WO2019066535A1 - 암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체 - Google Patents

암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체 Download PDF

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양유수
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Definitions

  • the present invention relates to a novel recombinant plasma membrane-based vesicle, and more particularly to a novel recombinant plasma membrane-based vesicle for the treatment of cancer.
  • Cancer refers to a group of diseases associated with abnormal cell growth that have the potential for invasion and metastasis to other parts of the body. As of 2015, more than 90 million people worldwide are known to have cancer, and about 14 million new cancer patients develop annually. Cancer accounts for 15.7% of the causes of human death. The most frequent cancers are lung cancer, prostate cancer, colon cancer and stomach cancer in men and breast cancer, colon cancer, lung cancer and cervical cancer in women.
  • cancer cells are recognized as "self” by the immune cells of our body. Therefore, the cancer cells can be recognized as "non-self” by inducing the immune cells to induce the cancerous phagocytosis and further the amplified immune response It is important.
  • Exosomes are cell-derived vesicles present in all biological fluids, including blood, urine, and culture media of cell cultures, and are also referred to as extracellular vesicles or microvesicles.
  • the size of the exosome is known to be between 30 and 100 nm, and when the multivesicular body fuses with the cell membrane, it is secreted from the cell, secreted directly through the cell membrane, or budged directly from the cell membrane.
  • Exosomes are known to play an important role in a variety of processes such as clotting, intercellular signaling, and metabolic waste management.
  • Exosomes have important advantages as drug carriers compared to liposomes or polymeric nanoparticles in that they are non-immunogenic in that they have similar composition to the cells of the human body (Ha et al ., Acta Pharm. Sin. B. 6 (4): 287-296, 2016).
  • exosomes may be used to deliver anticancer agents such as doxorubicin to tumor tissues (Tian et al ., Biomaterials . 35: 2383-2390, 2014), or to pass paclitaxel and doxorubicin through the blood- Yang et al ., Pharm Res .
  • catalase is passed through the blood-brain barrier to treat Parkinson's disease (Haney et al ., J. Control Release . 207: 18-30, 2015), and various attempts have been made to deliver siRNAs specific to specific genes to treat cancer (Shtam et al ., Cell Commun. Signal . 11: 88, 2013).
  • Extracellular vesicles are extracellular vesicles of various functionalities released or secreted from the cell into the extracellular environment, nucleic acid molecules such as RNA, or various biomolecules, such as lipids, encapsulated in the same lipid bilayer membrane as the cell membrane from which they originate ≪ / RTI > Extracellular endoplasmic reticulum refers to a plasma membrane-based vesicle having an average diameter of 100 nm to 1 [mu] m, which is usually greater than that of exosomes having a size of 30-100 nm.
  • Cell-derived nanobeicles are nano-sized vesicles surrounded by a plasma membrane, a nano-sized cell membrane component formed through an artificial process such as an extrusion process for passing a cell through a microfluidic channel or a multistage filtration process
  • a plasma membrane-based vesicle that is differentiated from the exosome or extracellular vesicles that are secreted by cells and produced naturally.
  • VSV-G vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • the VSV-G protein is a transmembrane protein that contains two N-linked glycans and can initiate membrane fusion in a low-pH-dependent manner when no other viral proteins are present.
  • VSV-G protein forms a complex with nucleic acid molecules such as DNA, it can be used as a carrier for direct gene transfer or as a stable and high-pseudotyped murine leukemia virus (MLV) -based retrovirus and lentivirus - based vectors have been used effectively in gene therapy.
  • MMV murine leukemia virus
  • the protein can be used for the purpose of transferring various proteins to target cells (Mangeot et al ., Mol. Ther . 19 (9): 1656-1666, 2011).
  • the method disclosed in the above-mentioned prior art is a difficult technique to be applied to clinical practice because it is difficult to supply and receive neural stem cells and the effect of killing cancer cells is not so large.
  • these problems are exemplary and do not limit the scope of the present invention.
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a VSV-G mutant protein having histidine replaced with arginine, which is a 162nd amino acid, is introduced into the membrane.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the recombinant plasma membrane-based vesicle as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising, as an active ingredient, a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a virus-derived membrane fusion protein is introduced into a membrane.
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a VSV-G mutant protein having histidine replaced with arginine at 162nd amino acid is introduced
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a fusion membrane protein is introduced for the manufacture of a cancer therapeutic agent.
  • a method of treating cancer in an individual comprising administering to the individual having the cancer a recombinant plasma membrane-based ER or one or more of the above pharmaceutical compositions.
  • the present invention can effectively treat cancer without a complicated mechanism such as gene transfer.
  • Fig. 3 is a schematic diagram schematically illustrating the mechanism.
  • FIG. 2A is a plasmid map showing a schematic structure of a plasmid DNA for producing a recombinant exosome according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2B is a diagram showing a plasmid DNA for producing a recombinant exosome according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a process diagram showing a production process of a recombinant exosome comprising mVSV-G according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a Western blot analysis of cell extracts transfected with the mVSV-G gene construct to produce recombinant exosomes and the recombinant exosomes according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a photograph of a recombinant exosome containing mVSV-G prepared according to an embodiment of the present invention by a transmission electron microscope
  • FIG. 5B is a photograph showing the result of analyzing the particle size of the recombinant exosome by dynamic light scattering analysis .
  • FIG. 6a shows the result of examining the degree of membrane fusion with cancer cells according to the pH change when mVSVG-Exo according to one embodiment of the present invention was treated with three kinds of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova, and CT26.CL25) (*: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇ 0.001).
  • FIG. 6a shows the result of examining the degree of membrane fusion with cancer cells according to the pH change when mVSVG-Exo according to one embodiment of the present invention was treated with three kinds of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova, and CT26.CL25) (*: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇ 0.001).
  • FIG. 6a shows the result of examining the degree of membrane fusion with cancer cells according to the pH change when mVSVG-Exo according to one embodiment of the present invention was treated with three kinds of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova, and CT26.CL
  • FIG. 6B shows the results of treatment of 4T1-Luc cells with mVSVG-Exo according to an embodiment of the present invention by staining with membrane anti-VSV-G antibody and anti-Cadherin antibody (green)
  • Figure 6c is a photograph of a low density lipoprotein receptor (LDLR) receptor known as VSV-G receptor on various cell surfaces including three types of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova and CT26.CL25) And Western blot analysis for the expression of the gene.
  • LDLR low density lipoprotein receptor
  • FIG. 7a shows a result of fusion of mVSV-G-Exo with three kinds of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova, and CT26.CL25) according to the change of pH according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7B is a graph showing a result of quantitative measurement of the results of FIG. 7A
  • FIG. 7C is a histogram showing the results of flow cytometry analysis to observe whether mVSV-G-Exo (*: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01) for confirming whether the cells directly induce the death of cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova and CT26.CL25).
  • FIG. 8a shows the effect of recombinant exosomes and mVSV-G-containing recombinant exosomes (Con-Exo) on 4T1-Luc breast cancer cells on phagocytosis by macrophages and dendritic cells according to one embodiment of the present invention
  • FIG. 8B is a graph showing the results of quantitative analysis after the fluorescence microscopic analysis.
  • FIG. 8B is a graph showing the results of the EL4-Ova lymphoma cells of the recombinant exosome containing mVSV-G and the control exo (Con-Exo) according to an embodiment of the present invention
  • 8C is a graph showing the results of fluorescence microscopy analysis of the effect on macrophages and dendritic cell-mediated phagocytic cell responses to recombinant exosomes and mVSV-G according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of the recombinant exosome (mVSVG-Exo) containing mVSV-G according to an embodiment of the present invention and the control group (mVSVG-Exo) according to one embodiment of the present invention to examine whether VSVG can act as a TLR4 agonist to activate dendritic cell function.
  • mVSVG-Exo recombinant exosome
  • mVSVG-Exo the control group
  • FIG. 10a shows the time course of passage of time in a 4T1-Luc breast tumor model animal (Balb / c, 7 week old magnetic mouse) administered with recombinant exosome (200 ⁇ g) containing mVSV-G according to an embodiment of the present invention (Squares are the control group, circles are the control exosomes not including mVSV-G, triangles are the recombinant exosomes containing mVSV-G according to one embodiment of the present invention),
  • FIG. 10B is a graph showing the results of measuring the weight of cancer tissues obtained by sacrificing an experimental animal after 16 days from the injection of cancer cells in FIG. 10A, and FIG. 10C is a graph showing changes in body weight of animals used in the experiment (* P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇
  • Figure 11a is a graphical representation of the time course of EL4-Ova lymphoma tumor model animals (C57BL / 6, 7 week old magnetic mouse) treated with recombinant exosomes (200 ⁇ g) containing mVSV-G according to one embodiment of the present invention (The rectangle is a control group, the circle is a control exosome not containing mVSV-G, and the triangle is a recombinant exosome including mVSV-G according to an embodiment of the present invention)
  • 11b is a graph showing the results of measuring the weight of cancer tissues obtained by sacrificing the experimental animals after lapse of 16 days from the injection of cancer cells in Figure 11a and
  • Figure 11c is a graph showing changes in the weights of the animals used in the experiment : P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇
  • FIG. 12 is a graph showing a comparison between the recombinant exosome (mVSVG-Exo) containing mVSV-G, the recombinant exosome (wtVSVG-Exo) containing wild-type VSV-G, the control Exosome (Con-Exo) according to an embodiment of the present invention, And PBS as a control group were injected into the cancer tissues of the tumor model animals (EL4-Ova-injected C57BL / 6 mice), and single cells were obtained from the cancer tissues, followed by staining with anti-VSV-G antibody. (*: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇ 0.001).
  • FIG. 13A is a graph showing the effect of the recombinant exosome (mVSVG-Exo) containing mVSV-G, the recombinant exosome (wtVSVG-Exo) containing wild type VSV-G, the control Exosome (Con-Exo) according to an embodiment of the present invention.
  • PBS was injected into the tumor tissues of tumor model animals (EL4-Ova-injected C57BL / 6 mice), and then the tumor cells draining lymph nodes were monolayered.
  • FIG. 13B is a graph showing the results of flow cytometry analysis using the anti-CD11c antibody and the anti-CD40 antibody after monocyzing the extracted tumor drainage lymph node
  • FIG. 13c is a graph showing the results of flow cytometry analysis using anti-CD11c antibody and anti-CD86 antibody after monocyzing the extracted tumor drainage lymph node
  • Fig. 13d are stained with the anti-tumor tissue flakes -CD8 antibodies
  • FIG. 13E is a graph showing the results of quantifying the degree of invasion of CD8 T cells into cancer tissues in FIG. 13D (FIG. 13B).
  • FIG. 13D is a graph showing the results of quantitative analysis of the degree of invasion of CD8 T cells in tumor tissues using a fluorescence microscope ***: P ⁇ 0.001).
  • FIG. 14A is a graph showing the effect of a recombinant exosome (mVSVG-Exo) containing mVSV-G, a recombinant exosome (wtVSVG-Exo) containing wild-type VSV-G, a control Exosome (Con-Exo) according to an embodiment of the present invention.
  • mVSVG-Exo a recombinant exosome containing mVSV-G
  • wtVSVG-Exo recombinant exosome containing wild-type VSV-G
  • a control Exosome Con-Exo
  • 14B is a graph showing the results of analysis of INF-y expression level of the culture medium by co-culturing with OT-1 CD8 T cells isolated from the transformed mouse spleen at a ratio of 1: 5, respectively,
  • the splenic tissues extracted from the experimental animals were treated with PBS and cancer-specific antigen, 10 ⁇ g / ml, for 24 hours in a single-celled splenocyte.
  • the INF- ⁇ expression level of the culture medium was analyzed by ELISA (*: P ⁇ 0.05; **: P ⁇ 0.01; ***: P ⁇ 0.001).
  • Fig. 15A and 15b show the results of immunohistochemical staining of recombinant exosome (mVSVG-Exo) containing mVSV-G according to an embodiment of the present invention, control exocomas (Con-Exo) (Left) and the weight of the tumor tissue sacrificed at 17 days after the injection of the cancer cells and measuring the weight of the tumor tissues were measured (Right side).
  • Fig. 15A shows the results of the experiment with low dose (two times of 100 g g), Fig.
  • 15B shows the results of the experiment with high dose (four times of 100 g g) (MVSVG-Exo) containing mVSV-G according to an embodiment of the present invention was intraperitoneally administered at intervals of 3 days from the day before the injection of the anti-CD8 antibody and the EL4-Ova cancer cells were injected subcutaneously Induced C57BL / 6
  • a graph showing the results of measurement of the volume of tumor tissue over time after administration into the tumor tissue of the mouse (left) and a graph showing the results of measurement of the weight of the tumor tissue sacrificed at 18 days after the injection of cancer cells to the right), as a control antibody was used as a recombinant IgG (***:.
  • Figure 15d is an embodiment little recombinant exo (mVSVG-exo) containing mVSVG according to the control group of the present invention
  • fusogenic membrane protein is a virus-derived membrane protein that plays a key role in causing attachment of a virus to host cells and inducing membrane fusion to penetrate host cells Protein.
  • a representative example is the envelope glycoprotein (VSV-G) derived from a virus type stomatitis virus.
  • VSV-G protein envelope glycoprotein (VSV-G protein) of vesicular stomatitis virus is the only viral glycoprotein present in the virion membrane of the vesicular stomatitis virus, It functions as a fusion protein.
  • the VSV-G protein is a transmembrane protein that contains two N-linked glycans and can initiate membrane fusion in a low-pH-dependent manner when no other viral proteins are present.
  • VSV-G protein forms a complex with nucleic acid molecules such as DNA, it can be used as a carrier for direct gene transfer or as a stable and high-pseudotyped murine leukemia virus (MLV) -based retrovirus and lentivirus - based vectors have been used effectively in gene therapy.
  • MMV murine leukemia virus
  • the protein can be used for the purpose of transferring various proteins to target cells (Mangeot et al ., Mol. Ther . 19 (9): 1656-1666, 2011).
  • a "plasm membrane-based vesicle” refers to a nano-sized vesicle surrounded by a cell-derived cell membrane, and includes exosomes produced by secretion or germination from cells, Cell-derived nano beads and the like, which are prepared by artificially processing external vesicles or cells, for example, extrusion.
  • exosome is a cell-derived vesicle present in all biological fluids including blood, urine, and culture media of cell culture, either extracellular vesicles or Also called microvesicle.
  • the size of the exosomes is known to be between 30 and 100 nm, and when the multivesicular body fuses with the cell membrane, it is secreted from the cell or secreted directly through the cell membrane. Exosomes are known to play an important role in a variety of processes such as clotting, intercellular signaling, and metabolic waste management.
  • recombinant exosome refers to an artificially produced exosome, which encodes an exogenous protein by genetic engineering into a host cell capable of producing exosome Is transgenic to produce a transformed host cell, and then the transformed host cell is cultured and then obtained from the culture.
  • the recombinant exosome contains the exogenous protein transduced therein or in the exosomal membrane.
  • extracellular vesicle refers to various functional proteins released or secreted from the cell into the extracellular environment, nucleic acid molecules such as RNA, or various biomolecules such as lipids, Quot; means a structure in the form of particles enclosed in a cell membrane of the same lipid bilayer.
  • Extracellular endoplasmic reticulum refers to a plasma membrane-based vesicle having an average diameter of 100 nm to 1 [mu] m, which is usually greater than that of exosomes having a size of 30-100 nm.
  • cell-derived nanobeicle refers to a nano-sized cell membrane component formed through an artificial process such as an extrusion process for passing a cell through a microfluidic channel, Like vesicles surrounded by naturally-occurring exosomes or extracellular vesicles that are secreted by the cells.
  • the term " immunogenic cell death" refers to a cell proliferation inhibitor, such as anthracyclines, oxaliplatin and bortezomib, or a cytostatic or cytostatic agent induced by radiotherapy and photodynamic therapy It means a kind of apoptosis. Unlike general apoptosis, the immunological apoptosis of cancer cells can induce an effective anti-cancer immune response through activation of dendritic cells and thus activation of specific T cell responses. The substance causing immunogenic cell death is called " immunogenic cell death inducer ". Immunogenic and immunogenic inducers of apoptosis are well described in Kroemer et al . ( Annu. Rev. Immunol ., 31: 51-72, 2013). This document is incorporated herein by reference in its entirety.
  • anthracycline-type anticancer agent refers to an antracycline-type anticancer agent, such as Streptomyces peucetius var. refers to a cell cycle non-specific anticancer agent family used in cancer chemotherapy derived from caesius.
  • Anthracycline-based anticancer agents are used for the treatment of various cancers including leukemia, lymphoma, breast cancer, stomach cancer, uterine cancer, ovarian cancer, bladder cancer and lung cancer.
  • the first anthracycline anticancer drugs discovered were daunorubicin, followed by doxorubicin, followed by epirubicin, idarubicin, and pixantrone.
  • anthracycline anticancer agent examples include insertion of a DNA / RNA strand into the salt phase to inhibit DNA and RNA synthesis, inhibiting the replication of rapidly growing cancer cells, inhibiting the activity of the topoisomerase II enzyme, Inhibition of transcription and replication by inhibiting the relaxation of DNA strands, induction of damage to DNA, proteins and cell membranes through the formation of iron-mediated free oxygen radicals and DNA damage reactions, Martin is referring to the induction of histones. Recent studies have shown that doxorubicin increases the Th1 immune response by activating CD4 + cells (Park et al ., Int. Immunopharmacol .
  • dendritic cells have been reported to exhibit anticancer activity by inducing immunogenic cell death of osteosarcoma in combination with doxorubicin (Kawano et al ., Oncol. Lett . 11: 2169-2175, 2016).
  • taxanoid anticancer agent or " taxane anticancer drug " as used herein refers to diterpenoid taxane derivatives derived from Taxus sp. It is a mitotic inhibitor with a mechanism of promoting assembly and inhibiting disassembly.
  • paclitaxel and docetaxel are presently available. Among them, paclitaxel is a taxane-based chemotherapeutic agent extracted from juniper of Taxus brevifolia . It was approved by the US FDA in 1992 for the treatment of intractable ovarian cancer, Docetaxel is a taxane-based anticancer drug derived from Taxus baccata .
  • the taxane-based anticancer agent also has a mechanism of promoting immunological cell death of these cancer cells by sensitizing cancer cells to cytotoxic T lymphocytes.
  • immune checkpoint inhibitor refers to a type of drug that blocks certain types of immune system cells, such as T lymphocytes, and certain proteins produced by some cancer cells, And prevents T lymphocytes from killing cancer cells. Thus, when these proteins are blocked, the "braking device" of the immune system is released and T lymphocytes can kill cancer cells better.
  • PD-1 / PD-L1 and CTLA-4 / B7-1 / B7-2 are well known as the above-mentioned "Immune Check Point".
  • PD-1 inhibitors include Pembrolizumab (trademark: Keytruda), Nivolumab (trade name: Opdivo), PD-1 ligand PD-L1 inhibitors include Atezolizumab (trade name: Tecentriq) and Avelumab And Ipilimumab (trademark: Yervoy) have been approved by the FDA as CTLA-4 inhibitors that inhibit the interaction of CTLA-4 / B7-1 / B7-2. In recent years there has been an impressive success, especially in patients with metastatic melanoma or hodgkin lymphoma, and there are many possibilities in clinical trials in other types of cancer patients.
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a VSV-G mutant protein having histidine replaced with arginine, which is a 162nd amino acid, is introduced into the membrane.
  • Recombinant plasma membrane-based vesicles can be exosomes, extracellular vesicles or cell-derived nano-vesicles.
  • the recombinant protoplast-based ER is transformed into a mammalian cell which is transformed with a gene construct containing a polynucleotide encoding the VSV-G mutant protein and which overexpresses the VSV-G mutant protein, Lt; / RTI >
  • the recombinant protoplast-based vesicle may be obtained from cells transformed to express the VSV-G variant protein.
  • a method for producing a VSV-G mutant protein wherein a VSV-G mutant protein in which histidine is substituted with arginine as a 162th amino acid is introduced into the membrane, and one or more immunogenic cell death inducers A recombinant plasma membrane-based vesicle is provided.
  • Incorporation of the drug into the recombinant plasma membrane-based vesicle can be accomplished by culturing the genetically engineered cells to produce a recombinant plasma membrane-based vesicle in a drug-dissolved cell culture medium, and separating the isolated recombinant plasma membrane- (Kim et al ., Nanomedicine , 12 (3): 655-664, 2016).
  • the immunogenic proliferation inducer is dissolved in a solvent and the supernatant is treated with ultrasonic waves to reconstitute the plasma membrane-based endoplasmic reticulum.
  • the isolated plasma membrane-based vesicle may be mixed with the drug in an appropriate solvent or medium, followed by stirring for a suitable time (Sun et al ., Mol Ther . 18 (9): 1606-1614, 2010), or in the case of hydrophilic drugs such as nucleic acids, electroporation can be used to enter the plasma membrane-based endoplasmic reticulum.
  • the immunogenic cell death inducer may be an anthracycline anticancer agent, a taxane anticancer agent, an anti-EGFR antibody, a BK channel agonist, bortezomib, a cardiac glycoside, a cyclophosphamide anticancer agent, , GADD34 / PP1 inhibitor, LV-tSMAC, Measles virus, bleomycine, mitoxantrone or oxaliplatin, and cardiac glycosides may be combined with non-immunogenic cell death inducers
  • the GADD34 / PP1 inhibitor may be used in combination with mitomycin, and the anthracycline anticancer agent may be selected from the group consisting of daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, pixantrone, sabarubicin, or valrubicin, and the taxane-based anticancer agent may be selected from the group consisting of: It may
  • a pharmaceutical composition for the treatment of cancer comprising the recombinant plasma membrane-based vesicle as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising, as an active ingredient, a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a virus-derived membrane fusion protein is introduced into a membrane.
  • the virus-derived membrane fusion protein protein may be selected from the group consisting of a virus type VSV-G protein, a Gibraltar virus GALV.fus, an influenza virus hemagglutinin, a respiratory syncytial virus F protein, a human immunodeficiency virus gp120 Or gp41, flavivirus E protein, alphavirus E1 protein, baculovirus gp64, hepatitis C virus gp31 or gp70, measles virus H protein or F protein, or Ebola virus gp1 or gp2, and the VSV-G protein May be a wild-type VSV-G protein, or a pH-sensitive mutant VSV-G protein in which the 162th amino acid histidine is substituted with arginine.
  • composition may further comprise one or two or more anti-cancer compounds.
  • the anti-cancer compound may be an immunogenic cell death inducer or an immune checkpoint inhibitor, and the immunogenic cell death inducer may be an anthracycline-based anti-cancer agent, a taxane-based anti-cancer agent, an anti-EGFR antibody, A bacteriostatic agent, a channel agonist, bortezomib, a cardiac glycoside, a cyclophosphamide anticancer agent, a GADD34 / PP1 inhibitor, LV-tSMAC, Measles virus, bleomycin, mitoxantrone or oxaliplatin
  • the GADD34 / PP1 inhibitor may be used in combination with mitomycin, and the anthracycline-based anticancer drug may be used in combination with a non-immunogenic cell death inducer.
  • said anti-EGFR-antibody may be paclitaxel or docetaxel, wherein said anti-EGFR-antibody is selected from the group consisting of cetuximab (cetuximab).
  • the PD-1 / PD-L1 interaction inhibitor may be a PD-1 / PD-L1 interaction inhibitor or a CTLA-4 / B7-1 / B7-2 interaction inhibitor
  • B7-1 / B7-2 interaction inhibitor may be CTLA-4, B7-1 / B7-2 interaction inhibitor, or a functional fragment or single chain-based antibody analog of said antibody, wherein said CTLA-4 / 1 or B7-2, or a functional fragment or single chain-based antibody analog of said antibody
  • said antibody targeting PD-1 or PD-L1 is selected from the group consisting of Pembrolizumab, Nivolumab, Atezolizumab or Avelumab
  • the CTLA-4 / B7-1 / B7-2 interaction inhibitor may be Ipilimumab.
  • the single chain-based antibody analog may be a scFv, sdAb, diabody, or a fragment thereof.
  • the single chain-based antibody analog may be a Fab, F (ab ') 2 or Fab' , may be a mono-body (monobody), variable-lymphocyte receptor (variable lymphocyte receptor, VLR), Nanobodies (nanobody) or Camelidae antibody heavy chain fragment (V H H).
  • the anticancer compound may be encapsulated in the plasma membrane-based vesicle, may be formulated in a simple manner, may be separately packaged, mixed immediately before use, or administered at the same time or at a different time have.
  • the immune checkpoint inhibitor is an antibody, a functional fragment of an antibody, or a single chain-based antibody analogue, it may be encapsulated in the exosome, but may be simply administered in combination with the recombinant plasmid membrane-based endoplasmic reticulum of the present invention Based on the membrane surface of the recombinant plasmid-based vesicle.
  • the immune checkpoint inhibitor may be used as a recombinant plasmid- Based vesicle may be produced by transfecting a host cell with a gene encoding the viral envelope using the recombinant technology in the same manner as the viral membrane fusion protein of the present invention and expressing it on the membrane surface of the host cell. Secreted or germinated, or obtained by artificially processing cells.
  • the antibody, the functional fragment of the antibody, or the single chain-based antibody analog may be genetically recombined to have a separate membrane passage domain or anchoring domain for presentation on the cell membrane surface.
  • the transmembrane domain or membrane-anchoring domain it is also possible to use IgM or IgD, which is a membrane-bound form of the antibody that is not secreted in the first place.
  • the recombinant plasma membrane-based vesicle and the immunogenic apoptosis inducing agent may be provided in the form of a premixed composition, separately packaged, mixed immediately prior to use, administered separately or at separate time intervals ≪ / RTI >
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be various oral or parenteral formulations, but is preferably a parenteral formulation.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, .
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like.
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspending agent examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • the suppository base examples include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, It can have one formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • parenterally it can be administered through various routes such as intravenous injection, intranasal inhalation, intramuscular injection, intraperitoneal administration, percutaneous absorption .
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will vary depending on the species and severity, age, sex, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at a dose of 0.1 mg / kg to 1 g / kg, more preferably at a dose of 1 mg / kg to 500 mg / kg. On the other hand, the dose can be appropriately adjusted according to the age, sex and condition of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other anticancer agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional anticancer agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a VSV-G mutant protein having histidine replaced with arginine at 162nd amino acid is introduced
  • a recombinant plasma membrane-based vesicle into which a fusion membrane protein is introduced for the manufacture of a cancer therapeutic agent.
  • a method of treating cancer in an individual comprising administering to the individual having the cancer a recombinant plasma membrane-based ER or one or more of the above pharmaceutical compositions.
  • the subject may be a human or a non-human mammal.
  • the inventors of the present invention found that when the low pH fusion inducing mutant (H162R) of the VSV-G protein, which is a membrane fusion membrane protein, is introduced into the surface of the exosome and treated with cancer cells, membrane fusion is not induced under the general physiological condition (pH 7.4) The membrane fusion is triggered by the membrane fusion at pH 6.8, similar to the microenvironment of cancerous tissues.
  • VSV-G H162R mutant protein itself has a pathogen associated molecular pattern (PAMP) ),
  • PAMP pathogen associated molecular pattern
  • a recombinant exosome showing the VGV-G H162R mutant protein on the surface was prepared under the assumption that phagocytic phagocytosis and cross-prime ability of dendritic cells would be enhanced (see Fig. 1) 2a to 5b).
  • the recombinant exosomes prepared as described above induce membrane fusion of cancer cells selectively at pH 6.8 in the test of in vitro conditions (see FIGS. 6A to 7B), but do not induce cancer cell death to cancer cells themselves (Fig. 7C).
  • the recombinant exosome (mVSVG-Exo) according to one embodiment of the present invention promoted phagocytic action on various cancer cells (4T1-Luc, EL4-Ova and CT26.CL25) by macrophages and dendritic cells (See FIGS. 8A to 8C), confirming that VSVG is a phenomenon caused by acting as a TLR4 agonist (see FIG. 9), and administering it to an actual tumor model animal significantly inhibits the growth of cancer cells without side effects such as weight loss (See Figs. 10a to 11c), and it was confirmed by flow cytometry analysis that VSV-G protein was significantly expressed on the cell surface of tumor tissue extracted from an experimental animal (see Fig. 12).
  • the recombinant exosome of the present invention is a multifunctional anticancer agent exhibiting anticancer activity through various mechanisms.
  • the present inventors conducted various analyzes in order to investigate the anticancer mechanism of the recombinant plasma membrane-based ERK of the present invention.
  • the recombinant exosome according to one embodiment of the present invention increased cancer specific antigen expression of dendritic cells (Fig. 13a) not only promoted the maturation of dendritic cells (see Figs. 13b-13c), but also increased the infiltration of CD8 T cells into tumor tissues (Figs. 13d and 13e).
  • the recombinant exosome according to one embodiment of the present invention significantly improves the cross-sensitizing ability of dendritic cells in cancer tissues (see FIG. 14A), and this cancer-specific immune ability is induced by cancer- (FIG. 14 (b)).
  • the present inventors conducted an animal experiment using a nude mouse lacking T cell immunity to confirm whether the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention is dependent on T cell immunity. As a result, (Fig. 15A). When the drug dose was doubled, the anticancer effect was confirmed (Fig. 15B). However, in the animal experiment using BATF3 knockout mouse lacking CD103 and CD8 dendritic cells, which play an important role in T cell immunity, no anticancer activity is shown in the recombinant exosome administration group of the present invention, (Fig. 15D).
  • VSV-G protein itself can act as a TLR4 agonist, it can not induce virus-derived membrane fusion protein protein on cancer cell surface through fusion of cancer cell and recombinant exosome in cancer microenvironment.
  • wild type VSV-G protein And that the T cell specific immune response induced by the recombinant exosomes contained in the membrane was induced by the activation of phagocytes through binding to the TLR4 receptor of phagocytes.
  • membrane fusion protein proteins derived from viruses other than VSV-G protein can also exhibit similar effects to the wtVSVG exosomes or mVSVG exosomes used in the present invention. It has been reported that a viral membrane fusion protein derived from viruses such as the GALV.fus protein derived from the actual gibbale rheumemia virus promotes the anticancer effect of the oncolytic herpes simplex virus (Fu et al , Mol. Ther. 7 (6): 748-754, 2003).
  • a plasma membrane-based endoplasmic reticulum derived from cells such as extracellular vesicles and cell-derived nano-vesicles similar in structure to recombinant exosomes
  • the host cell is transformed to include the virus-derived membrane fusion membrane protein in the membrane and then prepared from the transformed host cell by a conventional method, that is, by recombinant DNA, the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention It is expected to exert its function.
  • the present inventors In order to prepare a recombinant exosome comprising the VSV-G H162R mutant protein, the present inventors firstly synthesized a H162R mutant protein in which histidine, which is an amino acid residue at the 162nd position of VSV-G (protein base No. 178 disclosed in GenBank No. CAC47944) was constructed.
  • plasmid DNA pCMV-VSV-G Envelope Vector, RV-110, Cell Biolabs, hereinafter referred to as 'VSV'
  • plasmid DNA containing a polynucleotide (SEQ ID NO: 2) encoding the wild type VSV- (5'-ATA TGC CCC ACT GTC CGC AAC TCT ACA ACC TGG-3 ') represented by SEQ ID NO: 3 as a template and the reverse primer (SEQ ID NO: 3'-TAT ACG GGG TGA CAG GCG TTG AGA TGT TGG ACC-5 ') (the bold code corresponds to arginine, the mutant amino acid).
  • the present inventors constructed a pCMV-VSV-G H162R plasmid vector (hereinafter, referred to as' VSV-G H162R Constructor (SEQ ID NO: 6)) into which the gene encoding the VSV-G H162R protein 2b) were transfected into HEK293T cells and cultured for 48 hours. Then, the cell culture was recovered and subjected to sequential centrifugation at 300 g for 10 minutes, 2,000 g for 10 minutes, and 10,000 g for 30 minutes. The cells were then filtered using a 0.2 ⁇ m filter, Ultrafiltration was performed to recover the pellet (Fig. 3).
  • VSV-G H162R Constructor SEQ ID NO: 6
  • VSV-G H162R mutant protein was detected in both the transfected HEK293T cells and the recombinant exosome obtained therefrom.
  • Figure 4 also shows the results of western blot analysis of the exosomal markers Alix, CD63 and TSGlOl. This means that the VSV-G H162R mutant protein is normally contained in an exosome derived from a cell transformed to express the VSV-G H162R mutant protein according to an embodiment of the present invention.
  • the particle size of the recombinant exosomes was measured using a dynamic light scattering (DLS) analyzer (Malvern zetasizer nano ZS, UK), and the particle size of the recombinant exosomes was measured by a transmission electron microscope (Fig. 5B).
  • DLS dynamic light scattering
  • Fig. 5B transmission electron microscope
  • the present inventors prepared a gene construct such that a wild-type VSV-G protein without mutation 162 was expressed, and then, using the method of Example 2, the recombinant exosome (wtVSVG-Exo).
  • the purified exosomes ( ⁇ 10 11 exosomes) are first mixed with DOX in 1 mL PBS for the application of doxorubicin (DOX), an immunogenic cell death inducer, to the recombinant exosome prepared in Example 2 above.
  • DOX doxorubicin
  • the DOX-recombinant exosomal mixture is then sonicated using a Model 505 Sonic Dismembrator with a 0.25 inch tip for 3 minutes with 20% amplitude, 30 seconds on / off and 2 minutes between cycles One rotation is performed for 6 rotations in total.
  • the Exo-DOX solution is incubated at 37 DEG C for 60 minutes to recover the exosomal membrane.
  • Excess free drug is removed by size exclusion chromatography using a NAP-10 Sephadex G25 column (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).
  • the present inventors have determined whether the recombinant exosome prepared in Example 2 is fused with cancer cells under actual in vitro conditions.
  • 5 ⁇ 10 5 cells of 4T1-Luc mouse breast cancer cell line, EL4-Ova lymphoma cell line, and CT26.CL25 colon cancer cell line were inoculated into 1 ml fusion buffer (1.8 mM NAH 2 PO 4 , 8.4 mM Na 2 HPO 4 or 10 mM HEPES, 10 mM MES, 2.5 mM NaCl, pH adjusted to 7.4, 6.8 or 5.5 with hydrochloric acid) and incubated with 50 ⁇ g mVSVG-Exo or wtVSVG-Exo (pCMV-exo prepared using wild type VSVG plasmid vector Mice) for 10 minutes at 37 ° C, washed with the culture medium and stabilized in the culture medium at 37 ° C for 1 hour.
  • 1 ml fusion buffer 1.8 mM NAH 2 PO 4 , 8.4 mM Na 2 HPO 4 or 10 mM HEPES, 10 mM MES, 2.5 mM NaCl, pH adjusted to
  • the pH of the fusion buffer was divided into groups of pH 7.4 or pH 6.8 or pH 5.5. Then, the extent of fusion of mVSVG-Exo or wtVSVG-Exo on cancer cell surface was evaluated by anti-VSVG antibody staining using a flow cytometer. As a result, it was confirmed that wtVSVG-Exo can be fused to the surface of cancer cell membrane only at pH 5.5 in all cancer cells, while mVSVG is able to edit cancer cell membrane surface at pH 5.5 as well as pH of tumor microenvironment. (Fig. 6A).
  • LDLR low-density lipoprotein receptor
  • LDLR was not expressed in normal bone marrow-derived macrophages, bone marrow-derived dendritic cells and splenocytes, but LDLR was expressed in cancer cells 4T1-Luc, EL4-Ova and CT26.CL25 This suggests that the mVSVG-Exo produced is targeted only to cancer cells to be fused (Fig. 6C).
  • the present inventors sought to confirm whether or not mVSVG-Exo promotes fusion of cancer cells after fusing to the surface of cancer cells. Specifically, 1 ⁇ 10 5 cells of breast cancer cell line 4T1-Luc, lymphoma cell line EL4-Ova, and colorectal cancer cell line CT26.CL25 were stained with Deep red 1 ⁇ M or Green CMFDA 1 ⁇ M, respectively, MVSVG-Exo was treated according to the method to perform fusion at pH 7.4 or pH 6.8. Thereafter, seeds were sown on a 35-pie culture plate, and after 24 hours, the degree of cancer cell fusion (Green CMFDA Signal, Deep red signal double positive cell) was analyzed by flow cytometry. As a result, as shown in FIGS.
  • mVSVG-Exo itself induces cancer cell death.
  • 4T1-Luc breast cancer cell line, EL4-Ova lymphoma cell line and CT26.CL25 colon cancer cell line were treated with mVSVG-Exo, control Exosomes (Con-Exo) or Fusion was performed by treating the buffer (treated only with fusion buffer without exosome) with pH 7.4 or pH 6.8 fusion buffer.
  • 5X10 3 cells were seeded in 96 well plate with normal medium and cell viability was measured 24 hours later by CCK analysis.
  • Fig. 7C there was no difference in cell viability in all experimental groups, suggesting that mVSVG-Exo does not directly induce cancer cell death.
  • the present inventors carried out phagocytosis analysis to confirm that the fusion exosome according to one embodiment of the present invention promotes phagocytosis of cancer cells by macrophages and dendritic cells.
  • the present inventors used 4T1-Luc as a breast cancer cell line, EL4-Ova as a lymphoma cell line, and CT26.CL25 5X10 5 as a colorectal cancer cell line as mVSVG-Exo, a control Exosome (Con-Exo ) Or buffer (treated only with fusion buffer without exosomes) with pH 7.4 or pH 6.8 fusion buffer.
  • mVSVG-Exo a control Exosome (Con-Exo ) Or buffer (treated only with fusion buffer without exosomes) with pH 7.4 or pH 6.8 fusion buffer.
  • pH rode SE 120 ng / ml.
  • Bone marrow derived macrophages and bone marrow derived dendritic cells stained with 1 mM Green CMFDA and cancer cells stained with pH rodo SE were co-cultured for 2 hours at a ratio of 1: 2.
  • the fusion exosome of the present invention exhibits anticancer activity based on multifunctional antitumor activity by promoting not only the fusion of cancer cells but also phagocytic action by macrophages and dendritic cells against cancer cells.
  • the VSV-G protein is known as a TLR4 agonist. Accordingly, the present inventors investigated whether the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention promotes dendritic cell maturation through the TLR4 pathway. Specifically, 1 x 10 6 cells of bone marrow-derived dendritic cells were seeded in a 6-well culture dish and treated with 500 ng of mVSVG-Exo or 500 ng of Con-Exo for 24 hours. Cells were then detached, centrifuged, stained with anti-CD40 antibody and anti-CD86 antibody reflecting dendritic cell maturation, and maturation of dendritic cells was assessed by flow cytometry. As shown in FIG. 9, mVSVG-Exo increased the expression of CD40 and CD86 in dendritic cells, indicating that mVSVG-Exo could promote dendritic cell maturation.
  • the present inventors induced cancer development by subcutaneously inoculating EL4-Ova cancer cells 1 ⁇ 10 6 cells on the left side of the C57BL / 6 wild type mouse (day 0), and then on day 6 and 7 day after inoculation of cancer cells, 100 ⁇ g of wtVSVG- 100 ⁇ g of mVSVG-Exo, 100 ⁇ g of Con-Exo, or PBS was injected into the tumor using an injection.
  • the cancer size and the weight of the experimental animals were measured at intervals of 3 days (FIGS. 11A and 11C).
  • the mice were sacrificed to remove the cancer tissues and the cancer tissues were weighed (FIG.
  • the VSVG protein in the exosomal membrane of the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention is transferred to the cancer cell membrane by fusion of the cancer cell and the recombinant exosome in the tumor microenvironment This is to prove that it is caused.
  • the present inventors investigated whether the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention exhibited anticancer activity by activating the function of dendritic cells.
  • C57BL / 6 wild-type mice were subcutaneously injected with EL4-Ova cancer cells 1x10 6 cells to the left, and cancer cells were induced on the 6th day after the injection of cancer cells (day 0 of cancer cell injection) 100 ⁇ g of mVSVG-Exo, 100 ⁇ g of Con-Exo, or PBS was administered into the tumor. Mice were sacrificed on the 18th day after the injection of the cancer cells to exclude cancer tissues and tumor drainage lymph nodes.
  • a monoclonal tumor-derived lymph node was stained with MHC-1 as an anti-CD11c antibody which is a marker of dendritic cells and ovalbumin which is a cancer-specific antigen
  • the cells were stained with anti-H2Kb-Ova antibody and analyzed by flow cytometry (Fig. 13A).
  • Fig. 13A As a result, as shown in Fig. 13A, the mVSVG-Exo treatment group showed the best cancer-specific antigen expression level of dendritic cells.
  • the cancer tissues extracted from the experimental animal of Experimental Example 7-1 were embedded in an OCT compound, frozen and frozen flakes were prepared, stained with anti-CD8 antibody, and then stained with CD8 T cell infiltration (Figs. 13d and 13e).
  • mVSVG-Exo group showed the best CD8 T cell infiltration rate.
  • the CD8 T cell infiltration-promoting activity of the recombinant exosome according to one embodiment of the present invention is not limited to the function of the VSVG itself, And the effect of fusion with cancer cells.
  • the present inventors have investigated whether the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention is capable of crossing CD8 T cells. Specifically, 1 ⁇ 10 6 cells of EL4-Ova were subcutaneously injected into the left side of C57BL / 6 wild-type mice to induce cancer. On the 6th day after the injection of cancer cells (day 0 of cancer cell injection) 100 ⁇ g of Exo, 100 ⁇ g of mVSVG-Exo, 100 ⁇ g of Con-Exo, and PBS were injected into the tumor using an injection. On the 18th day after the injection of cancer cells, mice were sacrificed and tumor tissues and spleen tissues were extracted.
  • dendritic cells CD11c-positive cells
  • macrophages F4 / 80 cells
  • OT-1 CD8 T cells were then isolated from the spleen of OT-1 transgenic mice bearing OT-1 CD8 T cells capable of recognizing ovalbumin loaded on MHC1 using a CD8 T cell column, Separated dendritic cells or macrophages and OT-1 CD8 T cells were co-cultured in a 1: 5 ratio for 3 days in a culture medium. Three days later, the medium was recovered and ELISA analysis using anti-IFN-?
  • the present inventors investigated whether recombinant exosome according to one embodiment of the present invention can memorize cancer antigen and trigger a cancer-specific immune response when the same cancer recurs after completion of cancer treatment.
  • the spleen tissue from the experimental animal of Experimental Example 7-3 was monocytosed, and 5 ⁇ 10 6 cells were inoculated in a 12-well culture dish together with 1 ml of the culture medium.
  • the medium was recovered and ELISA analysis was performed using anti-IFN-? Antibody for each group to analyze the expression level of IFN-y in the medium (Fig. 14B).
  • Fig. 14B significant cancer antigen-specific immune responses were increased in the wtVSVG-Exo group and the mVSVG-Exo treated group, and in particular, the cancer antigen-specific immune response was most excellent in the mVSVG-Exo treated group.
  • the present inventors intend to investigate what immune cells depend on the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention.
  • EL4-Ova cancer cells (1 ⁇ 10 6 cells) were injected subcutaneously into the left side of the nude mouse to induce cancer, in order to confirm whether anticancer effects due to hyperactivity of phagocytic cells could be exhibited in nude mice lacking T cell immunity.
  • day 6 post-injection day 0 of cancer cell injection
  • mVSVG-Exo 100 ⁇ g Con-Exo 100 ⁇ g or PBS was injected into the tumor using an injection.
  • the size of the cancer was measured at intervals of 3 days, and the mice were sacrificed on the 18th day after the injection of the cancer cells, and the cancer tissues were extracted and weighed (FIG. 15A).
  • FIG. 15A it was confirmed that the antitumor effect of mVSVG-Exo in C57BL / 6 mice in which T cells were present disappeared in nude mice.
  • the recombinant exo- The anticancer effect of moxa is dependent on T cell immunity.
  • T sikyeotgo cells by the immune subcutaneous injection of EL4-Ova tumor cells 1x10 6 cell to determine whether the anti-cancer effect may result in enhancing phagocytosis of macrophages in the absence nude mice, etc.
  • mVSVG-Exo In order to confirm whether the effect of mVSVG-Exo on T cells of any T cell immune system was dependent on the effect of T cells, 1x10 6 EL4-Ova cancer cells were injected into the left side of C57BL / 6 wild type mice to induce cancer , MVSVG-Exo 100 ⁇ g, Con-Exo 100 ⁇ g, or PBS was injected into the tumor on the 7th day after the injection of the cancer cells (day 0 of the cancer cell injection). Subsequently, anti-CD8 neutralizing antibody was intraperitoneally administered at 150 ⁇ g every 3 days from the day before the injection of the cancer cells to remove CD8 T cells.
  • FIG. 15C The cancer size was measured at intervals of 3 days, and the mice were sacrificed on the 18th day after the cancer cells were injected, and cancer tissues were extracted and weighed (FIG. 15C).
  • Fig. 15C it was confirmed that the anti-cancer effect of mVSVG-Exo in C57BL / 6 mice in which T cell immunity was preserved disappeared in mice lacking CD8 T cells. This suggests that the mVSVG-Exo anti-cancer effect is dependent on CD8 T cell immunity.
  • the present inventors induced cancer by the CD103 and CD8 dendritic cells to perform a most important role lacking BATF3 four subcutaneous injection of 1x10 6 cell the EL4-Ova tumor cells or the like left in-out mouse in forming the T cell immunity,
  • 100 ⁇ g of mVSVG-Exo, 100 ⁇ g of Con-Exo or PBS was injected into the tumor by injection.
  • the size of the cancer was measured at intervals of 3 days, and the mice were sacrificed on the 18th day after the injection of the cancer cells, and the cancer tissues were extracted and weighed (FIG. 15d). As a result, as shown in FIG.
  • the recombinant exosome comprising the VSV-G H162R mutant protein promotes a specific anti-cancer immunity effect under the pH condition of the microenvironment of cancer tissue.
  • the antitumor effect of the recombinant exosome including the VSV-G H162R mutant protein is achieved without the help of other anticancer agents, and a synergistic effect is expected to be remarkably enhanced when the other anticancer agents, especially immunogenicity cell death inducing agents, are encapsulated or combined therewith.
  • the recombinant exosome when the anticancer agent is incorporated into the recombinant exosome according to an embodiment of the present invention, which is a membrane structure, the recombinant exosome can transfer the anticancer drug implanted into the inside of the cancer cell through specific fusion to cancer cells, Has the advantage of minimizing side effects that may occur by acting on normal cells.
  • the recombinant plasmid-based ER containing the recombinant exo somal according to an embodiment of the present invention has not only anticancer activity itself but also anticancer activity is anticipated through the combination with other anticancer drugs, so that side effects are minimized But it can be very useful for the development of new anticancer drugs showing strong effects.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 2 is a nucleic acid sequence of a polynucleotide encoding the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 3 is the nucleic acid sequence of the forward primer used to clone the polynucleotide encoding the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 4 is the nucleic acid sequence of the reverse primer used to clone the polynucleotide encoding the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the H162R mutant VSV-G protein according to one embodiment of the present invention.
  • SEQ ID NO: 6 is a nucleic acid sequence of a polynucleotide encoding the H162R mutant VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence around histidine which is the 162nd amino acid of the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence around arginine, the 162nd amino acid of the H162R mutant VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 9 is a nucleic acid sequence of a polynucleotide encoding a peptide around histidine which is the 162nd amino acid of the wild-type VSV-G protein.
  • SEQ ID NO: 10 is a nucleic acid sequence of a polynucleotide encoding a peptide around arginine which is the 162nd amino acid of the H162R mutant VSV-G protein.

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Abstract

본 발명은 재조합 원형질막-기반 소포체에 관한 것으로서, 더 상세하게는 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질을 포함하는 재조합 원형질막-기반 소포체 및 상기 재조합 원형질막-기반 소포체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체
본 발명은 신규 재조합 원형질막-기반 소포체에 관한 것으로서 보다 구체적으로는 암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체에 관한 것이다.
암은 신체의 다른 부위로 침투 및 전이의 잠재성을 가진 비정상적인 세포성장과 관련된 일군의 질환을 의미한다. 2015년 현재 전 세계적으로 9천만명 이상의 암환자가 존재하는 것으로 알려지고 있고, 매년 1천4백만명 정도의 신규 암환자가 발생하고 있다. 암은 인간 사망 원인의 15.7%를 차지하며, 가장 빈발하는 암은 남성의 경우 폐암, 전립선암, 대장암 및 위암이고, 여성의 경우 유방암, 대장암, 폐암 및 자궁경부암이다.
암을 치료하기 위해서, 다양한 항암제를 이용한 화학요법, 방사선 조사를 통한 방사선요법, 암과 관련된 특정 생체 내 분자를 표적으로 하는 항체요법 등 다양한 치료적 접근법이 시도되고 있으나, 화학요법제에 사용되는 항암제나 방사선조사의 경우 정상세포에도 영향을 주기 때문에 부작용이 심각하며, 암세포가 항암제에 대한 내성을 획득하여, 치료에 실패하거나 재발하는 경우가 빈번하다.
최근 우리 몸의 면역 체계를 이용한 항암 면역 치료가 임상에서 놀라운 효과를 보이고 있지만, 암의 복잡성으로 인해 평균 약 30% 미만의 환자에서만 효과를 보인다는 한계점이 있다. 이는 암세포가 우리 몸의 면역세포에 의해 "self"로 인식되기 때문인데, 따라서 암세포를 면역세포로 하여금 "non-self"로 인식시켜, 암세포의 탐식을 유도하고, 나아가 증폭된 면역반응을 일으키는 것이 중요하다.
엑소좀(exosome)은 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재하는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀의 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비되거나, 세포막으로부터 직접 출아(budding)된다. 엑소좀은 응고, 세포 간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다. 엑소좀은 인체의 세포 자신과 유사한 조성을 가지고 있다는 점에서 비면역원성이라는 점에서, 리포좀이나 폴리머계열의 나노입자와 비교하여 약물전달체로서 중요한 장점을 가지고 있다(Ha et al., Acta Pharm. Sin. B. 6(4): 287-296, 2016). 이와 관련하여, 엑소좀을 이용하여 독소루비신과 같은 항암제를 종양조직에 전달하거나(Tian et al., Biomaterials. 35:2383-2390, 2014), 파클리탁셀 및 독소루비신을 혈뇌장벽을 통과하여 뇌에 전달하거나(Yang et al., Pharm. Res. 32:2003-2014, 2015), 파킨슨병을 치료하기 위해 카탈레이즈(catalase)를 혈뇌장벽을 통과하여 전달하거나(Haney et al., J. Control Release. 207: 18-30, 2015), 암을 치료하기 위해 특정 유전자에 특이적인 siRNA를 전달하는(Shtam et al., Cell Commun. Signal. 11: 88, 2013) 등의 다양한 시도들이 있어 왔다.
세포외 소포(extracellular vesicle)는 세포에서 세포외 환경으로 방출 또는 분비되는 다양한 기능의 단백질, RNA와 같은 핵산분자 또는 지질 등의 다양한 생체 분자가 이것이 유래된 세포의 세포막과 동일한 지질 이중층의 세포막으로 봉입된 입자 형태의 구조체를 의미한다. 세포외 소포체는 통상 30 내지 100 nm의 크기를 갖는 엑소좀보다 더 큰 100 nm 내지 1 μm의 평균 직경을 갖는 원형질막-기반의 소포체를 의미한다.
세포-유래 나노베지클(cell-derived nanovesicle)은 세포를 미세유체 채널을 통과시키는 압출공정, 다단계 여과공정 등의 인위적인 방법을 통해 형성되는 나노크기의 세포막 성분인 원형질막에 의해 둘러싸인 나노 크기의 소포체로서 세포에 의해 분비가 되어 자연적으로 생성되는 엑소좀이나 세포외 소포와 구분되는 원형질막-기반의 소포체를 의미한다.
한편, VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein)은 수포성 구내염바이러스(vesicular stomatitis virus)의 바이러스 입자(virion) 막에 존재하는 유일한 바이러스 당단백질로 바이러스의 표적세포로의 부착 및 융합단백질로 작용한다. 상기 VSV-G 단백질은 두 개의 N-연결 글리칸을 포함하는 막 통과 단백질로, 다른 바이러스 단백질이 존재하지 않을 경우 저-pH-의존적인 방식으로 막 융합을 개시할 수 있다. VSV-G 단백질은 DNA 등 핵산분자와 복합체를 형성하기 때문에 직접적인 유전자 전달용 담체로 사용되거나, 보다 안정적이고 고역가의 위형(pseudotyped) 생쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV)-기반 레트로바이러스 및 렌티바이러스-기반 벡터를 생산함으로써 유전자 치료에 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나, 최근에 유전자 외에 다양한 단백질을 표적세포로 전달하는 용도로 이용가능성이 제시된 바 있다(Mangeot et al., Mol. Ther. 19(9): 1656-1666, 2011).
상기 VSV-G 단백질의 구조 및 기능에 대한 연구결과, 신호서열이 제거된 성숙 단백질 기준으로 60번째, 162번째 및 407번째 아미노산 잔기인 히스티딘이 클러스터를 형성하여 pH 센서로 작용함이 규명된 바 있고(Roche et al., Science, 313: 187-191, 2006; Roche et al., Science, 315: 843-848, 2007), 최근에는 그 중 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 변이될 경우(H162R), 암세포를 둘러싼 생리학적 pH인 pH 6.8에서 막융합을 유발하여, VSV-G 변이체(H162R)를 발현하는 신경줄기세포 투여 시 암세포의 사멸이 촉진된다고 보고된 바 있다(Zhu et al., Mol. Ther. 21(8): 1492-1497, 2013).
그러나, 상기 선행기술에 개시된 방법은 신경줄기세포의 수급이 어렵다는 점, 그리고 암세포 살멸 효과가 그리 크지 않다는 점에서 실제 임상에 적용하기엔 어려운 기술이다.
본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 항암제 없이도 자체적으로 암세포를 효율적으로 사멸시키면서, 암 미세환경 외의 조건에서는 작동하지 않는 안전한 항암치료용 재조합 원형질막-기반 소포체을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 암세포를 면역세포로 하여금 "적"으로 인식하게 할 수 있도록 "xenogenization"시킬 수 있는 재조합 원형질막-기반 소포체를 제공하고자 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle)이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학적 조성물이 제공된다.
아울러 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 바이러스 유래 막융합 막단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle) 또는 막에 바이러스 유래 막융합 막단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체의 암 치료제 제조로의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 원형질막-기반 소포체 또는 상기 중 어느 하나 이상의 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 유전자의 전달과 같은 복잡한 기전에 의하지 않고도 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 암세포 미세환경(pH 6.8)에서 항암면역효과를 유도하는 본 발명의 일 실시예에 따른 변이체 VSV-G H162R(이하, 'mVSV-G'로 약칭함)를 포함하는 재조합 엑소좀의 작용기전을 개략적으로 설명하는 개요도이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 엑소좀을 생산하기 위한 플라스미드 DNA의 개략적인 구조를 나타내는 플라스미드 맵이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀을 생산하기 야생형 VSV-G 및 돌연변이형 VSV-G 단백질의 162번 위치의 변이를 나타내는 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산서열을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀의 생산과정을 나타내는 공정도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀 및 상기 재조합 엑소좀을 생산하도록 mVSV-G 유전자 컨스트럭트로 형질 감염된 세포 추출물에 대한 웨스턴 블랏 분석결과이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀을 투과 전자현미경으로 촬영한 사진이고, 도 5b는 상기 재조합 엑소좀의 입도를 동적 광산란분석으로 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSVG-Exo를 세 종류의 암세포(4T1-Luc, EL4-Ova, 및 CT26.CL25)에 처리시 pH 변화에 따른 암세포와의 막융합 정도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이고(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001). 도 6b는 일 실시예에 따른 mVSVG-Exo를 4T1-Luc 세포에 처리시 pH 변화에 따른 암세포와의 막융합 여부를 항-VSV-G 항체 및 항-Cadherin 항체(초록)를 이용하여 염색한 후 형광 현미경 촬영을 한 사진이며, 도 6c는 세 종류의 암세포(4T1-Luc, EL4-Ova, 및 CT26.CL25)를 포함한 다양한 세포 표면에서 VSV-G의 수용체로 알려진 LDLR(low density lipoprotein receptor)의 발현 여부를 웨스턴 블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G-Exo가 pH의 변화에 따라 세 종류의 암세포(4T1-Luc, EL4-Ova, 및 CT26.CL25) 표면에 융합된 후 암세포끼리의 융합을 촉진하는지 여부를 관찰하기 위한 유세포분석 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 7b는 상기 도 7a의 결과를 정량적으로 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G-Exo가 직접 암세포들(4T1-Luc, EL4-Ova, 및 CT26.CL25)의 사멸을 유도하는지 확인하기 위한 세포 생존성 분석 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01).
도 8a은 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀 및 대조 엑소좀(Con-Exo)의 4T1-Luc 유방암 세포에 대한 대식세포 및 수지상세포에 의한 식세포 작용에 미치는 영향을 분석한 형광현미경 촬영 분석후 결과를 정량화한 그래프이고, 도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀 및 대조 엑소좀(Con-Exo)의 EL4-Ova 림포마 세포에 대한 대식세포 및 수지상세포에 의한 식세포 작용에 미치는 영향을 분석한 형광현미경 촬영 분석후 결과를 정량화한 그래프이며, 도 8c는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀 및 대조 엑소좀(Con-Exo)의 CT46.CL25 대장암 세포에 대한 대식세포 및 수지상세포에 의한 식세포 작용에 미치는 영향을 분석한 형광현미경 촬영 분석후 결과를 정량화한 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001).
도 9는 VSVG가 TLR4 작용제(agonist)로 작동하여 수지상 세포의 기능을 활성화할 수 있는지 조사하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo) 및 대조군 엑소좀(Con-Exo)을 각각 골수유래 수지상 세포에 처리한 후 상기 골수유래 수지상 세포에서의 CD40(좌측) 및 CD86(우측)의 상대적 발현비율의 변화를 기록한 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01).
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(200 μg)을 투여한 4T1-Luc 유방암 종양 모델 동물(Balb/c, 7주령 자성 마우스)에서의 시간의 경과에 따른 암세포의 크기를 비교한 그래프이고(사각형은 대조군, 원형은 mVSV-G를 포함하지 않는 대조군 엑소좀, 삼각형은 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀), 도 10b는 도 10a에서 암세포 주입 후 16일 경과 후 실험동물을 희생하여 적출된 암조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 10c는 실험에 사용된 동물의 몸무게의 변화를 나타낸 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001).
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(200 μg)을 투여한 EL4-Ova 림포마 종양 모델 동물(C57BL/6, 7주령 자성 마우스)에서의 시간의 경과에 따른 암세포의 크기를 비교한 그래프이고(사각형은 대조군, 원형은 mVSV-G를 포함하지 않는 대조군 엑소좀, 삼각형은 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀), 도 11b는 도 11a에서 암세포 주입 후 16일 경과 후 실험동물을 희생하여 적출된 암조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 11c는 실험에 사용된 동물의 몸무게의 변화를 나타낸 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 야생형 VSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(wtVSVG-Exo), 대조군 엑소좀(Con-Exo) 및 대조군으로 PBS를 종양모델 동물(EL4-Ova-주입 C57BL/6 마우스)의 암조직 내로 투여 후 적출된 암조직을 단일세포화한 후 항-VSV-G 항체로 염색 후 유세포 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001).
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 야생형 VSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(wtVSVG-Exo), 대조군 엑소좀(Con-Exo) 및 대조군으로 PBS를 종양모델 동물(EL4-Ova-주입 C57BL/6 마우스)의 암조직 내로 투여 후 적출된 종양 배액 림프절을 단일세포화한 후 수지상 세포 마커인 항-CD11c 항체와 항-H2kb-Ova 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 13b는 상기 적출된 종양 배액 림프절을 단일세포화한 후 항-CD11c 항체와 항-CD40 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 13c는 상기 적출된 종양 배액 림프절을 단일세포화한 후 항-CD11c 항체와 항-CD86 항체를 이용하여 유세포 분석한 결과를 나타내는 그래프이고(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001), 도 13d는 종양조직 박편을 항-CD8 항체로 염색한 후 형광현미경을 이용하여 종양조직 내의 CD8 T 세포의 침윤정도를 분석한 결과를 나타내는 일련의 사진이며, 도 13e는 상기 도 13d에서 CD8 T 세포의 암조직내 침윤정도를 정량화한 결과를 나타내는 그래프이다(***: P < 0.001).
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 야생형 VSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(wtVSVG-Exo), 대조군 엑소좀(Con-Exo) 및 대조군으로 PBS를 종양모델 동물(EL4-Ova-주입 C57BL/6 마우스)의 암조직 내로 투여 후 적출된 종양조직에서 CD11c 양성 수지상 세포와 F4/80 양성 대식세포를 분리한 후, OT-1 형질전환 마우스 비장에서 분리된 OT-1 CD8 T 세포와 각각 1:5의 비율로 공배양 한 후, 배양배지의 INF-γ 발현정도를 ELISA 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 14b는 상기 실험동물에서 적출된 비장조직을 단일세포화한 비장세포에 대조군으로 PBS 및 암 특이적 항원인 난알부민 10 μg/ml로 24시간 동안 처리한 후, 배양배지의 INF-γ 발현정도를 ELISA 분석을 통해 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001).
도 15a 및 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 대조군 엑소좀(Con-Exo) 및 대조군으로 PBS를 EL4-Ova 암세포를 피하주입하여 암을 유발한 누드마우스의 종양조직 내로 투여후 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 암세포 주입 후 17일째 마우스를 희생시키고 적출한 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프(우측)로 도 15a는 저용량(100 μg 두 차례) 투여에 따른 실험 결과를 나타내고, 도 15b는 동일 모델을 이용하여 고용량(100 μg 네 차례) 투여에 따른 실험결과를 나타내며, 도 15c는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo)을 항-CD8 항체를 암세포 주입 하루전부터 3일 간격으로 복강투여시키고 EL4-Ova 암세포를 피하주입하여 암을 유발한 C57BL/6 마우스의 종양조직 내로 투여후 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 암세포 주입 후 18일째 마우스를 희생시키고 적출한 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프(우측)로, 대조항체로는 재조합 IgG를 사용하였다(***: P < 0.001).도 15d는 본 발명의 일 실시예에 따른 mVSV-G를 포함하는 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 대조군 엑소좀(Con-Exo) 및 대조군으로 PBS를 EL4-Ova 암세포를 피하주입하여 암을 유발한 BATF3 KO 마우스(CD103 및 CD8이 결핍됨)의 종양조직 내로 투여후 시간의 경과에 따른 종양조직의 부피를 측정한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 암세포 주입 후 17일째 마우스를 희생시키고 적출한 종양조직의 무게를 측정한 결과를 나타내는 그래프(우측)이다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 용어 "막융합 막단백질(fusogenic membrane protein)"은 바이러스 유래의 막단백질로서 바이러스가 숙주 세포로 침투하기 위해 숙주 세포로의 부착 및 막융합을 유발하는데 있어서 핵심적인 역할을 수행하는 단백질을 의미한다. 대표적인 예로는 수포성 구내염 바이러스 유래의 외피 당단백질(VSV-G)가 존재한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "수포성 구내염 바이러스의 외피 당단백질(VSV-G 단백질)"은 수포성 구내염바이러스의 바이러스 입자(virion) 막에 존재하는 유일한 바이러스 당단백질로 바이러스의 표적세포로의 부착 및 융합단백질로 작용한다. 상기 VSV-G 단백질은 두 개의 N-연결 글리칸을 포함하는 막 통과 단백질로, 다른 바이러스 단백질이 존재하지 않을 경우 저-pH-의존적인 방식으로 막 융합을 개시할 수 있다. VSV-G 단백질은 DNA 등 핵산분자와 복합체를 형성하기 때문에 직접적인 유전자 전달용 담체로 사용되거나, 보다 안정적이고 고역가의 위형(pseudotyped) 생쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV)-기반 레트로바이러스 및 렌티바이러스-기반 벡터를 생산함으로써 유전자 치료에 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나, 최근에 유전자 외에 다양한 단백질을 표적세포로 전달하는 용도로 이용가능성이 제시된 바 있다(Mangeot et al., Mol. Ther. 19(9): 1656-1666, 2011).
본 문서에서 사용되는 "원형질막-기반 소포체(plasam membrane-based vesicle)"는 세포에서 유래한 세포막으로 둘러싸인 나노 크기의 소포체(vesicle)을 의미하며, 세포로부터 분비 또는 출아에 의해 생성되는 엑소좀, 세포외 소포 또는 세포를 압출 등 인위적인 방법을 이용하여 가공하여 제조되는 세포-유래 나노베지클 등이 여기에 포함된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재하는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀의 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포 간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "재조합 엑소좀(recombinant exosome)"은 인위적으로 생산된 엑소좀을 의미하며, 엑소좀을 생산할 수 있는 숙주세포(host cell)에 유전자공학(genetic engineering)의해 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 형질 도입하여 형질전환 숙주세포를 제조한 후 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 후 그 배양액으로부터 수득된 엑소좀이다. 상기 재조합 엑소좀에는 형질도입된 외래 단백질이 내부 또는 엑소좀 막에 포함되어 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포외 소포(extracellular vesicle)"는 세포에서 세포외 환경으로 방출 또는 분비되는 다양한 기능의 단백질, RNA와 같은 핵산분자 또는 지질 등의 다양한 생체 분자가 이것이 유래된 세포의 세포막과 동일한 지질 이중층의 세포막으로 봉입된 입자 형태의 구조체를 의미한다. 세포외 소포체는 통상 30 내지 100 nm의 크기를 갖는 엑소좀보다 더 큰 100 nm 내지 1 μm의 평균 직경을 갖는 원형질막-기반의 소포체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "세포-유래 나노베지클(cell-derived nanovesicle)"은 세포를 미세유체 채널을 통과시키는 압출공정, 다단계 여과공정 등의 인위적인 방법을 통해 형성되는 나노크기의 세포막 성분인 원형질막에 의해 둘러싸인 나노 크기의 소포체로서 세포에 의해 분비가 되어 자연적으로 생성되는 엑소좀이나 세포외 소포와 구분되는 원형질막-기반의 소포체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역원성 세포사멸(immunogenic cell death)"는 안트라사이클린(anthracyclines), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 보르테조밉(bortezomib)과 같은 세포증식 억제제나 방사선 요법 및 광역학 치료법에 의해 야기되는 일종의 세포사멸을 의미한다. 상기 면역원성 세포사멸은 일반적인 세포사멸과 달리, 암세포의 면역학적 세포사멸은 수지상세포(dendritic cell)의 활성화와 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 면역원성 세포사멸을 유발하는 물질을 "면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)"라고 한다. 상기 면역원성 세포사멸 및 면역원성 세포사멸 유도제에 대하여는 Kroemer 등(Annu. Rev. Immunol., 31: 51-72, 2013)에 잘 정리되어 있다. 상기 문헌은 전체적으로 본 문서에 참조로 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "안트라사이클린 계열 항암제(anthracyclin-type anticancer agent)"는 스트렙토마이세스 속 세균인 Streptomyces peucetius var. caesius 유래의 암 화학요법에 사용되는 세포주기 비특이적인 항암제 계열을 지칭한다. 안트라사이클린 계열 항암제는 백혈병, 림프종, 유방암, 위암, 자궁암, 난소암, 방광암, 및 폐암을 포함한 다양한 암의 치료에 사용되는데, 종래에 개발되어온 화학요법 항암제 중 가장 효과적인 항암제 중의 하나이다. 최초로 발견된 안트라사이클린계열 항암제로는 다우노루비신(daunorubicin)이 있고, 바로 이어 개발된 독소루비신(doxorubicin), 그 뒤로 개발된 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin) 등이 존재한다. 안트라사이클린 계열 항암제의 작용기전으로는 DNA/RNA 가닥의 염기상 사이에 삽입됨으로써 DNA 및 RNA 합성을 억제하여 신속히 성장하는 암세포의 복제를 방해하는 것, 토포아이소머레이즈 II 효소 활성을 억제하여 슈퍼코일화 DNA의 긴장완화를 억제하여 전사와 복제를 방해하는 것, 철-매개 유리 산소 라디컬의 형성을 통한 DNA, 단백질 및 세포막의 손상 유도 및 DNA 손상 반응, 에피게놈 및 전사체를 탈조절하는 크로마틴으로부터 히스톤 축출 유도 등이 거론되고 있다. 최근 연구에 따르면 독소루비신이 CD4+ 세포를 활성화시킴으로써 Th1 면역반응을 증가시킨다고 보고된 바 있고(Park et al., Int. Immunopharmacol. 9(13-14): 1530-1539, 2009), 수지상세포(dendritic cell)와 독소루비신의 병용투여시 골육종의 면역학적 세포사멸(immunogenic cell death)을 유발함으로써 항암활성을 나타낸다고 보고된 바 있다(Kawano et al., Oncol. Lett. 11:2169-2175, 2016).
본 문서에서 사용되는 용어 "탁산계열 항암제(taxanoid anticancer agent 또는 taxne anticancer drug)"는 주목속(Taxus sp.) 식물로부터 추출된 디테르페노이드 탁산 유도체(diterpenoid taxane derivatives)로, 세포내의 마이크로튜블의 조립을 증진시키고 해체를 저해하는 기전을 가진 유사분열 억제제이다. 현재 상용화된 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel) 등이 존재하며, 이중 파클리탁셀은 주목(Taxus brevifolia)의 주피에서 추출한 탁산계열 항암제로 1992년 난치성 난소암 치료제로 미국 FDA의 승인을 받았고, 도세탁셀은 Taxus baccata에서 유래된 탁산계열 항암제로서 파클리탁셀과 효능이 유사하며, 유방암, 비세포폐암, 림프종, 방광암 등의 치료에 사용되고 있으며, 파클리탁셀에 비해 친수성이 높은 특성을 가지고 있다. 최근에는 탁산계열 항암제 역시 암세포를 세포독성 T 림프구에 대하여 감작시킴으로써 이들 암세포의 면역원성 세포사멸을 촉진시키는 기전을 갖는 것으로 밝혀지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 림프구와 같은 특정 유형의 면역계 세포 및 일부 암세포에 의해 생산된 특정 단백질을 차단하는 유형의 약물을 의미하는데 이들 단백질들은 면역반응을 억제하고, T 림프구가 암세포를 살상하는 것을 방지한다. 따라서 이러한 단백질이 차단되면 면역계의 "제동장치"가 풀어지고 T 림프구가 암세포를 더 잘 죽일 수 있다. 상기 "면역 검문소"로 현재까지 잘 알려진 것은 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2 등이 존재한다. PD-1 저해제로는 Pembrolizumab(상표명: Keytruda), Nivolumab(상표명: Opdivo) 등이 존재하고, PD-1의 리간드인 PD-L1 저해제로는 Atezolizumab(상표명: Tecentriq), 및 Avelumab(상표명: Bavencio) 등이 존재한다.한편 CTLA-4/B7-1/B7-2의 상호작용을 저해하는 CTLA-4 저해제로는 Ipilimumab(상표명: Yervoy) 등이 FDA의 승인을 받은 바 있다. 최근 몇 년 동안 특히 전이성 흑색종(metastatic melanoma) 또는 호지킨 림프종(hodgkin lymphoma) 환자에게서 인상적인 성공을 거두었으며 다른 유형의 암 환자를 대상으로 한 임상시험에서 많은 가능성을 보여주고 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle)이 제공된다.
재조합 원형질막-기반 소포체는 엑소좀, 세포외 소포 또는 세포-유래 나노베지클일 수 있다.
상기 재조합 원형질막-기반 소포체는 상기 VSV-G 변이체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질 전환되어 상기 VSV-G 변이체 단백질을 과발현하는 포유동물 세포 바람직하게는 인간 세포로부터 분리·정제된 것일 수 있다.
상기 재조합 원형질막-기반 소포체는 상기 VSV-G 변이체 단백질이 발현되도록 형질 전환된 세포로부터 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입되고 내부에 하나 또는 둘 이상의 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)가 함입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle)가 제공된다.
상기 재조합 원형질막-기반 소포체로의 약물의 함입은 약물이 용해된 세포배양 배지 내에서 재조합 원형질막-기반 소포체를 생산하도록 유전자 조작된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있고, 분리된 재조합 원형질막-기반 소포체를 상기 면역원성 세포사멸 유도제가 용해된 용매에 넣고 초음파를 처리하여 원형질막-기반 소포체를 재구축함으로써 생성할 수 있다(Kim et al., Nanomedicine, 12(3): 655-664, 2016). 선택적으로 원형질막-기반 소포체에 약물을 담지 할 때 단순히 분리된 원형질막-기반 소포체를 약물과 적절한 용매 또는 배지 내에서 혼합한 후 적절한 시간동안 교반하여 혼합하는 방법을 사용할 수 있고(Sun et al., Mol. Ther. 18(9): 1606-1614, 2010), 혹은 핵산과 같은 친수성 약물의 경우 전기천공법(electroporation)을 이용하여 원형질막-기반 소포체 내에 함입시킬 수 있다.
상기 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycine), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)일 수 있고 강심성 배당체(cardiac glycoside)는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용될 수 있으며 상기 GADD34/PP1 저해제는 미토마이신(mitomycin)과 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있으며, 상기 항-EGFR 항체는 세툭시맙(cetuximab)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
아울러 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 바이러스 유래 막융합 막단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 바이러스 유래 막융합 막단백질은 수포성 구내염 바이러스 VSV-G 단백질, 긴팔원숭이 류케미아 바이러스 GALV.fus, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 호흡기세포융합바이러스 F 단백질, 인간면역결핍 바이러스 gp120 또는 gp41, 플라비바이러스 E 단백질, 알파바이러스 E1 단백질, 배큘로바이러스 gp64, C형 간염바이러스 gp31 또는 gp70, 홍역바이러스 H 단백질 또는 F 단백질, 또는 에볼라바이러스 gp1 또는 gp2일 수 있고, 상기 VSV-G 단백질은 야생형 VSV-G 단백질 또는 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 pH 민감성 변이체 VSV-G 단백질일 수 있다.
상기 조성물은, 하나 또는 둘 이상의 항암 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 항암 화합물은 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer) 또는 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)일 수 있고, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴일 수 있으며, 상기 강심성 배당체(cardiac glycoside)는 비-면역원성 세포사멸 유도제와 조합되어 사용될 수 있고, 상기 GADD34/PP1 저해제는 미토마이신(mitomycin)과 조합되어 사용될 수 있으며, 상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)일 수 있고, 상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)일 수 있으며, 상기 항-EGFR-항체는 세툭시맙(cetuximab)일 수 있다. 한편, 상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제일 수 있고, 상기 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제는 PD-1 또는 PD-L1을 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체일 수 있으며, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 CTLA-4, B7-1 또는 B7-2를 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체일 수 있고, 상기 PD-1 또는 PD-L1을 표적으로 하는 항체는, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)일 수 있으며, 상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)일 수 있다. 한편, 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, 또는 Fab'일 수 있고, 상기 단일쇄-기반 항체 유사체는 상기 단일쇄-기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 항체 중쇄 단편(VHH)일 수 있다.
한편 상기 조성물에 있어서, 상기 항암 화합물은 상기 원형질막-기반 소포체 내부에 봉입이 된 것일 수 있고, 단순 혼합되어 제형화될 수도 있으며, 별도로 포장되었다가 사용 직전에 혼합되거나 동시에 또는 시차를 두고 투여될 수도 있다. 다만, 상기 면역 검문소 억제제가 항체, 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체일 경우, 엑소좀 내부로 봉입이 될 수도 있으나, 단순히 본 발명의 세포 유래의 재조합 원형질막-기반 소포체와 병용투여되거나 상기 재조합 원형질막-기반 소포체의 막 표면에 제시됨으로써 기능을 발휘할 수 있다. 상기 항체, 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체가 재조합 원형질막-기반 소포체의 막 표면에 제시될 경우, 본 발명의 일 실시예에 따른 면역 검문소 억제제가 막 표면에 제시가 된 재조합 원형질막-기반 소포체는 본 발명에서 사용된 바이러스 유래 막융합 막단백질과 동일한 방법으로 유전자 재조합 기술을 이용하여 숙주세포에 이를 암호화하는 유전자를 형질도입하여 숙주세포의 막 표면에 제시되도록 발현시킨 후 이들 숙주세포로부터 분비되거나 출아되거나 또는 세포를 인위적으로 가공하여 제조된 나노크기의 소포체를 수득함으로써 제조될 수 있다. 이 때, 상기 항체, 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체는 세포막 표면에 제시를 위해 별도의 막통과 도메인 또는 앵커링 도메인을 갖도록 유전자 재조합된 것일 수 있다. 선택적으로 상기 막통과 도메인 또는 막-앵커링 도메인을 갖도록 유전자 재조합을 하는 대신에 애초에 분비형이 아닌 막-결합 형태의 항체인 IgM 또는 IgD를 사용하는 것도 가능하다.
상기 조성물의 경우, 상기 재조합 원형질막-기반 소포체와 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 미리 혼합된 조성물의 형태로 제공이 될 수 있고, 별도로 포장되어 사용 직전에 혼합되어 투여가 되거나 일정한 시간적 간격을 두고 개별적으로 투여될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥 내 주사, 비강 내 흡입, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 경피 흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle) 또는 막에 바이러스 유래 막융합 막단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체의 암 치료제 제조로의 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 원형질막-기반 소포체 또는 상기 중 어느 하나 이상의 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법이 제공된다.
상기 암 치료방법에 있어서, 상기 개체는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다.
본 발명자들은 엑소좀 표면에 막융합 막단백질인 VSV-G 단백질의 저 pH 융합유도 변이체(H162R)를 도입하여 암세포에 처리할 경우, 일반적인 생리학적 조건(pH 7.4)에서는 막융합이 유발되지 않으나, 암조직의 미세환경과 유사한 조건(pH 6.8)에서 막융합이 유발되며, 이러한 막융합에 의해 암세포의 사멸이 가능할 것이고, VSV-G H162R 변이체 단백질 자체가 병원체 관련 분자 패턴(PAMP, pathogen associated molecular pattern)이므로 식세포의 탐식작용 및 수지상세포의 교차 프라이밍 능력(Cross-prime ability)을 항진시킬 것이라는 가정 하에(도 1 참조), VGV-G H162R 변이체 단백질을 표면에 제시하는 재조합 엑소좀을 제조하였다(도 2a 내지 5b 참조). 실제, 상기와 같이 제조된 재조합 엑소좀은 시험관내 조건의 실험에서 pH 6.8에서 선택적으로 암세포의 막융합을 유도하나(도 6a 내지 7b 참조), 그 자체적으로 암세포에 대한 암세포사멸을 유도하지는 않음을 규명하였다(도 7c 참조). 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo)은 대식세포 및 수지상세포에 의한 다양한 암세포(4T1-Luc, EL4-Ova 및 CT26.CL25)에 대한 식세포 작용을 촉진시켰고(도 8a 내지 8c 참조), 이는 VSVG가 TLR4 작용제로 작동함으로써 나타나는 현상임을 확인하였으며(도 9 참조), 이를 실제 종양 모델 동물에 투여한 결과, 체중감소와 같은 부작용 없이 실제 암세포의 성장을 유의하게 억제함을 확인할 수 있었고(도 10a 내지 11c 참조), 실험동물에서 적출된 종양조직의 세포표면에서 VSV-G 단백질이 유의하게 발현됨을 유세포 분석을 통해 확인할 수 있었다(도 12 참조). 상기와 같은 결과는 본 발명의 재조합 엑소좀이 다양한 기전을 통해 항암활성을 나타내는 다기능성 항암제임을 시사하는 것이다.
아울러, 본 발명자들은 본 발명의 재조합 원형질막-기반 소포체의 항암 기전을 규명하기 위하여, 다양한 분석을 수행한 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀은 수지상 세포의 암 특이적인 항원 표출을 증가시키고(도 13a) 수지상 세포의 성숙을 촉진시킬 뿐만 아니라(도 13b 내지 13c 참조), 종양조직 내로의 CD8 T 세포의 침윤을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 13d 및 13e 참조). 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀은 암조직 내의 수지상 세포의 교차감작 능력이 유의하게 향상되고(도 14a 참조), 이러한 암특이적 면역 능력은 암 특이적 항원에 의하여 유도가 됨으로써 면역기억 능력 역시 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 14b 참조).
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 T 세포 면역에 의존적인지 여부를 확인하기 위해 T 세포 면역능력이 결여된 누드마우스를 이용하여 동물실험을 수행한 결과 항암효과가 사라지는 것을 확인하였고(도 15a), 약물 투여량을 두 배로 늘릴 경우 항암 효과가 나타남을 확인하였다(도 15b). 그러나, T 세포 면역에 중요한 역할을 수행하는 CD103 및 CD8 수지상 세포가 결여된 BATF3 넉아웃 마우스를 이용한 동물실험에서는 본 발명의 재조합 엑소좀 투여군에서도 아무런 항암활성이 나타나지 않아, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 수지상 세포를 통해 항암활성이 나타남을 확인할 수 있었으며(도 15d), 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 항암작용에서 CD8 T 세포의 역할을 규명하기 위해, 항-CD8 항체를 이용하여 CD8을 중화시킨 야생형 마우스를 이용한 동물실험 결과 항-CD8 항체를 투여하여 CD8 T 세포를 제거할 경우 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 항암활성이 제거됨을 확인할 수 있었다(도 15c). 이와 같은 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 종양 미세환경에서의 개체의 수지상 세포의 성숙을 유도함으로써 암세포에 대한 선천성 면역 반응을 강화하는 것 뿐만 아니라, CD8 T 세포의 종양조직 내로의 침윤을 촉진시킴으로써 암항원에 대한 후천적 면역 반응까지도 강화시킴으로써 항암활성을 나타내는 것임을 나타내는 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 pH 민감성 VSV-G 단백질이 아닌 야생형 VSV-G 단백질을 막에 포함하고 있는 재조합 엑소좀 역시 그 효과는 다소 떨어지나 T 세포 특이적 면역반응을 유도함으로써 항암 활성을 나타냄을 실험적으로 확인하였다. 비록 암 미세환경에서 암세포와 재조합 엑소좀의 융합을 통해 암세포 표면에 바이러스 유래의 막융합 막단백질을 제시는 하지 못하나 VSV-G 단백질 자체가 TLR4 작용제 (agonist)로 작용할 수 있어, 야생형 VSV-G 단백질을 막에 포함하고 있는 재조합 엑소좀이 유발하는 T 세포 특이적 면역반응이 식세포의 TLR4 수용체와 결합을 통해 식세포를 활성화 시켜 유발되는 효과임을 규명하였다. 따라서, VSV-G 단백질 외의 다른 바이러스 유래의 막융합 막단백질 역시 본 발명에서 사용된 wtVSVG 엑소좀 또는 mVSVG 엑소좀과 유사한 효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 실제 긴팔원숭이 류케미아 바이러스 유래의 GALV.fus 단백질과 같은 바이러스 유래의 막융합 막단백질이 종양살상성(oncolytic) 단순포진 바이러스(herpes simplex virus)에 의한 항암효과를 증진시킨다는 보고가 있다(Fu et al., Mol. Ther. 7(6): 748-754, 2003).
상기와 같은 결과는 다른 항암제의 사용 없이 달성된 것으로서, 독소루비신과 같은 다른 면역원성 세포사멸 유도제와 병용투여할 경우, 강력한 상승작용을 나타낼 것으로 예상되며, 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀은 종래의 항암제의 부작용을 최소화하면서 강력한 항암작용을 나타내는 새로운 항암 치료제의 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
아울러, 본 발명의 일 실시예에서는 비록 재조합 엑소좀을 이용하여 항암효과를 확인하였으나, 재조합 엑소좀과 구조가 유사한 세포외 소포 및 세포-유래 나노베지클과 같은 세포에서 유래한 원형질막-기반 소포체 역시 바이러스 유래 막융합 막단백질을 막에 포함하도록 숙주세포를 형질전환시킨 후 형질전환된 숙주세포로부터 통상의 방법 즉, 유전자 재조합에 의해 제조될 경우, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀과 동일한 기능을 발휘할 것으로 예상된다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: VSV-G H162R 컨스트럭트의 제조
본 발명자들은 VSV-G H162R 변이체 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 제조하기 위해 우선 VSV-G의 162번째(GenBank No. CAC47944에 개시된 단백질 기준 178번째) 아미노산 잔기인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 H162R 변이체 단백질을 암호화하는 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 구체적으로, 이를 위해 야생형 VSV-G 단백질(서열번호 1)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)가 포함된 플라스미드 DNA(pCMV-VSV-G Envelope Vector, RV-110, Cell Biolabs, 이하, 'VSV-G 컨스트럭트'로 약칭함)를 주형으로 서열번호 3으로 기재되는 포워드 프라이머(5'-ATA TGC CCC ACT GTC CGC AAC TCT ACA ACC TGG-3') 및 서열번호 4로 기재되는 리버스 프라이머(3'-TAT ACG GGG TGA CAG GCG TTG AGA TGT TGG ACC-5')를 이용하여 위치지정 돌연변이를 수행하였다(굵은 문자의 코드는 변이 아미노산인 아르기닌에 대응함).
실시예 2: VSV-G H162R 포함 재조합 엑소좀의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 VSV-G H162R 단백질(서열번호 5)을 암호화하는 유전자(서열번호 6)가 삽입된 pCMV-VSV-G H162R 플라스미드 벡터(이하, 'VSV-G H162R 컨스트럭트'로 약칭함, 도 2a 및 2b)를 HEK293T 세포에 형질감염시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포배양액을 회수하여 300 g에서 10분간, 2,000 g에서 10분, 10,000 g에서 30분의 순차적 원심분리를 수행한 후, 0.2 μm 필터를 이용하여 여과한 후, 다시 150,000 g에서 3시간 동안 한외여과를 수행하여 펠렛을 회수하였다(도 3).
그런 다음 엑소좀 내에 VSV-G H162R 변이체 단백질이 포함되어 있는지 확인하기 위해 상기 회수된 엑소좀 일부를 파쇄한 후 항-VSV-G 항체(Abcam, ab50549), 및 항-Alix 항체(엑소좀 마커, Santacruz, sc99010)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(도 4). 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 형질전환된 HEK293T 세포 및 그로부터 수득한 재조합 엑소좀 모두에서 VSV-G H162R 변이체 단백질이 검출되었다. 도 4는 또한 엑소좀 마커인 Alix, CD63 및 TSG 101에 대하여 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G H162R 변이체 단백질을 발현하도록 형질 전환된 세포로부터 유래한 엑소좀에 상기 VSV-G H162R 변이체 단백질이 정상적으로 포함되어 있음을 의미하는 것이다.
이어, 본 발명자들은 상기 회수된 재조합 엑소좀을 투과 전자현미경으로 촬영하는 한편(도 5a), 상기 재조합 엑소좀의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석 장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하였다(도 5b). 그 결과 도 5b에서 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo)와 대조군 엑소좀(Con-Exo) 모두 그 크기가 80 nm 내외의 상당히 좁은 스펙트럼을 갖고 있는 것으로 확인되었다.
비교예: wtVSVG 엑소좀의 제조
본 발명자들은 비교예로 162번 아미노산이 변이되지 않은 야생형 VSV-G 단백질이 발현되도록 유전자 컨스트럭트를 제조한 후 실시예 2의 방법을 이용하여 야생형 VSV-G 단백질이 막에 존재하는 재조합 엑소좀(wtVSVG-Exo)를 제조하였다.
실시예 3: 독소루비신 봉입 재조합 엑소좀의 제조
상기 실시예 2에서 제조된 재조합 엑소좀에 면역원성 세포사멸 유도제인 독소루비신(DOX)의 적제를 위해, 정제 된 엑소좀 (~ 1011 엑소좀)을 먼저 1 mL PBS 중의 DOX와 혼합한다. 이어, DOX - 재조합 엑소좀 혼합물은 다음과 같은 설정으로 초음파 처리한다: 0.25인치 팁이 있는 Model 505 Sonic Dismembrator를 이용하여 20% 진폭, 30초 켜기/끄기 및 사이클간 2분의 냉각기를 갖는 3분 1회전을 총 6회전 수행, 초음파 처리 후, Exo-DOX 용액을 37 ℃에서 60분 동안 배양하여, 엑소좀 막을 회수한다. 과량의 유리 약물은 NAP-10 Sephadex G25 컬럼(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 제거한다.
실험예 1: VSV-G H162R의 시험관내 조건에서의 암세포로의 융합 여부 분석
본 발명자는 상기 실시예 2에서 제조된 재조합 엑소좀이 실제 시험관내 조건에서 암세포와 융합하는지 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위해 구체적으로 본 발명자들은, 4T1-Luc 마우스 유방암 세포주, EL4-Ova 림포마 세포주, CT26.CL25 대장암 세포주 각각 5X105 개를 1 ml 융합 완충액(1.8 mM NAH2PO4, 8.4 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, 10 mM MES, 2.5 mM NaCl, 염산으로 pH를 7.4, 6.8 또는 5.5로 조정함)에 넣고 50 μg mVSVG-Exo 또는 wtVSVG-Exo (pCMV-야생형 VSVG 플라스미드 벡터를 이용하여 만든 엑소좀)와 함께 37℃에서 10분간 융합을 수행 후, 배양배지로 세척한 후 1시간 동안 37℃에서 배양배지에서 안정화시켰다. 이때 융합 완충액의 pH는 pH 7.4 또는 pH 6.8 또는 pH 5.5로 그룹을 구분하여 진행하였다. 이후 유세포 분석기를 이용하여 항-VSVG 항체 염색을 통해 암세포 표면에 mVSVG-Exo 또는 wtVSVG-Exo가 융합되는 정도를 평가하였다. 실험 결과 모든 암세포에 대해 wtVSVG-Exo의 경우 pH 5.5에서만 암 세포막 표면에 융합, 즉 암 세포막 편집이 가능하다는 것을 확인하였고, 반면 mVSVG의 경우 pH 5.5 뿐만 아니라 종양 미세환경의 pH인 6.8에서도 암세포막 표면에 융합되는 것을 확인하였다(도 6a). 아울러, 같은 조건으로 4T1-Luc 세포를 하루 전에 4 웰 챔버에 3x104 cell로 파종하고 상기와 같은 조건으로 mVSVG-Exo을 처리하였다. 이때 융합 완충액의 pH는 7.4 또는 6.8으로 그룹을 구분하여 진행하였다. 이후 항-VSVG 항체(빨강)와 세포막 염색이 가능한 항-Cadherin 항체(초록)를 함께 염색하고 공초점 형광현미경을 이용하여 촬영하였다. 그 결과 mVSVG-Exo의 경우 pH 7.4에서는 암 세포막 표면에 융합하지 못하였으나, pH 6.8에서는 융합이 가능함을 확인하였다(도 6b).
한편, VSVG가 세포막에 융합하기 위해 결합하는 세포막의 수용체로는 LDLR(low-density lipoprotein receptor)가 가장 잘 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 융합하는 암세포를 포함하여 다양한 세포에 대하여 항-LDLR 항체를 이용하여 LDLR 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 조사하였다. 그 결과, 도 6c에서 확인되는 바와 같이, 정상 세포인 골수 유래 대식세포, 골수 유래 수지상 세포 그리고 비장 세포에서는 LDLR이 발현되지 않지만 암세포인 4T1-Luc, EL4-Ova 그리고 CT26.CL25에서 LDLR이 발현됨을 확인할 수 있었고 이는 상기 제작된 mVSVG-Exo가 암세포만 표적하여 융합이 됨을 시사하는 것이다(도 6c).
실험예 2: 재조합 엑소좀의 암세포끼리의 융합 촉진 여부
이아, 본 발명자들은 mVSVG-Exo가 암세포 표면에 융합된 이후에 암세포끼리의 융합을 촉진하는지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 구체적으로 유방암 세포주인 4T1-Luc, 림포마 세포주인 EL4-Ova, 대장암 세포주인 CT26.CL25 각각 1x105 cell을 Deep red 1 μM 또는 Green CMFDA 1 μM로 염색하고 상기 실험예 1에 기재된 방법대로 mVSVG-Exo를 처리하여 pH 7.4 또는 pH 6.8의 조건에서 융합을 수행하였다. 이후 35파이 배양접시에 파종하고 24시간 경과 후 암세포 융합 정도(Green CMFDA Signal, Deep red signal double positive cell)를 유세포 분석을 통해 조사하였다. 그 결과 도 7a 및 7b에서 확인되는 바와 같이, 4T1-Luc, CT26.CL25의 경우 pH 7.4보다 pH 6.8에서 mVSVG-Exo으로 인해 세포간 융합이 유의하게 촉진되는 것으로 확인하였고, EL4-Ova의 경우에도 비록 유의하지는 않았으나, 융합이 증가되는 경향을 나타냈다.
이어, 본 발명자들은 mVSVG-Exo 자체가 암세포 사멸을 유도하는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로 유방암 세포주인 4T1-Luc, 림포마 세포주인 EL4-Ova, 대장암 세포주인 CT26.CL25을 상기 실험예 1에 기재된 방법과 같이, mVSVG-Exo, 대조군 엑소좀(Con-Exo) 또는 완충액(엑소좀 없이 융합 완충액만 처리)를 pH 7.4 또는 pH 6.8 융합 완충액을 사용하여 처리함으로써 융합을 수행하였다. 이후 그룹별로 5X103개 세포를 정상배지와 함께 96 웰 플레이트에 파종하였고 24시간 뒤에 CCK 분석을 통해 세포생존도(cell viability)를 측정하였다. 그 결과, 도 7c에서 확인되는 바와 같이, 모든 실험군에서 세포생존도 상의 차이는 없었으며, 이는 mVSVG-Exo이 직접 암세포 사멸은 유도하지 않는 것임을 시사하는 것이다.
실험예 3: 암세포에 대한 식세포 작용 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀이 대식세포 및 수지상세포에 의한 암세포의 식세포 작용(phagocytosis)을 촉진시키는지 확인하기 위해, 식세포 작용 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 유방암 세포주인 4T1-Luc, 림포마 세포주인 EL4-Ova, 대장암 세포주인 CT26.CL25 5X105을 상기 실험예 1에 기재된 방법대로 mVSVG-Exo, 대조군 엑소좀(Con-Exo) 또는 완충액(엑소좀 없이 융합 완충액만 처리)를 pH 7.4 또는 pH 6.8 융합 완충액을 사용하여 처리함으로써 융합을 수행하였다. 암 세포막 편집 이후 pH rodo SE 120 ng/ml으로 암세포를 염색하였다. Green CMFDA 1 μM으로 염색한 골수유래 대식세포(bone marrow derived macrophage) 및 골수유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cell)와 pH rodo SE으로 염색한 암세포를 1:2 비율로 2시간 동안 공배양하였다. 이후 형광현미경을 이용하여 대식세포 및 수지상세포가 암세포를 얼마나 탐식하였는지를 확인하였다. 실험 결과 도 8a 내지 8c에서 확인되는 바와 같이, 다른 그룹과 달리 pH 6.8에서 암세포막을 편집한 mVSVG-Exo 처리군만 식세포(골수유래 대식세포 및 골수유래 수지상 세포)에 의한 암세포 탐식 작용이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, pH 6.8에서 mVSVG-Exo를 이용하여 암 세포막 편집 후 항-VSVG 항체를 이용하여 사전차단(preblocking)할 경우(그래프상 pre로 표기됨) 항진된 탐식 작용이 사라지는 것을 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 탐식작용 항진효과는 mVSVG에 의존적임을 규명하였다.
이는 본 발명의 융합성 엑소좀이 암세포의 융합 뿐만 아니라, 암세포에 대한 대식세포 및 수지상세포에 의한 식세포 작용을 촉진시킴으로써 항암 작용을 하는 다중 기능에 기반한 항암활성을 나타냄을 시사하는 것이다.
실험예 4: 재조합 엑소좀의 수지상 세포 성숙 촉진 기전 규명
VSV-G 단백질은 TLR4 작용제(agonist)로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 TLR4 경로를 통해 수지상 세포의 성숙을 증진시키는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로, 6 웰 배양접시에 골수유래 수지상 세포 1x106 cell을 파종하고 mVSVG-Exo 500 ng 또는 Con-Exo 500 ng을 24시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 떼어 원심분리하고 수지상 세포 성숙을 반영하는 항-CD40 항체 및 항-CD86 항체를 이용하여 염색한 후 유세포 분석기를 통해 수지상 세포의 성숙을 평가하였다. 실험 결과 도 9에서 확인되는 바와 같이, mVSVG-Exo으로 인해 수지상 세포에서의 CD40 및 CD86 발현양이 증가하는 것을 확인하였고 이는 mVSVG-Exo가 수지상 세포의 성숙을 촉진할 수 있음을 의미한다.
실험예 5: 생체내 항암효과 분석
본 발명자들은 상기 실험예 1 내지 4의 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 생체 내 조건에서 암세포의 성장을 억제할 수 있는지 여부를 조사하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 상기 실시예 2에서 수득된 재조합 엑소좀(mVSVG-Exo), 또는 대조군 엑소좀(Con-Exo) 100 μg을 마우스 4T1-Luc 유방암 세포 1x106 cells를 등쪽 피하에 접종하여(0 일째) 암발생을 유도한 7주령의 Balb/c 야생형 마우스(암컷, n=21)에 암세포 접종후 5일 및 6일 째에 종양 내 주입하였다. 이 때 대조군으로는 PBS만 투여하였다. 이후, 3일 간격으로 암세포 접종 16일까지 암조직의 크기 및 실험동물의 몸무게를 확인하였다(도 10a 및 10c). 그리고 암세포 접종 16일 경과 후 실험동물을 모두 희생시킨 후 암조직을 적출한 후 무게를 측정하였다(도 10b).
아울러, 본 발명자들은 C57BL/6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포 1x106 cell을 피하 접종하여(0 일째) 암발생을 유도한 후 암세포 접종 6일째 및 7일째에 비교군인 wtVSVG-Exo 100 μg, mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 3일 간격으로 암 사이즈 및 실험동물의 몸무게를 측정하였고(도 11a 및 11c) 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출 후 암조직의 무게를 측정하였다(도 11b).
상기 실험결과, 도 10a 내지 11c에서 확인되는 바와 같이, 대조군과 비교하여 비교군인 wtVSVG-Exo 투여군 및 mVSVG-Exo 투여군에서 유의한 항암 효과를 나타냈고, 특히 mVSVG-Exo 투여군에서 다른 그룹과 비교하여 가장 뛰어난 항암효과가 관찰되었다.
실험예 6: 항암활성과 도입된 VSV-G의 상관관계
본 발명자들은 상기 실험예 5에서 나타난 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 생체내 항암효과가 엑소좀에 도입된 mVSV-G 단백질에 의한 작용인지 확인하기 위해 종양세포 표면의 VSVG 단백질의 발현정도를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로, C57BL/6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포 1x106 cells를 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 종양 크기가 100 mm3에 도달하였을 때 wtVSVG-Exo 100 μg, mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS를 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 투여 2시간 뒤 암 조직을 적출하고 단일 세포로 만들어 항-VSVG 항체를 이용한 염색을 수반한 유세포 분석을 수행하였다(도 12). 실험결과 도 12에서 나타난 바와 같이, mVSVG-Exo 그룹에서만 암세포막 표면에서 VSVG가 발현됨을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 생체내 항암활성이 엑소좀 막에 존재하는 VSVG 단백질이 종양 미세환경에서 암세포와 재조합 엑소좀의 융합에 의해 암세포막으로 이전됨에 따라 야기되는 것임을 입증하는 것이다.
실험예 7: 재조합 엑소좀의 항암작용 기전의 연구
7-1: 수지상 세포에 미치는 영향 조사
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 수지상 세포의 기능을 활성화시킴으로써 항암활성을 나타내는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 구체적으로 C57BL/6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포 1x106 cells을 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함) 7일째에 wtVSVG-Exo 100 μg, mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg, 또는 PBS을 종양 내 투여하였다. 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직 및 종양 배액 림프절을 적출하였다. 그런 다음, 수지상 세포의 암항원 표출 정도를 분석하기 위해 단일세포화한 종양 배액 림프절을 수지상 세포의 마커인 항-CD11c 항체와 암 특이적인 항원인 난알부민(Ovalbumin)이 MHC-1에 적재된 것을 측정할 수 있는 항-H2Kb-Ova 항체로 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다(도 13a). 그 결과, 도 13a에서 확인되는 바와 같이, mVSVG-Exo 투여군에서 가장 우수한 수지상 세포의 암 특이적인 항원 표출 정도를 나타냈다. 아울러, 수지상 세포의 성숙 정도를 분석하기 위해 단일세포화한 종양 배액 림프절을 수지상 세포의 마커인 항-CD11c 항체와 수지상 세포의 성숙 정도를 평가할 수 있는 항-CD40 항체 및 항-CD86 항체로 각각 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다(도 13b 및 13c). 실험 결과 wtVSVG-Exo와 mVSVG-Exo 그룹 모두 수지상 세포의 성숙을 촉진할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본원발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 수지상 세포 기능 촉진효과는 암세포로의 재조합 엑소좀의 융합과 무관한 VSVG 자체의 기능에 의한 것임을 알 수 있었다.
7-2: CD8 T 세포의 암조직 내로의 침윤에 미치는 영향 조사
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 CD8 T 세포의 암조직 내로의 침윤에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 구체적으로 상기 실험예 7-1의 실험동물로부터 적출된 암조직을 OCT compound에 포매하여 냉동시킨 후 동결박편을 제조하여 항-CD8 항체를 이용하여 염색한 후 형광현미경을 통해 암 조직 내 CD8 T cell 침윤 정도를 비교 분석하였다(도 13d 및 13e). 그 결과 mVSVG-Exo 투여군에서 가장 우수한 CD8 T 세포 침윤 정도를 보였다. 특히, wtVSVG-Exo 투여군의 경우 대조군이나 대조 엑소좀 투여군과 차이가 존재하지 않아, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 CD8 T 세포 침윤 촉진활성은 VSVG 자체의 기능 뿐만 아니라 종양 미세환경에서의 암세포와의 융합에 의한 효과임을 알 수 있었다.
7-3: 교차감작 능력 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 CD8 T 세포에 대한 교차능력이 있는지 조사하였다. 이를 위해 구체적으로, C57BL/6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포 1x106 cells를 피하주입하여 암을 유발했고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함) 7일째에 wtVSVG-Exo 100 μg, mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg, PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직과 비장조직을 적출하였다. 대식세포와 수지상 세포의 교차 감작 능력(cross-prime ability)을 평가하기 위해 단일세포화한 암조직에서 F4/80 또는 CD11c 자성 입자를 이용하여 수지상 세포 (CD11c-양성 세포)와 대식세포(F4/80-양성 세포)를 분리하였다. 이후 MHC1에 적재된 난알부민을 인지할 수 있는 OT-1 CD8 T 세포를 가지고 있는 OT-1 형질전환 마우스의 비장에서 CD8 T 세포 칼럼을 이용하여 OT-1 CD8 T 세포를 분리하였고, 암조직에서 분리한 수지상 세포 또는 대식세포 및 상기 OT-1 CD8 T cell를 각각 1:5의 비율로 3일간 배양배지에서 공배양하였다. 3일 뒤에 배지를 회수하여 그룹별로 항-IFN-γ 항체를 이용한 ELISA 분석을 수행하여 INF-γ의 발현정도를 분석하였다(도 14a). 그 결과, 다른 그룹에 비해 mVSVG-Exo을 처리한 쥐의 암조직에서 적출한 수지상 세포의 교차 감작 능력이 유의하게 향상되어 있음을 확인하였다.
7-4: 면역기억 능력 조사
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 암치료가 끝난 후 동일한 암이 재발할 경우 암항원을 기억하여 암특이적 면역반응을 촉발시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 상기 실험예 7-3의 실험동물에서 적출된 비장조직을 단일세포화한 후 5X106 cell을 12 웰 배양접시에 1 ml 배양 배지와 함께 파종하고 PBS 또는 암 특이적인 항원인 난알부민(Ovalbumin) 10 μg/ml로 24시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 회수하여 그룹별로 항-IFN-γ 항체를 이용하여 ELISA 분석을 수행함으로써 배지내의 IFN-γ의 발현정도를 분석하였다(도 14b). 그 결과 도 14b에서 확인되는 바와 같이, wtVSVG-Exo 투여군과 mVSVG-Exo 투여군에서 유의한 암항원 특이적 면역반응이 증가됐고, 특히 mVSVG-Exo 투여군에서 가장 뛰어난 암항원 특이적 면역반응이 관찰되었다.
7-5: 재조합 엑소좀의 항암활성과 관련된 면역세포의 규명
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 어떠한 면역세포에 의존적인지 조사하고자 하였다. 우선, T 세포 면역이 결여된 누드 마우스에서도 식세포의 탐식작용 항진으로 인한 항암 효과가 나타날 수 있는지를 확인하기 위해 EL4-Ova 암세포 1x106 cell을 누드 마우스의 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함), 7일째 mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 3일 간격으로 암 사이즈를 측정하였고 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출하여 무게를 측정하였다(도 15a). 그 결과, 도 15a에서 확인되는 바와 같이, T 세포가 존재하였던 C57BL/6 마우스에서 나타났던 mVSVG-Exo의 항암 효과가 누드마우스에서는 사라지는 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 항암 효과는 T 세포 면역에 의존적임을 알 수 있다. T 세포 면역이 결여된 누드 마우스에서도 식세포의 탐식작용 항진으로 인한 항암 효과가 나타날 수 있는지를 확인하기 위해 EL4-Ova 암세포 1x106 cell을 누드 마우스의 왼쪽 등에 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 5일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함), 6일째, 7일째, 8일째 mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다(다른 실험에 비해 2배 많은 양임). 3일 간격으로 암 사이즈를 측정하였고 암세포 주입 후 17 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출하여 무게를 측정하였다(도 15b). 그 결과 도 15b에서 확인되는 바와 같이, 기존 약물 투여량을 두배로 올리고 좀 더 암이 작은 시점에서 실험을 진행하였을 때 mVSVG-Exo의 항암 효과가 누드 마우스에서도 나타날 수 있음을 확인하였다. 이는, 본 발명의 재조합 엑소좀이 CD8 T 세포의 침윤능 증가 외에도 식세포의 탐식 작용을 촉진함으로써 선천성 면역반응을 유도하기 때문인 것으로 추정이 된다.
이어, 본 발명자들은 T 세포 면역 중 어느 종류의 T 세포에 mVSVG-Exo의 효과가 의존적인지를 확인하기 위해 C57BL/6 야생형 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포 1x106 개를 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함) 7일째에 mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 그런 다음, CD8 T 세포를 제거하기 위해 암세포 주입 하루 전부터 3일 간격으로 항-CD8 중화 항체를 150 μg씩 복강 투여하였다. 3일 간격으로 암 사이즈를 측정하였고 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출하여 무게를 측정하였다(도 15c). 그 결과 도 15c에서 확인되는 바와 같이, T 세포 면역이 보존되었던 C57BL/6 마우스에서 나타났던 mVSVG-Exo의 항암 효과가 CD8 T 세포가 없는 마우스에서는 사라지는 것을 확인하였다. 이는, mVSVG-Exo 항암 효과는 CD8 T 세포 면역에 의존적임을 시사하는 것이다.
마지막으로 본 발명자들은 T 세포 면역을 형성할 때 가장 중요한 역할을 수행하는 CD103 및 CD8 수지상 세포가 결여된 BATF3 넉아웃 마우스의 왼쪽 등에 EL4-Ova 암세포를 1x106 cell을 피하주입하여 암을 유발시켰고, 암세포 주입 후 6일째(암세포 주입한 날을 0일째로 함) 7일째에 mVSVG-Exo 100 μg, Con-Exo 100 μg 또는 PBS을 종양 내로 주사를 이용하여 투여하였다. 3일 간격으로 암 사이즈를 측정하였고 암세포 주입 후 18 일째에 마우스를 희생시켜 암조직을 적출하여 무게를 측정하였다(도 15d). 그 결과, 도 15d에서 확인되는 바와 같이, CD103 및 CD8 수지상 세포가 존재하였던 C57BL/6 마우스에서 나타났던 mVSVG-Exo의 항암 효과가 BATF3 넉아웃 마우스에서는 사라지는 것을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀의 항암 효과는 CD103 및 CD8 수지상 세포 그리고 T 세포 면역에 의존적임을 알 수 있다.
상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G H162R 변이체 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀이 암조직의 미세환경의 pH 조건에서 특이적인 항암면역효과를 촉진시킴을 시사하는 것이다. 이러한, VSV-G H162R 변이체 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀의 항암효과는 다른 항암제의 도움 없이도 달성된 것으로서, 다른 항암제 특히 면역원성 세포사멸 유도제를 내부에 봉입하거나 병용처리시 현저한 상승효과가 기대된다. 특히 막 구조인 본 발명의 실 시시예에 따른 재조합 엑소좀 내부에 상기 항암제를 함입시킬 경우, 재조합 엑소좀이 암세포에 특이적인 융합을 통해 내부에 함입된 항암제를 암세포 내부로 전달할 수 있기 때문에, 항암제가 일반 세포에 작용하여 발생할 수 있는 부작용을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀을 포함한 재조합 원형질막-기반 소포체는 그 자체로도 항암활성을 가지고 있을 뿐만 아니라 다른 항암제와의 병용을 통해 더욱 강력한 항암활성이 기대되므로, 부작용을 최소화하면서도 강력한 효과를 나타내는 새로운 항암제의 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
서열번호 1은 야생형 VSV-G 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 상기 야생형 VSV-G 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타디의 핵산서열이다.
서열번호 3은 야생형 VSV-G 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하기 위해 사용된 포워드 프라이머의 핵산서열이다.
서열번호 4는 야생형 VSV-G 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 클로닝하기 위해 사용된 리버스 프라이머의 핵산서열이다.
서열번호 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 H162R 돌연변이 VSV-G 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 H162R 돌연변이 VSV-G 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산서열이다.
서열번호 7은 야생형 VSV-G 단백질의 162번째 아미노산인 히스티딘 주변의 아미노산 서열이다.
서열번호 8은 H162R 돌연변이 VSV-G 단백질의 162번째 아미노산인 아르기닌 주변의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 상기 야생형 VSV-G 단백질의 162번째 아미노산인 히스티딘 주변의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산서열이다.
서열번호 10은 상기 H162R 돌연변이 VSV-G 단백질의 162번째 아미노산인 아르기닌 주변의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산서열이다.
본 발명은 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (30)

  1. 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체(recombinant plasma membrane-based vesicle).
  2. 제1항에 있어서,
    엑소좀, 세포외 소포 또는 세포-유래 나노베지클인, 재조합 원형질막-기반 소포체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 VSV-G 변이체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트로 형질전환되어 상기 VSV-G 변이체 단백질을 과발현하는 포유동물 세포로부터 분리·정제된 것인, 재조합 원형질막-기반 소포체.
  4. 막에 162번째 아미노산인 히스티딘이 아르기닌으로 치환된 VSV-G 변이체 단백질이 도입되고 내부에 하나 또는 둘 이상의 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)가 함입된 재조합 원형질막-기반 소포체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycine), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)인, 재조합 원형질막-기반 소포체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    하나 또는 둘 이상의 항암 화합물을 추가로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 항암 화합물은 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inudcer) 또는 면역 검문소 억제제(immune checkpoint inhibitor)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 항-EGFR 항체는 세툭시맙(cetuximab)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  13. 막에 바이러스 유래 막융합 막단백질이 도입된 재조합 원형질막-기반 소포체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 원형질막-기반 소포체는 엑소좀, 세포외 소포 또는 세포-유래 나노베지클인, 암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 바이러스 유래 막융합 막단백질은 수포성 구내염 바이러스 VSV-G 단백질, 긴팔원숭이 류케미아 바이러스 GALV.fus, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 호흡기세포융합바이러스 F 단백질, 인간면역결핍 바이러스 gp120 또는 gp41, 플라비바이러스 E 단백질, 알파바이러스 E1 단백질, 배큘로바이러스 gp64, C형 간염바이러스 gp31 또는 gp70, 홍역바이러스 H 단백질 또는 F 단백질, 또는 에볼라바이러스 gp1 또는 gp2인, 암 치료용 조성물.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 또는 둘 이상의 항암 화합물을 추가로 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 항암 화합물은 면역원성 세포사멸 유도제 또는 면역 검문소 저해제인, 암 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 면역원성 세포사멸 유도제(immunogenic cell death inducer)는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone) 또는 옥살리플라틴(oxaliplatin)인, 암치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 안트라사이클린 계열 항암제는 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 또는 발루비신(valrubicin)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 탁산 계열 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 도세탁셀(docetaxel)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 항-EGFR 항체는 세툭시맙인, 암 치료용 약학적 조성물.
  22. 제30항에 있어서,
    상기 면역 검문소 억제제는 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제 또는 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제인, 암 치료용 약학적 조성물.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 PD-1/PD-L1 상호작용 억제제는 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체인, 암 치료용 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 PD-1 또는 PDL1을 표적으로 하는 항체는, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab) 또는 아벨루맙(Avelumab)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 CTLA-4, B7-1 또는 B7-2를 표적으로 하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 단일쇄-기반의 항체 유사체인, 암 치료용 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 CTLA-4/B7-1/B7-2 상호작용 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  27. 제23항 또는 제25항에 있어서,
    상기 단일쇄-기반 항체 유사체는 상기 단일쇄-기반의 항체 유사체는 scFv, sdAb, 다이아바디(diabody), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR), 나노바디(nanobody) 또는 낙타과 중쇄 단편(VHH)인, 암 치료용 약학적 조성물.
  28. 제16항에 있어서,
    상기 항암 화합물은 상기 재조합 엑소좀 내부에 봉입된 것인, 암 치료용 약학적 조성물.
  29. 치료적으로 유효한 양의 제6항의 암 치료용 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법.
  30. 치료적으로 유효한 양의 제13항의 암 치료용 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암 치료방법.
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