KR20200037353A - 안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼 - Google Patents

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KR20200037353A
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therapeutic
cells
cell
msc
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KR1020207006379A
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화웨이 왕
리처드 클렘크
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본원에는 세포질체, 세포질체를 포함하는 조성물, 세포질체를 사용하는 방법, 및 대상체를 치료하는 방법, 예컨대 건강하거나 또는 건강하지 않은 대상체에게 이익을 제공하거나, 또는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 진단하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체를 치료하는 방법은 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 본원에는 세포질체를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 제공된다. 또한, 본원에는 상기 조성물 또는 방법을 사용하는 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.

Description

안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼
우선권 주장
본 출원은 2017년 8월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 62/542,133의 이익을 주장한다. 전술한 가출원의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부의 지원을 받는 연구 또는 개발
본 발명은 국립 암 연구소에 의해 수여된 승인 번호 CA097022 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 갖고 있다.
기술분야
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 생명공학 분야, 및 보다 구체적으로, 건강하거나 또는 이환된 대상체에서 질환의 치료, 예방, 예방적 치료, 아주반트 요법, 및 면역조정을 위하여 세포질체 (예를 들어, 제핵 세포)를 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되었고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2018년 8월 1일에 생성된, 상기 ASCII 카피는 Sequence Listing.txt로 명명되고 그 크기가 17.1 MB이다.
세포-기반 요법에 대한 현재의 기술 및 도구는 종종, 원치 않고 위험한 부작용, 예컨대 비제어된 증식, 증가된 돌연변이율 및 항-DNA 면역 반응의 경향이 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 안전하고 제어가능한 치료용 및/또는 전달 비히클로서 사용하기 위한 세포질체의 생성에 근거한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 여러 이점을 제공한다. 세포질체를 생성하기 위해 세포를 제핵하는 방법; 세포질체; 기재된 세포질체를 사용하는 조성물 및 방법은 이전의 세포-기반 치료제에 비해 여러 이익을 제공할 수 있다. 첫째, 본원에 기재된 세포질체, 조성물, 및 방법은 이전의 세포-기반 요법보다 더 안전할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 숙주에 대한 핵-코딩된 DNA 유전자 전달을 포함한 유전 물질 전달의 위험이 감소될 수 있다. 추가의 잠재적인 안전성 이점은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (예를 들어, 유핵 중간엽 줄기 세포와 비교해서) 대상체의 미세 환경(들)에 반응하지 않는 것, 증식하지 않는 것, 및 질환 진행에 기여하지 않는 것.
둘째, 본원에 기재된 세포질체는 제한되거나 또는 규정된 (예를 들어, 공지되거나 또는 프로그래밍가능한) 수명을 가질 수 있다. 셋째, 본원에 기재된 세포질체는 일부 다른 세포-기반 요법에서의 세포와 비교해서 크기가 감소될 수 있다.
넷째, 본원에 기재된 세포질체는 동결동면 또는 동결보존 후에 효능을 유지할 수 있다. 동결보존은 매우 낮은 온도 (예를 들어, 고체 CO2 중 -80℃, 액체 질소 중 -196℃ 등) 하에 생물학적 물질 (예를 들어, 세포, 세포질체)을 단기간 또는 장기간 냉각 또는 냉동, 및 저장하는 것을 포함한다. 동결동면은 비-동결 온도, 예컨대, 예를 들어, 4℃에서, 가사 상태 하에 생물학적 물질 (예를 들어, 세포, 세포질체)의 단기 냉각 및 저장을 포함한다. 세포질체의 동결동면은 하기 이유 중 하나 이상으로 인해 유리할 수 있다: 동결동면은 동결보존보다 덜 노동 집약적이고, 동결동면을 거친 세포질체는 운송 (예를 들어, 선적)될 수 있다.
다섯째, 본원에 기재된 세포질체는 광범위하게 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포질체는 치료적 실체를 생산하거나 또는 발현하도록, 또는 특이적 부위로 귀소하도록 조작될 수 있다. 본원에 청구된 발명의 다른 장점들이 본원에 기재된다.
따라서, 본원에는 세포질체, 세포질체를 포함하는 조성물, 세포질체를 사용하는 방법, 및 대상체를 치료하는 방법, 예컨대 건강하거나 또는 건강하지 않은 대상체에게 이익을 제공하거나, 또는 대상체에서 질환 또는 병태 (예를 들어, 암 또는 신생물, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환 (예를 들어, 신경변성 질환), 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 장애, 발달 장애, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 특발성 병태, 또는 그 중 둘 이상, 또는 본원에 개시된 임의의 질환)를 치료 또는 진단하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체를 치료하는 방법은: 세포질체 (예를 들어, 재조합 세포질체, 본원에 기재된 임의의 세포질체)를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 세포질체는 치료제를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 세포질체는 하기 중 하나 이상을 생산할 수 있다: 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질 (예를 들어, 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신), 치료용 펩티드 (예를 들어, 펩티드 호르몬 또는 항원), 소분자 치료제 (예를 들어, 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 또는 엠탄신), 또는 치료용 유전자 편집 인자. 일부 실시양태에서, 세포질체는 하기 중 하나 이상을 생산하도록 조작될 수 있다: 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 치료용 소분자, 또는 치료용 유전자 편집 인자. 일부 실시양태에서, 세포질체는 하기 중 하나 이상을 생산하도록 조작될 필요가 없다: 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 치료용 소분자, 또는 치료용 유전자 편집 인자. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자 편집 인자 중 하나 이상은 세포질체가 수득된 세포에 의해 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자 편집 인자는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 세포질체에 의해 생산될 수 있거나 또는 세포질체에 함유될 수 있는 비제한적 예시적인 표적화 모이어티는 케모카인 수용체, 부착 분자, 및 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질 (예를 들어, 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 치료용 단백질), 치료용 펩티드 (예를 들어, 펩티드 호르몬 또는 항원, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 치료용 펩티드), 소분자 치료제 (예를 들어, 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 진통제, 항응고제, 항우울제, 항암 약물, 항간질제, 항정신병제, 진정제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 엠탄신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 소분자 치료제), 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자, 또는 또 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)를 함유할 수 있다. 종양용해성 바이러스의 비제한적 예는 탈리모겐 라허파렙벡, 오닉스-015, GL-ONC1, CV706, 보이저-V1, 및 HSV-1716을 포함한다. 일부 야생형 바이러스, 예컨대 백시니아(Vaccinia) 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 폴리오바이러스(Poliovirus), 레오바이러스(Reovirus), 세네카바이러스(Senecavirus), ECHO-7, 및 셈리키 포레스트 바이러스가 또한, 종양용해성 행동을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료제, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자 편집 인자는 세포질체에 의해 생산되지 않는다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료제, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자 편집 인자는 세포질체 내부에 패키징된다.
일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 재조합적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포는 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자 중 하나 이상을 생산하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포는 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자 중 하나 이상을 안정적으로 (예를 들어, 영구적으로) 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포는 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자 중 하나 이상을 일시적으로 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포는 제핵에 앞서 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자 중 하나 이상을 일시적으로 발현하도록 조작된다 (예를 들어, 제핵 후에 조작됨).
일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포에서 (즉, 조작의 부재 하에) 자연적으로 발현되지 않는다 (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 세포질체에 대해 외인성임). 일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 대상체에서 자연적으로 발현되지 않는다 (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 대상체에 대해 외인성임). 일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 요법의 의도된 부위 (예를 들어, 종양, 또는 특별한 조직, 예컨대 뇌, 내장, 폐, 심장, 간, 비장, 췌장, 근육, 눈 등)에서 대상체에서 자연적으로 발현되지 않는다 (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 요법의 의도된 부위에 대해 외인성임).
일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포에서 (즉, 조작의 부재 하에) 자연적으로 발현된다 (예를 들어, 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포의 조작의 부재 하에) (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 세포질체에 대해 선천적으로 내인성임). 일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 대상체에서 자연적으로 발현된다 (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 대상체에 대해 내인성임). 일부 실시양태에서, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 요법의 의도된 부위 (예를 들어, 종양, 또는 특별한 조직, 예컨대 뇌, 내장, 폐, 심장, 간, 비장, 췌장, 근육, 눈 등)에서 대상체에서 자연적으로 발현된다 (즉, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 요법의 의도된 부위에 대해 내인성임).
일부 실시양태에서, 치료제, 예를 들어, 상기 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자는 합성 세포로부터 유래되고, 세포질체 내로 로딩된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는, 이러한 세포질체가 유래된 또는 수득된 세포와 비교 시, 보정되거나, 말단절단되거나, 또는 비-말단절단된 버전 및/또는 카피의 DNA 분자, RNA 분자, 단백질, 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 임의의 유핵 세포 (예를 들어, 진핵 세포, 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포), 원생동물 세포 (예를 들어, 아메바 세포), 해조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 무척추 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 또는 조류 세포)로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 적어도 2종 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과)의 상이한 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자-편집 인자를 임의의 조합으로 생산하거나 또는 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료용 DNA 분자 및 소분자 치료제를 생산하거나 또는 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체는 2종의 상이한 소분자 치료제를 생산하거나 또는 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체는 케모카인 수용체 (예를 들어, 표적화하기 위함) 및 소분자 치료제를 생산하거나 또는 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 불멸화 세포, 암 세포 (예를 들어, 임의의 암 세포), 1차 (예를 들어, 숙주-유래) 세포, 또는 세포주로부터 수득된다. 임의의 비-불멸 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 불멸화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체에 대해 자가인 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체에 대해 동종이계인 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 면역 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 대식세포, 림프구, 섬유모세포, 성체 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 장 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 후각 성체 줄기 세포, 신경 능선 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 또는 고환 세포), 비만 세포, 호염기구, 호산구, 또는 유도성 만능 줄기 세포로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 제핵에 앞서, 둘 이상의 세포 (예를 들어, 본원에 개시된 세포 중 임의의 것)는 본원에 개시되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 융합된다. 융합 산물의 제핵이 세포질체를 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제1 세포질체는 세포 또는 제2 세포질체에 융합된다. 일부 실시양태에서, 세포는 임의의 유핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포), 원생동물 세포 (예를 들어, 아메바 세포), 해조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 무척추 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 또는 조류 세포)이다. 일부 실시양태에서, 제2 세포는 합성 세포이다. 따라서, 특정 세포를 본원에 기재된 세포질체 중 임의의 것과 융합시키는 것을 포함하는, 상기 세포의 행동을 변경시키는 방법이 제공된다. 또한, 세포질체가 융합된 세포의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 제2 세포질체는 제1 세포질체와 동일한 유형의 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제2 세포질체는 제1 세포질체와 상이한 유형의 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제2 세포질체는 적어도 하나의 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자; 또는 제1 세포질체 내에 함유되거나 또는 그에 의해 발현된 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자와 동일한 또 다른 치료제를 함유하거나 또는 발현한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포질체는 적어도 하나의 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자; 또는 제1 세포질체 내에 함유되거나 또는 그에 의해 발현된 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자와 상이한 또 다른 치료제를 함유하거나 또는 발현한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포질체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 전기융합 또는 바이러스-기반 세포 표면 펩티드를 사용하는 바이러스 융합을 사용하여 세포 또는 제2 세포질체에 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료용 RNA 분자는 메신저 RNA (mRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 또는 RNA 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자 또는 DNA 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 소형 펩티드 기반 약물, 또는 효소이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자를 일시적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자의 발현은 유도성이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자를 발현하도록 영구적으로 조작된다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자의 발현. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료제 또는 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 소분자 또는 박테리아 또는 엑소솜이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 하나 이상의 추가적 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가적 요법은 세포-기반 요법, 소분자, 면역요법, 화학요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 치료용 나노입자 및/또는 또 다른 치료제를 포함하는 단리된 세포질체 (예를 들어, 재조합 세포질체, 또는 본원에 기재된 임의의 세포질체)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약물 또는 화학요법제 또는 유전자 편집 작용제이다.
또한 본원에는 유핵 세포를 제핵하는 단계; 및 이와 같이 제핵된 세포 내로, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 치료용 나노입자 및/또는 또 다른 치료제를 도입하는 단계를 포함하는, 재조합 세포질체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포질체)를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 도입 단계는 제핵 단계에 선행한다. 일부 실시양태에서, 제핵 단계는 도입 단계에 선행한다. 일부 실시양태에서, 도입 단계는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 또는 다른 치료제의 일시적 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 도입 단계가 제핵 단계에 선행할 때), 도입 단계는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 또는 다른 치료제의 영구적 발현을 초래한다. 일부 실시양태에서, 치료용 RNA 분자는 메신저 RNA (mRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 또는 RNA 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 분자는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자 또는 DNA 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA 또는 치료용 RNA는 유전자 요법이다. 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 효소, 항체, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 또는 백신이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 제핵 전에 다양한 조건 하에 (예를 들어, 시토카인 욕조에서, 또는 저산소성 조건 하에) 배양될 수 있다 (예를 들어, 현탁액에서, 부착 세포로서, 3D의 부착 세포로서 (예를 들어, 반-현탁액 또는 다른 비-부착 방법에서)).
또한 본원에는 유핵 세포를 벡터로 형질감염시키는 단계; 및 이와 같이 형질감염된 세포를 제핵하는 단계를 포함하는, 재조합 세포질체를 제조하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 수포 바이러스 벡터 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 벡터), 또는 하이브리드 바이러스 벡터)이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 세포질 복제 바이러스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 핵 복제 바이러스일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵은 벡터가 유핵 세포의 게놈 내로 통합된 후에 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포가 제핵된 후에 벡터가 형질감염된다. 형질감염 및 제핵의 순서는 벡터의 선택에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 제핵 전에 형질감염이 발생하는 경우, 세포질 복제 바이러스 또는 핵 복제 바이러스 중 하나가 허용되는 벡터일 수 있다. 예를 들어, 제핵 후에 형질감염이 발생하면, 세포질 복제 바이러스가 핵 복제 바이러스보다 더 나은 벡터의 선택일 수 있으며; 다른 한편으로는, 핵 복제 바이러스가 제핵 세포질체 내에 패키징되어 세포질체의 사멸에 따라 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 치료용 단백질의 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료용 단백질은 효소, 항체, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 또는 백신이다.
또한 본원에는 대상체에게 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자-편집 인자를 발현하는 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 대상체에게 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자-편집 인자를 발현하는 조작된 세포질체 또는 자연적으로 유래된 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또한 본원에는 대상체에게 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 치료용 나노입자, 및/또는 또 다른 치료제를 함유하는 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 포유동물 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 면역 세포로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 상기 조성물은 표적화 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 세포 표면 단백질이다.
일부 실시양태에서, 표적화 모이어티는 분비된 단백질, 또는 세포외 매트릭스에 테더링되어 있는 단백질이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재되며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 항목 및 다른 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌이 있을 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 출발 물질이 공여자-유래 동종이계 또는 자가 세포, 또는 설계된 기능(들)을 갖는 조작된 세포인 본 개시내용의 한 실시양태의 개략도이다.
도 2A-D: 도 2A는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT) 지방-유래 인간 중간엽 줄기 세포 (MSC)로부터 생산된 세포질체의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 세포를 적색 염료 (5-(및-6)-(((4-클로로메틸)벤조일)아미노)테트라메틸로다민) (CMTMR)로 염색하고 핵을 바이브런트(Vybrant)® 다이사이클(Dyecycle)™ 그린으로 염색하였다. 화살은 정상적인 유핵 세포를 가리키고 화살촉은 제핵 세포질체를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 2B는 HL-60 인간 호중구 세포 (호중구)로부터 생산된 세포질체의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 세포를 적색 염료 CMTMR로 염색하고 핵을 바이브런트® 다이사이클™ 그린으로 염색하였다. 화살은 유핵 세포를 가리키고 화살촉은 제핵 세포질체를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 2C는 NIH3T3 마우스 섬유모세포 세포 (섬유모세포)로부터 생산된 세포질체의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 세포를 적색 염료 CMTMR로 염색하고 핵을 바이브런트® 다이사이클™ 그린으로 염색하였다. 화살은 유핵 세포를 가리키고 화살촉은 제핵 세포질체를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 2D는 인간 자연 킬러 세포주 NKL 세포 (NK)로부터 생산된 세포질체의 대표적인 형광 현미경 영상이다. 세포를 녹색 염료 5-클로로메틸플루오레세인 디아세테이트 (CMFDA)로 염색하고 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 염색하였다. 화살은 유핵 세포를 가리키고 화살촉은 제핵 세포질체를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 3A는 시간 경과에 따른 생육성 세포 또는 세포질체에서의 상대적 배수 변화를 제시하는 대표적인 그래프이다.
도 3B는 냉동 저장 (동결보존)으로부터의 회수 후 생육성 세포 및 세포질체를 제시하는 대표적인 그래프이다.
도 3C는 제핵 후 24시간의 세포질체 (신선한 세포질체) 또는 제핵 후 냉동 저장으로부터의 회수 후 24시간의 세포질체 (동결보존됨)의 상대적 생육성을 제시하는 대표적인 그래프이며, 여기서 신선한 세포질체와 동결보존된 세포질체는 제핵 후 4시간의 세포질체의 생육성과 비교된다. 평균 ± SEM; n=10.
도 4는 표시된 형광 항체/마커 (CD90, CD44, CD146, CD166, CD45, 및 이소타입 대조군)의 시그널 강도에 대해 카운팅된 이벤트의 수를 제시하는 대표적인 유동 세포계수법 그래프이다. 골수 MSC 또는 MSC-유래 세포질체는 제핵 후 24시간에 염색한 다음, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용한 유동 세포계수법에 의해 분석되었다. 녹색 (연한 회색)은 유핵 MSC를 나타내고 적색 (짙은 회색)은 제핵 세포질체를 나타낸다.
도 5A-F': 도 5A는 F-액틴 세포 골격을 시각화하기 위해 로다민 팔로이딘으로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 2차원 (2D) 유리 바닥 챔버에서 배양된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 염색된 세포 골격 구조를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5B는 F-액틴 세포 골격을 시각화하기 위해 로다민 팔로이딘으로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 2D 유리 바닥 챔버에서 배양된 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 염색된 세포 골격 구조를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5C는 미세관 네트워크를 시각화하기 위해 항-α-튜불린 항체로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 2D 유리 바닥 챔버에서 배양된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 염색된 세포 골격 구조를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5D는 미세관 네트워크를 시각화하기 위해 항-α-튜불린 항체로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 2D 유리 바닥 챔버에서 배양된 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 염색된 세포 골격 구조를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5E는 F-액틴 세포 골격을 시각화하기 위해 로다민 팔로이딘으로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 3차원 (3D)-콜라겐 매트릭스에서 24시간 동안 배양된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5E'는 핵을 시각화하기 위한 병합되지 않은 DAPI 염색을 제시하는, 도 5E의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5F는 F-액틴 세포 골격을 시각화하기 위해 로다민 팔로이딘으로 염색되고 핵을 시각화하기 위해 DAPI로 염색된, 3D-콜라겐 매트릭스에서 24시간 동안 배양된 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 5F'는 핵을 시각화하기 위한 병합되지 않은 DAPI 염색을 제시하는, 도 5F의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6A-D': 도 6A는 16시간 동안 전체 배지에서 배양된 다음, 고정되고 크리스탈 바이올렛으로 염색된 MSC의 대표적인 위상차 현미경 영상이다. 화살촉은 윤곽이 분명한 나노튜브를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6B는 16시간 동안 전체 배지에서 배양된 다음, 고정되고, 핵을 시각화하기 위한 DAPI 및 미토콘드리아 마커 항-아폽토시스-유도 인자 (AIF)로 염색된 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살촉은 두드러진 미토콘드리아 염색을 수반한 윤곽이 분명한 나노튜브를 가리킨다. 녹색 (연한 회색)은 AIF-표지된 미토콘드리아를 나타내고; 청색 (짙은 회색)은 DAPI-염색된 핵을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6C는 16시간 동안 전체 배지에서 배양된 다음, 고정되고 크리스탈 바이올렛으로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 위상차 현미경 영상이다. 화살촉은 윤곽이 분명한 나노튜브를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6C'는 도 6C의 확대된 영상이다. 화살촉은 윤곽이 분명한 나노튜브를 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6D는 16시간 동안 전체 배지에서 배양된 다음, 고정되고, 핵을 시각화하기 위한 DAPI 및 미토콘드리아 마커 항-AIF로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살촉은 두드러진 미토콘드리아 염색을 수반한 윤곽이 분명한 나노튜브를 가리킨다. 녹색 (연한 회색)은 AIF-표지된 미토콘드리아를 나타내고; 청색 (짙은 회색)은 DAPI-염색된 핵을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.
도 6D'는 도 6D의 확대된 영상이다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7A-E': 도 7A는 미토콘드리아 마커 항-AIF (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 지방-유래 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 미토콘드리아를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7A'는 미토콘드리아 마커 항-AIF (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 영상이다. 화살은 미토콘드리아를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7B는 리소솜 마커 항-리소솜-연관 막 단백질 1 (LAMP1, 연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 지방-유래 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 리소솜을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7B'는 LAMP1 (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 리소솜을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7C는 SiSo 세포 상에 발현된 골지 마커 항-수용체 결합 암 항원 (RCAS1, 연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 지방-유래 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 골지를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7C'는 골지 마커 항-RCAS1 (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 골지를 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7D는 소포체 (ER) 마커 항-단백질 디술피드 이소머라제 (PDI, 연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 지방-유래 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 ER을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7D'는 소포체 (ER) 마커 항-PDI (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 ER을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7E는 엔도솜 마커 항-초기 엔도솜 항원 1 (EEA1, 연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 지방-유래 MSC의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 리소솜을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 7E'는 엔도솜 마커 항-EEA1 (연한 회색) 및 DAPI (짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 공초점 현미경 영상이다. 화살은 리소솜을 가리킨다. 화살촉은 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 50 μm.
도 8A는 3시간 내에 8.0 μm 다공성 필터의 하면으로 성공적으로 이동한 다음, 크리스탈 바이올렛으로 염색된, 보이덴(Boyden) 챔버 검정에서 MSC 또는 세포질체의 대표적인 명시야 현미경 영상이다. 음성 대조군에서, 세포 및 세포질체는 상부 챔버와 하부 챔버 둘 다에서 2% FBS를 함유하는 배양 배지에서 이동하였다. 자극된 군에서, 상부 챔버의 바닥 표면은 피브로넥틴으로 코팅되었고, 100 ng/mL의 기질 세포-유래 인자 1 알파 (SDF-1α)가 하부 챔버에 부가되었다. 스케일 바 = 50 μm.
도 8B는 도 8A에서와 같이 처리된 이동하는 MSC 또는 세포질체 (음성 또는 자극된)의 비율을 제시하는 대표적인 막대 그래프이며, 여기서 각각의 양은 로딩 대조군 (피브로넥틴-코팅된 플레이트에 직접 부착된 MSC 또는 세포질체)에 정규화되었다. 평균 ± SEM; n=10.
도 9A-D: 도 9A는 100 μM의 세포 투과성 펩티드 (Arg)9-FAM (플루오레세인 아미다이트, 연한 회색)과 함께 인큐베이션되고 훽스트(Hoechst) 33342 (핵, 짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC의 대표적인 표면 형광 현미경 영상이다. 화살은 훽스트-염색된 핵을 표시하고; 화살촉은 양성 (Arg)9-FAM 시그널을 표시한다.
도 9B는 100 μM의 세포 투과성 형광 펩티드 (Arg)9-FM (연한 회색)과 함께 인큐베이션되고 훽스트 33342 (핵, 짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 표면 형광 현미경 영상이다. 화살은 훽스트-염색된 핵을 표시하고; 화살촉은 양성 (Arg)9-FAM 형광을 표시한다.
도 9C는 100 μM의 화학요법제 약물 독소루비신 (연한 회색)과 함께 인큐베이션되고 훽스트 33342 (희미한 짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC의 대표적인 표면 형광 현미경 영상이다. 화살은 훽스트-염색된 핵을 표시한다.
도 9D는 100 μM의 화학요법제 약물 독소루비신 (연한 회색)과 함께 인큐베이션되고 훽스트 33342 (희미한 짙은 회색 타원형)로 염색된 MSC-유래 세포질체의 대표적인 표면 형광 현미경 영상이다. 화살촉은 양성 독소루비신 형광을 표시한다.
도 9E는 면적당 세포 및 세포질체 평균 보정된 총 세포 형광을 제시하는 대표적인 막대 그래프이며, 이는 세포와 세포질체 간의 크기 차이를 설명하면서 상대적인 형광을 모델링한다. 보정된 총 세포 형광 = 통합 밀도 - (선택된 세포의 면적 * 배경 판독 값의 평균 형광). 평균 ± SEM; n=10.
도 10A는 24시간 동안 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC, 밝은 회색 도트) 표지된 소형 간섭 RNA (siRNA)와 함께 인큐베이션되고 훽스트 33342 (핵, 진한 회색 타원형)로 염색된 MSC 및 MSC-유래 세포질체의 병합된 및 병합되지 않은 공초점 현미경 및 위상차 영상의 패널이다. 화살촉은 양성 FITC-표지된 siRNA 형광을 표시한다. 화살은 핵을 표시한다. 스케일 바 = 50 μm.
도 10B는 면적당 세포 및 세포질체 평균 보정된 총 세포 형광을 제시하는 대표적인 막대 그래프이며, 이는 세포와 세포질체 간의 크기 차이를 설명하면서 상대적인 형광을 모델링한다. 보정된 총 세포 형광 = 통합 밀도 - (선택된 세포의 면적 * 배경 판독 값의 평균 형광).
도 11A는 정제되고 증강된 녹색 형광 단백질 메신저 RNA (EGFP-mRNA)로 형질감염된 후 20시간 및 훽스트 33342로 염색된 MSC 및 MSC-유래 세포질체의 대표적인 병합된 및 병합되지 않은 표면 형광 현미경 영상이다.
도 11B는 도 11A에서와 같이 처리된 MSC 또는 MSC-유래 세포질체의 EGFP mRNA 형질감염 효율 (총 세포 중 형질감염된 세포의 백분율)을 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 평균 ± SEM; n=3.
도 11C는 크기에 있어서의 차이를 설명하는, 세포와 세포질체 간의 상대적 EGFP 형광 강도를 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 평균 ± SEM; MSC 군, n=27; MSC-유래 세포질체 군, n=23. 보정된 총 세포 형광 = 통합 밀도 - (선택된 세포의 면적 * 배경 판독 값의 평균 형광). 모든 데이터는 적어도 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 12A는 대조군 배지, MSC-조건화 배지 (MSC CM), MSC-유래 세포질체-조건화 배지 (세포질체 CM), 또는 50 ng/mL의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)로 10분 동안 처리된 세포의 대표적인 웨스턴 블롯이다. 단백질 키나제 B (Akt), 인산화 Akt (p-Akt), 세포외 시그널 조절된 키나제 (Erk), 인산화 Erk (p-Erk)에 대해 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)가 로딩 대조군이었다.
도 12B는 가우스 루시페라제 (Gluc) mRNA로 형질감염된 MSC (MSC-Gluc), 비-형질감염된 MSC 대조군 세포 (MSC), Gluc mRNA로 형질감염된 MSC-유래 세포질체 (세포질체-Gluc), 및 비-형질감염된 MSC-유래 세포질체 (세포질체)를 플레이팅한 후 48시간에 배지에서 상대적 Gluc 활성을 제시하는 대표적인 막대 그래프이다.
도 12C는 보이덴 챔버 검정에서 4시간 동안 표시된 조건화 배지의 구배를 향해 이동하는 RAW 264.7 대식세포의 비율을 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 하부 막 표면 상의 이동 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 필드당 세포 수를 카운팅하며, 로딩 대조군 (피브로넥틴-코팅된 플레이트에 직접 부착된 세포)에 정규화하였다. 집락 자극 인자 1 (CSF-1), 양성 대조군으로서의 40 ng/mL의 마우스 CSF-1; MSC-배지, MSC로부터의 조건화 배지; 세포질체 배지, MSC-유래 세포질체로부터의 조건화 배지. 평균 ± SEM; n=10.
도 13A는 MSC 및 세포질체 내로 형질감염된 인터류킨 10 (IL-10) mRNA의 개략도이다. 코작 서열을 IL-10 mRNA 코딩 영역 (CDS)의 출발 코돈 앞에 부가하였다. 인간 베타 글로빈 (HBB) mRNA의 5' UTR 및 3' UTR을 각각, IL-10 CDS의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. 인공 5'캡을 IL-10 mRNA의 5' 말단에 부가하고, 슈도우리딘 변형을 조작하여 mRNA 안정성을 증가시켰다.
도 13B는 형질감염된 (++) 또는 비-형질감염된 (--) MSC 또는 MSC-유래 세포질체의 배양 배지 중 IL-10 농도를 제시하는 막대 그래프이다. MSC-유래 세포질체를 IL-10 mRNA로 형질감염시킨 다음, 2.5 x 104개 세포/웰로 24 웰 플레이트에 시딩하였다. 조건화 배지 (CM)를 형질감염 후 24시간에 수집하고 IL-10 농도를 ELISA에 의해 결정하였다.
도 13C는 1시간 동안 도 13B에서와 같이 처리된 MSC 또는 세포질체로부터의 표시된 조건화 배지 (CM)로 처리된 혈청 결핍 RAW 대식세포에서 Stat3 및 인산화된 Stat3 (P-Stat3, IL-10 활성화의 마커)의 단백질 발현을 제시하는 이뮤노블롯이다. 미처리됨 = CM 처리되지 않은 대조군. 완전 배지 = MSC 완전 배양 배지로 처리된 RAW 세포. MSC Ctrl = 비-형질감염된 MSC로부터의 CM으로 처리된 RAW 세포. MSC IL-10 = IL-10 mRNA 형질감염된 MSC로부터의 CM으로 처리된 RAW 세포. 세포질체 Ctrl = 비-형질감염된 세포질체로부터의 CM으로 처리된 RAW 세포. 세포질체 IL-10 = IL-10 mRNA 형질감염된 세포질체로부터의 CM으로 처리된 RAW 세포.
도 13D는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 마우스 혈액 중 분비된 IL-10 시토카인의 농도를 제시하는 막대 그래프이다. MSC 또는 MSC-유래 세포질체를 도 13B에서와 같이 처리하고, C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 주사한지 2시간 후에, 동물을 안락사시키고, 심장 천자에 의해 혈액 샘플을 수집하였다. 평균 ± SEM; n=3.
도 14A는 24시간 동안 화학유인물질로서 10% FBS를 향해 기저 막 추출물 (BME)로 코팅된 8.0 μm 다공성 필터의 하면으로 침습한 보이덴 챔버 검정에서 크리스탈 바이올렛-염색된 MSC 또는 MSC-유래 세포질체의 대표적인 명시야 현미경 영상이다. 음성 = FBS 없음 (음성 대조군). 스케일 바 = 50 μm.
도 14B는 로딩 대조군과 비교해서 막의 하면에 침습한, 도 14A에서와 같이 처리된 MSC 또는 MSC-유래 세포질체의 비율을 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 평균 ± SEM; n=18.
도 15A는 현탁 배지 중 MSC 및 세포질체의 대표적인 표면 형광 현미경 영상 (상부 패널) 및 위상차 현미경 영상 (하부 패널)이다. 액틴 피질은 라이프액트(Lifeact) RFP로 염색되었지만, 세포핵은 바이브런트® 다이사이클™ 그린으로 염색되었다. 화살은 세포질체를 가리키고 화살촉은 MSC 핵을 가리킨다. 스케일 바 = 20 μm.
도 15B는 니콘 엘리먼트(Nikon Element) 소프트웨어로 측정된 바와 같은 MSC 및 세포질체의 크기 분포를 제시하는 대표적인 산포도이다. 평균 ± SEM; n=80.
도 15C는 폐에 존재하는 검출된 바이브런트® DiD-표지된 MSC 또는 세포질체를 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. MSC 또는 세포질체를 DiD 염료로 표지하고 C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 조직을 24시간 후에 수확하고, 세포 현탁액을 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM; n=3.
도 15D는 간에 존재하는 검출된 바이브런트® DiD 표지된 MSC 또는 세포질체를 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 평균 ± SEM; n=3. MSC 또는 세포질체를 DiD 염료로 표지하고, C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 조직을 24시간 후에 수확하고, 세포 현탁액을 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.
도 16A는 MSC 및 세포질체 상에 CXCR4 (서열식별번호(SEQ ID NO): 1-15)를 발현하도록 조작된 대표적인 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.
도 16B는 플로우조에 의해 분석된 바와 같이, 조작된 세포질체 및 조작된 모 MSC 상의 형광 항체에 의한 세포 표면 CXCR4 발현의 시그널 강도에 대해 카운팅된 이벤트의 수를 제시하는 대표적인 유동 세포계수법 그래프이다.
도 16C는 로딩 대조군과 비교해서 보이덴 챔버 막의 하면으로 이동한 이동하는 세포 또는 세포질체의 비율을 제시하는 대표적인 막대 그래프이다. 평균 ± SEM; n=10. 도 16A에서와 같이 조작된 CXCR4 수용체를 갖는 경우 및 갖지 않는 경우의 MSC 및 MSC-유래 세포질체를 보이덴 챔버 검정에서 2시간 동안 표시된 농도의 SDF-1α를 향해 이동시킬 수 있었다.
도 17A는 MSC 및 세포질체 상에 PSGL1 (P-셀렉틴 당단백질 리간드 1) 및 Fut7 (푸코실트랜스퍼라제, PSGL1을 글리코실화/활성화함)을 발현하도록 조작된 렌티바이러스 벡터의 개략도이다. PSGL1의 코딩 서열 (서열식별번호: 16) 및 Fut7의 코딩 서열 (서열식별번호: 17)이 2A 서열 (서열식별번호: 18)에 의해 연결되었다.
도 17B는 플로우조에 의해 분석된 바와 같이, 조작된 세포질체 및 조작된 모 MSC 상에 형광 항체에 의한 세포 표면 PSGL1 발현의 시그널 강도에 대해 카운팅된 이벤트의 수를 제시하는 대표적인 유동 세포계수법 그래프이다.
도 17C는 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, 조작된 MSC 및 MSC-유래 세포질체와 P-셀렉틴의 세포 표면 결합을 제시하는 대표적인 그래프이다. MSC 대조군 = 모 MSC. 조작된 MSC = PSGL1/Fut7 조작된 MSC. 조작된 세포질체 = PSGL1/Fut7 조작된 MSC-유래 세포질체.
도 18A는 MSC 및 세포질체 상에 mCD47 (서열식별번호: 19)을 발현하도록 조작된 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.
도 18B는 플로우조에 의해 분석된 바와 같이 조작된 세포질체 및 MSC 상에서의 mCD47 발현의 세포 표면의 시그널 강도에 대해 카운팅된 이벤트의 수를 제시하는 대표적인 유동 세포계수법 그래프이다.
도 18C는 대식세포에 의해 포식되지 않은 (F4/80- 및 CD11b-) 살아있는 세포질체 (DiD+)의 수를 제시하는 대표적인 막대 그래프이며, 이는 세포질체가 폐에서 대식세포 포식 작용을 벗어났다는 것을 표시한다. 평균 ± SEM; n=3. DiD 염료-표지된 대조군 세포질체 또는 조작된 세포질체 (mCD47 세포질체)를 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 24시간 후, 조직을 수확하고, 2종의 상이한 범-대식세포 마커 (F4/80 및 CD11b)로 염색하였다.
도 18D는 대식세포에 의해 포식되지 않은 (F4/80- 및 CD11b-) 살아있는 세포질체 (DiD+)를 제시하는 대표적인 막대 그래프이며, 이는 세포질체가 간에서 대식세포 포식 작용을 벗어났다는 것을 표시한다. 평균 ± SEM; n=3. DiD 염료-표지된 대조군 세포질체 또는 조작된 세포질체 (mCD47 세포질체)를 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 24시간 후, 조직을 수확하고, 2종의 상이한 범-대식세포 마커 (F4/80 및 CD11b)로 염색하였다.
도 19A는 IL-12 mRNA 설계의 개략도이다. 코작 서열을 IL-12 mRNA 코딩 영역 (CDS)의 출발 코돈 앞에 부가하였다. 인간 베타 글로빈 (HBB) mRNA의 5' UTR 및 3' UTR을 각각, IL-12 CDS의 5' 및 3' 말단에 부가하였다. 인공 5'캡을 IL-12 mRNA의 5' 말단에 부가하고 슈도우리딘 변형을 구현하여 mRNA 안정성을 증가시켰다.
도 19B는 IL-12 mRNA로 형질감염된 다음 24-웰 플레이트의 2.5 x 104개 세포/웰로 플레이팅된 MSC 또는 MSC-유래 세포질체의 조건화 배지에서 시간 경과에 따른 분비된 IL-12 농도를 제시하는 대표적인 선 그래프이다. 표시된 시점에 CM을 수집하고, 분비된 IL-12 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. MSC 단독 = 비-형질감염된 대조군으로부터의 CM. MSC IL-12 = IL-12 mRNA로 형질감염된 MSC로부터의 CM. 세포질체 IL-12 = IL-12 mRNA로 형질감염된 세포질체.
도 19C는 인산화된/활성화된 형태의 Stat4 (P-Stat4)의 활성화를 제시하는 이뮤노블롯이다. 마우스 비장 세포를 전체 배지, 정제된 IL-12 단백질 표준물, 또는 30분 동안 도 19B에서와 같이 조작된 MSC 또는 세포질체로부터 수집된 표시된 CM으로 처리하였다. MSC 전체 배지 = MSC 완전 배양 배지로 처리된 마우스 비장 세포. MSC IL-12 = IL-12 mRNA 형질감염된 MSC로부터의 CM으로 처리됨. 세포질체 IL-12 = IL-12 mRNA-형질감염된 세포질체로부터의 CM으로 처리됨.
도 19D는 종양 단백질 mg당 분비된 IL-12 시토카인의 농도를 제시하는 대표적인 산포도이다. 도 19B에서와 같이 처리된 IL-12 조작된 또는 대조군 세포질체를 동계 C57BL/6 마우스에서 성장하는 확립된 E0771 (마우스 수질 유방 암종) 종양 내로 주사하였다. 종양 주사 후 48시간에, 동물을 안락사시키고, 종양 샘플을 수집하며, 용해시키고 ELISA에 의해 분석하였다. PBS = PBS가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 = 비-조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 IL-12 = IL-12 시토카인을 발현하도록 조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 샘플.
도 20A는 인터페론-γ mRNA에 대한 발현의 배수 변화를 제시하는 산포도이다. IL-12를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체 또는 IL-12를 수반하지 않는 대조군 세포질체를 동계 C57BL/6 마우스에서 성장하는 확립된 E0771 종양 내로 주사하였다. 주사 후 48시간에, 동물을 안락사시키고, 종양 샘플을 수집하며, 용해시키고 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다. PBS = PBS가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 = 비-조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 IL-12 = IL-12 시토카인을 발현하도록 조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 종양 샘플. 각각의 도트는 마우스 종양 샘플을 나타낸다. 평균 ± SEM; n=5.
도 20B는 PD-L1 mRNA에 대한 발현의 배수 변화를 제시하는 산포도이다. IL-12를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체 또는 IL-12를 수반하지 않는 대조군 세포질체를 동계 C57BL/6 마우스에서 성장하는 확립된 E0771 종양 내로 주사하였다. 주사 후 48시간에, 동물을 안락사시키고, 종양 샘플을 수집하며, 용해시키고 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다. PBS = PBS가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 = 비-조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 IL-12 = IL-12 시토카인을 발현하도록 조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 종양 샘플. 각각의 도트는 마우스 종양 샘플을 나타낸다. 평균 ± SEM; n=5.
도 20C는 CXCL9 mRNA에 대한 발현의 배수 변화를 제시하는 산포도이다. IL-12를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체 또는 IL-12를 수반하지 않는 대조군 세포질체를 동계 C57BL/6 마우스에서 성장하는 확립된 E0771 종양 내로 주사하였다. 주사 후 48시간에, 동물을 안락사시키고, 종양 샘플을 수집하며, 용해시키고 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다. PBS = PBS가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 = 비-조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 샘플. 세포질체 IL-12 = IL-12 시토카인을 발현하도록 조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터의 종양 샘플. 각각의 도트는 마우스 종양 샘플을 나타낸다. 평균 ± SEM; n=5.
도 20D는 종양 세포 접종 후 제11일, 제14일 및 제18일에 3 x 106개 IL-12 조작된 세포질체 (세포질체 IL12 군) 또는 PBS (PBS 군)가 종양 내로 주사된 C57Bl/6 마우스에서 E0771 피하 종양 크기의 배수 변화를 제시하는 막대 그래프이다. 종양 크기의 배수 변화 = 제20일의 종양 용적/제11일의 종양 용적. 평균 ± SEM; n=5.
도 21A는 GFP를 코딩하는 종양용해성 단순 포진 바이러스 (oHSV-GFP) 0.05 MOI로 감염된 라이프액트-RFP 발현 MSC 또는 세포질체를 누드 마우스 내의 피하 U87 교모세포종 종양 내로 주사한 후 7일에 찍은 표면 형광 현미경 영상이다. 화살촉은 RFP 양성 세포를 나타낸다 (종양 내부의 MSC 생존 및 증식을 표시함). 화살은 GFP-양성 종양 세포를 나타낸다 (MSC 또는 세포질체로부터 종양 세포로의 oHSV-GFP의 성공적인 전달). 스케일 바 = 100um.
도 21B는 oHSV-GFP 바이러스를 운반하는 MSC 또는 세포질체에 의해 감염된 종양 세포의 일부분을 나타내는, 도 21A에서와 같이 처리된 종양에 대한 GFP-양성 종양 면적의 백분율을 제시하는 막대 그래프이다.
도 21C는 유동 세포계수법에 의해 분석된 바와 같이, 조작된 세포질체가 주사된 종양에 존재하는 총 CD45+ (면역 세포) 중 CD8+ 이펙터 T 림프구 세포의 비율을 제시하는 산포도이다. C57Bl/6 마우스에서 확립된 피하 E0771 종양에, oHSV-형질감염된 및 IL-12 조작된 세포질체 또는 PBS 단독 (음성 대조군)을 종양 내로 주사하였다.
도 22A는 Cre-조작된 세포질체와 성공적으로 융합된 유핵 MSC 세포에서의 RFP 발현을 제시하는 대표적인 표면 형광 현미경 영상이다. MSC-유래 세포질체는 Cre 재조합 효소를 발현하도록 유전적으로 조작된 다음, Loxp-GFP-스톱-Loxp-RFP를 발현하도록 조작된 hTERT-MSC와 3:1의 비율로 (3 펄스의 경우 100 μs 동안 500 V 하에) 전기융합되었다. RFP에 대한 분류 및 훽스트로 염색한 후 형광 영상을 촬영하였다. 화살촉은 훽스트-염색된 핵을 표시하고, 화살은 RFP의 성공적인 Cre-유도된 발현을 표시하는 양성 RFP 형광을 표시한다. 스케일 바 = 100 μm.
도 22B는 총 세포 중에서 RFP+ (융합된) 세포의 백분율을 제시하는 막대 그래프이다. Loxp MSC 단독 = Loxp-GFP-스톱-Loxp-RFP-hTERT-MSC의 단일 배양. Cre 세포질체 단독 = Cre 재조합 효소를 발현하도록 조작된 세포질체의 단일 배양. 공동 배양 = 48시간 동안 Loxp MSC와 Cre 세포질체의 공동 배양. 융합 = Loxp MSC 및 Cre 세포질체의 전기융합. 평균 ± SEM; n=4.
도 23은 MSC 및 세포질체 상에 mCCR2 (서열식별번호: 20)를 발현하도록 조작된 렌티바이러스 벡터의 개략도이다.
도 24A는 폐에서 검출된 DiD-표지된 MSC 또는 세포질체의 수를 제시하는 대표적인 산포도이다. MSC를 표준 부착 조건 (2D) 하에 배양하거나 또는 현적 방법 (3D)에 의해 현탁 배양하여 3D 세포질체를 생성시켰다. MSC 및 세포질체를 바이브런트® DiD 염료로 표지시키고, C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 조직을 24시간 후에 수확하고, 세포 현탁액을 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM; n=2.
도 24B는 간에서 검출된 DiD-표지된 MSC 또는 세포질체의 수를 제시하는 대표적인 산포도이다. MSC를 표준 부착 조건 (2D) 하에 배양하거나 또는 현적 방법 (3D)에 의해 현탁 배양하여 3D 세포질체를 생성시켰다. MSC 및 세포질체를 바이브런트® DiD 염료로 표지시키고, C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 조직을 24시간 후에 수확하고, 세포 현탁액을 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM; n=2.
도 24C는 비장에서 검출된 바이브런트® DiD-표지된 MSC 또는 세포질체의 수를 제시하는 대표적인 산포도이다. MSC를 표준 부착 조건 (2D) 하에 배양하거나 또는 현적 방법 (3D)에 의해 현탁 배양하여 3D 세포질체를 생성시켰다. MSC 및 세포질체를 DiD 염료로 표지시키고, C57BL/6 마우스의 안와후방 혈관계 내로 주사하였다. 조직을 24시간 후에 수확하고, 세포 현탁액을 유동 세포계수법에 의해 분석하였다. 평균 ± SEM; n=2.
도 25A는 표시된 시간 동안 4℃ 하에 동결동면로부터의 회복 직후 MSC 및 MSC-유래 세포질체의 생육성을 제시하는 대표적인 선 그래프이다. 트리판 블루 염료 배제를 사용하여 자동화된 세포 카운트 (셀 카운티스(Cell Countess))에서 생육성을 평가하고, 유입 세포의 수에 대한 비율로서 표시하였다.
도 25B는 표시된 시간 동안 4℃ 하에 동결동면으로부터의 회복 직후 보이덴 챔버 검정에서 이동된 MSC와 MSC-유래 세포질체를 비교하는 대표적인 막대 그래프이다. 세포 및 세포질체를 바닥 챔버에서 화학유인물질로서 무혈청 (음성 대조군) 또는 10% 프리미엄 FBS (P-FBS)와 함께 3시간 동안 이동시키고, 카운트를 로딩 대조군에 대해 정규화하였다.
본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같이 핵이 제거된 세포 (예를 들어, 세포질체)가 치료적 기능을 나타낸다는 것을 처음으로 제시한다. 일부 실시양태에서, 세포는 피질 액틴 세포 골격을 연화시키기 위해 시토칼라신 B로 처리될 수 있다. 그 후, 핵은 피콜(Ficoll)의 구배에서 고속 원심분리에 의해 세포체로부터 물리적으로 추출되어 핵이 없는 (제핵) 세포질체를 생성할 수 있다. 세포질체 및 무손상 유핵 세포는 피콜 구배에서 상이한 층으로 침강되기 때문에, 세포질체는 일부 실시양태에서, 치료적 목적으로 또는 다른 세포 (유핵 또는 제핵)에의 융합을 위해 용이하게 단리 및 제조될 수 있다. 제핵 프로세스는 수천만개의 세포를 프로세싱하도록 임상적으로 확장가능할 수 있다. 개념 증명 데이터에 따르면, 세포질체는 건강한 개체를 치료하기 위해 (예를 들어, 에너지, 운동 회복을 개선시키거나, 또는 자연 산물을 전달하기 위해) 또는 다양한 질환 (예를 들어, 본원에 기재된 질환 중 임의의 것)을 치료하기 위해 임상적으로 관련있는 카고/페이로드를 전달하기 위한 귀소 비히클로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포질체는 건강한 개체, 예를 들어, 전달된 치료체가 유효한 특이적 장애가 있는 것으로 진단되지 않은 개체에게 보충제, 항노화 인자, 예방적 치료 등을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 세포질체는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있기 때문에 상당한 치료적 가치를 보유하고 있다: 최대 14일 동안 생육성을 유지할 수 있고, 다른 세포 유형으로 분화되지 않으며, 생물활성 단백질을 분비하고, 물리적으로 이동/귀소할 수 있으며, 생체외에서 광범위하게 조작되어 특이적 치료적 기능을 수행할 수 있고, 동일하거나 다른 세포 유형과 융합되어 자연적이거나 또는 조작된 바람직한 세포 기능을 전달할 수 있다. 따라서, 세포질체는 치료적으로 중요한 생체분자, 유전자 편집 인자; 및 화학요법 약물 (예를 들어, 독소루비신), 유전자, 바이러스, 박테리아, mRNA, shRNA, siRNA, 펩티드, 플라스미드 및 나노입자를 포함한 질환 표적화 카고를 전달하기 위한 새로운 세포성 비히클로서의 넓은 유용성을 가질 수 있다. 본 개시내용은 유리하게는, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포질체를 사용하여 원치 않는 DNA가 대상체에게 전달되지 않게 하는 것으로 여겨지기 때문에 안전한 치료제의 생성을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 유리하게는, 세포질체의 세포 사멸이 일부 실시양태에서, 정확한 시간, 예를 들어 3-4일 내에 발생할 수 있으므로, 제어가능한 치료제를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포질체는 인간 또는 동물에게 특이적 유전자 편집, 질환 퇴치, 및 건강 증진 카고를 전달하도록 유전적으로 조작될 수 있는 세포-기반 운반체로서 작용할 수 있다. 마지막으로, 임상 적용을 위해 상당수의 치료용 세포를 제조하는 것은 제한되고 비용이 많이 들 수 있으므로, 특히 줄기 세포 분야에서 많은 세포-기반 요법의 적용을 제한한다. 따라서, 불멸화 세포 (hTERT, 바이러스 및 종양 유전자를 사용함)를 사용하여 제조 능력을 증가시키는 것이 유리할 수 있었는데, 이는 그것이 강력하고 비용 면에서 효과적일 수 있기 때문이다. 그러나, 불멸화 세포는 암을 유발할 수 있으므로, 치료적 적용에 너무 위험할 수 있다. 본 개시내용은 치료적 사용을 위해 배양 중인 대규모 제조를 위한 특정 유형의 유핵 세포 (불멸화 세포, 암 세포 (예를 들어, 임의의 암 세포), 1차 (예를 들어, 숙주 유래) 세포 또는 세포주)의 사용을 허용하는데, 이는 이들이 투여 또는 사용 전에 제핵에 의해 안전해질 수 있기 때문이다.
본 개시내용은 수명 동안 핵을 유지하거나 또는 자연적으로 제핵되지 않는 임의의 유핵 세포 유형으로부터, 대상체에서 안전하고 제어가능한 세포-기반 치료제를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 면역 시스템으로부터 유래된 (예를 들어, 수득된) 흔히 사용되는 치료용 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 대식세포, 림프구, 비만 세포, 호염기구, 호산구), 줄기 세포 (예를 들어, iPSC (유도 만능 줄기 세포), 성체 줄기 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포), 및 배아 줄기 세포 포함), 및 섬유모세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 신체로부터 제거된 임의의 1차 세포, 또는 정상 또는 암 세포주로부터 유래된 (예를 들어, 수득된) 임의의 유핵 세포로부터 세포 핵을 제거하는 (제핵으로 부르기도 함) 방법을 제공한다. 세포 제핵은 제한된 기간, 예를 들어, 최대 3-4일 동안 생육성인 치료용 세포질체를 창출할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 일부 측면에서, 하기 행위 중 하나 이상을 수행할 수 없는 안전한 치료용 비히클로서의 세포질체에 대한 새로운 용도를 제공한다: 증식하는 행위, 분화하는 행위, 대상체 내로 영구적으로 생착되는 행위, 암이 되는 행위, 또는 핵-코딩된 DNA/유전자를 대상체에게 전달하는 행위 (예를 들어, 위험한 핵-코딩된 DNA/유전자를 대상체에게 전달하는 행위).
세포-기반 요법의 경우, FDA 승인은 일부 경우에, 세포가 안정하다는 증거에 근거하고 있으며, 이는 대상체 내부에서 일단 변경되지 않거나 위험하지 않다는 것을 의미한다. 그러나, 1차 세포, 방사선조사된 세포, 또는 "사멸 스위치" 제어된 세포를 포함한 현재의 세포 제품은 여전히 생체내 미세 환경에 반응할 수 있거나 또는 변화할 수 있는 잠재력을 갖는다. 중요하게도, 현재의 요법은 여전히 새로운 유전자를 전사할 수 있는 잠재력을 보유할 수 있으며, 이는 생체내에서 제어가능한 반응이 아니다. 이러한 유전자 전사는 조절 요건을 만족시킬 수 있는 능력을 방해한다. 대조적으로, 핵이 결여된 세포질체는 일반적으로, 매우 상이한 생체내 미세 환경에서도 새로운 유전자 전사 잠재력을 갖지 않으므로, 보다 제어되고 보다 안전한 세포-기반 요법이다.
현재까지, 세포-기반 치료제는 일반적으로, 정상 또는 조작된 유핵 세포를 사용한다. 일부 세포-기반 요법은 세포 증식 및 유도된 치명적인 DNA-손상을 방지하기 위해 대상체 투여 전에 세포에 방사선조사한다. 그러나, 이러한 접근법은 돌연변이를 유도하고, 세포성 단백질 및 DNA를 비가역적으로 손상시킬 수 있는 상당한 양의 반응성 산소 종을 생산하며, 이는 대상체의 신체 내로 다량의 손상된/돌연변이된 DNA를 방출할 수 있다. 이러한 제품은 다른 세포 내로 통합되고/거나 원치 않는 항-DNA 면역 반응을 유도하는 경우에 위험할 수 있다. 방사선조사된 세포는 또한, 그의 돌연변이된 DNA 및 유전자를 세포-세포 융합에 의해 숙주 세포로 전달할 수 있기 때문에 위험할 수 있다. 세포로부터 전체 핵을 제거하는 것은 대상체 내로의 핵 DNA의 임의의 도입을 방해할 수 있는 세포성 수명을 제한하는데 덜 해롭고 상당히 더 안전한 방법이다. 더욱이, 많은 줄기 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 방사선으로 인한 사멸에 대해 높은 내성을 갖기 때문에, 이러한 방법을 사용하여 안전하게 만들 수 없다. 다른 경우에, 치료용 세포는 세포성 수명을 제한하기 위해 약물 유도성 자살 스위치로 조작되었다. 그러나, 생체내에서 그러한 스위치의 활성화는 원치 않는 부작용을 갖는 강력하고 잠재적으로 유해한 약물을 대상체에게 투여할 것을 요구할 수 있다. 이러한 방법이 배양 세포에서 자살을 유도할 수 있지만 (예를 들어, 95% 초과), 임상으로 옮겨 보면 이는 비효율적일 것으로 예상된다. 임의의 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 대상체 내의 모든 세포가 약물 유도된 사멸을 겪을 수 있는 것은 아니기 때문에, 약물 유도성 자살 스위치는 임상 실무를 위한 불충분한 안전성 측정 기준일 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 광범위하게 조작된 세포 또는 줄기 세포 또는 암 세포의 경우, 약물 유도된 자살 스위치는 임상 실무에 위험하거나 불충분한 것으로 간주될 수 있었다. 더욱이, 치료용 세포의 사멸은 다량의 DNA (정상 또는 유전적으로 변경됨)를 방출할 수 있으며, 이는 숙주 세포 내로 통합되거나 또는 위험한 전신 항-DNA 면역 반응을 유도할 수 있다. 세포가 자살 스위치를 돌연변이 및/또는 상실시키거나 또는 불활성화시키는 경우, 이는 비-제어가능한 돌연변이체 세포가 될 수 있다. 또한, 이들 세포는 대상체에서 숙주 세포와 융합하므로, DNA (예를 들어, 돌연변이체 DNA)를 전달할 수 있다. 이러한 융합된 세포는 모든 숙주 세포가 자살 유전자를 물려받지는 않지만 염색체 재구성 및 세포 혼성화 동안 치료용 세포의 유전자/DNA 중 일부를 물려받을 수 있기 때문에 위험할 수 있다. 또한, 동일한 이유로, 자살 스위치를 수반한 치료용 세포는 시험관내에서 세포 융합 파트너로서 사용하기에 이상적이지 않을 수 있다. 치료용 세포 수명을 제한하는 또 다른 방법은 치료적 사용에 유리한 생물학적 기능 (예를 들어, 단백질 번역)을 종료시키는 심각한 손상을 유발하는 열 유도된 사멸이다. 세포질체와는 달리, 유핵 세포 요법 및 상기 기재된 방법에 의해 불활성화된 일부 세포조차도 여전히, DNA를 대상체에게 전달할 수 있는데, 이는 그들이 자신의 핵 및 유전 물질을 보유하고 있기 때문이다. 화학요법 약물 및 미토마이신 C 등을 포함한 다수의 화학 물질이, 치료적 사용 전에 세포 증식을 억제하고/거나 세포 사멸을 유발한다. 그러나, 이러한 약물은 세포를 크게 손상시키는 상당한 표적을 벗어난 효과를 가질 수 있으며, 이는 높은 독성으로 인해 임상 적용에 바람직하지 않다. 많은 항증식 및 사멸 유도 약물은 내성으로 인해 세포의 100%를 효과적으로 억제하지 못하며, 세포질체와는 달리, 많은 약물 효과가 가역적이다. 따라서, 이러한 접근법은 생체내에서 불멸화 또는 암 세포의 세포 성장을 방지하는데 적합하지 않다.
본 개시내용은 DNA/유전자 (예를 들어, 플라스미드), RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 단백질, 펩티드, 소분자 치료제 (예를 들어, 소분자 약물), 유전자 편집 구성요소, 나노입자, 및 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 치료적 기능을 갖는 생체분자의 자연적 또는 유도성 발현 및/또는 흡수를 갖는 치료용 세포질체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 DNA/유전자 (예를 들어, 플라스미드), RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 단백질, 펩티드, 소분자 치료제 (예를 들어, 소분자 약물), 유전자 편집 구성요소, 나노입자, 및 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대상체에게 치료용 카고를 전달하기 위한 비히클로서 세포질체를 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 DNA/유전자 (예를 들어, 플라스미드), RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 단백질, 펩티드, 소분자 치료제 (예를 들어, 소분자 약물), 유전자 편집 구성요소, 나노입자, 및 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 또는 지질)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 이온, 분자, 화합물, 복합체, 또는 생체분자 (이는, 예를 들어, 분비되거나, 세포내이거나, 유도성이거나, 또는 그의 조합일 수 있음)를 생산하기 위해 세포질체를 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 임의의 유핵 세포 유형 (예를 들어, 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 포유동물 세포), 원생동물 세포 (예를 들어, 아메바 세포), 해조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 무척추 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 또는 조류 세포)으로부터 유래된 (예를 들어, 수득된) 치료용 세포질체를 시험관내에서 대규모로 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 세포는 자연적으로 또는 유전 공학에 의해 불멸화되고/거나 발암적으로 형질전환될 수 있었다.
본 개시내용은 미토콘드리아, 리보솜, 엔도솜, 리소솜, 골지, DNA/유전자 (예를 들어, 플라스미드), RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 단백질 (예를 들어, 시토카인, 성장 인자, 및 단백질 호르몬), 펩티드, 소분자 치료제 (예를 들어, 소분자 약물), 유전자 편집 구성요소, 나노입자, 및 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 소기관 및 생체분자 (분비된, 세포내, 및 자연 및 유도성)를 증강 및/또는 전달하기 위해 다른 세포 또는 세포질체 (치료용 또는 자연)와의 융합 파트너로서 치료용 세포질체 (자연적이거나 또는 조작된)를 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 시험관내에서 치료용 세포질체를 동결보존, 동결동면, 저장, 및 회수하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 생물학적 프로세스 및 건강 상태 또는 질환 상태의 시그널 변환 지표 및 바이오센서로서 세포질체를 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 일부 실시양태에서, 치료제로서 사용될 수 있고/거나 특이적 질환 퇴치 및 건강 증진 카고를 안전하고 제어가능한 방식으로 인간 또는 동물 대상체에게 전달하도록 변형될 수 있고/거나 유전적으로 조작될 수 있는 신규한 핵이 없는 세포-기반 제품의 생성을 가능하게 한다.
효과적인 세포-기반 치료제의 개발은 종종, 유전 공학과 생체외 세포의 게놈 내로의 새로운 유전 물질의 도입을 요구한다. 그러나, 이러한 프로세스는, 특히 조작된 세포가 영구적으로 체내로 생착되거나 또는 숙주 세포와 융합하는 경우에, 암 및 생명을 위협하는 다른 질환을 일으키는 위험한 돌연변이를 게놈 내로 도입할 수 있다. 본 개시내용은 본질상 생물학적 또는 합성인 특이적 페이로드를 전달하기 위한 비히클로서 또는 안전한 치료제로서 사용하기 위해 임의의 유핵 세포 유형으로부터 전체 핵 (즉, 모든 핵 코딩된 DNA)을 제거하는 것을 허용한다. 핵-코딩된 유전자 또는 외래 또는 돌연변이체 DNA가 대상체로 전달되지 않아서, 원치 않는 질환 상태를 창출하지 않고/거나 항-DNA 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 세포질체는 유핵 세포보다 더 안전할 수 있다. 본 개시내용은 iPSC (유도 만능 줄기 세포), 임의의 불멸화 세포, 줄기 세포, 1차 세포 (예를 들어, 숙주 유래 세포), 세포주, 임의의 면역 세포, 또는 암성 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 정상 또는 조작된 임의의 유핵 세포 유형으로부터 유래된 안전하고, 핵이 없는 세포 치료제의 새로운 플랫폼의 생성을 허용한다. 30년 넘게 전에 실제 제핵 프로세스가 문헌에 확립되었다는 것은 주목할 만하다. 그러나, 치료적 실체로서 또는 대상체에게 자연적이거나 또는 조작된 임의의 치료용 카고를 전달하기 위한 비히클로서의 세포질체의 사용 또는 개발은 현재까지 입증되지 않았다.
다수의 기존의 세포-기반 치료제의 중요한 문제는 신체에 전달된 후, 세포가 제어할 수 없을 정도로 증식하고 체내에 영구적으로 생착하여 생명을 위협할 수 있다는 것이다.
또한, 대상체에게 투여된 후 세포 제어의 결여는 정확한 용량의 치료용 세포 및 그들의 생물활성 산물의 전달을 어렵게 할 수 있다 (즉, 불량한 약동학). 본 개시내용의 일부 실시양태에서, 세포질체는 자신의 유핵 대응물과 동일한 많은 생물학적/치료적 기능을 수행할 수 있지만, 규정된 수명 (예를 들어, 1시간 내지 14일)을 가질 수 있기 때문에 대상체에서 영구적으로 증식하거나 생착되지 않는다. 따라서, 세포질체-기반 요법의 약동학은 대상체에서 제어가능하고 예측 가능한 반응으로 정의 가능하고 상당히 더 안전할 수 있다.
본 개시내용의 일부 실시양태에서, 세포질체는 그들의 규정된 수명을 지나 (예를 들어, "죽은" 세포질체) 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여된 세포질체의 사멸 프로세스는 대상체에 대해 면역 자극 효과를 가질 수 있다.
환자 또는 대상체 전달 전에, 전통적인 세포-기반 치료제는 바람직한 세포성 및 치료적 기능을 생성하기 위해 생체외에서 통상적으로 변형되거나 또는 유전적으로 변경된다. 그러나, 이들 세포가 대상체 내로 도입될 때, 새로운 숙주 환경은 현저하게 재프로그래밍되고 부정적으로 변경될 수 있거나, 또는 그렇지 않으면 이들을 효과적이지 못하게 만들 수 있다. 세포질체에는 핵이 없기 때문에, 새로운 유전자 전사가 존재하지 않으며, 이는 일부 실시양태에서, 세포질체가 재프로그래밍 및 유해한 외부 시그널에 반응할 수 없다는 것을 의미한다. 따라서, 세포질체는 대상체 내로 도입될 때 그들의 분화된 표현형 및 생체외 조작된 치료적 기능을 보유할 수 있어, 보다 제어가능하고 예측 가능한 치료용 비히클이 되도록 한다. 마찬가지로, 즉시 제핵되는 정상적인 공여자 세포는 대상체 내로 이식될 때 자신의 생체내 프로그램/속성을 보유할 수 있다. 전반적으로, 세포질체는 자신의 시험관내 및 생체내 표현형 및 생물학적 기능을 보유할 수 있기 때문에, 전통적인 세포-기반 치료제보다 더 제어가능하고 예측 가능한 치료용 비히클일 수 있다. 이러한 특성은 특이적 치료적 기능을 수행하기 위해 생체외에서 조작된 세포 또는 신선하게 유래된 (예를 들어, 신선하게 수득된) 공여자 세포에 의존하는 많은 치료적 적용에 매우 중요하다.
유핵 세포와는 달리, 핵이 없는 세포질체에는 일부 실시양태에서, 암 또는 다른 질환에 대항한 치료제로서 대상체에게 전달하기 위한 고용량의 DNA 손상/유전자 표적화제를 로딩할 수 있다. 이는 DNA 손상 화학요법 약물, DNA 통합 바이러스, 종양용해성 바이러스; 및 클러스터된 규칙적으로 공간을 둔 짧은 팔린드롬성 반복 서열 (CRISPR), cas의 소형 클러스터 (CRISPR/Cas 시스템), 및 플라스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 유전자 요법 적용/전달을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 또한, 임의의 카고를 세포질체에 로딩하지 않고서도, 대상체에게 투여 시 치료적 효과를 선천적으로 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 하나 이상의 치료제를 생산하도록 조작되지 않으면서도 치료적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 카고를 세포질체 내로 로딩하지 않거나 또는 하나 이상의 치료제를 생산하도록 조작되지 않으면서도 치료적일 수 있다. 예를 들어, 조작되지 않은 세포질체 자체는 환자 또는 대상체 내로 전달될 때 치료적 특성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작되지 않은 세포질체는 하기 중 하나 이상을 생산할 수 있다: 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자. 일부 실시양태에서, 조작되지 않은 세포질체 (예를 들어, 자가 또는 동종이계 공급원으로부터 유래됨)는 하기 행위 중 하나 이상을 수행할 수 있는 능력을 가질 수 있다: 치료용 표면 단백질, 면역 자극 항원, 또는 수용체를 발현하는 행위; 시토카인, 호르몬, 또는 단백질을 분비하는 행위; 엑소솜을 방출하는 행위; 막 입자를 흘리는 행위; 사멸 프로세스를 통해 면역 자극성이 되게 하는 행위; 또는 미토콘드리아 및 다른 세포-유래 생체분자를 전달할 수 있는 터널링 나노튜브를 창출하는 행위. 일부 실시양태에서, 죽은 세포질체는 선천적으로 치료적 효과를 초래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 세포 (예를 들어, 이종 배양된 세포)에 적용되거나 또는 그와 함께 배양되어 그들의 특성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체 (예를 들어, 조작되지 않은 세포질체 또는 조작된 세포질체)는 이종 배양된 세포에서 건강 증진 인자를 상향 조절할 수 있고, 일부 경우에, 이종 배양된 세포는 이들이 취해진 대상체로 돌려 보내질 수 있다.
유핵 세포와는 달리, 세포질체는 DNA 손상으로 인한 아폽토시스 사멸을 겪을 수 없으므로, 암 및 다른 질환의 치료를 위해 아폽토시스 유도제 및/또는 DNA 독성/표적화제와 조합하여 사용될 수 있다.
세포질체는 그들의 유핵 대응물보다 더 작으며, 이러한 이유로 인해 혈관계 및 조직 실질 내의 작은 구멍을 통해 더 잘 이동할 수 있다. 또한, 고밀도 핵을 제거하면, 세포가 혈관 및 조직 실질 내의 작은 구멍을 통해 자유롭게 이동할 수 있게 하는 주요 물리적 장벽이 완화된다. 따라서, 세포질체는 신체에서의 생체 분포가 개선될 수 있고 표적 조직으로의 움직임이 개선될 수 있다.
유핵 세포와 달리, 유사하거나 또는 상이한 기원의 동일하거나 또는 또 다른 세포 유형과의 세포질체의 융합은, 세포 표면 단백질, 시그널 변환 분자, 분비된 단백질, 지질, 및 후생적 변화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 바람직한 치료적 속성을 유지하면서도, 문제가 있는 핵 이동이 없는 독특한 세포 혼성체를 생성한다.
치료용 세포로부터 유래된 엑소솜 및 소형 세포성 막 소포는 일부 경우에, 치료적 효능을 단독으로 또는 전달 용기로서 보유하는 것으로 제시된 바 있지만, 세포질체와 비교 시 현저하게 상이하고 제한될 수 있다. 유사하게, 적혈 세포 (RBC, 적혈구)가 약물 전달 시스템으로서 유용한 것으로 가정되었다. RBC도 역시 세포질체와 상이하며, 세포질체와 비교 시 한계가 있을 수 있다. 엑소솜 및 막 소포 및 RBC와는 달리, 세포질체는 많은 활성 생물학적 프로세스 및 모든 세포성 세포 소기관 (예를 들어, ER/골지, 미토콘드리아, 엔도솜, 리소솜, 세포 골격 등)을 보유할 수 있는 생육성 세포 유사 실체일 수 있다. 따라서, 세포질체는 유핵 세포처럼 기능할 수 있고 중요한 생물학적 기능, 예컨대 부착, 터널링 나노튜브 형성, 액틴-매개된 확산 (2D 및 3D), 이동, 화학유인물질 구배 감지, 미토콘드리아 전이, mRNA 번역, 단백질 합성, 및 엑소솜 및 다른 생물활성 분자의 분비를 나타낼 수 있다. 이들 기능 중 하나 이상이 엑소솜, 소형 세포성 막 소포, 또는 RBC에 의해 나타나지 않을 수 있다. 적혈모구로부터 유래되는 RBC와 비교해서, 세포질체는 iPSC (유도 만능 줄기 세포), 임의의 불멸화 세포, 줄기 세포, 1차 세포 (예를 들어, 숙주 유래 세포), 세포주, 임의의 면역 세포, 암성 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 유형의 유핵 세포로부터, 또는 임의의 진핵 세포로부터 유래될 수 있다.
임상적 사용을 위한 세포-기반 치료제의 개발에 대한 제한은 충분히 많은 양의 치료용 세포, 특히 줄기 세포를 생산할 수 없다는 것과 비효율성일 수 있다. 이러한 제조 "병목현상"을 완화시키기 위해, 불멸화 세포 (hTERT, 바이러스 및 종양 유전자)가 비용 면에서 효과적인 방식으로 세포 생산 능력을 증가시키는데 사용되는 것으로 고려되었다. 그러나, 불멸화 세포는 암을 유발할 위험이 높기 때문에, 생체내 치료적 목적으로는 너무 위험할 수 있으며, 현재 식품 의약국 (FDA)에 의해 승인되지 않았다. 중요하게도, 본 개시내용은 불멸화 세포, 암 세포 (예를 들어, 임의의 암 세포), 1차 (예를 들어, 숙주 유래) 세포, 또는 세포주를 치료용 세포의 대규모 생산을 위하여 사용할 수 있게 해주는데, 이는 이러한 세포가 전달되기 전에 제핵되어, 이들을 안전한 치료제로 만들어 주기 때문이다. 본 개시내용은 또한, 자가 또는 동종이계 요법에 사용하기 위한 대규모 제조 및 바이오 뱅킹을 위해 개별 대상체로부터 더 많은 세포, 세포주 및/또는 불멸화 세포를 생성할 수 있게 한다 (예를 들어, 도 1 참조). 이는 상용 제품으로서 제공될 수 있는 세포-기반 치료제의 일관성 및 품질 관리를 크게 향상시킬 수 있다.
더욱이, 세포질체는 인공 합성 나노입자 및 리포솜 제형과 비교해서 우수한 치료용 비히클일 수 있는데, 이는 이들이 세포로부터 유래 (예를 들어, 수득)되고, 따라서 완전히 기능하는 세포 실체 (핵 제외)이므로, 중대한 생리학적 기능, 세포성 속성/세포 소기관, 및 대상체 독성이 감소된 생물활성 분자를 생산할 수 있는 생리학적 능력을 나타낸다.
본원에 기재된 방법, 세포질체, 및 조성물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 유핵 세포 (예를 들어, 진핵 세포, 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 개 세포, 고양이 세포, 말 세포, 돼지 세포, 영장류 세포, 소 세포, 양 세포, 설치류 세포 (예를 들어, 마우스 세포, 기니아 피그 세포, 햄스터 세포, 또는 마우스 세포), 면역 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 유핵 세포)는 피질 액틴 세포 골격을 연화시키기 위해 시토칼라신 B로 처리된다. 이어서, 피콜의 구배에서 고속 원심분리에 의해 세포체로부터 핵을 물리적으로 추출하여, 핵이 없는 세포질체를 생성한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포질체" 또는 "재조합 세포질체"는 상호 교환 가능하게 사용되며, 세포의 내부 덩어리 및 세포 소기관으로 이루어지는 이전의 유핵 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포)로부터 수득된 핵이 없는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자, 나노입자, 또는 또 다른 치료제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비어 있는 세포질체 (예를 들어, 외인성 구성요소를 수반하지 않는 세포질체)가 음성 대조군으로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는, 예를 들어, 케모카인 수용체, 부착 분자, 항원, 또는 대상체 내의 부위로의 세포질체의 귀소를 개선시키거나 또는 원하는 면역 반응을 자극 및/또는 조정할 수 있는 다른 마커를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포질체는 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유핵 세포는 (예를 들어, 현탁액에서, 부착 세포로서, 3D의 부착 세포로서 (예를 들어, 반-현탁액 또는 다른 비-부착 방법에서)) 배양되거나 또는 제핵 전에 클론에 의해 선택/확장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 1시간 미만 내지 14일 (예를 들어, 1시간 미만 내지 1시간, 1시간 미만 내지 6시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 1일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 13일, 14일, 1 내지 14일, 1 내지 12일, 1 내지 10일, 1 내지 9일, 1 내지 8일, 1 내지 7일, 1 내지 6일, 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 14일, 2 내지 12일, 2 내지 10일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 14일, 3 내지 12일, 3 내지 10일, 3 내지 8일, 3 내지 7일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 4 내지 14일, 4 내지 12일, 4 내지 10일, 4 내지 8일, 4 내지 7일, 4 내지 6일, 4 내지 5일, 4 내지 7일, 5 내지 14일, 5 내지 12일, 5 내지 10일, 5 내지 8일, 5 내지 7일, 5 내지 6일, 6 내지 14일, 6 내지 12일, 6 내지 10일, 6 내지 8일, 6 내지 7일, 7 내지 14일, 7 내지 12일, 7 내지 10일, 7 내지 8일, 8 내지 14일, 8 내지 12일, 8 내지 10일, 10 내지 14일, 10 내지 12일, 12 내지 14일, 14일 미만, 12일 미만, 10일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 1일 미만, 12시간 미만, 또는 6시간 미만)의 규정된 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포질체 집단의 수명은 세포질체 집단의 일부분 (예를 들어, 이러한 집단의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%)이 사멸할 것으로 결정되는 평균 시간을 결정함으로써 평가될 수 있다. 세포 사멸은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 하나 이상의 시점에서 세포질체의 생육력은 형태학적 또는 기능적 파라미터가 무손상인지의 여부를 결정함으로써 (예를 들어, 트리판-블루 염료 배제에 의하거나, 무손상 세포막을 평가하거나, 플라스틱에 대한 부착을 평가하거나 (예를 들어, 부착 세포질체에서), 세포질체 이동을 평가하거나, 아폽토시스 마커로의 음성 염색 등) 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체의 수명은 이것이 수득된 세포의 수명과 관련될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대식세포로부터 수득된 세포질체는 12 내지 24시간 생존할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 자연적으로 발생하는 제핵 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 자연적으로 제핵을 겪는 세포로부터 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체의 체내에서 제핵시킨 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체의 체내에서 제핵될 것인 세포로부터 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 적혈모구로부터 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 (예를 들어, 조작, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 제핵의 부재 하에) 그의 수명 동안 핵을 유지하는 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체에서 무핵 세포 (예를 들어, 적혈 세포 (적혈구), 혈소판, 수정체 세포 또는 그의 즉시 유핵 전구체)로서 발견되는 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 소포체, 골지 장치, 미토콘드리아, 리보솜, 프로테아솜 또는 스플라이세오솜으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 하기 특색 중 하나 이상을 특징으로 한다: 부착, 터널링 나노튜브 형성, 액틴-매개된 확산 (2D 및/또는 3D), 이동, 화학유인물질 구배 감지, 미토콘드리아 전이, mRNA 번역, 단백질 합성, 및 엑소솜 및/또는 다른 생물활성 분자의 분비. 일부 실시양태에서, 세포질체는 단백질을 분비할 수 있는 능력 (예를 들어, 엑소솜을 사용함)을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 생체외에서 제핵되었다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 시험관내에서 제핵되었다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 물리적으로 (예를 들어, 원심분리에 의해) 제핵되었다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 조작된 제핵 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 적혈 세포가 아니다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 헤모글로빈을 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 양면-오목 형상을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 적혈모구로부터 수득되지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 적혈 세포 (적혈구)가 되지 않을 것인 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 림프계 전구 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 림프구로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 중간엽 줄기 세포 (예를 들어, 골수 유래)로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 내피 줄기 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 신경 줄기 세포로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 피부 줄기 세포로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 직경이 적어도 1 μm이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 직경이 1 μm 초과이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 직경이 1-100 μm (예를 들어, 1-90 μm, 1-80 μm, 1-70 μm, 1-60 μm, 1-50 μm, 1-40 μm, 1-30 μm, 1-20 μm, 1-10 μm, 1-5 μm, 5-90 μm, 5-80 μm, 5-70 μm, 5-60 μm, 5-50 μm, 5-40 μm, 5-30 μm, 5-20 μm, 5-10 μm, 10-90 μm, 10-80 μm, 10-70 μm, 10-60 μm, 10-50 μm, 10-40 μm, 10-30 μm, 10-20 μm, 10-15 μm, 15-90 μm, 15-80 μm, 15-70 μm, 15-60 μm, 15-50 μm, 15-40 μm, 15-30 μm, 15-20 μm)이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 직경이 10-30 μm이다. 일부 실시양태에서, 세포질체의 직경은 5-25 μm (예를 들어, 5-20 μm, 5-15 μm, 5-10 μm, 10-25 μm, 10-20 μm, 10-15 μm, 15-25 μm, 15-20 μm, 또는 20-25 μm)이다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 엑소솜이 아니다. 임의의 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 일부 경우에, 일부 세포질체는 유리하게는, 더 나은 생체 분포를 허용하거나 또는 대상체의 폐에 갇힐 가능성이 적을 정도로 충분히 작을 수 있는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "진핵 세포"는 별개의 막 결합된 핵을 갖는 세포를 지칭한다. 이러한 세포는, 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 설치류, 비-인간 영장류 또는 인간), 비-포유동물 (예를 들어, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류), 무척추 동물, 곤충, 진균 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 고등 진핵 생물, 예컨대 포유동물, 조류, 식물 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 1차 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 면역 세포 (예를 들어, 림프구 (예를 들어, T 세포, B 세포), 대식세포, 자연 킬러 세포, 호중구, 비만 세포, 호염기구, 수지상 세포, 단핵구, 골수-유래 억제 세포, 호산구)이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 포식 세포 또는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 성체 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 장 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 후각 성체 줄기 세포, 신경 능선 줄기 세포, 고환 세포), 배아 줄기 세포, 유도성 만능 줄기 세포 (iPS))이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 세포주로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 현탁 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 부착 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 종양 유전자의 발현에 의해 불멸화된 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT) 또는 임의의 종양 유전자의 발현에 의해 불멸화된다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 환자 또는 대상체 유래 세포 (예를 들어, 자가 환자-유래 세포 또는 동종이계 환자-유래 세포)이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포가 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지된 제핵 기술 중 임의의 것을 사용하여 제핵되기 전에, 유핵 세포는 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터), 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 수포 바이러스 벡터 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 벡터), 또는 하이브리드 바이러스 벡터), 플라스미드)로 형질감염된다.
세포 (예를 들어, 본원에 기재된 세포 중 임의의 것)를 배양하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 세포는 3차원 배양; 저산소 환경; 규정된 세포외 매트릭스 구성요소 상에서의 배양; 화학적 작용제, 시토카인, 성장 인자로의 처리; 또는 특이적 바람직한 세포 반응을 유도하는 자연 또는 합성의 임의의 외인성 작용제에 대한 노출을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 치료적 능력/이익을 갖는 특이적 생물학적 기능의 성장, 증식, 생육력, 분화 및/또는 유도를 선호하는 조건 하에 시험관내에서 유지될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미 사용되고 있거나 또는 개발 중인 세포 요법은 세포질체를 형성하기 위해 제핵될 수 있다 (예를 들어, 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 사용함). 이미 사용되고 있거나 또는 개발 중인 세포 요법의 비제한적 예는 키메라 항원 수용체 조작된 T 세포 (CAR-T), NK 또는 대식세포를 사용한 암의 치료; 암, 자가면역 (크론병, 류마티스 관절염, 모든 유형의 관절염 등), 췌장염을 포함한 염증성 질환의 치료; 재생 의학 적용, 상처 치유, 골 또는 연골 복구 등; 인지 질환, 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 치료; 이식편 대 숙주 질환의 치료; 유전자 요법 (예를 들어, 겸상 적혈구 빈혈, 중증 복합 면역 결핍증 (ADA-SCID / X-SCID), 낭포성 섬유증, 혈우병, 뒤시엔느 근이영양증, 헌팅톤병, 파킨슨병, 고콜레스테롤혈증, 알파-1 항트립신, 만성 육아종성 질환, 판코니 빈혈, 또는 고셰병의 경우); 및 감염성 질환, 예컨대, 예를 들어, HIV, 간염, 말라리아 등의 치료를 포함한다.
임의의 특별한 이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 예를 들어, 세포질체는 대상체의 미세 환경에 의해 영향을 덜 받기 때문에, 이미 사용되고 있거나 또는 개발 중인 세포 요법의 제핵이 세포 요법의 안전성 프로파일 및/또는 치료적 이익에 긍정적인 영향을 줄 수 있는 것으로 여겨진다. 추가로, 일부 실시양태에서, 이러한 세포질체는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이러한 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 유전자-편집 인자, 나노입자, 또는 또 다른 치료제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포질체는, 예를 들어, 케모카인 수용체, 부착 분자, 항원, 또는 대상체 내의 부위로의 세포질체의 귀소를 개선시키거나 또는 원하는 면역 반응을 자극 및/또는 조정할 수 있는 다른 마커를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 세포질체는 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 세포질체는 나중에 사용하기 위해 냉각 또는 동결된다. 세포를 보존하는 다양한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 초저온 하에서의 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청) 및 디메틸 술폭시드 (DMSO)의 사용 (동결 동결보존) 또는 4℃ 하에 저장하기 위한 동면 배지의 사용 (동결동면)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 세포질체는 사용 전에 해동된다.
생체분자 (예를 들어, RNA 분자 (예를 들어, mRNA, miRNA, siRNA, shRNA, lncRNA), DNA 분자 (예를 들어, 플라스미드), 단백질, 유전자-편집 인자 (예를 들어, CRISPR/Cas9 유전자-편집 인자), 펩티드, 플라스미드)를 세포질체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포로부터 유래된 세포질체) 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 생체분자를 세포질체 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 방법의 비제한적 예는 전기천공, 미세주사, 리포펙션, 형질감염, 인산 칼슘 형질감염, 덴드리머-기반 형질감염, 양이온성 중합체 형질감염, 세포 스퀴징, 초음파천공, 광학 형질감염, 임페일펙션, 유체역학적 전달, 마그네토펙션, 및 나노입자 형질감염을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 도입하는 것은 세포질체에서 생체분자를 발현시키는 것을 추가로 포함한다. 다양한 발현 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에 사용될 수 있다. 발현 벡터의 비제한적 예가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 도 16A, 도 17A, 도 18A 또는 도 23 중 어느 하나에 제시된 벡터이다. 다양한 유전자-편집 인자가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 유전자-편집 인자의 비제한적 예는 CRISPR/Cas9 유전자-편집, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 징크 핑거 뉴클레아제를 포함한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 치료제, 바이러스, 항체, 약물, 또는 나노입자가 세포질체 내로 도입된다. 일부 실시양태에서, 치료용 DNA, 치료용 RNA, 치료용 단백질 (예를 들어, 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 치료용 단백질), 치료용 펩티드 (예를 들어, 펩티드 호르몬 또는 항원, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 치료용 펩티드), 소분자 치료제 (예를 들어, 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 진통제, 항응고제, 항우울제, 항암 약물, 항간질제, 항정신병제, 진정제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 엠탄신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 소분자 치료제), 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자, 또는 또 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)가 세포질체 내로 도입된다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 엑소솜으로 처리 (예를 들어, 자극 또는 로딩)될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑소솜으로의 처리는 생체분자, 치료제, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 치료용 나노입자, 또는 또 다른 치료제 (예를 들어, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스 (예를 들어, 종양용해성 바이러스), 엑소솜, 지질, 또는 이온)를 세포질체 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑소솜으로의 처리는 세포질체의 행위, 시그널링, 분비된 인자 또는 다른 특징을 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체에서 질환 (예를 들어, 암/신생물, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환 (예를 들어, 신경변성 질환), 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 장애, 발달 장애, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 특발성 병태, 또는 그 중 둘 이상)을 치료하기 위해 세포질체를 사용하는 것을 포함한다.
암의 비제한적 예는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 청소년 암, 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 기형양/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 원인불명 원발성 암종, 심장 종양, 자궁경부암, 소아기 암, 척삭종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 담관암, 관 상피내 암종, 배아성 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 육종, 두개외 배세포 종양, 고환외 배세포 종양, 간외 담관암, 안암, 난관암, 골의 섬유성 조직구종, 담낭암, 위암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 간질성 종양 (GIST), 배세포 종양, 임신성 영양막 질환, 신경교종, 교모세포종, 모발상 세포 종양, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포성 암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 도세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 구순 및 구강 암, 간암, 폐암, 림프종, 마크로글로불린혈증, 골의 악성 섬유성 조직구종, 골암종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 중추도 암종, 구강암, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 골수 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 골수증식성 신생물, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강암, 구강 암, 구순암, 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 뇌하수체암, 형질 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방 암, 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 신장 세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연부 조직 육종, 고형암, 편평 세포 암종, 편평 경부암, 위암, T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 원인불명 원발성 암종, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암 및 윌름스 종양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 원발성 (예를 들어, 원발성 종양) 또는 전이성 (예를 들어, 전이성 종양)일 수 있다.
감염의 비제한적 유형은 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염 및 원생동물 감염을 포함한다. 감염의 비제한적 예는 아시네토박터(Acinetobacter) 감염, 방선균증, 아프리카 수면병 (아프리카 트리파노소마증), AIDS (후천성 면역 결핍 증후군), 아메바증, 아나플라즈마증, 광동주혈선충증, 아니사키스증, 탄저병, 아르카노박테륨 헤모리티쿰(Arcanobacterium haemolyticum) 감염, 아르헨티나 출혈열, 회충증, 아스페르길루스증, 아스트로바이러스 감염, 바베스열원충증, 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 감염, 박테리아성 폐렴, 박테리아성 질염, 박테로이데스(Bacteroides) 감염, 대장섬모충증, 바르토넬라증, 바일리사스카리스(Baylisascaris) 감염, BK 바이러스 감염, 흑색털결절진균증, 블라스토시스티스증, 블라스토마이세스증, 볼리비아 출혈열, 보툴리누스 중독 (및 영아 보툴리누스 중독), 브라질 출혈열, 브루셀라증, 림프절형 페스트, 부르크홀데리아(Burkholderia) 감염, 부룰리 궤양, 칼리시바이러스 감염 (노보바이러스 및 사포바이러스), 캄필로박터증, 칸디다증 (모닐리아증; 아구창), 모세선충증, 카리온병, 고양이 할큄병, 세포염, 샤가스병 (아메리칸 트리파노소마증), 무른 궤양, 수두, 치쿤구니아, 클라미디아, 클라미도필라 뉴모니아에(Chlamydophila pneumoniae) 감염 (대만 급성 호흡기 인자 또는 TWAR), 콜레라, 색소모세포진균증, 키트리디오마이코시스(Chytridiomycosis), 간흡충증, 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 결장염, 콕시디오이데스 진균증, 콜로라도 진드기열 (CTF), 감기 (급성 바이러스성 비인두염; 급성 코감기), 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 크림-콩고 출혈열 (CCHF), 크립토코쿠스증, 크립토스포리디오시스증, 피부 유충 편두통 (CLM), 원포자충증, 낭충증, 시토메갈로바이러스 감염, 뎅기열, 데스모데스무스 감염, 디엔타모에바증, 디프테리아, 열두조충증, 매디나충증, 에볼라 출혈열, 포충증, 에를리키아증, 요충증 (요충 감염), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 감염, 엔테로바이러스 감염, 발진 티푸스, 감염 홍반 (제5병), 돌발성 발진 (제6병), 간질증, 비대흡충증, 치명적 가족성 불면증 (FFI), 필라리아병, 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens)에 의한 식중독, 자유 서식 아메바 감염, 푸소박테륨(Fusobacterium) 감염, 가스 괴저 (클로스트리디움성 근괴사), 지오트리쿰증, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 증후군 (GSS), 편모충증, 마비저, 악구충증, 임질, 서혜부 육아종 (도너반증), 군 A 스트렙토코쿠스 감염, 군 B 스트렙토코쿠스 감염, 헤모필루스(Haemophilus) 감염, 수족구병 (HFMD), 한타바이러스 폐 증후군 (HPS), 하트랜드 바이러스병, 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 감염, 용혈성-요독성 증후군 (HUS), 신장 증후군을 동반한 출혈열 (HFRS), A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 단순 포진, 히스토플라스마증, 십이지장충 감염, 인간 보카바이러스 감염, 인간 에윙기이(ewingii) 에를리키아증, 인간 과립구성 아나플라즈마증 (HGA), 인간 면역 결핍증 바이러스 (HIV) 감염, 인간 메타뉴모바이러스 감염, 인간 단핵구성 에를리키아증, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 감염, 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염, 왜소조충증, 엡스타인-바르 바이러스 감염성 단핵구증 (모노), 인플루엔자 (플루), 포자충증, 가와사키병, 각막염, 킨겔라 킨가에(Kingella kingae) 감염, 쿠루병, 라사열, 레지오넬라시스 (재향군인병), 레지오넬라시스 (폰티악열), 레슈마니아증, 나병, 렙토스피라병, 리스테리아증, 라임병 (라임 보렐리아증), 림프 사상충증 (상피병), 림프구성 맥락뇌막염, 말라리아, 마르부르크 출혈열 (MHF), 홍역, 중동 호흡기 증후군 (MERS), 멜리오이도시스 (휘트모어병), 수막염, 수막구균성 질환, 요코가와흡충증, 미포자충증, 전염 물렁종 (MC), 원숭이 두창, 유행성 이하선염, 발진열 (발진 티푸스), 미코플라스마 폐렴, 미코플라스마 제니탈리움 감염, 족균종 (명확성), 구데기증, 신생아 결막염 (신생아 안염), 노로바이러스 (어린이 및 유아), (신종) 변이 크로이츠펠트-야콥병 (vCJD, nvCJD), 노카르디아증, 회선사상충증 (리버 블라인드니스), 간흡충증, 파라콕시디오이데스진균증 (남아메리카 분아균증), 폐흡충증, 파스투렐라병, 두슬증 (머릿니), 몸이 기생증 (몸이), 음모슬증 (치모슬, 사면발이), 골반내 염증 질환 (PID), 백일해 (백일 기침), 흑사병, 폐렴구균 감염, 뉴모시스티스 폐렴 (PCP), 폐렴, 회색질척수염, 프레보텔라(Prevotella) 감염, 원발성 아메바성 수막뇌염 (PAM), 진행 다초점 백색질뇌병증, 앵무새병, Q열, 광견병, 회귀열, 호흡기 합포체 바이러스 감염, 리노스포리디움증, 리노바이러스 감염, 리케치아 감염, 리케치아두창, 리프트 밸리열 (RVF), 로키산 홍반열 (RMSF), 로타바이러스 감염, 풍진, 살모넬라증, SARS (중증 급성 호흡기 증후군), 옴, 성홍열, 주혈흡충증, 패혈증, 시겔라증 (세균성 이질), 대상 포진, 천연두, 스포로트리쿰증, 포도상구균 식중독, 포도상구균 감염, 분선충증, 아급성 경화성 범뇌염, 매독, 조충증, 파상풍 (개구 장애), 백선성 모창 (이발소 양진), 두부 백선 (두피의 백선), 체부 백선 (몸의 백선), 완백선 (사타구니 가려움증), 손 백선 (손의 백선), 흑색 백선, 족부 백선 (무좀), 손발톱 백선 (손발톱진균증), 전풍 (어루러기), 톡소카라증 (유충 안구 이행증 (OLM)), 톡소카라증 (유충 장기 이행증 (VLM)), 톡소플라스마증, 트라코마, 선모충증, 트리코모나스증, 편충증 (편충 감염), 결핵, 야생토끼병, 장티푸스, 발진 티푸스, 우레아플라스마 우레아리티쿰(Ureaplasma urealyticum) 감염, 계곡열, 베네수엘라 말뇌염, 베네수엘라 출혈열, 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus) 감염, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 장염, 바이러스성 폐렴, 서부 나일강 열, 백색 사모 (백색 백선), 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis) 감염, 예르시니아증, 황열, 지카열, 및 접합균증을 포함한다.
신경계 질환의 비제한적 예는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머병, 안면 신경 마비, 뇌 동맥류, 뇌 손상, 뇌 종양, 뇌성 마비, 만성 피로 증후군, 뇌진탕, 치매, 간질, 길랑-바레 증후군, 두통, 헌팅톤병, 편두통, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경병증, 신경근육 및 관련 질환, 파킨슨병, 정신 병태 (예를 들어, 우울증, 강박 장애), 척추 측만증, 발작, 척수 손상, 척추 기형, 척추 장애 (예를 들어, 아급성 복합 변성), 척추 종양, 뇌졸증, 및 현기증을 포함한다.
자가면역 질환의 비제한적 예는 이완 불능증, 애디슨병, 성인 스틸병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군, 자가면역성 혈관부종, 자가면역성 자율신경이상증, 자가면역성 뇌척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 내이 질환 (AIED), 자가면역성 심근염, 자가면역성 난소염, 자가면역성 고환염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 망막증, 축삭 및 뉴런 신경병증 (AMAN), 발로병, 베체트병, 양성 점막 유천포창, 수포성 유천포창, 캐슬만병 (CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염 (CRMO), 처크-스트라우스 증후군 (CSS) 또는 호산구성 육아종증 (EGPA), 흉터 유사천포창, 코간 증후군, 저온 응집병, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병 (시각 신경척수염), 당뇨병 (예를 들어, 유형 I 당뇨병, 유형 II 당뇨병, 임신성 당뇨병), 원반상 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염 (EoE), 호산구성 근막염, 결절성 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염 (관자 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스처 증후군, 다발성 혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스병, 길랑 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쉔라인 자반증 (HSP), 임신성 포진 또는 임신성 유사천포창 (PG), 화농성 한선염 (HS) (역성 여드름), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병증, IgG4-관련 경화성 질환, 면역성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 봉입체 근염 (IBM), 간질성 방광염 (IC), 유년기 관절염, 유년기 당뇨병 (유형 1 당뇨병), 유년기 근염 (JM), 가와사키병, 람버트 이튼 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환 (LAD), 루푸스, 만성 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발성 혈관염 (MPA), 혼합 결합 조직병 (MCTD), 무렌 궤양, 무하 하버만병, 다초점성 운동 신경병증 (MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시각 신경척수염, 호중구 감소증, 눈에 의한 반흔성 유천포창, 시신경염, 재발성 류마티즘 (PR), PANDAS, 부신생물 소뇌 변성 (PCD), 발작성 야간 헤모글로빈뇨 (PNH), 패리 롬버그 증후군, 평면부염 (말초 포도막염), 파르소니지-터너 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈 (PA), POEMS 증후군, 결절성 다발성 동맥염, 다선성 증후군 유형 I, II, III, 류마티스성 다발성 근통, 다발성 근염, 심근경색 후 증후군, 심막절개술 후 증후군, 원발성 담즙 간경변, 원발성 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 진성 적혈구계 빈혈 (PRCA), 괴저 농피종, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사성 교감신경성 이영양증, 재발성 다발성 연골염, 하지 불편 증후군 (RLS), 후복막 섬유증, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트 증후군, 공막염, 피부 경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 근육 강직 증후군 (SPS), 아급성 박테리아성 심내막염 (SBE), 수삭 증후군, 교감성 안염 (SO), 다카야수 동맥염, 관자 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성 자반증 (TTP), 톨로사-헌트 증후군 (THS), 횡단 척수염, 궤양성 결장염 (UC), 미분화 결합 조직 질환 (UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증, 보그트-고야나기-하라다병, 및 베게너 육아종증 (또는 다발성 혈관염을 동반한 육아종증 (GPA))을 포함한다.
심혈관 질환의 비제한적 예는 급성 심근경색, 심부전증, 난치성 협심증, 관상 동맥 질환, 류마티스성 심장 질환, 선천성 심장 질환, 뇌졸증, 대동맥류 및/또는 해부, 말초 동맥 질환, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심장의 종양, 뇌의 혈관 종양, 심근병증, 심장 판막 질환, 및 심낭 질환을 포함한다.
안과 질환의 비제한적 예는 녹내장, 백내장, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 사시, 망막 박리, 포도막염, 약시, 안구 건조증, 각막염, 황반 부종, 각막 궤양, 시신경병증, 시토메갈로바이러스 망막염, 각막 이영양증, 전방출혈, 트라코마, 중심 장액성 망막병증, 미숙아 망막병증, 안내염, 레베르 선천성 흑암시, 중심 망막 동맥 폐색, 첩모난생증, 유두부종, 그레이브스 안병증, 포도막 흑색종, 가지 망막 정맥 폐색, 맥락막결손증 및 황반병증을 포함한다.
골격 질환의 비제한적 예는 골연골이형성증, 연골무형성증, 저인산증, 연골무발생증, 치사성 이형성증, 골연화증, 구루병, 골감소증, 골다공증, 파제트병, 골수염, 골용해, 하주 체니 증후군, 비대성 폐성 골관절증, 비골화 섬유종, 가성 관절증, 섬유성 이형성증, 골과다증, 골경화증 및 농축이골증을 포함한다.
대사 질환의 비제한적 예는 시스틴뇨증, 파브리병, 갈락토스혈증, 고셰병 (유형 I), 하트넙병, 호모시스틴뇨증, 헌터 증후군, 헐러 증후군, 레쉬-니한 증후군, 메이플 시럽 소변 질환, 마로토-라미 증후군, 모르퀴오 증후군, 니만-픽병 (유형 A), 페닐케톤뇨증, 폼페병, 포르피린증, 샤이 증후군, 테이-삭스병, 티로신혈증 (간장신장), 폰 게르케병 (글리코겐 저장 결핍 유형 1A) 및 윌슨병을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체가 세포질체 치료를 필요로 하거나, 필요로 하는 것으로 결정되었거나, 또는 필요로 할 것으로 의심된다. 일부 실시양태에서, 암은, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 방광암, 유방암, 신장암, 흑색종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암 또는 전립선암일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 질환 또는 병태 (예를 들어, 암 또는 신생물, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환 (예를 들어, 신경변성 질환), 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 장애, 발달 장애, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 특발성 병태, 또는 그 중 둘 이상)의 진단을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 대상체의 특별한 건강, 질환 상태, 병태 또는 독소 수준을 나타낼 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 세포질체 중 임의의 것 (예를 들어, 조작되지 않은 세포질체, 또는 유전적으로 조작된 세포질체, 또는 바이오리포터 분자 또는 유도성 바이오리포터 분자가 외인성으로 로딩된 세포질체)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상체를 진단하거나, 또는 대상체에서 질환 또는 병태의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포질체 및/또는 세포질체에 의해 발현 또는 분비되거나 또는 세포질체 내에 함유된 분자가 바이오리포터로서 작동될 수 있다. 이러한 바이오리포터는 대상체에서 또는 생체외에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터 수득될 수 있다 (예를 들어, 혈액, 소변, 대변 또는 조직 (예를 들어, 생검)). 일부 실시양태에서, 세포질체는 측정가능한 임상 시그널을 보고하는, 예를 들어, 비색, 형광, 발광, 화학 발광 또는 전기 화학 분자를 발현하거나 또는 함유할 수 있다. 시그널은 화학 물질, 물리 작용제 또는 생체분자 (예를 들어, 성장 인자, 인슐린, 암 항원, 면역 인자)의 농도에 비례할 수 있거나, 또는 대상체에서의 또는 대상체로부터의 샘플에서의 유전자 전사 활성 또는 단백질 번역 활성에 비례할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 양서류, 어류, 파충류, 무척추 동물, 조류, 식물, 고세균, 진균 또는 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그), 개 (예를 들어, 개), 고양이 (예를 들어, 고양이), 말 (예를 들어, 말), 양, 소, 돼지, 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이 (예를 들어, 원숭이), 유인원 (예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔 원숭이) 또는 인간일 수 있다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 대상체는 0세 내지 120세 (예를 들어, 생후 1개월 이내 (예를 들어, 신생아), 1개월생 내지 2세 (예를 들어, 유아), 2세 내지 12세 (예를 들어, 어린이), 12세 내지 16세 (예를 들어, 청소년), 1 내지 120세, 1 내지 115세, 1 내지 110세, 1 내지 105세, 1 내지 100세, 1 내지 95세, 1 내지 90세, 1 내지 85세, 1 내지 80세, 1 내지 75세, 1 내지 70세, 1 내지 65세, 1 내지 60세, 1 내지 50세, 1 내지 40세, 1 내지 30세, 1 내지 25세, 1 내지 20세, 1 내지 15세, 1 내지 10세, 5 내지 120세, 5 내지 110세, 5 내지 100세, 5 내지 90세, 5 내지 60세, 5 내지 50세, 5 내지 40세, 5 내지 30세, 5 내지 20세, 5 내지 10세, 10 내지 120세, 10 내지 110세, 10 내지 100세, 10 내지 90세, 10 내지 80세, 10 내지 60세, 10 내지 50세, 10 내지 40세, 10 내지 30세, 10 내지 20세, 20 내지 120세, 20 내지 110세, 20 내지 100세, 20 내지 90세, 20 내지 70세, 20 내지 60세, 20 내지 50세, 20 내지 40세, 20 내지 30세, 30 내지 120세, 30 내지 110세, 30 내지 100세, 30 내지 90세, 30 내지 70세, 30 내지 60세, 30 내지 50세, 40 내지 120세, 40 내지 110세, 40 내지 100세, 40 내지 90세, 40 내지 80세, 40 내지 60세, 40 내지 50세, 50 내지 120세, 50 내지 110세, 50 내지 100세, 50 내지 90세, 50 내지 80세, 50 내지 70세, 50 내지 60세, 60 내지 120세, 60 내지 110세, 60 내지 100세, 60 내지 90세, 60 내지 80세, 60 내지 70세, 70 내지 120세, 70 내지 110세, 70 내지 100세, 70 내지 90세, 70 내지 80세, 80 내지 120세, 80 내지 110세, 80 내지 100세, 80 내지 90세, 90 내지 120세, 90 내지 110세, 90 내지 100세, 100 내지 120세, 또는 110 내지 120세)이다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어, 자궁 내에서 아직 태어나지 않았다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 1개월생 (예를 들어, 적어도 2세, 적어도 12세, 적어도 16세, 또는 적어도 18세)이다. 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 대상체, 예를 들어, 이환된 대상체 (즉, 예를 들어, 질환이 있는 것으로 진단된, 질환이 있는 대상체) 또는 무증상 대상체 (즉, 임상적으로 건강한 것으로서 제시되거나 또는 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체)를 치료할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 치료하는 것은 질환의 위험이 있는 대상체에서 질환의 징후 또는 증상의 발생을 감소시키거나 또는 예방 (또는 위험을 감소)하는 것을 의미하는 "예방적 치료"; 및 질환의 징후 또는 증상을 감소시키거나, 질환의 진행을 감소시키거나, 질환의 중증도를 감소시키거나, 질환이 있는 것으로 진단된 대상체에서 재발을 감소시키는 것을 의미하는 "치유적 치료"를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하다"는 질환의 적어도 하나의 임상 파라미터를 완화시키고/거나 이익 (예를 들어, 항노화, 흉터 방지, 상처 치유, 항우울, 항염증, 체중 감소)을 제공하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "질환", "장애" 및 "병태"는 대상체에서의 비정상 또는 대상체에서 건강한 상태로부터의 임의의 일탈을 지칭한다. 질환 및/또는 병태의 비제한적 예는 암 또는 신생물, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환 (예를 들어, 신경변성 질환), 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 장애, 발달 장애, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 또는 특발성 병태를 포함한다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 조성물은 일정 기간 동안 (예를 들어, 매일, 2일마다, 1주에 2회, 1주에 1회, 매주, 1개월에 3회, 1개월에 2회, 1개월에 1회, 2개월 마다, 3개월 마다, 4개월 마다, 5개월 마다, 6개월 마다, 7개월 마다, 8개월 마다, 9개월 마다, 10개월 마다, 11개월 마다, 1년에 1회) 적어도 1회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100회) 투여된다. 또한, 월간 치료, 예를 들어, 적어도 1개월 (예를 들어, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월 또는 그 초과, 예를 들어, 12개월 또는 그 초과) 동안 매달 적어도 1회 투여하는 것, 및 연간 치료 (예를 들어, 1년 이상 동안 매년 1회 투여하는 것)이 고려된다. 투여는 관련 기술분에 공지된 임의의 경로, 예를 들어, 피하, 정맥내, 동맥, 안구, 경구, 근육내, 비강내 (예를 들어, 흡입), 복강내, 국소, 점막, 경막외, 설하, 상피, 양막외, 관절간, 피내, 골내, 척수강내, 자궁내, 질내, 소포내, 유리체내, 혈관주위 및/또는 직장 투여, 또는 공지된 투여 방법의 임의의 조합을 통해서 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체의 사멸 프로세스는 대상체에 대한 치료적 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체의 사멸 프로세스는 면역 자극성일 수 있다. 따라서, 대상체에게 세포질체를 투여하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 세포질체의 사멸은 대상체에 대한 치료적 효과를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 세포질체는 죽은 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여된 세포질체는 투여될 때, 5일 미만 (예를 들어, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 36시간 미만, 1일 미만, 18시간 미만, 12시간 미만, 6시간 미만, 2시간 미만, 또는 1시간 미만)의 잔여 수명을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 제거된 다음, 제핵될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 제핵되기 전에 (예를 들어, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 치료용 나노입자 및/또는 또 다른 치료제를 생산하거나 또는 함유하도록) 조작된다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 세포는 제핵된 다음, (예를 들어, 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 치료용 나노입자 및/또는 또 다른 치료제를 생산하거나 또는 함유하도록) 조작된다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 (조작되었는지의 여부에 상관 없이) 그 세포가 제거된 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 세포질체가 배양 및/또는 저장되는 배지 ("조건화 배지")는 치료적 이익을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포질체가 세포와 공동 배양되고/거나 공동 저장되는 (예를 들어, 제핵 후) 배지 ("조건화 배지")는 치료적 이익을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포와 융합된 세포질체가 세포와 함께 배양되고/거나 저장되는 배지 ("조건화 배지")는 치료적 이익을 가질 수 있다.
따라서, 대상체에게 조건화 배지를 투여하는 것을 포함하는, 대상체를 치료하거나, 예방하거나 또는 예방적으로 치료하거나, 또는 대상체에서의 건강을 증진시키는 방법이 본원에 제공된다. 임의의 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 일부 실시양태에서, 배양된 배지의 치료적 이익은 세포질체에 의해 분비된 엑소솜 배지 (예를 들어, 치료용 단백질 함유)에서의 존재에 기인할 수 있는 것으로 여겨진다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가적 요법 (예를 들어, 임의의 약물 (예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항염증제) 또는 화학요법 (예를 들어, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 시클로포스파미드) 또는 본원에 기재된 소분자 치료제 중 임의의 것), 세포-기반 요법, 방사선 요법, 면역요법, 소분자, 억제성 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, miRNA, siRNA, lncRNA), 엑소솜-기반 요법, 유전자 요법 또는 수술)과 함께 투여된다.
본원에 제공된 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가적 요법 (예를 들어, 임의의 약물 (예를 들어, 항생제, 항바이러스제) 또는 화학요법 (예를 들어, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 시클로포스파미드)), 세포-기반 요법, 방사선 요법, 면역요법, 소분자, 억제성 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, miRNA, siRNA, lncRNA) 또는 수술)을 추가로 포함한다.
또한, 세포질체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포로부터 수득된 세포질체)를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상이한 투여 경로 (예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 안와후방, 복강내)를 위해 제형화된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체 (예를 들어, 인산염 완충 식염수)를 포함할 수 있다.
치료용 세포의 전신 투여의 경우, 이환된 조직으로의 성공적인 귀소에 대한 2가지 주요 문제가 있다. 첫째, 대부분의 세포는 폐 또는 다른 조직 내의 소형 모세관에 갇혀, 폐 색전증과 같은 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 세포질체는 일부 실시양태에서, 그의 모 세포보다 훨씬 더 작고 (예를 들어, 모 세포의 직경의 약 60% 및 용적의 1/8), 강성 핵을 갖지 않기 때문에, 세포질체는 그의 모 세포보다 작은 모세관 및 혈관을 통해 더 잘 통과할 수 있다. 둘째, 이환된 조직으로의 세포의 특이적 귀소는 케모카인 수용체 시그널링, 예컨대 SDF-1α/CXCR4, CCL2/CCR2, 및 부착 분자, 예컨대 PSGL-1에 의존할 수 있다. 본원에 제시된 바와 같이, 세포질체는 기능적 CXCR4, CCR2 뿐만 아니라 글리코실화된 PSGL-1을 특이적으로 발현하도록 조작될 수 있으며, 이는 조작된 세포질체의 특이적 귀소를 크게 증진시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 세포질체의 세포 표면 상에 발현되는 표적화 모이어티, 예를 들어, CXCR4, CCR2 또는 PSGL-1을 (예를 들어, 조작에 의해 또는 이들이 수득된 세포로부터) 추가로 포함할 수 있다. 세포질체의 세포 표면 상에 발현될 수 있는 세포 표면 단백질의 비제한적 예는 케모카인, 예컨대 CXCR4, CCR2, CCR1, CCR5, CXCR7, CXCR2 및 CXCR1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 세포질체에 의해 분비되거나 또는 세포외 매트릭스, 예를 들어, SDF1α 또는 CCL2에 테더링되어 있는 세포 표적화 모이어티를 (예를 들어, 조작에 의해 또는 이들이 수득된 세포로부터) 추가로 포함할 수 있다. 세포 귀소를 위해 세포질체에 의해 분비될 수 있는 단백질의 비제한적 예는 SDF1α, CCL2, CCL3, CCL5, CCL8, CCL1, CXCL9, CXCL10, CCL11 및 CXCL12를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질체는 대상체 면역 시스템의 회피를 돕는 표면 마커를 (예를 들어, 조작에 의해 또는 이들이 수득된 세포로부터) 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포질체는 CD47 마커를 포함할 수 있다. 임의의 특별한 이론에 얽매이는 것은 아니지만, CD47 마커는 세포질체가 대식세포에 의해 포식되는 것을 방지하는데 도움을 주는 것으로 여겨진다. 세포-매트릭스 수용체 및 세포-세포 부착 분자의 비제한적 예는 인테그린, 카드헤린, 당단백질 및 헤파린 술페이트 프로테오글리칸을 포함한다. 치료용 분자의 비제한적 예는 종양 항원 및 면역조정 펩티드, 폴리아민 및 ATP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포질체는 약 1일 내지 약 7일 (예를 들어, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 7일, 약 2일 내지 약 6일, 약 2일 내지 약 5일, 약 2일 내지 약 4일, 약 2일 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 7일, 약 3일 내지 약 6일, 약 3일 내지 약 5일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 7일, 약 4일 내지 약 6일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 7일, 약 5일 내지 약 6일, 또는 약 6일 내지 약 7일) 동안 약 -80℃ 내지 약 16℃ (예를 들어, 약 -80℃ 내지 약 12℃, -80℃ 내지 약 10℃, 약 -80℃ 내지 약 8℃, 약 -80℃ 내지 약 6℃, 약 -80℃ 내지 약 4℃, 약 -80℃ 내지 약 2℃, 약 -80℃ 내지 약 0℃, 약 -80℃ 내지 약 -4℃, 약 -80℃ 내지 약 -10℃, 약 -80℃ 내지 약 -16℃, 약 -80℃ 내지 약 -20℃, 약 -80℃ 내지 약 -25℃, 약 -80℃ 내지 약 -30℃, 약 -80℃ 내지 약 -35℃, 약 -80℃ 내지 약 -40℃, 약 -80℃ 내지 약 -45℃, 약 -80℃ 내지 약 -50℃, 약 -80℃ 내지 약 -55℃, 약 -80℃ 내지 약 -60℃, 약 -80℃ 내지 약 -65℃, 약 -80℃ 내지 약 -70℃, 약 -60℃ 내지 약 16℃, 약 -60℃ 내지 약 12℃, 약 -60℃ 내지 약 10℃, 약 -60℃ 내지 약 8℃, 약 -60℃ 내지 약 6℃, 약 -60℃ 내지 약 4℃, 약 -60℃ 내지 약 2℃, 약 -60℃ 내지 약 0℃, 약 -60℃ 내지 약 -4℃, 약 -60℃ 내지 약 -10℃, 약 -60℃ 내지 약 -10℃, 약 -60℃ 내지 약 -16℃, 약 -60℃ 내지 약 -20℃, 약 -60℃ 내지 약 -25℃, 약 -60℃ 내지 약 -30℃, 약 -60℃ 내지 약 -35℃, 약 -60℃ 내지 약 -40℃, 약 -60℃ 내지 약 -50℃, 약 -50℃ 내지 약 16℃, 약 -50℃ 내지 약 12℃, 약 -50℃ 내지 약 10℃, 약 -50℃ 내지 약 8℃, 약 -50℃ 내지 약 6℃, 약 -50℃ 내지 약 4℃, 약 -50℃ 내지 약 2℃, 약 -50℃ 내지 약 0℃, 약 -50℃ 내지 약 -4℃, 약 -50℃ 내지 약 -10℃, 약 -50℃ 내지 약 -16℃, 약 -50℃ 내지 약 -20℃, 약 -50℃ 내지 약 -30℃, 약 -50℃ 내지 약 -40℃, 약 -20℃ 내지 약 16℃, 약 -20℃ 내지 약 12℃, 약 -20℃ 내지 약 10℃, 약 -20℃ 내지 약 8℃, 약 -20℃ 내지 약 6℃, 약 -20℃ 내지 약 4℃, 약 -20℃ 내지 약 2℃, 약 -20℃ 내지 약 0℃, 약 -20℃ 내지 약 -4℃, 약 -20℃ 내지 약 -10℃, 약 -20℃ 내지 약 -15℃, 약 -10℃ 내지 약 16℃, 약 -10℃ 내지 약 12℃, 약 -10℃ 내지 약 10℃, 약 -10℃ 내지 약 8℃, 약 -10℃ 내지 약 6℃, 약 -10℃ 내지 약 4℃, 약 -10℃ 내지 약 2℃, 약 -10℃ 내지 약 0℃, 약 -10℃ 내지 약 -4℃, 약 -10℃ 내지 약 -6℃, 약 -4℃ 내지 약 16℃, 약 -4℃ 내지 약 10℃, 약 -4℃ 내지 약 6℃, 약 -4℃ 내지 약 4℃, 약 -4℃ 내지 약 2℃, 약 -4℃ 내지 약 0℃, 약 -2℃ 내지 약 16℃, 약 -2℃ 내지 약 12℃, 약 -2℃ 내지 약 10℃, 약 -2℃ 내지 약 6℃, 약 -2℃ 내지 약 4℃, 약 -2℃ 내지 약 2℃, 약 -2℃ 내지 약 0℃, 약 0℃ 내지 약 16℃, 약 0℃ 내지 약 14℃, 약 0℃ 내지 약 12℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 0℃ 내지 약 8℃, 약 0℃ 내지 약 6℃, 약 0℃ 내지 약 4℃, 약 2℃ 내지 약 16℃, 약 2℃ 내지 약 12℃, 약 2℃ 내지 약 10℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 2℃ 내지 약 6℃, 약 2℃ 내지 약 4℃, 약 4℃ 내지 약 16℃, 약 4℃ 내지 약 12℃, 약 4℃ 내지 약 10℃, 약 4℃ 내지 약 8℃, 약 4℃ 내지 약 6℃, 약 6℃ 내지 약 16℃, 약 6℃ 내지 약 12℃, 약 6℃ 내지 약 10℃, 약 6℃ 내지 약 8℃, 약 8℃ 내지 약 16℃, 약 8℃ 내지 약 12℃, 약 8℃ 내지 약 10℃, 약 10℃ 내지 약 16℃, 약 10℃ 내지 약 12℃, 또는 약 12℃ 내지 약 16℃) 온도 하에 저장될 수 있다.
또한, 본원에 기재된 임의의 조성물을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 조성물 또는 방법 중 임의의 것을 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 조성물 중 임의의 것의 적어도 하나의 용량을 포함할 수 있다.
수많은 실시양태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다.
예시적 실시양태:
실시양태 1은
치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및 치료용 유전자-편집 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 분자를 발현하거나 또는 함유하는 제1 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 것
을 포함하는 방법이다.
실시양태 2는 제1 세포질체가 포유동물 세포, 원생동물 세포, 해조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 무척추 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 또는 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포로부터 수득된 것인, 실시양태 1의 방법이다.
실시양태 3은 세포가 대상체로부터 수확된 세포이거나 또는 이러한 세포로부터 유래된 것인, 실시양태 2의 방법이다.
실시양태 4는 세포가 세포주, 불멸화 세포, 또는 암 세포이거나 또는 이러한 세포로부터 유래된 것인, 실시양태 2 내지 3 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 5는 제1 세포질체가 면역 세포로부터 수득된 것인, 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 6은 제1 세포질체가 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 대식세포, 호산구, 호염기구, 수지상 세포, 및 림프구로 이루어진 군으로부터 선택된 세포로부터 수득된 것인, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 7은 제1 세포질체가 조혈 줄기 세포, 유선 줄기 세포, 장 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 후각 성체 줄기 세포, 신경 능선 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 고환 세포, 배아 줄기 세포, 섬유모세포, 또는 유도성 만능 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포로부터 수득된 것인, 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 8은 제1 세포질체가 제2 세포질체에 융합되는 것인, 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 9는 제2 세포가 포유동물 세포, 원생동물 세포, 해조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 무척추 동물 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 파충류 세포, 또는 조류 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포로부터 수득된 것인, 실시양태 8의 방법이다.
실시양태 10은 치료용 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 또는 RNA 바이러스인, 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 11은 치료용 DNA 분자가 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자 또는 DNA 바이러스인, 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 12는 치료용 단백질이 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신인, 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 13은 세포질체가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자를 일시적으로 발현하는 것인, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 14는 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자의 발현이 유도성인, 실시양태 1 내지 12 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 15는 펩티드 치료제가 펩티드 호르몬 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 16은 소분자 치료제가 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 진통제, 항응고제, 항우울제, 항암 약물, 항간질제, 항정신병제, 진정제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 엠탄신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 소분자 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 17은 세포질체가 소분자 치료제 또는 치료용 나노입자를 함유하는 것인, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 18은 세포질체가 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 지질, 및 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 함유하는 것인, 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 19는 바이러스가 종양용해성 바이러스인, 실시양태 18의 방법이다.
실시양태 20은 소분자 치료제가 항암 약물, 항생제, 또는 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 1 내지 15 또는 17 내지 19 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 21은 대상체에게 하나 이상의 추가적 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 22는 하나 이상의 추가적 요법이 세포-기반 요법, 소분자, 면역요법, 화학요법, 방사선 요법, 유전자 요법, 및 수술로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 20의 방법이다.
실시양태 23은 제1 세포질체가 면역 시스템-회피 모이어티를 발현하는 것인, 실시양태 1 내지 21 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 24는 면역 시스템-회피 모이어티가 CD47인, 실시양태 23의 방법이다.
실시양태 25는 제1 세포질체 또는 이러한 제1 세포질체가 수득된 세포가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 비-펩티드 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자를 발현하도록 조작된 것인, 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 26은 제1 세포질체 또는 이러한 제1 세포질체가 수득된 세포가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 비-펩티드 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자 중 임의의 것을 발현하도록 조작되지 않은 것인, 실시양태 1 내지 24 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 27은 조성물이 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 28은 표적화 모이어티가 세포 표면 단백질인, 실시양태 27의 방법이다.
실시양태 29는 표적화 모이어티가 분비된 단백질, 또는 세포외 매트릭스에 테더링되어 있는 단백질인, 실시양태 27의 방법이다.
실시양태 30은 세포질체가 표적화 모이어티를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 31은 표적화 모이어티가 세포 표면 단백질인, 실시양태 30의 방법이다.
실시양태 32는 표적화 모이어티가 분비된 단백질, 또는 세포외 매트릭스에 테더링되어 있는 단백질인, 실시양태 30의 방법이다.
실시양태 33은 적어도 하나의 치료제를 포함하는 세포질체이다.
실시양태 34는 치료제가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 또는 치료용 유전자 편집 인자인, 실시양태 33의 세포질체이다.
실시양태 35는 치료용 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 또는 RNA 바이러스인, 실시양태 34의 세포질체이다.
실시양태 36은 치료용 DNA 분자가 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자 또는 DNA 바이러스인, 실시양태 34 내지 35 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 37은 치료용 단백질이 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신인, 실시양태 34 내지 36 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 38은 펩티드 치료제가 펩티드 호르몬 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 34 내지 37 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 39는 소분자 치료제가 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 진통제, 항응고제, 항우울제, 항암 약물, 항간질제, 항정신병제, 진정제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 엠탄신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 소분자 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 34 내지 38 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 40은 치료제가 나노입자, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 지질, 및 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 33 내지 38 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 41은 바이러스가 종양용해성 바이러스인, 실시양태 40의 세포질체이다.
실시양태 42는 소분자 치료제가 항암 약물, 항생제, 또는 항바이러스제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 33 내지 41 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 43은 세포질체가 면역 시스템-회피 모이어티를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 33 내지 43 중 어느 하나의 세포질체이다.
실시양태 44는 면역 시스템-회피 모이어티가 CD47인, 실시양태 43의 세포질체이다.
실시양태 45는
세포 내로 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자 편집 인자, 다른 치료제, 및/또는 치료용 나노입자를 도입하는 단계; 및
상기 세포를 제핵하는 단계
를 포함하는, 세포질체를 제조하는 방법이다.
실시양태 46은 도입 단계가 제핵 단계에 선행하는 것인, 실시양태 45의 방법이다.
실시양태 47은 도입 단계가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자의 영구적 발현을 초래하는 것인, 실시양태 46의 방법이다.
실시양태 48은 제핵 단계가 도입 단계에 선행하는 것인, 실시양태 45의 방법이다.
실시양태 49는 도입 단계가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 및/또는 치료용 유전자 편집 인자의 일시적 발현을 초래하는 것인, 실시양태 45, 46 또는 48 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 50은 치료용 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA, 긴 비-코딩 RNA (lncRNA) 또는 RNA 바이러스인, 실시양태 45 내지 49 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 51은 치료용 DNA 분자가 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자 또는 DNA 바이러스인, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 52는 치료용 단백질이 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신인, 실시양태 45 내지 51 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 53은 펩티드 치료제가 펩티드 호르몬 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 45 내지 52 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 54는 소분자 치료제가 스테로이드, 폴리케티드, 알칼로이드, 독소, 항생제, 항바이러스제, 진통제, 항응고제, 항우울제, 항암 약물, 항간질제, 항정신병제, 진정제, 콜키신, 탁솔, 미토마이신, 엠탄신, 또는 현재 이용가능하거나 또는 개발 중인 임의의 소분자 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 실시양태 45 내지 53 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 55는 세포질체가 치료용 나노입자를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 45 내지 54 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 56은 세포질체가 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 지질, 및 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된 치료제를 추가로 포함하는 것인, 실시양태 45 내지 54 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 57은 바이러스가 종양용해성 바이러스인, 실시양태 56의 방법이다.
실시양태 58은 도입하는 것이 형질감염시키는 것을 포함하는 것인, 실시양태 45 내지 57 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 59는 도입하는 것이 전기천공, 미세주사, 세포 스퀴징, 초음파천공, 임페일펙션, 또는 유체역학적 전달을 포함하는 것인, 실시양태 45 내지 58 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 60은
세포를 벡터로 형질감염시키는 단계; 및
상기 세포를 제핵하는 단계
를 포함하는, 세포질체를 제조하는 방법이다.
실시양태 61은 형질감염 단계가 제핵 단계에 선행하는 것인, 실시양태 60의 방법이다.
실시양태 62는 제핵하는 것이 벡터가 세포의 게놈 내로 통합된 후에 발생하는 것인, 실시양태 61의 방법이다.
실시양태 63은 제핵 단계가 형질감염 단계에 선행하는 것인, 실시양태 60의 방법이다.
실시양태 64는 벡터가 바이러스 벡터인, 실시양태 60 내지 63 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 65는 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 수포 바이러스 벡터, 또는 하이브리드 바이러스 벡터인, 실시양태 64의 방법이다.
실시양태 66은 벡터가 치료용 단백질의 코딩 서열을 포함하는 것인, 실시양태 60 내지 65 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 67은 치료용 단백질이 효소, 항체, 항원, 독소, 시토카인, 단백질 호르몬, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 또는 백신인, 실시양태 66의 방법이다.
실시양태 68은
세포를 제핵하는 단계
를 포함하는, 세포질체를 제조하는 방법이다.
실시양태 69는 세포가 적혈모구가 아닌 것인, 실시양태 68의 방법이다.
실시양태 70은 제핵하는 것이 원심분리를 포함하는 것인, 실시양태 68 또는 실시양태 69의 방법이다.
실시양태 71은
대상체에게 실시양태 33 내지 44 중 어느 하나의 세포질체의 치료상 유효량을 투여하는 단계
를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이다.
실시양태 72는
대상체에게 치료상 유효량의 세포질체를 투여하는 단계
를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이다.
실시양태 73은 세포질체가 적혈모구로부터 수득되지 않는 것인, 실시양태 72의 방법이다.
실시양태 74는
실시양태 45 내지 70 중 어느 하나의 방법에 의해 세포질체를 제조하는 단계; 및
상기 세포질체를 저장하는 단계
를 포함하는 방법이다.
실시양태 75는 저장하는 것이 동결보존을 포함하는 것인, 실시양태 74의 방법이다.
실시양태 76은 저장하는 것이 동결동면을 포함하는 것인, 실시양태 74의 방법이다.
실시양태 77은
세포를 배지에서 배양하는 단계;
상기 세포를 자극하는 단계; 및
상기 세포를 제핵하여 세포질체를 형성하는 단계
를 포함하는 방법이다.
실시양태 78은 배양하는 것이 3D 배양하는 것, 부착 배양하는 것, 현탁 배양하는 것, 및 반-현탁 배양하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인, 실시양태 77의 방법이다.
실시양태 79는 세포를 자극하는 것이 하나 이상의 약물을 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 항체를 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 엑소솜을 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 케모카인을 배지에 부가하는 것, 하나 이상 세포질체를 배지에 부가하는 것, 2D 또는 3D 조건 하에 배양하는 것, 또는 저산소성 조건 하에 배양하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인, 실시양태 77 내지 78 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 80은 세포 또는 세포질체를 배지로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 77 내지 80 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 81은
세포를 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 세포를 자극하며, 여기서 세포를 자극하는 것은 하나 이상의 세포질체를 배지에 부가하는 것을 포함하는 것인 단계
를 포함하는 방법이다.
실시양태 82는 배양하는 것이 3D 배양하는 것, 부착 배양하는 것, 현탁 배양하는 것, 및 반-현탁 배양하는 것 중 하나 이상을 포함하는 것인, 실시양태 81의 방법이다.
실시양태 83은 세포를 자극하는 것이 하나 이상의 약물을 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 항체를 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 엑소솜을 배지에 부가하는 것, 하나 이상의 케모카인을 배지에 부가하는 것, 2D 또는 3D 조건 하에 배양하는 것, 또는 저산소성 조건 하에 배양하는 것 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인, 실시양태 81 내지 82 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 84는 세포를 배지로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 81 내지 83 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 85는 세포를 제핵하여 세포질체를 형성하는 것을 추가로 포함하는, 실시양태 81 내지 84 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 86은
실시양태 80 또는 실시양태 84의 방법에 의해 제조된 배지의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이다.
실시양태 87은
실시양태 80 또는 실시양태 86의 방법에 의해 제조된 세포질체의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 단계
를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법이다.
실시양태 88은 암, 감염, 신경계 질환, 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 또는 그 중 둘 이상의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 실시양태 33 내지 44 중 어느 하나의 세포질체의 용도이다.
실시양태 89는 암, 감염, 신경계 질환, 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 또는 그 중 둘 이상의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 실시양태 80 또는 실시양태 84의 방법에 의해 제조된 배지의 용도이다.
실시양태 90은 세포질체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상체에서 질환 또는 병태의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이다.
실시양태 91은 질환 또는 병태가 암, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환, 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 병태, 발달 병태, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 특발성 질환, 또는 그 중 둘 이상인, 실시양태 90의 방법이다.
실시양태 92는 세포질체가 리포터 분자 또는 시약을 발현하거나 또는 함유하는 것인, 실시양태 90 내지 91 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 93은 리포터 분자 또는 시약이 바이오리포터 분자 또는 시약인, 실시양태 92의 방법이다.
실시양태 94는
제1 세포질체로서, 실시양태 33 내지 44 중 어느 하나의 세포질체인 제1 세포질체; 및
세포 또는 제2 세포질체
를 포함하는, 세포 융합 산물이다.
실시양태 95는
대상체로부터 샘플을 수득하는 단계; 및
세포질체를 상기 샘플에 부가하는 단계
를 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이다.
실시양태 96은 질환 또는 병태가 암, 감염, 염증성 병태, 신경계 질환, 변성 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 허혈성 질환, 유전적 또는 유전성 병태, 발달 병태, 안과 질환, 골격 질환, 대사 질환, 중독증, 특발성 질환, 또는 그 중 둘 이상인, 실시양태 95의 방법이다.
실시양태 97은 세포질체가 리포터 분자 또는 시약을 발현하거나 또는 함유하는 것인, 실시양태 95 내지 96 중 어느 하나의 방법이다.
실시양태 98은 리포터 분자 또는 시약이 바이오리포터 분자 또는 시약인, 실시양태 97의 방법이다.
실시예
본 개시내용은 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 청구범위에 기재된 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는다.
실시예 1 - 포유동물 세포의 성공적인 제핵 및 생존
도 1에 제시된 바와 같이, 치료용 세포질체는 동종이계 또는 자가 공여자-유래 세포로부터 생성될 수 있으며, 질환 치료 뿐만 아니라 진단을 위해 사용될 수 있다. 개념 증명으로서, 다양한 유형의 포유동물 세포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포, 호중구, 섬유모세포 및 자연 킬러 세포)의 제핵 효율 및 회수율을 결정하였다. 세포 배양 플레이트로부터 포유동물 세포를 제거한 후, 불연속 피콜 구배, 고속 원심분리를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 포유동물 세포를 제핵하였다 (도 2A-D). 표 1은 현탁 프로토콜을 사용한 제핵의 결과를 요약한 것이다. 제핵 효율 및 세포 생육력은 hTERT 형질전환 및 1차 중간엽 줄기 세포 (MSC) 뿐만 아니라 섬유모세포 및 호중구에서 가장 높았다. 표 2는 부착 프로토콜을 사용한 제핵의 결과를 요약한 것이다. 제핵 효율은 중간엽 줄기 세포와 대식세포 둘 다에서 70% 초과였다. 이러한 실험은 다양한 유형의 포유동물 세포가 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 사용하여 제핵을 겪을 수 있다는 것을 제시하였다.
표 1. 현탁 프로토콜을 사용한 포유동물 세포의 제핵 효율 및 생육력 결정
Figure pct00001
표 2. 부착 프로토콜을 사용한 포유동물 세포의 제핵 효율 및 생육력 결정
Figure pct00002
다음으로, 세포질체의 생존을 96시간에 걸쳐 결정하였다 (도 3A). MSC는 시간이 지남에 따라 증식한 반면, 세포질체는 그렇지 않았다. 대신, 생육성 세포질체에 있어서의 상대적 배수 변화는 96시간에 감소하기 전에 72시간 동안 상당히 일정하게 유지되었다. 따라서, 세포질체 생존은 3-4일에 걸쳐 있었다. 대부분의 세포-기반 요법이 즉시 사용되지 않기 때문에, 동결보존 후의 세포질체의 생육력이 결정되었다. 놀랍게도, 동결보존 후의 세포질체의 생육력은 동결보존 후의 MSC의 생육력보다 더 컸다 (도 3B). 제핵 직후에 플레이팅된 세포질체 및 동결보존으로부터 회수된 세포질체는 24시간 후에 유사한 상대적 세포 생육력을 나타냈다 (도 3C). 이러한 실험은 세포질체 생존이 동결보존에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 제시하였다. 추가적으로, 동결동면 후의 세포질체의 생육력은 동결동면 후의 MSC의 생육력과 유사하였다 (도 25A). 다양한 시간 동안 동결동면 후 회수된 세포질체는 동결동면 후 회수된 MSC와 유사한, 보이덴 챔버 검정에서의 유도된 이동을 겪을 수 있었다 (도 25B).
다음으로, 세포의 대규모 생산을 생체외에서 설정한 다음, 대용량 밀도 구배 원심분리 및 제핵을 수행하여 치료용 세포질체의 생성을 초래하였다. 한 실시양태에서, 치료용 세포질체에 질환 치료를 위한 치료용 카고 (예를 들어, mRNA, 약물, 펩티드 등)가 로딩된다. 또 다른 실시양태에서, 치료용 세포질체는 진단 용도를 위해 즉시 사용하기 위해 (예를 들어, 정맥내 주사 (IV), 복강내 주사 (IP), 조직 또는 시험관내 적용을 위해) 제조된다.
실시예 2 - 세포질체는 무손상 세포 소기관을 보유하고, 세포외 매트릭스와 상호 작용할 수 있는 능력이 있으며, 세포-생물학적 기능을 수행하고, 치료적 가치가 있는 전달 비히클로서 작용할 수 있다
동결보존 후 세포질체가 생육력을 유지할 수 있는지의 여부를 결정한 후, MSC-유래 세포질체의 세포 표면 마커 프로파일이 골수-유래 MSC와 상이한 지의 여부를 결정하기 위해 유동 세포계수법 분석을 수행하였다 (도 4). 도 4에 도시된 바와 같이, MSC-유래 세포질체와 골수 유래 MSC 둘 다는 CD45, CD90, CD44, CD146 및 CD166의 세포 표면 발현을 유지하였다. 도 5A-F' 및 도 6A-D'는 세포질체가 부착되고, 세포 골격을 재구성하며, 2D 및 3D 배양 시스템에서 매트릭스 단백질 상에 확산되고, 터널링 나노튜브를 형성하여, 동일하거나 상이한 기원의 세포들 간에 바이오 제품을 전달할 수 있다는 것을 제시하였다. 세포 소기관 염색에 따르면, 골지, ER, F-액틴 세포 골격, 리소솜, 엔도솜, 미세관 및 미토콘드리아가 세포질체에 무손상으로 유지된 것으로 나타났다 (도 7A-E'). 더욱이, 세포질체는 시험관내에서 귀소 잠재력을 나타냈다. 세포질체는 세포외 매트릭스 단백질 상에서 쉽게 이동하고 가용성 케모카인 구배를 향한 (즉, 화학 감지를 통해) 방향으로 이동하였다 (도 8A 및 8B). 특히, 정제된 mRNA로 외인성으로 형질감염된 세포질체는 기능적 세포내 단백질을 생산하였으며, 이는 다양한 임상 용도 및 질환 상태에 대해 개발된 치료적 mRNA 적용을 모방할 수 있다. 이는 또한, mRNA 번역 및 단백질 합성을 위한 기구가 핵의 부재 하에 세포질체에서 정상적으로 작동하므로, 치료적 가치가 있는 생물활성 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증해 준다.
공지된 분비된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA로 외인성으로 형질감염된 세포질체는 조건화 배양 배지에서 기능적 세포외 단백질을 생산하며, 이는 ER/골지 및 분비 경로가 핵의 부재 하에 세포질체에서 정상적으로 작동한다는 것을 나타낸다 (도 11). 또한, 분비된 단백질을 함유하는 세포질체 조건화 배지로 대식세포 및 내피 세포를 처리하면, 이들 세포에서 주요 시그널 변환 반응이 활성화되었다 (도 12). 이것은 세포질체가 치료적 가치가 있는 분비된 단백질 및 생체분자를 생산 및 전달하기 위한 신규 비히클로서 사용될 수 있었다는 개념의 증거를 제공하였다. 세포질체에는 siRNA, shRNA, mRNA, DNA 플라스미드, 펩티드, 및 화학요법제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 카고가 로딩될 수 있다 (예를 들어, 도 9 및 10 참조).
실시예 3 - 조작된 세포질체는 시험관내와 생체내 둘 다에서 기능할 수 있다.
이론에 얽매이고자 한 것은 아니지만, 본 실시예는 "카고", 예를 들어, 외인성 mRNA 분자를 발현하도록 조작된 세포질체가 생산될 수 있다는 것을 제시한다. 도 13B 및 13C는 MSC-유래 세포질체가 시험관내에서, 및 정맥내 주사 후 전임상 마우스 모델에서 치료 수준의 기능적 항-염증성 시토카인 인터류킨 10 (IL-10)을 생산 및 분비하도록 조작될 수 있다는 것을 제시한다. 도 13B는 IL-10 mRNA로 형질감염된 세포질체가 높은 수준의 IL-10을 분비할 수 있다는 것을 제시한다. 분비된 IL-10이 활성인지의 여부를 결정하기 위해, 혈청 결핍 대식세포를 미처리된 MSC, IL-10을 발현하는 MSC, 미처리된 세포질체 및 IL-10을 발현하는 세포질체로부터의 조건화 배지 (CM)와 함께 인큐베이션하였다. 인산화된 STAT3은 IL-10을 발현하는 MSC로부터의 CM과 함께 인큐베이션한 후 및 IL-10을 발현하는 세포질체로부터의 CM과 함께 인큐베이션한 후에 대식세포에서 검출된 반면, 미처리된 MSC 및 미처리된 세포질체로부터의 CM과 함께 인큐베이션한 후 대식세포에서는 STAT3 활성이 검출되지 않았다 (도 13C). 세포질체-분비된 IL-10이 생체내에서 검출될 수 있는지를 결정하기 위해, C57Bl/6 마우스에 IL-10을 발현하는 MSC 또는 MSC-유래 세포질체를 안와후방로 주사 하였다. 주사한지 2시간 후, 혈액을 수집하고 IL-10의 수준을 결정하였다. 미처리된 MSC를 주사한 마우스의 혈액에서는 IL-10이 거의 내지 전혀 검출되지 않았다 (도 13D). 도 13D에 제시된 바와 같이, 미처리된 MSC가 주사된 마우스에서의 수준과 비교 시, IL-10을 발현하는 MSC-유래 세포질체가 주사된 마우스에서는 더 높은 수준의 IL-10이 검출되었다.
이러한 데이터는 정상 및 이환된 조직을 치료하기 위해 임상적으로 관련된 치료적 시토카인을 생산 및 분비할 수 있는 유전적으로 조작된 세포질체-기반 세포 요법의 잠재력을 예시한다.
MSC-유래 세포질체가 기저막을 통해 침습할 수 있는지를 결정하기 위해, MSC 또는 MSC-유래 세포질체가 기저막을 통해 24시간 동안 10% FBS 쪽으로 침습하도록 허용되었다. 도 14A 및 14B에 제시된 바와 같이, MSC-유래 세포질체는 10% FBS의 존재 하에 미처리된 MSC로서 기저막을 침습하는데 효율적이었다. 주목할만한 것은, 미처리된 MSC는 화학유인물질의 부재 하에 기저막을 침습할 수 있었지만, MSC 처리된 세포질체는 화학유인물질의 부재 하에 기저막을 훨씬 덜 침습할 수 있었다는 것이다. 이러한 데이터는 MSC-유래 세포질체가 기저막을 통해 소화 및 침습할 수 있다는 것을 예시한다. 이들 데이터는 조직 내에서 그들의 카고(들)를 전달하기 위해 복잡한 세포외 매트릭스 장벽을 통과하고 이동할 수 있는 세포질체-기반 세포 요법의 선천적 잠재력을 예시해 준다.
도 15A 및 15B에 제시된 바와 같이, MSC-유래 세포질체는 12 μm의 평균 직경을 갖는 반면, MSC는 20 μm의 평균 직경을 갖는다. MSC-유래 세포질체의 생체 분포를 결정하기 위해, 마우스에게 MSC 또는 MSC-유래 세포질체를 안와후방로 주사하였다. 도 15C 및 15D에 제시된 바와 같이, 간에서 검출된 MSC의 수보다 더 많은 MSC-유래 세포질체가 간에서 검출되었다. 이들 데이터는 광범위한 질환을 치료하기 위해 순환계로 직접 전달될 수 있는 세포질체-기반 세포 요법의 잠재력을 예시한다.
실시예 4 - 조작된 세포질체는 기능적 세포 표면 단백질을 발현할 수 있다
도 16B에 제시된 바와 같이, CXCR4를 발현하는 조작된 MSC 및 CXCR4를 발현하는 조작된 MSC-유래 세포질체는 유동 세포계수법에 의해 결정된 바와 같이, 거의 동등한 수준의 CXCR4를 발현한다. 조작된 세포질체가 기능적 세포 표면 단백질을 발현할 수 있는지를 결정하기 위해, CXCR4 수용체를 발현하는 MSC 및 MSC-유래 세포질체가 다양한 농도의 SDF-1α를 향해 이동하도록 허용되었다. 도 16C에 제시된 바와 같이, 기능적 CXCR4를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체는 SDF-1α를 향해 이동할 수 있고, SDF-1α의 농도가 증가함에 따라 세포 이동이 증가한다. 더욱이, 이동하는 MSC-유래 세포질체의 수는, CXCR4를 발현하는 이동하는 MSC의 수보다 더 많았다 (도 16C).
도 17A-C는 염증화된 혈관계에 대한 세포 부착을 매개하는 것으로 공지된 기능적 세포 부착 단백질을 발현하도록 MSC-유래 세포질체가 조작될 수 있다는 것을 제시한다. 도 18A-D는 치료용 세포의 포식 작용 및 대식세포 상호 작용을 조정하는 것으로 공지된 세포 단백질을 발현하도록 MSC-유래 세포질체가 조작될 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 5. 세포질체는 기능적 IL-12를 분비하도록 조작될 수 있고, 유방암의 동계 마우스 모델에서 염증 유전자의 발현을 유도할 수 있고 종양 성장을 억제할 수 있다
MSC 및 MSC-유래 세포질체는 IL-12 mRNA로 형질감염되었다. 조건화 배지 (CM)는 형질감염 후 24시간, 48시간 및 72시간에 수집되었다. 도 19B에 제시된 바와 같이, MSC-유래 세포질체는 IL-12를 분비한다. MSC-유래 세포질체가 기능적 IL-12를 분비할 수 있는지를 결정하기 위해, 마우스 비장 세포를 전체 배지, IL-12를 발현하는 MSC로부터의 CM, IL-12를 발현하는 MSC-유래 세포질체로부터의 CM, 및 정제된 IL-12로 처리하였다. IL-12를 발현하는 MSC-유래 세포질체 및 IL-12를 발현하는 MSC는 마우스 비장 세포에서 STAT4의 인산화를 유발할 수 있는 기능적 IL-12를 분비한다 (도 19C).
실시예 3에 제시된 바와 같이, 세포질체를 안와후방로 투여하는 것은 마우스에서 널리 관용되고 있었다. 세포질체의 종양내 투여가 관용되었는지를 결정하기 위해, 마우스에게 안와후방 또는 종양내 투여에 의해 주사하였다. 사망 수는 주사 방법 및 사망 원인에 따라 기록되고 분류되었다 (표 3). 하기 표에 제시된 바와 같이, 세포질체의 종양내 투여는 우수한 안전성 프로파일로 널리 관용되고 있었다.
표 3. 마우스에서 세포질체 투여의 생체내 안전성
Figure pct00003
다음으로, IL-12를 발현하는 MSC-유래 세포질체 및 비어 있는 MSC-유래 세포질체를 확립된 E0771 피하 종양 내로 주사하였다. 주사 후 48시간에, 모든 마우스를 안락사시키고, 종양 샘플을 수집하였다. 도 19D에 제시된 바와 같이, IL-12를 발현하는 MSC-유래 세포질체가 주사된 마우스로부터 단리된 종양에서 종양 IL-12가 검출된 반면, 비어 있는 MSC-유래 세포질체가 주사된 마우스로부터 단리된 종양에서는 종양 IL-12가 거의 내지 전혀 검출되지 않았다. 취합해 보면, 이들 결과는 MSC-유래 세포질체가 전임상 마우스 모델에서 이환된 조직에 임상적으로 관련된 수준의 치료적 시토카인을 생산, 분비 및 전달할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 20A-C는 IL-12 시토카인을 발현하도록 조작된 세포질체가 주사된 마우스로부터 취한 샘플은 인터페론 감마 (IFNγ), PD-L1 및 CXCL9를 발현하는 반면, 단지 PBS 또는 비어 있는 세포질체가 투여된 마우스로부터 취한 샘플은 낮은 수준의 IFNγ, PD-L1 및 CXCL9를 발현하였다는 것을 제시한다. 이들 데이터는 IL-12를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체가, 상기 주사된 종양 내에서 염증 반응을 유도하였다는 것을 나타낸다. 도 20D는 IL-12를 발현하도록 조작된 MSC-유래 세포질체의 주사 후 종양 크기에 있어서의 감소를 제시한다.
도 21A-C는 MSC-유래 세포질체에 종양용해성 바이러스가 로딩될 수 있고, 이러한 바이러스를 면역 손상 및 면역 적격 마우스에서 성장하는 종양에 전달할 수 있으며, 이는 IL-12 분비와 조합하여, 세포 독성 CD8+ T 세포의 종양 내로의 침윤을 촉진시킨다는 것을 제시한다. 도 21A와 관련하여, 7일 후 종양에서는 거의 소수의 세포질체가 검출될 수 있는 반면, 성장하는 종양의 중심 (주사 부위) 및 외측 가장자리에 다수의 MSC가 존재한다는 것은 주목할 만하다.
도 22A-B는 유전적으로 조작된 MSC-유래 세포질체가 세포질체-숙주 세포 융합 후 숙주 세포에서 유전자 기능을 조절하기 위해 유전자 편집 단백질을 전달할 수 있다는 것을 제시한다. 이들 데이터는 세포에서 정상 또는 돌연변이체 유전자를 변형시키기 위해 유전자 편집 구성요소를 전달할 수 있는 세포질체-기반 세포 요법의 잠재력을 예시한다.
중간엽 줄기 세포 (MSC)의 제핵
본 프로토콜은 문헌 [Methods in Cell Biology Volume 14, 1976, Pages 87-93 Chapter 7 Enucleation of Mammalian Cells in Suspension (Michael H. Wigler, Alfred I. Neugut, I. Bernard Weinstein)]으로부터 변형되었다.
50% 피콜 용액의 제조: 빛으로부터 차폐된 유리 비이커에서, 피콜 그램 (PM400, GE 헬스케어(Healthcare) 17-0300-500)을 실온 하에 24시간 동안 연속 자기 교반에 의해 동등한 수의 밀리리터 초순수 물 (인비트로젠(Invitrogen) 10977-015)에 용해시켰다. 이어서, 혼합물을 30분 동안 고압 멸균시켰다. 일단 혼합물이 냉각되면, 균일한 점조도를 보장하기 위해 다시 교반시켰다. 굴절률은 굴절계 (라이헤르트(Reichert) 13940000)에서 측정되었으며, 1.4230-1.4290의 범위였다. 분취액을 -20℃ 하에 저장하였다.
2X MEM의 제조: 각각의 50 ml 수량에 대해, 10 mL 10X MEM (깁코(Gibco), 11430-030), 2.94 mL의 정확히 중탄산 나트륨 (7.5%, 깁코, 25080-094), 1 mL 100X Pen-Strep (깁코 15140-122) 및 36 mL 초순수 물 (인비트로젠 10977-015)을 사용하였다. 이어서, 용액을 0.22 um 막 플라스크 (올림푸스(Olympus) 25-227)를 통해 여과하고, 4℃ 하에 저장하였다.
제핵 하루 전날, MSC를 20 mL MSC 배지 [MEM 1X (깁코 12561-056); 16.5% 프리미엄 FBS (애틀란타 바이올로직스(Atlanta Biologics) S1150); 1% HEPES 1 M (깁코 15630-80); 1% 항-안티 100X (깁코 15240-062); 1% 글루타맥스(Glutamax) 100X (깁코 35050-061)]에서 15 cm 플레이트 (올림푸스 25-203)에 대하여 2.5 M로 시딩하였다. 다음으로, 시토칼라신 B (시그마 알드리치(Sigma Aldrich) C6762)를 2X MEM (2 μM/mL 최종 농도)에 부가하였다.
피콜 구배의 제조: 2X CytoB를 1:1 희석으로 50% 피콜 분취액에 부가하여 25% 피콜 스톡 농도를 만들었다. 다음으로, 25% 피콜을 적절한 용적의 1X MEM 완충액 (1:1 희석 하에 초순수 물에 부가된 시토칼라신 B를 함유하는 2X MEM)으로 희석함으로써 17%, 16%, 15% 및 12.5% 피콜을 만들었다. 희석액은 느슨한 캡으로 덮힌 CO2 인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 평형시켰다. 이어서, 피콜 구배를 13.2 mL 초 투명 튜브 (베크만(Beckman), 344059)에 따라 붓고, CO2 인큐베이터에서 밤새 (6-18시간) 인큐베이션하였다.
제핵 당일, 제핵을 위해 12-25M MSC (이상적으로 20 M)를 각각의 튜브에 수집하였다. 배지를 흡인하고, 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS) (깁코 14190-144)로 1회 세척하였다. 5 mL의 TrypLE-셀렉트 (깁코, 12563011)를 각각의 플레이트에 부가하고, 최대 5분 동안 인큐베이션하였다. 세포의 90%가 분리될 때, 5 mL 전체 MSC 배지를 부가하고, 세포를 50 ml 튜브에 수집하였다 (3-4 플레이트/튜브). 이어서, 튜브를 1,200 rpm 하에 5분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 10 mL PBS에 재현탁시켰다. 세포를 카운팅하고, 펠릿화하며, 12.5% 피콜로 재현탁시켰다. 다음으로, 세포-피콜 혼합물을 40 um 세포 여과기 (팔콘(Falcon) 352340)를 통해 새로운 50 mL 튜브 내로 적가하였다. 주사기를 사용하여, 3.2 mL의 세포 현탁액을 미리 만들어진 구배 상으로 서서히 로딩하였다. 1 mL의 1X MEM 완충액을 주사기로 최종 (상단) 층에 부가하였다. 이어서, 튜브를 로터 버킷 내로 로딩하고, 균형을 맞추며, 초원심분리기 (베크만, L8M)에서 60분 동안, 26,000 rpm, 31℃, 액셀(Accel) 7, 덱셀(Deccel) 7 하에 실행하였다. 원심분리가 끝날 무렵, 3개 층이 존재하였다: 12.5%의 상단 근처에 있는 1개 층 (세포질체 및 데브리스), 12.5/15% 경계면 근처에 있는 1개 층 (세포질체), 및 25%의 바닥에 있는 펠릿 (핵질체). 15% 피콜 용액 위의 층을 15 ml 원뿔형 튜브에 수집하였다. 이어서, 수집된 층을 4 용적 초과의 따뜻한 무혈청 MSC 배지 (즉, 3 mL의 피콜 및 최대 15 mL 배지로 충전)로 희석시킨다. 부드럽게 혼합한 후, 혼합물을 1,200 rpm 하에 10분 동안 펠릿화하였다. 따뜻한 무혈청 MSC 배지로 3회 세척한 후, 실험 프로토콜, 예를 들어, 형질감염 배지 vs. 이동 배지 vs. 무혈청 배지 vs. 전체 배지에 따라 배지에 세포를 재현탁시켰다. 1:2000 희석 바이브런트® 다이사이클™ 그린 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) V35004) 또는 1:5000 희석 훽스트 33342를 수반한 전체 MSC 배지를 부가함으로써 12-웰 플레이트에서 제핵 효율을 결정하였다. 작은 용적의 각각의 층을 각각의 웰에 부가하고 인큐베이터에서 10분 동안 부착/염색시켰다. 집단당 음성 세포질체의 백분율은 표면 형광 현미경 검사에 의해 결정되었다.
세포질체 mRNA 형질감염
1 M 세포질체를 따뜻한 1 ml 아미노산 무함유 α-MEM 전체 배지 (써모피셔(ThermoFisher) 12561056; 16.5% 프리미엄 소 태아 혈청 (FBS), 1% 글루타맥스 (깁코 35050061), 1% HEPES (깁코 15630080))로 현탁시켰다. 1 μg mRNA를 따뜻한 옵티-MEM으로 희석하고 피펫과 적어도 20회 혼합하였다. 4 μl 리포펙타민-3000 (써모피셔 L300015)을 46 μl 따뜻한 옵티-MEM (써모피셔 31985062)에 부가하고 피펫과 적어도 20회 혼합하였다. mRNA와 리포펙타민-3000의 비는 1:4 (w/v)였다. mRNA 및 리포펙타민-3000 희석액을 피펫과 적어도 20회 혼합하고, 실온 하에 15분 동안 인큐베이션하였다. mRNA 및 리포펙타민-3000 혼합물을 세포질체 현탁액에 부가하고, 잘 혼합하며, 37℃ 하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 응집을 방지하기 위해 현탁액을 5분마다 진탕시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 정상 α-MEM 전체 배지 (16.5% 프리미엄 FBS, 1% 항생제-항진균제, 1% 글루타맥스, 1% HEPES) 또는 PBS에 재현탁시켰다.
세포질체 siRNA 형질감염
1 M 세포질체를 따뜻한 1 ml A/A 무함유 α-MEM 전체 배지 (16.5% 프리미엄 FBS, 1% 글루타맥스, 1% HEPES)로 현탁시켰다. 2 μl siRNA를 따뜻한 옵티-MEM으로 희석하고 피펫과 적어도 20회 혼합하였다. 8 μl 리포펙타민-3000을 92 μl 따뜻한 옵티-MEM으로 희석하고, 피펫과 적어도 20회 혼합하였다. siRNA와 리포펙타민-3000의 비는 1:4 (v/v)였다. siRNA 및 리포펙타민-3000 희석액을 피펫과 적어도 20회 혼합하고, 실온 하에 15분 동안 인큐베이션하였다. siRNA 및 리포펙타민-3000 혼합물을 세포질체 현탁액에 부가하고, 잘 혼합하며, 37℃ 하에 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포 응집을 방지하기 위해 현탁액을 5분마다 진탕시켰다. 20분 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고, 정상 α-MEM 전체 배지 (16.5% 프리미엄 FBS, 1% 항생제-항진균제, 1% 글루타맥스, 1% HEPES)에 재현탁시켰다.
종양용해성 바이러스 감염된 세포질체의 생성
제핵 전날 (통상적으로 제핵하기 18시간 전)에, 2.5*10^6 hTERT-MSC를 15 cm 디쉬 위로 시딩하였다. 시딩한지 대략 2시간 후에, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 8 mL 무혈청 옵티-MEM으로 상이한 MOI (예를 들어, 0.05 또는 0.5) 하에 oHSV-GFP (이마니스(Imanis) OV3001)로 감염시켰다. 다음으로, 세포를 가끔 흔들면서 37℃ 하에 2시간 동안 인큐베이션하였다. 바이러스 접종원을 폐기하였다. 20 mL의 미리 가온된 전체 배양 배지 (α-MEM, 16.5% 프리미엄 FBS, 1% 항생제-항진균제, 1% 글루타맥스, 1% HEPES)를 각각의 웰에 부가하였다. 세포는 제핵될 때까지 37℃에서 인큐베이션되었다.
세포질체에서 기능적 단백질을 과다 발현하는 렌티바이러스
표적 세포를 1-2 × 105개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트의 하나의 웰에, 또는 0.5-1 M MSC를 갖는 10 cm 플레이트에 플레이팅하였다. 그 다음날, 농축된 재조합 렌티바이러스를 37℃ 수조에서 해동하고, 해동 즉시 상기 수조로부터 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 200μL 무혈청 배지 또는 2 mL 무혈청 배지 (1:1250 SureENTRY)를 부가하였다. 표적 세포를 MOI 10:1로 6-웰 플레이트에서 감염시켰다. 그 다음날, 바이러스 상등액을 제거하고 적절한 완전 성장 배지를 세포에 부가하였다. 72시간 인큐베이션 후, 세포를 2 × 100 mm 디쉬 내로 계대 배양하였다. 안정적인 세포주 생성을 위해 적절한 양의 선택 약물 (즉, 푸로마이신)을 부가하였다. 선택 후 10-15일에, 확장을 위해 클론을 골라내고, 양성 클론에 관하여 스크리닝하였다. 선택된 양성 클론을, 제핵을 위해 확장시켰다. 조작된 세포질체는 상기 요약된 바와 같이 제조되었다. 세포질체 상의 표적 단백질 발현은 통상적인 생화학적 방법 또는 기능적 검정, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류 (FACS), 웨스턴 블롯 또는 보이덴 챔버 검정에 의해 결정되었다.
세포질체 내로의 펩티드 로딩
웰당 1 x 105/ml를 전체 MSC 배지 [MEM 1X (깁코 12561-056); 16.5% 프리미엄 FBS (애틀란타 바이올로직스 S1150); 1% HEPES 1 M (깁코 15630-80); 1% 항-안티 100X (깁코 15240-062); 1% 글루타맥스 100X (깁코 35050-061)] 내의 4-챔버 유리 슬라이드 (랩텍 II 4-챔버 유리 슬라이드, 155383) 상으로 플레이팅하였다. 세포를 적어도 1시간 동안 또는 밤새 부착시켰다. 이어서, 세포를 PBS (깁코 14190-144)로 세정하였다. Arg9 (FAM) (10 mM, 아나스펙(Anaspec), AS-61207)를 전체 배지에서 1:100 (100 uM)의 총 농도가 되도록 희석시켰다. 이어서, 세포질체를 1 내지 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 3회 세정하였다. 훽스트 33342 (인비트로젠)를 적어도 10분 동안 전체 배지에서 1:5000 희석으로 부가하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고, 표면 형광 현미경 검사함으로써 영상화하였다.
면역 적격 마우스에서 전임상 동계 종양 모델의 생성
마우스 옆구리의 양쪽 측면 (팔꿈치 수평에서 허벅지 위까지 및 복부 바로 위에서 등을 가로질러 중간까지) 상의 작은 털 패치를 면도하였다. 과량의 털은 알콜 천으로 닦아내었다. 27G ½" 바늘이 있는 1 mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여, 1 M/100 μL E0771 세포를 마우스의 각각의 측면에 주사하였다. 대략 10-20일 후에, 종양이 0.7-1.0 cm 직경에 도달할 때까지 마우스를 모니터링하였다.
치료용 세포질체의 종양내 전달
조작된 세포질체 (즉, IL-12 mRNA가 로딩됨)를 원하는 농도, 예를 들어, 3 M/50 uL 하에 PBS에 재현탁시켰다. 주사 당일, 동물 체중 및 종양 치수를 측정하였다. 조작된 세포질체를 종양의 중심에 주사하였다. 마우스를 모니터링하였고; 2-3일마다 종양 및 체중을 측정하였다.
치료용 세포질체의 정맥내 전달
조작된 세포질체 (즉, IL-12 mRNA가 로딩됨)를 원하는 농도, 예를 들어, 3 M/50 μL 하에 PBS에 재현탁시켰다. 최대 권장 주사량은 100 μL였다. 1 mL 투베르쿨린 주사기 및 27G ½" 또는 28G ½" 바늘로 주사를 수행하였다. 정맥내 (IV) 주사를 위해 기관내 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜을 따랐다. 케타민/자일라진 복강내 (IP) 주사 또는 이소플루오란 흡입으로 마취 하에 안와후방 주사를 수행하였다. 구속 장치를 사용하여 꼬리 정맥 주사를 수행하였다.
실시예 6. 3D-배양된 MSC는 제핵될 수 있고 3D-유래 세포질체는 생체내에서 더 나은 생체 분포를 제시한다.
MSC를 3D-현적에서 배양한 다음 (3D MSC), 제핵하여 3D 세포질체를 생성하였다. 현적에 의한 MSC의 3D 배양 프로토콜은 문헌 [Curr Protoc Stem Cell Biol. 2014 Feb 6; 28: Unit-2B.6.(Thomas J. Bartosh1 and Joni H. Ylostalo)]으로부터 변형된 것이다.
건강한 MSC를 트립신에 의해 2D-배양된 플레이트로부터 수확하고, 신선한 α-MEM (써모피셔 12561056) 전체 배지 (16.5% 프리미엄 FBS, 1% 항생제-항진균제, 1% 글루타맥스, 1% HEPES)에 143만개 세포/ml로 재현탁시켰다. 15 cm 플레이트의 뚜껑을 완전히 열고, 20 ml PBS를 플레이트에 부가하였다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 비말당 35 μl (대략 50,000개 세포/비말)로 플레이트의 뚜껑에 비말을 만들었다. 약 100 내지 120개의 비말이 각각의 뚜껑 위에 놓였다. 뚜껑을 닫고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣었다. 비말을 2일 동안 배양한 다음, 세포 리프터로 수확하고 15 ml 튜브 내로 수집하였다 (튜브당 대략 300개 비말). 튜브를 1,200 rpm 하에 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 튜브를 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 모든 PBS를 제거하고 7.5 ml의 새로이 해동된 0.25% 트립신-EDTA (써모피셔 25200114)를 각각의 튜브에 부가하였다. 튜브를 수조에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 비말을 저 유지 팁이 있는 1 ml 피펫으로 약 10-20회 부드럽게 피펫팅하고, 수조에서 4분 더 인큐베이션하였다. 대부분의 비말이 해리될 때까지, 저 유지 팁이 있는 1 ml 피펫으로 비말을 다시 약 10-20회 부드럽게 피펫팅하였다. 7.5 ml의 전체 혈청 배지 (글루타맥스 보충제 (깁코 35050061); 소 태아 혈청 - 프리미엄 셀렉트 (애틀란타 바이올로지칼스(Atlanta Biologicals) S11550); HEPES (1 M) (깁코 15630080); 항생제-항진균제 (100X) (깁코 15240062))를 각각의 튜브에 부가하고, 튜브를 1,200 rpm 하에 10분 동안 원심분리하였다. 해리된 세포를 10 ml의 전체 혈청 배지로 세척하고, 세포를 5 ml의 전체 혈청 배지로 재현탁시켰다. 세포를 70 μm 세포 필터 내로 관통시킨 다음, 필터를 5 ml 전체 혈청 배지로 세척하였다. 세포를 카운팅하고, 10 M/ml 초과로 전처리된 12.5% 피콜로 재현탁시켰다. 30-40 M 세포를 각각의 제핵 튜브에 사용하였다. 후속적으로, 상기 기재된 제핵 프로토콜을 따랐다.
DiD 표지된 정상 2D-배양된 MSC (2D MSC), 3D MSC 또는 3D 세포질체를 각각 BalB/C 마우스 내로 안와후방로 주사하였다. 표시된 조직을 주사 후 24시간에 수확하고, DiD 표지된 세포를 FACS에 의해 분석하였다. 도 24는 3D-배양된 MSC로부터의 3D-유래 세포질체의 성공적인 생성을 제시하고, 또한 3D-유래 세포질체는 순환계 내로의 주사 후 2D-배양된 세포보다 폐 포획이 더 적고 말초 기관으로의 더 나은 생체 분포를 나타낸다는 것을 제시한다. 이는 조직의 정확한 위치를 찾아내서 카고를 전달할 수 있는 치료적 능력을 크게 개선시킬 것으로 예상된다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 연계해서 기재되었지만, 전술한 설명은 첨부 된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 예시하려는 것이지 그를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California <120> PLATFORM FOR GENERATING SAFE CELL THERAPEUTICS <130> 15670-0289WO1 <150> 62/542,133 <151> 2017-08-07 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 229 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RSV promoter <400> 1 aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca 60 tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga 120 tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt 180 gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaac 229 <210> 2 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Truncated HIV-1 5' long terminal repeat <400> 2 gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120 tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180 a 181 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HIV-1 packaging signal <400> 3 tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga gagag 45 <210> 4 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HIV-1 Rev response element <400> 4 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234 <210> 5 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Central polypurine tract <400> 5 ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60 agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt 118 <210> 6 <211> 1178 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Human eukaryotic translation elongation factor 1 alpha promoter <400> 6 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga agtgggtggg 360 agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt gaggcctggc 420 ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt ctcgctgctt 480 tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt tttttctggc 540 aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt tttggggccg 600 cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg ggcctgcgag 660 cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct ctggtgcctg 720 gtctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg tcggcaccag 780 ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca aaatggagga 840 cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg gcctttccgt 900 cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg cacctcgatt 960 agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt tatgcgatgg 1020 agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac ttgatgtaat 1080 tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag cctcagacag 1140 tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtga 1178 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Kozak translation initiation sequence <400> 7 gccacc 6 <210> 8 <211> 1059 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atggagggga tcagtatata cacttcagat aactacaccg aggaaatggg ctcaggggac 60 tatgactcca tgaaggaacc ctgtttccgt gaagaaaatg ctaatttcaa taaaatcttc 120 ctgcccacca tctactccat catcttctta actggcattg tgggcaatgg attggtcatc 180 ctggtcatgg gttaccagaa gaaactgaga agcatgacgg acaagtacag gctgcacctg 240 tcagtggccg acctcctctt tgtcatcacg cttcccttct gggcagttga tgccgtggca 300 aactggtact ttgggaactt cctatgcaag gcagtccatg tcatctacac agtcaacctc 360 tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc agtctggacc gctacctggc catcgtccac 420 gccaccaaca gtcagaggcc aaggaagctg ttggctgaaa aggtggtcta tgttggcgtc 480 tggatccctg ccctcctgct gactattccc gacttcatct ttgccaacgt cagtgaggca 540 gatgacagat atatctgtga ccgcttctac cccaatgact tgtgggtggt tgtgttccag 600 tttcagcaca tcatggttgg ccttatcctg cctggtattg tcatcctgtc ctgctattgc 660 attatcatct ccaagctgtc acactccaag ggccaccaga agcgcaaggc cctcaagacc 720 acagtcatcc tcatcctggc tttcttcgcc tgttggctgc cttactacat tgggatcagc 780 atcgactcct tcatcctcct ggaaatcatc aagcaagggt gtgagtttga gaacactgtg 840 cacaagtgga tttccatcac cgaggcccta gctttcttcc actgttgtct gaaccccatc 900 ctctatgctt tccttggagc caaatttaaa acctctgccc agcacgcact cacctctgtg 960 agcagagggt ccagcctcaa gatcctctcc aaaggaaagc gaggtggaca ttcatctgtt 1020 tccactgagt ctgagtcttc aagttttcac tccagctaa 1059 <210> 9 <211> 598 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element <400> 9 cgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt 60 tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc 120 ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 180 gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 240 cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct 300 ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg 360 gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct 420 gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc 480 cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 540 tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgg 598 <210> 10 <211> 511 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mouse phosphoglycerate kinase 1 promoter <400> 10 ttctaccggg taggggaggc gcttttccca aggcagtctg gagcatgcgc tttagcagcc 60 ccgctgggca cttggcgcta cacaagtggc ctctggcctc gcacacattc cacatccacc 120 ggtaggcgcc aaccggctcc gttctttggt ggccccttcg cgccaccttc tactcctccc 180 ctagtcagga agttcccccc cgccccgcag ctcgcgtcgt gcaggacgtg acaaatggaa 240 gtagcacgtc tcactagtct cgtgcagatg gacagcaccg ctgagcaatg gaagcgggta 300 ggcctttggg gcagcggcca atagcagctt tgctccttcg ctttctgggc tcagaggctg 360 ggaaggggtg ggtccggggg cgggctcagg ggcgggctca ggggcggggc gggcgcccga 420 aggtcctccg gaggcccggc attctgcacg cttcaaaagc gcacgtctgc cgcgctgttc 480 tcctcttcct catctccggg cctttcgacc t 511 <210> 11 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hygromycin resistance gene <400> 11 accatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc 60 gacagcgtct ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc 120 gatgtaggag ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa 180 gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac 240 attggggaat ttagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg 300 ttgcaagacc tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc ggaggccatg 360 gatgcgatcg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa 420 ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg 480 tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat 540 gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc 600 ggctccaaca atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag 660 gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg 720 gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg 780 ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt 840 gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc 900 ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat 960 ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca 1020 aaggaatag 1029 <210> 12 <211> 235 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Truncated HIV-1 3' long terminal repeat <400> 12 ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc tttttgcttg tactgggtct 60 ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 120 aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 180 tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagca 235 <210> 13 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Simian virus 40 early polyadenylation signal <400> 13 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 60 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 120 atcatgtctg gctct 135 <210> 14 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Ampicillin resistance gene <400> 14 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240 cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840 tcactgatta agcattggta a 861 <210> 15 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pUC origin of replication <400> 15 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 60 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 120 cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 180 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 240 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 300 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 360 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaaga 420 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 480 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 540 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa 589 <210> 16 <211> 1191 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 atgtccccaa gcttccttgt gctgctgacc atcttgggcc ctggcaacag ccttcagctg 60 caggacccct gggggcatga aaccaaggaa gccccgggtc ctgtgcatct ccgggaacgg 120 aggcaggtgg ttggggatga cgattttgag gaccctgact atacgtataa cacagacccc 180 ccagaattgc tgaaaaatgt caccaacacc gtggctgctc accctgagct gccaaccacc 240 gtggtcatgc tagagagaga ttccacgagc gctggaacct ccgagagagc cactgagaag 300 attgccacca ctgaccctac tgccccaggt acaggaggga cagctgttgg gatgctgagc 360 acagactctg ccacacagtg gagtctaacc tcagtagaga ccgtccaacc agcatccaca 420 gaggtagaga cctcgcagcc agcacccatg gaggcagaga cctcgcagcc agcacccatg 480 gaggcagaga cctcgcagcc agcacccatg gaggcagaca cctcaaagcc agcacccacg 540 gaggcagaga cctcaaagcc agcacccacg gaggcagaga cctctcagcc agcacccaac 600 gaggcagaga cctcaaaacc agcacccacg gaggcagaga cctcaaaacc agcacccacg 660 gaggcagaga ccacccagct tcccaggatt caggctgtaa aaactctgtt tacaacgtct 720 gcagccaccg aagtcccttc cacagaacct accaccatgg agacggcgtc cacagagtct 780 aacgagtcta ccatcttcct tgggccatcc gtgactcact tacctgacag cggcctgaag 840 aaagggctga ttgtgacccc tgggaattca cctgccccaa ccctgccagg gagttcagat 900 ctcatcccgg tgaagcaatg tctgctgatt atcctcatct tggcttctct ggccaccatc 960 ttcctcgtgt gcacagtggt gctggcggtc cgtctgtccc gtaagaccca catgtaccca 1020 gtgcggaact actcccccac ggagatgatc tgcatctcgt ccctgctacc tgagggggga 1080 gacggggccc ctgtcacagc caatgggggc ctgcccaagg tccaggacct gaagacagag 1140 cccagtgggg accgggatgg ggacgacctc accctgcaca gcttcctccc t 1191 <210> 17 <211> 1170 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 17 atgccaaccc cctgcccacc agcctgcctg tccacgccag ggacacacag actccttccc 60 tttccagact ggaaagcccc ctcctgggag agcaggaagg aagcaacctg caactcttcc 120 agccctggac cttgggctga acctacagtt caagggtacc accccaccag gaggctgcgg 180 gcctggggcg gcctagctgg aggagcaaca ttcatggtaa tttggttttt ctggctgtgg 240 ggatcagctc ctggaagtgc ccctgtgcct cagtccacac tcaccatcct tatctggcac 300 tggcctttca ccaaccggcc gccagagcta cctggtgaca cctgcactcg ctatggcatg 360 gccagctgcc gtctgagtgc taaccggagc ctgctagcca gtgctgatgc tgtggtcttc 420 caccaccgtg agctgcaaac ccggcaatct ctcctacccc tggaccagag gccacacgga 480 cagccttggg tctgggcctc catggaatcg cccagtaata cccatggtct ccatcgcttc 540 cggggcatct tcaactgggt gctgagctat cggcgtgatt cagatatctt tgtaccctac 600 ggtcgcttgg agcctctctc tgggcccaca tccccactac cggccaaaag caggatggct 660 gcctgggtga tcagcaattt ccaggagcgg cagcagcgtg caaagctgta ccggcagctg 720 gcccctcatc tgcaggtgga tgtgttcggt cgcgccagcg gacggcccct atgcgctaat 780 tgtctgctgc ccactttggc ccggtaccgc ttctacctgg cctttgagaa ctcacagcat 840 cgggactaca tcactgagaa gttctggcgc aatgccctgg cggctggtgc tgtacccgtg 900 gcgctgggac ctcctcgggc cacctacgag gcttttgtgc caccagatgc ctttgtacac 960 gtggacgact tcagctctgc ccgtgaactg gctgtcttcc tcgtcagcat gaatgagagt 1020 cgttatcgtg gcttctttgc ttggcgagac cggctccgtg tgcggctcct gggtgactgg 1080 agggagcgct tctgcaccat ctgtgcccgc tacccttact tgccccgcag ccaggtctat 1140 gaagaccttg aaagctggtt ccaggcttga 1170 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Self-cleaving 2A peptide from porcine teschovirus-1 <400> 18 ggaagcggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagatgttga agaaaacccc 60 gggcct 66 <210> 19 <211> 996 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 atgtggccct tggcggcggc gctgttgctg ggctcctgct gctgcggttc agctcaacta 60 ctgtttagta acgtcaactc catagagttc acttcatgca atgaaactgt ggtcatccct 120 tgcatcgtcc gtaatgtgga ggcgcaaagc accgaagaaa tgtttgtgaa gtggaagttg 180 aacaaatcgt atattttcat ctatgatgga aataaaaata gcactactac agatcaaaac 240 tttaccagtg caaaaatctc agtctcagac ttaatcaatg gcattgcctc tttgaaaatg 300 gataagcgcg atgccatggt gggaaactac acttgcgaag tgacagagtt atccagagaa 360 ggcaaaacag ttatagagct gaaaaaccgc acggccttca acactgacca aggatcagcc 420 tgttcttacg aggaggagaa aggaggttgc aaattagttt cgtggttttc tccaaatgaa 480 aagatcctca ttgttatttt cccaattttg gctatactcc tgttctgggg aaagtttggt 540 attttaacac tcaaatataa atccagccat acgaataaga gaatcattct gctgctcgtt 600 gccgggctgg tgctcacagt catcgtggtt gttggagcca tccttctcat cccaggagaa 660 aagcccgtga agaatgcttc tggacttggc ctcattgtaa tctctacggg gatattaata 720 ctacttcagt acaatgtgtt tatgacagct tttggaatga cctctttcac cattgccata 780 ttgatcactc aagtgctggg ctacgtcctt gctttggtcg ggctgtgtct ctgcatcatg 840 gcatgtgagc cagtgcacgg cccccttttg atttcaggtt tggggatcat agctctagca 900 gaactacttg gattagttta tatgaagttt gtcgcttcca accagaggac tatccaacct 960 cctaggaaag ctgtagagga accccttaac gaatag 996 <210> 20 <211> 711 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660 cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711

Claims (20)

  1. 적어도 하나의 치료제를 발현하거나 또는 함유하는 제1 세포질체를 포함하는 조성물의 치료상 유효량을 대상체에게 투여하는 것
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 치료제가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 소분자 치료제, 나노입자, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 지질, 및 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포가 대상체로부터 수확된 세포이거나 또는 이러한 세포로부터 유래되거나, 또는 세포주, 불멸화 세포, 또는 암 세포이거나 또는 이러한 세포로부터 유래된 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포질체가 제2 세포질체에 융합되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 하나 이상의 추가적 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포질체가 면역 시스템-회피 모이어티를 발현하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 면역 시스템-회피 모이어티가 CD47인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포질체 또는 이러한 제1 세포질체가 수득된 세포가 치료제를 발현하도록 조작된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포질체 또는 이러한 제1 세포질체가 수득된 세포가 치료제를 발현하도록 조작되지 않은 것인 방법.
  10. 적어도 하나의 치료제를 포함하는 세포질체.
  11. 제10항에 있어서, 치료제가 치료용 DNA 분자, 치료용 RNA 분자, 치료용 단백질, 치료용 펩티드, 소분자 치료제, 치료용 유전자-편집 인자, 소분자 치료제, 나노입자, 박테리아, 박테리아 포자, 박테리오파지, 박테리아 구성요소, 바이러스, 엑소솜, 지질, 및 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포질체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 세포질체가 면역 시스템-회피 모이어티를 추가로 포함하는 것인 세포질체.
  13. 세포 내로 치료제를 도입하는 단계; 및
    상기 세포를 제핵하는 단계
    를 포함하는, 세포질체를 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 도입 단계가 제핵 단계에 선행하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 도입 단계가 치료제의 영구적 발현을 초래하는 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 제핵 단계가 도입 단계에 선행하는 것인 방법.
  17. 제13항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 도입 단계가 치료제의 일시적 발현을 초래하는 것인 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 도입하는 것이 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 도입하는 것이 전기천공, 미세주사, 세포 스퀴징, 초음파천공, 임페일펙션, 또는 유체역학적 전달을 포함하는 것인 방법.
  20. 대상체에게 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 세포질체의 치료상 유효량을 투여하는 것
    을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
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GB (2) GB2597623A (ko)
WO (1) WO2019032628A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10960071B2 (en) * 2017-08-07 2021-03-30 The Regents Of The University Of California Platform for generating safe cell therapeutics
WO2019032628A1 (en) * 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
CN116875518A (zh) 2018-07-06 2023-10-13 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统
WO2021158991A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 The Regents Of The University Of California Methods and use for bioengineering enucleated cells

Family Cites Families (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1010543A (en) 1911-05-04 1911-12-05 George A Walter Drinking-fount.
US6538121B1 (en) 1994-11-01 2003-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-1 β converting enzyme like apoptosis protease-3 and 4
GB9514368D0 (en) 1995-07-13 1995-09-13 Medical Res Council Improvements in or relating to binding assays
US5811407A (en) 1997-02-19 1998-09-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill System for the in vivo delivery and expression of heterologous genes in the bone marrow
US6511967B1 (en) 1999-04-23 2003-01-28 The General Hospital Corporation Use of an internalizing transferrin receptor to image transgene expression
US20110171185A1 (en) 1999-06-30 2011-07-14 Klimanskaya Irina V Genetically intact induced pluripotent cells or transdifferentiated cells and methods for the production thereof
US20100158871A1 (en) * 1999-08-30 2010-06-24 David Stephen Terman Sickled erythrocytes with antitumor molecules induce tumoricidal effects
US20040214783A1 (en) 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US8071072B2 (en) 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
DE10003241A1 (de) 2000-01-26 2001-08-02 Werner Lubitz Verschließen von Bakterienghosts
EP1356070A2 (en) 2000-09-22 2003-10-29 Virxsys Conditionally replicating viral vectors and their use
US20020142397A1 (en) * 2000-12-22 2002-10-03 Philippe Collas Methods for altering cell fate
DE10157475A1 (de) 2001-11-23 2003-06-18 Hans-Hermann Gerdes Verfahren und Mittel zur Beeinflussung von interzellulärer Kommunikation und interzellulären Organellentransport
US20030113910A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-19 Mike Levanduski Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue
WO2004058157A2 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccines as immunotherapy
US20060140963A1 (en) 2003-04-14 2006-06-29 Arius Research, Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD59
US20040259249A1 (en) * 2003-05-16 2004-12-23 Nikolai Strelchenko Method of making stem cells from differentiated cells
US20060002956A1 (en) * 2004-04-05 2006-01-05 Surber Mark W Minicells as vaccines
KR20070111542A (ko) 2005-03-09 2007-11-21 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 암 치료유전자의 종양-특이적, 발현 고효율을 위한 신규한ｈＴＭＣ 프로모터 및 벡터
FR2919804B1 (fr) 2007-08-08 2010-08-27 Erytech Pharma Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral
FR2928926B1 (fr) 2008-03-18 2015-08-21 Centre Nat Rech Scient Polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogenes
US20110092961A1 (en) 2008-08-13 2011-04-21 Searete Llc Artificial cells
KR102019728B1 (ko) * 2009-04-17 2019-09-09 글로브이뮨 암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법
GB201020738D0 (en) 2010-12-07 2011-01-19 Affitech Res As Antibodies
FI20115914L (fi) 2011-09-16 2013-03-17 Oncos Therapeutics Ltd Muunnettu onkolyyttinen virus
US20150104428A1 (en) 2012-03-30 2015-04-16 University Of Southern California Compositions and Treatment Methods for Mesenchymal Stem Cell-Induced Immunoregulation
SG11201407239SA (en) 2012-05-09 2014-12-30 Gradalis Inc BI-FUNCTIONAL SHORT-HAIRPIN RNA (BI-SHRNA) SPECIFIC FOR SINGLE-NUCLEOTIDE <i>KRAS</i> MUTATIONS
ES2662326T5 (es) 2013-04-12 2021-08-04 Evox Therapeutics Ltd Vesículas de suministro terapéutico
EP3546485A1 (en) * 2013-05-10 2019-10-02 Whitehead Institute for Biomedical Research In vitro production of red blood cells with sortaggable proteins
EP3004357A4 (en) 2013-06-04 2017-01-11 The Johns Hopkins University Peg-prom mediated surface expression of avidin/streptavidin
JP6563389B2 (ja) 2013-06-27 2019-08-21 モナッシュ ユニバーシティ Ｉｌ−２１結合タンパク質及びその使用
PT3027738T (pt) 2013-08-01 2022-05-11 Swedish Stromabio Ab Mscs no tratamento de doenças pulmonares inflamatórias
CA2922805A1 (en) 2013-09-11 2015-03-19 Compugen Ltd. Anti-vstm5 antibodies and the use thereof in therapy and diagnosis
AU2014348683B2 (en) 2013-11-18 2020-11-05 Rubius Therapeutics, Inc. Synthetic membrane-receiver complexes
SG10201907841UA (en) 2013-11-22 2019-10-30 Dnatrix Inc Adenovirus expressing immune cell stimulatory receptor agonist(s)
WO2015128492A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Maghazachi Azzam A Monomethyl- and dimethylfumarate for nk cell activation
RU2736495C2 (ru) * 2014-04-01 2020-11-17 Рубиус Терапьютикс, Инк. Способ и композиции для иммуномодуляции
BR112016026651A2 (pt) 2014-05-16 2017-10-31 Univ Yale evolução de vesículas semelhantes a vírus de alta titulação para aplicações de vacina
CA2959356C (en) 2014-08-27 2024-02-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Novel antibodies that bind to b7h3
EP3194392B1 (en) 2014-09-15 2020-01-01 Plexxikon, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
AU2015335607B2 (en) 2014-10-24 2020-04-23 Calidi Biotherapeutics, Inc. Combination immunotherapy approach for treatment of cancer
WO2016100236A2 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells
MY196588A (en) 2015-03-05 2023-04-19 Hutchinson Fred Cancer Res Immunomodulatory Fusion Proteins and uses Thereof
EP3064507A1 (en) 2015-03-06 2016-09-07 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Fusion proteins comprising a binding protein and an interleukin-15 polypeptide having a reduced affinity for IL15ra and therapeutic uses thereof
EP3270940A4 (en) 2015-03-18 2018-08-29 Stemimmune, Incorporated Virotherapy with an antibody combination
US20180135012A1 (en) * 2015-05-13 2018-05-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
KR101714695B1 (ko) 2015-05-18 2017-03-09 한국과학기술연구원 가교화된 pva-ecm 복합체를 제조하는 방법 및 그에 의하여 제조된 pva-ecm 복합체
CN104877965B (zh) * 2015-05-27 2018-04-20 上海厚东生物科技有限公司 一种制备成熟红细胞的方法
WO2017027757A2 (en) 2015-08-11 2017-02-16 StemImmune, Incorporated Smallpox vaccine for cancer treatment
KR20180052757A (ko) 2015-09-21 2018-05-18 플렉시콘 인코퍼레이티드 헤테로시클릭 화합물 및 그의 용도
WO2017054085A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 University Of Ottawa Exosome packaging of nucleic acids
SI3383425T1 (sl) 2015-12-04 2020-11-30 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopični polipeptidi, ki antagonizirajo WNT-signaliziranje v tumorskih celicah
CN117402829A (zh) 2015-12-14 2024-01-16 贝里坤制药股份有限公司 用于治疗性细胞活化或消除的双重控制
LT3402491T (lt) 2016-01-11 2022-02-25 Rubius Therapeutics, Inc. Kompozicijos ir būdai, susiję su daugiamodalinėmis terapinėmis ląstelių sistemomis, skirti vėžio indikacijoms
US10940199B2 (en) 2016-03-09 2021-03-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Versikine for inducing and potentiating an immune response
RU2755059C2 (ru) 2016-03-19 2021-09-13 Эксума Биотек Корп. Способы и составы для производства лимфоцитов и их регулируемого увеличения
KR102491013B1 (ko) 2016-03-24 2023-01-31 코테라 바이오사이언스 인코포레이티드 Tg02를 사용한 암의 치료
US11458097B2 (en) 2016-03-30 2022-10-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Biological agent-exosome compositions and uses thereof
EP3246410A1 (en) 2016-05-19 2017-11-22 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Vsv/ndv hybrid viruses for oncolytic therapy of cancer
GB201609216D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Evox Therapeutics And Isis Innovation Ltd Exosomes comprising therapeutic polypeptides
CN109789177A (zh) 2016-05-27 2019-05-21 德那翠丝有限公司 腺病毒和免疫调节剂组合治疗
US11427625B2 (en) 2016-06-14 2022-08-30 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Expression of NKG2D activating ligand proteins for sensitizing cancer cells to attack by cytotoxic immune cells
CN107586341A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 生命序有限公司 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
GB2552473A (en) 2016-07-21 2018-01-31 Evox Therapeutics Ltd Surface decoration of extracellular vesicles
CN109790218B (zh) 2016-08-26 2023-03-03 百济神州有限公司 抗tim-3抗体及其用途
CA3036202A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Trustees Of Tufts College Combination therapies using immuno-dash inhibitors and pge2 antagonists
WO2018064513A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Natural killer cell-evasive oncolytic viruses
ES2917000T3 (es) 2016-10-24 2022-07-06 Orionis Biosciences BV Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo
EP3532164A4 (en) 2016-10-28 2020-10-07 Children's Hospital Medical Center TREATMENT OF DISEASES RELATED TO ACTIVATED IRAQ
RU2019120400A (ru) 2016-12-02 2021-01-11 Рубиус Терапьютикс, Инк. Композиции и способы, связанные с клеточными системами для проникновения в солидные опухоли
WO2018112033A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for targeting tumor-infiltrating tregs
EP3554521A4 (en) 2016-12-15 2020-09-16 The Regents of The University of California ORAL LACTIC ACID BACTERIA COMPOSITION FOR THE REGULATION OF IMMUNE REACTIONS AND RELATED PROCEDURES
JP2020505418A (ja) 2017-01-30 2020-02-20 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション 受動抗体依存性細胞媒介活性化
WO2018148378A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficiacy of cancer immunotherapy
US20200276318A1 (en) 2017-03-06 2020-09-03 University Of Washington Engineered cells and agent compositions for therapeutic agent delivery and treatments using same
CN108623686A (zh) 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN111148518A (zh) 2017-03-30 2020-05-12 丹娜法伯癌症研究院 使用cdk4/6抑制剂调控调节性t细胞和免疫应答的方法
WO2018187957A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Shenzhen International Institute For Biomedical Research Pum 1 protein as target for virus inhibition
WO2018195526A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Chung Eddie Yocon Membrane lipid coated nanoparticles and method of use
CN110869507A (zh) * 2017-05-08 2020-03-06 旗舰先锋创新V股份有限公司 促进膜融合的组合物和其用途
EP4286013A3 (en) 2017-05-09 2024-02-28 Scholar Rock, Inc. Lrrc33 inhibitors and use thereof
US11433143B2 (en) 2017-05-18 2022-09-06 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
BR112019024656A2 (pt) 2017-05-25 2020-06-09 Univ Central Florida Res Found Inc vírus oncolíticos para a sensibilização de células tumorais para morte por células exterminadoras naturais
MY200744A (en) 2017-05-31 2024-01-13 Boehringer Ingelheim Int Gmbh Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
US20210139846A1 (en) 2017-06-02 2021-05-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Engineered cells, and methods of using the same
EP3634496A4 (en) 2017-06-06 2021-09-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHOD FOR RISING AWARENESS IN CANCER CELLS AGAINST T-CELL-MEDIATED KILLING BY MODULATING MOLECULAR SIGNAL PATHS
US11692172B2 (en) 2017-06-26 2023-07-04 Mackay Memorial Hosptal Formulation comprising extracellular vesicles, method for producing the same, and uses thereof
US11740242B2 (en) 2017-07-14 2023-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating biomarkers to increase tumor immunity and improve the efficacy of cancer immunotherapy
US20200172868A1 (en) * 2017-07-19 2020-06-04 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for infectious disease
WO2019032628A1 (en) 2017-08-07 2019-02-14 The Regents Of The University Of California GENERATING PLATFORM FOR SAFE CELLULAR THERAPEUTIC AGENTS
US10960071B2 (en) 2017-08-07 2021-03-30 The Regents Of The University Of California Platform for generating safe cell therapeutics
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. ANTI-CD137 MOLECULES AND THEIR USE
CA3074678A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 GLAdiator Biosciences, Inc. Method of targeting exosomes
GB201714430D0 (en) 2017-09-07 2017-10-25 Micol Romain Compositions and processes for targeted delivery and expression and modulation of therapeutic components in tissue
WO2019055851A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Nantomics, Llc HMGB1 RNA AND ASSOCIATED METHODS
CA3077107A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 University Of Ottawa Fluorescent enveloped viral particles as standards for nanosale flow cytometry
WO2019066535A1 (ko) 2017-09-28 2019-04-04 주식회사 탠덤 암 치료용 신규 재조합 원형질막-기반 소포체
US20210040205A1 (en) 2017-10-25 2021-02-11 Novartis Ag Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
EP3703751A2 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to therapeutic cell systems for tumor growth inhibition
WO2019090355A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Children's National Medical Center Cells expressing antibodies and methods of treatment using the same
JP7423520B2 (ja) 2017-11-16 2024-01-29 アストラゼネカ・アクチエボラーグ Ｃａｓ９ベースノックイン方針の効力を改善するための組成物及び方法
US20190153409A1 (en) 2017-11-17 2019-05-23 Aviv MedTech Ltd. Compositions comprising particles and methods for treating cancer
EP3720502A4 (en) 2017-12-07 2022-01-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. CYTOBIOLOGICAL PRODUCTS AND THEIR THERAPEUTIC USES
WO2019113711A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 University Of Ottawa Exosome packaging and targeted autophagy
JP2021507924A (ja) 2017-12-22 2021-02-25 ディストリビューテッド バイオ， インコーポレイテッド 主要組織適合複合体（ｍｈｃ）組成物およびその使用方法
CN109970857B (zh) 2017-12-27 2022-09-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pd-l1抗体及其用途
SG11202005049QA (en) 2017-12-28 2020-07-29 Codiak Biosciences Inc Exosomes for immuno-oncology and anti-inflammatory therapy
US20210000750A1 (en) 2018-02-15 2021-01-07 North Carolina State University Engineered nanovesicles as checkpoint blockade for cancer immunotherapy
WO2019169141A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Lester Smith Medical Research Institute Production and use of extracellular vesicles
SG11202008261WA (en) 2018-03-08 2020-09-29 Rubius Therapeutics Inc Therapeutic cell systems and methods for treating cancer and infectious diseases
US20210060052A1 (en) 2018-03-15 2021-03-04 Atossa Therapeutics, Inc. In situ methods of inducing of immune response
US20200362052A1 (en) 2018-04-02 2020-11-19 Souvie Biodelivery, LLC Compositions and methods for treating toll-like receptor-driven inflammatory diseases
CN112135639B (zh) 2018-04-06 2023-10-20 北卡罗莱纳州立大学 细胞组装介导的癌症免疫治疗检查点抑制剂的递送
CA3096938A1 (en) 2018-04-10 2019-10-17 Ottawa Hospital Research Institute Microrna-based compositions and methods used in disease treatment
US11413315B2 (en) 2018-04-29 2022-08-16 City Of Hope Neural stem cell-mediated cancer treatment
WO2019213706A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Deakin University Extracellular vesicle-based drug-delivery
CA3099042A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Children's Medical Center Corporation Mesenchymal stromal cell exosome -treated monocytes and uses thereof
US20200054675A1 (en) 2018-06-01 2020-02-20 Washington University Suppression of cytokine release syndrome in chimeric antigen receptor cell therapy
US11505782B2 (en) 2018-06-04 2022-11-22 Calidi Biotherapeutics, Inc. Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
CA3177467A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Calidi Biotherapeutics, Inc. Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
AU2019288277A1 (en) 2018-06-19 2021-01-28 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Oncolytic virus or antigen presenting cell mediated cancer therapy using type I interferon and CD40-ligand
WO2019246528A1 (en) 2018-06-22 2019-12-26 Vyriad Methods of treating cancer using combination therapy
WO2020016900A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Exostem Biotec Ltd. Msc- and exosome-based immunotherapy
WO2020023350A1 (en) 2018-07-22 2020-01-30 Health Research, Inc. Major histocompatibility complex class ll-expressing cancer cell vaccine and methods of use for producing integrated immune responses
US20220340898A1 (en) 2018-08-01 2022-10-27 Yale University Compositions and Methods for Identification of Membrane Targets for Enhancement of T cell Activity Against Cancer
WO2020072126A2 (en) 2018-08-07 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Modulating ptpn2 to increase immune responses and perturbing gene expression in hematopoietic stem cell lineages
AU2019324747A1 (en) 2018-08-24 2021-04-01 Transfert Plus, S.E.C. Methods and compounds for targeting sortilin receptors and inhibiting vasculogenic mimicry
WO2020049158A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improved nucleases
AU2019351274A1 (en) 2018-09-27 2021-05-27 Genocea Biosciences, Inc. Treatment methods
KR20210091137A (ko) 2018-09-27 2021-07-21 제노세아 바이오사이언스, 인코퍼레이티드 치료 방법
US20200215114A1 (en) 2018-11-19 2020-07-09 Exosome Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing exosome loaded therapeutics for the treatment of multiple oncological disorders
AU2019377141A1 (en) 2018-11-06 2021-05-20 Calidi Biotherapeutics, Inc. Enhanced systems for cell-mediated oncolytic viral therapy
WO2020205579A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 University Of Southern California Genetically modified exosomes for immune modulation
WO2020217226A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Dcprime B.V. Methods of tumor vaccination
EP4022074A4 (en) 2019-08-27 2023-11-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York GENETICALLY ENGINEERED EXOSOMES FOR TARGETED DELIVERY
WO2021163222A1 (en) * 2020-02-11 2021-08-19 Cytonus Therapeutics, Inc. Rapid vaccine platform

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