FR3136483A1 - Procede de culture de cellules necessitant un apport en fer - Google Patents

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Guillaume Rousseau
Mathilde MAËSTRALI
Fanny RASSCHAERT
Marie-Catherine Giarratana
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Erypharm
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Abstract

PROCEDE DE CULTURE DE CELLULES NECESSITANT UN APPORT EN FER La présente invention concerne un procédé de culture de cellules de culture nécessitant un apport en fer, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un milieu de culture dont la capacité anti-oxydante est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM. (pas de figure)

Description

PROCEDE DE CULTURE DE CELLULES NECESSITANT UN APPORT EN FER Domaine de l’invention
La présente invention concerne un procédé de culture de cellules nécessitant un apport en fer, ainsi qu’un milieu de culture destiné à la culture de cellules de culture nécessitant un apport en fer.
 Arrière-plan technique
Il est connu que, lors de leur conservation, les globules rouges destinés à la transfusion sanguine subissent une hémolyse.
Parmi les solutions pour résoudre ce problème, Sparrowet al. (2014)Transfusion 54:560-568 ont proposé de remplacer la solution de conservation SAGM (NaCl 150 mM, Adénine 1,25 mM, Glucose 45 mM et Mannitol 30 mM) par la solution de conservation AS-1 (NaCl 154 mM, Adénine mM, Glucose 111 mM et Mannitol 41 mM). En effet, les globules rouges conservés dans la solution AS-1 présentent une hémolyse significativement inférieure à partir du 14èmejour de conservation par rapport aux globules rouges conservés dans la solution SAGM.
Toutefois, une hémolyse se produit encore en solution AS-1 qu’il est important de pouvoir réduire.
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que dans le cadre d’un procédé de culture de globules rouges de culture, l’ajout, au milieu de culture, de l’agent anti-oxydant Trolox, à la concentration de 100 µM, permettait d’améliorer le rendement de conservation des globules rouges après culture ainsi que de diminuer les pertes cellulaires en fin de culture.
La présente invention concerne un procédé de culture de cellules de culture nécessitant un apport en fer, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un milieu de culture dont la capacité anti-oxydante est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM, en particulier à 50 µM.
La présente invention concerne également un milieu de culture destiné à la culture de cellule nécessitant un apport en fer, dont la capacité anti-oxydante est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM, en particulier à 50 µM, et est notamment inférieure à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 250 µM.
Dans un mode de réalisation préféré du procédé de culture et du milieu de culture selon l’invention, le milieu de culture comprend au moins un agent anti-oxydant.
Avantageusement, le milieu de culture selon l’invention permet de réduire les pertes cellulaires des cellules de culture, notamment des globules rouges de culture, en fin de culture, et/ou d’améliorer le rendement de conservation des cellules de culture, notamment des globules rouges de culture.
Description de l’invention
A titre préliminaire, on rappellera que le terme « comprenant » signifie « incluant », « contenant » ou « englobant », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un élément ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet.A contrario, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un élément ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés.
Procédé de culture
Le procédé de culture selon l’invention peut être en mode discontinu (« batch »), en mode discontinu alimenté (« fed-batch ») ou par perfusion.
La perfusion est une méthode de culture continue dans laquelle les cellules sont retenues dans le bioréacteur ou mises en circulation et renvoyées dans le bioréacteur tandis que du milieu de culture usagé est évacué, compensé par l’addition d’un liquide de perfusion permettant de renouveler le milieu de culture. Le milieu de culture usagé et évacué ne contient donc pas de cellules.
Comme on l’entend ici, un procédé de culture par perfusion comprend au moins une étape de culture dans un réacteur à perfusion.
De préférence, le procédé de culture selon l’invention est un procédé de culture par perfusion.
L’étape de culture dans un bioréacteur à perfusion selon l’invention a pour but de multiplier les cellules cultivées et, dans le cas de la production de globules rouges de culture, de terminer leur différenciation pour les amener jusqu’à un stade de réticulocyte, cellule énucléée correspondant à un globule rouge jeune ou non mature, ou jusqu’à un stade de globule rouge mature.
La culture est conduite dans un bioréacteur adapté à une culture en perfusion. De nombreux modèles de bioréacteurs adaptés pour la culture des cellules par perfusion sont connus de la personne du métier.
Le bioréacteur a de préférence une contenance de 0,5 à 5000 L. De préférence, le bioréacteur a une contenance d’au moins 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000 ou 4000 L. De préférence, le bioréacteur à une contenance d’au plus 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 L.
De préférence, le bioréacteur comprend un moyen d’échange gazeux permettant de satisfaire les besoins en oxygène des cellules et de maîtriser le pH en contrôlant l’apport et/ou l’évacuation du dioxyde de carbone (CO2). De préférence, le moyen d’échange gazeux est à faible cisaillement.
De préférence, l’une au moins des conditions de culture suivantes, plus préférablement toutes, sont contrôlées ou régulées :
  • L’agitation ;
  • Le pH ;
  • L’oxygène dissous (DO) ;
  • La température ;
  • Le volume ou niveau du bioréacteur ;
  • Le débit de perfusion ;
  • L’apport en nutriments, notamment choisi parmi les glucides, les acides aminés, les vitamines et le fer ;
  • L’apport en facteurs de croissance, en cytokines et/ou en hormones ;
  • L’encrassement du bioréacteur et le colmatage des organes filtrants.
De préférence, la culture est effectuée pendant une période de temps suffisante pour obtenir une concentration de cellules supérieure à 30 millions de cellules/ml. De préférence cette période de temps est de 5 jours à 25 jours, plus préférablement de 10 jours à 20 jours.
De préférence, la température de culture est comprise entre 33°C et 40°C, plus préférablement entre 35°C et 39°C, et encore plus préférablement entre 36°C et 38°C.
De préférence, le pH de culture est compris entre 7 et 8, plus préférablement entre 7,2 et 7,7.
De préférence, la DO de culture est compris entre 1% et 100%, plus préférablement entre 10% et 100%.
Avantageusement, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion permet de concentrer les cellules de culture à des niveaux inatteignables en culture batch et fed-batch, c’est-à-dire au-delà de 30 millions de cellules/ml et jusqu’à 200 millions de cellules/ml. Avantageusement également, l’étape de culture en bioréacteur à perfusion du procédé de l’invention peut permettre d’effectuer une différenciation des cellules cultivées. Avantageusement, dans le cas de la production de globules rouges de culture, le taux de cellules énucléées en fin de culture de l’étape de culture en bioréacteur à perfusion dépasse 50%, 60%, 70% ou 80%.
Dans un mode de réalisation de l’invention l’étape de culture par perfusion selon l’invention est précédée d’au moins une étape de culture en bioréacteur de type batch (par lot) ou fed-batch (par lot alimenté).
Dans les cultures en « batch », le milieu n'est pas renouvelé, les cellules ne disposent ainsi que d'une quantité limitée d'éléments nutritifs. La culture en « fed-batch » correspond quant à elle à une culture en « batch » avec une alimentation notamment en nutriments et/ou en milieu de culture.
La ou les étapes de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch ont pour intérêt de réaliser une pré-amplification des cellules à cultiver et, dans le cas de la production de globules rouges de culture, d’engager ou de différencier les cellules de départ, ou de renforcer leur engagement ou leur différenciation, dans le lignage érythroïde.
Ainsi, dans le cas de la production de globules rouges de culture, on peut, dans un mode de réalisation de l’invention, poursuivre l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch jusqu’à ce que les cellules cultivées soient engagées dans le lignage érythroïde. Selon ce mode de réalisation de l’invention, on considère que des cellules sont suffisamment engagées dans le lignage érythroïde lorsqu’elles présentent une ou plusieurs caractéristiques spécifiques du lignage érythroïde, telles qu’un pourcentage de cellules présentant le marqueur CD235, mesurable par exemple par cytométrie en flux, supérieur à 50%, ou un pourcentage de cellules de phénotype érythroïde, mesurable par exemple par comptage cytologique après coloration au colorant May-Grünwald Giemsa, supérieur à 50%.
Une ou plusieurs cultures successives, ou itératives, en bioréacteur de type batch ou fed-batch peuvent être conduites, par exemple entre 1 et 4 fois.
Le modèle de bioréacteur de type batch ou fed-batch n'est pas particulièrement limité tant qu'il peut généralement cultiver des cellules animales. De préférence, le bioréacteur de type batch ou fed-batch a une contenance de 0,5 à 5000 L, plus préférablement de 0,5 à 500 L.
Dans un mode de réalisation de l’invention, le procédé de production de cellules de culture selon l’invention comprend une étape de purification des cellules de cultures obtenues après l’étape de culture en bioréacteur à perfusion.
L’étape de purification a pour objet :
- de laver les cellules pour éliminer les résidus potentiellement toxiques issus du procédé ; et
- dans le cas de la production de globules rouges de culture, de trier les cellules pour concentrer au maximum les cellules énucléées.
L’étape de purification peut comprendre une ou plusieurs opérations, notamment une opération de tri particulaire et une opération de lavage. L’opération de lavage peut être effectuée indifféremment avant et/ou après l’opération de tri particulaire.
Dans le cas de la production de globules rouges de culture, le tri particulaire permet d’augmenter le taux de cellules énucléées, en éliminant notamment les érythroblastes et les éventuelles cellules myéloïdes résiduelles. Les érythroblastes sont des cellules cultivées qui ne se sont pas arrivées au stade de différenciation de cellules énucléées, c’est-à-dire en réticulocytes ou globules rouges. Le tri particulaire permet également d’éliminer des déchets cellulaires, tels que des débris cellulaires, de l’ADN et des pyrénocytes.
Le tri particulaire selon l’invention peut comprendre au moins une opération sélectionnée dans le groupe constitué d’une filtration tangentielle, d’une filtration frontale et d’une élutriation.
La filtration tangentielle (ou «tangential-flow filtration») est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de filtration permettant de séparer les particules d'un liquide en fonction leur taille. En filtration tangentielle, le flux de liquide est parallèle au filtre, contrairement à la filtration frontale (ou «dead-end filtration») dans laquelle le flux de liquide est perpendiculaire au filtre. C'est la pression du fluide qui permet à celui-ci de traverser le filtre. Ceci a pour conséquence que les particules assez petites passent au travers du filtre alors que celles qui sont de taille trop importante continuent leur route via le flux de liquide.
La filtration frontale est bien connue de la personne du métier. Son principe consiste à retenir les particules à éliminer à l'intérieur d’un réseau poreux constitutif du filtre. La filtration repose sur 4 mécanismes : (i) les forces d’adhésion particules/paroi, (ii) les forces d’adhésion entre particules, (iii) la gêne stérique et (iv) la force de trainée du fluide sur les particules. Son efficacité dépend notamment du matériau, des tailles des pores, du type d’enchevêtrement des fibres et du rapport surface de filtration sur quantité de matière à filtrer.
L'élutriation est une technique de séparation et d'analyse granulométrique de particules de tailles différentes. L’élutriation se base sur la loi de Stokes. On envoie dans une chambre un fluide contenant les cellules à une vitesse connue où les particules sont soumises à une force centrifuge maîtrisée. Ces dernières restent en suspension quand les deux forces (d’entraînement par le fluide et centrifuge) s’annulent.
De préférence, l’opération de tri particulaire selon l’invention comprend une succession de filtrations frontales et éventuellement d’élutriation.
L’opération de lavage a notamment pour objet d’abaisser les quantités des composés toxiques potentiellement présents dans la culture de cellules en bioréacteur à perfusion en-dessous de leur seuil de toxicité.
L’opération de lavage peut comprendre une ou plusieurs centrifugations et/ou une ou plusieurs élutriations.
La centrifugation est bien connue de la personne du métier. Il s’agit d’un procédé de séparation des composés d'un mélange en fonction de leur différence de densité et de leur traînée en les soumettant à une force centrifuge unidirectionnelle et éventuellement à un flux opposé.
De préférence, l’étape de lavage selon l’invention comprend une succession d’opérations d’élutriation.
Les étapes de tri particulaire, de lavage et de formulation sont effectuées dans une période de temps inférieure à 72h, plus préférablement inférieure à 12h.
Milieu de culture
La personne du métier est à même de sélectionner ou de préparer un milieu de culture adapté selon l’invention. A titre d’exemple de milieux de culture adaptés on peut citer ceux décrits dans la publication internationale WO2011/101468A1 et dans l’article Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”, Blood 118:5071–5079.
Le milieu de culture comprend généralement un milieu de culture basal pour cellule eucaryotes, tel qu’un milieu DMEM, IMDM, RPMI 1640, MEM ou DMEM/F12, lesquels sont bien connus de la personne du métier et largement disponibles commercialement.
Le milieu de culture ou le liquide de perfusion peut également comprendre du plasma, en particulier dans une quantité de 0,5% à 6% (v/v).
De préférence, le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprend en outre des nutriments et des facteurs de croissance, des cytokines et/ou des hormones.
Ainsi, la personne du métier est à même d’adapter le milieu de culture et le liquide de perfusion en ajoutant certains composants ou en modulant les quantités de certains composants, notamment du sodium, du potassium, du calcium, du magnésium, du phosphore, du chlore, divers acides aminés, divers nucléosides, diverses vitamines, divers antioxydants, des acides gras, des sucres et analogues, du sérum bovin fœtal, du plasma humain, du sérum humain, du sérum de cheval, de l’héparine, du cholestérol, de l'éthanolamine, du sélénite de sodium, du monothioglycérol, du mercaptoéthanol, de l'albumine sérique bovine, de l'albumine sérique humaine, du pyruvate de sodium, du polyéthylène glycol, des poloxamères, des tensioactifs, des gouttelettes lipidiques, des antibiotiques, de la gélose, du collagène, de la méthylcellulose, diverses cytokines, diverses hormones, divers facteurs de croissance, diverses petites molécules, diverses matrices extracellulaires et diverses molécules d'adhésion cellulaire.
Des exemples de cytokines comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion comprennent l'interleukine-1 (IL-1), l'interleukine-2 (IL-2), l'interleukine-3 (IL-3), l'interleukine-4 (IL-4), l'interleukine-5 (IL- 5), interleukine-6 (IL-6), interleukine-7 (IL-7), interleukine-8 (IL-8), interleukine-9 (IL-9), interleukine-10 (IL-10), interleukine- 11 (IL-11), interleukine-12 (IL-12), interleukine-13 (IL-13), interleukine-14 (IL-14), interleukine-15 (IL-15), interleukine-18 (IL-18) ), Interleukine-21 (IL-21), Interféron -Α (IFN-α), interféron-β (IFN-β), interféron-γ (IFN-γ), facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de monocytes (M-CSF), facteur de stimulation des colonies de cellules granulo-macrophagiques (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF), ligand flk2 / flt3 (FL), facteur inhibiteur des cellules leucémiques (LIF), oncostatine M (OM), érythropoïétine (EPO), thrombopoïétine (TPO) Cependant, elle n'est pas limitée à ces derniers.
Les diverses petites molécules comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des antagonistes du récepteur d’aryl hydrocarbone comme la StemRegenin1 (SR1), des agonistes de l’auto-renouvellement des cellules souches hématopoïétiques comme l’UM171, et similaires, mais sans s’y limiter.
Les facteurs de croissance compris dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre le facteur de croissance transformant-α (TGF-α), le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), la protéine inflammatoire macrophage-la (MIP-1α), le facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance des fibroblastes-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF), facteur de croissance vasculo-endothélial (VEGF), facteur de croissance hépatocytaire (HGF), facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), protéase nexine I, protéase nexine II, facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), facteur de différenciation cholinergique (CDF), diverses chimiokines, ligands Notch (tels que Delta1), Protéines Wnt, protéines de type angiopoïétine 2, 3, 5 ou 7 (Angpt 2, 3, 5, 7), facteurs de croissance de type insuline (GF), protéine de liaison au facteur de croissance analogue à l'insuline (IGFBP), la pléiotrophine, et similaires, mais sans s'y limiter.
Les hormones comprises dans le milieu de culture ou le liquide de perfusion peuvent comprendre des hormones, notamment de la famille des glucocorticoïdes comme la dexaméthasone ou l’hydrocortisone, de la famille des hormones thyroïdiennes, comme la T3 et la T4, de l’ACTH, de l’alpha-MSH ou de l’insuline.
De préférence, notamment en cas de production de globules rouges de culture, le bioréacteur est alimenté, notamment via le liquide de perfusion, par une source de fer ferrique. Plus préférablement, la source de fer ferrique est un complexe de fer ferrique et d’un agent chélatant, notamment le citrate.
De préférence, le milieu de culture comprend de la transferrine, notamment recombinante. De préférence, la concentration en transferrine dans le bioréacteur est de 10 à 3 000 µg/ml, plus préférablement de 10 à 500 µg/ml.
Capacité anti-oxydante
La personne du métier connait bien les méthodes pour déterminer la capacité anti-oxydante d’une solution, notamment d’un milieu de culture, et la comparer à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox. Une méthode pouvant être utilisée est par exemple décrite dans l’article Marcet al. (2004)Med Sci(Paris)20:458-463. Par ailleurs, des tests commerciaux sont disponibles, par exemple OxiSelect™ (Cell Biolabs, Inc).
A titre d’exemple, la capacité anti-oxydante d’une solution peut être déduite de sa capacité à inhiber le radical ABTS•+, obtenu à partir de l’ABTS (sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)) comparativement à une solution d’un antioxydant de référence : le Trolox (acide 6- hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique). L’obtention du radical cation résulte du contact de l’ABTS avec une enzyme de peroxydation, tel que la peroxydase de raifort, en présence de H2O2ou d’un oxydant, tel que le dioxyde de manganèse ou persulfate de potassium. Le radical ABTS•+, en contact avec un donneur de H• conduit à l’ABTS+ et à la décoloration à 734 nm de la solution. D’autres auteurs utilisent l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique), ou ABTS•-, à la place de son sel d’ammonium et analysent l’inhibition du radical ABTS•-, produit par un initiateur de radicaux thermolabiles, l’ABAP (2,2’-azobis-(2-amidinopropane)HCl). La cinétique de réaction de la solution anti-oxydante étudiée doit être examinée préalablement pour déterminer la fin de réaction.
Comme la personne du métier le comprendra bien on compare la capacité anti-oxydante d’un volume du milieu de culture à la capacité anti-oxydante d’un même volume de la solution de Trolox.
De préférence, la capacité anti-oxydante du milieu de culture est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM, 75 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM ou 250 µM.
De préférence, la capacité anti-oxydante du milieu de culture est inférieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 1000 µM, 750 µM, 500 µM, 400 µM, 300 µM, 250 µM, 200 µM, 150 µM ou 100 µM.
De préférence, la capacité anti-oxydante du milieu de culture est égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox de 10 µM à 500 µM, de 10 µM à 250 µM, ou de 75 µM à 150 µM.
Agent anti-oxydant
L’agent anti-oxydant est de préférence hydrosoluble.
De préférence, l’agent antioxydant est sélectionné dans le groupe constitué d’un analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E, d’un caroténoïde, notamment le béta-carotène ou le lycopène, de l’acide ascorbique, du sélénium, du glutathion (GSH), du β-mercaptoéthanol, de l’acide urique, de l’uracile, de la N-actéyl-cystéine, du tempol, du NADPH, du NADH, de l’astaxanthine, de la lutéine, de la zéaxanthine, du rétinol, du rétinal, de l’acide rétinoïque, de l’allicine, de l’alliine, de l’allyl cystéine, de l’allyl disulfide, de la mélatonine, de la nuphlutine, de l’hermidine, du resvératrol, de la catéchine, du béta-hydroxy acide (BHA), de l’acide caféique, de la curcumine, de l’acide férulique, de la 8-hydroxyl quinoléine, de l’acide isoférulique, de la maclurine, du magnolol, du MEAS (extrait méthanolique de feuilles d’Aquilaria sinensis), du MEGM (extrait méthanolique deGynura bicolor Roxb. DC.), de la proanthocyanidine, de l’acide protocatéchique, de la puérarine, la pyridoxine, de la quercétine, de la rutine, et d’une protéine anti-oxydante.
De préférence, la protéine anti-oxydante est sélectionnée dans le groupe constitué d’une protéine à thiol, de l’haptoglobine, de l’hémoplexine, d’une catalase, d’une peroxydase, notamment une ascorbate peroxydase, une guaiacol peroxydase, ou une glutathion peroxydase, d’un superoxyde dismutase, d’une peroxyrédoxine, d’une glutarédoxine, d’une thiorédoxine et d’une glutathion réductase.
De préférence, l’agent antioxydant est l’acide ascorbique ou un analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E.
Comme on l’entend ici, l’analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E est notamment un analogue ou dérivé hydrosoluble du tocophérol, notamment de l’alpha-tocophérol. De préférence, l’analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E est le Trolox, le Tocofersolan, ou le MDL 73404, plus préférablement le Trolox.
Le Trolox est également nommé acide 3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-2H-1-benzopyran-2-carboxylique et est référencé sous le numéro CAS 53188-07-1.
Trolox
L’acide ascorbique est également nommé 5-(1,2-dihydroxyéthyl)-3,4-dihydroxyfuran-2-one. L’acide ascorbique selon l’invention peut être l’acide L-ascorbique (vitamine C), l’acide D-ascorbique ou un mélange, de l’acide L-ascorbique et de l’acide D-ascorbique.
Acide L-ascorbique
De préférence, le milieu de culture comprend de l’acide ascorbique ou du Trolox à une concentration d’au moins 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM, 75 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM ou 250 µM.
De préférence, le milieu de culture comprend de l’acide ascorbique ou du Trolox à une concentration d’au plus 1000 µM, 750 µM, 500 µM, 400 µM, 300 µM, 250 µM, 200 µM, 150 µM ou 100 µM.
De préférence, le milieu de culture comprend de l’acide ascorbique ou du Trolox à une concentration de 10 µM à 500 µM, de 10 µM à 250 µM, ou de 75 µM à 150 µM.
Cellules
Les cellules selon l’invention sont de tout type nécessitant un apport de fer ferrique.
De préférence, il s’agit de cellules eucaryotes, plus préférablement de cellules animales, notamment d’oiseau, de mammifère ou humaines.
Il peut s’agir de cellules à cultiver pour elles-mêmes, comme des cellules NK, des lymphocytes, notamment des lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique (CAR T cells), des cellules érythroïdes, notamment des érythroblastes, des globules rouges de culture ou des cellules de viande de culture, ou bien de cellules à cultiver en vue de produire des molécules d’intérêt, en particulier des protéines, plus particulièrement des anticorps ou des dérivés d’anticorps, notamment des anticorps monoclonaux. De préférence, les cellules à cultiver sont le siège de la production d’hèmes.
De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique sont des cellules qui contiennent de l’hémoglobine et/ou de la myoglobine.
De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique sont des cellules érythroïdes, notamment des érythroblastes, des globules rouges de culture ou des cellules de viande de culture. De préférence, les cellules de culture sont des érythroblastes ou des globules rouges de culture.
Comme on l’entend ici, « viande de culture » est synonymes de « viande de synthèse » ou encore de «clean meat».
Les cellules selon l’invention peuvent être des cellules souches, des progéniteurs, ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.
Les cellules souches peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ou des cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP). De préférence le procédé selon l’invention utilise comme source cellulaire des cellules souches hématopoïétiques et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP).
Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde peuvent être immortalisées au stade d’un progéniteur érythroïde ou d’un précurseur érythroïde. Par ailleurs, les cellules souches hématopoïétiques (HSC) peuvent également être immortalisées.
L’immortalisation est préférentiellement réalisée de façon conditionnelle. Ces cellules immortalisées peuvent alors être passées indéfinimentin vitro, cryoconservées et récupérées, et, de manière conditionnelle, produire des globules rouges totalement différenciés à partir d'une source définie et bien caractérisée. L'immortalisation de manière conditionnelle peut être obtenue par n'importe quel procédé bien connu de la personne du métier.
Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des cellules souches pluripotentes. Ces cellules sont à la fois capables de différenciation en de nombreux types de cellules et capables d'autoréplication. Elles peuvent maintenir cette pluripotence de différenciation tout en se multipliant par division. Les cellules souches embryonnaires font référence aux cellules souches pluripotentes dérivées d'embryons au stade blastocyste, qui est le stade précoce du développement animal. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont produites en introduisant plusieurs types de gènes de facteurs de transcription dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes.
Les cellules souches embryonnaires (ESC) selon l’invention sont obtenues par tout moyen ne nécessitant pas la destruction d’embryons humains. Par exemple en utilisant la technologie décrite par Chunget al.(Chung et al, Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction, Cell Stem Cell (2008)). Par ailleurs, le procédé selon l’invention n’utilise en aucun cas des embryons humains et ne vise en aucun cas à induire le processus de développement d’un être humain.
Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules souches utilisées dans le procédé selon l’invention ne sont pas des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et/ou des iPSC.
Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) utilisées dans le procédé selon l’invention sont des cellules multipotentes. Elles sont capables de se différencier pour donner tous les lignages de différenciation des cellules sanguines et capables de s'auto-répliquer tout en maintenant leur multipotence.
Les cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde sont des cellules déjà engagées dans le lignage érythroïde mais capables de s’auto-répliquer et sous contrôle externe de se différencier en cellules du lignage érythroïde.
Les cellules souches et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP) utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent provenir de n’importe quelle source, y compris, être dérivées de la moelle osseuse, du sang du cordon ombilical/placentaire ou du sang périphérique avec ou sans mobilisation préalable.
L'origine des cellules souches et cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde n'est pas particulièrement limitée tant qu'elle est dérivée d'un mammifère. Les exemples préférés comprennent les humains, les chiens, les chats, les souris, les rats, les lapins, les porcs, les vaches, les chevaux, les moutons, les chèvres et similaires, les humains étant plus préférés.
Les cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent produire, sans limitation, des globules rouges de donneurs universels, des globules rouges d'un groupe sanguin rare, des globules rouges pour une médecine personnalisée (par exemple, une transfusion autologue, éventuellement avec génie génétique) et des globules rouges conçus pour inclure une ou plusieurs protéines d'intérêt.
Dans certains modes de réalisation qui peuvent être combinés avec l'un quelconque des modes de réalisation précédents, lesdites cellules utilisées dans le procédé selon l’invention peuvent être isolées à partir d'un patient ayant un groupe sanguin rare comprenant, sans limitation, Oh, CDE / CDE, CdE / CdE, CwD- / CwD- , -D - / - D-, Rhnull, Rh: -51, LW (a-b +), LW (ab-), SsU-, SsU (+), pp, Pk, Lu (a + b-), Lu (ab-), Kp (a + b-), Kp (ab-), Js (a + b-), Ko, K: -11, Fy (ab-), Jk (ab-), Di (b- ), I-, Yt (a-), Sc: -1, Co (a-), Co (ab-), Do (a-), Vel-, Ge-, Lan-, Lan (+), Gy ( a-), Hy-, At (a-), Jr (a-), In (b-), Tc (a-), Cr (a-), Er (a-), Ok (a-), JMH - et En (a-).
Selon un mode de réalisation de l’invention, lesdites cellules peuvent être des cellules souches embryonnaires (ESC), de préférence humaines (hESC) et de préférence sélectionnées dans le groupe constitué des lignées H1, H9, HUES-1, HUES-2, HUES-3, HUES-7, CLO1 et des cellules souches pluripotentes (iPSC), de préférence humaine (hiPSC)
De préférence, lesdites cellules sont des cellules souches hématopoïétiques et/ou progéniteurs hématopoïétiques (HSC/HP), plus préférablement humaines.
Dans le cas de cellules dérivées du sang du cordon ombilical/ placentaire ou du sang périphérique, de la moelle osseuse, ou d’un prélèvement par aphérèse, une étape de sélection spécifique des cellules CD34+ peut être effectuée avant l’étape de culture en bioréacteur de type batch ou fed-batch du procédé selon l’invention.
L'aphérèse est une technique de prélèvement de certains composants sanguins par circulation extracorporelle du sang. Les composants que l'on souhaite prélever sont séparés par centrifugation et extraits, tandis que les composants non prélevés sont réinjectés au donneur (de sang) ou au patient (aphérèse thérapeutique).
Le qualificatif CD34+ (positif) signifie que l'antigène CD (cluster de différenciation) 34 est exprimé à la surface des cellules. Cet antigène est un marqueur des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices hématopoïétiques, et disparaît à mesure qu'elles se différencient. Des populations cellulaires similaires comprennent également des cellules positives au CD133.
Dans le cas où les cellules d’origine sont des ESC, des iPSC ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde, des étapes de pré-culture peuvent être ajoutées en amont de l’étape de culture dans le bioréacteur pour multiplier les cellules et éventuellement les engager dans une voie de différenciation, notamment de la lignée érythroïde.
De préférence, les cellules de culture nécessitant un apport de fer ferrique sont des globules rouges de culture et les cellules à cultiver sont des cellules souches ou des progéniteurs érythroïdes ou des cellules d’une lignée cellulaire immortalisée du lignage érythroïde.
Quelle que soit la source cellulaire, une étape préalable de congélation des cellules à cultiver est souvent requise pour des raisons de transport et de conservation. Les méthodes de congélation de cellules sont bien connues de l’état de l’art et font notamment appel à une descente en température programmée ainsi qu’à l’utilisation de cryoprotectant comme le lactose ou le diméthylsulfoxyde (DMSO). Lorsqu'il est ajouté au milieu, le DMSO empêche la formation de cristaux intracellulaires et extracellulaires dans les cellules pendant le processus de congélation.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le procédé selon l’invention comprend une étape de décongélation des cellules, préalable à l’étape de culture dans un bioréacteur à perfusion, dans le cas où les cellules à cultiver sont congelées. Les méthodes de décongélation de cellules sont bien connues de la personne du métier.
La décongélation est une étape du procédé à ne pas négliger notamment lorsque du DMSO a été utilisé pour la congélation. Ce composé est en effet cryopréservant tant que la suspension cellulaire est conservée en azote liquide ou en vapeur d’azote. Par contre, il devient cytotoxique dès que la suspension cellulaire est décongelée. Il convient donc d’éliminer très rapidement le DMSO par plusieurs étapes de lavage sitôt les cellules décongelées, comme cela est bien connu de la personne du métier.
Dans d’autres cas, les cellules de départ peuvent être fraiches, c’est-à-dire que le temps entre le prélèvement des cellules et la mise en culture est suffisamment court pour ne pas nécessiter de congélation, de préférence ce temps est inférieur à 48H. Cette situation peut exister par exemple lorsque le centre de prélèvement est localisé sur le même site ou à proximité du centre de production.
L’invention sera davantage explicitée à l’aide de l’Exemple et des Figures non limitatifs qui suivent.
Description des figures
La représente les pertes de cellules en fin de culture (%, axe des ordonnées) lors de cultures en perfusion de globules rouges conduites en présence (oui) ou absence (non) de Trolox dans le milieu de culture.
La représente le rendement de conservation de globules rouges (%, axe des ordonnées) de globules rouges obtenus par des cultures en perfusion conduites en présence (oui) ou absence (non) de Trolox dans le milieu de culture.
EXEMPLE
La production de globules rouges de culture a été effectuée avec et sans l’apport de Trolox lors de l’étape de culture en bioréacteur à perfusion du procédé qui est décrit ci-dessous.
Brièvement, les cellules mises en cultures selon l’invention sont des cellules nucléées totales collectées par cytaphérèse sur des donneurs volontaires préalablement mobilisés au G-CSF.
Une première étape du procédé selon l’invention est conduite sur 7 jours (de J1 à J7) en fed-batch à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2 et dans un milieu de culture adapté de celui décrit par Giarratanaet al. (2011) “Proof of principle for transfusion of in vitro–generated red blood cells”,Blood 118:5071–5079 pour la première étape de la procédure d’expansion décrite dans l’article (page 5072). A la moitié de la durée de cette étape du milieu de culture frais est ajouté à la culture de façon à diluer la culture au demi (on ajoute le même volume de milieu de culture que le volume présent initialement).
Une deuxième étape du procédé selon l’invention est conduite sur 15 jours (J7 à J22) dans un bioréacteur à perfusion de 2 L équipé d’un système de filtration tangentielle et d’une pompe centrifuge (TFF) ou à diaphragme (ATF). La culture est conduite à une température de 37°C, sous une atmosphère à 5% de CO2, avec un milieu de culture semblable à celui de l’étape précédente à l’exception de l’IL-3 et du glucocorticoïde qui sont absents. Des apports ponctuels de SCF et d’EPO sont également réalisés ainsi qu’un apport continu en fer.
La deuxième étape est conduite en absence ou en présence de Trolox ajouté dans le milieu de culture à la concentration d’environ 100 µM.
On effectue 15 cultures (9 sans Trolox et 6 avec Trolox) et on mesure les pertes cellulaires en fin de culture, définies comme le % de diminution de la concentration cellulaire entre le pic de concentration cellulaire et le jour d’arrêt de la culture (2 à 3 jours plus tard)
On observe sur la que l’adjonction de Trolox au milieu de culture permet de réduire significativement les pertes cellulaires en fin de culture (13% de perte sans Trolox contre 6% de perte avec Trolox en moyenne).
Par ailleurs, les globules rouges issus des cultures ci-dessus sont conservés pendant 28 jours dans une solution de conservation et on détermine le rendement de conservation à l’issue de la période de conservation [100 x (nombre de globules rouge finaux / mL)/(nombre de globules rouges initiaux / mL)].
On observe sur la que le rendement de conservation moyen est significativement amélioré lorsque la culture a été conduite en présence de Trolox (77% en présence de Trolox contre 63% sans Trolox).

Claims (11)

  1. Procédé de culture de cellules de culture nécessitant un apport en fer, comprenant une étape de culture de cellules à cultiver dans un milieu de culture dont la capacité anti-oxydante est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM.
  2. Procédé de culture selon la revendication 1, dans lequel le milieu de culture comprend au moins un agent antioxydant.
  3. Procédé de culture selon la revendication 2, dans lequel l’agent antioxydant est l’acide ascorbique ou un analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E, notamment le Trolox ou le Tocofersolan.
  4. Procédé de culture selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel le milieu de culture comprend l’acide ascorbique ou du Trolox à une concentration d’au moins 10 µM.
  5. Procédé de culture selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel la capacité anti-oxydante du milieu de culture est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 50 µM.
  6. Procédé de culture selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel les cellules à cultiver sont le siège de la production d’hèmes.
  7. Procédé de culture selon l’une des revendications 1 à 6, dans lequel les cellules de culture sont des érythroblastes ou des globules rouges de culture.
  8. Milieu de culture destiné à la culture de cellules nécessitant un apport en fer, dont la capacité anti-oxydante est supérieure ou égale à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 10 µM, en particulier à 50 µM, et est notamment inférieure à la capacité anti-oxydante d’une solution de Trolox à 250 µM.
  9. Milieu de culture selon la revendication 8, comprenant au moins un agent antioxydant.
  10. Milieu de culture selon la revendication 9, dans lequel l’agent antioxydant est l’acide ascorbique ou un analogue ou dérivé hydrosoluble de la vitamine E, notamment le Trolox, le Tocofersolan, ou le MDL 73404.
  11. Milieu de culture selon l’une des revendications 8 à 10, comprenant de l’acide ascorbique ou du Trolox à une concentration d’au moins 10 µM, en particulier au moins 50 µM.
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