FR3114323A1 - Procédé de production de globules rouges de culture - Google Patents
Procédé de production de globules rouges de culture Download PDFInfo
- Publication number
- FR3114323A1 FR3114323A1 FR2009679A FR2009679A FR3114323A1 FR 3114323 A1 FR3114323 A1 FR 3114323A1 FR 2009679 A FR2009679 A FR 2009679A FR 2009679 A FR2009679 A FR 2009679A FR 3114323 A1 FR3114323 A1 FR 3114323A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- cells
- red blood
- blood cells
- cultured red
- days
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 102
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 135
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 18
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 102000049320 CD36 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010045374 CD36 Antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 claims description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 20
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 14
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 13
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 13
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 13
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 11
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 11
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 11
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 9
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 9
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 9
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 6
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 6
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 4
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 T3 and T4 Substances 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000997803 Homo sapiens Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 2
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 101150090172 ccmH gene Proteins 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 2
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 2
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 4-[2-[[2-(1-benzothiophen-3-yl)-9-propan-2-ylpurin-6-yl]amino]ethyl]phenol Chemical compound N1=C(C=2C3=CC=CC=C3SC=2)N=C2N(C(C)C)C=NC2=C1NCCC1=CC=C(O)C=C1 BGFHMYJZJZLMHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000006501 Angiopoietin-like Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010019425 Angiopoietin-like Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100410782 Arabidopsis thaliana PXG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003984 Aryl Hydrocarbon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000448 Aryl Hydrocarbon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical group [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000003975 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000378 Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000003967 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102000003968 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000003956 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102000003957 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102100039897 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039277 Pleiotrophin Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710180316 Protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710127332 Protease I Proteins 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710137710 Thioesterase 1/protease 1/lysophospholipase L1 Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 1
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003173 enucleated reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 1
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940029303 fibroblast growth factor-1 Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 229940118526 interleukin-9 Drugs 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005709 nerve cell growth Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001568 pyrenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/16—Hollow fibers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Procédé de production de globules rouges de culture La présente invention concerne un procédé de production de globules rouges de culture à partir de cellules souches ou de cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde. (Pas de figure)
Description
Objet de l’invention
La présente invention concerne un procédé de production de globules rouges de culture.
Arrière-plan technique
La transfusion de globules rouges, ou érythrocytes, est couramment utilisée pour de nombreuses applications médicales et chirurgicales. Cette procédure a sauvé à elle seule des millions de vies au cours des 60 dernières années. La demande de telles transfusions est amenée à augmenter dans le futur du fait du vieillissement de la population.
La transfusion de globules rouges est utilisée comme traitement de l'anémie. L'approvisionnement dépend du don de sang volontaire, mais une main-d’œuvre importante est nécessaire pour la collecte, la préparation et le stockage afin d'assurer son approvisionnement continu. En outre, les préparations de globules rouges issues du don de sang ne sont pas totalement exemptes de tous risques infectieux résiduels. Dans de telles circonstances, afin de fournir de manière stable des globules rouges sûrs, il existe un besoin croissant de fabriquer artificiellement des globules rouges comme complément au don de sang.
La productionex vivode globules rouges de culture, également dits produits artificiellement, présente de nombreux intérêts et applications thérapeutiques et scientifiques. Par exemple, la transfusion sanguine, le transport de médicaments, les « Globules rouges médicaments » et comme support de test pour le développement de médicaments.
Bien que de nombreuses tentatives aient été faites, à ce jour, pour dériver des globules rougesin vitroà partir de cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (dérivés de moelle osseuse, de sang de cordon ombilical ou de sang périphérique), de cellules souches embryonnaires, d’iPSC ou de lignées cellulaires immortalisées du lignage érythroïde, elles ont échoué à passer au stade industriel pour diverses raisons, notamment pour des questions de coûts, de durée du protocole, d’étapes trop nombreuses, de l’utilisation de cellules nourricières, de l’intensité du travail, du faible rendement ou encore de l’incapacité à différencier complètement les cellules érythroïdes en cellules anucléées.
Ainsi, Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079 décrivent la productionex vivode globules rouges de culture à partir de cellules souches hématopoïétiques isolées du sang périphérique. Toutefois, le procédé utilisé n’est pas industrialisable.
Il existe donc un besoin pour un procédé de production industriel de globules rouges de culture sûrs et ayant une fonctionnalité similaire aux globules rouges natifs, notamment caractérisée par une bonne déformabilité et la présence d’hémoglobine fonctionnelle.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé de production de globules rouges de culture, en particulier à partir de cellules fraiches ou congelées, les cellules étant des cellules souches et/ou des progéniteurs ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, comprenant les étapes suivantes :
a) au moins une culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch des cellules ;
b) culture en bioréacteur de type perfusion des cellules obtenues à l'étape a) ;
c) Lavage et tri particulaire des cellules obtenues à l’étape b)
pour obtenir une population de globules rouges de culture.
La présente invention concerne également des globules rouges de culture obtenus, ou susceptibles d’être obtenus, par la mise en œuvre du procédé défini ci-dessus.
La présente invention concerne également une population de globules rouges de culture, qui peut être obtenue par la mise en œuvre du procédé défini ci-dessus, laquelle population de globules rouges de culture présente au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques suivantes :
- Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50% ;
- Un VGM de 80 fL à 160 fL ;
- Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule ;
- Une CCMH supérieure à 19 g/dl ;
- Une p50 de 18 à 28 mmHg ;
- Eventuellement une proportion de HbA de 70% à 100% ;
- Eventuellement une proportion de HbF de 0% à 30% ;
- Eventuellement une proportion de HbA2 inférieure à 8% ;
- Une proportion de HbCO de 0% à 10% ;
- Une proportion de MetHb de 0% à 3% ;
- Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs ;
- Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant des globules rouges de culture tels que définis ci-dessus à titre de substance active, éventuellement en association avec au moins un excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également des globules rouges de culture tels que définis ci-dessus, ou une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, pour une utilisation dans une méthode de diagnostic, de prévention ou de traitement d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu.
La présente invention concerne également une méthode de diagnostic, de prévention ou de traitement d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu, dans laquelle on administre à l’individu une quantité efficace de globules rouges de culture tels que définis ci-dessus ou d’une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également l’utilisation de globules rouges de culture tels que définis ci-dessus pour la préparation d’un réactif destiné au diagnostic, ou d’un médicament destiné à la prévention ou au traitement, d'une maladie, ou d'un trouble, caractérisé par une carence en nombre de globules rouges ou en hémoglobine fonctionnelle chez un individu.
Description de l’invention
A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet.A contrario, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés.
Cellules
Il est possible d’envisager la production de globules rouges à partir de diverses sources cellulaires. Le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches, des progéniteurs, ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.
Les cellules souches peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). De préférence le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches hématopoïétiques (HSC).
Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde peuvent être immortalisées au stade d’un progéniteur érythroïde ou d’un précurseur érythroïde. Par ailleurs, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) peuvent également être immortalisées.
L’immortalisation est préférentiellement réalisée de façon conditionnelle. Ces cellules immortalisées peuvent alors être passées indéfinimentin vitro, cryoconservées et récupérées, et, de manière conditionnelle, produire des globules rouges totalement différenciés à partir d'une source définie et bien caractérisée. L'immortalisation de manière conditionnelle peut être obtenue par n'importe quel procédé bien connu de la personne du métier.
Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes. Ces cellules sont à la fois capables de différenciation en de nombreux types de cellules et capables d'autoréplication. Elles peuvent maintenir cette pluripotence de différenciation même après avoir subi une prolifération par division. Les cellules souches embryonnaires font référence aux cellules souches pluripotentes dérivées d'embryons au stade blastocyste, qui est le stade précoce du développement animal. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont produites en introduisant plusieurs types de gènes de facteurs de transcription dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes.
Les cellules souches embryonnaires (ESC) selon l’invention sont obtenues par tout moyen ne nécessitant pas la destruction d’embryons humains. Par exemple en utilisant la technologie décrite par Chunget al.(Chung et al, Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction, Cell Stem Cell (2008)).
Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules souches utilisées dans le procédé selon l’invention ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et/ou des iPSC.
Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) utilisées dans le procédé selon l’invention sont des cellules multipotentes. Elles sont capables de se différencier pour donner tous les lignages de différenciation des cellules sanguines et capables de s'auto-répliquer tout en maintenant leur multipotence.
Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde sont des cellules déjà engagées dans le lignage érythroïde mais capables de s’auto-répliquer et sous contrôle externe de se différencier en cellules du lignage érythroïde.
Les cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP) utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent provenir de n’importe quelle source, y compris, être dérivées de la moelle osseuse, du sang du cordon ombilical/placentaire ou du sang périphérique avec ou sans mobilisation préalable.
L'origine des cellules souches et cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde n'est pas particulièrement limitée tant qu'elle est dérivée d'un mammifère. Les exemples préférés comprennent les humains, les chiens, les chats, les souris, les rats, les lapins, les porcs, les vaches, les chevaux, les moutons, les chèvres et similaires, les humains étant plus préférés.
Les cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent produire, sans limitation, des globules rouges de donneurs universels, des globules rouges d'un groupe sanguin rare, des globules rouges pour une médecine personnalisée (par exemple, une transfusion autologue, éventuellement avec génie génétique) et des globules rouges conçus pour inclure une ou plusieurs protéines d'intérêt.
Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, lesdites cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent être isolées à partir d'un patient ayant un groupe sanguin rare comprenant, sans limitation, Oh, CDE / CDE, CdE / CdE, CwD- / CwD- , -D - / - D-, Rhnull, Rh: -51, LW (a-b +), LW (ab-), SsU-, SsU (+), pp, Pk, Lu (a + b-), Lu (ab-), Kp (a + b-), Kp (ab-), Js (a + b-), Ko, K: -11, Fy (ab-), Jk (ab-), Di (b- ), I-, Yt (a-), Sc: -1, Co (a-), Co (ab-), Do (a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan (+), Gy ( a-), Hy-, At (a-), Jr (a-), In (b-), Tc (a-), Cr (a-), Er (a-), Ok (a-), JMH - et En (a-).
Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), de préférence humaines (hESC) et de préférence sélectionné dans le groupe constitué des lignées H1, H9, HUES-1, HUES-2, HUES-3, HUES-7, CLO1 et des cellules souches pluripotentes (iPSC), de préférence humaine (hiPSC)
De préférence, lesdites cellules sont des cellules souches hématopoïétiques (HSC), plus préférablement humaines.
Dans le cas de cellules dérivés du sang du cordon ombilical/ placentaire ou du sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, une étape de sélection spécifique des cellules CD34+ peut être effectuée avant l’étape a) du procédé selon l’invention.
L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extracorporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur (de sang) ou au patient (aphérèse thérapeutique).
Le qualificatif CD34+ (positif) signifie que l'antigène CD (cluster de différenciation) 34 est exprimé sur la surface cellulaire. Cet antigène est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices hématopoïétiques, et disparaît à mesure qu'elles se différencient. Des populations cellulaires similaires comprennent également des cellules positives au CD133.
Dans le cas où les cellules d’origine sont des ESC, des iPSC ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, des étapes de pré-culture peuvent être ajoutées en amont de l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch pour multiplier les cellules et éventuellement les engager dans la voie de différenciation de la lignée érythroïde.
Quelle que soit la source cellulaire, une étape préalable de congélation des cellules de départ est souvent requise pour des raisons de transport et de conservation. Les méthodes de congélation de cellules sont bien connues de l’état de l’art et font notamment appel à une descente en température programmée ainsi qu’à l’utilisation de cryoprotectant comme le lactose ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Lorsqu'il est ajouté au milieu, le DMSO empêche la formation de cristaux intracellulaires et extracellulaires dans les cellules pendant le processus de congélation.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de décongélation des cellules, préalable à l’étape a), dans le cas où les cellules de départ sont congelées. Les méthodes de décongélation de cellules sont bien connues de la personne du métier.
La décongélation est une étape du procédé à ne pas négliger notamment lorsque du DMSO a été utilisé pour la congélation. Ce composé est en effet cryopréservant tant que la suspension cellulaire est conservée en azote liquide ou en vapeur d’azote. Par contre, il devient cytotoxique dès que la suspension cellulaire est décongelée. Il convient donc d’éliminer très rapidement le DMSO par plusieurs étapes de lavage sitôt les cellules décongelées, comme cela est bien connu de la personne du métier.
Une fois les cellules décongelées, lesdites cellules sont mises en culture dans un bioréacteur de type batch, c’est-à-dire par lot, ou fed-batch, c’est-à-dire par lot alimenté (étape a) du procédé selon l’invention.
Dans d’autres cas, les cellules de départ peuvent être fraiches, c’est-à-dire que le temps entre le prélèvement des cellules et la mise en culture est suffisamment court pour ne pas nécessiter de congélation, de préférence ce temps est inférieur à 48H. Cette situation peut exister par exemple lorsque le centre de prélèvement est localisé sur le même site ou à proximité du centre de production. Dans cette situation, le procédé selon l’invention commence directement avec l’étape b) de mise en culture dans un bioréacteur de type batch ou fed-batch.
Etape a)
Le(s) culture(s) en bioréacteur de type batch ou fed-batch ont pour but d’engager ou de différencier les cellules de départ, ou de renforcer leur engagement ou leur différenciation, dans le lignage érythroïde. Autrement dit, selon l’invention, on poursuit de préférence l’étape a) jusqu’à ce que les cellules cultivées soient engagées dans le lignage érythroïde. Selon l’invention, on considère que des cellules sont suffisamment engagées dans le lignage érythroïde lorsqu’elles présentent une ou plusieurs caractéristiques spécifiques du lignage érythroïde, telles qu’un pourcentage de cellules présentant le marqueur CD235, mesurable par exemple par cytométrie en flux, supérieur à 50%, ou un pourcentage de cellules de phénotype érythroïde, mesurable par exemple par comptage cytologique après coloration au colorant May-Grünwald Giemsa, supérieur à 50%
Une ou plusieurs cultures successives, ou itératives, en bioréacteur de type batch ou fed-batch peuvent être conduites. L’étape a) du procédé selon l’invention peut donc être répétée plusieurs fois, de préférence entre 1 et 4 fois.
Dans les cultures en "batch", le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en "fed-batch" correspond quant à elle à une culture en "batch" avec une alimentation notamment en nutriments et/ou en milieu de culture.
Le modèle de bioréacteur utilisé pour la culture des cellules à l’étape a) n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut généralement cultiver des cellules animales. De préférence, le bioréacteur de l’étape a) a une contenance de 0,5 à 5000 L, plus préférablement de 0,5 à 500 L.
Les cultures selon l’invention sont conduites en bioréacteur avec les cellules en suspension dans un milieu de culture adapté dans des conditions contrôlées ou régulées, à savoir notamment l’agitation, la température, le pH, et l’oxygène dissous (DO). Des exemples spécifiques de bioréacteurs, de conditions de culture et de méthodes de propagation bien connus de la personne du métier peuvent être combinés de toute manière appropriée pour favoriser la différenciation ou l’engagement des cellules de départ dans le lignage érythroïde et peuvent être adaptées selon le type de cellules de départ.
La personne du métier est à même de sélectionner ou de préparer un milieu de culture adapté selon l’invention. A titre d’exemple de milieux de culture adaptés on peut citer ceux décrits dans la publication internationale WO2011/101468A1 et dans l’article Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079.
Le milieu de culture comprend généralement un milieu de culture basal pour cellule eucaryotes, tel qu’un milieu DMEM, IMDM, RPMI 1640, MEM ou DMEM/F1, lesquels sont bien connus de la personne du métier et largement disponibles commercialement.
Le milieu de culture peut également comprendre du plasma, en particulier dans une quantité de 0,5% à 6% (v/v).
Par ailleurs, divers cytokines, hormones et facteurs de croissance peuvent être compris dans le milieu de culture, ainsi que d'autres composés, notamment de bas poids moléculaire, qui agissent sur les cellules.
La personne du métier est à même d’adapter le milieu de culture en ajoutant certains composants ou en modulant les quantités de certains composants, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphore, du chlore, divers acides aminés, diverses vitamines, divers antioxydants, des acides gras, des sucres et analogues, du sérum bovin fœtal, du plasma humain, du sérum humain, du sérum de cheval, de la transferrine, de la lactoferrine, de l’héparine, du cholestérol, de l'éthanolamine, du sélénite de sodium, du monothioglycérol, du mercaptoéthanol, de l'albumine sérique bovine, de l'albumine sérique humaine, du pyruvate de sodium, du polyéthylène glycol, des poloxamères, des tensioactifs, des gouttelettes lipidiques, des antibiotiques de la gélose, du collagène, de la méthylcellulose, diverses cytokines, diverses hormones, divers facteurs de croissance, diverses petites molécules, diverses matrices extracellulaires et diverses molécules d'adhésion cellulaire.
Des exemples de cytokines comprises dans le milieu de culture comprennent l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-2 (IL-2), l'interleukine-3 (IL-3), l'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-5 (IL- 5), interleukine-6 (IL-6), interleukine-7 (IL-7), interleukine-8 (IL-8), interleukine-9 (IL-9), interleukine-10 (IL-10), interleukine- 11 (IL-11), interleukine-12 (IL-12), interleukine-13 (IL-13), interleukine-14 (IL-14), interleukine-15 (IL-15), interleukine-18 (IL-18) ), Interleukine-21 (IL-21), Interféron -Α (IFN-α), interféron-β (IFN-β), interféron-γ (IFN-γ), facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de monocytes (M-CSF), facteur de stimulation des colonies de cellules granulo-macrophagiques (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), facteur inhibiteur des cellules leucémiques (LIF), oncostatine M (OM), érythropoïétine (EPO), thrombopoïétine (TPO) Cependant, elle n'est pas limitée à ces derniers.
Les diverses petites molécules comprises dans le milieu de culture peuvent comprendre des antagonistes du récepteur d’aryl hydrocarbone comme la StemRegenin1 (SR1), des agonistes de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques comme l’UM171, et similaires, mais sans s’y limiter.
Les facteurs de croissance compris dans le milieu de culture peuvent comprendre le facteur de croissance transformant-α (TGF-α), le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), la protéine inflammatoire macrophage-la (MIP-1α), le facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF), facteur de croissance vasculo-endothélial (VEGF), facteur de croissance hépatocytaire (HGF), facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), protéase nexine I, protéase nexine II, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de différenciation cholinergique (CDF), diverses chimiokines, ligands Notch (tels que Delta1), Protéines Wnt, protéines de type angiopoïétine 2, 3, 5 ou 7 (Angpt 2, 3, 5, 7), facteurs de croissance de type insuline (GF), protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), la pléiotrophine, et similaires, mais sans s'y limiter.
Les hormones comprises dans le milieu de culture peuvent comprendre des hormones, notamment de la famille des glucocorticoïdes comme la dexaméthasone ou l’hydrocortisone, de la famille des hormones thyroïdiennes, comme la T3 et la T4, de l’ACTH, de l’alpha-MSH ou de l’insuline.
De préférence, afin de favoriser l’engagement ou la différenciation des cellules de départ dans le lignage érythroïde, le milieu de culture comprend au moins un facteur de différenciation érythrocytaire, en particulier sélectionné dans le groupe constitué de : facteur de cellules souches (SCF), interleukine-3 (IL-3), interleukine-6 (IL-6), interleukine-11 (IL-11), ligand flk2 / flt3 (FL), thrombopoïétine (TPO) et l'érythropoïétine (EPO), plus préférablement le milieu de culture comprend au moins un facteur de différenciation érythrocytaire sélectionné dans le groupe constitué de : facteur de cellule souche (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), interleukine-3 (IL-3), thrombopoïétine (TPO) et érythropoïétine (EPO), et encore plus préférablement le milieu de culture comprend un, deux ou trois facteurs de différenciation érythrocytaire sélectionnés dans le groupe constitué de SCF, IL-3 et EPO.
La concentration d'une cytokine ou d'un facteur de croissance dans le milieu de culture, notamment au moment de son ajout dans le milieu de culture, peut être fixée dans une plage dans laquelle la différenciation des cellules souches hématopoïétiques et/ou des cellules progénitrices hématopoïétiques en érythrocytes peut être obtenue, et généralement dans une plage de 0,1 ng/ml à 1000 ng/ml, de préférence de 1 ng/ml à 200 ng/ml.
La concentration d'une hormone dans le milieu de culture, notamment au moment de son ajout dans le milieu de culture, peut être fixée de manière appropriée dans une plage dans laquelle la différenciation des cellules souches hématopoïétiques et/ou des cellules progénitrices hématopoïétiques en les érythrocytes peut être obtenue, et généralement dans une plage de 0,1 ng/ml à 1000 µg/ml, de préférence de 1 µg/ml à 500 µg/ml.
De manière particulièrement préférée, le milieu de culture utilisé dans l’étape a) comprend un milieu de culture basal pour cellules eucaryotes, de l’héparine, notamment dans une concentration de 0,2 à 2 U/ml, du plasma, notamment dans une concentration de 0,5 à 6% (v/v), de la transferrine, notamment dans une concentration de 100 à 500 µg/ml, de l’Insuline, notamment dans une concentration de 1 à 15 µg/ml, du SCF, notamment dans une concentration de 50 à 300 ng/ml, de l’EPO, notamment dans une concentration de 1 à 5 UI/ml, de l’IL-3, notamment dans une concentration de 1 à 10 ng/ml et un glucocorticoïde, notamment dans une concentration de 0,5 à 5 µM.
De préférence, la culture de l’étape a) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 0,1 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 1 jour à 15 jours, plus préférablement de 3 jours à 10 jours, et encore plus préférablement de 6 à 8 jours.
De préférence, la température de culture de l’étape a) est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C.
De préférence, le pH de culture de l’étape a) est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7.
De préférence, la DO de culture de l’étape a) est comprise entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%.
De préférence, un renouvellement ou un apport de milieu neuf ou frais est réalisés au cours de l’étape a), notamment pour éviter une intoxication des cellules par des catabolites ou une pénurie de nutriments.
Etape b)
A la suite de(s) culture(s) en batch ou fed-batch de l’étape a), les cellules sont transférées dans un autre bioréacteur, opéré en perfusion (étape b)). L’étape b) a pour objet de multiplier les cellules cultivées et de terminer leur différenciation pour les amener jusqu’à un stade de réticulocyte énucléé.
La perfusion est une méthode de culture continue dans laquelle les cellules sont retenues dans le bioréacteur ou renvoyées dans le bioréacteur tandis que du milieu de culture usagé est évacué, compensé par l’addition de milieu de culture neuf ou frais. Le milieu usagé et évacué ne contient donc pas de cellules. Une concentration de cellules et un rendement en produits cellulaires plus élevés peuvent être atteints dans un bioréacteur à perfusion, pour un volume de réaction réduit, par rapport à un bioréacteur de type batch ou fed-batch.
L’étape b) est conduite dans un bioréacteur adapté à une culture par perfusion. De nombreux modèles de bioréacteurs adaptés pour la culture des cellules à l’étape b) sont connus de la personne du métier. De préférence, le bioréacteur comprend un moyen d’élimination du milieu de culture usagé qui permette de conserver les cellules cultivées. De préférence, ce moyen est sélectionné est du type spin-filter (filtre à spin ou rotatif), centrifugation continue, centrifugation discontinue, ou filtration tangentielle, plus préférentiellement le moyen est du type filtration tangentielle. Le bioréacteur de l’étape a de préférence une contenance de 1 à 5000 L.
De préférence, le bioréacteur utilisé à l’étape b) est ainsi un bioréacteur à filtration tangentielle, qui peut également comprendre une pompe à déplacement continu ou alternatif. De préférence, la pompe à déplacement continu ou alternatif est une pompe à faible cisaillement, ce qui permet de préserver les cellules.
De préférence, le bioréacteur de l’étape b), notamment le bioréacteur à filtration tangentielle, comprend d’un organe filtrant, qui peut notamment être une cassette de filtration ou un module de fibres creuses. De préférence, le bioréacteur de l’étape b) est un bioréacteur à filtration tangentielle équipé d’un organe filtrant comprenant un module de fibres creuses. De préférence, le seuil de coupure de l’organe filtrant permet de conserver les cellules au sein du bioréacteur. De préférence, le seuil de coupure de l’organe filtrant est de 1 kDa à 1.3 µm ou 500 kDa.
De préférence, le bioréacteur de l’étape b) comprend un moyen d’échange gazeux permettant de satisfaire les besoins en oxygène des cellules et de maîtriser le pH en contrôlant l’apport et/ou l’évacuation du dioxyde de carbone (CO2). De préférence, le moyen d’échange gazeux est à faible cisaillement.
De préférence, l’une au moins des conditions de culture suivantes, plus préférablement toutes, sont contrôlées ou régulées lors de l’étape b) :
- L’agitation ;
- Le pH ;
- La DO ;
- La température ;
- Le volume ou niveau du bioréacteur ;
- Le débit de perfusion ;
- L’apport en nutriments, notamment choisi parmi les glucides, les acides aminés, les vitamines et le fer ;
- L’apport en facteurs de croissance, notamment choisis parmi EPO, SCF, et Insuline ;
- L’encrassement du bioréacteur et le colmatage des organes filtrants.
De préférence, la culture de l’étape b) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 30 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, plus préférablement de 10 jours à 20 jours.
De préférence, également la culture de l’étape b) est poursuivie jusqu’à ce qu’au moins 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, plus préférablement au moins 50%, des cellules cultivées soient énucléées.
De préférence, la température de culture de l’étape b) est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C.
De préférence, le pH de culture de l’étape b) est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7.
De préférence, la DO de culture de l’étape b) est comprise entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%.
La description du milieu de culture donnée pour l’étape a) du procédé de l’invention s’applique également pour la présente étape b).
De manière particulièrement préférée, le milieu de culture utilisé dans l’étape b) comprend un milieu de culture basal pour cellules eucaryotes, de l’héparine, notamment dans une concentration de 0,2 à 2 U/ml, du plasma, notamment dans une concentration de 0,5 à 6% (v/v), de la transferrine, notamment dans une concentration de 100 à 500 µg/ml, de l’Insuline, notamment dans une concentration de 5 à 15 µg/ml, du SCF, notamment dans une concentration de 50 à 300 ng/ml, et de l’EPO, notamment dans une concentration de 1 à 5 UI/ml et éventuellement un glucocorticoïde, notamment dans une concentration de 0,5 à 5 µM.
Avantageusement, l’étape b) du procédé de l’invention permet de concentrer les cellules à des niveaux inatteignables en culture batch et fed-batch, c’est-à-dire au-delà de 30 millions de cellules/ml et jusqu’à 200 millions de cellules/ml. Avantageusement également, l’étape b) du procédé de l’invention permet de poursuivre la différenciation des cellules cultivées. Avantageusement, en fin de culture de l’étape b) le taux de cellules énucléées dépasse 50%.
Etape c)
Les cellules obtenues à l’étape b) sont ensuite purifiées lors de l’étape c) pour donner une population de globules rouges de culture. L’étape c) du procédé selon l’invention comprend deux opérations, une opération de tri particulaire et une opération de lavage. L’opération de lavage peut être effectuée indifféremment avant et/ou après l’opération de tri particulaire.
L’étape c) a pour objet :
- de trier les cellules pour concentrer au maximum les cellules énucléés ; et
- de laver les cellules pour éliminer les résidus potentiellement toxiques issus du procédé.
Le tri particulaire permet d’augmenter le taux de cellules énucléées, en éliminant notamment les érythroblastes et les éventuelles cellules myéloïdes résiduelles. Les érythroblastes sont des cellules cultivées qui ne se sont pas arrivées au stade de différenciation cellules énucléées, c’est-à-dire en réticulocytes ou globules rouges. Le tri particulaire permet également d’éliminer des déchets cellulaires, tels que des débris cellulaires, de l’ADN et des pyrénocytes.
Le tri particulaire selon l’invention peut comprendre au moins une opération sélectionnée dans le groupe constitué d’une filtration tangentielle, d’une filtration frontale et d’une élutriation.
La filtration tangentielle (ou «tangential-flow filtration») est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou « dead-end filtration ») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.
La filtration frontale est bien connue de la personne du métier. Son principe consiste à retenir les particules à éliminer à l'intérieur d’un réseau poreux constitutif du filtre. La filtration repose sur 4 mécanismes : (i) les forces d’adhésion particules/paroi, (ii) les forces d’adhésion entre particules, (iii) la gêne stérique et (iv) la force de trainée du fluide sur les particules. Son efficacité dépend notamment du matériau, des tailles des pores, du type d’enchevêtrement des fibres et du rapport surface de filtration sur quantité de matière à filtrer.
L'élutriation est une technique de séparation et d'analyse granulométrique de particules de tailles différentes. L’élutriation se base sur la loi de Stokes. On envoie dans une chambre un fluide contenant les cellules à une vitesse connue où les particules sont soumises à une force centrifuge maîtrisée. Ces dernières restent en suspension quand les deux forces (d’entraînement par le fluide et centrifuge) s’annulent.
De préférence, l’opération de tri particulaire selon l’invention comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation.
L’opération de lavage a notamment pour objet d’abaisser les quantités des composés toxiques potentiellement présents dans la culture de cellules de l’étape b) en-dessous de leur seuil de toxicité.
L’opération de lavage peut comprendre une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations.
La centrifugation est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité et de leur traînée en les soumettant à une force centrifuge unidirectionnelle et éventuellement à un flux opposé.
De préférence, l’étape de lavage selon l’invention comprend une succession d’opérations d’élutriation.
Les étapes de tri particulaire, de lavage et de formulation sont effectuées dans une période de temps inférieure à 72h, plus préférablement inférieure à 12h.
A l’issue de l’étape c) on obtient selon l’invention une population de globules rouges de culture.
Globules rouges de culture
De préférence, la population de globules rouges de culture obtenue par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, ou population de globules rouges de culture selon l’invention, est produite en 14 à 30 jours. Plus préférablement, la population de globules rouges de culture obtenue par la mise en œuvre de procédé selon l’invention est produite en environ 14 jours, environ 15 jours, environ 16 jours, environ 17 jours, environ 18 jours, environ 19 jours, environ 20 jours, environ 21 jours, environ 22 jours, environ 23 jours, environ 24 jours, environ 25 jours, environ 26 jours, environ 27 jours, environ 28 jours, environ 29 jours ou environ 30 jours.
Les globules rouges de culture selon l’invention ont des caractéristiques similaires à celles de réticulocytes natifs. Comme cela est bien connu de l’homme du métier, les réticulocytes dérivent des érythroblastes par énucléation. Cela est illustré par l’Exemple qui suit. Certains globules rouges de culture selon l’invention peuvent avoir des caractéristiques similaires à celles de globules rouges natifs.
De préférence, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques suivantes :
- Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30%, de préférence inférieur à 10%, plus préférablement inférieur à 5%, encore plus préférablement inférieur à 3% et le plus préférablement inférieur à 1% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50%, de préférence de 8% à 22% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50%, de préférence de 79% à 92% ;
- Eventuellement un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%, de préférence de 83% à 95% ;
- Un VGM de 80 fL à 160 fL, de préférence de 130 à 154 fL ;
- Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule, de préférence supérieure à 28 pg/cellule, plus préférablement supérieure à 32 pg/cellule et encore plus préférablement supérieure à 36 pg/cellule;
- Une CCMH supérieure à 19 g/dl, de préférence supérieure à 21 g/dl, plus préférablement supérieure à 23 g/dl et encore plus préférablement de 21 g/dl à 29 g/dl ;
- Une p50 de 18 à 28 mmHg, de préférence de 18 mmHg à 22 mmHg ;
- Eventuellement une proportion de HbA de 70% à 100%, de préférence de 74% à 86% ;
- Eventuellement une proportion de HbF de 0% à 30%, de préférence de 11,5% à 21% ;
- Eventuellement une proportion de HbA2 inférieure à 8%, de préférence de 2% à 5% ;
- Une proportion de HbCO de 0% à 10%, de préférence de 1,5% à 6,5% ;
- Une proportion de MetHb de 0% à 3%, de préférence inférieure à 0,5% ;
- Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs, de préférence de 81,5% à 85,5% de celle de globules rouges natifs ;
- Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb, de préférence de 7,5 µmol/g Hb à 10,5 µmol/g Hb.
De préférence, les caractéristiques ci-dessus comprennent :
- un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50%, de préférence de 8% à 22% ;
- un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50%, de préférence de 79% à 92% ;
- un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%, de préférence de 83% à 95%.
Comme la personne du métier le comprendra bien, lorsque les caractéristiques ci-dessus, ou deuxième liste de caractéristiques, sont ajoutées aux précédentes caractéristiques, ou première liste de caractéristiques, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou l’ensemble, des caractéristiques.
De préférence également, les caractéristiques ci-dessus comprennent :
- une proportion de HbA de 70% à 100%, de préférence de 74% à 86% ;
- une proportion de HbF de 0% à 30%, de préférence de 11,5% à 21% ;
- une proportion de HbA2 inférieure à 8%, de préférence de 2% à 5% ;
Comme la personne du métier le comprendra bien, lorsque les caractéristiques ci-dessus, ou troisième liste de caractéristiques, sont ajoutées aux précédentes caractéristiques, de la première liste de caractéristiques et le cas échéant de la deuxième liste de caractéristiques, les globules rouges de culture ou la population de globules rouges de culture selon l’invention, obtenus, susceptibles d’être obtenus ou pouvant être obtenus, par la mise en œuvre du procédé selon l’invention, présentent au moins 1, de préférence au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 et le cas échéant 13, 14, ou l’ensemble, des caractéristiques.
Les pourcentages (en nombre) de cellules Hoechst+, CD36+, CD71+, et marquées au thiazole orange (TO+) peuvent être déterminée par cytométrie en flux, selon des techniques bien connues de la personne du métier, notamment à l’aide d’un appareil FACSCalibur (BD Biosciences) avec le logiciel Cell Quest.
Les mesures de VGM, CCMH et TCMH sont des mesures standards d’hématologie déterminables par des automates commerciaux, tel que le XN 9100 (Sysmex).
La p50 ou pression partielle d'oxygène pour laquelle la saturation de l'hémoglobine en oxygène est de 50% peut être déterminée par des techniques bien connues de la personne du métier et notamment à l’aide d’un appareil Hemox Analyzer (TCS).
Les pourcentages (m/m) de HbA, HbF et HbA2 se rapportent respectivement à la quantité (en masse) de l’hémoglobine (Hb) considérée rapportée à la quantité totale d’hémoglobine (en masse). Ces pourcentages peuvent être déterminés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne échangeuse de cations, notamment comme cela est décrit par Ou & Rognerud (1993) « Rapid analysis of hemoglobin variants by cation-exchange HPLC »Clinical Chemistry39: 820–824 (incorporé ici par référence).
Les pourcentages (m/m) de HbCO, c’est-à-dire d’hémoglobine fixée au monoxyde de carbone, et de MetHb, c’est-à-dire de méthémoglobine, peuvent être déterminés par des techniques bien connues de la personne du métier, notamment à l’aide d’un analyseur de gaz du sang, tel que le Rapidlab (Siemens)
Le pourcentage de déformabilité peut être déterminé à l’aide de l’équipement LORRCA, notamment comme cela est décrit dans l’article Giarratanaet al. (2011) «Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells», Blood 118:5071–5079 (incorporé ici par reference), page 5072, paragraphe « Deformability measurements ». La déformabilité est exprimée en pourcentage de la déformabilité des globules rouges de culture rapportée à la déformabilité de globules rouges natifs, c’est dire de globules rouges de sang périphérique d’un donneur de même espèce que les globules rouges de culture, en particulier un donneur humain, notamment adulte, pour des globules rouges de culture humains.
La teneur en ATP peut être déterminée par colorimétrie ou fluorimétrie, notamment par mesure du produit de la réaction du glycérol avec l’ATP dont la quantité mesurable par colorimétrie ou fluorimétrie est proportionnelle à la quantité d’ATP, par exemple à l’aide d’un kit MAK190 (Sigma). La teneur en ATP est exprimée en µmol et rapportée à la quantité totale (en g) d’hémoglobine.
Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, la population de globules rouges de culture selon l’invention est une population de cellules humaines.
Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, la population de globules rouges de culture selon l’invention a un ou plusieurs groupes sanguins choisis parmi A +, A-, B +, B-, AB +, AB-, O + et O-.
Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, les globules rouges de culture selon l’invention ont un groupe sanguin rare ou universel.
Selon un mode de réalisation de l’invention, la population de globules rouges de culture selon l’invention est formulée dans une solution de conservation de globules rouges. Toute formulation connue dans l’état de la technique pour la conservation d’une population de globules rouges peut être utilisée.
Application thérapeutique
Tout excipient ou véhicule pharmaceutiquement acceptable connu dans l’état de la technique qui est approprié pour une utilisation avec des globules rouges peut être utilisé. A titre d’exemple, l'excipient ou le véhicule pharmaceutiquement acceptable est une solution saline à pH équilibré.
Les compositions pharmaceutiques selon l’invention peuvent également comprendre une ou plusieurs protéines exogènes d'intérêt utiles dans la prévention, le traitement ou le diagnostic d'une ou plusieurs maladies ou troubles, notamment en lien avec un déficit ou une carence de globules rouges ou d’hémoglobine fonctionnelle.
Toute formulation connue dans l’état de la technique pour l'administration à un individu d'une composition pharmaceutique contenant une population de globules rouges peut être utilisée. De préférence, la composition pharmaceutique selon l’invention est formulée sous forme d’une poche de transfusion sanguine.
L’individu selon l’invention est un animal, de préférence un mammifère, plus préférablement un humain.
L’invention sera davantage explicitée à l’aide de l’Exemple non limitatif qui suit.
Exemple
Les globules rouges de culture obtenus par la mise en œuvre du procédé selon l’invention ont été comparés à des globules rouges natifs, plus particulièrement à des réticulocytes de sang placentaire.
Brièvement, les cellules mises en cultures selon l’invention sont des cellules nucléées totales collectées par cytaphérèse sur des donneurs volontaires préalablement mobilisés au G-CSF.
L’étape a) du procédé selon l’invention est conduite sur 7 jours en fed-batch à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2et dans un milieu de culture adapté de celui décrit par Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079 pour la première étape de la procédure d’expansion décrite dans l’article (page 5072). A la moitié de la durée de l’étape a) du milieu de culture frais est ajouté à la culture de façon à diluer la culture au demi (on ajoute le même volume de milieu de culture que le volume présent initialement).
L’étape b) du procédé selon l’invention est conduite sur 15 jours dans un bioréacteur à perfusion à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2, avec un milieu de culture semblable à celui de l’étape a) à l’exception de l’IL-3 et du glucocorticoïde qui sont absents. Des apports ponctuels de SCF et d’EPO sont également réalisés ainsi qu’un apport continu en fer.
L’étape c) du procédé selon l’invention est conduite en effectuant un tri particulaire par une succession de filtrations frontales, suivi du lavage de cellules par élutriation.
Les caractéristiques de la population de globules rouges de culture obtenues ont été déterminées et sont résumées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Les moyennes et écart-types obtenus lors des cultures sont comparées aux valeurs attendues pour des réticulocytes natifs. Ces indicateurs permettent de vérifier que :
- Les phénotypes exprimés correspondent bien à ceux des réticulocytes (CD71 et CD36) ;
- La présence d’acides nucléiques résiduels correspond bien au statut de réticulocytes (TO) ;
- Les cellules ont une quantité d’hémoglobine suffisante et fonctionnelle pour assurer le transport de l’oxygène (TGM, CCMH, HbF, HbA, HbA 2 et P50) ;
- Les teneurs en HbCO et MetHb sont contenues dans les normes physiologiquement admises des individus sains ;
- Les cellules ont une réserve d’énergie suffisante pour assurer le maintien (ATP) ;
- Les cellules sont déformables et de taille raisonnable pour assurer une bonne circulation sanguine (Déformabilité, VGM) ;
La seule différence significative avec les réticulocytes natifs étudiés est la teneur inversée en Hb fœtale et adulte. Cette différence se justifie par le fait que les globules rouges de culture sont désormais produits à partir de cellules souches adultes (et contiennent donc en majorité de l’hémoglobine adulte), quand les réticulocytes témoins proviennent de sang placentaire (et contiennent donc en majorité de l’hémoglobine fœtale).
Tous ces critères ont été mesurés systématiquement sur pour plusieurs mises en œuvre de procédé selon l’invention, ce qui permet de faire une étude de stabilité du procédé (voir colonne CV : coefficient de variation). Ces résultats montrent que les globules rouges de synthèse ont des caractéristiques très proches de réticulocytes natifs (excepté la répartition entre HbA et HbF qui est inversée). En outre, le procédé est stable en comparaison de la variabilité des mesures faites sur des réticulocytes natifs.
Le procédé selon l’invention produit des globules rouges de culture ayant des caractéristiques proches de réticulocytes natifs. En outre, la faible variabilité des mesures effectuées indique que le risque de s’éloigner des caractéristiques de réticulocytes natifs est faible
Par ailleurs, le procédé selon l’invention permet d’améliorer significativement la concentration de globules rouges de culture dans la population obtenue avec de l’ordre de 50 à 130 millions de cellules par ml contre moins de 5 millions de cellules par ml avec le procédé de l’état de la technique décrit par Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079.
On estime en outre qu’alors qu’il faudrait de l’ordre 9000 flasques de 175 cm2tels que ceux utilisés dans l’article Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079 pour produire une unité de transfusion de globules rouges de culture, ce qui souligne la difficile mise en œuvre industrielle du procédé de l’état de la technique, la mise en œuvre du procédé selon l’invention permettrait d’obtenir la même quantité de globules rouges de culture en une fois à l’aide d’un bioréacteur à perfusion d’un contenance de quelques dizaines de litre.
Claims (13)
- Procédé de production de globules rouges de culture à partir de cellules souches ou de cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, comprenant les étapes suivantes :
a) au moins une culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch des cellules ;
b) culture en bioréacteur de type perfusion des cellules obtenues à l'étape a) ;
c) Lavage et tri particulaire des cellules obtenues à l’étape b) ;
pour obtenir une population de globules rouges de culture,
les cellules souches n’étant pas des cellules souches embryonnaires humaines. - Procédé de production de globules rouges de culture selon la revendication 1, dans lequel les cellules sont des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes (iPSC) ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP).
- Procédé de production de globules rouges de culture selon la revendication 1, dans lequel lesdites cellules sont des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, de préférence sélectionnées parmi les progéniteurs érythroïdes ou les précurseurs érythroïdes précoces.
- Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les cellules proviennent de sang de cordon ombilical/placentaire, de sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse.
- Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la culture de l’étape a) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 0,1 million de cellules/ml, de préférence cette période de temps est de 1 à 15 jours, plus préférablement de 3 à 10 jours.
- Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la culture de l’étape b) est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration des cellules à un niveau supérieur à 30 millions de cellules/ml, de préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, de manière encore plus préférentielle de 10 jours à 20 jours.
- Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le tri particulaire comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation.
- Procédé de production de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le lavage comprend une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations.
- Population de globules rouges de culture susceptible d’être obtenue par la mise en œuvre du procédé tel que défini dans l’une quelconque des revendications 1 à 8.
- Population de globules rouges de culture selon la revendication 9, présentant au moins 6, de préférence l'ensemble, des caractéristiques suivantes :
- Un pourcentage de Hoechst+ inférieur à 30% ;
- Un VGM de 80 fL à 160 fL ;
- Une TCMH supérieure à 24 pg/cellule ;
- Une CCMH supérieure à 19 g/dl ;
- Une p50 de 18 à 28 mmHg ;
- Une proportion de HbCO de 0% à 10% ;
- Une proportion de MetHb de 0% à 3% ;
- Une déformabilité supérieure à 75% de celle de globules rouges natifs ;
- Une teneur en ATP de 4 à 12 µmol/g Hb.
- Population de globules rouges de culture selon la revendication 9 ou 10, dans laquelle les caractéristiques comprennent également :
- un pourcentage de cellule CD36+ inférieur à 50% ;
- un pourcentage de cellules CD71+ supérieur à 50% ;
- un pourcentage de cellules marquées au thiazole orange supérieur à 50%.
- Population de globule rouges de culture selon l’une des revendications 9 à 11, dans laquelle les caractéristiques comprennent également :
- une proportion de HbA de 70% à 100% ;
- une proportion de HbF de 0% à 30% ;
- une proportion de HbA2 inférieure à 8%.
- Composition pharmaceutique comprenant une population de globules rouges de culture selon l’une quelconque des revendications 9 à 12 à titre de substance active, éventuellement en association avec au moins un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR2009679A FR3114323A1 (fr) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Procédé de production de globules rouges de culture |
| EP21770115.0A EP4217468A1 (fr) | 2020-09-23 | 2021-09-23 | Procédé de production de globules rouges de culture |
| US18/246,471 US20230383256A1 (en) | 2020-09-23 | 2021-09-23 | Process for producing cultured red blood cells |
| PCT/EP2021/076259 WO2022063928A1 (fr) | 2020-09-23 | 2021-09-23 | Procédé de production de globules rouges de culture |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR2009679A FR3114323A1 (fr) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Procédé de production de globules rouges de culture |
| FR2009679 | 2020-09-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3114323A1 true FR3114323A1 (fr) | 2022-03-25 |
Family
ID=74871441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR2009679A Pending FR3114323A1 (fr) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | Procédé de production de globules rouges de culture |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230383256A1 (fr) |
| EP (1) | EP4217468A1 (fr) |
| FR (1) | FR3114323A1 (fr) |
| WO (1) | WO2022063928A1 (fr) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455306B1 (en) * | 2000-06-09 | 2002-09-24 | Transcyte, Inc. | Transfusable oxygenating composition |
| WO2011101468A1 (fr) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Milieu de culture de cellules pour la croissance et la différenciation de cellules du lignage hématopoïétique |
| WO2020243006A1 (fr) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Rubius Therapeutics, Inc. | Procédés de génération de cellules érythroïdes énucléées |
-
2020
- 2020-09-23 FR FR2009679A patent/FR3114323A1/fr active Pending
-
2021
- 2021-09-23 US US18/246,471 patent/US20230383256A1/en active Pending
- 2021-09-23 WO PCT/EP2021/076259 patent/WO2022063928A1/fr unknown
- 2021-09-23 EP EP21770115.0A patent/EP4217468A1/fr active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455306B1 (en) * | 2000-06-09 | 2002-09-24 | Transcyte, Inc. | Transfusable oxygenating composition |
| WO2011101468A1 (fr) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6) | Milieu de culture de cellules pour la croissance et la différenciation de cellules du lignage hématopoïétique |
| WO2020243006A1 (fr) * | 2019-05-24 | 2020-12-03 | Rubius Therapeutics, Inc. | Procédés de génération de cellules érythroïdes énucléées |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| AINSI, GIARRATANA ET AL.: "Proof of principle for transfusion of in vitro-generated red blood cells", BLOOD, vol. 118, 2011, pages 507 1 - 5079 |
| ALLENBY MARK C ET AL: "Dynamic human erythropoiesis in a three-dimensional perfusion bone marrow biomimicry", BIOMATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 188, 8 August 2018 (2018-08-08), pages 24 - 37, XP085524581, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2018.08.020 * |
| CHUNG ET AL.: "Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction", CELL STEM CELL, 2008 |
| GIARRATANA ET AL.: "Proof of principlefor transfusion of in vitro-generated red blood cells", BLOOD, vol. 118, 2011, pages 5071 - 5079, XP055258936, DOI: 10.1182/blood-2011-06-362038 |
| M.-C. GIARRATANA ET AL: "Proof of principle for transfusion of in vitro-generated red blood cells", BLOOD, vol. 118, no. 19, 10 November 2011 (2011-11-10), US, pages 5071 - 5079, XP055258936, ISSN: 0006-4971, DOI: 10.1182/blood-2011-06-362038 * |
| OUROGNERUD: "Rapid analysis of he-moglobin variants by cation-exchange HPLC", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 39, 1993, pages 820 - 824 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20230383256A1 (en) | 2023-11-30 |
| WO2022063928A1 (fr) | 2022-03-31 |
| EP4217468A1 (fr) | 2023-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101216201B1 (ko) | 줄기세포 및 전구세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 | |
| US20100129440A1 (en) | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use | |
| WO2008149129A1 (fr) | Expansion cellulaire | |
| KR20050000400A (ko) | 줄기 및 전구 세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 | |
| FR3114323A1 (fr) | Procédé de production de globules rouges de culture | |
| EP4308689A1 (fr) | Procédé de production de cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique | |
| WO2023036883A1 (fr) | Procédé de production de cellules de culture à haute densité | |
| WO2023237770A1 (fr) | Procede de culture de cellules necessitant un apport en fer | |
| US11951136B2 (en) | Preservation of pancreatic islet grafts in the extrahepatic space | |
| WO2024018018A1 (fr) | Utilisation d'un composé vitisine pour la production de cellules hématopoïétiques | |
| Chaudhari et al. | Human Umbilical Cord Blood Therapy for Diabetes Mellitus: A Review | |
| EP1789089A2 (fr) | Compositions et traitements utilisant des cellules activees ex vivo pour patients presentant une myelosuppression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20220325 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |