KR101273555B1 - 돼지체외수정란의 체외발육에 있어 컬큐민의 항산화효과 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 체외수정란의 체외발육에 있어 curcumin을 첨가하여 체외발육율을 증가시키기 위함이다.
포유동물에 있어 세포를 체외배양시 세포내의 H2O2는 세포의 독성물질로 작용하는데, 체외의 환경에서는 항산화물질이 배양액내에 존재하지 않을 경우 세포의 성장을 억제시킨다는 보고가 있다(Murray 등, 1990). 체외배양액 내에서 생성되는 free radical을 제거하기 위한 수단으로서 연구자들은 항산화제를 첨가하여 발육억제현상을 극복할 수 있다고 보고하였다.
포유동물의 수정란은 체외 배양시 체내에서 성장할 때와는 조건이 다르기 때문에 발생퇴화 혹은 발육억제 현상이 나타난다. 이와 같은 현상을 극복하기 위해서 체외배양 조건을 개선시키려는 많은 연구가 이루어지고 있지만 아직 미비한 실정이다.
돼지체외수정란, 항산화물질, curcumin, 발육억제현상, 발생퇴화, 수정란
Description
가축의 잠재적 번식능력을 극대화시키기 위해서는 인공수정과 수정란이식등의 기법이 널리 이용되고 있으며, 국내에서는 인공수정을 통한 가축개량이 중요한 수단으로 이용되고 있다. 따라서 인공수정의 효율성을 증진시키기 위해서는 우수한 체외수정란의 생산과 대량공급이 중요하며, 개선해야할 중요한 과제이다. 포유동물의 세포에서 항산화제로서 작용하는 selenium(Se)과 vitamin E(Vit. E)는 정상적인 생리적 기능과 번식기능에 매우 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있으며, 각각 특별한 기능을 가지고 있으면서 상호보완적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다(Burton과 Ingold, 1984 ; Nino와 Prasad, 1980).
Curcumin은 심황뿌리로부터 추출하여 그림물감의 원료 및 음식물의 착색제로서 널리쓰이는 자연추출물이다. 또한 많은 연구자들은 포유동물 세포에서 항산화효과와 항암효과에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 포유동물의 체외수정란의 체외발육에 있어 항산화효과에 대해 검증된 자료가 제시되지 않았다.
본 발명의 목적은 돼지의 체외수정란에 curcumin을 첨가하여 돼지의 체외발육율을 증진시킴으로서 수정란이식에 활용하여 수태율을 향상시키기 위함이다.
본 발명에 이용된 구성은 다음과 같다.
1. 난포란의 채취
본 실험에 사용된 난포란은 도축 직후, 성숙 모돈에서 적출한 난소로부터 채취하였다. 도살 직후 적출한 난소를 2∼3시간이내에 실험실로 운반한 후, 미성숙 난포란의 채취는 3∼5mm인 난포를 선별하여 난포내의 미성숙 난포란을 흡입, 채취하였다. 채취한 난포란을 Dubelcco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS ; Gibco, USA)에 0.1% Polyvinyl-alcohol(PVA ; Sigma, USA)이 첨가된 배양액(D-PBS-PVA)과 희석하여 실체현미경(Nikon, Japan) 하에서 난구세포의 부착상태가 전체적으로 치밀하고 균일하게 부착되고 세포질의 상태가 양호한 것만을 회수하여 실험에 사용하였다.
2. 난포란의 체외성숙
난포란은 North Carolina state university 23 (NCSU 23; Wang 등, 1997) 배양액을 체외성숙용 기본배양액으로 하여 0.57mM의 cysteine, 10% 돼지 난포액과 10IU/㎖ hCG 호르몬을 각각 첨가하여 성숙 배양액을 제조하여 100㎕의 소적내에 미성숙 난포난을 20∼22개씩 넣어 22시간 1차 성숙배양을 실시한 후 호르몬이 첨가되지 않은 성숙배양액 100㎕의 소적내에서 22시간 동안 2차 체외성숙배양을 실시하였다.
체외성숙 배양액에 첨가된 난포액은 직경이 3∼5mm인 액상난포에서 채취한 난포액을 15㎖원심분리튜브에 넣어 1500×g, 4℃ 조건에서 30분간, 2회 원심분리 후, 0.2㎛ 일회용 syring filter(녹십자, 한국)로 여과하여 -20℃에서 사용 전까지 냉동보관 하면서 실험에 사용하였다.
3. 난포란의 체외수정
체외수정용 기본 배양액으로는 modified Tris Buffer Medium(mTBM ; Wang 등, 1997)에 2㎎/㎖의 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA; sigma)를 첨가하여 배양 접시 내에 50㎕의 소적을 만든 후 mineral oil을 가주하여 사용하였다. 체외에서 40∼44시간동안 성숙 배양된 난구 세포가 균일하게 확장된 성숙난포란을 0.1% hyaluronidase(sigma)가 첨가된 성숙배양액 내에서 반복 pipetting 방법으로 난구세포의 일부를 제거한 후, 체외수정 소적에 각각 15개의 성숙 난포란을 옮겨 넣었다.
체외수정을 위한 정자의 준비는 0.5㎖의 동결정액(1 straw)을 융해시킨 후 1㎎/㎖의 BSA와 10㎕/㎖의 Antibiotic antimiotic 용액(ABAM; Giboco)이 첨가된 D-PBS배양액과 혼합, 원심분리(900×g, 5분)로 2회 세척하여 정자의 농도가 2.0×106 정자/㎖가 되도록 조정하였다. 상기방법으로 준비된 정액을 2mM의 caffeine(sigma)이 첨가된 mTBM으로 희석시켜 정자 부유액을 준비하였다. 준비된 정자 부유액 50㎕을 미리 준비된 성숙 난포란의 옮겨진 체외수정 소적에 50㎕을 삽입하여 체외수정을 실시하였다.
4. 체외수정란의 체외배양
체외수정 후 40∼44시간에 생산된 정상적으로 분할된 2∼8세포기 체외수정란 만을 선별하여 돼지 난포액과 L-cysteine이 함유되지 않고 BSA가 첨가된 체외배양액인 NCSU 23 배양액에 항산화제인 curcumin을 첨가하여 체외수정란의 체외발육에 미치는 영향을 조사하였다.
돼지 체외수정란의 체외배양액에 curcumin을 0,1, 5, 10uM을 첨가하여 돼지체외수정란의 체외발육율을 검토한다.
체외수정 시킨 후 40∼44시간에 생산된 2∼8 세포기 체외수정란의 난구세포를 반복 pipetting 방법으로 제거한 후 체외수정란을 단순배양액에 항산화제 curcumin을 0, 1, 5 및 10uM 첨가하여 5%와 20% O2 농도와 5% CO2 농도와 38.5℃ 온도 조건에서 체외배양을 실시하여 curcumin의 적정농도를 조사하였다.
돼지 체외수정란의 curcumin의 효과는 5uM의 농도에서 배반포기이상의 체외발육율이 무첨가구에 비해 통계적으로 유의하게 높은 성적을 나타내었다.
따라서 본 발명은 돼지의 체외수정란에 curcumin을 첨가하여 돼지의 체외발육율을 증진시킴으로서 수정란이식에 활용하여 수태율을 향상시킬 수 있다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명에 따르면 돼지체외수정란의 체외발육에 있어 curcumin의 첨가는 항산화효과로서, 돼지 체외수정란 생산의 증가와 돼지의 수정란이식효율을 증대시킬 수 있어 우수한 경제형질을 보유하고 있는 개체들의 개량에 이용하여 부가가치를 높임에 효과를 얻을 수 있다.
Claims (1)
- 커큐민이 5μM의 농도로 함유된 배양액에서 돼지체외수정란을 배양하는 것을 특징으로 하는 돼지체외수정란 체외발육방법.
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