CN117651562A - 多臂粘液瘤病毒 - Google Patents
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Abstract
在某些实施方案中，本文公开了重组粘液瘤病毒(MYXV)和编码重组溶瘤病毒基因组及其部分的核酸构建体。在一些实施方案中，核酸构建体包括粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分和由痘病毒P11晚期启动子驱动的转基因(例如，IL‑12)。将转基因插入到MYXV基因组中以减少或破坏MYXV基因组的M153基因的表达。
Description
交叉引用
本申请要求提交于2021年3月1日的美国临时专利申请号63/155,195的权益，其以引用方式全文并入本文。
技术领域
本文公开了重组溶瘤病毒，即粘液瘤病毒(MYXV)、可用于制备重组溶瘤病毒的核酸构建体，以及其使用方法。
背景技术
目前用于治疗各种类型癌症的治疗方法往往是通过毒害或杀伤癌性细胞来起作用，但对癌细胞有毒的治疗方法通常也往往对健康细胞有毒。此外，肿瘤的异质性是难以找到有效治疗癌症方法的主要原因之一。目前的主流疗法，诸如化学疗法和放射疗法，倾向于在狭窄的毒性治疗窗口内使用。由于肿瘤细胞的类型不同并且可以施用这些治疗方法的窗口有限，这些类型的疗法的适用性有限。
发明内容
在一些方面，本文公开了一种重组核酸，其包含：粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分和编码白细胞介素-12亚基β(IL-12β)的第一核酸；其中第一核酸插入到MYXV基因组中以减少或破坏MYXV基因组的M153基因的表达；并且其中IL-12β的表达由第一痘病毒P11晚期启动子驱动。
在一些实施方案中，IL-12β是人IL-12β。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码白细胞介素-12亚基α(IL-12α)的第二核酸。在一些实施方案中，IL-12α是人IL-12α。在一些实施方案中，第二核酸的5'末端偶联至第一核酸的3'末端。在一些实施方案中，第一核酸和第二核酸通过编码弹性蛋白接头的第三核酸偶联。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码核心蛋白聚糖的第四核酸。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达由第一sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，第四核酸的5'末端偶联至第二核酸的3'末端。在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码IL-12β的第一核酸；(c)编码弹性蛋白接头的第三核酸；(d)编码IL-12α的第二核酸；(e)第一sE/L启动子；以及(f)编码核心蛋白聚糖的第四核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码报告标签的第五核酸。在一些实施方案中，报告标签包含绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，报告标签的表达由第二sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码IL-12β的第一核酸；(c)编码弹性蛋白接头的第三核酸；(d)编码IL-12α的第二核酸；(e)第一sE/L启动子；(f)编码核心蛋白聚糖的第四核酸；(g)第二sE/L启动子；以及(h)编码报告标签的第五核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码肿瘤坏死因子α(TNF-α)的第六核酸。在一些实施方案中，TNF-α是人TNF-α。在一些实施方案中，TNF-α是可溶性多肽。在一些实施方案中，TNF-α的表达由第二痘病毒P11晚期启动子驱动。在一些实施方案中，第六核酸位于编码IL-12α的第二核酸与编码核心蛋白聚糖的第四核酸之间。在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码IL-12β的第一核酸；(c)编码弹性蛋白接头的第三核酸；(d)编码IL-12α的第二核酸；(e)第二痘病毒P11晚期启动子；(f)编码TNF-α的第六核酸；(g)第一sE/L启动子；(h)编码核心蛋白聚糖的第四核酸；(i)任选地，第二sE/L启动子；以及(j)任选地，编码报告标签的第五核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些方面，本文公开了一种重组核酸，其包含粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分，以及插入到MYXV基因组中以减少或破坏MYXV基因组的M153基因的表达的核酸表达盒，其中核酸表达盒从5'至3'包含：sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-hIL-12β-IRES-hIL-12α-sE/L启动子-GFP。
在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ IDNO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些方面，本文公开了一种基因工程化的MYXV，其具有增强的免疫调节或抗肿瘤活性，其中MYXV基因组中至少80％的编码M153蛋白的核酸被敲除，其中基因工程化的MYXV包含前述实施方案中任一项所述的重组核酸。
在一些实施方案中，与用其中IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，IL-12β的表达在由基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。在一些实施方案中，与由其中IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的外周血单核细胞(PBMC)相比，IL-12β的表达在由基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。在一些实施方案中，与由其中IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由基因工程化的MYXV感染的细胞中的IL-12β的表达在感染后四小时是降低的。
在一些方面，本文公开了一种基因工程化的MYXV，其包含编码细胞因子的核酸，其中细胞因子的表达由痘病毒p11晚期启动子驱动，其中MYXV被基因工程化以减弱M153的表达或活性。
在一些实施方案中，细胞因子包括IL-12β、IL-12α或其组合。在一些实施方案中，细胞因子包括TNF-α。在一些实施方案中，至少80％的编码M153的核酸在基因工程化的MYXV的基因组中是缺失的。在一些实施方案中，与由其中细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，细胞因子的表达在由基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。在一些实施方案中，与由其中细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的PBMC相比，细胞因子的表达在由基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。在一些实施方案中，与由其中细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由基因工程化的MYXV感染的细胞中的细胞因子的表达在感染后四小时是降低的。在一些实施方案中，MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，MYXV是基因工程化的洛桑(Lausanne)株MYXV。在一些实施方案中，痘病毒p11晚期启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，痘病毒p11晚期启动子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些方面，本文公开了一种哺乳动物细胞，其用如前述实施方案中任一项所述的重组核酸或基因工程化的MYXV离体处理。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是外周血单核细胞(PBMC)或骨髓(BM)细胞。
在一些方面，本文公开了一种组合物，其包含如前述实施方案中任一项所述的重组核酸、基因工程化的MYXV、或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，组合物被配制用于全身施用。在一些实施方案中，组合物被配制用于局部施用。
在一些方面，本文公开了一种增加有需要的对象的针对肿瘤的免疫应答的方法，其包括向对象施用如前述实施方案中任一项所述的组合物。
在一些实施方案中，对象患有或疑似患有肿瘤。在一些实施方案中，施用是全身施用。在一些实施方案中，施用是静脉内施用。在一些实施方案中，施用是局部施用。在一些实施方案中，施用是瘤内施用。在一些实施方案中，肿瘤包括实体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，施用改善对象的存活。在一些实施方案中，施用降低癌细胞活力，或激活癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，施用以有效增加对象的肿瘤中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，施用以将肿瘤的体积有效减小至少10％的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，施用以将肿瘤的生长有效减小至少10％的剂量和时间表进行。在一些实施方案中，对象存活比施用高十倍剂量的表达M153、缺乏重组核酸或其组合的相应的对照粘液瘤病毒的对象长至少10％的时间。
附图说明
本发明的某些实施方案的新型特征在随附权利要求书中具体阐述。通过参考对其中利用了本发明原理的例示性实施方案作出阐述的以下详细描述以及所述实施方案的附图，将更好地理解本发明的特征和优点，附图中：
图1A是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(HV11)的重组核酸的示意图。
图1B是示出重组核酸和包含重组核酸的重组粘液瘤病毒(HV11)的产生的示意图。
图2A是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(HV14)的重组核酸的示意图。
图2B是示出重组核酸和包含重组核酸的重组粘液瘤病毒(HV14)的产生的示意图。
图3A是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(HV12)的重组核酸的示意图。
图3B是示出重组核酸和包含重组核酸的粘液瘤病毒(HV12)的产生的示意图。
图4A是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(MV2)的重组核酸的示意图。
图4B是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(MV4)的重组核酸的示意图。
图4C是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(MV1)的重组核酸的示意图。
图4D是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(MV3)的重组核酸的示意图。
图4E是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(HV13)的重组核酸的示意图。
图4F是示出可以用于产生本文公开的重组粘液瘤病毒(MV5)的重组核酸的示意图。
图5A是示出由HV11、HV12、HV13或HV14感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图5B是示出由HV11、HV12、HV13或HV14感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图5C是示出由HV13或HV14感染的Vero细胞的TNF-α释放的图。
图6A是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的TNF-α释放的图。
图6B是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图6C是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图7A是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以时间应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图7B是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以时间应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图7C是示出由HV11、HV12、HV13或HV14以时间应答性方式感染的Vero细胞的TNF-α释放的图。
图8是示出通过报告细胞系测量的由HV11、HV12、HV13或HV14感染的Vero细胞的双功能IL-12的表达水平的图。
图9A是示出在通过静脉内(IV)或瘤内(IT)注射由HV11或HV12感染的免疫缺陷A549荷瘤小鼠的血清样品中检测到的IL-12的图。
图9B是示出在通过静脉内(IV)或瘤内(IT)注射由HV11或HV12感染的免疫缺陷A549荷瘤小鼠的肿瘤样品中检测到的IL-12的图。
图10A是示出由MV1、MV2、MV3或MV4以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的TNF-α释放的图。
图10B是示出由MV1、MV2、MV3或MV4以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图10C是示出由MV1、MV2、MV3或MV4以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图11A是示出由MV1、MV2、MV3或MV4以时间应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图11B是示出由MV1、MV2、MV3或MV4以时间应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图11C是示出由MV3或MV4以时间应答性方式感染的Vero细胞的TNF-α释放的图。
图12是示出通过报告细胞测定确定的由MV1、MV2、MV3或MV4感染的Vero细胞产生的双功能IL-12的水平的图。
图13A是示出EMT-6乳腺癌小鼠模型在用MV1或MV3治疗后的肿瘤体积变化的图。
图13B是示出EMT-6乳腺癌小鼠模型在用MV1或MV3治疗后的存活率图。
图13C是示出EMT-6小鼠乳腺癌在初次治疗后59天使用指定粘液瘤病毒再次攻击后的肿瘤体积变化的图。
图14A是示出B16-F10小鼠黑色素瘤模型在通过瘤内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的肿瘤体积变化的图。
图14B是B16-F10小鼠黑色素瘤模型在通过瘤内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的存活率图。
图14C是示出B16-F10小鼠黑色素瘤在通过静脉内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的肿瘤体积变化的图。
图14D是B16-F10小鼠黑色素瘤动物在通过静脉内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的存活率图。
图15A是示出B16-F10小鼠黑色素瘤在通过瘤内注射用MV1治疗后的肿瘤体积变化的图。
图15B是B16-F10小鼠黑色素瘤动物在通过瘤内注射用MV1治疗后的存活率图。
图15C是示出B16-F10小鼠黑色素瘤在通过静脉内注射用MV1治疗后的肿瘤体积变化的图。
图15D是B16-F10小鼠黑色素瘤动物在通过静脉内注射用MV1治疗后的存活率图。
图16A是示出B16-F10-Luc播散性黑色素瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的肿瘤体积变化的图。
图16B是B16-F10-Luc播散性黑色素瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的存活率图。
图17A是示出B16-F10-Luc播散性黑色素瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1或MV2治疗后的肿瘤体积变化的图。
图17B是B16-F10-Luc播散性黑色素瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1或MV2治疗后的存活率图。
图18A是K7M2-Luc播散性骨肉瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1或MV2治疗后的存活率图。
图18B是K7M2-Luc播散性骨肉瘤小鼠模型在通过静脉内注射用MV1、MV2、MV3或MV4治疗后的存活率图。
图19A是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图19B是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以剂量(MOI)应答性方式感染的B16-F10细胞的IL-12释放的图。
图19C是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以剂量(MOI)应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图19D是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以剂量(MOI)应答性方式感染的B16-F10细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图20A是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以时间应答性方式感染的Vero细胞的IL-12释放的图。
图20B是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以时间应答性方式感染的B16-F10细胞的IL-12释放的图。
图20C是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以时间应答性方式感染的Vero细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图20D是示出由MV1、MV2、MV5或HV11以时间应答性方式感染的B16-F10细胞的核心蛋白聚糖释放的图。
图21A是相对于用HV11感染的人实体肿瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图21B是相对于用HV12感染的人实体肿瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图21C是相对于用HV13感染的人实体肿瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图21D是相对于用HV14感染的人实体肿瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图22A是在感染后24小时相对于用HV11感染的人多发性骨髓瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图22B是在感染后72小时相对于用HV11感染的人多发性骨髓瘤细胞系的EC50对％最大生长抑制作图的图。
图23A是示出人实体肿瘤细胞系在用MYXV-GFP、HV11、HV12、HV13或HV14感染后24小时的核心蛋白聚糖产生的图。
图23B是示出人实体肿瘤细胞系在用MYXV-GFP、HV11、HV12、HV13或HV14感染后24小时的IL-12产生的图。
图23C是示出人实体肿瘤细胞系在用MYXV-GFP、HV13或HV14感染后24小时的TNF-α产生的图。
图24A是示出人实体肿瘤细胞系在用HV11感染后24小时的核心蛋白聚糖和IL-12的产生的图。
图24B是示出人实体肿瘤细胞系在用HV12感染后24小时的核心蛋白聚糖和IL-12的产生的图。
图24C是示出人实体肿瘤细胞系在用HV13感染后24小时的核心蛋白聚糖和IL-12的产生的图。
图24D是示出人实体肿瘤细胞系在用HV14感染后24小时的核心蛋白聚糖和IL-12的产生的图。
图24E是示出人实体肿瘤细胞系在用HV13感染后24小时的核心蛋白聚糖和TNF-α的产生的图。
图24F是示出人实体肿瘤细胞系在用HV14感染后24小时的核心蛋白聚糖和TNF-α的产生的图。
图25A是示出人多发性骨髓瘤细胞系在用MYXV-GFP或HV11感染后24小时的核心蛋白聚糖产生的图。
图25B是示出人多发性骨髓瘤细胞系在用MYXV-GFP或HV11感染后24小时的IL-12产生的图。
具体实施方式
本文描述了溶瘤病毒，特别是溶瘤痘病毒，诸如工程化的溶瘤粘液瘤病毒。粘液瘤病毒在本文中可以称为MYXV或vMyx。
一些实施方案涉及双重或三重转基因臂的溶瘤病毒诸如MYXV，以及它们用于治疗癌症诸如实体癌和/或转移性癌症的方法。一些实施方案包括表达以下各项的重组MYXV构建体：2种人转基因：可以放大抗肿瘤免疫应答的人IL-12(hIL-12)和阻断肿瘤床内的TGF-β信号传导的人核心蛋白聚糖(hDecorin)，或三种人转基因：改善转移至肺部或身体其他部位的癌症的治疗功效的人细胞因子(hTNF)、hIL-12和hDecorin。
在一些实施方案中，MYXV被基因工程化以使M153基因或蛋白失活、破坏所述M153基因或蛋白或减弱其表达，例如，被基因工程化以减弱M153基因或蛋白的活性或表达水平。当与未修饰的MYXV、含有完整的野生型M153基因的MYXV、或在另一个基因座处具有修饰的MYXV相比时，如本文所述对粘液瘤病毒的修饰出人意料地改善了MYXV的溶瘤活性。除了M153基因座处的修饰之外，MYXV还可以包括编码非病毒分子的一种或多种转基因，诸如TNF-α、IL-12和/或核心蛋白聚糖，以进一步增强MYXV的溶瘤活性、增加其抗肿瘤免疫应答，或减少其不良副作用。
一些实施方案涉及重组核酸构建体，诸如病毒双重转基因或三重转基因构建体，其编码转基因并且可以整合到MYXV基因组中，例如整合到M153基因座中。在一些实施方案中，MYXV的转基因和其他修饰改善癌症疗法功效。
定义
本文使用的章节标题仅用于组织目的并且不应解释为限制所描述的主题。
提供以下术语解释仅是出于描述特定实施方案和实例的目的，而不旨在为限制性的。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”还旨在包括复数形式，除非上下文另外清楚指出。
如本文所用，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时组合的不存在。
如本文所用，“一个或多个/一种或多种”或至少一个/种可以指一、二、三、四、五、六、七、八、九、十个/种或更多个/种，直到任何数量。
“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生期望效果的本公开内容的化合物或组合物的量，所述效果可以是治疗和/或有益效果。
“有需要的对象(subject in need thereof或a subject in need of)”是已知患有或疑似患有疾病或病状诸如癌症的对象。
如本文所用，术语“抑制”或“治疗”疾病是指抑制疾病或病状的完全发展或进展。“治疗”是指在疾病或病理状况已开始发展后改善其征象或症状的治疗性干预。就疾病或病理状况而言，术语“改善”是指治疗的任何可观察到或可检测的有益效果。有益效果可以例如通过例如与对照对象或对象队列相比或与治疗之前相比易感对象的疾病临床症状的发作延迟、疾病的一些或全部临床症状的严重程度降低、疾病的进展减慢(诸如转移)、对象的整体健康或康健改善来证明，或通过本领域众所周知的对特定疾病具有特异性的其他参数来证明。“预防性”治疗是向不表现出疾病体征或仅表现出早期体征的对象施用的治疗，其目的是降低发展病理或疾病进展例如转移性癌症的风险。
MYXV可感染先天抗病毒应答不足的细胞。如本文所用的“先天抗病毒应答不足”是指当暴露于病毒或被病毒侵入时，细胞不诱导、基本上不诱导抗病毒防御机制，或表现出降低的抗病毒防御机制，所述抗病毒防御机制可以包括病毒复制的抑制、干扰素的产生、干扰素应答通路的诱导以及细胞凋亡。该术语包括与正常细胞(例如非感染细胞或非癌细胞)相比，在暴露于病毒或被病毒感染后细胞(诸如癌细胞)具有降低或有缺陷的先天抗病毒应答。这包括对干扰素无反应的细胞和细胞凋亡应答或细胞凋亡通路的诱导降低或有缺陷的细胞。这种缺陷可能是由多种原因造成的，包括感染、遗传或表观遗传缺陷或环境胁迫。然而，应当理解，当缺陷是由预先存在的感染造成时，可排除MYXV的重复感染，并且技术人员可以容易地鉴定此类情况。技术人员无需过度实验即可容易地确定任何给定细胞类型是否先天抗病毒应答不足并因此容易被MYXV感染。因此，在某些实施方案中，MYXV能够感染先天抗病毒应答不足的细胞。在某些实施方案中，细胞对干扰素无反应。在具体实施方案中，细胞是哺乳动物癌细胞。在某些实施方案中，细胞是人的癌细胞，包括人实体肿瘤细胞。在某些实施方案中，先天抗病毒应答不足的细胞包括癌细胞。
工程化的粘液瘤病毒
在某些实施方案中，本文公开了粘液瘤病毒(MYXV)。MYXV可包含MYXV的野生型株或其可包含基因修饰的MYXV株。在一些实施方案中，MYXV包括洛桑株。在一些实施方案中，MYXV包括洛桑株或由其工程化得到，诸如ATCC VR-1829；GenBank:GCF_000843685.1，或GenBank登录号AF170726.2，公布于2019年7月11日。野生型洛桑株具有大小为161.8kb的基因组，基因组中在两个方向(主链和互补链)上有171种基因。在这171种基因中，有159种基因被发现具有预测开放阅读框(ORF)。根据转录方向，所有ORF均被指定了具有字母R或L的名称。
在一些情况下，MYXV包括在南美森林兔(Sylvilagus brasiliensis)中循环的南美MYXV株。在一些情况下，MYXV包括在粗尾棉尾兔(Sylvilagus bachmani)中循环的加利福尼亚MYXV株。在一些情况下，MYXV包括6918，一种减毒的西班牙野生株，其在基因M009L、M036L、M135R和M148R中包含修饰(例如，GenBank登录号EU552530，公布于2019年7月11日)。在一些情况下，MYXV包括6918VP60-T2(GenBank登录号EU552531，公布于2019年7月11日)。在一些情况下，MYXV包括标准实验室株(SLS)。在一些实施方案中，MYXV包含如本文所述的核酸构建体或MYXV基因组。
在一些情况下，MYXV不是在南美森林兔中循环的南美MYXV株，或不是其衍生物。在一些情况下，MYXV不是在粗尾棉尾兔中循环的加利福尼亚MYXV株，或不是其衍生物。在一些情况下，MYXV不是6918，一种减毒的西班牙野生株，其在基因M009L、M036L、M135R和M148R中包含修饰(例如，GenBank登录号EU552530，公布于2019年7月11日)，或不是其衍生物。在一些情况下，MYXV不是6918VP60-T2(GenBank登录号EU552531，公布于2019年7月11日)，或不是其衍生物。在一些情况下，MYXV不是标准实验室株(SLS)或其衍生物。在一些实施方案中，MYXV不是SG33株、CNCM I-1594株、图卢兹(Toulouse)1株或其衍生物。
在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M001基因。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M151基因。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M152基因。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M153基因。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M154基因。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M156基因。在一些实施方案中，MYXV包含M008.1基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M008基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M007基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M006基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M005基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M004.1基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M004基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M003.2基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M003.1基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含M002基因的两个完整或功能性的拷贝。在一些实施方案中，MYXV包含完整或功能性的M11L基因。
在一些情况下，本文公开的MYXV或工程化的MYXV的亲本株与Cameron等人,“Thecomplete DNA sequence of Myxoma Virus,”Virology 264:298-318(1999)(其此类公开内容通过引用并入)中公开的序列包含至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、诸如介于95％与98％之间、介于95％与99％之间、包括90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的核酸序列同一性。在一些情况下，MYXV包含Cameron等人,“The complete DNA sequence ofMyxoma Virus,”Virology 264:298-318(1999)中公开的序列。
可以例如通过使用常用于此目的的计算机程序(诸如全局或局部比对算法)比较两个序列来确定如本文所公开的两个序列之间的序列同一性程度。非限制性实例包括BLASTp、BLASTn、Clustal W、MAFFT、Clustal Omega、AlignMe、Praline、GAP、BESTFIT、Needle(EMBOSS)、Stretcher(EMBOSS)、GGEARCH2SEQ、Water(EMBOSS)、Matcher(EMBOSS)、LALIGN、SSEARCH2SEQ，或其他合适的方法或算法。Needleman和Wunsch全局比对算法可以用于在两个序列的整体长度上对其进行比对，从而使匹配数量最大化并使空位数量最小化。可以使用默认设置。
在一些实施方案中，MYXV被工程化以使病毒基因或蛋白失活或减弱所述病毒基因或蛋白的活性或表达水平。在一些实施方案中，病毒基因或蛋白是M153。在一些实施方案中，病毒基因或蛋白的失活或其活性或表达水平的减弱导致MYXV相对于野生型MYXV或相对于不具有病毒基因或蛋白的失活或其活性或表达水平的减弱的MYXV(例如包含野生型M153基因和/或表达野生型(例如，功能性)M153蛋白的MYXV)表现出增强的抗癌活性。在一些实施方案中，MYXV被工程化以使多于一种病毒基因或蛋白失活或减弱其活性或表达水平。
在一些实施方案中，MYXV包含编码非病毒分子例如编码MYXV的非天然蛋白质(诸如细胞因子或细胞外基质蛋白)的转基因的重组核酸。在一些实施方案中，MYXV包括转基因，诸如本文所述的转基因。在一些实施方案中，转基因编码肿瘤坏死因子(TNF，例如TNF-α)、白细胞介素-12(IL-12)或核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，MYXV包括两种、三种、四种、五种或更多种转基因。在一些实施方案中，将两种或更多种转基因敲入MYXV基因组中。在一些实施方案中，转基因破坏MYXV基因组中的基因，例如，转基因插入MYXV基因组中的该基因内或替代所述基因的部分或全部，从而破坏所述基因和/或其所编码的蛋白质的表达。这种破坏可以称为敲除(KO)。在一些实施方案中，两种或更多种转基因串联排列。转基因可以存在于本文公开的表达盒中。
MYXV可被修饰以产生增强MYXV的抗癌作用的任何非病毒分子(例如，被修饰以携带任何转基因)。此类非病毒分子可以参与触发细胞凋亡，或参与靶向被感染细胞以进行免疫破坏，诸如刺激对干扰素的应答(例如，修复对干扰素的应答缺乏)的非病毒分子，或导致刺激抗体应答的细胞表面标志物的表达，诸如病原体相关分子模式，例如细菌细胞表面抗原。MYXV还可以被修饰以产生参与关闭赘生性细胞或癌细胞的增殖和生长，从而防止细胞分裂的非病毒分子。在一些实施方案中，MYXV被修饰以产生治疗性非病毒分子，诸如参与化学治疗剂合成的分子，或者它可以被修饰以在待抑制或杀伤的细胞所来源的特定物种的细胞(例如人细胞)中具有增加的复制水平。
在一些实施方案中，MYXV包括编码或表达两种或三种单独的非病毒分子的重组构建体，所述非病毒分子例如人转基因(例如，人TNF、人核心蛋白聚糖和/或人IL-12)和/或非人哺乳动物转基因(例如，小鼠TNF、小鼠核心蛋白聚糖和/或小鼠IL-12)。在一些实施方案中，重组构建体还编码或表达一种或多种报告标签，例如荧光蛋白，诸如eGFP和dsRed。
在一些实施方案中，MYXV被基因工程化以减弱其M153基因和/或蛋白的活性或表达水平，例如，包含病毒M153基因的破坏(M153敲除、M153KO)。在一些实施方案中，减弱M153的活性或表达水平改善针对病毒感染的癌细胞的MHC依赖性抗肿瘤免疫应答，例如，改善针对病毒感染的癌细胞的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞应答。在一些实施方案中，MYXV是用于治疗癌症的溶瘤病毒。一些实施方案将M153KO骨架与本文公开的转基因的免疫增强特性相结合，以增强MYXV的溶瘤特性。
在一些实施方案中，MYXV编码TNF(例如，TNF-α)转基因、IL-12转基因、核心蛋白聚糖转基因，或其中的两种或更多种的任何组合。在一些实施方案中，MYXV包括TNF(例如，TNF-α)转基因、IL-12转基因和核心蛋白聚糖转基因。在一些实施方案中，MYXV包括TNF-α转基因和IL-12转基因。在一些实施方案中，MYXV包括TNF-α转基因和核心蛋白聚糖转基因。在一些实施方案中，MYXV包括IL-12转基因和核心蛋白聚糖转基因。
在一些实施方案中，在向对象施用表达TNF的MYXV后，TNF激活并启动抗肿瘤免疫系统的先天和适应性臂，并以旁观者(by-stander)旁分泌样方式促进癌细胞死亡。在一些实施方案中，IL-12放大所产生的抗癌先天和适应性免疫应答。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖中断TGF-β介导的局部免疫阻抑作用，从而增强TNF和IL-12的作用并促进抗癌免疫应答。在一些实施方案中，三种转基因的协同作用加上肿瘤微环境(TME)中MYXV的作用增加溶瘤MYXV载体的免疫治疗潜力。在一些实施方案中，将编码非病毒分子(hTNF、hIL-12和/或hDecorin)的人转基因添加至MYXV基因组改善MYXV在肿瘤微环境(TME)中触发强抗肿瘤免疫应答的能力。
在一些实施方案中，MYXV被修饰以增强检测病毒或被病毒感染的细胞的容易性。例如，MYXV可被基因修饰以表达标志物，诸如报告标签，其可以容易地通过相差显微镜、荧光显微镜或通过放射性成像检测。标志物可以是所表达的荧光蛋白或所表达的参与比色或放射性标记反应的酶。在一些实施方案中，标志物包括中断或抑制正在测试的细胞的特定功能的基因产物。
在一些实施方案中，工程化的MYXV包含荧光蛋白。例示性荧光蛋白包括蓝色/UV蛋白，诸如TagBFP、Azurite、Sirus或Sapphire；青色蛋白，诸如ECFP、cerulean或mTurquoise；绿色蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、Emerald、mUKG、mWasabi或Clover；黄色蛋白，诸如EYFP、citrine、venus或SYFP2；橙色蛋白，诸如单体Kusabira-Orange、mKO2或mOrange；红色蛋白，诸如dsRed、mRaspberrym mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、mApple或mRuby；光激活蛋白，诸如PA-GFP、PAmCherry1或PATagRFP；以及光开关蛋白，诸如Dropna。在一些实施方案中，MYXV包括多于一种荧光蛋白。在一些实施方案中，工程化的MYXV不编码荧光蛋白。
在一些实施方案中，MYXV包含编码核心蛋白聚糖、IL-12和任选的GFP的转基因，其中一种或多种转基因插入在M153基因座处(例如，使得M153被破坏或敲除)。在一些实施方案中，MYXV包含编码TNF-α、核心蛋白聚糖、IL-12和任选的GFP的转基因，其中一种或多种转基因插入在M153基因座处(例如，使得M153被破坏或敲除)。在一些实施方案中，将本文公开的包含TNF-α、核心蛋白聚糖、IL-12和/或GFP的重组核酸引入M153基因座中以产生本公开内容的MYXV(例如，使得M153被破坏或敲除)。
在一些实施方案中，MYXV包含在与兔细胞向性相关的一种或多种基因处或与其相邻的修饰。在一些情况下，与兔细胞向性相关的一种或多种基因包括M11L、M063、M135R、M136R、M-T2、M-T4、M-T5或M-T7。在一些情况下，一种或多种与兔细胞向性相关的基因包括M135R、M136R或其组合。
MYXV可使用本领域已知的标准技术来制备。例如，病毒可通过以下方式制备：用待使用的MYXV株感染培养的兔细胞、或永生化的允许性的人或灵长类动物细胞，从而允许感染的进行，使得病毒在培养的细胞中复制并且可以通过本领域已知的标准方法释放以破坏细胞表面并从而释放病毒颗粒以供收获。一旦收获，就可通过感染允许(例如兔)细胞的汇合细胞层(lawn)并进行蚀斑测定来确定病毒滴度。
M153修饰
MYXV M153基因产物是一种E3-泛素连接酶，其可参与各种不同的细胞受体和蛋白质的下调，例如，人细胞中MHC I类和CD4的降解。在一些实施方案中，本公开内容的MYXV具有减弱的M153蛋白活性和/或表达水平。在一些实施方案中，减弱的M153蛋白活性和/或表达水平可以增强免疫表位的呈递，例如，病毒和/或癌症免疫肽的MHC依赖性呈递。被感染的癌细胞的免疫表位的呈递增强可以引发更强的免疫应答，包括抗癌T细胞应答，诸如抗癌CD8+T细胞应答。在一些实施方案中，减弱的M153蛋白活性和/或表达水平增加通过MHC-I进行的从M153KO病毒感染的肿瘤细胞的直接抗原呈递，并且增强由MYXV介导的免疫激活。在一些实施方案中，减弱的M153蛋白活性和/或表达水平增加CD4表达或活性，从而增强T细胞活化和抗癌免疫应答。
在一些实施方案中，MYXV包含M153基因的修饰。在一些情况下，修饰是减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的突变(例如，损害由M153基因编码的蛋白质的功能)。
在一些情况下，突变是缺失，例如，减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的缺失。在一些实施方案中，突变是至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％的M153基因核酸序列的缺失。在一些实施方案中，突变是整个M153基因的缺失。在一些情况下，修饰是部分缺失，例如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、90％或约95％的M153基因核酸序列的缺失。在一些实施方案中，缺失是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少750个、至少500个、至少550个或至少600个核酸的缺失。在一些实施方案中，缺失破坏启动子(例如，在野生型MYXV中驱动M153表达的启动子)。在一些实施方案中，缺失将终止密码子引入M153基因序列中，例如，阻止全长M153转录物和/或蛋白质表达的提前终止密码子。
在一些情况下，突变是插入，例如，减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的插入。在一些实施方案中，插入包含编码非病毒分子的转基因，例如，编码TNF、核心蛋白聚糖、IL-12、报告标签或其组合的转基因。在一些实施方案中，插入包含两种转基因。在一些实施方案中，插入包含三种转基因。在一些实施方案中，插入包含四种转基因。在一些实施方案中，插入包含五种转基因。一种或多种转基因可以破坏(例如，中断)病毒M153基因并减弱M153转录物和/或蛋白的活性或表达水平。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码IL-12的转基因和编码核心蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因和编码IL-12的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因和编码核心蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含编码TNF的转基因、编码IL-12的转基因和编码核心蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，插入包含驱动一种或多种转基因的表达的一个或多个启动子。在一些实施方案中，插入包含一个或多个启动子，例如p11启动子和/或sE/L启动子。在一些实施方案中，插入破坏启动子(例如，在野生型MYXV中驱动M153表达的启动子)。在一些实施方案中，将M153基因破坏与转基因表达相结合改善了所得的重组病毒的抗肿瘤特性。
在一些实施方案中，插入是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1500个、或至少2000个核酸的插入。
在一些实施方案中，突变包括插入和缺失，例如，M153的一个或多个核苷酸的缺失和本文公开的一种或多种转基因的插入。
在一些实施方案中，插入将终止密码子引入M153基因序列中，例如，阻止全长M153转录物和/或蛋白质表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，插入改变M153基因序列的阅读框，从而破坏M153转录物和/或蛋白质的表达。
在一些情况下，突变是取代，例如，减弱由M153基因编码的蛋白质的活性或表达水平的取代。在一些实施方案中，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少7个、至少10个、至少20个、至少30个核酸被取代。在一些实施方案中，取代将终止密码子引入M153基因序列中，例如，阻止全长M153转录物和/或蛋白质表达的提前终止密码子。在一些实施方案中，取代破坏启动子(例如，在野生型MYXV中驱动M153表达的启动子)。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M153基因和/或蛋白的活性水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的相应MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的修饰或突变使M153基因和/或蛋白的表达水平相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的相应MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的相应MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％的M153蛋白活性水平。
在一些实施方案中，本文公开的MYXV具有相对于野生型MYXV或编码功能性野生型M153的相应MYXV减弱至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、或至少约99％的M153基因和/或蛋白表达水平。
在一些实施方案中，M153基因和/或蛋白的活性和/或表达水平的减弱使应答于被MYXV感染的细胞的T细胞活化(例如，对病毒或癌抗原具有特异性的CD4+或CD8+T细胞的活化)增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％，至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、或至少约100倍，例如，如通过测量T细胞增殖或活化标志物表达的流式细胞术测定所确定的。
TNF
在一些实施方案中，MYXV包含编码肿瘤坏死因子(TNF)蛋白的转基因。在一些实施方案中，TNF蛋白是TNF-α蛋白。在一些实施方案中，TNF-α蛋白是人TNF-α蛋白。在一些实施方案中，TNF-α蛋白是可溶的。在一些实施方案中，TNF-α蛋白是膜结合的或表面结合的。在一些实施方案中，TNF-α蛋白通过激活抗肿瘤免疫细胞或诱导癌细胞死亡来增强MYXV的抗癌活性。
TNF是一种细胞因子，它是先天炎症免疫应答的一部分。在一些实施方案中，TNF参与放大获得性(例如，适应性)免疫应答。TNF可以表达为细胞表面免疫配体，并且当在表达转化蛋白水解酶(诸如TACE)(其催化例如在骨髓谱系细胞中高水平表达的可溶性配体的切割和释放)的特定细胞中产生时，它也可以作为经切割的可溶性三聚体细胞因子分泌。一种TNF效应途径是通过TNF受体-1(TNFR1)通路诱导细胞死亡。在一些实施方案中，TNF对TNFR1通路的诱导导致细胞凋亡或坏死性凋亡。在一些实施方案中，TNF例如通过激活抗肿瘤CD8+T细胞和NK细胞来激活先天和适应性免疫应答。
尽管早期希望可溶性TNF的全身施用可作为有效的抗肿瘤药物在人体中发挥作用，但一些临床试验表明，分泌性细胞因子在用可溶性配体全身治疗的患者中造成严重的全身毒性。此外，全身TNF治疗并未像临床前报道的那样在患者体内诱导明显的抗肿瘤作用。由用本文公开的MYXV感染的细胞表达的TNF，例如TNF的分泌形式或细胞表面膜形式，可通过在肿瘤微环境中引发更大程度的旁观者细胞杀伤来改善局部癌细胞死亡，并且还刺激驻留在同一肿瘤床内的各种类别的免疫细胞的抗癌活性，同时最大程度地减少TNF介导的全身不良毒性作用。
在一些实施方案中，TNF-α由替代或邻近MYXV基因组的M135R基因的基因编码。在一些实施方案中，TNF-α基因插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，TNF-α基因插入在介于MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区域中。在一些实施方案中，TNF-α由插入在MYXV基因组的M152与M154基因之间的基因编码。在一些实施方案中，TNF-α由替代或破坏MYXV基因组的M153基因的基因编码。在一些实施方案中，TNF-α基因替代或破坏MYXV基因组的M153基因，例如作为本文公开的重组核酸的插入的一部分。
在一些实施方案中，TNF-α基因的表达由诸如痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子的启动子驱动。在一些实施方案中，TNF-α基因的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。
在一些实施方案中，TNF-α基因的表达由P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子)驱动。在一些实施方案中，晚期启动子p11的使用限制或实质上限制TNF-α在允许病毒的癌细胞中的表达，并减少TNF-α在病毒的顿挫感染中在其他细胞类型诸如外周血单核细胞中的表达。在一些实施方案中，晚期启动子p11的使用限制与来自其他启动子的TNF-α表达相关的毒性，这是由于非癌细胞中的表达减少，例如在感染后的早期时间点。TNF-α的表达水平可以通过本文公开的实施例确定。
在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含在细胞感染的期望阶段促进TNF-α表达的重组核酸。在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含重组核酸，其促进TNF-α在细胞感染的早期表达，例如，在感染后少于18小时、少于12小时、少于6小时、少于4小时或少于2小时内，被感染细胞的培养物上清液中可测量水平的TNF-α，或为至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，重组核酸促进包含重组核酸的MYXV在细胞感染的晚期表达TNF-α，例如，以在感染后约6小时、约12小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时，在被感染细胞(例如，癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞)的培养物上清液中产生可测量水平的TNF-α(例如，高于检测限)，或为至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约6小时在被感染细胞(例如，癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞)的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约12小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约18小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约24小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约32小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约48小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，直到感染后至少约6小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约12小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约18小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约24小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约32小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约48小时，TNF-α才以至少100、至少500、至少1000、至少5000或至少10000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，TNF-α的水平在所述时间点低于检测限。被感染细胞可以是癌细胞，例如，实体肿瘤细胞、血癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、黑色素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、NCI-N87(胃癌)、SK-MEL-1(黑色素瘤)、COLO205(结肠癌)、LoVo(结直肠癌)、HCC1806(棘层松解性鳞状细胞癌/乳腺癌)、HCC1599(乳腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、SW620(结直肠癌)、HEP3B(肝细胞癌)、MKN-45(转移性胃腺癌)、SJSA-1(骨肉瘤)、HUH-7(肝细胞癌)、A673(尤文肉瘤)、MDA-MB-435(转移性黑色素瘤)、H1975(肺腺癌/非小细胞肺癌)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、HT-29(结直肠腺癌)、A204(横纹肌肉瘤)、A549(肺腺癌)、DLD-1(结直肠腺癌)、A375(黑色素瘤)、MDA-MB-231(转移性乳腺腺癌)、SK-MES-1(肺鳞状细胞癌)、H358(细支气管肺泡癌/非小细胞肺癌)、HEP-G2(肝母细胞瘤/肝细胞癌)、MDA-MB-157(转移性乳腺癌)、KMS-34(r)、LP-1、RMPI-8226、L363、NCI-H929、MM1.s、U266、KMS-34或ANBL-6细胞。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后3小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后6小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后12小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后18小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后24小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后36小时引发由非癌细胞(例如，PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000或少于10000pg/mL的TNF-α。在一些实施方案中，TNF-α的水平在所述时间点低于检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。在一些实施方案中，所引发的TNF-α的水平低于检测限。
在一些实施方案中，例如当在感染后6小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，例如当在感染后12小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，例如当在感染后18小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，例如当在感染后24小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，例如当在感染后36小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，例如当在感染后48小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比暴露于相同病毒或用相同病毒感染的本文公开的癌细胞的群体所产生的TNF-α水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，TNF-α的表达低于非癌细胞(例如，PBMC)的检测限并且高于癌细胞的检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后6小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后12小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后18小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后24小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后36小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后48小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的TNF-α水平。在一些实施方案中，在p11启动子的调节控制下产生的TNF-α水平在所述时间点低于检测限，并且如果由sE/L启动子驱动则高于检测限。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后6小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后12小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后18小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后24小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后36小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达TNF-α的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后48小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达TNF-α的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的TNF-α水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些情况下，TNF蛋白与2019年7月3日公布的UniProtKB-P01375(条目版本247)中所示的序列包含至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白与2019年7月3日公布的UniProtKB-P01375(条目版本247)中所示的序列包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白与2019年7月3日公布的UniProtKB-P01375(条目版本247)中所示的序列包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白包含2019年7月3日公布的UniProtKB-P01375(条目版本247)中所示的序列。
在一些情况下，TNF蛋白与UniProtKB-P01375的残基77-233包含至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白与UniProtKB-P01375的残基77-233包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，TNF蛋白与UniProtKB-P01375的残基77-233包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，TNF蛋白包含UniProtKB-P01375的残基77-233。
在一些情况下，TNF蛋白由与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:41包含至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基因编码。在一些情况下，TNF蛋白由与SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:41包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的基因编码。在一些情况下，TNF蛋白由与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:41包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性的基因编码。在一些实施方案中，TNF蛋白由包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:41、基本上由其组成、或由其组成的基因编码。在一些实施方案中，TNF由包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:41的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码TNF的基因包含与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:41的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列。
在一些情况下，由本公开内容的MYXV或重组核酸编码的TNF蛋白与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:35的残基77-233、或SEQ ID NO:43包含至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，TNF蛋白与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:35的残基77-233、或SEQ ID NO:43包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，TNF蛋白与SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:35的残基77-233、或SEQ ID NO:43包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，TNF蛋白包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:35的残基77-233、或SEQ ID NO:43、基本上由其组成、或由其组成。
在一些实施方案中，MYXV不编码肿瘤坏死因子(TNF)蛋白。
IL-12
在一些实施方案中，MYXV包含(例如，编码)非病毒分子，例如，包含编码白细胞介素-12(IL-12)蛋白的一种或多种转基因。在一些实施方案中，IL-12蛋白是人IL-12蛋白。在一些实施方案中，IL-12蛋白是可溶的。在一些实施方案中，IL-12蛋白是膜结合的或表面结合的。在一些实施方案中，IL-12蛋白通过促进免疫细胞分化或引发免疫细胞的细胞毒性进一步增强MYXV的抗癌活性。
IL-12是一种细胞因子。在一些实施方案中，IL-12促进1型辅助T(Th1)分化，并增强自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒性。在一些实施方案中，该IL-12的作用在先天免疫和适应性免疫的要素之间产生改善的互连，以促进抗癌免疫应答。在一些实施方案中，由于这种桥接先天免疫和适应性免疫的作用，IL-12增强了MYXV的抗肿瘤作用。在一些实施方案中，IL-12有效刺激IFN-γ(一种协调抗癌防御机制的细胞因子)的产生，从而增强MYXV的抗肿瘤作用。
由于毒性事件、全身施用IL-12的短暂性和肿瘤诱导的免疫阻抑，全身递送重组IL-12细胞因子疗法的临床试验尚未在癌症患者中引起令人满意的结果。然而，在肿瘤微环境(TME)内局部表达IL-12的病毒可导致有效的抗肿瘤功效，例如，通过由适当的启动子驱动的IL-12表达。在一些实施方案中，来自被限制于肿瘤床的溶瘤病毒的IL-12表达使得转基因在TME内局部表达，减少了与该细胞因子的全身递送相关的毒性作用。因此，在一些实施方案中，MYXV对IL-12的两个亚基的共表达改善了由带臂MYXV诱导的针对一种或多种类型的癌症的抗肿瘤免疫。
在一些实施方案中，IL-12包含IL-12α(p35)亚基。在一些实施方案中，IL-12α亚基由IL-12α基因编码。在一些实施方案中，IL-12α基因是人IL-12α基因。在一些实施方案中，IL-12α基因由IRES驱动。在一些实施方案中，IL-12α基因由诸如sE/L启动子的启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12α基因的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子、牛痘病毒晚期启动子P11)的启动子驱动。在一些实施方案中，晚期启动子P11的使用限制或实质上限制IL-12α在允许病毒的癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞中的表达，并减少IL-12α在病毒的顿挫感染中在其他细胞类型诸如外周血单核细胞中的表达。在一些实施方案中，晚期启动子P11的使用限制或降低与来自其他启动子(例如，早期启动子或sE/L启动子)的IL-12α表达相关的毒性。
在一些实施方案中，IL-12α基因位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间，例如在具有M153的缺失或破坏的MYXV中。在一些实施方案中，IL-12α基因替代或破坏M153基因或其部分。在一些实施方案中，IL-12α基因插入在介于MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区域中。
在一些实施方案中，IL-12包含IL-12β(p40)亚基。在一些实施方案中，IL-12β亚基由IL-12β基因编码。在一些实施方案中，IL-12β基因是人IL-12β基因。在一些实施方案中，IL-12β基因的表达由IRES驱动。在一些实施方案中，IL-12β基因的表达由诸如sE/L启动子的启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12β基因的表达由P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子、牛痘病毒晚期启动子P11)驱动。在一些实施方案中，晚期启动子P11的使用限制或实质上限制IL-12β在允许病毒的癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞中的表达，并减少IL-12β在病毒的顿挫感染中在其他细胞类型诸如外周血单核细胞中的表达。在一些实施方案中，晚期启动子p11的使用限制或降低与来自其他启动子的IL-12β表达相关的毒性。
在一些实施方案中，IL-12β基因位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间，例如在具有M153的缺失或破坏的MYXV中。在一些实施方案中，IL-12β基因替代或破坏MYXV M153基因。在一些实施方案中，IL-12β基因插入在介于MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区域中。
在一些实施方案中，IL-12包含IL-12α亚基和IL-12β亚基。在一些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基共价连接。在一些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基非共价连接。在一些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基表达为一种转录物。在一些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基表达为不同的转录物，例如由单独的启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12α亚基和IL-12β亚基表达为一种多肽，例如，具有连结两个亚基的肽接头。接头序列的长度可以是例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸残基。接头的长度可以是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸残基。接头的长度可以是至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多15个、至多20个、至多25个、至多30个、至多40个或至多50个氨基酸残基。柔性接头可以具有包含甘氨酸和丝氨酸残基链段的序列。甘氨酸和丝氨酸残基的小尺寸提供了灵活性，并允许所连接的功能性结构域的移动性。丝氨酸或苏氨酸的并入可以通过与水分子形成氢键，从而减少接头与蛋白质部分之间的不利相互作用来维持接头在水性溶液中的稳定性。柔性接头还可以包含另外的氨基酸(诸如苏氨酸和丙氨酸)以维持灵活性，以及极性氨基酸诸如赖氨酸和谷氨酰胺以改善溶解度。刚性接头可以具有例如α螺旋结构。α-螺旋刚性接头可以充当蛋白质结构域之间的间隔子。接头可以包含SEQ ID NO:31或51-60的任何序列或其重复序列。SEQ ID NO:51-56提供了柔性接头序列的实例。SEQ ID NO:57-60提供了刚性接头序列的实例。接头可以是弹性蛋白或弹性蛋白样接头，例如，SEQ ID NO:31(由例如SEQ IDNO:6编码)中提供的接头，或相对于SEQ ID NO:31具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失或取代的接头。接头可以是自切割接头，例如2A肽接头，例如以促进产生适当比例的IL-12亚基。
在一些实施方案中，MYXV表达相对低水平的IL-12。可以例如通过在编码IL-12亚基的序列之间使用IRES序列来实现相对较低的IL-12表达。在一些实施方案中，MYXV表达相对高水平的IL-12。例如，通过使用在单一多肽中连结IL-12的亚基的合适的接头，例如弹性蛋白接头，诸如SEQ ID NO:31的接头，可以实现相对较高的IL-12表达。
在一些实施方案中，IL-12表达水平可以通过本文公开的实施例确定，例如实施例2的测定。例如，可以用本公开内容的MYXV以MOI 1感染Vero细胞，可以在感染后24小时收获上清液，并且可以通过ELISA测量IL-12的量。在一些实施方案中，低水平的IL-12表达小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或小于5ng/mL的IL-12，如通过实施例2的ELISA测定所确定的。在一些实施方案中，高水平的IL-12表达大于20、大于30、大于40、大于50、大于60、大于70、大于80、大于90、大于100、大于150、大于200、大于250、大于300、大于400、或大于500ng/mL的IL-12，如通过实施例2的测定所确定的。在一些实施方案中，高水平的IL-12表达大于150ng/mL的IL-12，并且低水平的IL-12表达小于150ng/mL的IL-12。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含在细胞感染的期望阶段促进IL-12表达的重组核酸。在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含重组核酸，其促进IL-12在细胞感染的早期表达，例如，以在感染后少于18小时、少于12小时、少于6小时、少于4小时或少于2小时内，在被感染细胞的培养物上清液中产生可测量水平的IL-12(例如，高于检测限)，或为至少100、至少500、至少1000、至少5000、或10000pg/mL的水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，重组核酸促进包含重组核酸的MYXV在细胞感染后期表达IL-12，例如，以在感染后约6小时、约12小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时，在被感染细胞(例如，癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞)的培养物上清液中产生可测量水平的IL-12(例如，高于检测限)，或为至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约6小时在被感染细胞(例如，癌细胞或先天抗病毒应答不足的细胞)的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约12小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约18小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约24小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约32小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，重组核酸促进在感染后约48小时在被感染细胞的培养物上清液中表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的IL-12。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，直到感染后至少约6小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约12小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约18小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约24小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约32小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，直到感染后至少约48小时，IL-12才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。在一些实施方案中，IL-12在所述时间点低于检测限。被感染细胞可以是癌细胞，例如，实体肿瘤细胞、血癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、黑色素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、NCI-N87(胃癌)、SK-MEL-1(黑色素瘤)、COLO205(结肠癌)、LoVo(结直肠癌)、HCC1806(棘层松解性鳞状细胞癌/乳腺癌)、HCC1599(乳腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、SW620(结直肠癌)、HEP3B(肝细胞癌)、MKN-45(转移性胃腺癌)、SJSA-1(骨肉瘤)、HUH-7(肝细胞癌)、A673(尤文肉瘤)、MDA-MB-435(转移性黑色素瘤)、H1975(肺腺癌/非小细胞肺癌)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、HT-29(结直肠腺癌)、A204(横纹肌肉瘤)、A549(肺腺癌)、DLD-1(结直肠腺癌)、A375(黑色素瘤)、MDA-MB-231(转移性乳腺腺癌)、SK-MES-1(肺鳞状细胞癌)、H358(细支气管肺泡癌/非小细胞肺癌)、HEP-G2(肝母细胞瘤/肝细胞癌)、MDA-MB-157(转移性乳腺癌)、KMS-34(r)、LP-1、RMPI-8226、L363、NCI-H929、MM1.s、U266、KMS-34或ANBL-6细胞。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后6小时引发由细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后12小时引发由细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后18小时引发由细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后24小时引发由细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后36小时引发由细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的IL-12。在一些实施方案中，IL-12低于检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，例如当在感染后6小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，例如当在感染后12小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，例如当在感染后18小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，例如当在感染后24小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，例如当在感染后36小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，例如当在感染后48小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比已用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的IL-12水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，非癌细胞(例如，PBMC)产生的IL-12水平低于检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后6小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后12小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后18小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后24小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后36小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后48小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的IL-12水平。在一些实施方案中，在p11启动子的调节控制下产生的IL-12的水平在所述时间点低于检测限，并且如果由sE/L启动子驱动则高于检测限。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后6小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后12小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后18小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后24小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后36小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。在一些实施方案中，在用在p11启动子的调节控制下表达IL-12的MYXV感染细胞群体(例如，本文公开的非癌细胞、PBMC或癌细胞的群体)后，被感染细胞的群体在感染后48小时表达比用在sE/L启动子的调节控制下表达IL-12的相应MYXV感染的细胞群体高至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、高到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍的IL-12水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，IL-12亚基中的一个或两者可以是截短的。具有截短亚基的IL-12的实例提供于SEQ ID NO:36中，其包含小鼠IL-12β(SEQ ID NO:37)、弹性蛋白接头(SEQ ID NO:31)和截短的小鼠IL-12α(SEQ ID NO:38)。
在一些情况下，IL-12α亚基包含与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:29的残基35-253、SEQ ID NO:29的残基57-253、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、或SEQ ID NO:50具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，IL-12α亚基包含与SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:29的残基35-253、SEQ ID NO:29的残基57-253、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、或SEQ ID NO:50具有介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，IL-12α亚基与SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:29的残基35-253、SEQ ID NO:29的残基57-253、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、或SEQ ID NO:50包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，IL-12α亚基包含SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:29的残基35-253、SEQ ID NO:29的残基57-253、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、或SEQ ID NO:50、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基23-328、或SEQ ID NO:37具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，IL-12β亚基包含与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基23-328、或SEQ ID NO:37具有介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，IL-12β亚基与SEQ ID NO:28、SEQID NO:28的残基23-328、或SEQ ID NO:37包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，IL-12β亚基包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:28的残基23-328、或SEQ ID NO:37、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，IL-12与SEQ ID NO:34包含至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些情况下，IL-12与SEQ ID NO:34包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，IL-12与SEQ ID NO:34包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，IL-12包含SEQ ID NO:34、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，IL-12α亚基由与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12α亚基由与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12α亚基由与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性的基因编码。在一些实施方案中，IL-12α亚基由包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5、基本上由其组成或由其组成的基因编码。在一些实施方案中，IL-12α亚基由包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码IL-12α亚基的基因包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列。
在一些情况下，IL-12β亚基由与SEQ ID NO:3包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12β亚基由与SEQ ID NO:3包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12β亚基由与SEQ ID NO:3包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性的基因编码。在一些实施方案中，IL-12β亚基由包含SEQ ID NO:3、基本上由其组成、或由其组成的基因编码。在一些实施方案中，IL-12β亚基由包含SEQ ID NO:3的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码IL-12β亚基的基因包含与SEQ ID NO:3的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列。
在一些情况下，IL-12由与SEQ ID NO:9包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12由与SEQ ID NO:9包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的基因编码。在一些情况下，IL-12由与SEQ ID NO:9包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列同一性的基因编码。在一些实施方案中，IL-12由包含SEQ ID NO:3、基本上由其组成、或由其组成的基因编码。在一些实施方案中，IL-12由包含SEQ ID NO:9的序列的基因编码。在一些实施方案中，编码IL-12的基因包含与SEQ ID NO:9的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列。
核心蛋白聚糖
在一些实施方案中，MYXV包含编码核心蛋白聚糖的转基因。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白是人核心蛋白聚糖蛋白。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白是可溶的。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白是膜结合的或表面结合的。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白通过阻断或减少TGF-β信号传导来增强MYXV的抗癌活性。
核心蛋白聚糖是细胞外基质蛋白聚糖家族的成员，其存在于基质组织和上皮细胞内并在其中发挥作用。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖通过直接或间接靶向参与细胞生长、存活、转移和/或血管生成的信号传导分子来影响不同类型癌症的生物学。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖阻断TGF-β诱导的信号传导。在一些实施方案中，TGF-β是促进一些肿瘤微环境(TME)中的免疫阻抑的细胞因子。在一些情况下，TGF-β将效应T细胞(其否则可识别并攻击癌细胞)转化为调节(阻抑)T细胞，其相反地关闭或减少先天炎症反应以及识别和消除癌细胞所需的获得性免疫通路。在多种类型的癌症中，部分TGF-β信号传导通路发生突变，并且该细胞因子不再控制至少一些细胞靶标。这些癌细胞可增殖并增加其内源性TGF-β的产生，所述TGF-β可作用于周围的基质细胞、免疫细胞、内皮和平滑肌，从而造成癌组织内的局部免疫阻抑和肿瘤床血管生成，这使得癌症甚至更具侵袭性。因此，在一些实施方案中，表达核心蛋白聚糖的溶瘤MYXV载体直接阻断TME内的TGF-β并从而诱导比不表达核心蛋白聚糖的MYXV更强的抗肿瘤免疫应答。
此外，核心蛋白聚糖可以抑制肿瘤细胞生长和增殖。将核心蛋白聚糖病毒递送到各种实体肿瘤中可直接对抗肿瘤发生。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖用作受到TGF-β的局部过表达的保护的至少一些类型的癌症的抗癌靶标。
在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白由核心蛋白聚糖基因编码。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因是人核心蛋白聚糖基因。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因由IRES驱动。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因由诸如sE/L启动子的启动子驱动，例如以用于在感染周期的多个阶段中表达。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子、牛痘病毒晚期启动子P11)的启动子驱动。在一些实施方案中，晚期启动子P11的使用限制或实质上限制核心蛋白聚糖在允许病毒的癌细胞中的表达，并减少核心蛋白聚糖在病毒的顿挫感染中在其他细胞类型诸如外周血单核细胞中的表达。在一些实施方案中，晚期启动子P11的使用限制与来自其他启动子的核心蛋白聚糖表达相关的毒性。
在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含在细胞感染的期望阶段促进核心蛋白聚糖表达的重组核酸。在一些实施方案中，本公开内容的MYXV包含重组核酸，其促进核心蛋白聚糖在细胞感染的早期表达，例如，以在感染后少于18小时、少于12小时、少于6小时、少于4小时或少于2小时内，在被感染细胞的培养物上清液中产生可测量水平的核心蛋白聚糖，或为至少10、至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，重组核酸促进包含重组核酸的MYXV在细胞感染后期表达核心蛋白聚糖，例如，以在感染后约6小时、约12小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时，在被感染细胞(例如，癌细胞)的培养物上清液中产生可测量水平的核心蛋白聚糖(例如，高于检测限)，或为至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，直到感染后至少约6、至少约12、至少约18、至少约24、至少约26、或至少约48小时，核心蛋白聚糖才以至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的水平表达。被感染细胞可以是癌细胞，例如实体肿瘤细胞、血癌细胞、肺癌细胞、结直肠癌细胞、黑色素瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、或本文公开的另一细胞类型。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒引发细胞(例如，癌细胞、非癌细胞、PBMC)在感染后6小时表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒引发细胞(例如，癌细胞、非癌细胞、PBMC)在感染后12小时表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒引发细胞(例如，癌细胞、非癌细胞、PBMC)在感染后18小时表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒引发细胞(例如，癌细胞、非癌细胞、PBMC)在感染后24小时表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒引发细胞(例如，癌细胞、非癌细胞、PBMC)在感染后36小时表达至少100、至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少50,000、至少100,000、至少500,000、或至少1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。细胞可以每个重复大约1-1.5x 105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后6小时引发细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后12小时引发细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后18小时引发细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后24小时引发细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，本文公开的粘液瘤病毒在感染后36小时引发细胞(例如，非癌细胞、PBMC)表达少于100、少于500、少于1000、少于5000、少于10,000、少于50,000、少于100,000、少于500,000、或少于1,000,000pg/mL的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的水平在所述时间点低于检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，例如当在感染后6小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，例如当在感染后12小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，例如当在感染后18小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，例如当在感染后24小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，例如当在感染后36小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，例如当在感染后48小时评价时，本文公开的粘液瘤病毒引发由非癌细胞(例如，PBMC)的群体产生比用相同病毒感染或暴露于相同病毒的本文公开的癌细胞的群体所产生的核心蛋白聚糖水平低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/50、至少约1/100、至少约1/1000、或至少约1/5000的核心蛋白聚糖水平。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的产生水平低于非癌细胞(例如，PBMC)的检测限并且高于癌细胞的检测限。可以通过用MYXV处理来以感染复数1感染细胞。细胞可以每个重复大约1-1.5x105个细胞铺板和/或在大约70％汇合度或至少70％汇合度下被感染。
在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间，例如在具有M153的缺失或破坏的MYXV中。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因替代或破坏M153基因。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖基因插入在介于MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间的基因间区域中。
在一些实施方案中，核心蛋白聚糖由包含SEQ ID NO:7的序列、基本上由其组成、或由其组成的基因编码。在一些实施方案中，编码核心蛋白聚糖的基因包含与SEQ ID NO:7的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列。在一些情况下，核心蛋白聚糖由与SEQ ID NO:7包含至少85、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的基因编码。在一些情况下，核心蛋白聚糖由与SEQ ID NO:7包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的基因编码。在一些情况下，核心蛋白聚糖由与SEQ ID NO:7包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列同一性的基因编码。
在一些情况下，核心蛋白聚糖蛋白与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32的残基31-359、或者SEQ ID NO:40或44-47中的任一个包含至少85、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性。在一些情况下，核心蛋白聚糖蛋白与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32的残基31-359、或者SEQ IDNO:40或44-47中的任一个包含介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性。在一些情况下，核心蛋白聚糖蛋白与SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32的残基31-359、或者SEQ ID NO:40或44-47中的任一个包含约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％的序列同一性。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖蛋白包含残基SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32的残基31-359、或者SEQ ID NO:40或44-47中的任一个。
重组核酸
在某些实施方案中，本文公开了重组核酸。一些实施方案涉及一种包含MYXV基因组的至少一部分的重组核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含DNA。在一些实施方案中，MYXV基因组或MYXV基因组的部分被修饰以减少M153基因的表达。在一些实施方案中，M153基因被修饰以缺失或敲除MYXV基因组中的M153基因的至少一部分。
在一些实施方案中，重组核酸被工程化以向M153基因中引入突变。突变可以包括例如插入、缺失、变位(substation)或其组合。在一些实施方案中，重组核酸包含基因敲入，其中M153基因被破坏。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码非病毒分子的核酸。在一些实施方案中，重组核酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种核酸，其各自编码非病毒分子或其组分，例如，编码蛋白质的转基因。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码肿瘤坏死因子α(TNF-α)的核酸。在一些实施方案中，TNF-α是人TNF-α。在一些实施方案中，编码TNF-α的核酸替代或邻近MYXV基因组的M135R基因。在一些实施方案中，编码TNF-α的核酸插入在MYXV基因组的M135R基因与M136R基因之间。在一些实施方案中，TNF-α的表达由痘病毒合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动。在一些实施方案中，TNF-α的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子)的启动子驱动。在一些实施方案中，编码TNF-α的核酸破坏、替代或邻近MYXV基因组的M153基因，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码白细胞介素-12亚基α(IL-12α)的核酸。在一些实施方案中，IL-12α是人IL-12α。在一些实施方案中，IL-12α的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在一些实施方案中，IL-12α的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12α的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子)的启动子驱动。在一些实施方案中，编码IL-12α的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码白细胞介素-12亚基β(IL-12β)的核酸。在一些实施方案中，IL-12β是人IL-12β基因。在一些实施方案中，IL-12β的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12β的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子)的启动子驱动。在一些实施方案中，IL-12β的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在一些实施方案中，编码IL-12β的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。在一些实施方案中，编码IL-12β的核酸和编码IL-12α的核酸均破坏MYXV基因组的M153基因的表达，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码核心蛋白聚糖的核酸。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达由诸如P11启动子(例如，痘病毒P11晚期启动子)的启动子驱动。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达由内部核糖体进入位点(IRES)驱动。在一些实施方案中，重组核酸包含编码核心蛋白聚糖的核酸，其破坏MYXV基因组的M153基因的表达，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码报告标签例如荧光蛋白的核酸。在一些实施方案中，报告标签包含绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，报告标签的表达由sE/L启动子驱动。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码第二报告标签的核酸。在一些实施方案中，第二报告标签包含红色荧光蛋白(RFP)，例如dsRed。在一些实施方案中，第二报告标签的表达由痘病毒P11晚期启动子驱动。在一些实施方案中，编码第二报告标签的核酸破坏MYXV基因组的M153基因的表达，和/或位于MYXV基因组中的M152与M154基因之间。
在一些实施方案中，使用p11启动子驱动本文公开的重组核酸中的第一转基因(例如，IL-12)的表达导致令人惊讶且意想不到的效果，例如，第二转基因(例如，核心蛋白聚糖)独立于驱动第二转基因表达的启动子的改变且有益的产生概况。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至包含IL-12β亚基、接头(例如，弹性蛋白接头或本公开内容的另一接头)和IL-12α亚基的IL-12转基因的p11启动子，(ii)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，以及任选地(iii)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图1A和SEQ ID NO:10中。另一非限制性实例提供于图4F中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(ii)或(iii)的3'末端的3'重组臂，例如，如SEQ IDNO:11中所提供。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至包含IL-12β亚基、接头(例如，弹性蛋白接头或本公开内容的另一接头)和IL-12α亚基的IL-12转基因的p11启动子，(ii)可操作地连接至TNF-α转基因的p11启动子，(iii)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，以及任选地(iv)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图2A和SEQ ID NO:20中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(iii)或(iv)的3'末端的3'重组臂，例如，如SEQ ID NO:21中所提供。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，(ii)可操作地连接至包含IL-12β亚基、IRES和IL-12α亚基的IL-12转基因的sE/L启动子，以及任选地(iii)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图3A和SEQ ID NO:25中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(ii)或(iii)的3'末端的3'重组臂，例如，如SEQ ID NO:26中所提供。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至包含IL-12β亚基、IRES和IL-12α亚基的IL-12转基因的p11启动子，(ii)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，以及任选地(iii)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图4A中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(ii)或(iii)的3'末端的3'重组臂。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至包含IL-12β亚基、IRES和IL-12α亚基的IL-12转基因的p11启动子，(ii)可操作地连接至TNF-α转基因的p11启动子，(iii)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，以及任选地(iv)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图4B中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(iii)或(iv)的3'末端的3'重组臂。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至核心蛋白聚糖转基因的sE/L启动子，(ii)可操作地连接至包含IL-12β亚基、接头(诸如弹性蛋白接头或本公开内容的另一接头)和IL-12α亚基的IL-12转基因的sE/L启动子，以及任选地(iii)可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，dsRed)的sE/L或p11启动子。此类重组核酸的非限制性实例提供于图4C中。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(ii)或(iii)的3'末端的3'重组臂。
在一些实施方案中，重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(i)可操作地连接至TNF-α转基因的sE/L启动子，以及(ii)任选地，可操作地连接至报告蛋白转基因(例如，GFP)的sE/L启动子。重组核酸可以任选地包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂，以靶向整合到粘液瘤病毒基因组中和/或使粘液瘤病毒基因组的一部分缺失，例如，还包含位于(i)的5'末端的5'重组臂，并且还包含位于(i)或(i)的3'末端的3'重组臂(例如，M135与M136之间的基因间区域，如图4D和图4E中所示)。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:10、11、20、21、25、26、63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQID NO:63的核苷酸1-3534中的任一个具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:10、11、20、21、25、26、63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534中的任一个具有介于95％与98％之间、或介于95％与99％之间的序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:10、11、20、21、25、26、63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534中的任一个具有约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:10、11、20、21、25或26的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含与SEQ ID NO:10、11、20、21、25、26、63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534中的任一个具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％、或由上述百分比中的任两者限定的百分比范围的同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:10具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:10的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:11具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:11的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:20具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:20的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:21具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:21的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:25具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:25的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:26具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:26的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:63具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:63的序列、基本上由其组成、或由其组成。
在一些情况下，重组核酸包含与SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，重组核酸包含为SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534的序列、基本上由其组成、或由其组成。
重组核酸可以包含与粘液瘤病毒基因组的区域同源的重组臂(例如，一个或两个重组臂)，以例如通过同源重组靶向整合和/或缺失粘液瘤病毒基因组的一部分。在一些实施方案中，重组核酸包含5'重组臂。在一些实施方案中，重组核酸包含3'重组臂。在一些实施方案中，重组核酸包含5'重组臂和3'重组臂。在重组核酸整合后，重组臂核苷酸序列可以保持存在于MYXV的基因组中。
5'重组臂可以包含与SEQ ID NO:65具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。5'重组臂可以包含与SEQ IDNO:65的至少200个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。5'重组臂可以包含与SEQ ID NO:65的至少300个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。5'重组臂可以包含与SEQ ID NO:65的至少400个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。5'重组臂可以包含与SEQ ID NO:65的至少500个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。5'重组臂可以包含SEQ ID NO:65的至少50个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQ ID NO:65的至少100个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQ ID NO:65的至少150个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQID NO:65的至少200个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQ ID NO:65的至少300个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQ ID NO:65的至少400个连续核苷酸。5'重组臂可以包含SEQ IDNO:65的至少500个连续核苷酸。5’重组臂可以包含SEQ ID NO:65的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
3'重组臂可以包含与SEQ ID NO:66具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。3'重组臂可以包含与SEQ IDNO:66的至少200个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。3'重组臂可以包含与SEQ ID NO:66的至少300个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。3'重组臂可以包含与SEQ ID NO:66的至少400个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。3'重组臂可以包含与SEQ ID NO:66的至少500个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。3'重组臂可以包含SEQ ID NO:66的至少50个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQ ID NO:66的至少100个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQ ID NO:66的至少150个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQID NO:66的至少200个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQ ID NO:66的至少300个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQ ID NO:66的至少400个连续核苷酸。3'重组臂可以包含SEQ IDNO:66的至少500个连续核苷酸。3’重组臂可以包含SEQ ID NO:66的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方案中，本公开内容的重组核酸、转基因或蛋白质相对于SEQ ID NO:1-66中提供的任一序列包含一个或多个取代、缺失或插入。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或蛋白质包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个至最多约100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15个取代、缺失或插入。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或蛋白质包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少或至少50个取代、缺失或插入。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或蛋白质包含至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个、至多7个、至多8个、至多9个、至多10个、至多11个、至多12个、至多13个、至多14个、至多15个、至多16个、至多17个、至多18个、至多19个、至多20个、至多25个、至多30个、至多35个、至多40个、至多45个、或至多50个取代、缺失或插入。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或蛋白质包含1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、1-6个、1-7个、1-8个、1-9个、1-10个、1-15个、1-20个、1-30个、1-40个、2-3个、2-4个、2-5个、2-6个、2-7个、2-8个、2-9个、2-10个、2-15个、2-20个、2-30个、2-40个、3-3个、3-4个、3-5个、3-6个、3-7个、3-8个、3-9个、3-10个、3-15个、3-20个、3-30个、3-40个、5-6个、5-7个、5-8个、5-9个、5-10个、5-15个、5-20个、5-30个、5-40个、10-15个、15-20个、或20-25个取代、缺失或插入。
在一些实施方案中，重组核酸、转基因或蛋白质包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个取代、缺失或插入。取代可以是保守取代或非保守取代。一个或多个取代、缺失或插入可以位于序列内的N端、C端、5'末端、3'末端、或其组合。取代、缺失或插入可以是连续的、不连续的、或其组合。
在一些实施方案中，重组核酸、转基因或由其编码的蛋白质包含或编码信号序列。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或由其编码的蛋白质缺乏或不编码信号序列，例如相对于本文提供的序列去除了信号序列。在一些实施方案中，重组核酸、转基因或由其编码的蛋白质包含与本文提供的信号序列不同的信号序列。
组合物和施用
在某些实施方案中，本文公开了包含如本文所述的MYXV的组合物。在一些实施方案中，组合物是或包含药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些实施方案中，药学上可接受的载剂包括可注射流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。在一些实施方案中，组合物包含固体组合物，诸如粉末、丸剂、片剂或胶囊。在一些实施方案诸如包括固体组合物的那些实施方案中，药学上可接受的载剂包括甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。在一些实施方案中，药学上可接受的载剂包括生物中性载剂。在一些实施方案中，组合物包含润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
在一些实施方案中，药学上可接受的载剂或赋形剂的身份或比例基于施用途径、与活病毒的相容性或标准药学实践来确定。在一些实施方案中，药物组合物用不显著损害MYXV的生物学特性的组分配制。药物组合物可以通过用于制备适合施用于对象的药学上可接受的组合物的已知方法来制备，使得有效量的一种或多种活性物质与药学上可接受的媒介物组合在混合物中。在一些实施方案中，组合物包括MYXV与一种或多种药学上可接受的赋形剂、媒介物或稀释剂结合的溶液，并且包含在具有合适的pH且与生理液体等渗的缓冲溶液中。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于施用于对象。如本领域技术人员将理解的，取决于所选择的施用途径，药物组合物可以多种形式施用于对象。在一些情况下，药物组合物全身施用，或被配制用于全身施用。在一些实施方案中，药物组合物局部施用，或被配制用于局部施用。
在一些实施方案中，药物组合物肠胃外施用，或被配制用于肠胃外施用。肠胃外施用的实例包括静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌内、经上皮、经鼻、肺内、鞘内、直肠和局部施用方式。肠胃外施用可通过在选定时间段内连续输注来进行。肠胃外施用可通过推注进行。
在一些实施方案中，药物组合物经口施用，或被配制用于经口施用。药物组合物可例如与惰性稀释剂或载剂一起经口施用，或者可将其封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可将其压制成片剂。对于经口治疗性施用，可将MYXV与赋形剂混合，并以可摄取片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、晶片等形式使用。
MYXV的溶液可在生理学上合适的缓冲液中制备。在一些实施方案中，在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长，但不会使活病毒失活。在一些实施方案中，待使用的药物组合物的剂量取决于所治疗的具体病状、病状的严重程度、个体对象参数(包括年龄、身体状况、体型和体重)、治疗的持续时间、同步疗法的性质(如果有的话)、特定的施用途径以及健康从业者的知识和专业技能范围内的其他类似因素。在某些实施方案中，可将治疗性病毒冷冻干燥以在室温下储存。
药物组合物可另外包含另外的治疗剂，诸如另外的抗癌剂。在一些实施方案中，组合物包含化学治疗剂。化学治疗剂例如可以是基本上任何剂，其表现出针对对象的癌细胞或赘生性细胞的溶瘤作用并且不抑制或削弱MYXV的肿瘤杀伤作用。例如，化学治疗剂可以是但不限于蒽环霉素、烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂剂或细胞因子。优选地，化学治疗剂是已知有效对抗癌性或赘生性的特定细胞类型的化学治疗剂。在一些情况下，另外的治疗剂包括免疫检查点调节剂。
在一些实施方案中，组合物包含通过如本文所述的MYXV离体处理的外周血单核细胞(PBMC)、骨髓(BM)细胞或其组合。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合包括自体细胞。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合获自同种异体供体。在一些实施方案中，PBMC、BM细胞或其组合获自异源供体。
使用方法
在某些实施方案中，本文公开了在有需要的对象中抑制、缓解、治疗、减轻或预防癌症的方法，其包括向对象施用如本文所述的组合物或药物组合物。在某些实施方案中，所述方法包括向对象(诸如人类对象)施用如本文所述的MYXV，从而治疗和/或抑制有需要的对象的癌症。
一些实施方案包括用MYXV进行预防性治疗。在一些实施方案中，对象患有癌症、疑似患有癌症或处于患癌症的风险中。一些实施方案包括选择疑似患有癌症的对象。一些实施方案包括选择处于患癌症风险的对象。在一些实施方案中，对象患有癌症。在一些实施方案中，所述方法包括选择患有癌症的对象。
在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是患者。在一些实施方案中，对象是动物或非人动物。非人动物的实例包括脊椎动物，诸如哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的一些实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛和啮齿类动物诸如小鼠和大鼠。
在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤。实体肿瘤诸如肉瘤和癌的实例包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、骨源性肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、转移性乳腺癌/乳房腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、肝母细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结直肠癌、结直肠腺癌、胃癌、胃腺癌、胃肠癌、腺样囊性癌、神经内分泌肿瘤、棘层松解性鳞状细胞癌、棘层松解性鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌和中枢神经系统肿瘤(诸如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。在一些实施方案中，癌症包括骨肉瘤、三阴性乳腺癌或黑色素瘤。
在一些实施方案中，癌症已转移至对象体内的位置。在一些实施方案中，所述位置包括对象的肺、脑、肝脏和/或淋巴结。
在一些实施方案中，癌症包括血液系统癌症。血液系统癌症的非限制性实例包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞或T细胞血液系统癌症、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、混合表型白血病、骨髓纤维化、高危骨髓增生异常综合征、极高危骨髓增生异常综合征。
在一些实施方案中，组合物降低癌细胞活力，和/或激活癌症中的免疫原性细胞死亡。在一些实施方案中，在施用组合物后，癌症得到抑制、缓解或预防。在一些实施方案中，施用改善对象的存活。
可以使用标准施用方法向对象施用MYXV或包含MYXV的组合物。在一些实施方案中，病毒或包含病毒的组合物全身施用(例如，IV注射)。在一些实施方案中，病毒或包含病毒的组合物通过在疾病部位注射(例如，瘤内)来施用。在一些实施方案中，病毒或包含病毒的组合物经口或肠胃外施用，或通过本领域已知的任何标准方法施用。在某些实施方案中，MYXV或包含MYXV的组合物在肿瘤和/或转移的部位施用。
MYXV可以最初以合适的量施用，所述量可取决于对象的临床应答根据需要进行调整。病毒的有效量可以凭经验确定，并且取决于可以安全施用的MYXV的最大量，以及产生期望结果的病毒的最小量。
待施用的病毒浓度可根据待施用的特定MYXV株的毒力和所靶向的细胞的性质而变化。在一个实施方案中，向人类对象施用小于约3x1010病灶形成单位(“ffu”)(也称为“感染单位”)的剂量，在各种实施方案中，介于约102至约109pfu之间、介于约102至约107pfu之间、介于约103至约106pfu之间、或介于约104至约105pfu之间可以单剂量施用。
在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的免疫细胞(例如，PBMC)对细胞因子的表达的剂量和时间表施用。免疫细胞的细胞因子表达可以增加，例如，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、增加到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍。在一些实施方案中，细胞因子的表达从低于检测限增加至可检测水平。在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的免疫细胞对两种、三种、四种、五种、六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的免疫细胞对至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。细胞因子可以包括，例如，IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何组合。在一些实施方案中，TNF-α的表达增加。在一些实施方案中，IL-12的表达增加。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达增加。在一些实施方案中，IFN-γ的表达增加。
在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的癌细胞对细胞因子的表达的剂量和时间表施用。癌细胞的细胞因子表达可以增加，例如，至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、增加到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约1000倍、或至少约5000倍。在一些实施方案中，细胞因子的表达从低于检测限增加至可检测水平。在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的癌细胞对两种、三种、四种、五种、六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。在一些实施方案中，MYXV以有效增加对象中的癌细胞对至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多种细胞因子的表达的剂量和时间表施用。细胞因子可以包括，例如，IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α或其任何组合。在一些实施方案中，TNF-α的表达增加。在一些实施方案中，IL-12的表达增加。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖的表达增加。在一些实施方案中，IFN-γ的表达增加。
与对照粘液瘤病毒相比，本文公开的粘液瘤病毒可以表现出有利特性，所述对照粘液瘤病毒例如表达功能性M153蛋白、缺乏一种或多种转基因、含有不同的重组核酸，和/或利用不同的启动子进行转基因表达。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸的具有降低的M153活性或表达的MYXV所表现出的对癌症(例如，癌细胞系)的杀伤或生长抑制的EC50比表达功能性M153蛋白的对照粘液瘤病毒所表现出的EC50低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/25、至少约1/50、至少约1/100、或至少约1/1000，例如，根据本文公开的体外测定。可以例如用大约70％汇合或至少70％汇合的细胞进行测定。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并表达转基因的MYXV所表现出的对癌症(例如，癌细胞系)的杀伤或生长抑制的EC50比缺乏转基因的对照粘液瘤病毒所表现出的EC50低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/25、至少约1/50、至少约1/100、或至少约1/1000，例如，根据本文公开的体外测定。可以例如用大约70％汇合或至少70％汇合的细胞进行测定。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并由p11启动子表达转基因(例如，IL-12、TNF-α或核心蛋白聚糖)的MYXV所表现出的对癌症(例如，癌细胞系)的杀伤或生长抑制的EC50比由不同启动子(例如，sE/L启动子)表达转基因的相应的对照粘液瘤病毒所表现出的EC50低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、低到至少约1/2、至少约1/5、至少约1/10、至少约1/25、至少约1/50、至少约1/100、或至少约1/1000。
EC50可以计算为与对照相比最大应答抑制的50％，例如，根据感染后72小时的细胞滴度发光活力测定中的发光信号确定。细胞的存活分数可以通过将测试剂的平均发光值除以未处理对照的平均发光值来确定。可以使用Prism 8软件(GraphPad Software,Inc.)，通过使用非线性回归分析对归一化的应答数据进行曲线拟合来估计测试剂和对照的有效浓度值。
与对照粘液瘤病毒相比，本文公开的粘液瘤病毒可以在癌症治疗中表现出有利特性，所述对照粘液瘤病毒例如表达功能性M153蛋白、缺乏一种或多种转基因、含有不同的重组核酸，和/或利用不同的启动子进行转基因表达。
在一些实施方案中，具有降低的M153活性或表达的本文公开的MYXV所实现的肿瘤体积减小比表达功能性M153蛋白的对照粘液瘤病毒多至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、多到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并表达转基因的MYXV所实现的肿瘤体积减小比缺乏转基因的对照粘液瘤病毒多至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、多到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并由p11启动子表达转基因(例如，IL-12、TNF-α或核心蛋白聚糖)的MYXV所实现的肿瘤体积减小比由不同启动子(例如，sE/L启动子)表达转基因的相应的对照粘液瘤病毒多至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、多到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，与表达功能性M153蛋白的对照粘液瘤病毒相比，具有降低的M153活性或表达的本文公开的MYXV将患有癌症的对象的存活率提高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，与缺乏转基因的对照粘液瘤病毒相比，包含本文公开的重组核酸并表达转基因的MYXV将患有癌症的对象的存活率提高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，与由不同启动子(例如，sE/L启动子)表达转基因的相应的对照粘液瘤病毒相比，包含本文公开的重组核酸并由p11启动子表达转基因(例如，IL-12、TNF-α或核心蛋白聚糖)的MYXV将患有癌症的对象的存活率提高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，与表达功能性M153蛋白的对照粘液瘤病毒相比，具有降低的M153活性或表达的本文公开的MYXV将平均存活时间延长至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、延长到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并表达转基因的MYXV所实现的平均存活时间延长比缺乏转基因的对照粘液瘤病毒多至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、多到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍，例如，根据本文公开的测定。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，包含本文公开的重组核酸并由p11启动子表达转基因(例如，IL-12、TNF-α或核心蛋白聚糖)的MYXV所实现的平均存活时间延长比由不同启动子(例如，sE/L启动子)表达转基因的相应的对照粘液瘤病毒多至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、多到至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、或至少约1000倍。在一些实施方案中，甚至与更高剂量的对照粘液瘤病毒相比，例如高到两倍、五倍或十倍的剂量，也实现了所述效果。
在一些实施方案中，MYXV以有效减小对象的肿瘤体积的剂量和时间表施用。肿瘤的体积可以减小例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％，例如，相对于施用前、相对于未治疗的对象、或相对于施用对照MYXV的对象。
在一些实施方案中，MYXV以有效降低对象的肿瘤或癌细胞生长速率的剂量和时间表施用。肿瘤或癌细胞的生长速率可以降低例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％，例如，相对于施用前、相对于未治疗的对象、或相对于用对照MYXV治疗的对象。
在一些实施方案中，MYXV以有效增加用MYXV治疗的患有癌症的对象的存活率的剂量和时间表施用。存活率可以增加例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％，例如，相对于未治疗或用对照MYXV治疗的对象。
在一些实施方案中，MYXV以有效增加患有癌症的对象的存活时间(例如，平均临近死亡时间(mean time to death))的剂量和时间表施用。存活时间可以增加例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、增加到至少约2倍、至少约5倍、或至少约10倍，例如，相比于未治疗的对象或用对照MYXV治疗的对象。
在一些实施方案中，与进一步表达TNF-α的相应病毒相比，包含编码IL-12和核心蛋白聚糖的本公开内容的重组核酸的粘液瘤病毒表现出令人惊讶且出乎意料地增强的抗肿瘤功效，例如，与进一步表达TNF-α的相应的对照MYXV相比，对于施用包含重组核酸并表达IL-12和核心蛋白聚糖的MYXV的对象，实现了更大程度的肿瘤体积减小、增加的存活率或延长的存活时间(例如，平均临近死亡时间)。
MYXV可以作为单独疗法施用或者可与其他疗法组合施用，包括化学疗法、免疫疗法和/或放射疗法。例如，MYXV可以在手术移除原发性肿瘤之前或之后施用，或者在治疗诸如施用放射疗法或常规化学治疗药物之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，可以在其他疗法之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周或3周施用MYXV。在一些实施方案中，可以在其他疗法之后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周或3周施用MYXV。在一些实施方案中，可以在其他疗法的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天内施用MYXV。在一些实施方案中，MYXV可以与其他疗法同时施用。
一些实施方案还包括向对象施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。在一些实施方案中，在施用组合物之前向对象施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，在施用组合物之后向对象施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂作为与组合物的组合施用于对象。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括免疫调节剂，例如免疫激活调节剂、免疫检查点调节剂或免疫检查点抑制剂。示例性的免疫检查点调节剂包括但不限于PD-L1抑制剂或激活调节剂，诸如来自AstraZeneca的德瓦鲁单抗(durvalumab)(Imfinzi)、来自Genentech的阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、来自EMD Serono/Pfizer的阿维鲁单抗(avelumab)、来自CytomX Therapeutics的CX-072、来自Novartis Pharmaceuticals的FAZ053、来自3D Medicine/Alphamab的KN035、来自Eli Lilly的LY3300054、或来自EMDSerono的M7824(抗PD-L1/TGFβtrap)；PD-L2抑制剂或激活调节剂，诸如GlaxoSmithKline的AMP-224(Amplimmune)、以及rHIgM12B7；PD-1抑制剂或激活调节剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的纳武单抗(nivolumab)(Opdivo)、来自Merck的帕博利珠单抗(pembrolizumab)(Keytruda)、来自Agenus的AGEN 2034、来自BeiGene的BGB-A317、来自Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals的Bl-754091、来自CBT Pharmaceuticals的CBT-501(杰诺单抗(genolimzumab))、来自Incyte的INCSHR1210、来自Janssen Research&Development的JNJ-63723283、来自MedImmune的MEDI0680、来自MacroGenics的MGA012、来自Novartis Pharmaceuticals的PDR001、来自Pfizer的PF-06801591、来自RegeneronPharmaceuticals/Sanofi的REGN2810(SAR439684)、或来自TESARO的TSR-042；CTLA-4抑制剂或激活调节剂，诸如来自Bristol Meyers Squibb的伊匹单抗(ipilimumab)(也称为MDX-010、BMS-734016和MDX-101)、来自Pfizer的曲美木单抗(tremelimumab)(CP-675,206、替西木单抗(ticilimumab))、或来自Agenus的AGEN 1884；LAG3抑制剂或激活调节剂，诸如来自Bristol-Myers Squibb的BMS-986016、来自Novartis Pharmaceuticals的IMP701、来自Novartis Pharmaceuticals的LAG525、或来自Regeneron Pharmaceuticals的REGN3767；B7-H3抑制剂或激活调节剂，诸如来自MacroGenics的伊布妥组单抗(enoblituzumab)(MGA271)；KIR抑制剂或激活调节剂，诸如来自Innate Pharma的利瑞鲁单抗(Lirilumab)(IPH2101；BMS-986015)；CD137激活调节剂，诸如乌瑞芦单抗(urelumab)(BMS-663513，Bristol-Myers Squibb)、PF-05082566(抗4-1BB、PF-2566，Pfizer)或XmAb-5592(Xencor)；PS抑制剂或激活调节剂，诸如巴维昔单抗(Bavituximab)；以及免疫激活调节剂，诸如靶向、调节、抑制、激活或结合TIM3、CD40、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的抗体或其片段(例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、RNAi分子或小分子。
还公开了一种递送策略，其中首先将治疗性MYXV病毒离体吸附至细胞，然后将细胞输注到对象体内。在该策略中，MYXV可以通过与病毒离体接触的细胞的迁移被递送至癌症部位(例如，原发性和/或转移性部位)。这种全身递送方法有时被称为“离体病毒疗法”，或EVV(又名EV2)，因为病毒在输注到对象体内之前首先被递送至分离的细胞。MYXV构建体和该递送策略可在有需要的对象中显著降低肿瘤负荷并增加存活。
在一些实施方案中，细胞是白细胞。在一些实施方案中，细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，细胞是骨髓源性细胞。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞不是原代细胞，例如，是细胞系。在一些实施方案中，细胞是工程化的细胞，例如，被工程化以表达或过表达免疫受体(诸如嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、细胞因子受体、趋化因子受体或NK受体)的细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞。在一些实施方案中，细胞是作为自体或同种异体造血干细胞移植的一部分施用的造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，细胞是间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，细胞是部分分化或终末分化的干细胞。
在一些实施方案中，用MYXV构建体离体吸附细胞一小时，然后将负载MYXV的细胞输注回受体体内。在一些实施方案中，用MYXV构建体离体吸附细胞至少或约30分钟、一小时、两小时、三小时、四小时、六小时或更长时间，然后将负载MYXV的细胞输注回受体体内。
在某些实施方案中，细胞获自对象，例如作为自体细胞。在一些实施方案中，细胞获自一个或多个同种异体供体，例如与受体至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个HLA等位基因(诸如HLA-A、HLA-B、HLA-A和/或HLA-DR等位基因的一个或两个拷贝)匹配的供体。HLA等位基因可以是多种类型，例如，使用基于DNA的方法。在一些实施方案中，外周血单核细胞和/或骨髓细胞获自一个或多个单倍体供体。
实施方案
实施方案1.一种重组核酸，其包含：粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分和编码白细胞介素-12亚基β(IL-12β)的第一核酸；其中所述第一核酸插入到所述MYXV基因组中以减少或破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达；并且其中所述IL-12β的表达由第一痘病毒P11晚期启动子驱动。
实施方案2.如实施方案1所述的重组核酸，其中所述IL-12β是人IL-12β。
实施方案3.如实施方案1或实施方案2所述的重组核酸，还包含编码白细胞介素-12亚基α(IL-12α)的第二核酸。
实施方案4.如实施方案3所述的重组核酸，其中所述IL-12α是人IL-12α。
实施方案5.如实施方案3或4所述的重组核酸，其中所述第二核酸的5'末端偶联至所述第一核酸的3'末端。
实施方案6.如实施方案3-5中任一项所述的重组核酸，其中所述第一核酸和第二核酸通过编码弹性蛋白接头的第三核酸偶联。
实施方案7.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，还包含编码核心蛋白聚糖的第四核酸。
实施方案8.如实施方案7所述的重组核酸，其中所述核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。
实施方案9.如实施方案7或实施方案8所述的重组核酸，其中所述核心蛋白聚糖的表达由第一sE/L启动子驱动。
实施方案10.如实施方案7-9中任一项所述的重组核酸，其中所述第四核酸的5'末端偶联至所述第二核酸的3'末端。
实施方案11.如实施方案9或实施方案10所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第一sE/L启动子；以及(f)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸。
实施方案12.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案13.如任何前述实施方案中的一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案14.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案15.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，还包含编码报告标签的第五核酸。
实施方案16.如实施方案15所述的重组核酸，其中所述报告标签包含绿色荧光蛋白(GFP)。
实施方案17.如实施方案15或实施方案16所述的重组核酸，其中所述报告标签的表达由第二sE/L启动子驱动。
实施方案18.如实施方案15-17中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第一sE/L启动子；(f)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸；(g)所述第二sE/L启动子；以及(h)编码所述报告标签的所述第五核酸。
实施方案19.如实施方案15-17中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案20.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案21.如前述实施方案中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案22.如实施方案1-21中任一项所述的重组核酸，还包含编码肿瘤坏死因子α(TNF-α)的第六核酸。
实施方案23.如实施方案22所述的重组核酸，其中所述TNF-α是人TNF-α。
实施方案24.如实施方案22或实施方案23所述的重组核酸，其中所述TNF-α是可溶性多肽。
实施方案25.如实施方案22-24中任一项所述的重组核酸，其中所述TNF-α的表达由第二痘病毒P11晚期启动子驱动。
实施方案26.如实施方案22-25中任一项所述的重组核酸，其中所述第六核酸位于编码IL-12α的所述第二核酸与编码核心蛋白聚糖的所述第四核酸之间。
实施方案27.如实施方案22-26中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第二痘病毒P11晚期启动子；(f)编码TNF-α的所述第六核酸；(g)所述第一sE/L启动子；(h)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸；(i)任选地，所述第二sE/L启动子；以及(j)任选地，编码所述报告标签的所述第五核酸。
实施方案28.如实施方案22-27中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案29.如实施方案22-28中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案30.如实施方案22-28中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案31.如实施方案22-28中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒或由其组成。
实施方案32.如实施方案22-28中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案33.如实施方案22-28中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案34.一种重组核酸，其包含粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分，以及插入到所述MYXV基因组中以减少或破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达的核酸表达盒，其中核酸表达盒从5'至3'包含：sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-hIL-12β-IRES-hIL-12α-sE/L启动子-GFP。
实施方案35.如实施方案34所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案36.如实施方案34所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案37.一种基因工程化的MYXV，其具有增强的免疫调节或抗肿瘤活性，其中MYXV基因组中至少80％的编码M153蛋白的核酸被敲除，其中所述基因工程化的MYXV包含如实施方案1-36中任一项所述的重组核酸。
实施方案38.如实施方案37所述的基因工程化的MYXV，其中与用其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，所述IL-12β的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。
实施方案39.如实施方案37或实施方案38所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的外周血单核细胞(PBMC)相比，所述IL-12β的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。
实施方案40.如实施方案37所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由所述基因工程化的MYXV感染的细胞的所述IL-12β的表达在感染后四小时是降低的。
实施方案41.一种基因工程化的MYXV，其包含编码细胞因子的核酸，其中所述细胞因子的表达由痘病毒p11晚期启动子驱动，其中所述MYXV被基因工程化以减弱M153的表达或活性。
实施方案42.如实施方案41所述的基因工程化的MYXV，其中所述细胞因子包括IL-12β、IL-12α或其组合。
实施方案43.如实施方案41或实施方案42所述的基因工程化的MYXV，其中所述细胞因子包括TNF-α。
实施方案44.如实施方案41-43中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中至少80％的编码所述M153的核酸在所述基因工程化的MYXV的基因组中是缺失的。
实施方案45.如实施方案41-44中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，所述细胞因子的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。
实施方案46.如实施方案41-44中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的PBMC相比，所述细胞因子的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。
实施方案47.如实施方案41-44中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由所述基因工程化的MYXV感染的细胞中的所述细胞因子的表达在感染后四小时是降低的。
实施方案48.如实施方案41-47中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案49.如实施方案41-47中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案50.如实施方案37-49中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV是基因工程化的洛桑株MYXV。
实施方案51.如实施方案37-50中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中所述p11启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案52.如实施方案37-50中任一项所述的基因工程化的MYXV，其中所述p11启动子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
实施方案53.一种哺乳动物细胞，其用如实施方案1-36中任一项所述的重组核酸或如实施方案37-52中任一项所述的基因工程化的MYXV离体处理。
实施方案54.如实施方案53所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是肿瘤细胞。
实施方案55.如实施方案53所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是外周血单核细胞(PBMC)或骨髓(BM)细胞。
实施方案56.一种组合物，其包含如实施方案1-36中任一项所述的重组核酸、如实施方案37-52中任一项所述的基因工程化的MYXV、或如实施方案53-55中任一项所述的哺乳动物细胞。
实施方案57.如实施方案56所述的组合物，其被配制用于全身施用。
实施方案58.如实施方案56所述的组合物，其被配制用于局部施用。
实施方案59.一种增加有需要的对象的针对肿瘤的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用如实施方案56-58中任一项所述的组合物。
实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述对象患有或疑似患有所述肿瘤。
实施方案61.如实施方案59或实施方案60所述的方法，其中所述施用是全身施用。
实施方案62.如实施方案59-61中任一项所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
实施方案63.如实施方案59或实施方案60所述的方法，其中所述施用是局部施用。
实施方案64.如实施方案59、60和63中任一项所述的方法，其中所述施用是瘤内施用。
实施方案65.如实施方案59-64中任一项所述的方法，其中所述肿瘤包括实体肿瘤。
实施方案66.如实施方案59-65中任一项所述的方法，其中所述肿瘤是肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或黑色素瘤。
实施方案67.如实施方案59-66中任一项所述的方法，其中所述施用改善所述对象的存活。
实施方案68.如实施方案59-67中任一项所述的方法，其中所述施用降低癌细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。
实施方案69.如实施方案59-68中任一项所述的方法，其中所述施用以有效增加所述对象的所述肿瘤中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。
实施方案70.如实施方案59-69中任一项所述的方法，其中所述施用以将所述肿瘤的体积有效减小至少10％的剂量和时间表进行。
实施方案71.如实施方案59-70中任一项所述的方法，其中所述施用以将所述肿瘤的生长有效减小至少10％的剂量和时间表进行。
实施方案72.如实施方案59-71中任一项所述的方法，其中所述对象存活比施用高到十倍剂量的表达M153、缺乏所述重组核酸或其组合的相应的对照粘液瘤病毒的对象长至少10％的时间。
实施例
提供这些实施例仅用于说明目的，并且不旨在限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1-病毒构建
本实施例描述了新型工程化的粘液瘤病毒的设计和产生，其中M153被敲除并且将编码IL-12、核心蛋白聚糖、TNF-α、GFP和/或dsRed的转基因引入病毒基因组中。粘液瘤病毒洛桑株(ATCC VR-1829；GenBank：GCF_000843685.1)是用于产生这些工程化的病毒的亲本病毒。
HV11粘液瘤病毒
溶瘤粘液瘤病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、核心蛋白聚糖和GFP转基因并敲除了M153。如图1A所示，p11启动子驱动人IL-12A和IL-12B的表达，它们通过弹性蛋白接头连结；合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；并且sE/L启动子驱动作为报告蛋白的GFP的表达。
为了产生在M153基因座上插入期望的转基因和启动子的新重组病毒，设计了重组质粒载体。重组质粒包括插入序列，以及包含与M153上游和下游区域同源的序列的0.5-1kb侧翼重组臂，如图1B所示。
所用的sE/L启动子是SEQ ID NO:1。所用的p11启动子是SEQ ID NO:2。IL-12从5'至3'包含不包括终止密码子的人IL-12B(SEQ ID NO:3的核苷酸1-984)、弹性蛋白接头(SEQID NO:6)和缺乏信号肽的人IL-12A(SEQ ID NO:5)。编码IL-12B-弹性蛋白-IL-12A融合蛋白的序列提供于SEQ ID NO:9中。核心蛋白聚糖基因具有SEQ ID NO:7的序列。GFP基因具有SEQ ID NO:8的序列。包含启动子和转基因的组合插入序列提供于SEQ ID NO:10中。包括上游和下游侧翼序列以指导基因组的粘液瘤病毒的M153基因座处的重组的插入序列在SEQID NO:11中示出。全长重组质粒序列提供于SEQ ID NO:12中。
用亲本粘液瘤病毒洛桑株以感染复数(MOI)1感染单层Vero细胞。添加病毒后1小时，将SEQ ID NO:12的重组质粒转染到Vero细胞中。基于GFP的表达鉴定重组病毒的灶点(Foci)，并进行四轮克隆选择以分离含有插入序列的重组粘液瘤病毒。使用靶向M153上游和下游序列的引物通过PCR确认插入，得到亲本病毒的大约0.7kb的条带和具有插入序列的重组病毒的大约4.5kb的条带(引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。
通过被感染细胞培养物上清液的ELISA测试克隆的IL-12和核心蛋白聚糖表达。选择经确认表达IL-12和核心蛋白聚糖的克隆用于后续使用。
IL-12上游p11启动子的存在通过使用p11特异性正向引物(SEQ ID NO:15)和IL-12特异性反向引物(SEQ ID NO:16)进行的PCR并通过测序来确认。产生HV11的主原液用于后续实验。
HV14粘液瘤病毒
溶瘤粘液瘤病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、TNF-α、核心蛋白聚糖和GFP转基因并敲除了M153。如图2A所示，p11启动子驱动人IL-12A和IL-12B的表达，它们通过弹性蛋白接头连结；p11启动子驱动人TNF-α的表达；合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；并且sE/L启动子驱动作为报告蛋白的GFP的表达。
为了产生在M153基因座上插入期望的转基因和启动子的新重组病毒，设计了重组质粒载体。重组质粒包括插入序列，以及包含与M153上游和下游区域同源的序列的0.5-1kb侧翼重组臂，如图2B所示。
所用的sE/L启动子是SEQ ID NO:1。所用的p11启动子是SEQ ID NO:2。IL-12从5'至3'包含不包括终止密码子的人IL-12B(SEQ ID NO:3的核苷酸1-984)、弹性蛋白接头(SEQID NO:6)和缺乏信号肽的人IL-12A(SEQ ID NO:5)。编码IL-12B-弹性蛋白-IL-12A融合蛋白的序列提供于SEQ ID NO:9中。在IL-12A基因与驱动TNF-α表达的p11启动子之间插入六碱基对的间隔子(SEQ ID NO:17)。TNF-α基因具有SEQ ID NO:18的序列。在TNF-α基因与驱动核心蛋白聚糖表达的sE/L启动子之间插入六碱基对的间隔子(SEQ ID NO:19)。核心蛋白聚糖基因具有SEQ ID NO:7的序列。GFP基因具有SEQ ID NO:8的序列。包含启动子和转基因的组合插入序列提供于SEQ ID NO:20中。包括上游和下游侧翼序列以指导基因组的粘液瘤病毒的M153基因座处的重组的插入序列在SEQ ID NO:21中示出。全长重组质粒序列提供于SEQ ID NO:22中。
用亲本粘液瘤病毒洛桑株以感染复数(MOI)1感染单层Vero细胞。添加病毒后1小时，将SEQ ID NO:22的重组质粒转染到Vero细胞中。基于GFP的表达鉴定重组病毒的灶点(Foci)，并进行四轮克隆选择以分离含有插入序列的重组粘液瘤病毒。使用靶向M153上游和下游序列的引物通过PCR确认插入，得到亲本病毒的大约0.7kb的条带和具有插入序列的重组病毒的大约5.5kb的条带(引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。
通过被感染细胞培养物上清液的ELISA测试克隆的IL-12、TNF-α和核心蛋白聚糖表达。选择经确认表达IL-12、TNF-α和核心蛋白聚糖的克隆用于后续使用。
IL-12和TNF-α上游p11启动子的存在通过使用p11特异性正向引物(SEQ ID NO:15)和IL-12特异性反向引物(SEQ ID NO:16)或TNF-α特异性反向引物(SEQ ID NO:23)进行的PCR并通过测序来确认。产生HV14的主原液用于后续实验。
HV12粘液瘤病毒
溶瘤粘液瘤病毒被构建为在M153基因座上包含核心蛋白聚糖、IL-12和GFP转基因并敲除了M153。如图3A所示，合成早期/晚期(sE/L)启动子驱动每种转基因的表达。
为了产生在M153基因座上插入期望的转基因和启动子的新重组病毒，设计了重组质粒载体。重组质粒包括插入序列，以及包含与M153上游和下游区域同源的序列的0.5-1kb侧翼重组臂，如图3B所示。
所用的sE/L启动子是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:61。核心蛋白聚糖基因具有SEQID NO:7或SEQ ID NO:62的序列。IL-12从5'至3'包含人IL-12B(SEQ ID NO:3)、内部核糖体进入位点(IRES；SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:42)和人IL-12A(SEQ ID NO:4)。GFP基因具有SEQ ID NO:8的序列。包含启动子和转基因的组合插入序列提供于SEQ ID NO:25中；替代性序列提供于SEQ ID NO:63中。包括上游和下游侧翼序列以指导基因组的粘液瘤病毒的M153基因座处的重组的插入序列在SEQ ID NO:26中示出。全长重组质粒序列提供于SEQ ID NO:27中。
用亲本粘液瘤病毒洛桑株以感染复数(MOI)1感染单层Vero细胞。添加病毒后1小时，将SEQ ID NO:27的重组质粒转染到Vero细胞中。基于GFP的表达鉴定重组病毒的灶点，并进行五轮克隆选择以分离含有插入序列的重组粘液瘤病毒。使用靶向M153上游和下游序列的引物通过PCR确认插入，得到亲本病毒的大约0.7kb的条带和具有插入序列的重组病毒的大约4.5kb的条带(引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)。
通过被感染细胞培养物上清液的ELISA测试克隆的IL-12和核心蛋白聚糖表达。选择经确认表达IL-12和核心蛋白聚糖的克隆用于后续使用。
产生HV12的主原液用于后续实验。
MV1、MV2、MV3、MV4和HV13粘液瘤病毒
使用类似技术如下产生具有转基因插入的另外的粘液瘤病毒。
MV2病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、核心蛋白聚糖和GFP转基因并敲除了M153。如图4A所示，p11启动子驱动鼠IL-12A和IL-12B的表达，它们通过IRES分开；sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；并且sE/L启动子驱动作为报告蛋白的GFP的表达。
MV4病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、TNF-α、核心蛋白聚糖和GFP转基因并敲除了M153。如图4B所示，p11启动子驱动鼠IL-12A和IL-12B的表达，它们通过IRES分开；p11启动子驱动人TNF-α的表达；sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；并且sE/L启动子驱动作为报告蛋白的GFP的表达。
MV1病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、核心蛋白聚糖和dsRed转基因并敲除了M153。如图4C所示，sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；sE/L启动子驱动小鼠IL-12A和IL-12B的表达，它们通过弹性蛋白接头连结，并且p11启动子驱动作为报告蛋白的dsRed的表达。
MV3病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、核心蛋白聚糖和dsRed转基因，并敲除了M153，并且TNF-α和GFP转基因存在于M135与M136之间的基因间区域中。如图4D所示，sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；sE/L启动子驱动小鼠IL-12A和IL-12B的表达，它们通过弹性蛋白接头连结；p11启动子驱动作为报告蛋白的dsRed的表达；sE/L启动子驱动人TNF-α的表达，并且sE/L启动子驱动GFP的表达。
HV13病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12和核心蛋白聚糖转基因，并敲除了M153，并且TNF-α和GFP转基因存在于M135与M136之间的基因间区域中。如图4E所示，sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；sE/L启动子驱动人IL-12A和IL-12B的表达，它们通过IRES分开，sE/L启动子驱动TNF-α的表达，并且sE/L启动子驱动GFP的表达。
MV5病毒被构建为在M153基因座上包含IL-12、核心蛋白聚糖和GFP转基因并敲除了M153。如图4F所示，p11启动子驱动小鼠IL-12A和IL-12B的表达，它们通过弹性蛋白接头连结；sE/L启动子驱动人核心蛋白聚糖的表达；并且sE/L启动子驱动GFP的表达。
实施例2-被感染细胞的转基因表达
本实施例证实了用本公开内容的粘液瘤病毒感染的细胞分泌TNF、核心蛋白聚糖和/或IL-12。
将Vero细胞以大约1.5x 105个细胞/孔铺板在24孔板中，并使其粘附过夜。用HV11、HV12、HV13和HV14粘液瘤病毒以感染复数(MOI)1感染细胞(至少70％汇合)。24小时后，收获细胞培养物上清液，并进行ELISA以测量IL-12、核心蛋白聚糖和TNF-α的产生。在所有工程化的病毒的上清液中均检测到IL-12和核心蛋白聚糖，分别如图5A和图5B所示，表明所述病毒能够诱导被感染细胞表达和分泌IL-12和核心蛋白聚糖。针对HV11和HV14病毒检测到相对较高的IL-12水平，其具有连结IL-12A和IL-12B亚基的弹性蛋白接头。在HV13和HV14感染的Vero细胞的上清液中还检测到TNF-α，如图5C所示。
当用从0.1至3的不同MOI条件重复实验时，观察到对转基因表达的MOI依赖性效应，其中在用较高浓度的病毒感染的培养物中检测到较高的TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖产量，分别如图6A、图6B和图6C所示。在用“空”粘液瘤病毒感染的培养物中未检测到TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖，所述病毒缺乏TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖转基因(MYXV-GFP)并且含有完整的M153基因。
进行时间过程实验以在感染后2、4、6、8和24小时测量被感染的Vero细胞的细胞因子和核心蛋白聚糖产生。观察到时间依赖性效应，其中在24小时时检测到最高的IL-12、核心蛋白聚糖和TNF-α浓度，分别如图7A、图7B和图7C所示。与其他工程化的病毒相比，对于用HV11和HV14感染的培养物，在更早的时间点检测到IL-12，其具有连结IL-12A和IL-12B亚基的弹性蛋白接头(图7A)。
进行测定，以测量由用HV11、HV12、HV13和HV14感染的Vero细胞产生的IL-12的生物功能性。在感染后24小时收集用工程化的病毒感染的Vero细胞培养物的上清液，并使用IL-12应答性报告细胞系(例如，HEK-Blue IL-12细胞，其应答于IL-12信号传导而产生碱性磷酸酶，随后可以对所述酶进行测量以量化IL-12活性)测量上清液的功能性IL-12活性。在源自用所有四种工程化的粘液瘤病毒感染的培养物的上清液中检测到生物活性IL-12，如图8所示。
评价了人癌细胞系的IL-12、核心蛋白聚糖和TNF产生。用HV11、HV12、HV13和HV14工程化的粘液瘤病毒感染A549(肺癌)和HeLa(宫颈腺癌)细胞，各自的MOI均为1。在感染后24小时收获培养物上清液，并通过ELISA评价转基因的产生。表1示出检测到的蛋白质浓度，以pg/mL计。这些结果表明，工程化的粘液瘤病毒引发人癌细胞中细胞因子和核心蛋白聚糖转基因的产生。
表1
还测试了MV1、MV2、MV3和MV4工程化的病毒引发被感染细胞产生所编码的转基因的能力。
将Vero细胞以大约1.5x 105个细胞/孔铺板在24孔板中，并使其粘附过夜。用MV1、MV2、MV3和MV4粘液瘤病毒以0.1、0.3、1或3的感染复数感染细胞(至少70％汇合)。24小时后，收获细胞培养物上清液，并进行ELISA以测量IL-12、核心蛋白聚糖和TNF-α的产生。观察到对转基因表达的MOI依赖性效应，其中在用较高浓度的病毒感染的培养物中检测到较高的TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖产量，分别如图10A、图10B和图10C所示。
进行时间过程实验以在感染后2、4、6、8和24小时测量被感染的Vero细胞的TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖产生。观察到时间依赖性效应，其中在24小时时检测到最高的IL-12、核心蛋白聚糖和TNF-α浓度，分别如图11A、图11B和图11C所示。与TNF-α表达由p11启动子驱动的MV4相比，对于TNF-α表达由sE/L启动子驱动的MV3，在较早的时间点检测到TNF-α(图11C)；在用MV1和MV3感染的培养物中，也在较早的时间点检测到IL-12，其中所述MV1和MV3的IL-12表达由sE/L启动子驱动并且其具有连结IL-12A和IL-12B亚基的弹性蛋白接头(图11A)。
进行测定，以测量由用MV1、MV2、MV3和MV4感染的Vero细胞产生的IL-12的生物功能性。在感染后24小时收集用工程化的病毒感染的Vero细胞培养物的上清液，并使用IL-12应答性报告细胞测量上清液的功能性IL-12活性。在源自用所有四种工程化的粘液瘤病毒感染的培养物的上清液中检测到生物活性IL-12，如图12所示。
评价了被感染的癌细胞系的IL-12、核心蛋白聚糖和TNF产生。用MV1、MV2、MV3和MV4工程化的粘液瘤病毒感染B16-F10(黑色素瘤)、K7M2(转移性骨肉瘤)和CT-26(结肠癌)细胞，各自的MOI均为1。在感染后24小时收获培养物上清液，并通过ELISA评价转基因的产生。表2示出检测到的蛋白质浓度，以pg/mL计。这些结果表明，工程化的粘液瘤病毒在小鼠癌细胞中引发细胞因子和核心蛋白聚糖转基因的产生。
表2
实施例3-被感染细胞的体内转基因表达
本实施例证实，HV11和HV12工程化的粘液瘤病毒在体内癌症模型中引发IL-12的产生。
在免疫缺陷小鼠的胁腹皮下植入5x106个A549人非小细胞肺癌细胞。当平均肿瘤体积为100-150mm3时，将荷瘤动物随机化，并在第1天通过瘤内(IT)注射2x107病灶形成单位(FFU)/剂或静脉内(IV)注射1x108 FFU/剂进行治疗(n＝3只动物/组)。在病毒注射后4、24或72小时收集血清和肿瘤样品，并处理以用于进行细胞因子量化。使用MesoScaleDiscovery(MSD)U-Plex 6-测定96孔SECTOR板进行细胞因子分析。符号代表个体动物，线条代表平均值。结果显示，HV11和HV12病毒引发经治疗的荷瘤小鼠的血清(图9A)和肿瘤(图9B)中的IL-12产生。
实施例4-重组粘液瘤病毒对癌细胞系的生长的体外抑制
为了进一步表征HV11、HV12、HV13和HV14在体外抑制癌细胞系生长的能力，以9种不同的感染复数(MOI＝0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100)感染14种人癌细胞系，并使用细胞活力测定来确定生长抑制。在大约70％汇合度下对粘附细胞进行感染。表3示出针对细胞系计算的EC50值。对于显示出小于50％总生长抑制但相对于对照在≤50％表现出生长抑制平台的细胞系，括号中的值是针对每种病毒观察到的最大生长抑制。数据显示，在许多情况下，HV11、HV12、HV13和HV14以比缺乏转基因的粘液瘤病毒(MYXV-GFP)更低的MOI实现生长抑制。该数据还提供了本文公开的粘液瘤病毒的实例，其对癌细胞表现出特别强的抑制，这可以取决于例如转基因的组合(一个或多个启动子驱动一种或多种转基因的表达)、IL-12A与IL12B亚基之间存在/不存在接头、转基因方向和/或癌细胞类型。
表3
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实施例5-重组粘液瘤病毒在小鼠乳腺癌模型中的抗癌活性
在小鼠乳腺癌模型中测试了MV1和MV3的抗肿瘤功效。在Balb/c小鼠的右胁腹皮下植入1x106个EMT-6细胞。将荷瘤动物随机分为治疗组，每组8只动物，平均肿瘤体积为79mm3(范围64-99mm3)。在随机化后，每四天一次通过瘤内(IT)注射2x107 FFU/剂用MV1、MV3或缺乏TNF-α、IL-12和核心蛋白聚糖转基因的粘液瘤病毒(MYXV-GFP)对动物进行治疗，共四剂。如图13A所示，粘液瘤病毒治疗导致肿瘤负荷减小，其中在MV1治疗的动物中观察到最低的肿瘤体积。监测动物随时间推移的存活；当个体动物的肿瘤体积≥1500mm3，或当满足IACUC终末处死指南时，达到存活终点。如图13B所示，用粘液瘤病毒治疗提高了存活率，其中用MV1治疗的组的存活率最高。在初始粘液瘤病毒给药后存活至第59天的动物的左胁腹皮下植入1x106个EMT-6细胞对其进行再次攻击，每周记录三次肿瘤体积测量值。先前用粘液瘤病毒治疗的动物对肿瘤再次攻击具有抗性，如图13C所示。
实施例6-重组粘液瘤病毒在小鼠黑色素瘤模型中的抗癌活性
在小鼠黑色素瘤模型中测试了MV1、MV2、MV3和MV4的抗肿瘤功效。向C57BL/6小鼠皮下植入1x106个B16-F10黑色素瘤细胞。将荷瘤动物随机分为治疗组，每组8只动物，平均肿瘤体积为75-100mm3。
在第一个实验中，在随机化后的第1天和第8天，通过瘤内(IT)注射2x107 FFU/剂用MV1、MV2、MV3或MV4对动物进行治疗。如图14A所示，与媒介物治疗的对照动物相比，粘液瘤病毒治疗导致肿瘤负荷减小。监测动物随时间推移的存活；当个体动物的肿瘤体积≥1500mm3，或当满足IACUC终末处死指南时，达到存活终点。如图14B所示，用粘液瘤病毒治疗增加了平均存活时间。
在第二个实验中，每4天一次通过静脉内(IV)注射2x107 FFU/剂用MV1、MV2、MV3或MV4对动物进行治疗，共4剂。肿瘤体积随时间的变化绘制在图14C中，并且存活数据绘制于图14D中。用粘液瘤病毒治疗导致肿瘤体积减小并增加了平均存活时间长度。
在第三个实验中，在随机化后的第1天和第8天，通过IT注射指定剂量(2x105、5x105、2x106或2x107 FFU/剂)的MV1对动物进行治疗。如图15A和图15B所示，对于MV1治疗的小鼠观察到肿瘤负荷和存活的剂量依赖性改善，并且与用缺乏核心蛋白聚糖和IL-2转基因的粘液瘤病毒治疗的小鼠相比实现了存活(例如，存活率和/或平均存活时间)的改善，即使在较低溶瘤病毒剂量下也是如此。
在第四个实验中，在随机化后，每四天一次通过IV注射指定剂量(2x105、2x106、2x107或1x108 FFU/剂)的MV1对动物进行治疗，共四剂。如图15C和图15D所示，在MV1治疗的小鼠中观察到肿瘤负荷和存活的剂量依赖性改善。
实施例7-重组粘液瘤病毒在小鼠转移性黑色素瘤模型中的抗癌活性
在小鼠转移性黑色素瘤模型中测试了MV1、MV2、MV3和MV4的抗肿瘤功效。通过尾静脉的静脉内注射将0.33x106个B16-F10-Luc黑色素瘤细胞植入白化的C57BL/6小鼠中。
在第一个实验中，从肿瘤细胞注射后第3天开始，每四天一次通过静脉内(IV)注射2x107 FFU/剂的MV1、MV2、MV3或MV4对动物进行治疗，共四剂。测量荧光素酶生物发光强度信号(BLI)作为黑色素瘤负荷的指标。如图16A所示，与媒介物治疗的动物相比，并且与用缺乏IL-12、核心蛋白聚糖和/或TNF-α转基因的粘液瘤病毒(MYXV-GFP)治疗的动物相比，接受MV1、MV2、MV3或MV4粘液瘤病毒的动物中的黑色素瘤负荷减小。监测动物随时间推移的存活；当满足IACUC终末处死指南时，达到存活终点。如图16B所示，用粘液瘤病毒进行治疗增加了一些动物/组的平均临近死亡时间或存活时间。
在第二个实验中，从肿瘤细胞注射后第3天开始，每四天一次通过静脉内(IV)注射指定剂量(0.3x106、1x106、1x107或1x108)FFU/剂的MV1或MV2对动物进行治疗，共四剂。如图17A和图17B所示，在用MV1或MV2治疗的一些组中，尤其是在接受较高剂量的那些组中，观察到黑色素瘤负荷的减小和存活的增加。
实施例8-重组粘液瘤病毒在小鼠转移性骨肉瘤模型中的抗癌活性
在小鼠转移性骨肉瘤模型中测试了MV1、MV2、MV3和MV4的抗肿瘤功效。通过尾静脉的静脉内注射将2x106个K7M2-Luc骨肉瘤细胞植入Balb/c小鼠中。监测动物随时间推移的存活；当满足IACUC终末处死指南时，达到存活终点。
在第一个实验中，在肿瘤细胞注射后第3天，通过单次静脉内(IV)注射2x107 FFU的MV1或MV2对动物进行治疗。如图18A所示，临近死亡时间在用MV1或MV2治疗的动物中延迟。
在第二个实验中，从肿瘤细胞注射后第3天开始，每四天一次通过IV注射2x107FFU/剂的MV1、MV2、MV3或MV4对动物进行治疗，共四剂。如图18B所示，与媒介物治疗的动物相比，并且与用缺乏IL-12、核心蛋白聚糖和/或TNF-α转基因的粘液瘤病毒(MYXV-GFP)治疗的动物相比，四剂方案增加了用MV1、MV2、MV3或MV4治疗的小鼠的存活时间。
实施例9-被感染细胞的转基因表达
本实施例证实，用本公开内容的粘液瘤病毒感染的细胞分泌核心蛋白聚糖和IL-12，并且转基因产生的时间过程可以基于所使用的启动子进行调节。
将Vero细胞或B16-F10黑色素瘤细胞以大约1.5x 105个细胞/孔铺板在24孔板中，并使其粘附过夜。用MV1、MV2、MV5或HV11粘液瘤病毒以0.1、0.3、1或3的感染复数(MOI)感染细胞(至少70％汇合)。在感染后4小时和24小时，收获细胞培养物上清液，并进行ELISA以测量IL-12和核心蛋白聚糖的产生。
在感染后24小时，观察到对转基因表达的MOI依赖性效应，其中在用较高浓度的病毒感染的培养物中检测到较高的IL-12和核心蛋白聚糖产量(图19A-Vero细胞的IL-12产生；图19B-B16-F10细胞的IL-12产生；图19C-Vero细胞的核心蛋白聚糖产生；图19D-B16-F10细胞的核心蛋白聚糖产生)。对于表达具有连结IL-12A和IL-12B亚基的弹性蛋白接头的IL-12的病毒，通常检测到相对较高水平的IL-12。
对于以MOI 1感染的细胞，观察到时间依赖性效应，其中与感染后4小时相比，在24小时检测到更高浓度的IL-12和核心蛋白聚糖(图20A-Vero细胞的IL-12产生；图20B-B16-F10细胞的IL-12产生；图20C-Vero细胞的核心蛋白聚糖产生；图20D-B16-F10细胞的核心蛋白聚糖产生)。
在感染后的早期时间点(4h)，与各自由p11启动子表达弹性蛋白连接的IL-12的MV5和HV11病毒相比，对于由sE/L启动子表达弹性蛋白连接的IL-12的MV1病毒观察到IL-12的浓度增加。这些数据表明，转基因产生的时间过程可以基于所使用的启动子进行调节。例如，p11启动子可以用于在感染早期减少转基因的产生和/或将转基因表达限制在发生较高病毒复制的癌细胞中，这在一些实施方案中减少与来自替代性启动子诸如sE/L启动子的较高转基因表达相关的毒性。
实施例10-重组粘液瘤病毒对实体肿瘤细胞系的生长的体外抑制
为了进一步表征HV11、HV12、HV13和HV14抑制人的癌症生长的能力，以9种不同的感染复数(MOI＝0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100)感染人实体肿瘤细胞系，并在感染后72小时使用细胞滴度发光活力测定来确定生长抑制。在大约70％汇合度下对粘附细胞系进行感染。
所测试的细胞系包括NCI-N87(胃癌)、SK-MEL-1(黑色素瘤)、COLO205(结肠癌)、LoVo(结直肠癌)、HCC1806(棘层松解性鳞状细胞癌/乳腺癌)、HCC1599(乳腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、SW620(结直肠癌)、HEP3B(肝细胞癌)、MKN-45(转移性胃腺癌)、SJSA-1(骨肉瘤)、HUH-7(肝细胞癌)、A673(尤文肉瘤)、MDA-MB-435(转移性黑色素瘤)、H1975(肺腺癌/非小细胞肺癌)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、HT-29(结直肠腺癌)、A204(横纹肌肉瘤)、A549(肺腺癌)、DLD-1(结直肠腺癌)、A375(黑色素瘤)、MDA-MB-231(转移性乳腺腺癌)、SK-MES-1(肺鳞状细胞癌)、H358(细支气管肺泡癌/非小细胞肺癌)、HEP-G2(肝母细胞瘤/肝细胞癌)以及MDA-MB-157(转移性乳腺癌)。
计算EC50值并针对最大生长抑制百分比作图，从而使每种病毒抑制癌细胞系生长的效力可视化(图21A–HV11；图21B–HV12；图21C–HV13；图21D–HV14)。EC50值计算为根据发光信号确定的与对照相比最大应答抑制的50％。细胞的存活分数通过将测试剂的平均发光值除以未处理对照的平均发光值来确定。使用Prism 8软件(GraphPad Software,Inc.)，通过使用非线性回归分析对归一化的应答数据进行曲线拟合来估计测试剂和对照的有效浓度值。
这些数据还提供了本文公开的粘液瘤病毒的实例，其对癌细胞表现出强抑制，这可以取决于例如转基因的组合(一个或多个启动子驱动一种或多种转基因的表达)、IL-12A与IL-12B亚基之间存在/不存在接头、转基因方向、癌细胞类型、癌细胞特征或其组合。
实施例11-HV11对多发性骨髓瘤细胞系的体外抑制
为了进一步表征HV11抑制多发性骨髓瘤生长的能力，将细胞系以大约1x 105个细胞/孔铺板，以9种不同的感染复数(MOI＝0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30、100)进行感染，并使用细胞滴度发光活力测定在感染后24和72小时确定生长抑制。
所测试的细胞系包括KMS-34(r)、LP-1、RMPI-8226、L363、NCI-H929、MM1.s、U266、KMS-34和ANBL-6。
计算EC50值并针对最大生长抑制百分比作图，从而使每种病毒抑制多发性骨髓瘤细胞系生长的效力可视化(图22A–24小时；图22B–72小时)。EC50值计算为根据发光信号确定的与对照相比最大应答抑制的50％。细胞的存活分数通过将测试剂的平均发光值除以未处理对照的平均发光值来确定。使用Prism 8软件(GraphPad Software,Inc.)，通过使用非线性回归分析对归一化的应答数据进行曲线拟合来估计测试剂和对照的有效浓度值。
实施例12-用重组粘液瘤病毒感染的实体肿瘤细胞系在体外的核心蛋白聚糖、IL-12和TNF-α产生
为了进一步表征本文公开的粘液瘤病毒在癌细胞的感染后引发核心蛋白聚糖、IL-12和/或TNF-α产生的能力，将人实体肿瘤细胞系用HV11、HV12、HV13或HV14以感染复数1进行感染，并且在感染后24小时对上清液中每种蛋白质的浓度进行量化。在大约70％汇合度下对粘附细胞进行感染。作为对照，用不编码核心蛋白聚糖、IL-12或TNF-α并且含有完整的M153基因的“空”粘液瘤病毒(MYXV-GFP)感染细胞。
所测试的细胞系包括NCI-N87(胃癌)、SK-MEL-1(黑色素瘤)、COLO205(结肠癌)、LoVo(结直肠癌)、HCC1806(棘层松解性鳞状细胞癌/乳腺癌)、HCC1599(乳腺癌)、HT1080(纤维肉瘤)、SW620(结直肠癌)、HEP3B(肝细胞癌)、MKN-45(转移性胃腺癌)、SJSA-1(骨肉瘤)、HUH-7(肝细胞癌)、A673(尤文肉瘤)、MDA-MB-435(转移性黑色素瘤)、H1975(肺腺癌/非小细胞肺癌)、SK-MEL-28(黑色素瘤)、HT-29(结直肠腺癌)、A204(横纹肌肉瘤)、A549(肺腺癌)、DLD-1(结直肠腺癌)、A375(黑色素瘤)、MDA-MB-231(转移性乳腺腺癌)、SK-MES-1(肺鳞状细胞癌)、H358(细支气管肺泡癌/非小细胞肺癌)、HEP-G2(肝母细胞瘤/肝细胞癌)以及MDA-MB-157(转移性乳腺癌)。
HV11、HV12、HV13和HV14引发实体肿瘤细胞产生核心蛋白聚糖(图23A和24A-F)，而MYXV-GFP引发较少的核心蛋白聚糖、不引发核心蛋白聚糖或基本上不引发核心蛋白聚糖(图23A)。在许多情况下，尽管在所有病毒中核心蛋白聚糖表达都是由sE/L启动子驱动的，但观察到应答于HV11和HV14的较高核心蛋白聚糖(图23A)。
HV11、HV12、HV13和HV14引发实体肿瘤细胞产生IL-12(图23B和24A-D)，而MYXV-GFP不引发或基本上不引发IL-12(图23B)。用HV11或HV14感染的细胞产生较高的IL-12(图23B)。
HV13和HV14引发实体肿瘤细胞产生TNF-α(图23C和24E-F)，而MYXV-GFP引发较少的TNF-α、不引发TNF-α或基本上不引发TNF-α(图23C)。在许多情况下，用HV13感染的细胞产生较高的TNF-α(图23C)，其中TNF-α是由sE/L启动子而不是p11启动子驱动的。
实施例13-用HV11感染的多发性骨髓瘤细胞系在体外的核心蛋白聚糖和IL-12产生
为了进一步表征本文公开的粘液瘤病毒在癌细胞的感染后引发核心蛋白聚糖和IL-12产生的能力，将人多发性骨髓瘤细胞系以大约1x105个细胞/孔铺板，用HV11以感染复数1进行感染，并在感染后24小时对核心蛋白聚糖和IL-12的浓度进行量化。作为对照，用不编码核心蛋白聚糖或IL-12并且含有完整的M153基因的“空”粘液瘤病毒(MYXV-GFP)感染细胞。
所测试的细胞系包括KMS-34(r)、LP-1、RMPI-8226、L363、NCI-H929、MM1.s、U266、KMS-34和ANBL-6。
在许多所测试的细胞系中，HV11引发IL-12和核心蛋白聚糖，而MYXV-GFP引发较少的或基本上不引发核心蛋白聚糖(图25A)和/或IL-12(图25B)。
另外的序列
与本文所述的组合物和方法相对应的示例性序列在表4中示出。
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尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为实例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不脱离本发明。应当理解，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可在本发明的实践中采用。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且从而覆盖在这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。
Claims (72)
1.一种重组核酸，其包含：
粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分和编码白细胞介素-12亚基β(IL-12β)的第一核酸；
其中所述第一核酸插入到所述MYXV基因组中以减少或破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达；并且
其中所述IL-12β的表达由第一痘病毒P11晚期启动子驱动。
2.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述IL-12β是人IL-12β。
3.如权利要求1所述的重组核酸，还包含编码白细胞介素-12亚基α(IL-12α)的第二核酸。
4.如权利要求3所述的重组核酸，其中所述IL-12α是人IL-12α。
5.如权利要求3所述的重组核酸，其中所述第二核酸的5'末端偶联至所述第一核酸的3'末端。
6.如权利要求5所述的重组核酸，其中所述第一核酸和所述第二核酸通过编码弹性蛋白接头的第三核酸偶联。
7.如权利要求6所述的重组核酸，还包含编码核心蛋白聚糖的第四核酸。
8.如权利要求7所述的重组核酸，其中所述核心蛋白聚糖是人核心蛋白聚糖。
9.如权利要求7所述的重组核酸，其中所述核心蛋白聚糖的表达由第一sE/L启动子驱动。
10.如权利要求7所述的重组核酸，其中所述第四核酸的5'末端偶联至所述第二核酸的3'末端。
11.如权利要求9所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第一sE/L启动子；以及(f)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸。
12.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
13.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
14.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
15.如权利要求9所述的重组核酸，还包含编码报告标签的第五核酸。
16.如权利要求15所述的重组核酸，其中所述报告标签包含绿色荧光蛋白(GFP)。
17.如权利要求15所述的重组核酸，其中所述报告标签的表达由第二sE/L启动子驱动。
18.如权利要求17所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第一sE/L启动子；(f)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸；(g)所述第二sE/L启动子；以及(h)编码所述报告标签的所述第五核酸。
19.如权利要求15所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
20.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
21.如权利要求1所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:11的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
22.如权利要求7所述的重组核酸，还包含编码肿瘤坏死因子α(TNF-α)的第六核酸。
23.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述TNF-α是人TNF-α。
24.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述TNF-α是可溶性多肽。
25.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述TNF-α的表达由第二痘病毒P11晚期启动子驱动。
26.如权利要求25所述的重组核酸，其中所述第六核酸位于编码IL-12α的所述第二核酸与编码核心蛋白聚糖的所述第四核酸之间。
27.如权利要求25所述的重组核酸，其中所述重组核酸从5'至3'包含以下各项、基本上由其组成、或由其组成：(a)所述第一痘病毒P11晚期启动子；(b)编码所述IL-12β的所述第一核酸；(c)编码所述弹性蛋白接头的所述第三核酸；(d)编码所述IL-12α的所述第二核酸；(e)所述第二痘病毒P11晚期启动子；(f)编码TNF-α的所述第六核酸；(g)所述第一sE/L启动子；(h)编码所述核心蛋白聚糖的所述第四核酸；(i)任选地，所述第二sE/L启动子；以及(j)任选地，编码所述报告标签的所述第五核酸。
28.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin表达盒、基本上由其组成、或由其组成。
29.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
30.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
31.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含vMyx-P11晚期启动子-hIL-12β-弹性蛋白接头-hIL-12α-P11晚期启动子-TNF-α-sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-GFP表达盒或由其组成。
32.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
33.如权利要求22所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
34.一种重组核酸，其包含粘液瘤病毒(MYXV)基因组的至少一部分以及核酸表达盒，所述核酸表达盒插入到所述MYXV基因组中以减少或破坏所述MYXV基因组的M153基因的表达，其中所述核酸表达盒从5'至3'包含：sE/L启动子-hdecorin-sE/L启动子-hIL-12β-IRES-hIL-12α-sE/L启动子-GFP。
35.如权利要求34所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含与SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的序列、基本上由其组成、或由其组成。
36.如权利要求34所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含为SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
37.一种基因工程化的MYXV，其具有增强的免疫调节或抗肿瘤活性，其中MYXV基因组中编码M153蛋白的核酸的至少80％被敲除，其中所述基因工程化的MYXV包含如权利要求1-36中任一项所述的重组核酸。
38.如权利要求37所述的基因工程化的MYXV，其中与用其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，所述IL-12β的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。
39.如权利要求37所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的外周血单核细胞(PBMC)相比，所述IL-12β的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。
40.如权利要求37所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述IL-12β的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由所述基因工程化的MYXV感染的细胞中的所述IL-12β的表达在感染后四小时是降低的。
41.一种基因工程化的MYXV，其包含编码细胞因子的核酸，其中所述细胞因子的表达由痘病毒p11晚期启动子驱动，其中所述MYXV被基因工程化以减弱M153的表达或活性。
42.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述细胞因子包括IL-12β、IL-12α或其组合。
43.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述细胞因子包括TNF-α。
44.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中编码所述M153的核酸的至少80％在所述基因工程化的MYXV的基因组中是缺失的。
45.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的非癌细胞相比，所述细胞因子的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的非癌细胞中降低。
46.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的PBMC相比，所述细胞因子的表达在由所述基因工程化的MYXV感染的PBMC中降低。
47.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中与由其中所述细胞因子的表达由sE/L启动子驱动的相应的对照粘液瘤病毒感染的细胞相比，由所述基因工程化的MYXV感染的细胞中的所述细胞因子的表达在感染后四小时是降低的。
48.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQ ID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少98％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
49.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV包含核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:10的核苷酸1-2762、SEQ ID NO:20的核苷酸1-3507、SEQID NO:25的核苷酸1-3288、或SEQ ID NO:63的核苷酸1-3534、基本上由其组成、或由其组成。
50.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述MYXV是基因工程化的洛桑株MYXV。
51.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述痘病毒p11晚期启动子包含与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
52.如权利要求41所述的基因工程化的MYXV，其中所述痘病毒p11晚期启动子包含SEQID NO:2的核苷酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
53.一种哺乳动物细胞，其用如权利要求1-36中任一项所述的重组核酸或如权利要求37-52中任一项所述的基因工程化的MYXV离体处理。
54.如权利要求53所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是肿瘤细胞。
55.如权利要求53所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是外周血单核细胞(PBMC)或骨髓(BM)细胞。
56.一种组合物，其包含如权利要求1-36中任一项所述的重组核酸、如权利要求37-52中任一项所述的基因工程化的MYXV、或如权利要求53-55中任一项所述的哺乳动物细胞。
57.如权利要求56所述的组合物，其被配制用于全身施用。
58.如权利要求56所述的组合物，其被配制用于局部施用。
59.一种增加有需要的对象的针对肿瘤的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用如权利要求56-58中任一项所述的组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述对象患有或疑似患有所述肿瘤。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述施用是全身施用。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述施用是静脉内施用。
63.如权利要求59所述的方法，其中所述施用是局部施用。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述施用是瘤内施用。
65.如权利要求59所述的方法，其中所述肿瘤包括实体肿瘤。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述肿瘤是肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌或黑色素瘤。
67.如权利要求59所述的方法，其中所述施用改善所述对象的存活。
68.如权利要求59所述的方法，其中所述施用降低癌细胞活力，或激活所述癌症中的免疫原性细胞死亡。
69.如权利要求59所述的方法，其中所述施用以有效增加所述对象的所述肿瘤中的至少两种细胞因子的表达的剂量和时间表进行。
70.如权利要求59所述的方法，其中所述施用以将所述肿瘤的体积有效减小至少10％的剂量和时间表进行。
71.如权利要求59所述的方法，其中所述施用以将所述肿瘤的生长有效减小至少10％的剂量和时间表进行。
72.如权利要求59所述的方法，其中所述对象存活比施用高十倍剂量的表达M153、缺乏所述重组核酸或其组合的相应的对照粘液瘤病毒的对象长至少10％的时间。
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