CN115553287B - 一种蜱虫保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜱虫保存液及其制备方法和应用，属于生物体保存试剂技术领域。本发明提供的蜱虫保存液包含适宜量的氧钒核糖核苷复合物、青霉素、链霉素、磷酸盐、氯化钠、十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、卵清蛋白等成分，在常温条件下即能够有效保护蜱虫虫体的完整性，以及蜱虫虫体可能携带的病原微生物的核酸稳定性，因此有利于蜱虫种类的鉴定，以及蜱虫虫体可能携带的病原微生物的鉴定。

Description

一种蜱虫保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物体保存试剂技术领域，具体涉及一种蜱虫保存液及其制备方法和应用。

背景技术

采集蜱虫的主要目的之一是掌握当地蜱虫的分布状况，了解蜱虫的种类、数量、分布特征等；另一方面，可对蜱虫体内可能携带的病原种类进行分离鉴定，以分析可能存在的自然疫源地分布及特征，推测可能对当地人群健康产生的不利影响，并提供预防控制方案及措施。因此采集的蜱虫的个体的完整性及其可能携带的病原微生物的核酸完整性非常重要。

目前，采集蜱虫后主要的保存方式是液氮快速冻存和样本管(空的)密封保存，但这些保存方式均存在较多不足，例如：蜱虫采集基本上是在比较偏远的地区，液氮运输、保存比较困难，而且具有一定的危险性；液氮挥发比较快、在野外补充比较困难，对样本长期保存产生不利影响；蜱虫经液氮冻存，解冻后，很容易造成蜱虫盾板、假头基、口下板及须肢等部位的损坏、缺失，会对蜱虫的分类鉴定以及可能携带的病原种类的鉴定等造成影响；样本管密封保存的蜱虫样本，在保持一定的湿度条件下，蜱虫生存时间比较长，但在长时间运输过程中，由于颠簸或内环境的变化，可能会造成蜱虫死亡、腐败，导致肢体脱落、不完整，甚至可能会导致蜱虫携带的病原微生物核酸的降解等，不仅不利于蜱虫种类的鉴定，同时对蜱虫携带的病原微生物的鉴定也带来困难。因此为了便于对蜱虫进行分类鉴定以及对其可能携带的病原微生物种类进行检测鉴定，有需要开发一种可同时有效保存蜱虫虫体及其可能携带的病原微生物的保存液，然而现有技术中还未有此类保存液的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种蜱虫保存液，其包含以下浓度(在保存液中的终浓度)的成分：

在一些实施方式中，所述蜱虫保存液的pH值为7.2-7.6。

本发明另一方面提供一种用于制备蜱虫保存液的组合物，包含以下成分：

本发明再一方面提供一种蜱虫保存液的制备方法，其包括：按照各成分的浓度将所需量的氧钒核糖核苷复合物、青霉素、链霉素、卵清蛋白、十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠溶解于纯水中，并定容，得到所述蜱虫保存液。

在一些实施方式中，在蜱虫保存液的制备方法中，在将各成分溶于纯水中后，还包括将获得的溶液的pH值调节为7.2-7.6的步骤。

在一些实施方式中，在蜱虫保存液的制备方法中，在定容后，还包括对定容后的溶液进行过滤的步骤；优选地，采用0.22μm滤膜对所述定容后的溶液进行过滤。

本发明另一方面还提供一种生物样本(例如蜱虫)的保存和运输方法，其包括将采集的生物样本置于盛放有上述的蜱虫保存液或由上述的组合物制备的保存液的塑料管中并加盖封存后保存和/或运输。

在一些实施方式中，在常温条件下，所述生物样本在所述盛放有保存液的塑料管中的保存时间长达10天以上，优选长达20天以上，更有选长达30天以上。

本发明再一方面还提供一种对野外采集的蜱虫和/或其携带的病原微生物进行鉴定的方法，其包括以下步骤：

1)将野外采集的蜱虫置于盛放有上述的蜱虫保存液或由上述的组合物制备的保存液的塑料管中并加盖封存后，保存并运输至检验实验室；

2)在检验实验室中将蜱虫从塑料管中取出，以对所述蜱虫和/或其携带的病原微生物进行鉴定。

在一些实施方式中，所述病原微生物包括立克次体、无形体、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、大别山病毒、或其组合。

基于以上技术方案提供的蜱虫保存液包含适宜量的氧钒核糖核苷复合物、青霉素、链霉素、磷酸盐、氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、对羟基苯甲酸异丁酯、卵清蛋白(OVA)等成分，其中氧钒核糖核苷复合物、SDS作为核酸酶抑制剂，可以防止蜱虫体内可能携带的病原微生物核酸的降解；磷酸盐作为缓冲液，可以保持保存液的pH值稳定，并防止蜱虫体内可能携带的病原的低渗膨胀或高渗皱缩死亡；对羟基苯甲酸异丁酯作为防腐剂，可以防止蜱虫样本的腐蚀、变质等；卵清蛋白(OVA)作为蛋白保存剂，可以防止蜱虫虫体和病原微生物结构的破坏；青霉素、链霉素作为抑菌剂，可以防止病原菌或杂菌的生长。以上多种成分共同作用，从而实现对蜱虫虫体及其可能携带的病原微生物的良好保存效果，能够保证采集的蜱虫虫体的完整，而且可以长期保存，并可有效保证蜱虫虫体可能携带的病原微生物的核酸稳定性，因此有利于后续的蜱虫种类鉴定、蜱虫虫体可能携带的病原微生物的鉴定，而且可以采用常温方式保存和运输样本，节约成本。

具体实施方式

本发明旨在提供一种能够对蜱虫虫体及其可能携带的病原微生物提供良好保存效果的保存液，并提供了该保存液的制备方法及其使用方法。

通过以下具体实施例详细说明本发明。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：蜱虫保存液的制备

发明人基于对蜱虫虫体及其体内和/或体外可能携带的病原微生物的深入研究，确定了保存液中几种重要功能成分，包括：

核酸酶抑制剂：用于防止蜱虫体内可能携带的病原微生物核酸的降解；

防腐剂：用于防止蜱虫样本的腐蚀、变质；

蛋白保存剂：用于防止蜱虫虫体和病原微生物结构的破坏；

抑菌剂：用于防止病原菌或杂菌的生长；

稳定剂：用于保持pH值稳定，以及防止蜱虫体内可能携带的病原的低渗膨胀或高渗皱缩死亡。

基于以上考虑，发明人综合各功能成分之间的协调与组配可能性，制备了众多配方的保存液，并从中确定出适宜的蜱虫保存液配方。下表1示出了其中部分配方(配方1-7)的保存液。表1保存液的制备过程如下：

1)按照下表1所述的配方中的成分准确称取所需量的氧钒核糖核苷复合物(Sigma-Aldrich)、青霉素、链霉素、卵清蛋白、十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、异硫氰酸胍、牛血清白蛋白、山梨酸钾，溶于800ml纯水中，充分混匀；

2)用NaOH(0.01M)或稀HCl调整步骤1)所得溶液的pH值为7.4；

3)将步骤2)已调节pH值的溶液加入1000ml容量瓶中，并用纯水定容至1000ml；

4)将步骤3)定容后的溶液用0.22μm滤膜过滤，得到各配方对应的保存液，分装至5ml/10ml无菌带盖塑料管常温保存。

表1：保存液的配方

实施例2：保存液对蜱虫虫体及其携带的病原微生物的保存效果检验

该实施例检验上述实施例1制备的配方1-7保存液分别对蜱虫虫体或对蜱虫虫体内携带的病原微生物的保存效果，具体包括以下实验。

2.1)保存液对蜱虫虫体的保存效果

(1)将采集到的4种常见蜱虫(长角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱和全沟硬蜱)，用镊子夹取，分别放入实施例1制备的5ml无菌带盖塑料管中的配方1-4和配方6-7保存液中，每管中保存1只蜱虫，每种保存液设置3个重复；

(2)盖好塑料管管盖，轻轻振荡，将塑料管放入样本采集箱中，常温保存并运输至实验室(耗时约1天)；

(3)在实验室中取出塑料管中的蜱虫，按照常规检验方法(镜检)对蜱虫虫体的完整性进行检验，结果如下表2和表3所示。

由下表2和表3所示的检验结果可知，针对所有4种常见蜱虫，经历约1天的保存和运输过程后，配方1-3和6-7保存液均能够保证蜱虫各部位的结构清晰和完整(或较清晰完整)，而配方4保存液可能会导致蜱虫个别部位(例如长角血蜱的假头基、足基，森林革蜱的须肢和全沟硬蜱的假头基等)的结构不清晰或不完整(推测可能是由于腐蚀造成的)。因此在短时间(例如1天以内)保存蜱虫虫体的情况下，相对于配方4保存液不适宜用来保存蜱虫虫体，实施例1制备的配方1-3和6-7保存液对蜱虫虫体均具有较好的保存效果。

表2：配方1-3保存液对4种常见蜱虫的保存效果

表3：配方4、6-7保存液对4种常见蜱虫的保存效果

2.2)使用保存液长时间保存蜱虫虫体的效果

该实验中验证实施例1制备的配方1-3和6-7保存液长时间保存蜱虫虫体的效果，具体包括以下操作：在实验室中，将4种常见蜱虫(长角血蜱、嗜群血蜱、森林革蜱和全沟硬蜱) 分别保存于实施例1制备的5ml无菌带盖塑料管中的配方1-3和6-7保存液中，每管中保存1 只蜱虫，每种保存液设置3个重复，分别于常温条件下保存10天、20天和30天后，按照常规检验方法(镜检)对每个管中的蜱虫虫体的完整性进行检验。

其中配方2、6-7保存液对蜱虫虫体长时间保存的结果分别如表4-6所示。由下表4所示的检验结果可知，针对所有4种常见蜱虫，将其保存于配方2保存液中10天、20天和30天后均能保证4种蜱虫各部位的结构清晰和完整(或较清晰完整)，配方1和配方3保存液具有类似的保存效果。由下表5所示的检验结果可知，针对所有4种常见蜱虫，将其保存于配方6保存液中10天后还能够保证4种蜱虫各部位的结构清晰和完整(或较清晰完整)，但从第20天开始，保存的蜱虫的某些部位(例如长角血蜱的足基和全沟硬蜱的假头基等)的结构开始逐渐不清晰或不完整，直到保存的第30天，保存的蜱虫虫体的某些部位(例如长角血蜱的足基，嗜群血蜱的须肢，森林革蜱的须肢和全沟硬蜱的假头基等)的结构已经不清晰或不完整(推测可能是由于腐蚀造成的)。由下表6所示的检验结果可知，针对所有4种常见蜱虫，将其保存于配方7保存液中10天后还能够保证4种蜱虫各部位的结构清晰和完整(或较清晰完整)，但从第20天开始，保存的蜱虫的某些部位(例如长角血蜱的假头基和嗜群血蜱的须肢等)的结构开始逐渐不清晰或不完整，直到保存的第30天，保存的蜱虫虫体的某些部位(例如长角血蜱的假头基、足基，嗜群血蜱的须肢，森林革蜱的须肢和全沟硬蜱的假头基等)的结构已经不清晰或不完整(推测可能是由于腐蚀造成的)。因此，相对于配方6-7保护液，可确定实施例1制备的1-3保护液更适宜用来长时间(例如至少10天、20天、30天等)保存蜱虫虫体，且具有良好的保存效果，不会导致蜱虫某些部位的结构因为长时间保存等原因而腐蚀或缺失，易于后续对蜱虫进行分类鉴定。

表4：蜱虫在配方2保存液中保存10天、20天、30天后的镜检结果

表5：蜱虫在配方6保存液中保存10天、20天、30天后的镜检结果

表6：蜱虫在配方7保存液中保存10天、20天、30天后的镜检结果

2.3)保存液对蜱虫虫体携带的病原微生物的保存效果

按照文献(杨宇，王静，王建成，等.2012-2013年中蒙边境甘其毛都口岸地区蜱携带病原体调查[J]，中国国境卫生检疫杂志，2016，39(25)：330-332，以下称文献1)提供的蜱虫携带病原体调查方案，合成引物，采取PCR法对蜱虫可能携带的病原微生物进行检测，以评估实施例1制备的配方1-5保存液对蜱虫携带的病原微生物的保存效果。具体包括以下操作：

(1)将同一地区采集的蜱虫虫体样本分别置于实施例1制备的分别装有配方1-5保存液的10ml塑料管中，盖好管盖，轻轻振荡，其中每管中保存5只蜱虫。每管放入的5只蜱虫分别于保存前取每只蜱虫的部分组织形成混合样本，按照上述文献1的方法对蜱虫可能携带的病原微生物进行检测；

(2)常温保存10天后，从每管中取出蜱虫，将各蜱虫残余组织制成混合样本，按照上述文献1公开的蜱虫携带病原体检验方案进行核酸检测，以判定该管蜱虫所携带病原微生物的核酸是否降解、确定携带病原微生物种属等。结果如下表7和表8所示。

由下表7所示的结果可见，保存于配方1-3保存液管中的蜱虫虫体内检测到的病原微生物与保存前的检测结果一致；而由下表8所示的结果可见，保存于配方4和5保存液管中的蜱虫虫体内检测到的病原微生物与保存前的检测结果不一致，推测保存于配方4和5保存液中的蜱虫虫体上携带的病原微生物核酸可能发生降解。因此相对于配方4和5保存液，实施例1中制备的配方1-3保存液更能够有效保护蜱虫虫体上可能携带的病原微生物核酸的稳定 (完整)，有利于蜱虫虫体上可能携带的病原微生物的鉴定。

表7：配方1-3保存液对蜱虫携带的病原微生物的保存(10天)效果

表8：配方4-5保存液对蜱虫携带的病原微生物的保存(10天)效果

2.4)使用保存液长时间保存蜱虫虫体对其携带的病原微生物的保存效果

按照上述文献1提供的蜱虫携带病原体调查方案，采取PCR法对蜱虫可能携带的病原微生物进行检测，以评估实施例1制备的配方1-3保存液对长时间保存的蜱虫虫体上携带的病原微生物的保存效果。具体包括以下操作：

(1)将同一地区采集的蜱虫虫体样本置于实施例1制备的装有配方1-3 保存液的10ml塑料管中，盖好管盖，轻轻振荡，每管中保存5只蜱虫。每管放入的蜱虫于保存前取每只蜱虫的部分组织样本混合，按照上述文献1的方法对蜱虫可能携带的病原微生物进行检测；

(2)常温保存15天后，从管中取出蜱虫，按照上述文献1公开的蜱虫携带病原体检验方案对各管中各蜱虫残余组织组成的混合样本进行核酸检测，以判定蜱虫虫体上携带的病原微生物的核酸稳定性(完整性)以及病原微生物的种类等。结果如下表9所示。

由下表9所示的检测结果可知，保存于配方1-3保存液中15天后的蜱虫虫体上仍能检测到病原微生物，且与保存前按照上述文献1的方法的检测结果一致，表明配方1-3保存液不仅可以长时间(例如至少15天)保存蜱虫虫体，而且还能够有效保护蜱虫虫体上携带的病原微生物核酸的稳定(完整)，因此有利于蜱虫虫体上可能携带的病原微生物的判定。

表9：在配方1-3保存液中保存15天后病原微生物的核酸检测结果

综上实施例结果，配方1、配方2和配方3的保存液能有效保存蜱虫虫体及其可能携带的病原微生物，一方面该保存液能够有效保护蜱虫虫体的结构完整性，不会导致其遭受腐蚀等而缺失，且能够长时间(例如虫体保存至少10天、长至30天)保存蜱虫虫体，有利于对蜱虫进行分类鉴定；另一方面该保存液也能够长时间(例如病原微生物核酸保存至少10天，长至15天)且有效保护蜱虫虫体上可能携带的病原微生物的核酸稳定或完整，因此也有利于对蜱虫虫体上可能携带的病原微生物进行鉴定。因此，本发明确定的蜱虫保存液可包含以下浓度(终浓度)的成分：1.0-3.0g/L的氧钒核糖核苷复合物、青霉素、链霉素各3-5U/L、8.0-12.0 g/L的卵清蛋白、8.0-12.0g/L的十二烷基硫酸钠、4.0-6.0g/L的对羟基苯甲酸异丁酯、5.5-7.5 g/L的磷酸二氢钠、10.5-12.5g/L的磷酸氢二钠、8.5-10.5g/L的氯化钠。本发明还证明了以上适宜量的特定成分的组合能够对蜱虫虫体及其可能携带的病原微生物起到良好的保存效果，在常温保存条件下即能够保证采集的蜱虫虫体结构清晰完整(或较清晰完整)，有利于后续的种属鉴定，以及能够保证蜱虫虫体上可能携带的病原微生物的核酸稳定性，有利于后续的蜱虫携带病原微生物的判定，由此可以推测出该地区可能存在的自然疫源性疾病，并为其防治提供快速、准确、完整的数据资料；另一方面，使用该保存液可以采用常温方式保存和运输样本，节约成本且可延长保存时间。

实施例3：蜱虫保存液的应用

该实施例使用实施例1制备的配方2保存液(装于5ml带盖塑料管中)分别对采集的某地区的10例蜱虫样本进行保存，并常温运送至检验实验室；随后按照镜检和上述文献1的核酸检测方法，以判定这10例蜱虫样本的完整性及其可能携带的病原种类分布状况等，由此推测该地区可能存在的自然疫源性疾病，并为其防治提供快速、准确、完整的数据资料。其中10例蜱虫的形态检测结果如下表10所示，10例蜱虫携带的病原微生物的检测结果如下表11所示。

由表10所示的检测结果可知，采集的10例蜱虫样本中有1例为长角血蜱，3例为全沟硬蜱，2例为嗜群血蜱，4例为森林革蜱。由表11所示的检测结果可知，样本1(全沟硬蜱)上携带有土拉菌病原，样本2(森林革蜱)携带有立克次氏体和无形体病原，样本3(森林革蜱)、样本8(嗜群血蜱)和样本10(森林革蜱)上没有携带病原微生物，样本4(森林革蜱)上携带有立克次氏体病原，样本5(全沟硬蜱)携带有无形体病原，样本6(全沟硬蜱) 上携带有土拉菌和新疆出血热病毒病原，样本7(长角血蜱)上携带有立克次氏体病原，样本9(嗜群血蜱)上携带有无形体病原，因此推测该地区可能存在土拉菌、立克次氏体、无形体、和新疆出血热病毒的自然疫源性疾病，从而可以针对性的采取预防或治疗手段。

表10：10例蜱虫样本形态检测结果

表11：10例蜱虫样本携带的病原微生物核酸检测结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保存范围之内。

Claims (10)

1.一种蜱虫保存液，其包含以下浓度的成分：

氧钒核糖核苷复合物 1.0-3.0 g/L，

青霉素、链霉素 各3-5 U/L，

卵清蛋白 8.0-12.0 g/L，

十二烷基硫酸钠 8.0-12.0 g/L，

对羟基苯甲酸异丁酯 4.0-6.0 g/L，

磷酸二氢钠 5.5-7.5 g/L，

磷酸氢二钠 10.5-12.5 g/L，以及

氯化钠 8.5-10.5 g/L。

2.根据权利要求1所述的蜱虫保存液，其pH值为7.2-7.6。

3.一种用于制备蜱虫保存液的组合物，包含以下成分：

氧钒核糖核苷复合物 1.0-3.0 重量份，

青霉素、链霉素 各3-5 U，

卵清蛋白 8.0-12.0 重量份，

十二烷基硫酸钠 8.0-12.0 重量份，

对羟基苯甲酸异丁酯 4.0-6.0 重量份，

磷酸二氢钠 5.5-7.5 重量份，

磷酸氢二钠 10.5-12.5重量份，以及

氯化钠 8.5-10.5 重量份。

4.权利要求1或2所述的蜱虫保存液的制备方法，其包括：按照各成分的浓度将所需量的氧钒核糖核苷复合物、青霉素、链霉素、卵清蛋白、十二烷基硫酸钠、对羟基苯甲酸异丁酯、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠溶解于纯水中，并定容，得到所述蜱虫保存液。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其在将各成分溶于纯水中后，还包括将获得的溶液的pH值调节为7.2-7.6的步骤。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其在定容后，还包括对定容后的溶液进行过滤的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中采用0.22 µm滤膜对所述定容后的溶液进行过滤。

8.一种生物样本的保存和运输方法，其包括将采集的生物样本置于盛放有权利要求1-2中任一项所述的蜱虫保存液或由权利要求3所述的组合物制备的保存液的管中并加盖封存后保存和/或运输；其中所述生物样本为蜱虫和/或其携带的病原微生物。

9.一种对野外采集的蜱虫和/或其携带的病原微生物进行鉴定的方法，其包括以下步骤：

1）将野外采集的蜱虫置于盛放有权利要求1-2中任一项所述的蜱虫保存液或由权利要求3所述的组合物制备的保存液的管中并加盖封存后，保存并运输至检验实验室；和

2）在检验实验室中将蜱虫从管中取出，以对所述蜱虫和/或其携带的病原微生物进行鉴定。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病原微生物包括立克次体、无形体、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、大别山病毒、或其组合。