TR201816125T4 - Canlı biyolojik malzemeleri korumak, nakletmek ve saklamak için bileşim ve usul. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş doğal ve biyo-işlenmiş canlı biyolojik malzemelerin korunması, nakledilmesi ve/veya saklanması için özellikle uygun olan bir bileşim ve usul ile ilgilidir. Bileşim ve usul özellikle donma noktasının üzerindeki sıcaklıklarda korunan, nakledilen ve/veya saklanan biyolojik malzemelerde gerçekleşen fonksiyonel ve fiziksel (hücre, doku ve/veya organ) bütünlüğü kaybını önemli ölçüde önleme ve en aza indirme kabiliyeti sayesinde, biyolojik malzemelerin korunması, nakliyesi ve saklanmasına yönelik geleneksel bileşimler ve usullere göre önemli gelişmeleri temsil etmektedir. Bileşim ve usul ayrıca kozmetik prosedürlerde, özellikle biyolojik malzemelerin transplantasyonunda, bilhassa otolog veya allojenik biyolojik malzemelerin transplantasyonunda kullanım için son derece uygundur.

Description

TARIFNAME CANLI BIYOLOJIK MALZEMELERI KORUMAK, NAKLETMEK VE SAKLAMAK IÇIN BILESIM VE USUL Bulusun Alani Mevcut bulus canli doku biyo-koruina teknolojisi alanindadir. Mevcut bulus, özellikle, bir gelismis bilesim ve bulusa göre olan bilesim kullanilarak keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerinin korunmasina yönelik bir usul saglamaktadir. Mevcut bulusa göre olan gelismis bilesim ve usul, özellikle canli biyo-malzemelerin donma noktasinin üzerindeki sicakliklarda korunmasi baglaminda, canli biyolojik malzemelerin biyolojik aktivitesi ve fiziksel bütünlügündeki kaybin en aza indirilmesinde özellikle etkilidir. Mevcut bulusa göre olan gelismis bilesimler ve usul keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerinin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasinda kullanim için özellikle uygundur. Mevcut bulusa göre olan gelismis bilesimler ve usul ayrica ihtiyaci olan bir süjede biyolojik malzemelerin transplantasyonunda kullanim için, özellikle otolog veya allojenik biyolojik malzemelerin transplantasyonu için de Bulus ile ilgili bilinen hususlar Doku mühendisligi, doku transplantasyon teknolojisi, yenileyici tip ve yüz ve Vücut gençlestirme için kozmetik prosedürler gibi, büyük ölçüde dogal ve biyo-islenmis canli hücre esasli ve/veya doku esasli ürünler gibi canli biyolojik malzemelerin kullanimina dayanan yeni teknolojilerin ortaya çikmasi, dogal ve biyo-islenmis canli biyolojik malzemelerin korunmasina yönelik bilesimler ve usullere ihtiyaç dogurmustur.

Biyolojik malzemelerin korunmasina yönelik bilesimler ve usuller hem dogal ve hem de islenmis (canli) biyolojik malzemelerin sadece fonksiyonel ve fiziksel bütünlügünün korunmasi için önemli olmakla kalmayip, ayrica bu tip biyolojik malzemelerin nakliyesi ve saklanmasi (uzatilmis raf ömrü) için de önemlidir.

Biyo-koruma teknolojileri iki ana yaklasima, yani kriyo-koruma (donma noktasinin altindaki sicakliklar) ve hipotermik usullere (donma noktasinin üstündeki sicakliklar) dayanmaktadir. Kriyo-koruma usulleri tipik olarak uzun süreli saklama için gereklidir.

Ancak, donmadan dolayi yapilandirilmis dokulardaki buz olusumundan kaynaklanan erime üzerine ortaya çikan hasardan dolayi, kriyo-koruma usulleri canli hücreler ve/veya dokularin bu tip hasari kaldirma konusundaki sinirli kapasitesinden dolayi problemli olabilir.

Hipotermik usuller organ bagisi bölgeleri, biyo-mühendislik bölgeleri, islem laboratuvarlari, hücre/doku bankalari ve son kullanicilar arasinda birçok tipte hücre/dokunun geçici korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için yaygin olarak kullanilmaktadir. Hipotermik usulde, biyolojik malzeme tipik olarak sodyum, potasyum, kalsiyum, magnezyum, klorür, fosfat ve bikarbonat, glükoz, laktoz, amino asitler, vitaminler, platelet topaklasmasi önleyici/vazoaktif maddeler, kalinodulin inhibitörleri, kalsiyum kanali blokerleri, proteaz ve fosfolipaz inhibitörleri, anti-oksidanlar/serbest radikal toplayicilar, demir selatlayicilari, membran stabilizatörleri, sito-koruyucu maddeler, anti-apoptotik maddeler, metabolik substratlar, sekerler, nükleotid prekürsörleri (hep gelistiricileri), oksijen-tasiyicilar, trofik faktörler ve diger bilesikler dahil, çesitli konsantrasyonlarda çesitli katki maddelerinin eklenmesiyle modifiye edilebilen, yaygin olarak izotonik salinden olusan bir sulu salin-esasli bilesim içinde saklanir.

Ancak, canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için geleneksel bilesimlerin kullanimi sinirlidir, çünkü canli biyolojik malzemeler, hücre ve/veya doku dejenerasyonu (yani, nekroz ve/veya apoptozla) baslamadan önce nispeten kisa bir zaman periyodu boyunca basarili bir sekilde korunabilir. Ayrica, yaygin olarak kullanilan hipoterrnik usullerde kullanilan bilesimlerle iliskili bir baska büyük problem, bu tip bilesimlerin hücresel fonksiyonu düsük sicakliklarda (yani, donma noktasinin üzerinde, ancak ~37°C'nin altinda) degil, normal fizyolojik sicakliklarda (yani, ~37°C) sürdürecek sekilde tasarlanmasidir. Dolayisiyla, mevcut bilesimler biyolojik malzemelerin düsük sicakliklarda (yani, donina noktasinin üzerinde, ancak ~37°C'nin altinda) korunmasi, nakledilmesi ve/veya saklanmasi için optimum degildir.

Dolayisiyla, teknikte, canli biyolojik malzemelerin korunmasi için bu sinirlamalarin olmadigi gelismis bilesimlere ve usullere ihtiyaç vardir.

Ek olarak, koruma, nakliye ve/veya saklama için olan bilesimler genel olarak Cenin Buzagi Serumu içerir. Serum, mevcut olduklarinda, kültürlerden çikarilmasi zor olan önemli bir viral katisiklik kaynagidir. Bilimsel deneylerin sonucunu etkileyebilen ve kültürlenmis hücreye hastaliklar tasiyabilen virüsler, prionlar ve mikoplazma içerebilir.

Ek olarak, Cenin Buzagi Serumunun üretimi ciddi etik tartismalara neden olmaktadir.

Teknikte, Cenin Buzagi Serumu içermeyen, canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için gelismis bilesimlere ve korunmasi için usullere ihtiyaç vardir.

WO98/47471A1'de, saç çogaltmak için bir usul açiklanmakta ve saç hücrelerini kültürlemek için bahsedilen usulde kullanilmak üzere bilesimler ve saç hücrelerini kültürlemek için bilesimler saglanmaktadir.

Mevcut bulusun bir amaci canli biyolojik malzemelerin korunmasi için bu tip gelismis bilesiinler ve gelismis usuller saglamaktir.

Bulusun Özeti Bir birinci yönde, mevcut bulus canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için, müteakiben verilenleri içeren bir bilesimle ilgilidir: en az bir anti-apoptotik bilesik, burada bahsedilen anti-apoptotik madde bir fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigidir, en az bir anti-oksidan bilesik, eritropoetin, CD34-pozitif hücreler ve retinoik asitten olusan gruptan seçilen en az bir kök hücre gelistirici bilesik ve en az bir hücre-disi matris bilesigi.

Bir düzenlemede, fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyum, oksovanadyum ve ortovanadyumdan olusan gruptan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyumdur.

Bir düzenlemede, burada açiklanan bilesim ayrica triiyodotironin, estradiol, progesteron, doku ekstrakti, insülin, transferin, selenyum, L-sistein, adenosin trifosfat- magnezyum klorür ve L-lösinden olusan gruptan seçilen bir ikinci veya ek anti- apoptotik bilesik içerir. Bir düzenlemede, doku ekstrakti bir bovin hipofiz bezi ekstraktidir.

Bir düzenlemede, burada açiklanan bilesimdeki en az bir anti-oksidan bilesigi kuversetin, monohidroksietil, rutozid, C Vitamini, lipoik asit, deferoksamin inesilat ve E vitainininden olusan gruptan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, anti-oksidan bilesik kuversetin ve mono-hidroksietil rutozidden olusan gruptan seçilir.

Bir düzenlemede, burada açiklanan bilesimdeki kök hücre gelistirici bilesik eritropoetin, CD34-pozitif hücre ve retinoik asit grubundan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, kök hücre gelistirici bilesik eritropoetin ve CD34-pozitif hücre grubundan seçilir. Daha tercih edilen bir düzenlemede, kök hücre gelistirici bilesik eritropoetindir.

Bir düzenlemede, CD34-pozitif hücre ve/veya eritropoetin bir süjenin periferal kani veya kemik iliginden türetilir. Tercih edilen bir düzenlemede, CD34-pozitif hücre bir insan CD34-pozitif hücresi hattindan elde edilir.

Bir düzenlemede, burada açiklanan bilesimdeki hücre-disi matris bilesigi müteakiben verilenlerden olusan gruptan seçilir: platelet bakimindan zengin plazma, laminin, kolajen IV, heparin sülfat, entaktin ve kondroitin sülfat. Tercih edilen bir düzenlemede, hücre-disi matris bilesigi platelet bakimindan zengin plazmadir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, platelet bakimindan zengin plazma bir süjenin periferal kanindan türetilir.

Bir düzenlemede, mevcut bulusa göre olan bilesim ayrica en az bir degranülasyon maddesi içerir. Tercih edilen bir düzenlemede, degranülasyon maddesi Bilesik 48/ 80'dir.

Bir baska düzenlemede, burada açiklanan bilesim ayrica bir inorganik tuz içerir. Tercih edilen bir düzenlemede, inorganik tuz CaClz'dir.

Bir düzenlemede, burada açiklanan bilesim ayrica fizyolojik olarak uygun bir salin çözeltisi içerir.

Bir baska düzenlemede, burada açiklanan bilesim ayrica asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla bilesik içerir: albümin, esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitler, vitaminler, eser elementler, organik bilesenler, inorganik tuzlar, insan serum albümini, insülin, büyüme takviyeleri ve antibiyotikler.

Bir düzenlemede, mevcut bulus göre olan bilesim kullanima hazir bir formda veya bir konsantre formdadir.

Bir baska düzenlemede, mevcut bulusa göre olan bilesim sterildir.

Bir düzenlemede, mevcut bulusa göre olan bilesim keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerini korumak, nakletmek ve/veya saklamak için kullanilir.

Bir ikinci yönde, mevcut bulus keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerini korumak, nakletmek ve/veya saklamak için, asagidaki asamalari içeren bir in vitro usul ile ilgilidir: (a) burada açiklanan bir bilesimin saglanmasi; ve (b) bilesimin keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerine uygulanmasi.

Bir düzenlemede, mevcut bulusa göre olan in vitro usuldeki asama (b)'deki bahsedilen keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücreleri 0°C`nin üzerinde ve 40°C'nin altinda bir sicaklik araliginda tutulur.

Bir baska düzenlemede, mevcut bulusa göre olan bilesiin mevcut bulusa göre olan in vitro usulün asamalarinda günlük olarak yenilenir.

Bir düzenlemede, mevcut bulusa göre olan in vitro usuldeki asama (b)'deki canli biyo- malzeme yaklasik 25°C'nin altinda, daha tercihen yaklasik 15°C'nin altinda bir sicaklikta tutulur.

Bulusun Detayli Açiklamasi GENEL TANIM Burada kullanilan "nöral hücreler ve/veya nöral doku" ve "sinir hücresi ve/Veya sinir dokusu" mense sinir sisteminin iki bölümünün ana bileseni olan hücre ve/veya dokuyu belirtmektedir: merkezi sinir sistemindeki (CNS) beyin ve omurilik ve periferal sinir sistemindeki (PNS) dallanan periferal sinirler. "Sinirsel hücre ve/veya doku" terimi de yaygin olarak "nöral hücreler ve/veya nöral doku" ve "sinir hücresi ve/veya sinir dokusu" terimine bir esdeger olarak kullanilmaktadir. Mevcut bulusta, bu terimler esanlamli olarak kullanilmaktadir.

Bu terimler hem dogal ve hem de biyo-islenmis biyolojik malzemeyi kapsar ve örnegin hücreleri ve dokulari kapsar. Canli biyolojik malzeme bir organin bir bölümü olabilir veya bir bütün organ, ör., bir donör süjeden elde edilen bir organ (bir bölümü) olabilir.

Sinirlayici olmayan canli biyolojik malzeme örneklerine sunlar dahildir: sinir hücreleri, retina pigment epitelyum hücresi ve çubuklar ve koniler gibi göz hücreleri, kardiyomiyositler ve kalp atisi düzenleyici hücreler gibi kalp hücreleri, odontoblast ve diger pulpa hücreleri gibi dis hücresi, epitelyal hücreler, yag hücreleri, kan hücreleri, bagisiklik hücreleri, kas hücreleri, deri hücreleri, saç folikül kök hücreleri, embriyonik olmayan kök hücreler, embriyonik kök hücreler, kemik hücreleri, örnegin osteoblastlar, osteositler, osteoklastlar ve kikirdak hücreleri, örnegin kondrositler. Terim ayrica, sinirlayici olmaksizin, sinir dokusu, göz dokusu, kalp dokusu, dis dokusu, epitelyal doku, bag dokusu, yag dokusu, kas dokusu, deri dokusu, saç dokusu, kemik dokusu ve kikirdak dokusu gibi dokulari kapsar. Benzer sekilde, "canli biyolojik malzeme" terimi kalp, karaciger, böbrekler, gözler, pankreas, mesane, safra kesesi, ince bagirsak, tendonlar, baglar, trake, akciger, mide, yemek borusu, hipofiz bezi, tiroid bezi, burun, kulaklar, böbrek üstü bezi, testis, timüs, lenf dügümleri, dalak, kan damarlari, arterler, venler, dil, omurilik ve kemik iligi gibi organlari kapsar. Canli biyolojik malzeme herhangi bir menseye sahip olabilir, ancak tercihen insan menselidir. organlarin fizyolojik kosullara geri döndügünde normal fonksiyonlarini yerine getirme kabiliyeti olarak tanimlanmaktadir. Dokular veya organlar içinde hücre yasayabilirligini degerlendirme usullerinin örneklerine amino asit alimi, protein sentezi, kontraktilite, ribonükleik asit sentezi, 2-de0ksiglükoz fosforilasyonu ve boya alimi analizi dahildir.

Boya alimi analizinin bir örnegi tripan mavisi boyama analizidir. Analiz, ölü hücreleri (doku ve/veya organlar içindeki ölü hücreleri de) seçici bir sekilde maviye boyamak için bir tripan mavisi boyanin kullanimina dayanmaktadir. Tripan mavisi boya hücre meinbrani boyunca basitçe geçirildiginde ölü hücreler tarafindan kolayca absorbe edilirken, tripan mavisi boya canli hücrelerin hücre membrani boyunca geçisi aktif bir sekilde bloke edilir. Sonuç olarak, mikroskop altinda canli hücreler boyasiz olurken, sadece ölü hücreler ayirt edici bir mavi renkle belirlenir. Tripan mavisiyle boyama analizi hücre ve/veya doku yasayabilirliginin degerlendirilmesi için mikroskopide rutin bir sekilde kullanilmaktadir. Mevcut bulus baglaminda, tripan mavisi ile boyanma olmamasi veya azalma olmasi sirasiyla herhangi bir hücre ve/veya doku ölümü olmadiginin güvenilir bir isareti veya hücre ve/veya doku yasayabilirliginde bir artisin güvenilir bir isareti olarak kabul edilir.

Burada kullanilan "anti-apoptotik bilesik" terimi apoptozu önleyebilen veya azaltabilen bir bilesigi belirtmektedir. "Anti-apoptotik bilesik" terimi teknikte uzman kisilerce anti- apoptotik akviteye sahip olan bilesikleri veya maddeleri tanimlamak için yaygin olarak kullanilmaktadir. Anti-apoptotik bilesiklerin Sinirlayici olmayan örneklerine sunlar dahildir: fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesikleri (ör. bis (maltolato) oksovanadyum, oksovanadyum, ortovanadyum), triyodotironin, estradiol, progesteron, insülin, transferin, selenyum, L-sistein, L-lösin, adenosin trifosfat-magnezyum klorür, doku ekstrakti (ör. bovin hipofiz ekstrakti) ve digerleri.

Burada kullanilan "anti-oksidan bilesik" terimi diger moleküllerin oksitlenmesini inhibe eden veya azaltabilen ve/veya bir hücre ve/veya dokuda oksitleyici baskinin etkilerine karsi koyabilen bir bilesigi belirtmektedir. Teknikte uzman kisiler "anti-oksidan" teriminin anlamina oldukça asinadir ve çesitli bilesiinler veya ürünlerde kullanilan iyi bilinen bir bilesik kategorisi olarak tanimlar. Sinirlayici olmayan anti-oksidan örneklerine sunlar dahildir: kuversetin, monohidroksietil rutozid, C vitamini, lipoik asit, deferoksamin mesilat, E vitamini ve digerleri.

Burada kullanilan "kök hücre gelistirici bilesik" terimi bir kök hücrenin yeniden programlanmasini veya bir kök hücrenin arzu edilen bir doku tipine farklilasmasini gelistirebilen bir bilesigi belirtmektedir. Kök hücre gelistirici bilesikler yaygin olarak ayrica kültür kosullari altinda genomik stabiliteleri ve yasayabilirliklerini sürdürürken kök hücrelerin çogalmasini desteklemek için kullanilir. Teknikte uzman kisiler, özellikle kök hücrelerin in vitro olarak çesitli tiplerde dokular olusturmak için kullanildigi yenileyici tip ve kozmetik prosedürler baglaminda, "kök hücre gelistirici bilesik" terimine oldukça asinadir. Kök hücre gelistirici bilesiklere eritropoetin, CD34- pozitif hücreler, retinoik asit dahildir. "CD34-pozitif hücre" terimi bir hücre-hücre yapisma faktörü olarak görev yapan bir yüzey glikoproteini olan moleküler isaret CD34 için pozitif olan bir hücreyi belirtmektedir. CD34 ayrica kök hücrelerin kemik iligi hücre-disi matrisine veya dogrudan stromal hücrelere baglanmasina aracilik edebilir.

CD34 ayrica proteini kodlayan insan geninin adidir. CD34, basit kandan ve kemik iliginden türetilen progenitör hücreler için, özellikle hematopoetik ve endotelyal progenitörler için iyi bilinen bir isarettir. CD34-pozitif hücreler bir süjedeki periferal kan veya kemik iliginden izole edilebilir. CD34-pozitif hücreler bir kök hücre gelistirici bilesik örnegidir.

Mevcut bulus baglaminda "otolog" terimi ayni süjenin vücudundan türetilmis veya nakledilmis" anlamina gelir ve bir süjenin ayni süjeye uygulanacak veya nakledilecek olan (istege bagli olarak vücudun bir baska bölümüne) organlari, dokulari, hücreleri, sivilari veya proteinleri olabilir. Bu tip "otolog" prosedürle nakledilen organlar, dokular, hücreler veya proteinler bir otogref veya ototransplant olarak belirtilmektedir.

Burada kullanilan "allojenik" terimi bir donör süjeden alinan ve donör süjeyle genetik olarak özdes olmayan ayni türden bir alici süjeye uygulanacak veya nakledilecek olan organlari, dokulari, hücreleri, sivilari veya proteinleri belirtmektedir. Bu tip "allojenik" prosedürle nakledilen organlar, dokular, hücreler, sivilar veya proteinler bir allogref veya allotransplant olarak belirtilmektedir.

Burada kullanilan "fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi" terimleri teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Canli dokulari geçici olarak korumak için ve parenteral olarak uygulanan islaçlar için bir çözücü olarak kullanilan, vücut sivilari veya vücut hücreleri, dokulari ve/veya organlari için izotonik olan bir steril sodyum klorür salin çözeltisini belirtmektedir. Mevcut bulusta, bir salin çözeltisi ozmolalitesi yaklasik 300 mOsm ve ozmolaritesi yaklasik 154 mmol sodyum ve yaklasik 154 mmol klorür olan, bir litre su içindeki yaklasik %090 a/h sodyum klorür çözeltisi olarak tanimlanmaktadir.

Burada kullanilan "izotonik çözelti" terimi etkili ozmol konsantrasyonu bir baska çözeltinin veya karsilastirildigi bir baska hücre ve/Veya dokunun çözünen madde konsantrasyonuyla ayni olan bir çözeltiyi belirtmektedir. Bu durum, örnegin, su ve toplam çözünen madde moleküllerinin konsantrasyonu bir harici çözeltide hücre içerigindekiyle ayni oldugunda ortaya çikar. Su molekülleri plazma membrani boyunca her iki yönde de yayildigindan ve su yayilma hizi her iki dogrultuda da ayni oldugunda, hücre ne su kazani ne de kaybeder. Mevcut bulusta, bir izotonik bilesim hem su ve hem de toplam çözünen madde moleküllerinin konsantrasyonun bir harici çözeltide mevcut bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen veya saklanan hücrenin hücre içerigindekiyle veya mevcut bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen veya saklanan bir doku ve/veya organin bir parçasi olan hücrelerin hücre içerigiyle ayni oldugu bir çözeltiyi belirtmektedir.

BULUSA GÖRE OLAN BILESIM Mevcut bulus biyolojik malzeme korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasina kullanim için uygun bir bilesim saglamaktadir. Mevcut bulusun sahibi özellikle mevcut bulusa göre olan bilesimin bilhassa hücreler, dokular ve/veya organlar dahil, korunmalari, nakliyeleri ve/veya saklanmalari sirasinda biyolojik malzemelerin fonksiyonel ve fiziksel bütünlüklerinin korunmasinda etkili oldugunu bulmustur. Apoptotik ve/veya nekrotik tahribat seviyesinin bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan canli biyolojik malzemelerde, salin çözeltisi esasli bilesimlerde veya bir temel büyüme serumu ortami içinde korunanlara kiyasla önemli ölçüde azaldigi gözlemlenmistir. Ayrica viral katisiklik seviyesinin (örnegin virüsler, prionlar ve mikoplazmadan kaynaklanan) bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan canli biyolojik malzemelerde, salin çözeltisi esasli bilesimlerde veya bir temel büyüme serumu ortami, Özellikle Cenin Bovin Serumu (Cenin Buzagi Serumu olarak da bilinmektedir) veya insan serumu dahil hayvan serumu içerenler içinde korunanlara kiyasla azaldigi gözlemlenmistir.

Ayrica, mevcut bulusun sahibi, bulusa göre olan bilesimin canli biyolojik malzemelerin donma noktasinin üzerindeki, yani sifirdan yüksek 37°C'den düsük sicakliklarda korunabildigi, nakledilebildigi ve/veya saklanabildigi zaman penceresini uzattigini göstermistir. Özellikle, canli biyolojik malzemelerin bulusa göre olan bilesim içinde minimum fonksiyonel ve fiziksel bütünlük kaybi sürdürülerek uzun zaman periyotlari boyunca korunabildigi, nakledilebildigi ve/veya saklanabildigi gözlemlenmistir.

Bir birinci yönde, mevcut bulus canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için uygun olan, müteakiben verilenleri içeren bir bilesimle ilgilidir: en az bir anti-apoptotik bilesik, burada bahsedilen anti-apoptotik madde bir Iizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigidir, en az bir anti-oksidan bilesik, eritropoetin, CD34- pozitif hücreler ve retinoik asitten olusan gruptan seçilen en az bir kök hücre gelistirici bilesik ve en az bir hücre-disi matris bilesigi. Anti-apoptotik bilesikler, anti-oksidan bilesikler, kök hücre gelistirici bilesikler ve hücre-disi matris bilesikleri ayri ayri olarak teknikte iyi bilinmektedir ve piyasadan temin edilebilir. Anti-apoptotik bilesikler, anti- oksidan bilesikler, kök hücre gelistirici bilesikler ve hücre-disi matris bilesiklerini hazirlama protokolleri ve usulleri de teknikte iyi bilinmektedir. Her türlü piyasadan temin edilebilen veya hazirlanabilen anti-apoptotik bilesikler, anti-oksidan bilesikler, kök hücre gelistirici bilesikler, hücre-disi matris bilesikleri mevcut bulusa göre olan bilesimin hazirlanmasinda kullanilabilir.

Bir düzenlemede, fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyum, oksovanadyum ve ortovanadyum grubundan seçilir. Tercih edilen bir düzenlemede, fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyumdur.

Mevcut bulusa göre olan bilesimde her türlü fizyolojik olarak uygun bis (maltolato) oksovanadyum konsantrasyonu (mg/ml) kullanilabilir. Örnegin, bis (maltolato) oksovanadyum konsantrasyonu yaklasik 0.01-100 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.1- mg/ml, daha tercihen yaklasik @5-8 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.6-6 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.7-3 mg/ml, yaklasik 0.8-2 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.9- 1.5mg/ml, daha tercihen yaklasik lmg/ml araligi içinde olabilir. Mevcut bulusun sahibi, bir fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi, özellikle bis (maltolato) oksovanadyum gibi bir anti-apoptotik bilesigin kullaniminin bir temel anti-apoptotik bilesik olarak özellikle etkili oldugunu bulinustur. Özellikle, bulusa göre olan bilesime bir fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi, özellikle bis (maltolato) oksovanadyum eklenmesinin, bilesimde mevcut olan diger bilesenlerin, örnegin büyüme faktörlerinin etkinligini arttirdigi bulunmustur.

Bir düzenlemede, bis (maltolato) oksovanadyum, oksovanadyum ve ortovanadyum birbirlerini yerine kullanilmaktadir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim ayrica triiyodotironin, estradiol, progesteron, doku ekstrakti, insülin, transferin, selenyum, L-sistein, adenosin trifosfat-magnezyum klorür ve L-lösinden olusan gruptan seçilen bir ikinci veya ek anti-apoptotik bilesik Bir düzenlemede, doku ekstrakti bir bovin hipofiz ekstraktidir. Bovin hipofiz ekstraktlari gibi doku ekstraktlari teknikte bilininektedir ve piyasadan temin edilebilir.

Doku ekstrakti hazirlanmasina yönelik usuller ve protokoller de teknikte iyi bilinmektedir. Her türlü piyasadan temin edilebilen veya hazirlanan doku ekstrakti bulusa göre olan bilesimi hazirlamak için kullanilabilir, ancak bovin hipofiz ekstrakti tercih edilir. Bulusa göre olan bilesim içinde koruma, nakletme ve/veya saklama sirasinda hücrelerin, dokularin ve/veya organlarin hücre ve/veya doku farklilasmasina maruz kalmasini önlemek amaciyla bulusa göre olan bilesime bir doku ekstrakti, özellikle bir bovin hipofiz ekstrakti eklenmesi özellikle avantajli olabilir. Hücreler, dokular ve/veya organlarin farklilasmaya maruz kalmasinin önlenmesi hücrelerin, dokularin ve/veya organlarin kesintisiz bir sekilde orijinal durumlarinda, yani koruma, nakletme ve/veya saklama fazlari boyunca bilesimle ilk temas ettiklerindeki gibi korunmalari için önemlidir.

Bir düzenlemede, asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az iki, üç, dört, bes, alti, yedi, sekiz, dokuz, on veya daha fazla antiapoptotik bilesik: fizyolojik olarak uygun bir vanadyum bilesigi (ör. bis (maltolato) oksovanadyum ve/veya oksovanadyum ve/veya ortovanadyum), triyodotironin, estradiol, progesteron, doku ekstrakti (ör. bovin hipofiz ekstrakti), insülin, transferin, selenyum, L-sistein, adenosin trifosfat-magnezyum klorür ve L-lösin, bulusa göre olan bilesimde mevcuttur. Özellikle, mevcut bulusun sahibi, en az iki, tercihen üç, tercihen dört, tercihen bes, tercihen alti, tercihen yedi, tercihen sekiz, tercihen dokuz ve daha tercihen on anti- apoptotik bilesik eklenmesinin özellikle etkili oldugunu, yani bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünü korunmasinin sadece bir anti-apoptotik bilesik mevcut olan bir çözeltiye kiyasla gelistirdigini bulmustur.

Bilesimdeki en az bir antioksidan bilesigi asagidakilerden olusan gruptan seçilebilir: kuversetin, monohidroksietil rutozid, C vitamini, lipoik asit, deferoksamin mesilat ve E vitamini. Tercih edilen bir düzenlemede, anti-oksidan bilesik kuversetin ve mono- hidroksietil rutozidden olusan gruptan seçilir, daha tercihen mono-hidroksietil rutoziddir. Mevcut bulusun sahibi, bu bilesiklerin özellikle etkili oldugunu, yani bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fiziksel bütünlügünü daha da gelistirdigini bulmustur. yaklasik 0.12-2 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.15-1.5 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.4 ing/ml, daha tercihen yaklasik O.23-0.3 mg/ml, daha tercihen yaklasik 0.23- 0.28 mg/ml ve daha tercihen yaklasik 0.25 mg/ml araligi içinde bir konsantrasyon gibi her türlü fizyolojik olarak uygun mono-hidroksietil rutozid konsantrasyonu (mg/ml) mevcut bulusa göre olan bilesimde kullanilabilir.

Bir düzenlemede, asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az ik, üç veya daha fazla anti-oksidan bilesik: kuversetin, monohidroksietil rutozid, C vitamini, lipoik asit, deferoksamin mesilat ve E vitamini, bulusa göre olan bilesime eklenir. Bulus sahibi, üç anti-oksidan bilesik gibi iden fazla anti-oksidan bilesik mevcudiyetinin bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünü sadece bir anti-oksidan bilesik mevcut olan bir çözeltiye kiyasla daha da gelistirdigini bulmustur.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesimdeki en az bir kök hücre gelistirici bilesik sunlardan olusan gruptan seçilir: eritropoetin, bir CD34-pozitif hücre ve retinoik asit.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesimdeki en az bir kök hücre gelistirici bilesik eritropoetin ve CD34-pozitif hücreden olusan gruptan seçilir.

Bir düzenlemede, kök hücre gelistirici bilesik bir CD34-pozitif hücredir. Mevcut bulusa göre olan bilesimde her türlü fizyolojik olarak uygun miktarda (hücre/m1) CD34-pozitif hücre kullanilabilir, ancak yaklasik 1x101-1x105 hücre/ml, daha tercihen yaklasik hücre/ml, daha tercihen yaklasik 9x102-0.15 xlO4 hücre/ml, daha tercihen yaklasik lxlO3 CD34-pozitif hücre/ml tercih edilir. Bir düzenlemede, CD34-pozitif hücre bir CD34-pozitif hücre hattindan elde edilebilir veya elde edilir. CD34-pozitif hücre hatlari teknikte bilinmektedir ve örnegin KG-la, KG-l ve NIH3T3 piyasadan temin edilebilir.

Bir baska düzenlemede, CD34-pozitif hücre KG-la, KG-l ve NIH3T3 gibi piyasadan da temin edilebilen bir insan CD34-pozitif hücresi hattindan elde edilebilir veya elde edilir.

Ancak, bir baska tercih edilen düzenlemede, CD34-pozitif hücre bir donör süjenin periferal kani veya kemik iliginden türetilir. Bir donörün örneklerine bir insan olmayan memeli veya bir insan dahildir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, donör bir insan süjedir. Bir donör süjenin periferal kani veya kemik iliginden CD34-pozitif hücrelerin izole edilmesi ve belirlenmesine yönelik usuller teknikte bilinmektedir.20 Tercih edilen bir düzenlemede, kök hücre gelistirici bilesik eritropoetindir. Her türlü fizyolojik olarak uygun eritropoetin miktari mevcut bulusta kullanilabilir, ancak yaklasik 0.1 birim ila 10 birim eritropoetin/ml, tercihen yaklasik 0.3 birim ila 8 birim eritropoetin/ml, tercihen yaklasik 0.5 birim ila 6 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.7 birim ila 4 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.9 birim ila 2 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.95 birim ila 1.5 birim eritropoetin/ml, daha tercihen yaklasik 1 birim eritropoetin/ml kullanilir. Bir düzenlemede, eritropoetin bir ticari kaynaktan elde edilebilir. Tercih edilen bir düzenlemede, eritropoetin bir donör süjeden, örnegin bir donör süjenin kan dolasimindan veya kemik iliginden elde edilebilir. Bir donörün örneklerine bir insan olinayan memeli veya bir insan dahildir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, donör bir insan süjedir. Periferal kan veya kemik iliginden eritropoetin elde edilmesine yönelik usuller teknikte bilinmektedir. Teknikte uzman kisiler eritropoetin miktari için bir ölçü birimi olarak "Birim" ("U" olarak kisaltilir) terimine oldukça asinadir. Eritropoetin miktarlari gram veya molden ziyade birim (U) cinsinden ifade edilir, çünkü dogal eritropoetin ve rekombinant insan eritropoetini farkli biyoaktiviteleri olan izoformlarin karisimlaridir. Mevcut bulusta, bir birim, fenilhidrazin uygulanan farelerin dalak hücrelerine l birim WHO - eritropoetin referans standardi (2. Birinci Uluslararasi Referans Terkibi) olarak ifade edilene esdeger 3[H]-timidin eklenmesini saglamak için gereken eritropoetin miktari olarak tanimlanmaktadir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesiinde eritropoetin, CD34-pozitif hücreler ve retionik asit grubundan seçilen en az iki veya en az üç veya daha fazla kök hücre gelistirici bilesik mevcuttur. Mevcut bulusun sahibi, asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az iki kök hücre gelistirici bilesigin mevcudiyetinin, tercihen üç kök hücre gelistirici bilesigin mevcudiyetinin: eritropoetin, CD34-pozitif hücre ve retionik asit, bilesimin etkinliginde bir artis sagladigini, yani bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fiziksel bütünlügünü daha da arttirdigini bulmustur.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim ayrica en az bir degranülasyon maddesi içerir. Tercih edilen bir düzenlemede, degranülasyon maddesi Bilesik 48/80'dir. Bilesik 48/80 gibi degranülasyon maddeleri teknikte bilinmektedir ve piyasadan temin edilebilir. Bulusa göre olan bilesim ayrica degranülasyon maddesinin etkisinin optimize edilmesine yardimci olabilen en az bir inorganik tuz da içerebilir. Inorganik tuzlar teknikte bilinmektedir ve bunlar da piyasadan temin edilebilir. Bir düzenlemede, inorganik tuz CaClz'dir. Bulusa göre olan bilesimde CD34-pozitif hücreler mevcut oldugu takdirde, Bilesik 48/80 gibi en az bir degranülasyon maddesi ve CaClZ gibi en az bir inorganik tuz eklenmesi özellikle avantajli olabilir. CD34-pozitif hücrelerin sitoplazmalari içinde birden fazla granül içerdigi bilinmektedir. Degranülasyon maddesi (tercihen bir inorganik tuzla kombinasyon halinde) bir CD34-pozitif hücreyi nihai olarak bulusa göre olan bilesime büyüme faktörlerinin salininasina yol açan daha küçük parçalar halinde kesmek için (yani degranülasyon) kullanilir. Degranülasyonun ardindan, bir CD34-pozitif hücrenin kalintilari istege bagli olarak bilesimden örnegin santrifüjle uzaklastirilabilir. Olusan bilesim daha sonra canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için kullanilabilir. Piyasadan temin edilebilen veya hazirlanan her türlü degranülasyon maddesi ve organik tuz bulusa göre olan bilesimin hazirlanmasi için kullanilabilir. Ancak, CaClg ile kombinasyon halinde Bilesik 48/80 tercih edilir, çünkü mevcut bulusun sahibi bu kombinasyonu CD34-pozitif hücrelerde daha verimli bir degranülasyon sagladigini gözlemlemistir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesimdeki en az bir hücre-disi matris bilesigi platelet bakimindan zengin plazma, laminin, kolajen IV, heparin sülfat, entaktin ve kondroitin sülfat grubundan seçilir. "Hücre-disi matris bileseni" terimi teknikte uzman kisilerce iyi bilinen bir terimdir. Diger hücre-disi matris bilesiklerinin sinirlayici olmayan örnekleri piyasadan yaygin bir sekilde temin edilebilen kolajen, laminin, elastin, fibronektin ve benzerleridir. Bunlarin ikameleri de teknikte bilinmektedir ve piyasadan temin edilebilir. Hücre-disi matris bilesiklerinin hazirlanmasina yönelik usuller ve protokoller de teknikte iyi bilinmektedir. Her türlü hazirlanan veya piyasadan temin edilebilen hücre-disi bilesik bulusa göre olan bilesimde kullanilabilir. Tercih edilen bir düzenlemede, en az bir hücre-disi matris bilesigi platelet bakimindan zengin plazmadir. Her türlü fizyolojik olarak uygun platelet bakimindan zengin plazma konsantrasyonu mevcut bulusta kullanilabilir, ancak yaklasik 0.0005-5 ml/ml, daha tercihen yaklasik 0.05 ml/ml araligi içindeki bir platelet bakimindan zengin plazma20 konsantrasyonu tercih edilir. Bir baska düzenlemede, platelet bakimindan zengin plazma bir donörün, tercihen bir insan süjenin periferal kanindan türetilir. Bir süjenin kanindan platelet bakimindan zengin plazma elde edilmesine yönelik protokoller ve usuller teknikte bilinmektedir. Mevcut bulusun sahibi, platelet bakimindan zengin plazma eklenmesinin bulusa göre olan bilesimi özellikle etkili hale getirdigini, yani bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fiziksel bütünlügünü daha da gelistirdigini göstermistir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesiinde platelet bakimindan zengin plazma, laininin, kolajen IV, heparin sülfat, entaktin ve kondroitin sülfattan seçilen en az iki, üç, dört, bes veya daha fazla hücre-disi matris bilesigi mevcuttur. Mevcut bulusun sahibi, bulusa göre olan bilesime en az iki, tercihen üç, tercihen dört, tercihen bes, daha tercihen alti hücre-disi matris bilesigi eklenmesinin daha etkili bir bilesim sagladigini, yani tek bir hücre-disi matris bileseninin mevcut oldugu bilesime kiyasla, bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan hücreler, dokular ve/veya organlarin fonksiyonel ve fiziksel bütünlügünün korunmasina yönelik gelismis bir kabiliyet sagladigini bulmustur.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim sunlari içerir: bis (maltolato) oksovanadyum; eritropoetin; ve asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az bir antioksidan bilesik: kuversetin, monohidroksietil rutozid, C vitamini, lipoik asit, deferoksamin mesilat ve E vitamini, tercihen en az mono-hidroksietil rutozid içerir; ve en az bir hücre-disi matris bilesigi, tercihen en az platelet bakimindan zengin plazma. Mevcut bulusta her türlü fizyolojik olarak uygun konsantrasyonda bis (maltolato) oksovanadyum, eritropoetin, mono-hidroksietil rutozid ve platelet bakimindan zengin plazma kullanilabilir. Ancak, Bis (maltolato) oksovanadyum/ml, tercihen yaklasik 0.5-8 mg Bis (maltolato) oksovanadyum/ml, tercihen yaklasik 0.6-6 mg Bis (maltolato) oksovanadyum/ml, tercihen yaklasik 0.7-3 mg Bis (maltolato) oksovanadyum/ml, tercihen yaklasik 0.8- 2 mg Bis (maltolato) oksovanadyum/ml, tercihen yaklasik 09-15 mg Bis (maltolato) oksovanadiu/ml, daha tercihen yaklasik lmg Bis (maltolato) oksovanadyum/ml ve yaklasik 0.1 birim ila 10 birim eritropoetin/ml, tercihen yaklasik 0.3 birim ila 8 birim eritropoetin/ml, tercihen yaklasik 0.5 birim ila 6 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.7 birim ila 4 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.9 birim ila 2 birim eritropoetin/ml, yaklasik 0.95 birim ila 1.5 birim eritropoetin/ml, daha tercihen yaklasik 1 birim eritropoetin/ml mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen yaklasik 0.12-2 mg mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen yaklasik 0.15-l.5 mg mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen yaklasik 018-] mg mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen yaklasik 02-05 mg mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen yaklasik 0.21-0.4 mg mono-hidroksietil rutozid/ml, tercihen mono-hidroksietil rutozid/ml, daha tercihen yaklasik 0.25 mg mono-hidroksietil rutozid/ml ve 0.0005-5 ml platelet bakimindan zengin plazma/ml, tercihen yaklasik platelet bakimindan zengin plazma/ml, tercihen yaklasik 0.02-0.15 ml platelet bakimindan zengin plazma/ml, tercihen yaklasik 0.03-O.10 ml platelet bakimindan zengin plazma/ml, tercihen yaklasik 0.04-0.08 ml platelet bakimindan zengin plazma/m1, tercihen yaklasik 0.045-0.06 ml platelet bakimindan zengin plazma/ml, daha tercihen yaklasik 0.05 ml platelet bakimindan zengin plazma/ml kullanilmasi uygun olabilir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim bir izotonik çözeltidir. Bir düzenlemede, agirlik/hacim, örnegin yaklasik %90 agirlik/hacim sodyum klorür içerir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, çözelti bir litre çözücü basina yaklasik 200-400 mOsm, örnegin yaklasik 250-350 mOsm, örnegin yaklasik 300 mOsm ozmolaliteye sahiptir. Bir baska düzenlemede, çözelti bir litre çözücü basina yaklasik 120-190 mmol, örnegin yaklasik yaklasik 154 mmol sodyum ve bir litre çözücü basina yaklasik 120-190 mmol, örnegin örnegin yaklasik 154 mmol klorür molaritesine sahiptir. Mevcut bulusta, çözücü tercihen su veya bir sulu çözeltidir. Bir düzenlemede, çözelti korunacak olan canli biyolojik malzemeninkine büyük ölçüde esit bir ozmolaliteye sahiptir. Hücre tahribatini, örnegin hücrenin dahili ortami ve harici ortaini (yani, bulusa göre olan bilesim) arasindaki ozmolalite dengesinden dolayi hücrelerin patlayarak açilmasini önlemek için,20 bu özellikle avantajlidir. Bir izotonik çözelti hazirlanmasina yönelik protokoller ve usuller teknikte bilinmektedir. Izotonik çözelti tercihen sterildir, ancak bu zaruri degildir.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan canli biyolojik hücreler ve/veya dokunun alindigi süje için otolog olmadigi sürece, burada açiklanan bilesim, Cenin Bovin Seruinu (Cenin Buzagi Serumu olarak da bilinmektedir) veya insan seruinu dahil herhangi bir hayvan seruinu içermez.

Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan bir canli biyolojik dokunun alindigi süje için otolog olmadigi sürece, Cenin Bovin Serumu (Cenin Buzagi Serumu olarak da bilinmektedir) veya insan serumu dahil herhangi bir hayvan serumu içermeyen burada açiklanan bilesim insan vücuduna veya üzerine tekrar uygulanmasi öngörülen hücreler ve dokularin korunmasi, nakledilmesi ve/veya saklanmasi için uygun olabilir.

Bir baska düzenlemede, bulusa göre olan bilesim ayrica asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla bilesen içerir: albümin, esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitler, vitaminler, eser elementler, organik bilesenler, inorganik tuzlar, insan serum albümini, insülin, büyüme takviyeleri ve antibiyotikler. Inorganik tuzlarin sinirlayici olmayan örneklerine sodyum klorür, potasyum klorür, magnezyum sülfat, sodyum fosfat, kalsiyum klorür, glükoz sodyum bikarbonat, sodyum laktat ve sodyum piruvat dahildir. Bahsedilen bilesenlerin bir veya daha fazlasinin eklenmesi, patojenlerin veya baska maddelerin katisikliga neden olmasi önlenirken, bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan canli biyolojik malzemelerin fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünün daha iyi korunmasi için özellikle avantajli olabilir. Patojenlerin ve diger katisikliga neden olan maddelerin ortadan kaldirilmasi bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan hücrelerin, dokularin ve/veya organlarin bir alici süje için transplantlar veya implantlar olmasinin öngörüldügü baglam dahilinde önemlidir. Genel olarak, bu islem bahsedilen süjede enflamasyon ve/veya bagisiklik retleriyle ilgili komplikasyonlarin ortaya çikmasini önler.

Bir düzenlemede, bilesim kullaniina hazir bir formda veya, örnegin, su içinde seyreltilmek üzere, konsantre bir formda olabilir. Teknikte uzman kisiler bir konsantre20 bilesimin su veya baska sulu çözücüler içinde nasil uygun sekilde seyreltilecegini bilir.

Bir baska düzenlemede, bulusa göre olan bilesim sterildir. Bir steril bilesimin hazirlanmasina yönelik usuller ve protokoller teknikte bilinmektedir. Bulusa göre olan bilesimin sterilize edilmesi, bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan hücrelerin, dokularin ve/veya organlarin bir alici süje için transplantlar veya implantlar olmasinin öngörüldügü baglain dahilinde özellikle avantajli olabilir. Genel olarak, bu islem de bahsedilen süjede enflamasyon ve/veya bagisiklik retleriyle ilgili komplikasyonlarin ortaya çikmasini önler.

Bir düzenlemede, canli biyolojik malzeme dogal ve/Veya biyo-islenmis biyolojik inalzemedir. Bir baska düzenlemede, canli dogal ve/veya biyo-islenmis biyolojik malzeme sunlardan olusan gruptan seçilir: hücre ve doku. Ayrica dogal ve/veya biyo- islenmis canli hücrenin sinir hücresi, retina pigment epitelyum hücresi ve çubuk ve koni gibi göz hücresi, kardiyomiyosit ve kalp atisi düzenleyici hücre gibi kalp hücresi, odontoblast ve diger pulpa hücreleri gibi dis hücresi, epitelyal hücre, keratinosit hücresi, fibroblast hücresi, yag hücresi, kan hücresi, bagisiklik hücresi, kas hücresi, deri hücresi, saç folikül kök hücresi, embriyonik olmayan kök hücre, embriyonik kök hücre, kemik hücresi, örnegin osteoblast, osteosit, osteoklast ve kikirdak hücresi, örnegin kondrositler ve benzerlerinden olusan gruptan seçildigi açiklanmaktadir. Ayrica, dogal ve/Veya biyo- isleninis canli dokunun sinir dokusu, göz dokusu, kalp dokusu, dis dokusu, epitelyal doku, kreatinosit dokusu, fibroblast dokusu, bag dokusu, yag dokusu, kas dokusu, deri dokusu, saç dokusu, kemik dokusu ve kikirdak dokusu ve benzerlerinden olusan gruptan seçildigi açiklanmaktadir.

Bir düzenlemede, canli biyolojik malzeme bir organin, tercihen bir donör süjeden elde edilen bir bütün organin bir bölümüdür. Ayrica, canli organin beyin, omurilik, sinirler, göz, kalp, dis, karaciger, böbrek, pankreas, mesane, safra kesesi, ince bagirsak, tendon, bag, trake, akciger, mide, yemek borusu, tiroid bezi, hipofiz bezi, böbrek üstü bezi, yumurtalik, plasenta, göbek bagi, burun, dil, kulaklar, testis, timüs, lenf dügümü, dalak, kan damari, arter, ven, kemik iligi ve benzerlerinden olusan gruptan seçildigi açiklanmaktadir. Bir baska tercih edilen düzenlemede, bulusa göre olan bilesim içinde korunacak, nakledilecek ve/veya saklanacak olan dogal ve/veya biyo-islenmis biyolojik malzeme (yani, hücre, doku ve/veya organ) insan menselidir.

Bir düzenlemede, hücreler, dokular ve/veya organlar içeren canli biyolojik malzemenin korunmasi, nakledilmesi ve/veya saklanmasi için sicaklik donma noktasinin üzerinde, yani, 0°C'nin üzerindedir. Sicaklik yaklasik 40, 39, 38 veya 37°C'nin altinda olabilir.

Hücre, doku ve/veya organ içeren canli biyolojik malzemenin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için sicaklik, örnegin yaklasik 2, 3, 4 veya 5°C ila yaklasik 10, 15, Canli biyolojik malzeme bulusa göre olan bilesim içinde, hücrelerin, dokularin ve organlarin fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügü büyük ölçüde korunurken (düsük seviyede hücre ölümünün gösterdigi sekilde), yaklasik bir yil, 1 1 ay, 10 ay, 9 ay, 8 ay, 7 Bir düzenlemede, bulusa göre olan bilesim kozmetik amaçlarla ve/veya tibbi amaçlarla, örnegin yenileyici tip amaçlariyla ihtiyaci olan bir hastaya canli biyolojik malzeme implantasyonu veya transplantasyonunda kullanim için özellikle uygundur. Bulusun bir düzenlemesinde, bir süjeye implantasyonu veya transplantasyonu yapilacak olan canli biyolojik malzeme allojenik canli biyolojik malzeme (yani, ani türden, genetik olarak özdes olinayan bir süjeden elde edilen) veya otolog canli biyolojik malzeme (ayni süjeden elde edilen) olabilir. Bir düzenlemede, bir süjeye otolog canli biyo-malzemenin transplantasyonu veya implantasyonunun yapilacagi durumda, bulusa göre olan bilesimin bahsedilen hastadan elde edilen CD34-pozitif hücreler ve/veya platelet bakimindan zengin plazma içermesi tercih edilir. Tercih edilen bir düzenlemede, bir süjeye otolog canli biyo-malzemenin transplantasyonu veya implantasyonunun yapilacagi durumda, bulusa göre olan bilesimin bahsedilen hastadan elde edilen eritropoetin ve/veya platelet bakimindan zengin plazma içermesi tercih edilir.

Implantasyon veta transplantasyon prosedürü sirasinda bahsedilen hastada enflamasyon ve/Veya bagisiklik reddi ile komplikasyonlarin ortaya çikmasini önlemek amaciyla bulusa göre olan bilesime bahsedilen hastanin periferal kani ve/Veya kemik iliginden elde edilen otolog elemanlarin eklenmesi özellikle avantajlidir.

CANLI BIYOLOJIK MALZEMENIN KORUNMASINA YÖNELIK BULUSA GÖRE OLAN USUL Bir ikinci yönde, bulus keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerini korumak için, asagidaki asamalari içeren bir gelismis usul ile ilgilidir: (a) burada açiklanan bulusa göre olan bir bilesimin saglanmasi; (b) bulusa göre olan bilesimin keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerine, örnegin keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerinin bahsedilen bilesime batirilmasiyla uygulanmasi; (c) istege bagli olarak bilesimin, örnegin, günlük olarak yenilenmesi; ve (d) istege bagli olarak, asama (b)'deki keratinosit hücreleri ve/Veya saç folikül hücrelerinin donma noktasinin (O°C) üzerinde, örnegin 2°C, 4°C, 6°C'nin üzerinde veya 10°C'nin altinda bir sicaklikta tutulmasi.

Korunacak ve/veya saklanacak olan keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücreleri, bahsedilen keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerinin üzerinde en azindan ince bir bilesim tabakasinin gözlemlenebilecegi sekilde, bulusa göre olan bilesimle kaplanabilir. Örnegin, mevcut bulusa göre olan bilesim bir jel, bir yari-sivi veya bir macun formunda oldugu takdirde, keratinosit hücreleri ve/Veya saç folikül hücreleri üzerine uygulanabilir. Alternatif olarak, bulusa göre olan bilesim bir siVi formunda oldugu takdirde, keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücreleri bahsedilen sivi bilesim içine batirilabilir.

Bilesimin düzenli bir sekilde, örnegin günlük bazda yenilenmesinin özellikle korunacak, nakledecek ve/veya saklanacak olan biyolojik malzemenin fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünün (düsük hücre Ölümü seviyesi ile gösterilen) korunmasi bakimindan, bilesimin etkinligini arttirdigi bulunmustur.

BULUS ILE ILGILI SEKILLERE YÖNELIK KISA AÇIKLAMA Sekil 1, 4 saat süreyle bir salin çözeltisi içinde korunan saç foliküllerine (panel B) kiyasla, 4 saat süreyle bulusa göre olan bilesim içinde korunan saç foliküllerinin (panel D) fotograflarini göstermektedir. Sonuçlar, tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilen hücre ölümü seviyesinin 4 saat süreyle bir salin çözeltisi içinde korunan saç foliküllerine (panel B) kiyasla, ayni süre boyunca bulusa göre olan bilesim içinde korunan saç foliküllerinde (panel D) önemli ölçüde düstügünü göstermektedir. Panel A ve C, 0 saat koruma süresinde sirasiyla salin çözeltisi ve bulusa göre olan bilesim içindeki saç foliküllerini göstermektedir.

Sekil 2, bir salin çözeltisi (panel A) veya bir Ringer laktat çözeltisi (panel B) içinde korunan deri dokusuna kiyasla, bulusa göre olan bilesim (panel C) içinde korunan deri dokusunun fotograflarini göstermektedir. Sonuçlar, tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilen hücre ölümü seviyesinin bir salin çözeltisi (panel A) veya bir Ringer laktat çözeltisi (panel B) içinde korunan deri dokusuna kiyasla, 4 saat sonra bulusa göre olan bilesim (panel C) içinde korunan deri dokusunda önemli ölçüde düstügünü göstermektedir.

Sekil 3, bir salin çözeltisi (panel B) veya bir Ringer laktat çözeltisi (panel D) içinde 4 saat korunan yag dokusuna kiyasla, bulusa göre olan bilesim (panel F) içinde 4 saat korunan yag dokusunun fotograflarini göstermektedir. Sonuçlar, tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilen hücre ölümü seviyesinin bir salin çözeltisi (panel B) veya bir Ringer laktat çözeltisi (panel D) içinde korunan deri dokusuna kiyasla, 4 saat sonra bulusa göre olan bilesim (panel F) içinde korunan yag dokusunda önemli ölçüde düstügünü göstermektedir. Panel A, C ve E, 0 saat koruma süresinde sirasiyla salin çözeltisi, Ringer laktat çözeltisi ve bulusa göre olan bilesim içindeki yag dokusunu göstermektedir.

Sekil 4, fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesiklerinin, oksovanadyum (OVAN) ve bis(maltolato) oksovanadyum (BMOV), keratinositlerin proliferasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. Keratinositlerin proliferasyonu kültür ortami miktarina göre sayilan hücre sayisi (yani, hücre sayisi x10E4/ml) seklinde ifade edilir. Sonuçlar, kontrol durumuna (yani bir vanadyum bilesigi içermeyen temel büyüme ortami temel ortam büyüme serumu (SFK)) göre 1 mg/ml OVAN veya 1 mg/ml BMOV ile takviye edilmis bir SFK içeren bir bilesimle islemin ardindan bir gelismis keratinosit proliferasyonu oldugunu göstermektedir. BMOV ile islemin OVAN ile isleme kiyasla daha yüksek bir sayida proliferasyona ugramis hücre ile iliskili oldugu belirtilmelidir. ÖRNEKLER Örnek 1. Bilesimin hazirlanmasi Biyolojik malzeme korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasina yönelik bilesim bir steril Serumsuz Büyüme Ortamina (Tanimli Serumsuz (Keratinosit) Büyüme Ortami, Gibco, ABD'den satin alinmistir) asagidaki bilesenlerin eklenmesiyle taze hazirlanmistir: - 0.25 mg/ml D-tokoferol asit süksinat /a-tokoferol (E vitamini) - 0.1 mg/ml lipoik asit - 0.1 umol/ml adenozin trifosfat-magnezyum klorür - 15 mg/ml deferoksamin mesilat - 1 x 103 hücre/ml CD34-pozitif hücre - 0.05 ml/ml platelet bakiinindan zengin plazma - 1 birim/ml eritropoetin Örnek 2. Saç dokusunun korunmasi M: Saç dokusu oda sicakliginda (21 °C civarinda) 4 saatlik bir periyot boyunca bulusa göre olan bilesime batirilmistir. Paralel bir sekilde, saç dokusu ayni sicaklikta ayni süre boyunca bir fizyolojik olarak uygun salin çözeltisinden olusan bir geleneksel bilesime batirilmistir. Hücre ölümü seviyesi bir tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilmistir. Kisaca, 25 saç mikro grefî 15 dakika süreyle bir %01 tripan mavisi çözeltisine batirilmis ve daha sonra durulanmistir. Maviye boyanan ölü hücreler gözlemlenmis ve bir mikroskop altinda sayilmistir. Ölü hücre seviyeleri bulusa göre olan bilesim içinde korunan saç dokusu ve geleneksel bilesim içinde korunan saç dokusu arasinda karsilastirilmistir.

Sonuçlar: Sonuçlar, ölü hücre seviyesinin salin çözeltisi içinde korunan saç dokusunda gözlemlenen ölü hücre seviyesine kiyasla bulusa göre olan bilesim içinde korunan saç dokusunda önemli ölçüde düstügünü göstermektedir (Sekil 1). Sonuçlar, genel olarak, mevcut bulusa göre olan bilesimin, bir geleneksel bilesimle (ön, fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi) elde edilene kiyasla, bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan saç dokusunun fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünün korunmasinda özellikle etkili oldugunu göstermektedir. Örnek 3. Deri dokusunun korunmasi Us_ul: Deri dokusu oda sicakliginda (21°C civarinda) 4 saatlik bir periyot boyunca bulusa göre olan bilesime batirilmistir. Paralel bir sekilde, deri dokusu ayni sicaklikta ayni süre boyunca bir fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi veya bir Ringer laktat çözeltisine batirilmistir. Hücre ölümü seviyesi bir tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilmistir. Kisaca, 25 deri mikro grefi 15 dakika süreyle bir %01 tripan mavisi çözeltisine batirilmis ve daha sonra durulanmistir. Maviye boyanan ölü hücreler gözlemlenmis ve bir mikroskop altinda sayilmistir. Ölü hücre seviyesi bulusa göre olan bilesim içinde korunan deri dokusu ve geleneksel bilesimler (yani, fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi ve Ringer laktat çözeltisi) içinde korunan deri dokusu arasinda karsilastirilmistir.

Sonuçlar: Sonuçlar, ölü hücre seviyesinin geleneksel çözeltiler (ör., fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi ve Ringer laktat çözeltisi) içinde korunan deri dokusunda gözlemlenen ölü hücre seviyesine kiyasla bulusa göre olan bilesim içinde korunan deri dokusunda önemli ölçüde düstügünü göstermektedir (bkz., Sekil 2). Sonuçlar, genel olarak, bulusa göre olan bilesimin, geleneksel bilesimlerle (ör., fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi veya Ringer laktat çözeltisi) elde edilene kiyasla, bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan deri dokusunun fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünün korunmasinda özellikle etkili oldugunu göstermektedir. Örnek 4. Yag dokusunun korunmasi Us_ul: Yag dokusu oda sicakliginda (21°C civarinda) 4 saatlik bir periyot boyunca bulusa göre olan bilesime batirilmistir. Paralel bir sekilde, yag dokusu ayni sicaklikta ve ayni süre boyunca bir fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi veya bir Ringer laktat çözeltisine batirilmistir. Hücre ölümü seviyesi bir tripan mavisi boyama analizi kullanilarak degerlendirilmistir. Kisaca, 25 yag mikro grefi 15 dakika süreyle bir %01 tripan mavisi çözeltisine batirilinis ve daha sonra durulanmistir. Maviye boyanan ölü hücreler gözlemlenmis ve bir mikroskop altinda sayilmistir. Ölü hücre seviyeleri bulusa göre olan bilesim içinde korunan yag dokusu ve geleneksel bilesimler (yani, fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi ve Ringer laktat çözeltisi) içinde korunan yag dokusu arasinda karsilastirilmistir (bkz, Sekil 3).

Sonuçlar: Sonuçlar, ölü hücre seviyesinin geleneksel çözeltiler (ör., fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi ve Ringer laktat çözeltisi) içinde korunan yag dokusunda gözlemlenen ölü hücre seviyesine kiyasla bulusa göre olan bilesim içinde korunan yag dokusunda önemli ölçüde düstügünü göstermektedir. Sonuçlar, genel olarak, bulusa göre olan bilesimin, bilesimlerle (ön, fizyolojik olarak uygun salin çözeltisi veya Ringer laktat çözeltisi) elde edilene kiyasla, bulusa göre olan bilesim içinde korunan, nakledilen ve/veya saklanan yag dokusunun fonksiyonel ve fizyolojik bütünlügünün korunmasinda özellikle etkili oldugunu göstermektedir. Örnek 5: Vanadyum bilesiklerinin keratinositlerin proliferasyonu üzerindeki M Saç folikülleri 500 mg/ml penisilin (Life Technologies B.V. Breda, Hollanda) ve 0.25 tig/ml streptomisin (Life Technologies B.V. Breda, Hollanda) ile dSFK içeren 24 gözenekli bir kültür diskine aktarilmis ve 14 gün süreyle 31°C'deki %5 C02 içeren bir nemlendirilmis atmosfer içinde bir kültür ortamina konulmustur. Üç farkli kültür ortami kullanilmistir: - Oksovanadvum (OVAN) islem grubu: Kültür ortami l mg/ml OVAN ile takviye edilmis bir temel SFK büyüme serumu (SFK, Enschede, Hollanda tedarikçisinden satin alinmis) içeren bir bilesimdir.

- Bis (maltolato) oksovanadvum (BMOV) islem grubu: Kültür ortami l mg/ml BMOV ile takviye edilmis bir temel SFK büyüme serumu (SPK, Enschede, Hollanda tedarikçisinden satin alinmis) içeren bir bilesimdir. 4 Kontrol grubu: Kontrol durumu vanadyum bilesikleri (yani, OVAN veya BMOV) içermeyen SFK temel büyüme ortami içeren bir bilesimden olusmaktadir.

Ilgili kültür ortamlari her üç günde bir dikkatli bir sekilde çikarilmis ve taze kültür ortamlariyla degistirilmistir. Hücreler bu kültür periyodu sirasinda saç foliküllerine EDTA (etilen diamintetraasetik asit) çözeltisi (Life Technologies B.V. Breda, Hollanda) ile degistirilmis ve bu ortam içinde 5 dakika 37°C'de enkübe edilmistir. Bu enkübasyon periyodundan sonra, hücre kümeleri saç foliküllen'nden ayrilmistir. Bunlar bir Eppendorf içinde 300 g'de 4°C'de dakika santrifüjlenerek toplanmistir. Hücre sayisi sayilmis ve kültür ortami ml'si basina proliferasyona ugramis hücre miktari olarak ifade edilmistir.

Sonuçlar: Sonuçlar, proliferasyona ugramis keratinosit miktarinin kontrol durumuna kiyasla her iki vanadyum bilesigi, yani OVAN ve BMOV, ile islemin ardindan önemli ölçüde arttigini göstermektedir. Sonuçlar ayrica BMOV'nin OVAN'den daha kuvvetli göründügünü göstermektedir. Bu sonuçlar genel olarak vanadyum bilesiklerinin hücre proliferasyonunun yani sira kültür kosullarinda hayatta kalmanin desteklenmesinde özellikle etkili oldugunu göstermektedir (bkz, Sekil 4).

Claims (1)

ISTEMLER Canli biyolojik malzemelerin korunmasi, nakliyesi ve/veya saklanmasi için, bir bilesim olup, müteakiben verilenleri içerir: en az bir anti-apoptotik bilesik, burada bahsedilen anti-apoptotik madde bir fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigidir, en az bir anti-oksidan bilesik, eritropoetin, CD34-pozitif` hücreler ve retinoik asitten olusan gruptan seçilen en az bir kök hücre gelistirici bilesik ve en az bir hücre-disi matris bilesigi. Istem l'e göre bilesim olup, burada fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyum, oksovanadyum ve ortovanadyumdan olusan gruptan seçilir. Istem 1 veya 2'ye göre bilesim olup, burada fizyolojik olarak uygun vanadyum bilesigi bis (maltolato) oksovanadyumdur. Istem l-3'ten herhangi birine göre bilesim olup, ayrica bir triiyodotironin, estradiol, progesteron, doku ekstrakti, insülin, transferin, selenyum, L-sistein, adenosin trifosfat-magnezyum klorür ve L-lösinden olusan gruptan seçilen bir ikinci veya ek anti-apoptotik bilesik içerir. Önceki isteinlerden herhangi birine göre bir bilesim olup, burada anti-oksidan bilesik kuversetin, monohidroksietil, rutozid, C Vitamini, lipoik asit, deferoksamin mesilat ve E Vitamininden olusan gruptan seçilir. Önceki istemlerden herhangi birine göre bilesim olup, burada kök hücre gelistirici bilesik eritropoetin ve CD34-pozitif hücre grubundan seçilir. Istem 6'ya göre bir bilesim olup, burada CD34-pozitif hücre ve/veya eritropoetin bir süjenin periferal kani veya kemik iliginden türetilir. Istem 6-7'den herhangi birine göre bilesim olup, burada CD34-pozitif hücre bir insan CD34-pozitif hücresi hattindan elde edilir. Önceki istemlerden herhangi birine göre bir bilesim olup, burada hücre-disi matris bilesigi platelet bakimindan zengin plazma, laminin, kolajen IV, heparin sülfat, entaktin ve kondroitin sülfattan olusan gruptan seçilir. Istem 1-9'dan herhangi birine göre bir bilesimin keratinosit hücreleri ve/Veya saç11. folikül hücrelerini korumak, nakletmek ve/veya saklamak için kullanimidir. Keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerini korumak, nakletmek ve/veya saklamak için in vitro usul olup, asagidaki asamalari içerir: (a) istem

1-9'dan herhangi birine göre olan bir bilesimin saglanmasi ve (b) bilesimin keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücrelerine uygulanmasi. Istem 11'e göre in vitro usul olup, burada asama b'deki keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücreleri O°C`nin üzerinde ve 40°C'nin altindaki aralik içindeki bir sicaklikta tutulur. Istem 11 veya [Z'den herhangi birine göre in vitro usul olup, burada bilesim günlük olarak yenilenir. Istem ll-l3'ten herhangi birine göre in vitro usul olup, burada asama b'deki keratinosit hücreleri ve/veya saç folikül hücreleri 25°C'nin altinda bir sicaklikta