys Ala Val Val Leu
50 55 60
Gly Ala Ala Cys Leu Leu Glu Leu Leu Arg Arg Thr Cys Arg Gly Trp
65 70 75 80
Gly Arg Tyr His Pro Tyr Met Asp Pro Val Val Val
85 90
<210> 15
<211> 186
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 5
<400> 15
Met Lys Pro Val Leu Val Leu Ala Ile Leu Ala Val Leu Phe Leu Arg
1 5 10 15
Leu Ala Asp Ser Val Pro Arg Pro Leu Asp Val Val Val Ser Glu Ile
20 25 30
Arg Ser Ala His Phe Arg Val Glu Glu Asn Gln Cys Trp Phe His Met
35 40 45
Gly Met Leu Tyr Phe Lys Gly Arg Met Ser Gly Asn Phe Thr Glu Lys
50 55 60
His Phe Val Asn Val Gly Ile Val Ser Gln Ser Tyr Met Asp Arg Leu
65 70 75 80
Gln Val Ser Gly Glu Gln Tyr His His Asp Glu Arg Gly Ala Tyr Phe
85 90 95
Glu Trp Asn Ile Gly Gly His Pro Val Thr His Thr Val Asp Met Val
100 105 110
Asp Ile Thr Leu Ser Thr Arg Trp Gly Asp Pro Lys Lys Tyr Ala Ala
115 120 125
Cys Val Pro Gln Val Arg Met Asp Tyr Ser Ser Gln Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Tyr Leu Gln Arg Ser Met Arg Asp Asp Asn Trp Gly Leu Leu Phe Arg
145 150 155 160
Thr Leu Leu Val Tyr Leu Phe Ser Leu Val Val Leu Val Leu Leu Thr
165 170 175
Val Gly Val Ser Ala Arg Leu Arg Phe Ile
180 185
<210> 16
<211> 281
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 5
<400> 16
Met Val Gln Ile Gln Phe His Gln Gly Glu Pro Leu Gly His Lys Lys
1 5 10 15
Glu Lys Pro Pro Pro Val Ser Pro Pro Ser Pro Pro Pro Ile Arg Arg
20 25 30
Val Thr Val Ile Thr Lys Asp Glu Asp Thr Leu Arg Ser Val Gln His
35 40 45
Phe Leu Trp Met Val Arg Leu Tyr Gly Thr Val Val Phe Gln Thr Ser
50 55 60
Ala Thr Ile Ala Thr Thr Ile Leu Phe Met Leu Ile Pro Trp Arg Val
65 70 75 80
Thr Thr Pro Tyr Leu Arg Asp Thr Leu Pro Phe Trp Ser Thr Leu Leu
85 90 95
Pro Cys Ala Leu Arg Cys His Ala Tyr Trp Leu Glu Arg Gln Arg Arg
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Met Leu Val Met Val Tyr Thr Thr Leu Thr Thr Ile
115 120 125
Ser Val Ser Thr Ile Gly Leu Cys Phe Asp Arg Thr Val Val Ile Gln
130 135 140
Ala Tyr Val Leu Ser Ser Met Leu Cys Val Trp Cys Thr Gly Leu Ala
145 150 155 160
Trp Leu Met Ala Trp Asn Met Gln Arg Arg Leu Ala Ile Leu Cys Leu
165 170 175
Leu Ser Phe Met Leu Pro Ile Leu Trp Leu Phe Ile Ala Val Gln Ser
180 185 190
Trp Glu Pro Tyr Gln Arg Ile Ile Leu Ala Leu Thr Val Ser Phe Ile
195 200 205
Tyr Gly Leu Lys Ile Val Leu Ile Arg Asp Thr Leu Thr Val Leu Tyr
210 215 220
Arg Ser Pro Ser Asn Cys Tyr Thr Asp Gly Asp Leu Leu Arg Thr Ala
225 230 235 240
Met Leu Leu Tyr Met Asp Gln Val Ile Met Phe Leu Leu Val Val Val
245 250 255
Pro Leu Thr Ala Pro Ile Trp Tyr Pro Asn Tyr Ala Gly Ala Leu Gly
260 265 270
Arg Thr Ala His Trp Leu Phe His Lys
275 280
<210> 17
<211> 225
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 5
<400> 17
Met Arg Ile Gln Leu Leu Leu Val Ser Thr Leu Val Ala Ser Ile Val
1 5 10 15
Ala Thr Arg Val Glu Asp Met Ala Thr Phe Arg Thr Glu Lys Gln Trp
20 25 30
Gln Gln Asp Leu Gln Tyr Arg Arg Glu Phe Val Lys Arg Gln Leu Ala
35 40 45
Pro Lys Pro Lys Ser Asn Ile Val Val Ser His Thr Val Ser Cys Val
50 55 60
Ile Asp Gly Gly Asn Met Thr Ser Val Trp Arg Phe Glu Gly Gln Phe
65 70 75 80
Asn Pro His Ile Ala Ser Glu Val Ile Leu His Asp Thr Ser Gly Leu
85 90 95
Tyr Asn Val Pro His Glu Val Gln Asn Asp Gly Gln Val Leu Thr Val
100 105 110
Thr Val Lys Arg Ser Ala Pro Ala Asp Ile Ala Lys Val Leu Ile Ser
115 120 125
Leu Lys Pro Val Gln Leu Ser Ser Gly Gln Tyr Glu Cys Arg Pro Gln
130 135 140
Leu Gln Leu Pro Trp Val Pro Arg Pro Ser Ser Phe Met Tyr Asp Ser
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Trp Tyr Glu Lys Arg Trp Leu Thr Ile Ile Leu Tyr Val
165 170 175
Phe Met Trp Thr Tyr Leu Val Thr Leu Leu Gln Tyr Cys Ile Val Arg
180 185 190
Phe Ile Gly Thr Arg Leu Phe Tyr Phe Leu Gln Arg Asn Ile Thr Ile
195 200 205
Arg Phe Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Asn Leu Leu Thr Tyr Pro Val Lys
210 215 220
Gly
225
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 5
<400> 18
Met Arg Arg Trp Leu Arg Leu Leu Val Gly Leu Gly Cys Cys Trp Val
1 5 10 15
Thr Leu Ala His Ala Gly Asn Pro Tyr Glu Asp Asp Asp Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Arg Glu Asp Glu Pro Arg Gln His Gly Glu Pro Asn Tyr Val Ala
35 40 45
Pro Pro Ala Arg Gln Phe Arg Phe Pro Pro Leu Asn Asn Val Ser Ser
50 55 60
Tyr Gln Ala Ser Cys Val Val Lys Asp Gly Val Leu Asp Ala Val Trp
65 70 75 80
Arg Val Gln Gly Thr Phe Tyr Pro Glu Lys Gly Ile Val Ala Arg Val
85 90 95
Gly Trp Ser Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Gly Arg Leu His Ala Pro
100 105 110
Glu Cys Leu Val Glu Thr Thr Glu Ala Val Phe Arg Leu Arg Gln Trp
115 120 125
Val Pro Thr Asp Leu Asp His Leu Thr Leu His Leu Val Pro Cys Thr
130 135 140
Lys Cys Lys Pro Met Trp Cys Gln Pro Arg Tyr His Ile Arg Tyr Phe
145 150 155 160
Ser Tyr Gly Asn Ser Val Asp Asn Leu Arg Arg Leu His Tyr Glu Tyr
165 170 175
Arg His Leu Glu Leu Gly Val Val Ile Ala Ile Gln Met Ala Met Val
180 185 190
Leu Leu Leu Gly Tyr Val Leu Ala Arg Thr Val Tyr Arg Val Ser Ser
195 200 205
Ala Tyr Tyr Leu Arg Trp His Ala Cys Val Pro Gln Lys Cys Glu Lys
210 215 220
Ser Leu Cys
225
<210> 19
<211> 183
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 5
<400> 19
Met Asp Leu Leu Ile Arg Leu Gly Phe Leu Leu Met Cys Ala Leu Pro
1 5 10 15
Thr Pro Gly Glu Arg Ser Ser Arg Asp Pro Lys Thr Leu Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Arg Gln Gln Ala Cys Val Pro Arg Thr Lys Ser His Arg Pro
35 40 45
Val Cys Tyr Asn Asp Thr Gly Asp Cys Thr Asp Ala Asp Asp Ser Trp
50 55 60
Lys Gln Leu Gly Glu Asp Phe Ala His Gln Cys Leu Gln Ala Ala Lys
65 70 75 80
Lys Arg Pro Lys Thr His Lys Ser Arg Pro Asn Asp Arg Asn Leu Glu
85 90 95
Gly Arg Leu Thr Cys Gln Arg Val Arg Arg Leu Leu Pro Cys Asp Leu
100 105 110
Asp Ile His Pro Ser His Arg Leu Leu Thr Leu Met Asn Asn Cys Val
115 120 125
Cys Asp Gly Ala Val Trp Asn Ala Phe Arg Leu Ile Glu Arg His Gly
130 135 140
Phe Phe Ala Val Thr Leu Tyr Leu Cys Cys Gly Ile Thr Leu Leu Val
145 150 155 160
Val Ile Leu Ala Leu Leu Cys Ser Ile Thr Tyr Glu Ser Thr Gly Arg
165 170 175
Gly Ile Arg Arg Cys Gly Ser
180
<210> 20
<211> 490
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 20
Met Asp Leu Leu Val Asp Glu Leu Phe Ala Asp Met Asn Ala Asp Gly
1 5 10 15
Ala Ser Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ala Gly Gly Pro Lys Asn Thr Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Pro Leu Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Gln Ala Gln Leu
35 40 45
Met Pro Ser Pro Pro Met Pro Val Pro Pro Ala Ala Leu Phe Asn Arg
50 55 60
Leu Leu Asp Asp Leu Gly Phe Ser Ala Gly Pro Ala Leu Cys Thr Met
65 70 75 80
Leu Asp Thr Trp Asn Glu Asp Leu Phe Ser Ala Leu Pro Thr Asn Ala
85 90 95
Asp Leu Tyr Arg Glu Cys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Pro Ser Asp Val
100 105 110
Val Glu Trp Gly Asp Ala Tyr Val Pro Glu Arg Thr Gln Ile Asp Ile
115 120 125
Arg Ala His Gly Asp Val Ala Phe Pro Thr Leu Pro Ala Thr Arg Asp
130 135 140
Gly Leu Gly Leu Tyr Tyr Glu Ala Leu Ser Arg Phe Phe His Ala Glu
145 150 155 160
Leu Arg Ala Arg Glu Glu Ser Tyr Arg Thr Val Leu Ala Asn Phe Cys
165 170 175
Ser Ala Leu Tyr Arg Tyr Leu Arg Ala Ser Val Arg Gln Leu His Arg
180 185 190
Gln Ala His Met Arg Gly Arg Asp Arg Asp Leu Gly Glu Met Leu Arg
195 200 205
Ala Thr Ile Ala Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Thr Ala Arg Leu Ala Arg
210 215 220
Val Leu Phe Leu His Leu Tyr Leu Phe Leu Thr Arg Glu Ile Leu Trp
225 230 235 240
Ala Ala Tyr Ala Glu Gln Met Met Arg Pro Asp Leu Phe Asp Cys Leu
245 250 255
Cys Cys Asp Leu Glu Ser Trp Arg Gln Leu Ala Gly Leu Phe Gln Pro
260 265 270
Phe Met Phe Val Asn Gly Ala Leu Thr Val Arg Gly Val Pro Ile Glu
275 280 285
Ala Arg Arg Leu Arg Glu Leu Asn His Ile Arg Glu His Leu Asn Leu
290 295 300
Pro Leu Val Arg Ser Ala Ala Thr Glu Glu Pro Gly Ala Pro Leu Thr
305 310 315 320
Thr Pro Pro Thr Leu His Gly Asn Gln Ala Arg Ala Ser Gly Tyr Phe
325 330 335
Met Val Leu Ile Arg Ala Lys Leu Asp Ser Tyr Ser Ser Phe Thr Thr
340 345 350
Ser Pro Ser Glu Ala Val Met Arg Glu His Ala Tyr Ser Arg Ala Arg
355 360 365
Thr Lys Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Ile Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro
370 375 380
Asp Asp Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr
405 410 415
Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala
420 425 430
Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly
435 440 445
Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro
450 455 460
Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr
465 470 475 480
Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly
485 490
<210> 21
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Thr Met Glu Thr Gln Met Ser Gln Asn Val Cys Pro Arg Asn Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Gln Pro Leu Thr Val Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala Asp
20 25 30
Ser Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro
35 40 45
Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly
50 55 60
Ala Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn
65 70 75 80
Leu Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn
85 90 95
Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser
100 105 110
Asp Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr
115 120 125
Pro His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His
130 135 140
Ser Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gln Lys Phe Ser His Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln
165 170 175
Ala Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly
180 185 190
Tyr Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro
195 200 205
Ser Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile Val Ala Val Val Ile
210 215 220
Ala Thr Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala Val Val Ala Leu Ile Tyr
225 230 235 240
Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Asn Ser Thr Asp Pro Val Lys Ala
245 250 255
Ala Gln Phe Glu Pro Pro Gly Arg Gln Met Ile Ala Ile Arg Lys Arg
260 265 270
Gln Leu Glu Glu Thr Asn Asn Asp Tyr Glu Thr Ala Asp Gly Gly Tyr
275 280 285
Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp Lys Asn Ile Tyr
290 295 300
Leu Thr Leu Pro Pro Asn Asp His Val Asn Ser Asn Asn
305 310 315
<210> 22
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Ile Leu Ser Phe Leu Pro Val Leu Ala Thr Glu Ser Asp Trp
1 5 10 15
Ala Asp Cys Lys Ser Pro Gln Pro Trp Gly His Met Leu Leu Trp Thr
20 25 30
Ala Val Leu Phe Leu Ala Pro Val Ala Gly Thr Pro Ala Ala Pro Pro
35 40 45
Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val Leu Gln Glu
50 55 60
Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro Glu Ser Asp
65 70 75 80
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100 105 110
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165 170 175
Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser His Ser Gly
180 185 190
Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr Ser Ser Lys
195 200 205
Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile
210 215 220
Ile Val Ala Val Val Thr Gly Ile Ala Val Ala Ala Ile Val Ala Ala
225 230 235 240
Val Val Ala Leu Ile Tyr Cys Arg Lys Lys Arg Ile Ser Ala Leu Pro
245 250 255
Gly Tyr Pro Glu Cys Arg Glu Met Gly Glu Thr Leu Pro Glu Lys Pro
260 265 270
Ala Asn Pro Thr Asn Pro Asp Glu Ala Asp Lys Val Gly Ala Glu Asn
275 280 285
Thr Ile Thr Tyr Ser Leu Leu Met His Pro Asp Ala Leu Glu Glu Pro
290 295 300
Asp Asp Gln Asn Arg Ile
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<211> 390
<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 23
Met Pro Cys Arg Pro Leu Gln Gly Leu Val Leu Val Gly Leu Trp Val
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Leu Val Val Arg Gly Pro Thr Val Ser Leu Val Ser
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Asn Ser Phe Val Asp Ala Gly Ala Leu Gly Pro Asp Gly Val Val Glu
35 40 45
Glu Asp Leu Leu Ile Leu Gly Glu Leu Arg Phe Val Gly Asp Gln Val
50 55 60
Pro His Thr Thr Tyr Tyr Asp Gly Gly Val Glu Leu Trp His Tyr Pro
65 70 75 80
Met Gly His Lys Cys Pro Arg Val Val His Val Val Thr Val Thr Ala
85 90 95
Cys Pro Arg Arg Pro Ala Val Ala Phe Ala Leu Cys Arg Ala Thr Asp
100 105 110
Ser Thr His Ser Pro Ala Tyr Pro Thr Leu Glu Leu Asn Leu Ala Gln
115 120 125
Gln Pro Leu Leu Arg Val Gln Arg Ala Thr Arg Asp Tyr Ala Gly Val
130 135 140
Tyr Val Leu Arg Val Trp Val Gly Asp Ala Pro Asn Ala Ser Leu Phe
145 150 155 160
Val Leu Gly Met Ala Ile Ala Ala Glu Gly Thr Leu Ala Tyr Asn Gly
165 170 175
Ser Ala Tyr Gly Ser Cys Asp Pro Lys Leu Leu Pro Ser Ser Ala Pro
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Arg Leu Ala Pro Ala Ser Val Tyr Gln Pro Ala Pro Asn Gln Ala Ser
195 200 205
Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ser Thr Pro Ser Thr Thr Ile Pro Ala Pro
210 215 220
Ser Thr Thr Ile Pro Ala Pro Gln Ala Ser Thr Thr Pro Phe Pro Thr
225 230 235 240
Gly Asp Pro Lys Pro Gln Pro Pro Gly Val Asn His Glu Pro Pro Ser
245 250 255
Asn Ala Thr Arg Ala Thr Arg Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Thr Val Thr
260 265 270
Gln Ile Ile Gln Ile Ala Ile Pro Ala Ser Ile Ile Ala Leu Val Phe
275 280 285
Leu Gly Ser Cys Ile Cys Phe Ile His Arg Cys Gln Arg Arg Tyr Arg
290 295 300
Arg Ser Arg Arg Pro Ile Tyr Ser Pro Gln Met Pro Thr Gly Ile Ser
305 310 315 320
Cys Ala Val Asn Glu Ala Ala Met Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Lys
325 330 335
Ser His Pro Ser Thr Pro Pro Lys Ser Arg Arg Arg Ser Ser Arg Thr
340 345 350
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355 360 365
Ala Ala Gly Leu Pro Thr Pro Pro Val Asp Pro Thr Thr Pro Thr Pro
370 375 380
Thr Pro Pro Leu Leu Val
385 390
<210> 24
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
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Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
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Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
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Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
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210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245 250
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL1 正向引物
<400> 25
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<212> PRT
<213> 人类疱疹病毒 1
<400> 26
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1 5 10 15
Val Gly Gly Gln Glu Ala Gly Gly Pro Ser Ala Ala Thr Gln Gly Glu
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Ala Ala Gly Ala Pro Leu Ala His Gly His His Val Tyr Cys Gln Arg
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Val Asn Gly Val Met Val Leu Ser Asp Lys Thr Pro Gly Ser Ala Ser
50 55 60
Tyr Arg Ile Ser Asp Ser Asn Phe Val Gln Cys Gly Ser Asn Cys Thr
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Met Ile Ile Asp Gly Asp Val Val Arg Gly Arg Pro Gln Asp Pro Gly
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Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Phe Val Ala Val Thr Asn Ile Gly Ala
100 105 110
Gly Ser Asp Gly Gly Thr Ala Val Val Ala Phe Gly Gly Thr Pro Arg
115 120 125
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Glu Ala Leu Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Arg Phe Thr Leu Gly Gly
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Gly Cys Cys Ser Cys Arg Asp Thr Arg Arg Arg Ser Ala Val Phe Gly
165 170 175
Gly Glu Gly Asp Pro Val Gly Pro Ala Glu Phe Val Ser Asp Asp Arg
180 185 190
Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Asp Ser Glu Asp Thr Asp Ser Glu Thr
195 200 205
Leu Ser His Ala Ser Ser Asp Val Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Asp Asp
210 215 220
Ala Leu Asp Ser Asp Ser Ser Ser Asp Asp Ser Leu Gln Ile Asp Gly
225 230 235 240
Pro Val Cys Arg Pro Trp Ser Asn Asp Thr Ala Pro Leu Asp Val Cys
245 250 255
Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gly Ala Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ala Val
260 265 270
Asp Pro His Ala Pro Thr Thr Gly Ala Gly Ala Gly Leu Ala Ala Asp
275 280 285
Pro Ala Val Ala Arg Asp Asp Ala Glu Gly Leu Ser Asp Pro Arg Pro
290 295 300
Arg Leu Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Pro Val Pro Leu Glu Leu Thr Pro
305 310 315 320
Glu Asn Ala Glu Ala Val Ala Arg Phe Leu Gly Asp Ala Val Asn Arg
325 330 335
Glu Pro Ala Leu Met Leu Glu Tyr Phe Cys Arg Cys Ala Arg Glu Glu
340 345 350
Thr Lys Arg Val Pro Pro Arg Thr Phe Cys Ser Pro Pro Arg Leu Thr
355 360 365
Glu Asp Asp Phe Gly Leu Leu Asn Tyr Ala Leu Val Glu Met Gln Arg
370 375 380
Leu Cys Leu Asp Val Pro Pro Val Pro Pro Asn Ala Tyr Met Pro Tyr
385 390 395 400
Tyr Leu Arg Glu Tyr Val Thr Arg Leu Val Asn Gly Phe Lys Pro Leu
405 410 415
Val Ser Arg Ser Val Arg Leu Tyr Arg Ile Leu Gly Val Leu Val His
420 425 430
Leu Arg Ile Arg Thr Arg Glu Ala Ser Phe Glu Glu Trp Leu Arg Ser
435 440 445
Lys Glu Val Ala Leu Asp Phe Gly Leu Thr Glu Arg Leu Arg Glu His
450 455 460
Glu Ala Gln Leu Val Ile Leu Ala Gln Ala Leu Asp His Tyr Asp Cys
465 470 475 480
Leu Ile His Ser Thr Pro His Thr Leu Val Glu Arg Gly Leu Gln Ser
485 490 495
Ala Leu Lys Tyr Glu Glu Phe Tyr Leu Lys Arg Phe Gly Gly His Tyr
500 505 510
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Cys Arg Ala Thr Arg Gly Met Arg His Ile Ala Leu Gly Arg Glu Gly
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565 570 575
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Gly Val Leu Ala Gly Glu Glu Ala Gln Arg Cys Asp Asn Ile Phe Ser
675 680 685
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Met Ser Leu Ala Asp Phe His Gly Glu Glu Phe Glu Lys Leu Tyr Gln
725 730 735
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740 745 750
Ala Tyr Gly Ile Val Arg Ser Ala Ala Thr Thr Gly Ser Pro Phe Val
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770 775 780
Ala Ala Ile Ala Gly Ser Asn Leu Cys Thr Glu Ile Val His Pro Ala
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Ser Lys Arg Ser Ser Gly Val Cys Asn Leu Gly Ser Val Asn Leu Ala
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Arg Cys Val Ser Arg Gln Thr Phe Asp Phe Gly Arg Leu Arg Asp Ala
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835 840 845
Gln Pro Thr Pro Gln Cys Thr Arg Gly Asn Asp Asn Leu Arg Ser Met
850 855 860
Gly Ile Gly Met Gln Gly Leu His Thr Ala Cys Leu Lys Leu Gly Leu
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980 985 990
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<211> 36
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL1 反向引物
<400> 28
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<211> 35
<212> DNA
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<220>
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<400> 29
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL2 反向引物
<400> 30
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<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 31
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<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 32
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 33
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<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL4 反向引物
<400> 34
gtctacttaa ttaaggaccc caaaagtttg tctgcg 36
<210> 35
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 36
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<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL6 反向引物
<400> 38
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<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL7 反向引物
<400> 40
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<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL8 正向引物
<400> 41
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<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL8 反向引物
<400> 42
gtctacttaa ttaaggcaaa cagaaacgac atcttg 36
<210> 43
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL9 正向引物
<400> 43
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<210> 44
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL9 反向引物
<400> 44
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<210> 45
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL10 正向引物
<400> 45
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<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL10 反向引物
<400> 46
gtctacttaa ttaaccaacg gcggacggtg ctgtac 36
<210> 47
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL11 正向引物
<400> 47
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<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL11 反向引物
<400> 48
gtctacttaa ttaattcgct atcggacatg gggggtg 37
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL12 正向引物
<400> 49
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<210> 50
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL12 反向引物
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<210> 51
<211> 35
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<220>
<223> UL13 正向引物
<400> 51
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<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL13 反向引物
<400> 52
gtctacttaa ttaacgacag cgcgtgccgc gcgcac 36
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL14 正向引物
<400> 53
gtctacacta gtatggaccg agatgccgcc cacg 34
<210> 54
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL14 反向引物
<400> 54
gtctacttaa ttaattcgcc atcgggatag tcccg 35
<210> 55
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL15 正向引物
<400> 55
gtctacacta gtatgtttgg tcagcagctg gcgtc 35
<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL15 反向引物
<400> 56
gtctacttaa ttaacgaaac gcgtgtgatg ggagcg 36
<210> 57
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL16 正向引物
<400> 57
gtctacacta gtatggcgca gctgggaccc cggcg 35
<210> 58
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL16 反向引物
<400> 58
gtctacttaa ttaattcggg atcgcttgag gaggcccg 38
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL17 正向引物
<400> 59
gtctacacta gtatgaacgc gcacttggcc aacgaggtc 39
<210> 60
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL17 反向引物
<400> 60
gtctacttaa ttaagcgaga acggccgttc ccgga 35
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL18 正向引物
<400> 61
gtctacacta gtatgctggc ggacggcttt gaaac 35
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL18 反向引物
<400> 62
gtctacttaa ttaagggata gcgtataacg gg 32
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL19 正向引物
<400> 63
gtctacacta gtatggccgc tcccaaccgc gaccc 35
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL19 反向引物
<400> 64
gtctacttaa ttaacagagc cagtcccttg agcggggatg 40
<210> 65
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL20 正向引物
<400> 65
gtctacacta gtatgaccat gcgggatgac cttcctc 37
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL20 反向引物
<400> 66
gtctacttaa ttaagaacgc gacgggtgca ttcaag 36
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL21 正向引物
<400> 67
gtctacacta gtatggagct tagctacgcc acc 33
<210> 68
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL21 反向引物
<400> 68
gtctacttaa ttaacacaga ctgtccgtgt ttgg 34
<210> 69
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL22 正向引物
<400> 69
gtctacacta gtatggggaa tggtttatgg ttcg 34
<210> 70
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL22 反向引物
<400> 70
gtctacttaa ttaattcgcg tctccaaaaa aacgggacac 40
<210> 71
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL23 正向引物
<400> 71
gtctacacta gtatggcttc gtacccctgc catc 34
<210> 72
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL23 反向引物
<400> 72
gtctacttaa ttaagttagc ctcccccatc tcccgggcaa acg 43
<210> 73
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL24 正向引物
<400> 73
gtctacacta gtatggccgc gagaacgcgc agc 33
<210> 74
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL24 反向引物
<400> 74
gtctacttaa ttaattcgga ggcggctcgg ggtttg 36
<210> 75
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL25 正向引物
<400> 75
gtctacacta gtatggaccc gtactgccca tttg 34
<210> 76
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL25 反向引物
<400> 76
gtctacttaa ttaaaaccgc cgacaggtac tgtgg 35
<210> 77
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL26 正向引物
<400> 77
gtctacacta gtatggcagc cgatgccccg ggag 34
<210> 78
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL26 反向引物
<400> 78
gtctacttaa ttaagcgggc ccccatcatc tgagag 36
<210> 79
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL26.5 正向引物
<400> 79
gtctacacta gtatgaaccc cgttccggca tcgggc 36
<210> 80
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL26.5 反向引物
<400> 80
gtctacttaa ttaagcgggc ccccatcatc tgagag 36
<210> 81
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL27 正向引物
<400> 81
gtctacacta gtatgcgcca gggcgccccc gc 32
<210> 82
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL27 反向引物
<400> 82
gtctacttaa ttaacaggtc gtcctcgtcg gcgtc 35
<210> 83
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL28 正向引物
<400> 83
gtctacacta gtatggccgc cccggtgtcc gagccc 36
<210> 84
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL28 反向引物
<400> 84
gtctacttaa ttaacggggg cccgtcgtgc cccc 34
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL29 正向引物
<400> 85
gtctacacta gtatggagac aaagcccaag acggc 35
<210> 86
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL29 反向引物
<400> 86
gtctacttaa ttaacagcat atccaacgtc aggtctc 37
<210> 87
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL30 正向引物
<400> 87
gtctacacta gtatgttttc cggtggcggc gg 32
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL30 反向引物
<400> 88
gtctacttaa ttaatgctag agtatcaaag gctc 34
<210> 89
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL31 正向引物
<400> 89
gtctacacta gtatgtatga caccgacccc catc 34
<210> 90
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL31 反向引物
<400> 90
gtctacttaa ttaacggcgg aggaaactcg tcgaatg 37
<210> 91
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL32 正向引物
<400> 91
gtctacacta gtgcccagcc atggcaactt cg 32
<210> 92
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL32 反向引物
<400> 92
gtctacttaa ttaatacata ggtacacagg gtgtgc 36
<210> 93
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL33 正向引物
<400> 93
gtctacacta gtgaagttgc catggctggg c 31
<210> 94
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL33 反向引物
<400> 94
gtctacttaa ttaagccccg cagaatctgg tgcaggtc 38
<210> 95
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL34 正向引物
<400> 95
gtctacacta gtatggcggg actgggcaag ccc 33
<210> 96
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL34 反向引物
<400> 96
gtctacttaa ttaataggcg cgcgccagca ccaac 35
<210> 97
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL35 正向引物
<400> 97
gtctacacta gtatggccgt cccgcaattt cac 33
<210> 98
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL35 反向引物
<400> 98
gtctacttaa ttaacggggt cccgggcgtc gaagg 35
<210> 99
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL36 正向引物
<400> 99
gtctacacta gtatgatcgc gggcacccca ccgcac 36
<210> 100
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL36 反向引物
<400> 100
gtctacttaa ttaagcccag taacatgcgc acgtgatg 38
<210> 101
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL37 正向引物
<400> 101
gtctacacta gtatggcaga ccgcggtctc ccgtccg 37
<210> 102
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL37 反向引物
<400> 102
gtctacttaa ttaattggta actcgttaac ggcaagtc 38
<210> 103
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL38 正向引物
<400> 103
gtctacacta gtatgaagac caatccgcta cccg 34
<210> 104
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL38 反向引物
<400> 104
gtctacttaa ttaacgcgca tgcccgccac tcgcc 35
<210> 105
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL39 正向引物
<400> 105
gtctacacta gtatggccag ccgcccagcc gc 32
<210> 106
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL39 反向引物
<400> 106
gtctacttaa ttaacagcgc gcagctcgtg cagac 35
<210> 107
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL40 正向引物
<400> 107
gtctacacta gtatggattc cgcggcccca g 31
<210> 108
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL40 反向引物
<400> 108
gtctacttaa ttaacagatc gttgacgacc gc 32
<210> 109
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL41 正向引物
<400> 109
gtctacacta gtatgggttt gttcgggatg atgaag 36
<210> 110
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL41 反向引物
<400> 110
gtctacttaa ttaactcgtc ccagaatttg gccag 35
<210> 111
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL42 正向引物
<400> 111
gtctacacta gtatgacgga ttcccctggc ggtg 34
<210> 112
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL42 反向引物
<400> 112
gtctacttaa ttaaggggaa tccaaaacca gac 33
<210> 113
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL43 正向引物
<400> 113
gtctacacta gtatgctccg caacgacagc cacc 34
<210> 114
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL43 反向引物
<400> 114
gtctacttaa ttaaatcgcc cgaccgcccg cccgttg 37
<210> 115
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL44 正向引物
<400> 115
gtctacacta gtgctttgcc gggaacgcta gc 32
<210> 116
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL44 反向引物
<400> 116
gtctacttaa ttaaccgccg atgacgctgc cgcgac 36
<210> 117
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL45 正向引物
<400> 117
gtctacacta gtatgcctct gcgggcatcg gaac 34
<210> 118
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL45 反向引物
<400> 118
gtctacttaa ttaacggcag ccccagcgcg ttgc 34
<210> 119
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL46 正向引物
<400> 119
gtctacacta gtctggacgc ggcataactc cgac 34
<210> 120
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL46 反向引物
<400> 120
gtctacttaa ttaaccggct ccggcgtcct tcgcgtttaa g 41
<210> 121
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL47 正向引物
<400> 121
gtctacacta gtatgtcggc tcgcgaaccc gc 32
<210> 122
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL47 反向引物
<400> 122
gtctacttaa ttaatgggcg tggcgggcct cccag 35
<210> 123
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL48 正向引物
<400> 123
gtctacacta gtatggacct cttggtcgac gagctg 36
<210> 124
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL48 反向引物
<400> 124
gtctacttaa ttaacccacc gtactcgtca attccaag 38
<210> 125
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL49 正向引物
<400> 125
gtctacacta gtatgacctc tcgccgctcc gtgaag 36
<210> 126
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL49 反向引物
<400> 126
gtctacttaa ttaactcgac gggccgtctg g 31
<210> 127
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL49A 正向引物
<400> 127
gtctacacta gtctcatctt cctgttaggg acgatg 36
<210> 128
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL49A 反向引物
<400> 128
gtctacttaa ttaaggcgtg cccggcagcc agtag 35
<210> 129
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL50 正向引物
<400> 129
gtctacacta gtgtccctaa caggaagatg agtcag 36
<210> 130
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL50 反向引物
<400> 130
gtctacttaa ttaaaatacc ggtagagcca aaacc 35
<210> 131
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL51 正向引物
<400> 131
gtctacacta gtatggcttc tcttctcggg gc 32
<210> 132
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL51 反向引物
<400> 132
gtctacttaa ttaattgacc caaaacacac ggagctgc 38
<210> 133
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL52 正向引物
<400> 133
gtctacacta gtatggggca ggaagacggg aac 33
<210> 134
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL52 反向引物
<400> 134
gtctacttaa ttaaagacga cggttgagag gtgctgc 37
<210> 135
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL53 正向引物
<400> 135
gtctacacta gtatgctcgc cgtccgttcc ctgcag 36
<210> 136
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL53 反向引物
<400> 136
gtctacttaa ttaatacatc aaacaggcgc ctctggatc 39
<210> 137
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL54 正向引物
<400> 137
gtctacacta gtatggcgac tgacattgat atgctaattg 40
<210> 138
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL54 反向引物
<400> 138
gtctacttaa ttaaaaacag ggagttgcaa taaaaatatt tgc 43
<210> 139
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL55 正向引物
<400> 139
gtctacacta gtcttttgca ctatgacagc gacc 34
<210> 140
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL55 反向引物
<400> 140
gtctacttaa ttaacgcctt aattttaatc ttgac 35
<210> 141
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL56 正向引物
<400> 141
gtctacacta gtcatccatg gcttcggagg cggcgc 36
<210> 142
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UL56 反向引物
<400> 142
gtctacttaa ttaaccgcca caggaatacc agaataatg 39
<210> 143
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RS1 正向引物
<400> 143
gtctacacta gtatggcgtc ggagaacaag cagcg 35
<210> 144
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RS1 反向引物
<400> 144
gtctacttaa ttaacagcac cccgtccccc tcgaacgcg 39
<210> 145
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US1 正向引物
<400> 145
gtctacacta gtatggccga catttcccca gg 32
<210> 146
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US1 反向引物
<400> 146
gtctacttaa ttaacggccg gagaaacgtg tcgctg 36
<210> 147
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US2 正向引物
<400> 147
gtctacacta gtatgggcgt tgttgtcgtc aacg 34
<210> 148
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US2 反向引物
<400> 148
gtctacttaa ttaacagggt ggtaaccgga tagcagatg 39
<210> 149
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US3 正向引物
<400> 149
gtctacacta gtatggcctg tcgtaagttt tgtcg 35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US3 反向引物
<400> 150
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<210> 151
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US4 正向引物
<400> 151
gtctacacta gtcatcatgt cgccgggcgc catg 34
<210> 152
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US4 反向引物
<400> 152
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<210> 153
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US5 正向引物
<400> 153
gtctacacta gtatgtctct gcgcgcagtc tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US5 反向引物
<400> 154
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<210> 155
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US6 正向引物
<400> 155
gtctacacta gtgtgtggtg cgttccggta tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US6 反向引物
<400> 156
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<210> 157
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US7 正向引物
<400> 157
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US7 反向引物
<400> 158
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US8 正向引物
<400> 159
gtctacacta gtgacatgga tcgcggggcg gtg 33
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US8 反向引物
<400> 160
gtctacttaa ttaaccagaa gacggacgaa tcgg 34
<210> 161
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US8A 正向引物
<400> 161
gtctacacta gtatggatcc ggctttgaga tc 32
<210> 162
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US8A 反向引物
<400> 162
gtctacttaa ttaatgcgcc tcgggcaatt gacgtc 36
<210> 163
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US9 正向引物
<400> 163
gtctacacta gtatgacgtc ccggctctcc g 31
<210> 164
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US9 反向引物
<400> 164
gtctacttaa ttaagcggag cagccacatc aggag 35
<210> 165
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US10 正向引物
<400> 165
gtctacacta gtgtgataat gatcaagcgg cgg 33
<210> 166
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US10 反向引物
<400> 166
gtctacttaa ttaagcacag gggtggggtt agg 33
<210> 167
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US11 正向引物
<400> 167
gtctacacta gtgtggctct cgagatgagc cag 33
<210> 168
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US11 反向引物
<400> 168
gtctacttaa ttaatacaga cccgcgagcc gtacgtg 37
<210> 169
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US12 正向引物
<400> 169
gtctacacta gtatgtcgtg ggccctggaa atggc 35
<210> 170
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> US12 反向引物
<400> 170
gtctacttaa ttaaacgggt taccggatta cggggac 37

Claims (21)

1.一种用于治疗感染编码Fc结合蛋白的病原体的受试者的药物组合物，所述组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合病原体编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫效应细胞是B细胞、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或粒细胞、T细胞或树突细胞。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中编码Fc结合蛋白的所述病原体是单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒或水痘带状疱疹病毒(VZV)。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述病原体编码的Fc结合蛋白包含疱疹病毒糖蛋白E(gE)或巨细胞病毒68kDa-糖蛋白(gp68)。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域的所述免疫多肽是IgG抗体的Fc片段。
6.一种治疗感染编码Fc结合蛋白的病原体的受试者的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求1所述的药物组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域的所述免疫多肽是IgG抗体的Fc片段。
8.一种用于预防患有HSV1感染的受试者的神经损伤的药物组合物，所述组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合单纯疱疹病毒编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。
9.一种用于预防患有HSV1感染的受试者的神经损伤的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求8所述的药物组合物。
10.一种用于预防患有HSV1感染的受试者的死亡的药物组合物，所述组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合单纯疱疹病毒编码的Fc结合蛋白的非重叠结构域。
11.一种用于预防患有HSV1感染的受试者的死亡的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求10所述的药物组合物。
12.一种用于治疗经受溶瘤病毒治疗的受试者的癌症的药物组合物，所述组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域和结合靶细胞上的Fc结合蛋白的非重叠结构域。
13.一种用于治疗经受溶瘤病毒治疗的受试者的癌症的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求12所述的药物组合物。
14.一种用于增强受试者的溶瘤病毒治疗的药物组合物，所述组合物包含多肽，所述多肽包含结合靶细胞上的Fc结合蛋白的区域，但不包含结合Fcγ受体(FcγR)的区域。
15.一种增强受试者的溶瘤病毒治疗的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求14所述的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在用溶瘤病毒治疗剂治疗之前施用所述药物组合物。
17.一种减少接受抗癌治疗的受试者的炎症的方法，包括：
(a)施用治疗有效量的多肽，所述多肽包含结合Fc结合蛋白的区域但不包含结合Fcγ受体(FcγR)的区域；和
(b)施用包含单克隆抗体药物的抗癌治疗。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述单克隆抗体药物是利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、达雷木单抗、伊匹单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、阿仑单抗或派姆单抗。
19.根据权利要求17所述的方法，其中在用所述单克隆抗体药物治疗之前施用药物组合物。
20.根据权利要求17所述的方法，其中药物组合物包含免疫多肽，所述免疫多肽包含结合免疫效应细胞上的FcγR的结构域，所述免疫多肽是IgG抗体的Fc片段。
21.一种提高从PBMC或单核细胞产生树突细胞或巨噬细胞的效率的方法，包括在预涂覆有蛋白A或蛋白G的板中或用聚合的蛋白A或蛋白G培养PBMC或单核细胞。
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