WO2023180635A1 - Methode de conservation de cellules - Google Patents

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WO2023180635A1
WO2023180635A1 PCT/FR2022/050530 FR2022050530W WO2023180635A1 WO 2023180635 A1 WO2023180635 A1 WO 2023180635A1 FR 2022050530 W FR2022050530 W FR 2022050530W WO 2023180635 A1 WO2023180635 A1 WO 2023180635A1
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WO
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cells
concentration
freezing
adherent cells
cryoprotective
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Application number
PCT/FR2022/050530
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English (en)
Inventor
Francisco FERNANDES
Christophe Helary
Kankan QIN
Original Assignee
Sorbonne Universite
Centre National De La Recherche Scientifique
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Publication date
Application filed by Sorbonne Universite, Centre National De La Recherche Scientifique filed Critical Sorbonne Universite
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method of preserving free cells, such as blood cells, by freezing in the presence of a non-toxic cryoprotective agent, that is to say compatible with administration to a living human organism or animal.
  • the present invention thus relates to methods, compositions and kits for freezing and storing non-adherent cells, such as red blood cells, for extended periods of time while preventing damage that may occur during their storage, and, for the case of red blood cells, by maintaining their deformability and increasing their survival.
  • blood transfusion is widely used for medical purposes, particularly for the care of cardiovascular surgery, severe burns, transplant surgery, massive trauma, pregnancy-related complications. and therapy of solid and hematologic malignancies.
  • blood intended for transfusion is stored for up to 42 days at 4°C.
  • blood stored at this temperature for more than 21 days is considered old blood, in which depletion of metabolites, loss of cell membrane integrity, immune mediators, and hemolysis can be observed.
  • anticoagulants and suitable preservation media has made it possible to limit the damage caused to red blood cells during their storage and to increase the safety and clinical effectiveness of allogeneic or autologous blood transfusions.
  • Glycerol like ethylene glycol, DMSO or DMF, used as a cryoprotectant protects red blood cells by limiting the formation of ice crystals in the intracellular space, by reducing the exposure of cells to excessive concentrations of electrolytes during freezing and preventing excessive contraction of the cytoplasmic volume.
  • cryoprotectants which can be used for the cryopreservation of red blood cells, in particular, for example hydroxyethyl starch, polyvinylpyrrolidone (PVP) and dextran, which have the main advantage of not crossing the cell membrane.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • dextran dextran
  • cryoprotectants such as trehalose, whose cryoprotective action in living systems is known, do not spontaneously cross the cell membrane but have a predominant action in the intracellular space, are often used in the presence of adjuvants allowing its transport such as hydroxyapatite particles or in modified forms such as acetylated trehalose.
  • the present invention thus relates to an original method of preserving non-adherent cells by directional freezing comprising the steps of: a) suspending said non-adherent cells, at a concentration which can be between lxlO 6 and 5xl0 9 cells/mL , preferably the cell concentration is between lxlO 8 and 5xl0 9 cells/mL, in a cryopreservation medium composed of an isotonic aqueous solution, preferably saline, for example an aqueous solution containing 0.9% by weight of NaCl, and at least one agent non-toxic cryoprotectant, preferably at a concentration of between 4 and 50% by weight/volume, preferably this cryoprotective agent is a natural protein, preferably natural proteins with a molecular weight of between 10 and 80 kDa, and can be chosen from among albumins, alpha and beta globulins and fibrinogen; optionally, the mixture may also include a cryoprotective additive such as carboxymethyl cellulose, suc
  • Blood cells red blood cells, white blood cells, platelets
  • cryoprotectant agent is non-toxic, that is, it can be administered to a human or animal patient; it is therefore not essential to purify the medium containing the cells after their thawing; the cryoprotective agent is a natural protein which can be chosen from:
  • the cryoprotective agent is human serum albumin (also designated HSA for human serum albumin).
  • serum albumin is present in cryopreservation medium at a concentration of between 4 and 50% weight/volume, more preferably between 20 and 50% weight/volume.
  • the cryopreservation medium consists of an isotonic aqueous solution and at least one of the aforementioned cryoprotective agents.
  • the cryopreservation medium consists of an isotonic aqueous solution, at least one of the aforementioned cryoprotective agents and at least one cryoprotective additive chosen from sucrose, glucose, trehalose and carboxymethyl cellulose.
  • carboxymethyl cellulose can be used at a concentration of between 0.1 and 1% w/v; trehalose at a concentration between 0.5 and 5% w/v and sucrose at a concentration between 0.5 and 5% w/v; glucose has a concentration between 0.5 and 5% w/v.
  • Directional freezing is a freezing technique which consists of linearly moving a sample from a support thermalized at a temperature higher than the melting temperature of the sample (called hot block) towards a support thermalized at a temperature lower than the melting temperature. melting of the sample (called cold block).
  • the distance between the two supports as well as the temperatures of each of the supports can be chosen independently to achieve a controlled thermal gradient.
  • the hot block temperature range is between 0.5 and 40°C and the cold block temperature range is between -60 and -100°C).
  • the speed at which the sample, placed in the freezing chamber, is moved between the hot block and the cold block corresponds to the growth speed of the ice front and is controlled by a dedicated motor which operates between 10 and 200 pm/s.
  • directional freezing can be implemented according to the method described in Q/n et al., 2020.
  • the storage temperature depends on the device used for storing frozen cells; for example, it could be of the order of -80°C with a variation of +/-3°C in a mechanical freezer, of the order of -150°C with a variation of +/-3°C in a freezer capable of producing lower temperatures, of the order of -196°C if conservation is carried out in liquid nitrogen and between -135°C and -190°C if conservation is carried out in steam nitrogen.
  • the present invention also relates to a method of thawing suspended cells preserved according to the preservation method of the invention.
  • This thawing method is thus preferably implemented after the preservation method according to the invention; it includes the steps of: i. bringing the freezing chamber containing frozen cells into contact with a surface heated to a temperature between 35 and 45°C for 10 and 40 seconds, until the ice crystals have completely melted; ii. centrifugation; iii. suspension of the cells from the centrifugation supernatant in an isotonic aqueous solution comprising between 1 to 10% by weight/volume of proline.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising, or consisting of, non-adherent cells and an isotonic aqueous solution, preferably saline, comprising at least one non-toxic cryoprotective agent at a concentration of between 4 and 50% by weight/ volume and chosen from albumins, alpha and beta globulins and fibrinogen.
  • the composition may also include a cryoprotective additive such as sucrose, trehalose, glucose or carboxymethyl cellulose; in this embodiment, carboxymethyl cellulose can be used at a concentration of between 0.1 and 1% w/v; trehalose at a concentration between 0.5 and 5% w/v, sucrose at a concentration between 0.5 and 5% w/v and glucose at a concentration between 0.5 and 5% w/v .
  • a cryoprotective additive such as sucrose, trehalose, glucose or carboxymethyl cellulose
  • carboxymethyl cellulose can be used at a concentration of between 0.1 and 1% w/v
  • trehalose at a concentration between 0.5 and 5% w/v
  • sucrose at a concentration between 0.5 and 5% w/v
  • glucose at a concentration between 0.5 and 5% w/v
  • the cryoprotective agent is human serum albumin.
  • the present invention also relates to a kit for preserving non-adherent cells comprising at least one waterproof device for storing sterile biological fluids, flexible at room temperature and capable of withstanding storage temperatures down to -196°C without damage.
  • an isotonic aqueous solution preferably saline
  • a cryoprotective additive such as sucrose, trehalose, glucose and carboxymethyl cellulose, then, preferably, carboxymethyl cellulose can be used at a concentration between 0.1 and 1% w/v, trehalose at a concentration between 0, 5 and 5% w/v, sucrose at a concentration between 0.5 and 5% w/v and glucose at a concentration between 0.5 and 5% w/v.
  • Figure 1 Red blood cell (RBC) recovery after directional freezing with varying volume fractions of BSA (4>BSA) (0.04, 0.14 and 0.28) at varying translational speeds.
  • Top panel image of the centrifuged samples after the freeze-thaw process. The red color is due to hemoglobin released by the lysed cells. Neg, represents the negative control obtained without being frozen.
  • Lower panel Cell recovery after freezing and thawing.
  • FIG. 2 Cell recovery after directional freezing of RBCs (5xl0 9 cells. mL 1 ) at 100 pm.s -1 . ns, indicates no significant difference.
  • FIG. 3 SEM and flow cytometry of RBCs after freezing and thawing. RBCs were stained with Calcein-AM for flow cytometry. Negative and positive controls indicate unstained and calcein-stained cells without having undergone freezing. Varying BSA volume fractions and ice front velocities were applied to the experimental groups. Scale bar, 2 pm.
  • FIG. 4 (A) Cell size (FSC-A) of calcein-stained red blood cells. (B) Comparison of cell size between positive control (fresh cell) and cryopreserved cells. Frozen cells with a 4>BSA of 0.14 showed a significantly smaller size than fresh cells. ***, indicates P ⁇ 0.01.
  • Figure 5 Cell recovery (A) and flow cytometry (B) of RBCs after 106 days of freezer storage.
  • FIG. 6 (A) Cell size (FSC-A) of RBCs stained with Calcein after 106 days of storage in a freezer at -80°C. (B) Comparison of cell size between positive control (fresh cell) and cryopreserved cells. ***, indicates a significant difference at P ⁇ 0.01.
  • Figure 7 Efficiency of resuspension of thawed cells followed by freezing at 100 pm.s 1 . Positive control, absorbance of hemolysis in deionized H 2 O with the same quantity of cells compared to that in the presence of BSA.
  • Figures 8, 9, 10 and 11 post-freezing cell suspension tests, the histograms show the measurement of hemoglobin in the supernatant after suspension.
  • Freezing protocol a 5 mL of sheep blood in Alsevers solution (saline solution comprising 2.05% dextrose, 0.8% sodium citrate, 0.055% citric acid, and 0.42% sodium chloride) (1:1) are centrifuged at 600g, 4°C for 10 mins; b. The supernatant is removed and a 0.9% NaCl solution is added to return to the initial volume (5mL); vs. The suspension obtained is centrifuged at 600 g, 4°C for 10 mins; d. The supernatant is removed and a 0.9% NaCl solution is added to return to the initial volume (5mL); e. Steps c and d are repeated once more; f.
  • Alsevers solution saline solution comprising 2.05% dextrose, 0.8% sodium citrate, 0.055% citric acid, and 0.42% sodium chloride
  • the concentration of red blood cells is calculated using a hemocytometer; g. The cells necessary to obtain a concentration of 10 8 or 1.5*10 9 are transferred into 2 mL of BSA solution (between 4 and 50% by weight); h. The cell suspensions are frozen in 500 pL CoverWellTM incubation chambers (Grace Bio-Labs) 22mm to the thermal block at -90°C; distance between blocks 2mm). The translation speeds of the samples are 10, 50 and 100 pm.s -1 . i. After freezing, the chambers containing the frozen cell suspensions are maintained at -80°C (from 1 day to 106 days).
  • Thawing protocol a The chambers containing the cells are thawed in contact with a surface at 45°C for 10-15s. b. 200 ⁇ L of the contents of each chamber are transferred to an Eppendorf, and centrifuged according to the following conditions:
  • Steps b and c are repeated two more times for characterization by FACS; four more times for characterization by SEM.
  • the efficiency of freezing-thawing is estimated from the measurement by UV-Vis absorption at 541 nm of the concentration of hemoglobin in the supernatant obtained in step b.l or b.2.
  • the cell density used in these experiments (10 8 cells mL -1 ) was 50 times lower than the physiological density ( ⁇ 5xl0 9 cells mL 1 ) of the human body.
  • cell density has a positive effect essential for final cryosurvival.
  • another test was carried out with a cell density of 5xl0 9 cells mL 1 at 100 pm.s 4 (figure 2).
  • Cells frozen with a BSA volume fraction of 0.28 showed the highest recovery ( ⁇ 80%), further supporting the beneficial effects of highly concentrated BSA on cell survival during directional freezing.
  • relatively lower survival compared to samples containing 10 8 cells mL 1 was observed, which may be attributed to the increased mechanical stresses between cells.
  • cells can be cryopreserved in a relatively diluted state, but once needed, these cells could be thawed, concentrated and then mixed into specific solutions without time-consuming and harmful post-purification of the cells. or also subjected to simple centrifugation, which represents a substantial advantage of the method of the invention.
  • the 0.28 BSA volume fraction group showed good cryosurvival and led to a cell size similar to that of fresh cells. The comparable recovery and viability of
  • RBCs thawed after 1 day and 106 days of storage extended the shelf life of RBCs from the commonly accepted 49 days to 106 days.
  • the low rate of hemolysis during resuspension of thawed cells constitutes a simple tool to enrich RBCs for transfusion.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode de conservation de cellules libres, telles que des cellules sanguines, par congélation en présence d'un agent cryoprotecteur non toxique, c'est-à-dire compatible avec l'administration à un organisme vivant humain ou animal. La présente invention se rapporte ainsi à des méthodes, des compositions et des kits pour la congélation et le stockage de cellules non adhérentes, telles que des globules rouges, pendant des périodes de temps prolongées tout en prévenant les lésions pouvant survenir lors de leur stockage, et, pour le cas des globules rouges, en conservant leur déformabilité et en augmentant leur survie.

Description

Méthode de conservation de cellules
La présente invention se rapporte à une méthode de conservation de cellules libres, telles que des cellules sanguines, par congélation en présence d'un agent cryoprotecteur non toxique, c'est-à-dire compatible avec l'administration à un organisme vivant humain ou animal.
La présente invention se rapporte ainsi à des méthodes, des compositions et des kits pour la congélation et le stockage de cellules non adhérentes, telles que des globules rouges, pendant des périodes de temps prolongées tout en prévenant les lésions pouvant survenir lors de leur stockage, et, pour le cas des globules rouges, en conservant leur déformabilité et en augmentant leur survie.
Dans ce contexte, et à titre d'exemple, la transfusion sanguine est largement utilisée à des fins médicales, en particulier pour les soins de chirurgie cardiovasculaire, les brûlures graves, la chirurgie de transplantation, les traumatismes massifs, les complications liées à la grossesse et la thérapie des tumeurs malignes solides et hématologiques.
En général, le sang destiné à la transfusion est conservé jusqu'à 42 jours à 4°C. Cependant, le sang conservé à cette température pendant plus de 21 jours est considéré comme du sang ancien, dans lequel on peut observer une déplétion des métabolites, une perte de l'intégrité de la membrane cellulaire, des médiateurs immunitaires et une hémolyse.
L'utilisation d'anticoagulants et de milieux de conservation adaptés a permis de limiter les dommages causés aux globules rouges lors de leur stockage et d'augmenter la sécurité et l'efficacité clinique des transfusions sanguines allogéniques ou autologues.
Une alternative à cette méthode de conservation est la congélation ; la congélation revêt un intérêt particulier notamment pour un usage militaire et le stockage de cellules sanguines pour le traitement de maladies rares. Il existe deux méthodes généralement utilisées pour la cryoconservation des globules rouges :
- la technique de refroidissement lent (environ -l°C/min) dans un milieu à haute teneur en glycérol (environ 40%) et permet une conservation à -80°C ; et
- la technique de refroidissement rapide (supérieur à -100°C/min) dans un milieu à basse teneur en glycérol (environ 20%) et permet une conservation à -196°C. Cependant, des quantités excessives de glycérol entraînent des problèmes de déséquilibre osmotique, ce qui peut provoquer une hémolyse. Pour éviter cela, le personnel clinique doit effectuer des opérations complexes et longues de déglycérolisation après décongélation, incluant la préparation de différentes concentrations de solution de lavage, de multiples centrifugations, l'élimination répétée du liquide surnageant usagé.
Le glycérol, tout comme l'éthylène glycol, le DMSO ou le DMF, utilisé comme cryoprotecteur protège les globules rouges en limitant la formation des cristaux de glace dans l'espace intracellulaire, en diminuant l'exposition des cellules aux concentrations excessives d'électrolytes pendant la congélation et en empêchant une contraction excessive du volume cytoplasmique.
Il existe d'autres cryo protecteurs extracellulaires qui peuvent être utilisés pour la cryoconservation des globules rouges notamment, par exemple l'hydroxyethylamidon, la polyvinylpyrrolidone (PVP) et le dextran, qui présentent le principal avantage de ne pas traverser la membrane cellulaire. Bien que ces cryoprotecteurs non perméables soient biodégradables et tolérés par l'organisme humain, il demeure nécessaire de les éliminer après la décongélation.
Finalement des cryoprotecteurs comme le tréhalose, dont l'action cryoprotectrice dans des systèmes vivants est connue, ne traversent pas spontanément la membrane cellulaire mais ont une action prépondérante dans l'espace intracellulaire, sont souvent utilisées en présence d'adjuvants permettant son transport comme des particules d'hydroxyapatite ou sous des formes modifiées telles que le tréhalose acétylé.
Il demeure cependant nécessaire d'optimiser la cryoconservation des cellules ; c'est ce à quoi est parvenue la Demanderesse par la mise au point d'une méthode de cryoconservation de cellules qui s'affranchit des agents de cryoconservation toxiques devant être éliminés après décongélation et présente également l'avantage de pouvoir être mise en œuvre avec des congélateurs mécaniques.
La présente invention se rapporte ainsi à une méthode originale de conservation de cellules non adhérentes par congélation directionnelle comprenant les étapes de : a) mise en suspension des dites cellules non adhérentes, à une concentration pouvant être comprise entre lxlO6 et 5xl09 cellules/mL, de préférence la concentration cellulaire est comprise entre lxlO8 et 5xl09 cellules/mL, dans un milieu de cryoconservation composé d'une solution aqueuse isotonique, de préférence saline, par exemple une solution aqueuse à 0,9% en poids de NaCI, et d'au moins un agent cryoprotecteur non toxique, de préférence à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids/volume, de préférence cet agent cryoprotecteur est une protéine naturelle, préférentiellement des protéines naturelles de poids moléculaire compris entre 10 et 80 kDa, et peut être choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène ; optionnellement, le mélange peut également comprendre un additif cryoprotecteur tel que la carboxymethyl cellulose, le saccharose, le tréhalose ou le glucose ; b) optionnellement, conditionnement du mélange obtenu à l'étape a) ; c) congélation directionnelle du mélange obtenu à l'étape a) ; d) conservation à une température entre -79°C et -197°C, préférentiellement à environ - 80°C.
Cette méthode permet la conservation de toute cellule dite non adhérente ou libre, c'est- à-dire de cellules circulantes ou de cellules adhérentes temporairement en suspension, i.e détachées de leur support/environnement physiologique ; en particulier, ces cellules sont choisies parmi :
• Cellules sanguines (globules rouges, globules blancs, plaquettes) ;
• Hépatocytes ;
• Cellules neuronales ;
• Cellules rares (liées à des pathologies particulières) dont la conservation pourrait présenter un intérêt futur ;
• Cellules immunomodulatrices (Tregs, etc...) ;
• Cellules souches, iPSCs.
De préférence, il s'agit de cellules sanguines et encore préférentiellement de globules rouges.
Préalablement à la mise en œuvre de l'étape a), il peut être nécessaire de séparer les cellules de leur milieu ; c'est notamment le cas des cellules sanguines présentes dans un prélèvement de sang qu'il conviendra de séparer du plasma ; ceci est réalisé à l'aide de techniques classiques connues de l'homme du métier, comme la centrifugation par exemple. L'agent de cryoprotecteur est non toxique, c'est-à-dire qu'il est peut être administré à un patient humain ou animal ; il n'est donc pas indispensable de purifier le milieu contenant les cellules après leur décongélation ; l'agent cryoprotecteur est une protéine naturelle qui peut être choisi parmi :
• L'albumine humaine ou bovine, l'ovalbumine ;
• L'alpha-1 glycoprotéine, le fibrinogène, ...
De préférence, lorsque les cellules conservées par la méthode selon l'invention sont destinées à être administrées à un humain, l'agent cryoprotecteur est l'albumine sérique humaine (aussi désignée HSA pour human serum albumin).
De préférence, l'albumine sérique est présente dans milieu de cryoconservation à une concentration comprise entre 4 et 50% poids/volume, plus préférentiellement entre 20 et 50% poids/volume.
Selon un mode de réalisation, le milieu de cryoconservation est constitué d'une solution aqueuse isotonique et d'au moins un des agents cryoprotecteurs précités.
Selon un autre mode de réalisation, le milieu de cryoconservation est constitué d'une solution aqueuse isotonique, d'au moins un des agents cryoprotecteurs précités et d'au moins un additif cryoprotecteur choisi parmi le saccharose, le glucose, le trehalose et la carboxymethyl cellulose.
Selon ce mode de réalisation, la carboxymethyl cellulose peut être utilisée à une concentration comprise entre 0,1 et 1% p/v ; le tréhalose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v et le saccharose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v ; le glucose a une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v.
La congélation directionnelle est une technique de congélation qui consiste à déplacer linéairement un échantillon d'un support thermalisé à une température supérieure à la température de fusion de l'échantillon (dit bloc chaud) vers un support thermalisé à une température inférieure à la température de fusion de l'échantillon (dit bloc froid). La distance entre les deux supports ainsi que les températures de chacun des supports peuvent être choisies indépendamment pour aboutir à un gradient thermique contrôlé. La gamme de température du bloc chaud est comprise entre 0,5 et 40°C et la gamme de températures du bloc froid est comprise entre -60 et -100°C). La vitesse à laquelle l'échantillon, placé dans la chambre de congélation, est déplacé entre le bloc chaud et le bloc froid correspond à la vitesse de croissance du front de glace et est contrôlée par un moteur dédié qui opère entre 10 et 200 pm/s. A titre d'exemple la congélation directionnelle peut être mise en œuvre selon la méthode décrite dans Q/n et al., 2020.
La température de conservation dépend du dispositif utilisé pour la conservation des cellules congelées ; par exemple, elle pourra être de l'ordre de -80°C avec une variation de +/-3°C dans un congélateur mécanique, de l'ordre de -150°C avec une variation de +/-3°C dans un congélateur capable de produire des températures plus basses, de l'ordre de - 196°C si la conservation est réalisée dans de l'azote liquide et entre -135°C et -190°C si la conservation est réalisée dans de la vapeur d'azote.
La présente invention se rapporte également à une méthode de décongélation des cellules en suspension conservées selon la méthode de conservation de l'invention.
Cette méthode de décongélation est ainsi préférentiellement mise en œuvre après la méthode de conservation selon l'invention ; elle comprend les étapes de : i. mise en contact de la chambre de congélation contenant des cellules congelées avec une surface chauffée à une température comprise entre 35 et 45°C entre 10 et 40s, jusqu'à la fusion complète des cristaux de glace ; ii. centrifugation ; iii. mise en suspension des cellules du surnageant de centrifugation dans une solution aqueuse isotonique comprenant entre 1 à 10% en poids/volume de proline.
La présente invention se rapporte encore à une composition comprenant, ou constituée, des cellules non adhérentes et d'une solution aqueuse isotonique, de préférence saline, comprenant au moins un agent cryoprotecteur non toxique à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids/volume et choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène. Optionnellement, la composition peut également comprendre un additif cryoprotecteur tel que le saccharose, le tréhalose, le glucose ou la carboxymethyl cellulose ; dans ce mode de réalisation, la carboxymethyl cellulose peut être utilisée à une concentration comprise entre 0,1 et 1% p/v ; le tréhalose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v, le saccharose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v et le glucose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v.
De préférence, l'agent cryoprotecteur est l'albumine sérique humaine. La présente invention se rapporte encore à un kit de conservation de cellules non- adhérentes comprenant au moins un dispositif étanche de stockage de fluides biologiques stérile, flexible à température ambiante et capable de supporter sans endommagement les températures de stockage jusqu'à -196°C et une solution aqueuse isotonique, de préférence saline, comprenant au moins un agent cryoprotecteur non toxique à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids et choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène et, optionnellement, un additif cryoprotecteur tel que le saccharose, le tréhalose, le glucose et la carboxymethyl cellulose , alors, de préférence, la carboxymethyl cellulose peut être utilisée à une concentration comprise entre 0,1 et 1% p/v, le tréhalose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v, le saccharose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v et le glucose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v.
Figure 1 : Récupération des globules rouges (G R) après congélation directionnelle avec des fractions volumiques de BSA (4>BSA) variables (0,04, 0,14 et 0,28) à des vitesses de translation variables. Panneau supérieur : image des échantillons centrifugés après le processus de congélation-décongélation. La couleur rouge est due à l'hémoglobine libérée par les cellules lysées. Neg, représente le contrôle négatif obtenu sans être congelé. Panneau inférieur : Récupération cellulaire après congélation et décongélation.
Figure 2 : Récupération cellulaire après congélation directionnelle des GR (5xl09 cellules. mL 1) à 100 pm.s -1. ns, n'indique aucune différence significative.
Figure 3 : SEM et cytométrie en flux des GR après congélation et décongélation. Les GR ont été colorés avec Calcéine-AM pour la cytométrie en flux. Les témoins négatifs et positifs indiquent les cellules non colorées et colorées par la calcéine sans avoir subi de congélation. Des fractions de volume de BSA et des vitesses de front de glace variables ont été appliquées aux groupes expérimentaux. Barre d'échelle, 2 pm.
Figure 4 : (A) Taille des cellules (FSC-A) des globules rouges colorés à la calcéine. (B) Comparaison de la taille des cellules entre le témoin positif (cellule fraîche) et les cellules cryoconservées. Les cellules congelées avec une 4>BSA de 0,14 ont montré une taille significativement plus petite que les cellules fraîches. ***, indique P<0,01. Figure 5 : Récupération cellulaire (A) et cytométrie de flux (B) des GR après 106 jours de stockage au congélateur.
Figure 6 : (A) Taille cellulaire (FSC-A) des GRs colorés à la Calcéine après 106 jours de conservation dans un congélateur à -80°C. (B) Comparaison de la taille des cellules entre le témoin positif (cellule fraîche) et les cellules cryoconservées. ***, indique une différence significative à P<0,01.
Figure 7 : Efficacité de remise en suspension des cellules décongelées suivie d'une congélation à 100 pm.s 1. Contrôle positif, absorbance de l'hémolyse dans l'H2O déionisée avec la même quantité de cellules comparée à celle en présence de BSA.
Figures 8, 9, 10 et 11 : essais de mise en suspension de cellules post-congélation, les histogrammes présentent la mesure de l'hémoglobine dans le surnageant après suspension.
Protocole de congélation a. 5 mL de sang de mouton en solution d'Alsevers (solution saline comprenant 2.05% de dextrose, 0.8% de citrate de sodium, 0.055% d'acide citrique, and 0.42% de chlorure de sodium) (1:1) sont centrifugés à 600g, 4°C pendant 10 mins ; b. Le surnageant est enlevé et une solution de NaCI 0.9% est ajoutée de manière à retrouver le volume initial (5mL) ; c. La suspension obtenue est centrifugée à 600g, 4°C pendant 10 mins ; d. Le surnageant est enlevé et une solution de NaCI 0.9% est ajoutée de manière à retrouver le volume initial (5mL) ; e. Les étapes c et d sont répétées une fois de plus ; f. La concentration de globules rouges est calculée à l'aide d'un hématimètre ; g. Les cellules nécessaires à obtenir une concentration de 108 ou 1.5*109 sont transférées dans 2 mL de solution de BSA (entre 4 et 50 % en poids) ; h. Les suspensions de cellules sont congelés dans des chambres d'incubation de 500 pL CoverWell™ (Grace Bio-Labs) 22mm X 40mm X 0.5mm sur un gradient thermique de 50°C.mm 1 (passage du bloc thermique à +10°C au bloc thermiques à -90°C ; écart entre les blocs 2mm). Les vitesses de translation des échantillons sont 10, 50 et 100 pm.s -1. i. Apres congélation les chambres contenant les suspensions de cellules congelées sont maintenues à -80 °C (de 1 jour jusqu'à 106 jours).
Protocole de décongélation a. Les chambres contenant les cellules sont décongelées en contact avec une surface à 45°C pendant 10-15s. b. 200 pL du contenu de chaque chambre sont transférés dans un eppendorf, et centrifugés selon les conditions suivantes :
1. Pour les concentrations en BSA inférieures ou égales à 20% : 3000 rpm, 20°C, 10 mins
2. Pour les concentrations en BSA supérieures à 20% : 6000 rpm, 20°C, 20 mins c. Le surnageant est enlevé et les cellules sont suspendues dans une solution de 1% proline, 0.9% NaCI. d. Etapes b et c sont répétées deux fois de plus pour caractérisation par FACS ; quatre fois de plus pour caractérisation par MEB. e. L'efficacité de la congélation-décongélation est estimée à partir de la mesure par absorption UV-Vis à 541 nm de la concentration d'hémoglobine dans le surnageant obtenu dans l'étape b.l ou b.2.
D'autres formulations ont été testées pour la resuspension des cellules post décongélation (les résultats correspondent à la mesure de l'hémoglobine dans le surnageant après resuspension) :
• Proline (1, 2, 4, 8, 10 %)
• Proline (1, 2, 4, 8, 10 %) puis BSA 4%
(voir Figure 8)
• BSA 4% + proline (0.1, 0.5, 1, 2, 5 %)
(voir Figure 9)
• BSA + PBS
• PBS
• 0.9 % NaCI
• BSA + glucose
• BSA + glucose + trimethylglycine + proline
• BSA + glucose + trimethylglycine + proline + glycine + glutamine
• BSA + trimethylglycine + proline + glycine + glutamine (voir Figures 10 et 11 où Cl: bsa+glucose ; C2: Cl+betaine+proline ; C3: C2+glycine+glutamine ; C4: C3-glucose)
1% Proline dans 0.9% NaCI produit des résultats similaires aux autres concentrations de proline, systématiquement supérieurs aux autres formulations.
Résultats
L'augmentation de la fraction volumique de BSA (4>BSA) a entraîné une amélioration de la récupération des cellules qui était encore améliorée avec l'augmentation de la vitesse de congélation par translation mise en œuvre (Figure 1).
Pour des fractions volumiques de 0,04 à 0,28, la récupération des cellules est passée de ~18% à ~30% à 10 pm.s 1 et de ~38% à ~95% à 100 pm.s -1. Pour toutes les fractions volumiques, l'augmentation de la vitesse de translation a entraîné une meilleure récupération des cellules, en particulier pour la valeur 4>BSA = 0,28 qui permet l'augmentation d'un facteur trois lorsque la vitesse de translation varie de 10 à 100 m.s . Après décongélation et centrifugation, les globules rouges (GR) non lysés ont été regroupés au fond du tube et l'hémoglobine des cellules brisées a été libérée dans le surnagent, conduisant à une couleur rouge. Pour le contrôle négatif, l'échantillon de sang frais ne présentait presque pas d'hémolyse cellulaire, comme le montre le surnageant incolore. Les échantillons traités dans d'autres conditions ont présenté une couleur rouge, sauf pour une 4>BSA comprise entre 0,28 et 50 à 100 pm.s4, confirmant le rôle positif des systèmes de BSA hautement concentrés sur la récupération des GR.
La densité cellulaire utilisée dans ces expériences (108 cellules mL -1) était 50 fois inférieure à la densité physiologique (~5xl09 cellules mL 1) du corps humain. Dans la littérature, la densité cellulaire a un effet positif essentiel pour la cryosurvie finale. Pour tenir compte de cet effet, un autre test a été effectué avec une densité cellulaire de 5xl09 cellules mL 1 à 100 pm.s4 (figure 2). Les cellules congelées avec une fraction volumique de BSA de 0,28 ont montré la récupération la plus élevée (~80%), ce qui confirme encore les effets bénéfiques de la BSA hautement concentrée sur la survie des cellules pendant la congélation directionnelle. Cependant, une survie relativement plus faible par rapport aux échantillons contenant 108 cellules mL 1 a été observée, ce qui peut être attribué à l'augmentation des contraintes mécaniques entre les cellules.
Qualité des globules rouges Si les expériences précédentes ont permis de déterminer la quantité d'érythrocytes dont l'intégrité de la membrane était préservée, il est également utile d'obtenir des informations complémentaires sur l'état physiologique des cellules récupérées. À cette fin, une observation par microscopie électronique à balayage et une cytométrie de flux ont été réalisées sur les cellules après congélation et décongélation. Il est connu de la littérature que les GR sains présentent une forme biconcave qui leur confère une grande flexibilité et une grande capacité de transport de l'oxygène ; La figure 3A montre qu'une majorité de GR frais présentent une forme de disque biconcave. Les cellules congelées à 100 pm.s 1 en présence d'une faible fraction volumique de BSA (4>BSA = 0,04 et 0,14) ont présenté une forme similaire à celle des échantillons frais (figure 3B-C).
Pour les groupes à fraction volumique élevée, une majorité de cellules décongelées présentent une forme de disque en l'absence de la caractéristique concave, et une petite partie des cellules présentent une altération morphologique vers une forme légèrement sphérique (Figure 3D). La variation de la vitesse de translation n'a pas modifié de manière significative la forme des GR lorsque 4>BSA = 0,28 (figure 3E-F). La calcéine-AM, un colorant non fluorescent perméable aux cellules qui est converti en calcéine fluorescente verte par des estérases intracellulaires dans les cellules vivantes, a été utilisée pour le test de cytométrie de flux. Dans la figure 3G, le contrôle négatif (cellules fraîches non colorées) et le contrôle positif (cellules fraîches colorées) ont une intensité de fluorescence distincte apparente, ce qui facilite la détermination du groupe expérimental. Quelles que soient les conditions expérimentales (concentration de BSA et vitesse de translation), plus de 97% des cellules présentent une intensité élevée de calcéine. Cela indique que, après remise en suspension, la plupart des GR récupérés ont une activité estérase et sont donc vivants. En d'autres termes, la forme légèrement altérée des GR n'affecte pas leur activité estérasique. Dans l'analyse par cytométrie en flux, le « Forward scatter gating » est généralement considéré comme un indice de la taille des cellules [9]. Pour les groupes expérimentaux, les GR décongelés ont montré une taille médiane des cellules similaire à celle du témoin positif, sauf ceux congelés en présence de 4>BSA = 0,14 (à 100 pm.s 1) dont la taille est légèrement plus petite (Figure 4A-B). En tenant compte à la fois de la récupération et de la qualité des cellules, plus de 95 % des GR présentent des membranes intactes avec des activités métaboliques et une taille cellulaire similaire par rapport au contrôle après avoir été cryoconservés via une congélation directionnelle avec 4>BSA = 0,28 à 100 pm.s -1.
Comme décrit précédemment, la durée de vie limitée des GR, même en présence d'additifs (< 49 jours), entraîne une forte demande de donneurs de sang quotidiens. Ici, la cryoconservation des GR a été réalisée par congélation directionnelle, les GR ont ensuite été stockés dans un congélateur à -80°C pendant trois mois (106 jours). Dans la figure 5A, la récupération des cellules a suivi la même tendance de survie que celle après un jour de conservation. La survie des globules rouges a pu être améliorée avec une augmentation de la teneur en BSA et encore plus avec une vitesse de translation plus élevée. Après 106 jours, les échantillons préparés avec une fraction volumique de 0,28 à 100 pm.s 1 a montré une survie de ~95% comparable à celle des échantillons décongelés après 1 jour de conservation. Une coloration supplémentaire à la calcéine (figure 5B) a indiqué que plus de 98% des cellules présentaient une activité estérase, quelles que soient les conditions de congélation. Dans tous les échantillons, la taille des cellules décongelées était similaire à celle du témoin positif, à l'exception du groupe ayant une fraction volumique de 0,14 qui présentait une taille plus petite (Figure 6). Ainsi, la congélation directionnelle en présence de BSA (4>BSA = 0,28) permet une conservation deux fois plus longue en congélateur sans affecter significativement la viabilité et la vitalité des cellules que la durée de conservation autorisée des globules rouges (49 jours).
Dans la cryoconservation conventionnelle des GR, le processus de déglycérolisation a des effets néfastes sur la qualité finale des cellules. Pour les applications cliniques, l'efficacité de la remise en suspension des cellules congelées-décongelées doit être prise en compte afin d'obtenir une suspension cellulaire hautement concentrée équivalente à la densité cellulaire physiologique. Dans la figure 7, aucune hémolyse (absorbance à 541 nm inférieure à 0,005) ne s'est produite après la remise en suspension des cellules décongelées (4)BSA = 0,28, à 100 pm.s 1) par rapport au contrôle positif, c'est-à-dire l'hémolyse complète des GR. En d'autres termes, les cellules peuvent être cryoconservées dans un état relativement dilué, mais une fois que l'on en a besoin, ces cellules pourraient être décongelées, concentrées puis mélangées dans des solutions spécifiques sans postpurification des cellules, longue et nuisible, ou également soumis à une simple centrifugation, ce qui représente un avantage substantiel de la méthode de l'invention. Une autre analyse de l'activité métabolique basée sur l'estérase a indiqué que plus de 95% des GR conservés après congélation et décongélation sont vivants, quelles que soient les conditions expérimentales. En ce qui concerne la viabilité et la qualité des GR, le groupe de fraction volumique de 0,28 BSA a montré une bonne cryosurvie et a conduit à une taille de cellule similaire à celle des cellules fraîches. La récupération et la viabilité comparables des
GR décongelés après 1 jour et 106 jours de stockage ont permis d'étendre la durée de conservation des GR de 49 jours communément acceptée à 106 jours. Compte tenu de la densité cellulaire physiologique, le faible taux d'hémolyse lors de la remise en suspension des cellules décongelées constitue un outil simple pour enrichir les GR en vue d'une transfusion.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition comprenant des cellules non adhérentes et une solution aqueuse isotonique comprenant au moins un agent cryoprotecteur non toxique à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids/volume (p/v) et choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'agent cryoprotecteur est l'albumine sérique humaine.
3. Composition selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un additif cryoprotecteur choisi parmi le saccharose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v, le tréhalose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v, le glucose à une concentration comprise entre 0,5 et 5% p/v et la carboxymethyl cellulose à une concentration comprise entre 0,1 et 1% p/v.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les cellules non adhérentes sont des cellules sanguines, de préférence, des globules rouges.
5. Méthode de conservation de cellules non adhérentes par congélation comprenant les étapes de : a) mise en suspension desdites cellules non adhérentes dans un milieu de cryoconservation composé d'une solution aqueuse isotonique avec au moins un agent cryoprotecteur non toxique à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids et choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène ; b) optionnellement, conditionnement du mélange obtenu à l'étape a) ; c) congélation directionnelle du mélange obtenu à l'étape a) ; d) conservation à une température entre -79°C et -197 °C, préférentiellement à environ -
6. Méthode de conservation de cellules non adhérentes par congélation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'agent cryoprotecteur est l'albumine sérique humaine.
7. Méthode de conservation de cellules non adhérentes par congélation selon la revendication 5 ou la revendication 6, caractérisée en ce que le milieu de cryoconservation comprend en outre un additif cryoprotecteur choisi parmi le saccharose, le glucose, le tréhalose et la carboxymethyl cellulose.
8. Méthode de décongélation des cellules non adhérentes comprenant les étapes de : i. mise en contact des cellules congelées avec une surface chauffée à une température comprise entre 35 et 45°C ; ii. centrifugation ; iii. mise en suspension des cellules du surnageant de centrifugation dans une solution saline comprenant entre 1 à 10% de proline.
9. Kit de conservation de cellules non-adhérentes comprenant au moins un dispositif étanche de stockage de fluides biologiques stérile et une solution aqueuse isotonique comprenant au moins un agent cryoprotecteur non toxique à une concentration comprise entre 4 et 50% en poids et choisi parmi les albumines, les globulines alpha et beta et le fibrinogène et, optionnellement, un additif cryoprotecteur tel que le saccharose, la carboxymethyl cellulose, le tréhalose ou le glucose.
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