WO2021106312A1 - 腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞 - Google Patents

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WO2021106312A1
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virus
tumor
cell
derived
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PCT/JP2020/033947
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藤原　俊義
慶彦 垣内
朋子 津村
新士 黒田
大 田澤
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国立大学法人岡山大学
オンコリスバイオファーマ株式会社
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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular vesicle of biological origin containing an oncolytic virus.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a diameter of 50-150 nm secreted from cells. Its surface is a lipid bilayer membrane composed of lipids and proteins derived from cell membranes, and contains intracellular substances such as various nucleic acids and proteins inside. Exosomes are considered to be a type of extracellular vesicles. In addition to exosomes, extracellular vesicles include microvesicles and apoptotic bodies, each of which has a different production mechanism and size (Non-Patent Document 1: Non-Patent Document 1: Yamamoto T, et al. Sci Technol Adv Mater. 2019).
  • exosomes are secreted from organs and cells, they are also present in body fluids (blood, cerebrospinal fluid, urine, etc.) and circulate throughout the body. It has been noted that it is responsible for information transmission between cells as an important function of exosomes (Non-Patent Document 2: Kikuchi S, et al. Int. J. Mol. Sci. 2019). As described above, exosomes contain nucleic acids and the like inside, but it is known that nucleic acids (microRNA, messenger RNA) of secreted cells are transmitted to receiving cells via exosomes and function. (Non-Patent Document 3: Zhang H, et al. Nat Communi. 2017). For this reason, exosomes are thought to act as communication tools between cells.
  • the abscopal effect the fact that tumor shrinkage outside the therapeutic range is caused by immune activation after local treatment such as radiation therapy is called the abscopal effect, and it is said that exosomes may be involved in this effect.
  • various studies are being conducted to confirm that miRNAs and mRNAs contained in exosomes are involved in the abscopal effect, but the abscopal effect is caused by substances contained in exosomes that transcend immune activity. Has not yet been proven to occur.
  • telomelysin® is a type 5 adenovirus genetically modified to specifically proliferate in cancer cells and destroy the cancer cells.
  • Patent Document 1 WO2004 / 005511
  • OBP-301 is clinical because it exhibits strong antitumor activity that lyses cancer cells by specifically proliferating in cancer cells with high telomerase activity, and its proliferative ability is extremely low among normal cells. Expected to be useful, clinical trials are underway. However, the relationship between exosomes and oncolytic viruses has not yet been clarified.
  • oncolytic viruses have proven to have promising antitumor effects, they are non-specifically trapped in the reticular endothelial system, such as the liver and spleen, or neutralizing antibodies to type 5 adenovirus, for example, in adult men There was a problem that it was limited to local administration because the virus was neutralized after systemic administration because 80% had it. In addition, there has been a demand for an oncolytic virus that can efficiently accumulate in tumors and infect cancer cells. From the above, the development of a more useful drug for oncolytic viruses using extracellular vesicles has been required.
  • the present inventor has found that an oncolytic virus containing extracellular vesicles has a strong antitumor effect, and has completed the present invention. That is, the present invention is as follows. [1] Living-derived extracellular vesicles containing an oncolytic virus. [2] The extracellular vesicle according to [1], wherein the virus is a virus that proliferates specifically in tumor cells. [3] The extracellular vesicle according to [2], wherein the virus that proliferates specifically in tumor cells is a virus that is controlled by the telomerase reverse transcriptase promoter.
  • [4] The extracellular vesicle according to any one of [1] to [3], wherein the virus is a recombinant adenovirus.
  • [5] The extracellular vesicle according to [4], wherein the recombinant adenovirus is OBP-301 or OBP-702.
  • [6] The extracellular vesicle according to any one of [1] to [5], which is an exosome.
  • [7] Obtained by infecting a tissue or cell collected from a living body or an established cell derived from a living body with a tumor-melting virus so as to have a concentration within the range of IC50 ⁇ 20%, and culturing the cell.
  • the extracellular vesicle according to any one of [1] to [6].
  • Tissues or cells collected from a living body, or cells derived from a living body are infected with a tumor thawing virus and cultured, and then the obtained culture is centrifuged to obtain a living body-derived tumor thawing virus.
  • the medicament according to any one of [10] to [12] for obtaining the extracellular vesicles of the above-mentioned cells and returning the extracellular vesicles to the living body.
  • [14] The antitumor preparation containing the extracellular vesicle according to any one of [1] to [9].
  • [15] The antitumor preparation according to [14], which has an abscopal effect.
  • [16] The dendritic cell activator containing the extracellular vesicle according to any one of [1] to [9].
  • [17] After culturing a tissue or cell collected from a living body or a cell derived from a living body by infecting it with a tumor thawing virus, an extracellular vesicle containing the tumor thawing virus is obtained from the obtained culture.
  • a method for producing the extracellular vesicle which comprises separating.
  • a method for treating a tumor which comprises obtaining the extracellular vesicle by separation and administering the extracellular vesicle to the living body.
  • the present invention provides extracellular vesicles containing an oncolytic virus.
  • the extracellular vesicle of the present invention is useful as an antitumor drug.
  • it is possible to avoid the problem caused by the neutralizing antibody, which has been a problem in the past.
  • a higher antitumor effect can be expected even at the same dose, and an equivalent antitumor effect can be expected even at a smaller dose.
  • it can exert an antitumor effect by efficient accumulation in a tumor, infection of cancer cells, and systemic administration.
  • FIG. 6 It is a figure which shows the outline of the recovery method of the exosome used in this invention. It is a figure which shows the outline of the recovery method of the exosome used in this invention. It is a micrograph of the recovered exosome. It is a figure which shows the result of having measured the size of the recovered exosome. It is a figure which shows the abundance ratio of pure Exo301 among the recovered Exo301. It is a figure which shows the test result of the cytotoxic activity of each exosome. In FIG. 6, a represents the test result of the cytotoxic activity of Exo and b represents the cytotoxic activity of Exo301. It is a figure which shows the test result for determining the cytotoxic activity of PureExo301. In FIG.
  • a represents the result when IgG was reacted and b was reacted with the anti-CD63 antibody.
  • HCT116 cell human colorectal cancer cell line
  • a is PBS
  • b is GW4869
  • c is OBP-301
  • d is OBP-301 and GW4869.
  • transplanted CT26 cells mae colon cancer cell line
  • a represents the result of Exo
  • b represents the result of Exo301
  • c represents the result of Exo702.
  • a represents the cytotoxic activity of Exo301 and Exo702 to Panc-1 cell and MIA PaCa-2 cell.
  • a represents the result of Exo
  • b represents the result of Exo301
  • c represents the result of Exo702.
  • a represents the result of Exo
  • b represents the result of Exo301
  • c represents the result of Exo702.
  • the extracellular bodies of the present invention contain an oncolytic virus.
  • the virus used in the present invention is an oncolytic virus and can proliferate in a tumor cell-specific manner. Tumor cell-specific means that it acts selectively on tumor cells as compared to normal cells and has little effect on normal cells.
  • Viruses include adenovirus, simple herpesvirus, vaccinia virus, leovirus, poxvirus, picornavirus and the like. Of these, adenovirus and herpesvirus are preferable, and adenovirus is particularly preferable from the viewpoint of safety.
  • type 5 adenovirus is particularly preferable because it is easy to handle.
  • a virus controlled by the telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter can be mentioned, and an adenovirus containing the hTERT promoter is preferable.
  • a recombinant oncolytic virus can be used.
  • Recombinant oncolytic virus means a virus in which a polynucleotide containing a human telomerase promoter, an E1A gene, an IRES sequence, and an E1B gene are integrated into its genome in this order.
  • Recombinant tumor-thawed adenovirus can be obtained by the method described in WO 2004/5511.
  • OBP-301 one of the recombinant tumor-melting adenoviruses, is available from Oncolys BioPharma Inc. as "Telomelysin”®.
  • OBP-702 having the tumor suppressor gene p53 mounted on OBP-301 OBP-502 having the RGD sequence mounted on the fiber, and E3 having the RGD sequence mounted on the fiber.
  • OBP-405 examples include OBP-405 in which the region is missing.
  • OBP-702, OBP-405 and OBP-502 are available from Oncolys BioPharma Inc.
  • Extracellular vesicles The extracellular vesicles used in the present invention may be exosomes, microvesicles, or apoptotic bodies, but small exosomes are considered in consideration of EPR (Enhanced Permeation and Retention Effect). desirable. Exosomes are endosome-derived vesicles, microvesicles are vesicles secreted directly from cells, and apoptotic bodies are cell fragments produced by cell death.
  • Extracellular vesicles can be recovered from all tissues. That is, it is said that it can be recovered not only from animals including humans but also from food. (Wang Q, et al. Nat Communi. 2013) However, in order to emphasize tumor orientation by systemic administration, tumor-derived extracellular vesicles are considered to be the most appropriate, but tumor malignancy. Information is contained in these extracellular vesicles and is not ethically suitable. As the most ethically acceptable tissue while maintaining tumor orientation, normal tissue from the patient to be administered (preferably a cancer-causing organ) is considered to be the most desirable. In recent cancer treatments, personalized medicine is being promoted for each patient, so it is considered appropriate to use normal tissue derived from the patient.
  • the greatest advantage in this case is that the immune response may be minimized because the tissue is self-derived. Even if it is an extracellular vesicle derived from a tumor, it should be used when the antitumor effect of this preparation is superior to that of the extracellular vesicle's malignant transformation promoting factor and clinical safety is confirmed. There is still the possibility of being able to do it.
  • mesenchymal stem cells are considered to have a regenerative ability by themselves, and it is considered that the ability is inherited by extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells (Zhang Y, et al. J Neurosurg. 2015.). Although it is less directional than cancer cell-derived extracellular vesicles, it may have a powerful therapeutic effect by combining its own regenerative ability with the therapeutic ability of Exo301 (exosome containing OBP-301). ..
  • tissue or cells from which extracellular vesicles such as exosomes are derived are collected from a living body.
  • the collected tissue or cells are cultured to obtain a culture.
  • Tissues can be collected by biopsy, surgical excision, etc., but mesenchymal stem cells (established cell lines) can also be used.
  • the method for recovering extracellular vesicles when infecting a tumor-lytic virus is, for example, a method of directly injecting or infecting the collected cells with the tumor-lytic virus and using a culture medium containing no animal serum-derived exosomes for a predetermined time (for example, 6 hours). ) After culturing, the cells are crushed as much as possible with a scalpel, etc., cultured at 4 ° C for 48 hours, and then the culture solution is collected (Jingushi K, et al. Int J Cancer. 2018.). ..
  • tumor-lytic virus is directly injected or infected into collected cells, cultured in a medium containing animal serum for a predetermined time, and then cultured in a medium containing animal serum for a predetermined time.
  • Examples thereof include a method of collecting the culture medium after culturing.
  • the time for culturing in the medium containing animal serum is not particularly limited, but is preferably 10 to 40 hours, more preferably 20 to 30 hours, and particularly preferably 24 hours.
  • the time for culturing in a medium containing no animal serum is not particularly limited, but is preferably 24 to 72 hours, more preferably 36 to 60 hours, even more preferably 42 to 54 hours, and particularly preferably 48 hours.
  • the 50% growth inhibitory concentration of cells per unit population is IC50 with respect to tissues or cells collected from the living body or established cells derived from the living body
  • the concentration at which the collected cells are infected with the tumor lytic virus it is preferable to infect the collected cells with a tumor-melting virus so that the concentration is within the range of IC50 ⁇ 20%, and the concentration is more preferably within the range of IC50 ⁇ 10%. , IC50 ⁇ 5% is more preferable, and IC50 is particularly preferable.
  • Extracellular vesicles are collected (recovered) from the culture obtained by the above culture.
  • exosome recovery methods include ultracentrifugation, PEG precipitation, immunoprecipitation, affinity with magnetic beads using Tim4 (receptor for exosomes expressed on macrophages), and density gradient centrifugation. And so on. Exosomes may be isolated and recovered by using a commercially available reagent (kit) for isolating exosomes.
  • the ultracentrifugation method for example, several steps are performed in advance with a centrifugal force of about 100 g to 10,000 g (example: 100 g for 10 minutes, 2,000 g for 10 minutes, 10,000 g for 30 minutes), and the supernatant fraction is 80,000.
  • High-purity exosomes can be obtained by performing ultracentrifugation at least once for 70 minutes with a centrifugal force of g to 120,000 g, for example, a centrifugal force of about 100,000 g.
  • a centrifugal force of 500 g to 5,000 g is preferable, 1,000 g to 3,000 g is more preferable, and 2,000 g is particularly preferable.
  • the pore size of the filter is preferably 1,000 nm to 100 nm, more preferably 800 nm to 200 nm, and particularly preferably to pass the filter twice in the order of 800 nm and 220 nm.
  • a centrifugal force of 80,000 g to 120,000 g is preferable, 90,000 g to 110,000 g is more preferable, and 100,000 g is particularly preferable.
  • the virus-containing extracellular vesicles and the virus have almost the same size and mass, it is possible that both are contained in the fraction recovered by the above ultracentrifugation.
  • its number ratio and mass ratio can be predicted from the relative content of E1A.
  • extracellular vesicles are contained at least 70% or more, 80% or more, or 90% or more as virus-containing extracellular vesicles in the fraction recovered by ultracentrifugation. Furthermore, the purity of the fraction recovered by ultracentrifugation can be increased by heat treatment or alkali treatment (for example, 100 mM NaOH for 20 minutes).
  • extracellular vesicles can be recovered not only from the above tissues and cells but also from milk, urine, food and the like.
  • the method for recovering from each substance is described in the following documents, and known milk: skim milk is preheated at 37 ° C for 10 minutes and mixed with acetic acid at room temperature for 5 minutes. Then centrifuge at 4 ° C at 10,000 g for 10 minutes. Pass through a 0.22 nm filter, centrifuge at 4 ° C. and 210,000 g for 70 minutes, and stir with PBS. (Somiya M, et al. J Extracell Vesicles. 2018.) Urine: The collected urine is centrifuged at 20 ° C.
  • extracellular vesicles contain nucleic acids.
  • nucleic acids include mRNA, miRNA, RNA transcripts and repeat sequences that overlap the protein coding region, as well as small non-coding RNA species such as tRNA, rRNA, and siRNA, as well as mitochondrial DNA and retrotransposon. Includes short DNA sequences and the like. Therefore, it can be confirmed that the extracellular vesicle is the target by performing PCR targeting these nucleic acid sequences.
  • extracellular vesicles contain membrane lipid components such as sphingomyelin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, ganglioside (GM3), phosphatidylinositol, prostaglandin and lysophosphatidic acid.
  • membrane lipid components such as sphingomyelin, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, ganglioside (GM3), phosphatidylinositol, prostaglandin and lysophosphatidic acid.
  • GM3 ganglioside
  • phosphatidylinositol phosphatinositol
  • prostaglandin lysophosphatidic acid.
  • the present invention provides a medicine containing an extracellular vesicle of a living body containing an oncolytic virus.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition and an antitumor preparation containing the extracellular vesicle and a pharmaceutically acceptable elemental substance. These pharmaceuticals, pharmaceutical compositions and formulations are used to treat tumors.
  • the target tumor to which the pharmaceutical, pharmaceutical composition or preparation of the present invention is used is not particularly limited.
  • brain tumors including pituitary adenoma and glioma
  • head and neck cancer cervical cancer, jaw cancer, maxillary cancer, submandibular adenocarcinoma, oral cancer, salivary adenocarcinoma, sublingual adenocarcinoma, parotid adenocarcinoma, nasal cavity Cancer, sinus cancer, laryngeal cancer, esophageal cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer (including pancreatic duct cancer), gastric cancer, biliary tract cancer (including bile duct cancer, bile sac cancer) small intestine or duodenal cancer, colon cancer, bladder cancer, renal cancer , Liver cancer, prostate cancer, uterine cancer (including cervical cancer, uterine body cancer), ovarian cancer, thyroid cancer, pharyngeal cancer, sarcoma (eg, osteosarcom
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains various pharmaceutically (pharmaceutically) acceptable carriers depending on the form of use as long as the extracellular vesicle, which is an active ingredient, is contained in an effective amount without losing its activity.
  • pharmaceutically (pharmaceutically) acceptable carriers depending on the form of use as long as the extracellular vesicle, which is an active ingredient, is contained in an effective amount without losing its activity.
  • commonly used carriers can be applied as diluents, excipients and the like.
  • water, physiological buffer (PBS, etc.) various organic solvents can be mentioned.
  • the organic solvent include an aqueous solution of alcohol (ethanol or the like), glycerol, olive oil and the like.
  • various fillers, bulking agents, binders, surfactants, pigments, fragrances and the like can be added.
  • the pharmaceutical composition and preparation of the present invention can be in the form of liquids, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, aqueous gels and the like. Further, since it is used for injection or the like, it can be used as a lyophilized product or a granulated product for preparing a drug solution by dissolving it in physiological saline or an appropriate buffer solution (for example, PBS) immediately before use.
  • physiological saline or an appropriate buffer solution for example, PBS
  • the medicament, pharmaceutical composition and preparation of the present invention can be used in a form, method and dose suitable for a therapeutic purpose and a patient.
  • the amount and number of additions are not particularly limited because they may vary depending on conditions such as the type of tumor cells at the time of exosome production, cell density (cell density at the start of culture), number of passages, culture conditions, type of medium, and the like.
  • the extracellular vesicles obtained in the present invention naturally change in the composition, particle size, and distribution value of the proteins and other substances contained in the extracellular vesicles depending on the cells to be infected, the oncolytic virus, and the production conditions including virus infection and exosome recovery. Therefore, it is impractical to directly identify the object by its structure or properties. In addition, manufacturing by combining various cells, viruses, manufacturing conditions, etc., and measuring the composition, particle size, etc. of each requires unrealistic number of experiments, etc., and as a result, Cannot be comprehensively expressed in the claims.
  • the present invention can be used in a mode in which tissues or cells are collected from a patient, infected with a virus and cultured, and then the extracellular vesicles collected after the culture are returned to the patient.
  • an antitumor effect that is, an abscopal effect can be exhibited even in a tumor on the non-treated side. This effect is considered to be caused by OBP-301, OBP-702, etc. contained in exosomes, that is, Exo301, Exo702, etc.
  • the concentration in the medium is preferably 1.0 ⁇ g / mL or more, and preferably 1.0 ⁇ g / mL to 1000 ⁇ g / mL.
  • extracellular vesicles derived from tumors are a strong source of tumor-related antigens.
  • the present inventor analyzed the immunostimulatory ability of extracellular vesicles obtained from tumors administered with OBP-301 or OBP-702.
  • Extracellular vesicles were isolated by ultracentrifugation of MIA PaCa-2 and Panc-1 (both human pancreatic duct adenocarcinoma cell lines) conditioned medium after administration of OBP-301 and OBP-702 (Exo301, Called Exo702).
  • LC / MS analysis identified 19 proteins commonly contained in Exo301 and Exo702 isolated from two cancer cell lines, one of which was the dendritic cell surface marker CD86.
  • the extracellular vesicle of the present invention has a function of activating dendritic cells via the extracellular vesicle derived from the administered tumor. It is known that OBP-301 alone does not activate dendritic cells (Endo Y et al. Oncogene, 2008). Therefore, the present invention provides a dendritic cell activator containing the extracellular vesicles of the present invention.
  • the dendritic cell activator can be formulated in the same manner as the above-mentioned pharmaceutical composition and preparation.
  • FIGS. 1 and 2 Examples (outline) of a method for recovering exosomes are shown in FIGS. 1 and 2.
  • (1) Normal exosome recovery method (Fig. 1) 1. Spray 10 million HCT116 (human colorectal cancer cell line) cells in a 175T culture dish containing McCoy's culture medium supplemented with FBS. 2. After 24 hours (over night), change the supernatant to medium without FBS. 3. After culturing for another 48 hours, collect the supernatant.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line
  • Exo301 recovery method (Fig. 1) 1. Spray 10 million HCT116 (human colorectal cancer cell line) cells in a 175T culture dish containing McCoy's culture medium supplemented with FBS. 2. After 24 hours (over night), OBP-301 was sprayed to infect cells. The amount of OBP-301 shall be the IC50 concentration. 3. After culturing for 24 hours, change the supernatant to a medium without FBS. 4. After culturing for another 48 hours, collect the supernatant.
  • HCT116 human colorectal cancer cell line
  • FIG. 3 A photomicrograph of the recovered exosomes is shown in FIG.
  • the upper panel (Exo) is an exosome recovered from HCT116 (human colorectal cancer cell line)
  • the lower panel (Exo301) is an exosome recovered from HCT116 treated with OBP-301. From FIG. 3, it was shown that Exo301 was slightly larger than Exo301 macroscopically, and the inside of Exo301 was darker, and it was possible that OBP-301 was contained. Moreover, as a result of measuring the size of the obtained exosomes with a zetasizer, it was objectively shown that Exo301 was slightly larger than Exo (Fig. 4).
  • ExoCap a commercially available immunoprecipitation kit (exosome recovery kit) called ExoCap (EC) was used to react the microbeads in the kit with Exo301 (EC-Exo301), which was used for PCR measurement.
  • EC immunoprecipitation kit
  • EC-Exo301 Exo301
  • PCR Reagent Custom TaqMan MGB Probe (Obtained from Applied Biosystems) Template array: 5'--FAM --CTGTGTCTAGAGAATGC --MGB --3' (SEQ ID NO: 1) Forward primer sequence: 5'-CCTGAGACGCCCGACATC --3' (SEQ ID NO: 2) Reverse primer sequence: 5'-GGACCGGAGTCACAGCTATCC --3' (SEQ ID NO: 3) Cycle conditions: 95 ° C for 20 minutes, 60 ° C for 20 seconds, 1 cycle, 40 cycles
  • EC-Exo301 contains about 70% E1A when Exo301 is used as a reference. EC does not include E1A (control). Of the recovered Exo301, pure Exo301 accounted for about 70% (Fig. 5). In FIG. 5, the vertical axis represents the relative content of E1A when the amount of E1A contained in Exo301 is used as a reference (1.0).
  • Exo301 Cytotoxic Activity Test Exo301 is considered to contain OBP-301 and pure Exo301 as described above, but has a very strong cell-killing effect. Therefore, using Exo301 and exosomes (Exo) not treated with OBP-301, the cytotoxicity rate for HCT116 cells was confirmed by XTT.
  • Exo301 contained many OBP-301 or related elements.
  • Exo301 shows high cytotoxicity to HCT116, its cytotoxic mechanism is almost the same as OBP-301, tumor-derived exosomes contain substances contained in the derived cells, and the substances are transmitted to distant sites via exosomes. It was confirmed that it would be delivered.
  • Exo301 reacted with the anti-CD63 antibody had a cell-killing effect attenuated from 0.5 to 0.8 under the reaction with an anti-CD63 antibody amount of 1 ⁇ g / mL (Fig. 7).
  • the vertical axis represents the ratio of viable cells when the cell viability without Exo301 and anti-CD63 antibody is used as a reference (1.0) and each is administered at the described concentration.
  • the tumor diameter was measured at the time of administration of each drug (3 times), and then the major axis and minor axis were measured twice a week, and the tumor size was determined by major axis x minor axis x minor axis / 2.
  • the vertical axis represents the tumor volume obtained above, and the tumor having a volume exceeding 4000 cm 3 appears or is measured until the 28th.
  • the growth of the tumor was significantly suppressed in the OBP-301 / OBP-301 + GW4869 treatment group as compared with the PBS and GW4869 treatment groups (Fig. 9).
  • the vertical axis represents the tumor volume as in FIG. 8, and the measurement conditions were the same.
  • the OBP-301 treated group had a significant difference in tumor growth compared to the other groups. Is suppressed. Therefore, it was shown that even in immunized mice, exosomes generated from the treated tumor bring about an antitumor effect (abscopal effect) in the non-treated tumor.
  • rectal cancer HCT116-RFP
  • liver metastasis model HCT116-Luc
  • IVIS cells containing Luc
  • the rectal side is treated with PBS, OBP-301, OBP-301 + GW4869, and RFP existing in each organ is immunostained. Quantified.
  • the vertical axis represents the stained region quantified by ImageJ as a result of performing immunostaining with RFP of each organ. Since the primary lesion was a cell containing RFP, it was certain that RFP was present, and there was no difference between the three groups. In liver metastatic tumors and other major organs, only liver metastatic tumors in the group treated with OBP-301 were not significantly different from the primary lesion. That is, the RFP value was significantly lower in the other parts.
  • Dendritic cell activation test ⁇ Materials and methods> Extracellular vesicles were isolated by ultracentrifugation of MIA PaCa-2 and Panc-1 (both human pancreatic duct adenocarcinoma cell lines) conditioned medium after administration of OBP-301 and OBP-702 (Exo301, Called Exo702). The size distribution of exosomes derived from MIA PaCa-2 and Panc-1 is shown in FIG. When the isolated extracellular vesicles were subjected to LC / MS analysis, 19 types of proteins commonly contained in Exo301 and Exo702 were identified, one of which was the dendritic cell surface marker CD86.
  • Exo, Exo301, Exo702 By administering Exo, Exo301, Exo702 at a concentration of 20 ug / ml to immature dendritic cells and measuring whether they change to mature dendritic cells by measuring CD86, CD80, CD83 and IFN- ⁇ by flow cytometry. Analyzed.

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Abstract

【課題】腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞の提供。 【解決手段】本発明は、腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞に関し、生体から採取された細胞又は組織に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物から腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を分離することにより当該細胞外小胞を得、これを前記生体に投与することを特徴とする。

Description

腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞
　本発明は、腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来細胞外小胞に関する。
　エクソソーム（Exosome）は、細胞から分泌される直径50-150 nmの小胞体である。その表面は細胞膜由来の脂質やタンパク質で構成される脂質二重膜であり、内部には各種核酸及びタンパク質など細胞内物質を含む。エクソソームは細胞外小胞（Extracellular vesicle）の一種とされており、細胞外小胞にはエクソソームのほかにマイクロベシクル、アポトーシス小体があり、それぞれ産生機構や大きさが異なる（非特許文献１：Yamamoto T, et al. Sci Technol Adv Mater. 2019）。
　エクソソームは臓器・細胞から分泌されるため、体液（血液、髄液、尿など）にも存在しており、体中を循環する。エクソソームの重要な機能として、細胞間の情報伝達を担っていることが注目されている（非特許文献２：Kikuchi S, et al. Int. J. Mol. Sci. 2019）。上記の通り、エクソソームは、その内部に核酸などを含むが、分泌した細胞の核酸（マイクロRNA、メッセンジャーRNA）がエクソソームを介して受け取り側の細胞に伝達され、機能していることが知られている（非特許文献３：Zhang H, et al.Nat Commun. 2017）。このため、エクソソームは細胞間のコミュニケーションツールとして働いていると考えられている。
　また、放射線療法などの局所治療後に治療範囲外の腫瘍縮小が免疫の活性化によって引き起こされることをアブスコパル効果と言うが、エクソソームがこの効果に関与しているのではないかと言われている。現在、エクソソーム内に含まれるmiRNAやmRNAがアブスコパル効果へと関与していることを確認するための各種研究が行われているが、免疫の活性を超越してエクソソーム内に含まれる物質によってアブスコパル効果が生じることは、未だ証明されていない。
　他方、腫瘍融解ウイルスであるテロメライシン（登録商標）（OBP-301）は、がん細胞で特異的に増殖し、がん細胞を破壊することができるように遺伝子改変された5型のアデノウイルスである（特許文献１：WO2004/005511)。OBP-301は、テロメラーゼ活性の高いがん細胞で特異的に増殖することでがん細胞を溶解させる強い抗腫瘍活性を示すことや、正常な細胞の中では増殖能力が極めて低いことから臨床的有用性が期待され、臨床試験も進められている。
　しかしながら、エクソソームと腫瘍融解ウイルスとの関係は未だ明らかにされていない。
国際公開2004/005511号パンフレット
Yamamoto T, et al. Sci Technol Adv Mater. 2019 Kikuchi S, et al. Int. J. Mol. Sci. 2019 Zhang H, et al.Nat Commun. 2017
　腫瘍融解ウイルスには有望な抗腫瘍効果があることは証明されてきたが、肝臓や脾臓といった細網内皮系に非特異的にトラップされたり、例えば5型アデノウイルスの中和抗体は成人男性の80%が持っていることにより全身投与後にウイルスが中和されたりするため、局所投与に限定されるという課題があった。
　また、効率的に腫瘍に集積し、癌細胞に感染できる腫瘍溶解ウイルスが求められていた。
  上記のことから、細胞外小胞を利用した腫瘍融解ウイルスにおけるさらに有用な医薬の開発が求められていた。
  本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、細胞外小胞を含む腫瘍融解ウイルスが強い抗腫瘍効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
  [１] 腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞。
  [２] ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである、[１]に記載の細胞外小胞。
  [３] 腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるウイルスである[２]に記載の細胞外小胞。
  [４] ウイルスが組換えアデノウイルスである、[１]～[３]のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  [５] 組換えアデノウイルスが、OBP-301又はOBP-702である[４]に記載の細胞外小胞。
  [６] エクソソームである[１]～[５]のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  [７] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に対してIC50±20%の範囲内の濃度となるように腫瘍融解ウイルスを感染させて培養することにより得られた、[１]～[６]のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  [８] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍溶解ウイルスを感染させた後、動物血清由来エクソソームを含有しない培養液で培養することにより得られた、[１]～[７]のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  [９] 培養物を、100g～10,000gで遠心分離処理する工程、又は100g～10,000gで遠心分離処理した後に上清画分をフィルターに供する工程と、100,000gの遠心分離処理する工程とを含む、[７]又は[８]に記載の細胞外小胞。
  [１０] [１]～[９]のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む医薬。
  [１１] 腫瘍を治療するための、[１０]に記載の医薬。
  [１２] アブスコパル効果を有する、[１１]に記載の医薬。
  [１３] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物を遠心分離処理することにより腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を得、当該細胞外小胞を前記生体に戻すための、[１０]～[１２]のいずれか１項に記載の医薬。
　[１４] [１]～[９]のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む抗腫瘍製剤。
  [１５] アブスコパル効果を有する、[１４]に記載の抗腫瘍製剤。
  [１６] [１]～[９]のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む樹状細胞活性化剤。
  [１７] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物から腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を分離することを特徴とする当該細胞外小胞の製造方法。
  [１８] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に対してIC50±20%の範囲内の濃度となるように腫瘍融解ウイルスを感染させて培養する工程を含む、[１７]に記載の方法。
  [１９] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍溶解ウイルスを感染させた後、動物血清由来エクソソームを含有しない培養液で培養する工程を含む、[１７]又は[１８]に記載の方法。
  [２０] 培養物を、100g～10,000gで遠心分離処理する工程、又は100g～10,000gで遠心分離処理した後に上清画分をフィルターに供する工程と、100,000gの遠心分離処理する工程とを含む、[１７]～[１９]のいずれか１項に記載の方法。
  [２１] 生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物から腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を分離することにより当該細胞外小胞を得、これを前記生体に投与することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
  [２２] 細胞外小胞が、分離された画分中に、個数比または質量比として少なくとも７０％含有される、[１７]～[２１]のいずれか１項に記載の方法。
  本発明により、腫瘍融解ウイルスを含む細胞外小胞が提供される。本発明の細胞外小胞は、抗腫瘍医薬として有用である。
　本発明により、従来課題とされていた中和抗体による問題を回避することができる。その結果、同じ投与量でもより高い抗腫瘍効果が期待でき、また、少ない投与量でも同等の抗腫瘍効果が期待できる。さらに、効率的な腫瘍への集積、癌細胞に対する感染、全身投与での抗腫瘍効果を発揮することができる。
本発明において使用されるエクソソームの回収法の概要を示す図である。 本発明において使用されるエクソソームの回収法の概要を示す図である。 回収されたエクソソームの顕微鏡写真である。 回収されたエクソソームのサイズを測定した結果を示す図である。 回収されたExo301のうち、pure Exo301の存在割合を示す図である。 各エクソソームの細胞傷害活性の試験結果を示す図である。図６において、ａはExo、ｂはExo301の細胞傷害活性の試験結果をを表す。 Pure Exo301の細胞傷害活性を求めるための試験結果を示す図である。図７において、ａはIgG、ｂは抗CD63抗体と反応させたときの結果を表す。 マウスにHCT116細胞(ヒト大腸癌細胞株)を移植し、治療側腫瘍でのOBP-301、非治療側腫瘍でのExo301の抗腫瘍効果を示す図である。図８のグラフにおいて、ａはPBS、ｂはGW4869、ｃはOBP-301、ｄはOBP-301及びGW4869で処理したときの結果を表す。 マウスにCT26細胞（マウス大腸癌細胞株）を移植し、治療側腫瘍でのOBP-301、非治療側腫瘍でのExo301の抗腫瘍効果を示す図である。図９に示すグラフにおいて、ａ、ｂ、ｃ、ｄの符号は図８と同じである。 直腸癌(HCT116-RFP)と肝転移モデル(HCT116-Luc)を用いて、OBP-301で治療された直腸癌から分泌されるエクソソームの指向性を確認した結果を示す図である。図１０において、ａはPBS、ｂはOBP-301、ｃはOBP-301及びGW4869で処理したときの結果を表す。 Panc-1細胞（ヒト膵癌細胞株）にOBP-702を感染させて回収されたエクソソームの電子顕微鏡写真である。 Panc-1細胞及びMIA PaCa-2細胞（いずれもヒト膵癌細胞株）から得られたエクソソームのサイズを示す図である。図１２において、ａはExo、ｂはExo301、ｃはExo702の結果を表す。 Exo301及びExo702のPanc-1細胞及びMIA PaCa-2細胞に対する細胞障害活性を示す図である。図１３において、ａはExo、ｂはExo301、ｃはExo702の結果を表す。 Exo301及びExo702のDC細胞に対する作用を示す図である。 Exo301及びExo702をDC細胞に作用させたときの細胞表面マーカーの発現を示す図である。
１．腫瘍融解ウイルス
　本発明の細胞外小体は、腫瘍融解ウイルスを含有するものである。
　本発明において使用されるウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスであり、腫瘍細胞特異的に増殖することができる。腫瘍細胞特異的とは、正常細胞と比較して腫瘍細胞に選択的に作用し、正常細胞にはほとんど作用しないことを意味する。ウイルスには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルスなどが含まれる。これらのうち、アデノウイルス、ヘルペスウイルスが好ましく、安全性の観点からアデノウイルスが特に好ましい。アデノウイルスのなかでも、5型アデノウイルスは、取り扱いが容易などの理由から特に好ましい。本発明では、腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスとして、テロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)プロモーターにより制御されるウイルスを挙げることができ、hTERTプロモーターを含むアデノウイルスが好ましい。
　さらに本発明においては、組換え型の腫瘍融解ウイルスを用いることができる。組換え型の腫瘍溶解ウイルスは、ヒトテロメラーゼのプロモーター、E1A遺伝子、IRES配列およびE1B遺伝子をこの順に含むポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれているウイルスを意味する。組換え腫瘍融解アデノウイルスは、WO 2004/5511に記載の方法により得ることができる。あるいは、組換え腫瘍融解アデノウイルスの一つであるOBP-301は、Oncolys BioPharma Inc.から「Telomelysin」（登録商標）として入手できる。
　さらに、本発明において使用される腫瘍融解ウイルスとして、OBP-301に腫瘍抑制遺伝子p53を搭載させたOBP-702、fiberにRGD配列を搭載したOBP-502、fiberにRGD配列を搭載し、かつE3領域が欠損したOBP-405などが挙げられる。
　OBP-702、OBP-405、OBP-502はOncolys BioPharma Inc.から入手することができる。
２．細胞外小胞
　本発明において使用される細胞外小胞は、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体のいずれであってもよいが、EPR効果(Enhanced Permeation and Retention Effect)を考慮するとサイズの小さいエクソソームが望ましい。エクソソームはエンドソーム由来の小胞、マイクロベシクルは細胞から直接分泌された小胞、アポトーシス小体は細胞死により生じた細胞断片である。
　細胞外小胞はすべての組織から回収可能である。すなわち人を含めた動物のみならず、食物などからも回収可能であるとされている。（Wang Q, et al. Nat Commun. 2013）しかし、全身投与にて腫瘍への指向性を重視するためには、腫瘍由来の細胞外小胞が最も適切であると考えられるが、腫瘍の悪性情報がこれらの細胞外小胞には含まれるため倫理的に適さない。腫瘍指向性を維持しながら倫理的に許容される最も適切な組織としては、投与対象となる患者由来の正常組織(可能であれば、癌発生臓器)が最も望ましいと考えられる。昨今の癌治療においては、患者個々に対してオーダーメイド医療が推進されていることから、患者由来の正常組織を用いることは適切であると考えられる。また、この場合の最大の利点として、自己由来組織であるため免疫反応が最小限に抑えられる可能性がある。なお、腫瘍由来の細胞外小胞であっても、細胞外小胞が有する悪性化促進因子よりも本製剤の抗腫瘍効果が上回り、かつ、臨床上安全性が確認される場合には、使用できる可能性が残されている。
その一方で、ヒト由来正常組織株（間葉系幹細胞や線維芽細胞）、ウシ由来ミルクなどを用いることも可能である。特に間葉系幹細胞はそれ自身が再生能力を持つとされ、間葉系幹細胞由来細胞外小胞にもその能力は引き継がれると考えられるため（Zhang Y, et al. J Neurosurg. 2015.）、癌細胞由来細胞外小胞よりも指向性には劣るが、自らの再生能力とExo301（OBP-301を含有するエクソソーム）の治療能力が組み合わさることで、強力な治療効果を得る可能性がある。
　本発明の腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞の製造方法を説明する。
　まず、エクソソームなどの細胞外小胞が由来する組織又は細胞を生体から採取する。採取された組織又は細胞を培養し、培養物を得る。
　組織の採取は、生検、外科的切除などにより行うことができるが、間葉系幹細胞（樹立細胞株）を用いることもできる。
　腫瘍溶解ウイルスを感染させる場合の細胞外小胞の回収方法は、例えば、採取細胞に腫瘍溶解ウイルスを直接注入又は感染し、動物血清由来エクソソームが混入していない培養液で所定時間（例えば6時間）培養した後に、メスなどで細胞を可及的に粉砕し、4℃で48時間培養した後、培養液を回収する方法などが挙げられる（Jingushi K, et al. Int J Cancer. 2018.）。
　また、別の細胞外小胞の回収方法として、例えば、採取細胞に腫瘍溶解ウイルスを直接注入又は感染し、動物血清を含有する培地で所定時間培養した後に、動物血清を含有しない培地で所定時間培養した後、培養液を回収する方法などが挙げられる。
　動物血清を含有する培地で培養する時間としては、特に制限はないが、10～40時間が好ましく、20～30時間がより好ましく、24時間が特に好ましい。
　動物血清を含有しない培地で培養する時間としては、特に制限はないが、24～72時間が好ましく、36～60時間がより好ましく、42～54時間がさらに好ましく、48時間が特に好ましい。
　ここで、生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に対して単位集団あたりの細胞の50％増殖阻害濃度をIC50とすると、採取細胞に腫瘍溶解ウイルスを感染させる濃度としては、特に制限はないが、採取細胞に対しIC50±20%の範囲内の濃度となるように腫瘍融解ウイルスを感染させて培養することが好ましく、IC50±10%の範囲内となる濃度がより好ましく、IC50±5%の範囲内となる濃度がさらに好ましく、IC50が特に好ましい。
　上記培養により得られた培養物から、細胞外小胞を採取（回収）する。
　細胞外小胞のうち、エクソソームの回収法は、超遠心分離法、PEG沈殿法、免疫沈降法、Tim4 （マクロファージに発現するエクソソームの受容体）を用いた磁気ビーズによるアフィニティ法、密度勾配遠心法などが挙げられる。市販のエクソソーム単離用試薬（キット）を採用して、エクソソームを単離、回収してもよい。
　超遠心分離法の場合、例えば、予め100g～10,000g程度の遠心力で数段階行い（例：100gを10分、2,000gを10分、10,000gを30分）、上清画分について、80,000g～120,000gの遠心力、例えば100,000g程度の遠心力で70分を1回以上、超遠心分離を行うことによって、高純度のエクソソームを得ることができる。なお、工程については、100g～10,000gの遠心力で１回遠心分離を行った後、上清画分をフィルターに供することで、100gおよび10,000gの遠心分離を省略することも可能である。
　フィルターを使用する場合の100g～10,000gの遠心分離としては、500g～5,000gの遠心力が好ましく、1,000g～3,000gがより好ましく、2,000ｇが特に好ましい。
フィルターの孔径としては、1,000nm～100nmが好ましく、800nm～200nmがより好ましく、800nmと220nmの順に２回フィルターを通すことが特に好ましい。
超遠心分離としては、80,000g～120,000gの遠心力が好ましく、90,000g～110,000gがより好ましく、100,000gが特に好ましい。
　ウイルス含有細胞外小胞とウイルスは、大きさ及び質量がほぼ同じであるため、上記超遠心分離により回収された画分中に両方が含まれている可能性がある。腫瘍溶解アデノウイルスの場合、E1Aの相対含有量からその個数比及び質量比を予測することができる。
　本発明においては、細胞外小胞は、超遠心により回収された画分中に、ウイルス含有細胞外小胞として少なくとも７０％以上、８０％以上、又は９０％以上含有される。さらに、超遠心により回収された画分を熱処理またはアルカリ処理（たとえば、100 mM NaOH 20分間）することにより、その純度を高めることもできる。
　また、細胞外小胞は、上記組織や細胞のみならず、牛乳、尿、食物などからも回収することが可能である。
　それぞれの物質から回収する方法は下記文献に記載されており、公知である
　牛乳：脱脂乳を37℃で10分間余熱し室温で5分間酢酸と混合。その後4℃で10,000gで10分間遠心する。0,22nmフィルターを通し、4℃、210,000gで70分遠心しPBSで攪拌する。（Somiya M, et al. J Extracell Vesicles. 2018.）
　尿：回収した尿を20℃、17,000gで20分間遠心し、220nmのフィルターに通した後20℃、100000gで2時間遠心する。その後PBSにて攪拌する。（Liu F, et al. J Cell Biochem, 2019）
　食物：果物の場合、果汁をPBSで希釈し、500gで10分、2,000gで20分、5,000gで30分、10,000gで1時間、100,000gで2時間遠心し、さらに密度勾配を利用し回収する。（Wang Q, et al. Nat Commun. 2013）
　このようにして回収した細胞外小胞に、OBP-301を導入するには超音波処理(Kim MS, et al. Nanomedicine. 2016.)や電気穿孔法(Kamerkar S, et al. Nature. 2017.)によって可能である。
　回収された細胞外小胞が目的のものであることの確認は、透過型電子顕微鏡による形態観察、PCRを利用した遺伝子解析、免疫学的手法（ELISA、FACS等）、ウエスタンブロットなどにより行うことができる。
　例えば、細胞外小胞には核酸が含まれる。そのような核酸には、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、並びに、タンパク質コード領域と重複するＲＮＡ転写物、反復配列のほか、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの小型非コーディングＲＮＡ種、さらには、ミトコンドリアＤＮＡ、レトロトランスポゾンの短いＤＮＡ配列等が含まれる。従って、これらの核酸配列を標的としてPCRを行うことにより、目的の細胞外小胞であることが確認できる。
　また、細胞外小胞には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ガングリオシド（ＧＭ３）、ホスファチジルイノシトール、プロスタグランジン及びリゾビスホスファチジン酸等の膜脂質成分が含まれる。これらの脂質成分をクロマトグラフィー等に付すことで確認することができる。
　さらには、いくつかのタンパク質はエクソソームマーカーとして認識されており、なかでもテトラスパニン（例えばCD9、ＣＤ６３、ＣＤ８１）をエクソソームマーカーとして検出に使用することができる。
３．医薬、医薬組成物及医薬製剤
　本発明は、腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞含む医薬を提供する。また、本発明は、当該細胞外小胞及び薬学的に許容される単体を含む医薬組成物及び抗腫瘍製剤を提供する。これらの医薬、医薬組成物及び製剤は、腫瘍を治療するために使用される。
　本発明の医薬、医薬組成物又は製剤の使用の対象となる標的腫瘍は、特に限定されるものではない。例えば、脳腫瘍（下垂体腺腫、神経膠腫を含む）、頭頸部癌、頚癌、顎癌、上顎癌、顎下腺癌、口腔癌、唾液腺癌、舌下腺癌、耳下腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳癌、膵癌（膵管癌を含む）、胃癌、胆道癌（胆管癌、胆嚢癌を含む）小腸又は十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌を含む）、卵巣癌、甲状腺癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、悪性リンパ腫（ホジキン型リンパ腫、非ホジキン型リンパ腫を含む）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）及び急性リンパ性白血病（ALL）、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異型成症候群などを含む）、皮膚癌、メラノーマなどを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物は、有効成分である細胞外小胞をその活性を失わずに有効量含有している限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含めることができる。例えば、希釈剤、賦形剤等として、一般に使用される担体を適用することができる。
  例えば、水、生理学的緩衝液（ＰＢＳ等）、種々の有機溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、アルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油等が挙げられる。さらには、種々の充填剤、増量剤、結合剤、表面活性剤、色素、香料等を添加することができる。
  本発明の医薬組成物及び製剤は、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等の形態とすることができる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
  本発明の医薬、医薬組成物及び製剤は、治療目的や患者に応じた形態、方法、用量で使用することができる。
   添加量および添加の回数は、エクソソーム製造の際の腫瘍細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
本願発明において得られる細胞外小胞は、感染させる細胞、腫瘍溶解ウイルス並びにウイルス感染及びエクソソーム回収を含む製造条件等によって、含有するタンパク質その他の組成や粒径及びその分布の値が当然に変化するため、その物を構造又は特性により直接特定することは非実際的である。また、さまざまな細胞、ウイルス、製造条件等を組み合わせて製造し、それぞれについての組成及び粒径その他を測定することは、現実的ではない回数の実験等を行うことを要するものであり、その結果を特許請求の範囲に包括的に表現することもできない。
　さらに、本発明においては、患者から組織又は細胞を採取しウイルス感染させて培養した後、培養後に回収した細胞外小胞を当該患者に戻す態様で使用することができる。
　また本発明において、本発明の医薬組成物又は製剤を腫瘍に適用することにより、非治療側の腫瘍においても抗腫瘍効果、すなわちアブスコパル効果を発揮させることができる。この効果は、エクソソームに内包されたOBP-301やOBP-702等、すなわちExo301、Exo702等により引き起こされるものと考えられる。
　細胞外小胞有効量として、培地中の濃度は、1.0μｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、1.0μｇ／ｍＬ～1000μｇ／ｍＬであることが好ましい。ＣＤ４７発現抑制効果を一定期間以上継続させるためには、例えば１日あたり１～3回、１日～7日程度の間隔で繰り返すことが好ましい。
　ところで、腫瘍に由来する細胞外小胞は腫瘍関連抗原の有力なソースである。本発明者は、OBP-301やOBP-702を投与した腫瘍から得られる細胞外小胞の免疫活性化能力を解析した。細胞外小胞は、OBP-301やOBP-702投与後のMIA PaCa-2及びPanc-1（ともにヒト膵管腺癌細胞株）の馴化培地を超遠心することで単離した（これをExo301、Exo702と呼ぶ）。LC/MS解析により2種類の癌細胞株から単離したExo301とExo702に共通して含まれるタンパク質19種類が同定され、そのうち1つは樹状細胞の表面マーカーCD86であった。ウェスタンブロットにより、MIA PaCa-2及びPanc-1から単離したExo301とExo702におけるCD86の発現が示された。さらに、樹状細胞に対するExo301とExo702の免疫原性効果を解析したところ、CD86やCD86の共刺激分子であるCD80と、樹状細胞の成熟マーカーであるCD83の発現がExo702により上昇しており、結果的に樹状細胞からのIFN-γ産生量が顕著に増大した。
　以上の結果より、本発明の細胞外小胞には、投与された腫瘍に由来する細胞外小胞を介して樹状細胞を活性化する働きがある。OBP-301単独では樹状細胞を活性化しないことが知られている（Endo Y et al. Oncogene, 2008）。
　従って、本発明は、本発明の細胞外小胞を含む樹状細胞活性化剤を提供する。樹状細胞活性化剤は、上記医薬組成物及び製剤と同様に処方することができる。
  実施例
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
　エクソソームの回収
　エクソソームの回収方法の例（概要）を図１及び図２に示す。
（１）通常のエクソソームの回収方法（図１）
  1. 1,000万個のHCT116(ヒト大腸癌細胞株)細胞を、FBSが添加されたMcCoy’s培養液を含む175T培養皿に散布する。
  2. 24時間後(over night)、上清をFBSの入ってない培地に変更する。
  3. さらに48時間培養後、上清を回収する。
（２）Exo301の回収方法（図１）
　1. 1,000万個のHCT116(ヒト大腸癌細胞株)細胞を、FBSが添加されたMcCoy’s培養液を含む175T培養皿に散布する。
  2. 24時間後(over night)、OBP-301を散布し細胞に感染させた。OBP-301の量はIC50濃度とする。
  3. 24時間培養後、上清をFBSの入ってないメディウムに変更する。
  4. さらに48時間培養後、上清を回収する。
（３）遠心分離
　1. 上記（１）及び（２）の操作により回収した上清を遠心(10分、2,000g)した。
　2. １の上清を回収し、0.8μm、0.22μmのフィルターに通した。
　3. ２で回収した液体を70分、100,000gで超遠心し、上清を破棄した。
　4. ３で回収したペレットにPBSを加え70分、100,000gで再度超遠心し、上清を破棄し、沈殿したペレットをPBSで溶解し、これをエクソソームとした。
　回収したエクソソームの顕微鏡写真を図３に示す。
　図３において、上パネル（Exo）は、HCT116(ヒト大腸癌細胞株)から回収したエクソソームであり、下パネル（Exo301）はOBP-301で処理したHCT116から回収したエクソソームである。
　図３より、ExoとExo301では肉眼的にExo301の方がやや大きく、さらにExo301の内部は濃くなっておりOBP-301が内包されている可能性が示された。また、得られたエクソソームの大きさを、ゼータサイザーにて測定した結果、ExoよりもExo301の方がやや大きいことが客観的に示された（図４）。
　Exo301中におけるOBP-301の確認
　本実施例では、実施例１により得られたエクソソームExo301において、OBP-301の含有率を測定した。すなわち、PCRによりOBP-301中のE1AがExo301中にどの程度入っているかを確認した。
　この際、Exo301とOBP-301は大きさおよび質量がほぼ同じであるため、回収法である超遠心法では、ほぼ同じ遠心力（G）で回収される可能性がある。すなわち、回収されるExo301としたものの中には、OBP-301とpure Exo301（「pure Exo301」とは、エクソソームの中にOBP-301成分が含まれたエクソソームを指す）が含まれている可能性がある。
　そこで、市販のExoCap(EC)という免疫沈降キット（エクソソーム回収キット）を用いて、キット中のマイクロビーズとExo301とを反応させ (EC-Exo301)、これをPCR測定に用いた。
　PCRの条件は以下の通りである。
　PCR試薬：カスタムTaqMan MGBプローブ（Applied Biosystems 社より入手）
テンプレート配列：5’ - FAM - CTGTGTCTAGAGAATGC - MGB - 3’（配列番号１）
　フォワードプライマー配列：5’ - CCTGAGACGCCCGACATC - 3’（配列番号２）
　リバースプライマー配列：5’ - GGACCGGAGTCACAGCTATCC - 3’（配列番号３）
　サイクル条件：95℃を20分、60℃を20秒サイクルを１サイクルとしてこれを40サイクル
　その結果、Exo301を基準としたときにEC-Exo301は約70％程度E1Aを含んでいる。ECにはE1Aは含まれない(コントロール)。
　回収されたExo301のうち、pure Exo301は70%程度を占めていた（図５）。図５において、縦軸は、Exo301に含まれるE1A量を基準(1.0)としたときの、E1Aの相対含有量を表す。
　Exo301の細胞傷害活性試験
　Exo301には、前記の通りOBP-301とpure Exo301が含まれていると考えられるが、非常に強い殺細胞効果を有する。そこで、Exo301、及びOBP-301処理を行っていないエクソソーム（Exo)を用いて、HCT116細胞に対する細胞傷害率をXTTにて確認した。
　XTT (2,3-bis [2- Methoxy- 4-nitro- 5-sulfophenyl ]- 2H- tetrazolium- 5-carboxyanilide inner salt)アッセイは、生細胞中のミトコンドリアの脱水素酵素により生存細胞の活性を測定することを基本原理としており、in vitroにおける細胞毒性をモニターするのに適した方法である。
　XTTアッセイは当分野で公知である。
　結果を図６に示す。
　図６より、Exo301は、0.1ug/mLの治療濃度で細胞傷害率約50％に達し、Exoとは異なる物質が回収されていることが示された。図６において、縦軸は、未治療(横軸の0)の時を基準(1.0)とし、それぞれを各濃度で投与したときの生存細胞の比を表す。
　In vitroにおいてExo301内にはOBP-301もしくはそれに関連した要素が多く内包されていると考えられた。Exo301はHCT116に対して高い細胞傷害性を示し、その細胞傷害メカニズムもOBP-301とほぼ同様であり、腫瘍由来エクソソームは由来細胞に含まれる物質を含み、その物質がエクソソームを介して遠隔部位へと送達されることを確認した。
（１）Exo301の細胞傷害試験
　本項では、Exo301細胞傷害率をXTTにて確認した。
　方法は、96wellプレートにHCT116を3,000個ずつ散布し24時間後に各用量で治療を行う。その72時間後に試薬を投入し、さらに6時間後に測定を行った。
　その結果、OBP-301とpure Exo301が含まれているExo301には、非常に強い殺細胞効果をもつことが示された（図６）。
（２）Pure Exo301の細胞傷害試験
　また、本項では、Pure Exo301の細胞傷害率をXTTにて確認した。
　エクソソーム表面抗体であるCD63に対する抗CD63抗体とエクソソームを反応させると、エクソソームはオプソニン作用によって、不活化されることが証明されている。（参考文献：Nishida-Aoki N, et al. Mol Ther. 2017.）
　そこで、抗CD63抗体と反応させたExo301の細胞傷害活性を試験した。なお、IgGはコントロールとして使用した。
　その結果、抗CD63抗体と反応させたExo301は、抗CD63抗体量1μg/mLと反応下において殺細胞効果が0.5から0.8程度まで減弱した(図７)。図７において、縦軸は、Exo301および抗CD63抗体を含まない細胞生存率を基準(1.0)にし、それぞれを記載の濃度で投与した際の生存細胞の比を表す。他方、Exo301とIgGを投与したものは0.5のままであった
　以上より、エクソソームを不活化することにより殺細胞効果が0.3/0.5＝60%程度減弱された。この減弱分がpure Exo301による殺細胞効果である。
In vivoでのアブスコパル効果の確認
（１）免疫不全マウスを用いた実験
　免疫不全マウス（BALB/C nu-nu)にHCT116を用いて皮下腫瘍を背側に2個作成した。
　片側のみを4群(PBS、GW4869、OBP-301、OBP-301+GW4869)で治療した。なお、GW4869はエクソソーム産生阻害剤であり、本実施例でも阻害されることをin vitroでの予備実験で確認している。
　腫瘍径の測定は、各薬剤投与時(3回)、その後は週に2回ほどの頻度で長径・短径を測定し、そこから長径×短径×短径／２によって腫瘍サイズ求めた。
　その結果、治療側腫瘍ではPBS、GW4869治療群と比較してOBP-301、OBP-301+GW4869治療群は有意差をもって腫瘍の成長が抑制された（図８）。図８のグラフにおいて、縦軸は上記で求めた腫瘍体積を表し、体積が4000cm3を超える腫瘍が出現する、もしくは28日まで測定を行った
　一方、非治療側腫瘍ではOBP-301治療群のみが有意差をもってその他の群よりも腫瘍の成長が抑制された。
　免疫のないマウスにおいて導かれたこの非治療側腫瘍での結果は、エクソソームの産生を阻害すると腫瘍の成長抑制ができなくなるということを示し、エクソソームに内包されたOBP-301、すなわちExo301が抗腫瘍効果（アブスコパル効果）を引き起こしたと考えられる。
（２）正常免疫マウスを用いた実験
　正常免疫を有するマウス（BALB/C）を用いて、上記（１）の手法に準じてCT26(マウス大腸癌細胞)を皮下腫瘍として背側に2個作成した。
　治療方法・治療群は前記と同じである。
　その結果、治療側腫瘍ではPBS、GW4869治療群と比較してOBP-301・OBP-301+GW4869治療群は有意差をもって腫瘍の成長が抑制された（図９）。図９のグラフにおいて、縦軸は図8と同様に腫瘍体積を表し、測定条件も同様とした
　さらに、非治療側腫瘍ではOBP-301治療群のみが有意差をもってその他の群よりも腫瘍の成長が抑制されている。
　従って、免疫のあるマウスにおいても、治療側腫瘍から発生したエクソソームが非治療側腫瘍において抗腫瘍効果（アブスコパル効果）をもたらすことが示された。
　エクソソームの腫瘍指向性の確認
　本実施例では、直腸癌(HCT116-RFP)と肝転移モデル(HCT116-Luc)を作成し、原発となる直腸癌を治療した後に分泌されるエクソソームの指向性を確認した。
　IVISで肝転移が確実にできていることを確認(Luc入り細胞)した後に、直腸側をPBS、OBP-301、OBP-301+GW4869で治療し、各臓器に存在するRFPを免疫染色にて定量した。
　結果を図１０に示す。図１０において、縦軸は、各臓器のRFPでの免疫染色を行った結果、染色された領域をImageJにて定量化したものを表す。
　原発巣はRFP入り細胞であるのでRFPが存在することは確実であり、3群で差はなかった。
　肝転移腫瘍、その他主要な臓器においてはOBP-301で治療した群の肝転移腫瘍のみが、原発巣と比較して有意差がなかった。すなわち、それ以外の部位は有意差をもってRFPが低値であった。
　以上より、RFPがエクソソームによって運ばれることが示され、エクソソームには同種腫瘍に対して指向性があることが示唆された。すなわち、エクソソームは由来細胞の性質を持ち、遠隔部位へと送達・取り込まれる能力があり、エクソソームが腫瘍指向性を保持することが示された。
　樹状細胞活性化試験
＜材料と方法＞
　細胞外小胞は、OBP-301とOBP-702投与後のMIA PaCa-2及びPanc-1（ともにヒト膵管腺癌細胞株）の馴化培地を超遠心することで単離した（これをExo301、Exo702と呼ぶ）。MIA PaCa-2及びPanc-1由来のエクソソームのサイズ分布を図１２に示す。
　単離した細胞外小胞をLC/MS解析にかけたところ、Exo301とExo702に共通して含まれるタンパク質19種類が同定され、そのうち1つは樹状細胞の表面マーカーCD86であった。
　さらに、ウェスタンブロットによりExo301とExo702におけるCD86の発現を確認したところ、MIA PaCa-2及びPanc-1由来のExo301とExo702におけるCD86の発現が示された。
　さらに、樹状細胞に対するExo702の免疫原性効果を解析した。ヒト単球性白血病細胞株THP1をIL-4 100ng/mlとGM-CSF 100ng/mlで5日間刺激して未成熟樹状細胞に分化誘導した。未成熟樹状細胞にExo,Exo301,Exo702を20ug/mlの濃度で投与し、成熟樹状細胞に変化するかどうかを、フローサイトメトリーによりCD86,CD80、CD83及びIFN-γを測定することにより解析した。
＜結果＞
　その結果、Exo702を投与した樹状細胞では、CD86やCD86の共刺激分子であるCD80と、樹状細胞の成熟マーカーであるCD83の発現が上昇しており、結果的に樹状細胞からのIFN-γ産生量が顕著に増大した。
　以上の結果より、本発明の細胞外小胞には、投与された腫瘍に由来する細胞外小胞を介して樹状細胞を活性化する働きがあることが示された（図１３～１５）。
　配列番号１～３：合成DNA

Claims (22)

  1. 　腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞。
  2. 　ウイルスが腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスである、請求項１に記載の細胞外小胞。
  3. 　腫瘍細胞特異的に増殖するウイルスが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターにより制御されるウイルスである請求項２に記載の細胞外小胞。
  4. 　ウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  5. 　組換えアデノウイルスが、OBP-301又はOBP-702である請求項４に記載の細胞外小胞。
  6. 　エクソソームである請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  7. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に対してIC50±20%の範囲内の濃度となるように腫瘍融解ウイルスを感染させて培養することにより得られた、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  8. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍溶解ウイルスを感染させた後、動物血清由来エクソソームを含有しない培養液で培養することにより得られた、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞外小胞。
  9. 　培養物を、100g～10,000gで遠心分離処理する工程、又は100g～10,000gで遠心分離処理した後に上清画分をフィルターに供する工程と、100,000gの遠心分離処理する工程とを含む、請求項７又は８に記載の細胞外小胞。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む医薬。
  11. 　腫瘍を治療するための、請求項１０に記載の医薬。
  12. 　アブスコパル効果を有する、請求項１１に記載の医薬。
  13. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物を遠心分離処理することにより腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を得、当該細胞外小胞を前記生体に戻すための、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の医薬。
  14. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む抗腫瘍製剤。
  15. 　アブスコパル効果を有する、請求項１４に記載の抗腫瘍製剤。
  16. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む樹状細胞活性化剤。
  17. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物から腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を分離することを特徴とする当該細胞外小胞の製造方法。
  18. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に対してIC50±20%の範囲内の濃度となるように腫瘍融解ウイルスを感染させて培養する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍溶解ウイルスを感染させた後、動物血清由来エクソソームを含有しない培養液で培養する工程を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 　培養物を、100g～10,000gで遠心分離処理する工程、又は100g～10,000gで遠心分離処理した後に上清画分をフィルターに供する工程と、100,000gの遠心分離処理する工程とを含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　生体から採取された組織若しくは細胞、又は生体由来の株化細胞に腫瘍融解ウイルスを感染させて培養した後、得られる培養物から腫瘍融解ウイルスを含有する生体由来の細胞外小胞を分離することにより当該細胞外小胞を得、これを前記生体に投与することを特徴とする、腫瘍の治療方法。
  22. 　細胞外小胞が、分離された画分中に、個数比または質量比として少なくとも７０％含有される、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。
     
     
     
     
     
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