WO2023074723A1 - 腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカー - Google Patents

腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカー Download PDF

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WO2023074723A1
WO2023074723A1 PCT/JP2022/039851 JP2022039851W WO2023074723A1 WO 2023074723 A1 WO2023074723 A1 WO 2023074723A1 JP 2022039851 W JP2022039851 W JP 2022039851W WO 2023074723 A1 WO2023074723 A1 WO 2023074723A1
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WO
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muc1
mgam
diagnostic marker
urinary
renal
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PCT/JP2022/039851
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Inventor
豊 張田
慶一 滝澤
幸嗣 植田
Original Assignee
国立大学法人東京大学
公益財団法人がん研究会
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a diagnostic marker for renal dysfunction, a method for determining renal prognosis, a detection kit for a diagnostic marker for renal dysfunction, and a diagnostic marker for renal dysfunction.
  • CKD chronic kidney disease
  • CAKUT congenital anomalies of the kidney and urinary tract
  • Extracellular vesicles are particles that are naturally released from cells separated by lipid bilayers.
  • Urinary EVs (uEVs) or urinary exosomes contain specific proteins from cells of all parts of the nephron.
  • uEVs can be a resource of urinary biomarkers that reflect molecular expression changes in renal physiologic and pathological conditions.
  • uEV-based studies of biomarkers for various diseases such as acute kidney injury, glomerular disease, renal tubular disorder, polycystic kidney disease, and kidney transplant have been reported (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Urinary extracellular vesicles A position paper by the Urine Task Force of the International Society for Extracellular Vesicles. Erdbrugger U, et al., J Extracell Vesicles. 2093. Epub 2021 May 21.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and includes a method for detecting renal dysfunction diagnostic markers capable of diagnosing renal dysfunction with high accuracy and non-invasively, a method for determining renal prognosis, and a renal dysfunction diagnostic marker.
  • a detection kit and a diagnostic marker for renal dysfunction are provided.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for detecting a renal dysfunction diagnostic marker comprising measuring the expression level of MUC1 and/or MGAM in urinary extracellular vesicles derived from a subject.
  • [4] A method for determining renal prognosis, wherein the ratio of the expression level of MGAM and the expression level of MUC1 in urinary extracellular vesicles derived from a subject is calculated, and the ratio is a threshold value or more A method for determining that the prognosis is poor.
  • a kit for detecting a diagnostic marker for renal dysfunction comprising an anti-MUC1 antibody and/or an anti-MGAM antibody.
  • the kit of [6] further comprising an affinity substance for urinary extracellular vesicles.
  • the affinity substance is Tim4.
  • a marker for diagnosing renal dysfunction comprising MUC1 and/or MGAM in urinary extracellular vesicles derived from a subject.
  • the marker of [9] wherein the urinary extracellular vesicles are phosphatidylserine-positive.
  • the detection method of the renal dysfunction diagnostic marker which can diagnose renal dysfunction highly accurately and noninvasively, the renal prognosis determination method, the detection kit of a renal dysfunction diagnostic marker, and a renal dysfunction diagnostic marker are provided. can.
  • FIG. 4 shows a scheme of uEV isolation from urine samples using Tim4 affinity beads.
  • Urine samples were centrifuged at 1,200 ⁇ g for 20 min at 4° C. to remove cell debris and urine salts, and then at 10,000 ⁇ g for 30 min at 4° C. to detect large EVs such as apoptotic bodies. removed.
  • Streptavidin magnetic beads coupled with biotinylated Tim4 were added to the supernatant and the mixture was rotated at 20-25°C for 1 hour. The beads were washed three times with wash buffer and bound uEVs were eluted with elution buffer. It is a negative Tein transmission electron microscope image of uEV. Scale bar indicates 200 nm.
  • Nanoparticle tracking analysis of uEVs isolated from healthy controls Venn diagram of total protein detected in uEVs isolated from healthy controls. Bar graphs representing the abundance of common classical exosome markers (CD63, CD9) and classical microvesicle markers (Annexin A1) and ARRDC1-mediated microvesicle markers (TSG101) in healthy controls. The y-axis represents the log10 relative abundance.
  • KEGG/Wiki pathway analysis results of 1,298 common proteins contained in uEV from healthy controls (g: Profiler). The top 5 terms with the lowest adjusted P-values were extracted. Kidney cell explorer visualization of the relative abundance in nephron fractions of the top 50 molecules in uEV from healthy controls and immunofluorescence images of 5 of the 50 molecules in human kidney specimens.
  • Glutathione hydrolase 1 proenzyme (GGT1), phosphoglycerate kinase 1 (PGK1), uromodulin (UMOD), annexin A11 (ANXA11), and keratin 14 (KRT14) regulate proximal, Henle's loop, and distal tubules, respectively. , collecting ducts, and deep medullary pelvic epithelium.
  • the numbers above the figure represent each nephron segment. 1 podocyte; 2 apical cortex; 3 proximal tubules; 4 Henle's loops; 5 distal tubules; Scale bar represents 200 ⁇ m. Table showing baseline characteristics of Discovery cohort participants.
  • FIG. 3 is a correlation plot of particle count and urinary creatinine;
  • B Particle size versus particle correlation plot.
  • C Correlation plot of particle size and urinary creatinine. Correlation coefficients are expressed as Pearson's R.
  • A Density plot showing particle size distribution in healthy controls and CKD patients. Dotted lines indicate the average size of particles in each group.
  • B Boxplot comparing particle counts between healthy control and CKD patient samples.
  • C Boxplot comparing mean particle size between healthy control and CKD patient samples.
  • D Boxplot comparing peak size densities between healthy control and CKD patient samples. Data were compared using a two-tailed Welch's t-test.
  • FIG. 1 shows the selection process of candidate molecules for ELISA.
  • MGAM was the only transmembrane protein among 35 molecules that were elevated in bilateral hypoplastic kidney or CKD uEV.
  • MUC1 was particularly suitable for evaluation by Tim4-ELISA.
  • Standard curves for MUC1, MGAM, and exosome markers (CD9 and CD63) are obtained by plotting absorbance at 450 nm (y-axis) against values of standard concentration (x-axis).
  • R2 is the correlation coefficient of the standard curve.
  • A Schematic of sandwich ELISA using Tim4.
  • B Immunostaining image showing expression of MGAM, MUC1, and CD9 in nephron segments.
  • FIG. 10 is a graph comparing MUC1 and MGAM levels (absorbance at 450 nm) measured by customized ELISA in samples from healthy controls and CKD patients.
  • G1 indicates CKD patients with eGFR ⁇ 90 and G2-5 indicates CKD patients with eGFR ⁇ 90 mL/min/1.73 m 2 .
  • A ROC curve for distinguishing patients with reduced renal function (eGFR ⁇ 60) from healthy controls by logistic regression.
  • B ROC curve for distinguishing patients with reduced renal function (eGFR ⁇ 90) from healthy controls by logistic regression.
  • C ROC curve for distinguishing CKD patients with normal eGFR ⁇ 90 from healthy controls by logistic regression. Box and beeswarm plots of MGAM/MUC1 assay values (MGAM expression divided by MUC1 expression) in CKD patients and healthy controls with each renal function in the discovery and validation cohorts.
  • FIG. 10 is a graph examining the expression of exosome markers (CD9 and CD63) in uEVs of the validation cohort.
  • FIG. 10 is a graph examining the correlation between urinary albumin and ELISA expression levels of MGAM, MUC1, CD9, and CD63.
  • FIG. 10 is a graph examining the correlation between uEV and urinary MUC1 expression levels.
  • FIG. Correlation plots using 40 randomly selected cases from the validation cohort are shown. The correlation coefficient is expressed as Pearson's R. Values on the x-axis indicate absorbance at 450 nm by ELISA, and values on the y-axis represent urinary concentrations of MUC1 (U/mL).
  • ⁇ Diagnostic marker for renal dysfunction ⁇ This embodiment provides a renal dysfunction diagnostic marker comprising MUC1 and/or MGAM in subject-derived urinary extracellular vesicles.
  • Diseases that can be tested as renal dysfunction include chronic kidney disease, congenital renal and urinary tract abnormalities, hypoplastic kidney, dysplastic kidney, renal tubular dysgenesis, hydronephrosis, single kidney, and polycystic dysplastic kidney. , nephron aplasia, ciliopathy, autosomal recessive polycystic kidney disease, autosomal dominant polycystic kidney disease, renal scar, vesicoureteral reflux disease, megaureter, fused kidney, horseshoe kidney, and the like.
  • the present inventors comprehensively analyzed proteins in uEVs isolated from patients with hypoplastic kidney, and discovered markers for diagnosing renal dysfunction.
  • Subjects are not particularly limited, and include pediatric renal disease patients, adult renal disease patients, and the like.
  • MUC1 (Mucin1) is a type I transmembrane glycoprotein belonging to the family of mucin proteins, a protein consisting of an extracellular domain, a transmembrane domain and a short cytoplasmic domain. The expression level was decreased in uEV derived from patients with hypoplastic kidney.
  • MGAM (Maltase-Glucoamylase) is an ⁇ -glucosidase digestive enzyme and a transmembrane protein. The expression level was increased in uEV derived from patients with hypoplastic kidney.
  • the urinary extracellular vesicles are preferably phosphatidylserine-positive, and the renal dysfunction diagnostic marker of the present embodiment preferably further includes CD9.
  • CD9 is a cell surface glycoprotein found on the surface of exosomes. MGAM; MUC1 and MGAM; MUC1 and CD9; MGAM and CD9; MUC1, MGAM and CD9; The greater the number of marker molecules, the more accurate the diagnosis.
  • kits for detecting a diagnostic marker for renal dysfunction comprising an anti-MUC1 antibody and/or an anti-MGAM antibody.
  • Antibodies are not limited as long as they recognize antigens, and include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), antibody fragments, and the like.
  • the kit of this embodiment preferably further contains a substance with an affinity for urinary extracellular vesicles.
  • Substances with affinity for urinary extracellular vesicles include antibodies against molecules expressed on urinary extracellular vesicle membranes such as CD9, and phospholipid affinity substances. Phosphatidylserine affinity substances are preferred, and Tim4 is more preferred.
  • the kit of this embodiment preferably further contains a solid phase or carrier bound to a substance with an affinity for urinary extracellular vesicles.
  • the solid phase include glass substrates, silicon substrates, plastic substrates, metal substrates, etc. Plastic substrates used for ELISA and the like are preferred.
  • Carriers include beads of silicon, titanium dioxide, aluminum oxide, glass, polystyrene, cellulose, polyamides, and the like.
  • the kit of this embodiment preferably contains a plastic substrate on which Tim4 is immobilized and an antibody against MUC1 and/or MGAM.
  • a method for using the kit of the present embodiment urinary extracellular vesicles of a subject are captured on a Tim4-immobilized plastic substrate, and then labeled antibodies against MUC1 and/or MGAM are used to extract urinary extracellular vesicles.
  • a method for detecting MUC1 and/or MGAM expressed on the vesicle outer surface is included.
  • Substances used for labeling antibodies against MUC1 and/or MGAM include labeling enzymes such as horseradish peroxidase and alkaline phosphatase.
  • the present embodiment provides a method for detecting a diagnostic marker for renal dysfunction, comprising measuring the expression levels of MUC1 and/or MGAM in urinary extracellular vesicles derived from a subject.
  • MUC1 protein expression in the specimen If the amount is less than the control expression level of the poor prognosis control, it can be predicted that the subject has impaired renal function.
  • the MGAM protein expression level in urinary extracellular vesicles derived from the subject and the control expression level of a control subject with a known poor prognosis were compared to compare both expression levels, and MGAM protein expression in the sample If the amount is greater than the control expression level in poor prognosis controls, it can be predicted that the subject has impaired renal function.
  • the urinary extracellular vesicles are preferably positive for phosphatidylserine, and the method for detecting a marker for diagnosing renal dysfunction of the present embodiment further comprises measuring the expression level of CD9 in the urinary extracellular vesicles. is preferred. Furthermore, the accuracy of diagnosis is improved by measuring the expression level of CD9.
  • This embodiment is a method for determining renal prognosis, in which the ratio of the expression level of MGAM and the expression level of MUC1 in urinary extracellular vesicles derived from a subject is calculated. Provided is a determination method for determining that a patient has a poor prognosis in some cases.
  • the average eGFR at onset of patients with MGAM/MUC1 of 0.35 or more was reduced to It was confirmed that the eGFR decreased significantly in some patients, lower than the group.
  • the urinary extracellular vesicles are preferably phosphatidylserine positive.
  • the protein composition of uEVs separated from control samples was analyzed using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Purified uEVs were individually analyzed using an LC-MS/MS system.
  • a subsequent Sequest database search identified 1,298 non-redundant proteins in all three control samples (see Figure 5). This list included most non-tissue specific EV proteins (category 1a) and EV-recovered cytosolic proteins (category 2).
  • common exosome markers CD63 and CD9
  • ANXA1 classical microvesicle markers
  • ARMM ARRDC1-mediated microvesicle
  • uEVs from all patients with hypoplastic kidney contained marker proteins for classical exosomes (CD63 and CD9), classical microvesicles (ANXA1), and ARMM (TSG101) (see Figure 10). .).
  • Multidimensional scaling (MDS) analysis using the expression levels of these 135 proteins in uEV differentiated between healthy controls and patients with hypoplastic kidneys see Figure 12).
  • the mean eGFR for patients in cluster 1 was 99.2 mL/min/1.73 m 2 and the mean eGFR for patients in cluster 2 was significantly reduced to 46.0 mL/min/1.73 m 2 .
  • the quantities are shown in FIG. MDS analysis using quantitative proteomic data showed that the uEV proteome could distinguish patients with renal impairment (see Figure 16). This result suggests that the expression of these proteins may be used to screen urine from patients with impaired renal function.
  • MUC1 is a transmembrane glycoprotein whose expression is restricted to the apical surface of distal tubules and collecting ducts.
  • MGAM which is an ⁇ -glucosidase, is expressed only in kidney proximal tubular cells (see FIG. 22(B)).
  • CD9 and CD63 are markers of these small EVs ( See Figure 21).
  • CD9 is mainly expressed on the basement membrane side of distal tubules and collecting ducts (see Figure 22B).
  • MUC1 concentrations were examined by ELISA.
  • the sample size required to discriminate renal hypofunction eGFR ⁇ 60 or ⁇ 90 by MUC1 was calculated to be 10.8 or 23.9, respectively.
  • Urine samples were collected from 26 controls and 94 pediatric patients with CKD (validation cohort; see Figure 23). Reflecting the etiology of pediatric CKD, patients predominantly suffer from CAKUT and none with diabetes or diabetic kidney disease.
  • MUC1, MGAM, CD9, and CD63 levels in uEVs were quantified by ELISA (see Figures 24 and 28).
  • the MGAM/MUC1 value yielded an AUC of 0.922 for segregating patients with renal impairment (eGFR ⁇ 90) (see FIG. 27(A)).
  • the sensitivity and specificity of MGAM/MUC1 for diagnosing eGFR depression were 88.5% and 87.5%, respectively, based on optimal cut-off values derived from ROC curves. It achieves significantly higher accuracy than urinary creatinine, albumin, or L-FABP, suggesting that the new method of the present application captures changes that cannot be detected by existing urinary biomarkers (see Figure 27 (A)). .
  • renal dysfunction can be diagnosed with high precision and non-invasiveness.

Abstract

腎機能障害診断マーカーの検出方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭの発現量を測定することを含む、検出方法。

Description

腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカー
　本発明は、腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカーに関する。
　多様な病態が慢性腎臓病（ＣＫＤ）の原因となるが、原因に関係なく機能ネフロンの不可逆的な喪失が、その発生と進行の根底にある。最近、小児期のＣＫＤは研究の焦点となっている。これは、罹患率と死亡率の増加をもたらし、小児期を超えて様々な医学的問題を引き起こすためである。成人のＣＫＤとは異なり、先天性腎尿路異常 （ＣＡＫＵＴ）や遺伝性疾患を含む非糸球体腎疾患が、小児のＣＫＤのほとんどの症例を占めている。治療的介入と組み合わせた早期発見は、小児および成人のＣＫＤ患者の両方に大きな利益をもたらす。
　しかし、血液検査や尿検査では、ネフロン減少の初期段階を見逃す可能性がある。疾患の進行を予測する可能性のある新しい尿バイオマーカーの特定が求められている。
　細胞外小胞（ＥＶ）は、脂質二重層によって区切られた細胞から自然に放出される粒子である。尿中ＥＶ（ｕＥＶ）又は尿中エクソソームは、ネフロンの全ての部分の細胞に由来する特異的タンパク質を含む。ｕＥＶは、腎臓の生理学的及び病理学的状態における分子発現変動を反映する尿バイオマーカーのリソースとなり得る。急性腎障害、糸球体疾患、腎尿細管障害、多発性嚢胞腎、移植腎等、様々な疾患のバイオマーカーのｕＥＶベースの研究が報告されている（例えば非特許文献１－２参照。）。
Urinary extracellular vesicles: A position paper by the Urine Task Force of the International Society for Extracellular Vesicles. Erdbrugger U, et al.,. J Extracell Vesicles. 2021 May;10(7):e12093. doi: 10.1002/jev2.12093. Epub 2021 May 21.
Extracellular Vesicles in Renal Diseases: More than Novel Biomarkers? Erdbrugger U, Le TH.J Am Soc Nephrol. 2016 Jan;27(1):12-26. doi: 10.1681/ASN.2015010074. Epub 2015 Aug 6.
　しかしながら、今日まで、機能しているネフロンの量的変化を検出するためのバイオマーカー、又はｕＥＶを使用したバイオマーカーは確立されていない。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高精度かつ非侵襲的に腎機能障害を診断できる腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカーを提供する。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］腎機能障害診断マーカーの検出方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭの発現量を測定することを含む、検出方法。
［２］前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、［１］に記載の検出方法。
［３］更に、前記尿中細胞外小胞におけるＣＤ９の発現量を測定することを含む、［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］腎予後の判定方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＧＡＭの発現量とＭＵＣ１の発現量の発現量の比を計算し、前記比が閾値以上である場合には、予後不良であると判定する、判定方法。
［５］前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、［４］に記載の判定方法。
［６］腎機能障害診断マーカーの検出キットであって、抗ＭＵＣ１抗体及び／又は抗ＭＧＡＭ抗体を含む、キット。
［７］更に、尿中細胞外小胞に対する親和性物質を含む、［６］に記載のキット。
［８］前記親和性物質は、Ｔｉｍ４である、［７］に記載のキット。
［９］腎機能障害診断マーカーであって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭを含む、マーカー。
［１０］前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、［９］に記載のマーカー。
［１１］更に、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＣＤ９を含む、［９］又は［１０］に記載のマーカー。
　本発明によれば、高精度かつ非侵襲的に腎機能障害を診断できる腎機能障害診断マーカーの検出方法、腎予後の判定方法、腎機能障害診断マーカーの検出キット及び腎機能障害診断マーカーを提供できる。
ディスカバリーコホートとバリデーションコホートを概説する概略図である。 Ｔｉｍ４アフィニティビーズを使用した尿サンプルからのｕＥＶ分離のスキームを示す図である。尿サンプルを１，２００×ｇで４℃２０分間遠心分離して細胞破片と尿塩を除去し、次に１０，０００×ｇで４℃３０分間遠心分離して、アポトーシス小体などの大きなＥＶを除去した。ビオチン化Ｔｉｍ４と結合したストレプトアビジン磁気ビーズを、上清に加え、混合物を２０～２５℃で１時間回転させた。ビーズを洗浄バッファーで３回洗浄し、結合したｕＥＶを溶出バッファーで溶出した。 ｕＥＶのネガティブテイン透過型電子顕微鏡像である。スケールバーは、２００ｎｍを示す。 健常対照者から分離されたｕＥＶのナノ粒子追跡分析結果である。 健常対照者から分離されたｕＥＶで検出された総タンパク質のベン図である。 健常対照者における一般的な古典的エクソソームマーカー（ＣＤ６３、ＣＤ９）と古典的マイクロベジクルのマーカー（アネキシンＡ１）、及びＡＲＲＤＣ１介在性マイクロベジクルのマーカー（ＴＳＧ１０１）の存在量を表す棒グラフ。ｙ軸は、ｌｏｇ１０相対存在量を表す。 健常対照者のｕＥＶに含まれる１，２９８種類の一般的なタンパク質の ＫＥＧＧ／Ｗｉｋｉパスウェイ分析結果である（ｇ：プロファイラー）。調整されたＰ値が最も低い上位５つの用語が抽出された。 健常対照者からのｕＥＶ における上位５０分子のネフロン各分画における相対存在量を腎細胞エクスプローラーにより視覚化した図、及び５０個の分子のうち５個のヒト腎臓標本の免疫蛍光像である。グルタチオン加水分解酵素１プロ酵素 （ＧＧＴ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）、ウロモジュリン（ＵＭＯＤ）、アネキシンＡ１１（ＡＮＸＡ１１）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）は、それぞれ近位尿細管、ヘンレループ、遠位尿細管、集合管、及び深部髄質腎盂上皮で発現している。図の上の数字は、各ネフロンセグメントを表す。１ポドサイト；２頭頂上皮；３近位尿細管;４ヘンレループ；５遠位尿細管；６結合尿細管；７皮質集合管；８髄質集合管；９深部髄質腎盂上皮。スケールバーは、２００μｍを表す。 ディスカバリーコホートの参加者のベースライン特性を示す表である。 低形成腎患者における、一般的な古典的エクソソームマーカー （ＣＤ６３、ＣＤ９）と、古典的マイクロベジクルのマーカー（アネキシンＡ１）、及びＡＲＲＤＣ１介在性マイクロベジクルのマーカー（ＴＳＧ１０１）の存在量を表す棒グラフである。ｙ軸は、ｌｏｇ１０相対的存在量を表す。 健常対照者と低形成腎患者との間で異なって発現するｕＥＶタンパク質を表示する火山プロットである。それぞれ、健常児で高発現する１００個のタンパク質、低形成腎患者で高発現する３５個のタンパク質を示す。 １３５個の特徴的に発現変動するタンパク質の定量的プロファイルに基づく多次元尺度構成法（ＭＤＳ）分析である。 低形成腎患者のｕＥＶにおいて、発現が上昇した３５個のタンパク質と発現が減少した１００個のタンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析（ｇ：プロファイラー）による生物学的プロセスを示すグラフである。 １３５個のタンパク質の発現と３０人の患者の臨床情報のヒートマップである。発現レベルは対数変換され、各タンパク質のゼロ平均と単位標準偏差にｚ正規化された。 腎機能が正常な個人（Ｎ：ｅＧＦＲ≧９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）又は腎機能が低下した患者（Ｄ：ｅＧＦＲ＜９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）のｕＥＶにおけるタンパク質の発現例を示すバイオリンプロットである。両側マンホイットニーＵ検定を使用してデータを比較した。ｎｓ＝有意ではない。 特徴的に発現変動する１３５個のタンパク質の定量的プロファイルに基づくＭＤＳ分析である。 （Ａ）ＣＫＤにおけるｕＥＶの形態学的特徴を示すグラフである。粒子数と尿クレアチニンの相関プロットである。（Ｂ）粒子サイズと粒子の相関プロットである。（Ｃ）粒子サイズと尿クレアチニンの相関プロットである。相関係数は、ピアソンのＲ として表される。 （Ａ）健常対照者とＣＫＤ患者の粒子のサイズ分布を示す密度プロットである。点線は、各グループの粒子の平均サイズを示している。（Ｂ）健常対照者とＣＫＤ患者のサンプル間の粒子数を比較するボックスプロットである。（Ｃ）健常対照者とＣＫＤ患者のサンプル間の粒子の平均サイズを比較するボックスプロットである。（Ｄ）健常対照者とＣＫＤ患者のサンプル間のピークサイズ密度を比較するボックスプロットである。データは、両側ウェルチのｔ検定を使用して比較された。 （Ａ）ｕＣｒが５０ｍｇ／ｄＬを超えたサンプル及び５０ｍｇ／ｄＬ未満のサンプルの粒子のサイズ分布を示す密度プロットである。点線は、各グループの粒子の平均サイズを示す。（Ｂ）粒子数の割合を比較するボックスプロットである。（Ｃ）粒子の平均サイズを比較するボックスプロットである。（Ｄ）サイズ範囲４０～１５０ｎｍの粒子の割合を比較するボックスプロットである。（Ｅ）サイズ範囲１５０～１０００ｎｍの粒子の割合を比較するボックスプロットである。データは、両側ウェルチのｔ検定を使用して比較された。 ＥＬＩＳＡの候補分子の選択プロセスを示す図である。両側性低形成腎又はＣＫＤのｕＥＶで増加した３５分子のうち、ＭＧＡＭは唯一の膜貫通タンパク質であった。ＣＫＤで発現が減少した１００分子のうち、市販の抗体を用いて５分子を評価した。その中で、ＭＵＣ１がＴｉｍ４－ＥＬＩＳＡによる評価に特に適していた。 ｕＥＶにおけるＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、及びエクソソームマーカー（ＣＤ９ 及びＣＤ６３）の評価のためのＥＬＩＳＡの結果である。ＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、及びエクソソームマーカー（ＣＤ９ 及びＣＤ６３）の標準曲線は、４５０ ｎｍでの吸光度（ｙ 軸）を標準濃度（ｘ 軸）の値に対してプロットすることによって得られる。Ｒ２は標準曲線の相関係数である。 （Ａ）Ｔｉｍ４を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡの概略図である。（Ｂ）ネフロンセグメントでのＭＧＡＭ、ＭＵＣ１、及びＣＤ９の発現を示す免疫染色像である。発現パターンは、腎細胞エクスプローラー及びヒト腎臓組織を使用した蛍光免疫組織染色によって視覚化された。図の上の数字は、各ネフロンセグメントを表す。１ポドサイト；２頭頂上皮；３近位尿細管;４ヘンレループ；５遠位尿細管；６結合尿細管；７皮質集合管；８髄質集合管；９深部髄質腎盂上皮。スケールバーは、１００μｍを表す。 バリデーションコホートの１２０人の参加者の特徴を示す表である。プラスマイナス値は平均±ｓ.ｄ.を表す。その他は、馬蹄腎、腎尿細管形成異常、後部尿道弁、尿管瘤、紫斑病性腎炎、ネフローゼ症候群、無症候性タンパク尿症、肥満関連腎臓病、エプスタイン症候群、腎性尿崩症、ＤＯＨａＤによる慢性腎疾患、巨大尿管、異形成腎、腎石灰化症、重度の新生児仮死による腎障害である。ＮＡは該当無しを表し、ＮＤは、未実施を表す。 健常対照者とＣＫＤ患者からのサンプルでカスタマイズされたＥＬＩＳＡによって測定されたＭＵＣ１レベルとＭＧＡＭレベル（４５０ｎｍでの吸光度）を比較したグラフである。Ｇ１はｅＧＦＲ≧９０のＣＫＤ患者を示し、Ｇ２－５はｅＧＦＲ＜９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のＣＫＤ患者を示す。 （Ａ）ロジスティック回帰により、腎機能が低下した患者（ｅＧＦＲ ＜６０）を健常対照者と区別するためのＲＯＣ曲線である。（Ｂ）ロジスティック回帰により、腎機能が低下した患者（ｅＧＦＲ ＜９０）を健常対照者と区別するためのＲＯＣ曲線である。（Ｃ）正常なｅＧＦＲ≧９０を有するＣＫＤ患者を、ロジスティック回帰によって健常対照者と区別するためのＲＯＣ曲線である。 ディスカバリーコホートとバリデーションコホートにおける各腎機能を有するＣＫＤ患者及び健常対照者におけるＭＧＡＭ／ＭＵＣ１のアッセイ値（ＭＧＡＭの発現をＭＵＣ１の発現で割ったもの）のボックスおよびビースウォームプロットである。 （Ａ）ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１、尿中クレアチニン（ｕＣｒ）、尿中アルブミン（ｕＡｌｂ）、及びＬ－ＦＡＢＰ の組み合わせを使用したロジスティック回帰により、腎機能が低下した患者（ｅＧＦＲ ＜６０）を健常対照者から区別するためのＲＯＣ曲線である。（Ｂ）２つのグループ（ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１が ０．３５未満及びその他）における追跡期間中のｅＧＦＲの変化を示したグラフである。データは、両側マンホイットニーＵ検定を使用して比較された。 バリデーションコホートのｕＥＶにおけるエクソソームマーカー（ＣＤ９及びＣＤ６３）の発現を調べたグラフである。健常対照者とＣＫＤ患者のサンプルでカスタマイズされたＥＬＩＳＡによって測定されたＣＤ９レベルとＣＤ６３レベル（４５０ｎｍでの吸光度）を比較した。Ｇ１はｅＧＦＲ≧９０のＣＫＤ患者を示し、Ｇ２－５はｅＧＦＲ＜９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２のＣＫＤ患者を示す。 尿アルブミンと、ＭＧＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ９、及びＣＤ６３のＥＬＩＳＡ発現レベルとの相関を調べたグラフである。 ｕＥＶと尿中のＭＵＣ１の発現レベル間の相関を調べたグラフである。バリデーションコホートからランダムに選択された４０症例を使用した相関プロットを示す。相関係数はピアソンのＲとして表される。ｘ軸の値はＥＬＩＳＡによる４５０ｎｍでの吸光度を示し、ｙ軸の値はＭＵＣ１の尿中濃度（Ｕ／ｍＬ）を表す。
≪腎機能障害診断マーカー≫
　本実施形態は、腎機能障害診断マーカーであって、被検者由来の尿中細胞外小胞における、ＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭを含む、マーカーを提供する。
　腎機能障害として、検査の対象となり得る疾患としては、慢性腎臓病、先天性腎尿路異常、低形成腎、異形成腎、ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ、水腎症、単腎、多嚢胞性異形成腎、ネフロン癆、繊毛病、常染色体劣性多発性嚢胞腎、常染色体優性多発性嚢胞腎、腎瘢痕、膀胱尿管逆流症、巨大尿管、癒合腎、馬蹄腎等が挙げられる。
　実施例において後述するように、本発明者は、低形成腎患者から分離されたｕＥＶ中のタンパク質を網羅的に解析し、腎機能障害診断マーカーを見出した。
　被検者としては、特に限定されず、小児腎疾患患者、成人腎疾患患者等が挙げられる。
　ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ１）は、ムチンタンパク質のファミリーに属するＩ型膜貫通糖タンパク質であり、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、短い細胞質領域からなるタンパク質である。低形成腎患者由来のｕＥＶで発現量が減少していた。
　ＭＧＡＭ（Ｍａｌｔａｓｅ－Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）は、α－グルコシダーゼ消化酵素であり、膜貫通タンパク質である。低形成腎患者由来のｕＥＶで発現量が増加していた。
　前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性であることが好ましく、本実施形態の腎機能障害診断マーカーは、更に、ＣＤ９を含むことが好ましい。ＣＤ９は、エクソソーム表面に見出される細胞表面糖タンパク質である。
　本実施形態の腎機能障害診断マーカーとしては、ＭＵＣ１；ＭＧＡＭ；ＭＵＣ１及びＭＧＡＭ；ＭＵＣ１及びＣＤ９；ＭＧＡＭ及びＣＤ９；ＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、及びＣＤ９；の組み合わせが挙げられる。マーカー分子の数が多いほど診断の精度が上がる。
≪腎機能障害診断マーカーの検出キット≫
　本実施形態は、腎機能障害診断マーカーの検出キットであって、抗ＭＵＣ１抗体及び／又は抗ＭＧＡＭ抗を含む、キットを提供する。抗体としては、抗原を認識するものであれば限定されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片等が挙げられる。
　本実施形態のキットは、更に、尿中細胞外小胞に対する親和性物質を含むことが好ましい。尿中細胞外小胞に対する親和性物質としては、ＣＤ９等の尿中細胞外小胞膜上に発現する分子に対する抗体、リン脂質親和性物質が挙げられ、ホスファチジルセリン親和性物質が好ましく、Ｔｉｍ４がより好ましい。
　本実施形態のキットは、更に、尿中細胞外小胞に対する親和性物質と結合した固相又は担体を含むことが好ましい。固相としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板、金属基板等が挙げられ、ＥＬＩＳＡ等に用いられるプラスチック基板が好ましい。
　担体としては、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等のビーズが挙げられる。
　本実施形態のキットは、Ｔｉｍ４が固定化したプラスチック基板と、ＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭに対する抗体を含むことが好ましい。本実施形態のキットの使用方法としては、被検者の尿中細胞外小胞を、Ｔｉｍ４固定化プラスチック基板上に補足した後、ＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭに対する標識抗体を用いて、尿中細胞外小胞外表面に発現するＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭを検出する方法が挙げられる。ＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭに対する抗体の標識に用いられる物質としては、標識酵素が挙げられ、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼが挙げられる。
≪腎機能障害診断マーカーの検出方法≫
　本実施形態は、腎機能障害診断マーカーの検出方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭの発現量を測定することを含む、検出方法を提供する。
　例えば、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１タンパク質発現量と、予後不良が分かっている対照者の対照発現量とを用いて両発現量を比較して、検体中のＭＵＣ１タンパク質発現量が、予後不良対照者の対照発現量より少ない場合、被検者が、腎機能障害を有していると予測できる。
　また、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＧＡＭタンパク質発現量と、予後不良が分かっている対照者の対照発現量とを用いて両発現量を比較して、検体中のＭＧＡＭタンパク質発現量が、予後不良対照者の対照発現量より多い場合、被検者が、腎機能障害を有していると予測できる。
　前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性であることが好ましく、本実施形態の腎機能障害診断マーカーの検出方法は、更に、前記尿中細胞外小胞におけるＣＤ９の発現量を測定することが好ましい。更にＣＤ９の発現量を測定することで診断の精度が上がる。
≪腎予後の判定方法≫
　本実施形態は、腎予後の判定方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＧＡＭの発現量とＭＵＣ１の発現量の発現量の比を計算し、前記比が閾値以上である場合には、予後不良であると判定する、判定方法を提供する。
　実施例において後述するように、ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１の閾値を０．３５と設定することにより、ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１が０．３５以上の患者の発症時の平均ｅＧＦＲは、ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１が０．３５未満のグループよりも低く、一部の患者ではｅＧＦＲ が大幅に低下することが確認された。また、前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性であることが好ましい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
Ｔｉｍ４ビーズを使用して分離されたヒトｕＥＶの概要。
　本発明に係るプロトコールは、図１に示される。ｕＥＶを分離する方法に関して、最も一般的に使用される技術である分画超遠心法には、いくつかの制限がある。精製プロセス中にＥＶに損傷を与える可能性があるため、技術的専門知識を必要とする。エクソソームマーカーを用いるアフィニティー精製方法についても問題がある。ｕＥＶの多くは、ＣＤ６３又はＣＤ９を発現していない。これは、これらの分子を用いる方法は、尿から精製された小胞に偏りが生じることにつながる。ここで、発明者は、Ｔｉｍ４ベースの精製システムを採用した（図２参照。）。Ｔｉｍ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインは、エクソソームやマイクロベジクルを含むＥＶの表面でホスファチジルセリンに結合する。結合はＣａ２＋依存性であるため、Ｃａ２＋キレート剤を添加することにより、無傷のＥＶをＴｉｍ４結合ビーズから簡単に解放できる。透過型電子顕微鏡によって明らかにされたｕＥＶの外観は、典型的な受け皿のような形状と一致した（図３参照。）。
　懸濁液中のｕＥＶの数とサイズ分布は、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって分析した。コントロールサンプルから分離されたｕＥＶの平均数（±ＳＤ）は、１９．１９ （±７．１９）×１０９粒子／ｍＬであった。ｕＥＶの平均サイズ （±ＳＤ）は、１３７．９（± ２．５）ｎｍで、ピークは１１７．４７ ｎｍ （±１．０）であった（図４参照。）。
　コントロールサンプルから分離されたｕＥＶのタンパク質組成は、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分析した。精製されたｕＥＶは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用して個別に分析した。続くＳｅｑｕｅｓｔデータベース検索により、３つのコントロールサンプル全てにおいて、１, ２９８の非冗長タンパク質が特定された（図５参照。）。
　このリストには、ほとんどの非組織特異的ＥＶタンパク質（カテゴリー１ａ）及びＥＶで回収されたサイトゾルタンパク質（カテゴリー２）が含まれていた。予想どおり、一般的なエクソソームマーカー（ＣＤ６３及びＣＤ９）、古典的マイクロベジクルのマーカー（ＡＮＸＡ１）、及びＡＲＲＤＣ１介在性マイクロベジクル（ＡＲＭＭ）のマーカー（ＴＳＧ１０１））が、３つのサンプル全てで検出された（図６参照。）。
　ｕＥＶサンプルに豊富に含まれるタンパク質において、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）とＷｉｋｉｐａｔｈｗａｙｓの分析により、リソソーム、代謝経路、エンドサイトーシス、及び近位尿細管輸送を含むｕＥＶプロテオームに富むいくつかの経路が明らかとなった（図７参照。）精製された小胞の細胞起源の不均一性は、ネフロンの様々な細胞における遺伝子発現パターンを視覚化する腎細胞エクスプローラー、及びヒト腎臓標本の免疫蛍光法によって示された（図８参照。）。
腎低形成におけるｕＥＶの変化
　次に、発明者は、両側性低形成腎の患者から分離されたｕＥＶに注目した。低形成腎は、ネフロンの数が減少した先天的に小さな腎臓を特徴とする。後天性疾患に続発する腎瘢痕又は腎萎縮は除外された。
　患者の特徴を図９に示す。各ｕＥＶサンプルにおける総タンパク質量で正規化した後、低形成腎の患者から単離したｕＥＶのタンパク質組成物を、コントロールサンプルから単離したｕＥＶのものと比較した。総タンパク質量は、ＥＶの相対排泄率を計算する際の正規化変数として一般的に使用される。
　低形成腎の全ての患者からのｕＥＶには、古典的なエクソソーム（ＣＤ６３及びＣＤ９）、古典的なマイクロベジクル（ＡＮＸＡ１）、及びＡＲＭＭ（ＴＳＧ１０１）のマーカータンパク質が含まれていた（図１０参照。）。経験的ベイジアン統計と組み合わせたｐｒｏｔｅｉｎ－ｗｉｓｅ ｌｉｎｅａｒモデルによるエンリッチメント解析を適用して、低形成腎の患者と健常対照者サンプルを最もよく区別するタンパク質を特定した。その結果、合計１３５個の識別タンパク質が明らかになり、そのうち３５個と１００個のタンパク質が低形成腎でそれぞれ増加及び減少していた（図１１参照。）。ｕＥＶにおけるこれらの１３５個のタンパク質の発現レベルを使用した多次元尺度構成法（ＭＤＳ）分析により、健常対照者と低形成腎の患者が区別された（図１２参照。）。遺伝子オントロジー分析により、腎低形成で発現レベルが上昇するタンパク質が、いくつかの免疫介在経路に関連していることが明らかになり（図１３参照。）、ＣＫＤ患者の腎臓の慢性炎症の可能性が示唆された。一方、腎低形成で発現レベルが低下したタンパク質は、塩化物イオンの恒常性や一価の無機陰イオンの恒常性など、尿細管での電解質移動に関連していた（図１３参照。）。
ＣＫＤ患者におけるｕＥＶの発現シグネチャと特徴
　次に、腎及び尿路の先天異常（膀胱尿管逆流、単腎、又は代償性対側腎肥大を伴う片側低形成腎）又は繊毛病（ネフロン癆又は多発性嚢胞腎）による様々な腎機能を呈するＣＫＤ患者からのサンプルを分析した（図９参照）。これらのデータを、コントロール及び両側性低形成腎からのｕＥＶのデータと組み合わせて解析した。コントロールと両側性低形成腎を区別する１３５のタンパク質の定量的発現データを使用して、３０個のｕＥＶサンプルの教師なしコンセンサスクラスタリングを実行した（図１４参照。）。この解析によりこれらのｕＥＶサンプルが２つの主要なクラスター（クラスター１及び２）に分類されていることが明らかになった（図１４参照。）。クラスター１の患者の平均ｅＧＦＲは、９９．２ ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であり、クラスター２の患者の平均ｅＧＦＲは大幅に減少し、４６．０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であった。ｅＧＦＲが９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２以上の患者（Ｎ）及びｅＧＦＲが９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満の患者 （Ｄ）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって評価された代表的なタンパク質の存在量を図１５に示す。定量的プロテオームデータを使用したＭＤＳ分析は、ｕＥＶプロテオームが腎機能の低下した患者を区別できることを示した（図１６参照。）。この結果は、これらのタンパク質の発現が、腎機能が低下した患者の尿のスクリーニングに使用できる可能性があることを示唆する。
ＣＫＤ患者におけるｕＥＶの特徴
　次に、ｕＥＶの物理的特性がＣＫＤで変化するかどうかを調べた。ＮＴＡは、検討に必要なサンプル量が利用可能な２０のサンプルで実行された。粒子数は尿クレアチニンと正の相関があり（図１７（Ａ）参照。）、ｕＥＶの平均サイズと負の相関がある（図１７（Ｂ）及び （Ｃ）参照。）。粒子の数とＣＫＤ患者及びコントロールからのｕＥＶの平均サイズは統計的に異ならなかったが、ピークサイズはコントロールよりもＣＫＤ患者で有意に低かった（Ｐ＝０．００７）（図１８（Ａ）－（Ｄ）参照。）。
　ｕＥＶの形態が尿クレアチニンによって変化するかどうかを調べた。尿クレアチニンが低いサンプル（ｕＣｒ：＜５０ｍｇ／ｄＬ）では、クレアチニンが高いサンプル（ｕＣｒ：≧５０ｍｇ／ｄＬ）よりも大きな小胞（１５０－１０００ ｎｍ）の比率が顕著であった（図１９参照。）。
ｕＥＶシグネチャの検出のためのＥＬＩＳＡプラットフォームの構築
　ｕＥＶシグネチャがＣＫＤに関連付けられているという概念実証のために、Ｔｉｍ４ をＥＶ捕捉物質として使用し、ビオチン化抗体を検出抗体として使用するＥＬＩＳＡ プラットフォームを確立することを目指した。システムは、簡単な手順でｕＥＶの候補バイオマーカーのタンパク質含有量を定量化する。両側低形成腎又はＣＫＤのｕＥＶで発現が上昇する分子の中で、ＭＧＡＭは細胞外領域に対する抗体が利用可能な唯一の膜貫通タンパク質であった（図１５参照。）。ＣＫＤで発現が低下する分子のリストを絞り込むために、次の基準を使用した：腎細胞の細胞表面に局在し、細胞外領域に対する抗体が利用可能であり、正常な尿のプロテオームにおいて、そのシグナルが腎細胞で安定して検出される膜タンパク質。５つの分子（ＭＵＣ１、ＰＶＲ、ＰＫＤ２、ＰＲＯＭ１、及びＴＨＹ１) が基準を満たした（図１５参照。）。最後に、市販の抗体を使用して、Ｔｉｍ４精製ｕＥＶでの発現を評価できるかどうかを調べた。この分析により、最終的にＭＵＣ１とＭＧＡＭの定量システムの構築に成功した（図２０及び２１参照。）。
　ＭＵＣ１は膜貫通糖タンパク質であり、その発現は遠位尿細管と集合管の頂端面に限られている。α－グルコシダーゼであるＭＧＡＭは、腎臓の近位尿細管細胞でのみ発現している（図２２（Ｂ）参照。）。更に、ＣＫＤ患者の減少した粒子のサイズは、古典的または非古典的なエクソソームのサイズに対応するため（図１８（Ａ）参照。）、これらの小さなＥＶのマーカーとしてＣＤ９及びＣＤ６３も含めた（図２１参照。）。ＣＤ９は、主に遠位尿細管及び集合管の基底膜側に発現する（図２２Ｂ参照。）。
ＣＫＤの検出のためのｕＥＶの有用性
　ディスカバリーコホートを使用して、ＥＬＩＳＡによりＭＵＣ１濃度を調べた。
　 ＭＵＣ１による腎機能低下ｅＧＦＲ＜６０又は＜９０の識別に必要なサンプルサイズは、それぞれ１０．８又は２３．９と計算された。２６人のコントロールとＣＫＤの９４人の小児患者から尿サンプルを収集した（バリデーションコホート；図２３参照。）。小児ＣＫＤの病因を反映して、患者は主にＣＡＫＵＴを患い、糖尿病や糖尿病性腎疾患の患者はいない。ＥＬＩＳＡにより、ｕＥＶのＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、ＣＤ９、及びＣＤ６３レベルを定量化した（図２４及び図２８参照。）。ｕＥＶにおけるＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、ＣＤ９、及びＣＤ６３の発現レベルは、尿アルブミンと相関していなかった（図２９参照。）。
　受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を実行して、腎機能が低下した患者を特定する際の識別性能を評価した。ｕＥＶのＭＵＣ１レベルを使用した単変量解析では、ｅＧＦＲ＜６０（図２５（Ａ）参照。）又は＜９０ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２ （図２５（Ｂ）参照。）の患者を識別するための高い診断性能が示された。
　ＡＵＣ値は、ＭＵＣ１とＭＧＡＭ を使用した二変量解析でさらに増加した。ＭＵＣ１、ＭＧＡＭ、及びＣＤ９を使用した三変量解析では、最高のＡＵＣ値１．０００（ｅＧＦＲ＜６０）（図２５（Ａ）参照。）及び ０．９５３（ｅＧＦＲ＜９０）（図２５（Ｂ）参照。）を達成した。また、この方法でｅＧＦＲが正常（ｅＧＦＲ≧９０）のＣＫＤ患者と健常対照者を区別できるかどうかも調べた。二変量又は三変量解析のＡＵＣ値は、０．７５を超えた（図２５（Ｃ）参照。）。これは、ｅＧＦＲが正常なＣＫＤ患者であっても、ｕＥＶ シグネチャが腎臓の変化を検出できることを示唆している。
　また、複合多変量解析の代わりに、ＭＧＡＭの発現値をＭＵＣ１の発現値で割った値 （ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１）が、腎機能低下の指標として使用できるかどうかも調査した。ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１値は、ディスカバリー及びバリデーションコホートで腎機能が低下するにつれて増加した（図２６参照。）。ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１値は、腎機能が低下した患者 （ｅＧＦＲ＜９０）を分離するために０．９２２のＡＵＣをもたらした（図２７（Ａ）参照。）。ｅＧＦＲ低下の診断に対するＭＧＡＭ／ＭＵＣ１の感度と特異度は、ＲＯＣ曲線から導き出された最適なカットオフ値に基づいて、それぞれ８８．５％と８７．５％であった。尿クレアチニン、アルブミン、又はＬ－ＦＡＢＰよりも大幅に高い精度を実現し、本願の新しい方法が既存の尿バイオマーカーでは検出できない変化を捉えることを示唆している（図２７（Ａ）参照。）。
　最後に、ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１と腎予後との関連を分析した。ディスカバリー及びバリデーションコホートの患者のうち、最初の分析から６か月以上経過した追跡データが３５人の患者で利用可能であった。初期分析のＭＧＡＭ／ＭＵＣ１値に従って、これらの患者は２つのグループに分類された。しきい値（０．３５）は、健常対照者のＭＧＡＭ／ＭＵＣ１値の最大値（０．３３０）を含むように設定された。初期分析からフォローアップ分析までの平均期間は２５．８（±１４．４）か月であった。ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１が０．３５未満の患者 （＜０．３５；６例）では、発症時の平均ｅＧＦＲは、８６．７（±２６．７）ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２であった。このグループでは、ｅＧＦＲは追跡期間中に大幅に変化しなかった。ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１が０．３５以上の患者（≧０．３５；２９人の患者） の発症時の平均ｅＧＦＲは、ＭＧＡＭ／ＭＵＣ１＜０．３５のグループ（６５．４±３６．２ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）よりも低く、一部の患者ではｅＧＦＲ が大幅に低下した（図２７（Ｂ）参照。）。
　ＭＵＣ１の尿中濃度は、腎疾患と潜在的に関連していることが報告されている。高カルシウム尿性腎結石症の患者では、尿中ＭＵＣ１のレベルが大幅に低下するとされる。更に、腎尿細管上皮から放出される尿中ＭＵＣ１フラグメントは、腎機能障害に関連するバイオマーカーとして報告されている。そこで、尿中とｕＥＶ中のＭＵＣ１濃度の相関関係を調べた。図３０に示すように、これら２つの値の間に相関は見つからなかった。この結果は、ｕＥＶにおけるＭＵＣ１の変化が、可溶性ＭＵＣ１フラグメントの尿中濃度とは無関係に、腎臓組織の変化を捕捉することを示唆している。
　本実施形態によれば、高精度かつ非侵襲的に腎機能障害を診断できる。

Claims (11)

  1. 　腎機能障害診断マーカーの検出方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭの発現量を測定することを含む、検出方法。
  2. 　前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　更に、前記尿中細胞外小胞におけるＣＤ９の発現量を測定することを含む、請求項１又は２に記載の検出方法。
  4. 　腎予後の判定方法であって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＧＡＭの発現量とＭＵＣ１の発現量の発現量の比を計算し、前記比が閾値以上である場合には、予後不良であると判定する、判定方法。
  5. 　前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、請求項４に記載の判定方法。
  6. 　腎機能障害診断マーカーの検出キットであって、抗ＭＵＣ１抗体及び／又は抗ＭＧＡＭ抗体を含む、キット。
  7. 　更に、尿中細胞外小胞に対する親和性物質を含む、請求項６に記載のキット。
  8. 　前記親和性物質は、Ｔｉｍ４である、請求項７に記載のキット。
  9. 　腎機能障害診断マーカーであって、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＭＵＣ１及び／又はＭＧＡＭを含む、マーカー。
  10. 　前記尿中細胞外小胞は、ホスファチジルセリン陽性である、請求項９に記載のマーカー。
  11. 　更に、被検者由来の尿中細胞外小胞におけるＣＤ９を含む、請求項９又は１０に記載のマーカー。
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