CN114127252A - 生成去核红系细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了生成去核红系细胞群的方法。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月24日提交的美国临时专利申请序列号62/852,930的优先权；其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及生成去核红系细胞的方法。
发明背景
将红细胞输血给已经经历了失血的患者。此外，工程化去核红系细胞(包括红细胞)正在开发作为治疗剂，其携带或呈递外源性蛋白质至有此需要的患者。
发明概述
本发明基于以下发现：分化和/或成熟期间红系祖细胞的灌注培养导致增加的细胞增殖、增加的去核率，从而导致增加的去核红系细胞数量(例如，相比于不包括在红系祖细胞分化或成熟期间使用灌注培养的方法)，和/或增加红系祖细胞可以继续生长和/或去核的时间长度。
鉴于这一发现，本文提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群。本文还提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在器皿内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)分批或补料分批培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群。本文还提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在器皿内的第三培养基中以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)分批或补料分批培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群。
本文提供了生成去核红系细胞群的方法，其包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法在步骤(a)之前进一步包括：(i)将多个红系祖细胞布置到包含在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的第一细胞培养物；和(ii)分批或补料分批培养第一细胞培养物约1天至约15天。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶具有约15mL至约5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括以0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇管。在一些实施方案中，摇管具有约2mL至约500mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约10mL至约250mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约50mL至约200mL的体积。
在一些实施方案中，摇管是锥形容器。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇管。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇管。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是培养袋。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约25L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约5L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括分批培养第一细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括补料分批培养第一细胞培养物。在一些实施方案中，补料分批培养包括随时间添加额外体积的第一培养基至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一培养基随时间连续添加至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至第一细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。在一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体。在一些实施方案中，第一培养基包括约50ng/mL至约150ng/mL Flt-3配体。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第一培养基包括约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。在一些实施方案中，第一培养基包括约10ng/mL至约100ng/mL IL-6。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包括约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约5mM至约7mM的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3搅动第二细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3搅动第二细胞培养物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养包括随时间添加额外体积的第二培养基至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二培养基随时间连续添加至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二培养基随时间定期添加至第二细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括以下中的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第二培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约100ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约10ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约200nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约100nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约25nM地塞米松。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM的L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mMN-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约5天至约8天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括约10W/m3至约200W/m3搅动第三细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(d)包括以约10W/m3至约100W/m3搅动第三细胞培养物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养包括：(i)添加额外体积的第三培养基至第三细胞培养物持续第一时间段，和(ii)添加额外体积的第四培养基至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基连续添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基连续添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基定期添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基定期添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约1天至约7天。在一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约3天至约5天。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约1天至约10天。在一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约3天至约7天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第三培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约9天至约13天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)和(d)中的灌注培养包括使用切向过滤。在一些实施方案中，切向过滤是交替切向过滤(ATF)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。在一些实施方案中，过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)导致约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
本文提供了生成去核红系细胞群的方法，其包括：(a)将一定体积的红系细胞祖细胞的第一细胞培养物布置到包括在器皿内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)分批或补料分批培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包括在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法在步骤(a)之前进一步包括：(i)将多个红系祖细胞布置到包括在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的第一细胞培养物；(ii)分批或补料分批培养第一细胞培养物约1天至约15天。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶具有约15mL至约5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇管。在一些实施方案中，摇管具有约2mL至约500mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约10mL至约250mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约50mL至约200mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，摇管是锥形容器。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇管。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇管。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是培养袋。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约25L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约5L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)还包括以每分钟约10个摇摆周期至约每分钟50个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括分批培养第一细胞培养物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括补料分批培养第一细胞培养物。在一些实施方案中，补料分批培养包括随时间添加额外体积的第一培养基至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一培养基随时间连续添加至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至第一细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。在一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
在一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体。在一些实施方案中，第一培养基包括约50ng/mL至约150ng/mL Flt-3配体。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第一培养基包括约50ng/mL至约500ng/mL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。在一些实施方案中，第一培养基包括约10ng/mL至约100ng/mL IL-6。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包括约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶具有约15mL至约3L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇管。在一些实施方案中，摇管具有约2mL至约500mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约10mL至约250mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约50mL至约200mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，摇管是锥形容器。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇管。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇管。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是培养袋。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约25L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约5L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)还包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。在一些实施方案中，步骤(b)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器具有1L至约15,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的生物反应器具有约5L至约100L的体积。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括分批培养第二细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括补料分批培养第二细胞培养物。在一些实施方案中，补料分批培养包括随时间添加额外体积的第二培养基至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二培养基随时间连续添加至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二细胞培养基随时间定期添加至第二细胞培养物。
在一些实施方案中在本文所述的任何方法中，第二培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第二培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约100ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约10ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约200nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约100nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约25nM地塞米松。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的分批或补料分批培养进行约5天至约8天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，步骤(c)中的灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动第三细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(d)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动第三细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养包括：(i)添加额外体积的第三培养基至第三细胞培养物持续第一时间段，和(ii)添加额外体积的第四培养基至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基连续添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基连续添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基定期添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基定期添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约1天至约7天。在一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约3天至约5天。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约1天至约10天。在一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约3天至约7天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第三培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括以下中的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-ac乙基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约9天至约13天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养包括使用切向过滤。在一些实施方案中，切向过滤是交替切向过滤(ATF)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。在一些实施方案中，过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)产生约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
本文还提供了生成去核红系细胞群的方法，其包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包括在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包括在器皿内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)分批或补料分批培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法在步骤(a)之前进一步包括：(i)将多个红系细胞祖细胞布置到包括在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的第一细胞培养物；和(ii)分批或补料分批培养第一细胞培养物约1天至约15天。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶具有约15mL至约3L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是摇管。在一些实施方案中，摇管具有约2mL至约500mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约10mL至约250mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约50mL至约200mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，摇管是锥形容器。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇管。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇管。
在一些实施方案中，步骤(i)中的器皿是培养袋。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约25L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约5L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。在一些实施方案中，步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括分批培养第一细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括补料分批培养第一细胞培养物。在一些实施方案中，补料分批培养包括随时间添加额外体积的第一培养基至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一培养基随时间连续添加至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至第一细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。在一些实施方案中，第一培养基包括Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体。在一些实施方案中，第一培养基包括约50ng/mL至约150ng/mL Flt-3配体。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第一培养基包括约50ng/mL至约500ng/mL SCF。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。在一些实施方案中，第一培养基包括约10ng/mL至约100ng/mL IL-6。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第一培养基包括约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第一培养基包括约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，其中第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，其中第一培养基包含约5mM至约7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，其中第一培养基包含约5mM至约7mM的L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，其中第一培养基包含约5mM至约7mM的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第一培养基包括约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第一培养基包括约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约12天。在一些实施方案中，步骤(ii)中的分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(i)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，步骤(a)中的灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养包括随时间添加额外体积的第二培养基至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二培养基随时间连续添加至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第二培养基随时间定期添加至第二细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第二培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约100ng/mL IL-3。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1ng/mL至约10ng/mL IL-3。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第二培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约200nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约100nM地塞米松。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1nM至约25nM地塞米松。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第二培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第二培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第二培养基包括约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第二培养基包括约脂质(例如，脂质混合物)。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约4天至约10天。在一些实施方案中，步骤(b)的灌注培养进行约5天至约8天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(a)中的初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的器皿是摇瓶。在一些实施方案中，摇瓶具有约15mL至约3L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。在一些实施方案中，摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。在一些实施方案中，步骤(d)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的器皿是摇管。在一些实施方案中，摇管具有约2mL至约500mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约10mL至约250mL的体积。在一些实施方案中，摇管具有约50mL至约200mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，摇管是锥形容器。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括以约0.1xg至约4.1xg温育摇管。在一些实施方案中，步骤(d)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇管。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的器皿是培养袋。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约25L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约5L的体积。在一些实施方案中，培养袋具有约50mL至约500mL的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。在一些实施方案中，步骤(d)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育培养袋。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的器皿是生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器具有1L至约15,000L的体积。在一些实施方案中，生物反应器具有5L至约5,000L的体积。在一些实施方案中，生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。在一些实施方案中，生物反应器具有约5L至约100L的体积。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动第二细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括分批培养第三细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括补料分批培养第三细胞培养物。在一些实施方案中，补料分批培养包括随时间添加额外体积的第三培养基至第三细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第三培养基随时间连续添加至第三细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的第三细胞培养基随时间定期添加至第三细胞培养物。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)中的分批和补料分批培养包括：(i)添加额外体积的第三培养基至第三细胞培养物持续第一时间段，和(ii)添加额外体积的第四培养基至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基连续添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基连续添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基定期添加至第三细胞培养物持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基定期添加至第三细胞培养物持续第二时间段。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约1天至约7天。在一些实施方案中，(i)中的第一时间段为约3天至约5天。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约1天至约10天。在一些实施方案中，(ii)中的第二时间段为约3天至约7天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第三培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约1μg/mLSCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL SCF。在一些实施方案中，第三培养基包括约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第三培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第三培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第三培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第三培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第三培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。在一些实施方案中，第四培养基包括约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约200ng/mL EPO。在一些实施方案中，第四培养基包括约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。在一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，第四培养基包括约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，第四培养基包括约0.5％v/v至约10％v/v血清。在一些实施方案中，第四培养基包括约4％v/v至约6％v/v血清。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约8天至约15天。在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约9天至约13天。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。在一些实施方案中，步骤(c)中的初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养包括使用切向过滤。在一些实施方案中，切向过滤是交替切向过滤(ATF)。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。在一些实施方案中，过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)产生约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。在一些实施方案中，步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，红系祖细胞是人红系细胞祖细胞。在一些实施方案中，红系祖细胞获得自O阴性人供体。在一些实施方案中，红系祖细胞获得自O阴性和Kell阴性人供体。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，去核红系细胞群是去核人红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(e)从步骤(d)中的第三细胞培养物中分离去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(f)配制在步骤(e)中分离的去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(g)向有此需要的受试者施用步骤(f)中的经配制的去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：在步骤(a)之前，将核酸引入第一细胞培养物中的红系细胞祖细胞中，并且该方法导致了工程化去核红系细胞群的生产。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞群是工程化去核人红系细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，核酸编码一种或多种外源性多肽。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，工程化人去核红系细胞包括一种或多种外源性蛋白质。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括将一种或多种外源性蛋白质点击缀合至细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括低渗加载细胞。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括通过物理操作加载细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，一种或多种外源性蛋白质中的一种存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，一种或多种外源性蛋白质中的一种是存在于工程化人去核红系细胞的膜上的蛋白质。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，一种或多种外源性蛋白质中的一种是苯丙氨酸解氨酶，其中苯丙氨酸解氨酶存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，一种或多种外源性蛋白质包括免疫调节分子。在本文所述的任何方法的一些实施方案中，一种或多种外源性蛋白质包括抗原呈递分子。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(e)从步骤(d)中的第三细胞培养物中分离工程化去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(f)配制在步骤(e)中分离的工程化去核红系细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，该方法进一步包括：(g)向有此需要的受试者施用步骤(f)中的经配制的工程化去核红系细胞群。
本文还提供了通过本文所述的任何方法生产的去核红系细胞群。
本文还提供了通过本文所述的任何方法生产的配制剂。
术语“群体”意指给定物品的两个或更多个(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。
术语“工程化去核红系细胞”意指包含一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)外源性蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的示例性外源性蛋白质的任何组合)的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)。例如，工程化去核红系细胞可以具有存在于其胞质溶胶中的一种或多种外源性蛋白质。在一些实例中，工程化去核红系细胞可以具有存在于其质膜上的一种或多种外源性蛋白质。在一些实例中，工程化红细胞可以具有(i)一种或多种存在于其胞质溶胶中的外源性蛋白质和(ii)一种或多种存在于其质膜上的外源性蛋白质。工程化去核红系细胞的非限制性实例包括点击缀合的去核红系细胞、已经低渗加载的去核红系细胞，以及已通过物理操作(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性物理操作类型)加载的去核红系细胞。本文描述了工程化去核红系细胞的其他非限制性方面。
术语“点击缀合的去核红系细胞”意指具有至少一种通过化学反应与存在于工程化去核红系细胞的质膜上的另一种蛋白质(例如去核红细胞的内源性蛋白质或不同外源性蛋白质)缀合的外源性蛋白质的工程化去核红系细胞。
术语“低渗加载的去核红系细胞”意指至少部分通过将去核红系细胞或红系祖细胞暴露于包含一种或多种外源性蛋白质的低离子强度缓冲液(例如，本文所述的任何示例性低离子强度缓冲液)来生成的工程化去核红系细胞。本文描述了可以用于生成低渗加载的去核红系细胞的方法的非限制性实例。用于生成低渗加载的去核红系细胞的其他方法是本领域已知的。
术语“通过物理操作加载的去核红系细胞”意指至少部分通过以导致向红系祖细胞中引入一种或多种外源性蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源性蛋白质)和/或编码一种或多种外源性蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源性蛋白质)的核酸的方式物理操作红系祖细胞来生成的去核红系细胞。可以用于将编码一种或多种外源性蛋白质的核酸引入红系祖细胞的物理操作的非限制性实例包括电穿孔和颗粒介导的转染。可以用于将编码一种或多种外源性蛋白质的核酸引入红系祖先的物理操作的其他实例是本领域已知的。
术语“外源性蛋白质”是指引入细胞内或细胞上的蛋白质，或通过将编码蛋白质的外源性核酸引入细胞或细胞的祖先中引起的由细胞表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源性蛋白质是由引入细胞或细胞的祖先中的外源性核酸编码的蛋白质，核酸任选地不由细胞保留。在一些实施方案中，外源性蛋白质是通过化学或酶促手段与细胞表面缀合的蛋白质。外源性蛋白质的非限制性类别包括酶、白细胞介素、细胞因子受体、Fc结合分子、T细胞激活配体、T细胞受体、免疫抑制分子、MHC分子、APC结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如，受体激动剂或受体拮抗剂)，和抗体或抗体片段。本文描述了可以存在于工程化去核红系细胞中的外源性蛋白质的其他实例(参见例如表A-D)。可以存在于工程化去核红系细胞中的外源性蛋白质的其他实例是本领域已知的。
术语“存在于膜上的蛋白质”意指(1)物理附着或至少部分嵌入去核红系细胞的膜中的蛋白质(例如，跨膜蛋白、外周膜蛋白、脂质锚定蛋白(例如，GPI锚、N-肉豆蔻酰化蛋白或S-棕榈酰化蛋白))或(2)与其关联受体稳定结合的蛋白质，其中关联受体物理附着到去核红系细胞的膜上(例如，与其关联受体结合的配体，其中关联受体物理附着到去核红系细胞的膜上)。用于确定哺乳动物细胞膜上蛋白质的存在的非限制性方法包括荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学、细胞分级测定法和Western印迹法。
术语“红系祖细胞”意指能够最终分化/发育成去核红系细胞的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，红系祖细胞是脐带血干细胞、CD34+细胞、造血干/祖细胞(HSC、HSPC)、脾集落形成(CFU-S)细胞、髓系共同祖细胞(CMP)、胚细胞集落形成细胞、爆发形成单位-红系细胞/红细胞(BFU-E)、巨核细胞-红系祖(MEP)细胞、红系集落形成单位或集落形成单位红细胞(CFU-E)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞(MSC)或其组合。在一些实例中，红系祖细胞是人红系祖细胞。在一些实施方案中，红系祖细胞可以获得自O阴性人供体。在一些实施方案中，红系祖细胞可以获得自O阴性和Kell阴性人供体。
术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是灵长类(例如，人、猿猴(例如，猴(例如，狨猴或狒狒)或猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿))、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)、兔子、狗、猫、马、绵羊、奶牛、猪或山羊。在一些实施方案中，受试者或“适合治疗的受试者”可以是非人哺乳动物，尤其是可以采用常规用作证明对人的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，小鼠、猪、大鼠或非人灵长类)。在一些实例中，受试者可以预先诊断或鉴定为需要由医学专业人员(例如，内科医师、实验室技术员、内科医师助理、护士或临床实验室技术员)治疗。
如本文所用，“治疗”意指受试者(例如，本文所述的任何示例性受试者)中医学疾病或病况的一种或多种症状的数量、严重性、频率和/或持续时间的减少。
术语“摇瓶”意指可以容纳一定体积的液体培养基的器皿(例如，无菌器皿)，其具有至少一个透气表面(例如，端部，其具有透气元件，例如膜，其也可以充当无菌屏障)和/或至少一个通气帽，并且其形状的至少部分是近似截头圆锥体的。例如，摇瓶可以是细胞培养瓶，例如T-瓶、锥形瓶，或其任何本领域公认的改良版。
术语“摇管”意指可以保留液体培养基的器皿(例如，无菌器皿)，其具有至少一个透气表面(例如，端部，其具有透气元件，例如膜，其也可以充当无菌屏障)和/或至少一个通气帽，并且能够在搅动(例如，旋转搅动)时将液体培养基保留在器皿内，并且其形状的至少部分是近似圆柱形的。例如，摇管可以是EppendorfTM管(例如，50mL或15mL的EppendorfTM管)，或其任何本领域公认的等同物或改良版。在一些实例中，摇管可以是多孔板中的孔(例如，圆底孔或平底孔)。
术语“补料分批培养”意指培养方法，其包括向初始细胞培养物中递增或连续添加第二液体培养基，而不从细胞培养物中大量或显著去除第一液体培养基。在一些情况下，第二液体培养基包括与第一液体培养基基本上相同浓度的相同组分。在其他情况下，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式和/或作为干粉添加。
术语“灌注培养”意指培养方法，其包括向细胞培养物中添加(递增或连续)液体培养基和从细胞培养物中除去液体培养基。除去和添加可以同时或依次进行，或两者结合进行。此外，除去和添加可以连续进行。
在一些情况下，在整个或部分培养期间，除去的液体培养基的体积和添加的液体培养基的体积在每24小时时段(或替代地，约1小时至约24小时的递增时间段或大于24小时的递增时间段)保持近似相同。如本领域中已知的，可以变化除去液体培养基体积的速率(体积/时间单位)和添加液体培养基体积的速率(体积/时间单位)。去除液体培养基体积的速率(体积/单位时间)和添加液体培养基体积的速率(体积/单位时间)可以大致相同或可以不同.
或者，在培养期间，除去和添加的体积可以在每24小时时段(或替代地，1小时至约24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)改变(例如，逐渐增加)。例如，在培养期间，可以增加(例如，逐渐或通过交错增量)在培养期间的每24小时时段(或替代地，约1小时至超过24小时之间的递增时间段或大于24小时的递增时间段)内除去的液体培养基的体积和添加的液体培养基的体积。
可以除去液体培养基的体积，例如通过可以从器皿(例如生物反应器)中除去液体培养基体积的机械系统，通过允许细胞沉降并使用移液器除去液体培养物的体积，或通过可以至少部分包括使用离心力的方法)。替代地或另外地，液体培养基的体积可以由液体培养基体积的渗出或重力流通过具有排除红系祖细胞和去核红系细胞的截留分子量的无菌膜除去。
可以将液体培养基的体积以自动化方式，例如通过蠕动泵或灌注泵添加到器皿(例如生物反应器)中。
术语“无动物成分的液体培养基”意指不含有任何衍生自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。
术语“无血清液体培养基”意指不含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学成分确定的液体培养基”意指其中所有化学组分都是已知的液体培养基。例如，化学成分确定的液体培养基不含有胎儿血清、血清白蛋白或血清白蛋白，因为这些制剂通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。
术语“搅动”意指细胞培养物(例如，包括本文所述的任何示例性细胞的细胞培养物)在器皿中的运动。可以使用任何本领域已知的方法，例如，以圆形或椭圆形运动移动含有细胞培养物的器皿的仪器，诸如旋转振荡器进行搅动。替代地或另外地，可以通过倾斜容器或滚动含有细胞培养物的器皿进行搅动。在一些实施方案中，可以通过在含有细胞培养物的生物反应器中使用叶轮来发生细胞培养物的搅动。
在本文所述的任何方法的一些实例中，细胞培养不包括在本文所述的任何方法的至少部分中搅动细胞培养物。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的而不意图是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的其他特征和优点将从以下详细描述和附图以及从权利要求中显而易见。
附图说明
图1显示了灌注培养的M期红系细胞和对照条件下培养的M期红系细胞的去核百分比。M期相对应于本文所述方法中的步骤(d)。
图2显示了灌注培养的M期红系细胞和在对照条件下培养的红系细胞的存活细胞密度。
图3显示了灌注培养的D期红系细胞的存活细胞密度和存活力。D期对应于本文所述方法中的步骤(b)。
发明详述
本文提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群。本文还提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括：(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在器皿内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)分批或补料分批培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)灌注培养步骤(c)的第三种细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群。本文还提供了生成去核红系细胞群的方法，该方法包括(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；(b)灌注培养第二细胞培养物约2天至约15天；(c)将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物布置到包含在器皿内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；(d)分批或补料分批培养步骤(c)的第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，第三培养基包含去核红系细胞群。
在一些实例中，本文所述的方法在任何本文所述方法结束时，提供在去核率或去核细胞百分比上的增加(例如，至少1％至约300％增加(例如，约1％至约280％增加、约1％至约260％增加、约1％至约240％增加、约1％至约220％增加、约1％至约200％增加、约1％至约180％增加、约1％至约160％增加、约1％增加至约140％增加、约1％至约120％增加、约1％增加至约100％增加、约1％增加至约80％增加、约1％增加至约60％增加、约1％增加至约40％增加、约1％增加至约20％增加、约1％增加至约10％增加、约1％增加至约5％增加、约5％增加至约300％增加、约5％至约280％增加、约5％至约260％增加、约5％至约240％增加、约5％至约220％增加、约5％至约200％增加、约5％至约180％增加、约5％至约160％增加、约5％增加至约140％增加、约5％至约120％增加、约5％增加至约100％增加、约5％增加至约80％增加、约5％增加至约60％增加、约5％增加至约40％增加、约5％增加至约20％增加、约5％增加至约10％增加、约10％增加至约300％增加、约10％至约280％增加、约10％至约260％增加、约10％至约240％增加、约10％至约220％增加、约10％至约200％增加、约10％至约180％增加、约10％至约160％增加、约10％增加至约140％增加、约10％至约120％增加、约10％增加至约100％增加、约10％增加至约80％增加、约10％增加至约60％增加、约10％增加至约40％增加、约10％增加至约20％增加、约20％增加至约300％增加、约20％至约280％增加、约20％至约260％增加、约20％至约240％增加、约20％至约220％增加、约20％至约200％增加、约20％至约180％增加、约20％至约160％增加、约20％增加至约140％增加、约20％至约120％增加、约20％增加至约100％增加、约20％增加至约80％增加、约20％增加至约60％增加、约20％增加至约40％增加、约40％增加至约300％增加、约40％至约280％增加、约40％至约260％增加、约40％至约240％增加、约40％至约220％增加、约40％至约200％增加、约40％至约180％增加、约40％至约160％增加、约40％增加至约140％增加、约40％至约120％增加、约40％增加至约100％增加、约40％增加至约80％增加、约40％增加至约60％增加、约60％增加至约300％增加、约60％至约280％增加、约60％至约260％增加、约60％至约240％增加、约60％至约220％增加、约60％至约200％增加、约60％至约180％增加、约60％至约160％增加、约60％增加至约140％增加、约60％至约120％增加、约60％增加至约100％增加、约60％增加至约80％增加、约80％增加至约300％增加、约80％至约280％增加、约80％至约260％增加、约80％至约240％增加、约80％至约220％增加、约80％至约200％增加、约80％至约180％增加、约80％至约160％增加、约80％增加至约140％增加、约80％至约120％增加、约80％增加至约100％增加、约100％增加至约300％增加、约100％至约280％增加、约100％至约260％增加、约100％至约240％增加、约100％至约220％增加、约100％至约200％增加、约100％至约180％增加、约100％至约160％增加、约100％增加至约140％增加、约100％至约120％增加、约120％增加至约300％增加、约120％至约280％增加、约120％至约260％增加、约120％至约240％增加、约120％至约220％增加、约120％至约200％增加、约120％至约180％增加、约120％至约160％增加、约120％增加至约140％增加、约140％增加至约300％增加、约140％至约280％增加、约140％至约260％增加、约140％至约240％增加、约140％至约220％增加、约140％至约200％增加、约140％至约180％增加、约140％至约160％增加、约160％增加至约300％增加、约160％至约280％增加、约160％至约260％增加、约160％至约240％增加、约160％至约220％增加、约160％至约200％增加、约160％至约180％增加、约180％增加至约300％增加、约180％至约280％增加、约180％至约260％增加、约180％至约240％增加、约180％至约220％增加、约180％至约200％增加、约200％增加至约300％增加、约200％至约280％增加、约200％至约260％增加、约200％至约240％增加、约200％至约220％增加、约220％增加至约300％增加、约220％至约280％增加、约220％至约260％增加、约220％至约240％增加、约240％增加至约300％增加、约240％至约280％增加、约240％至约260％增加、约260％增加至约300％增加、约260％至约280％增加或约280％增加至约300％增加))，例如，与不包括在分化或成熟期间使用灌注培养的类似方法相比。
在一些实例中，本文所述的方法在任何本文所述方法结束时，提供在去核红系细胞(例如，任何本文所述的去核红系细胞)的浓度、数量或产量上的约1％到约300％的增加(或本文所述的这个范围的任何子范围)，例如，与不包括在分化或成熟期间使用灌注培养的类似方法相比。
在一些实例中，本文所述的方法在任何本文所述方法期间，提供在每个祖红系细胞的平均细胞分裂数上的约1％至约300％的增加(或本文所述的这个范围的任何子范围)，例如，与不包括在分化或成熟期间使用灌注培养的类似方法相比。
以下描述了这些方法的非限制性方面。本领域技术人员可以理解，以下列出的示例性方面可以在任意组合中使用，并且可以与本领域已知的其他方面组合。
摇瓶
本文所述方法的一些方面包括使用摇瓶。在一些实例中，摇瓶可以具有以下的体积：约2mL至约5L、约2mL至约4.5L、约2mL至约4L、约2mL至约3.5L、约2mL至约3L、约2mL至约2.5L、约2mL至约2L、约2mL至约1.5L、约2mL至约1.0L、约2mL至约950mL、约2mL至约900mL、约2mL至约850mL、约2mL至约800mL、约2mL至约750mL、约2mL至约700mL、约2mL至约650mL、约2mL至约600mL、约2mL至约550mL、约2mL至约500mL、约2mL至约450mL、约2mL至约400mL、约2mL至约350mL、约2mL至约300mL、约2mL至约250mL、约2mL至约200mL、约2mL至约180mL、约2mL至约160mL、约2mL至约140mL、约2mL至约120mL、约2mL至约100mL、约2mL至约80mL、约2mL至约60mL、约2mL至约40mL、约2mL至约20mL、约2mL至约10mL、约2mL至约5mL、约5mL至约5L、约5mL至约4.5L、约5mL至约4L、约5mL至约3.5L、约5mL至约3L、约5mL至约2.5L、约5mL至约2L、约5mL至约1.5L、约5mL至约1.0L、约5mL至约950mL、约5mL至约900mL、约5mL至约850mL、约5mL至约800mL、约5mL至约750mL、约5mL至约700mL、约5mL至约650mL、约5mL至约600mL、约5mL至约550mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约5L、约10mL至约4.5L、约10mL至约4L、约10mL至约3.5L、约10mL至约3L、约10mL至约2.5L、约10mL至约2L、约10mL至约1.5L、约10mL至约1.0L、约10mL至约950mL、约10mL至约900mL、约10mL至约850mL、约10mL至约800mL、约10mL至约750mL、约10mL至约700mL、约10mL至约650mL、约10mL至约600mL、约10mL至约550mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约5L、约20mL至约4.5L、约20mL至约4L、约20mL至约3.5L、约20mL至约3L、约20mL至约2.5L、约20mL至约2L、约20mL至约1.5L、约20mL至约1.0L、约20mL至约950mL、约20mL至约900mL、约20mL至约850mL、约20mL至约800mL、约20mL至约750mL、约20mL至约700mL、约20mL至约650mL、约20mL至约600mL、约20mL至约550mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约5L、约40mL至约4.5L、约40mL至约4L、约40mL至约3.5L、约40mL至约3L、约40mL至约2.5L、约40mL至约2L、约40mL至约1.5L、约40mL至约1.0L、约40mL至约950mL、约40mL至约900mL、约40mL至约850mL、约40mL至约800mL、约40mL至约750mL、约40mL至约700mL、约40mL至约650mL、约40mL至约600mL、约40mL至约550mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约5L、约60mL至约4.5L、约60mL至约4L、约60mL至约3.5L、约60mL至约3L、约60mL至约2.5L、约60mL至约2L、约60mL至约1.5L、约60mL至约1.0L、约60mL至约950mL、约60mL至约900mL、约60mL至约850mL、约60mL至约800mL、约60mL至约750mL、约60mL至约700mL、约60mL至约650mL、约60mL至约600mL、约60mL至约550mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约5L、约80mL至约4.5L、约80mL至约4L、约80mL至约3.5L、约80mL至约3L、约80mL至约2.5L、约80mL至约2L、约80mL至约1.5L、约80mL至约1.0L、约80mL至约950mL、约80mL至约900mL、约80mL至约850mL、约80mL至约800mL、约80mL至约750mL、约80mL至约700mL、约80mL至约650mL、约80mL至约600mL、约80mL至约550mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约5L、约100mL至约4.5L、约100mL至约4L、约100mL至约3.5L、约100mL至约3L、约100mL至约2.5L、约100mL至约2L、约100mL至约1.5L、约100mL至约1.0L、约100mL至约950mL、约100mL至约900mL、约100mL至约850mL、约100mL至约800mL、约100mL至约750mL、约100mL至约700mL、约100mL至约650mL、约100mL至约600mL、约100mL至约550mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约5L、约120mL至约4.5L、约120mL至约4L、约120mL至约3.5L、约120mL至约3L、约120mL至约2.5L、约120mL至约2L、约120mL至约1.5L、约120mL至约1.0L、约120mL至约950mL、约120mL至约900mL、约120mL至约850mL、约120mL至约800mL、约120mL至约750mL、约120mL至约700mL、约120mL至约650mL、约120mL至约600mL、约120mL至约550mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约5L、约140mL至约4.5L、约140mL至约4L、约140mL至约3.5L、约140mL至约3L、约140mL至约2.5L、约140mL至约2L、约140mL至约1.5L、约140mL至约1.0L、约140mL至约950mL、约140mL至约900mL、约140mL至约850mL、约140mL至约800mL、约140mL至约750mL、约140mL至约700mL、约140mL至约650mL、约140mL至约600mL、约140mL至约550mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约5L、约160mL至约4.5L、约160mL至约4L、约160mL至约3.5L、约160mL至约3L、约160mL至约2.5L、约160mL至约2L、约160mL至约1.5L、约160mL至约1.0L、约160mL至约950mL、约160mL至约900mL、约160mL至约850mL、约160mL至约800mL、约160mL至约750mL、约160mL至约700mL、约160mL至约650mL、约160mL至约600mL、约160mL至约550mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约5L、约180mL至约4.5L、约180mL至约4L、约180mL至约3.5L、约180mL至约3L、约180mL至约2.5L、约180mL至约2L、约180mL至约1.5L、约180mL至约1.0L、约180mL至约950mL、约180mL至约900mL、约180mL至约850mL、约180mL至约800mL、约180mL至约750mL、约180mL至约700mL、约180mL至约650mL、约180mL至约600mL、约180mL至约550mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约5L、约200mL至约4.5L、约200mL至约4L、约200mL至约3.5L、约200mL至约3L、约200mL至约2.5L、约200mL至约2L、约200mL至约1.5L、约200mL至约1.0L、约200mL至约950mL、约200mL至约900mL、约200mL至约850mL、约200mL至约800mL、约200mL至约750mL、约200mL至约700mL、约200mL至约650mL、约200mL至约600mL、约200mL至约550mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约5L、约250mL至约4.5L、约250mL至约4L、约250mL至约3.5L、约250mL至约3L、约250mL至约2.5L、约250mL至约2L、约250mL至约1.5L、约250mL至约1.0L、约250mL至约950mL、约250mL至约900mL、约250mL至约850mL、约250mL至约800mL、约250mL至约750mL、约250mL至约700mL、约250mL至约650mL、约250mL至约600mL、约250mL至约550mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约5L、约300mL至约4.5L、约300mL至约4L、约300mL至约3.5L、约300mL至约3L、约300mL至约2.5L、约300mL至约2L、约300mL至约1.5L、约300mL至约1.0L、约300mL至约950mL、约300mL至约900mL、约300mL至约850mL、约300mL至约800mL、约300mL至约750mL、约300mL至约700mL、约300mL至约650mL、约300mL至约600mL、约300mL至约550mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约3L、约350mL至约2.5L、约350mL至约2L、约350mL至约1.5L、约350mL至约1.0L、约350mL至约950mL、约350mL至约900mL、约350mL至约850mL、约350mL至约800mL、约350mL至约750mL、约350mL至约700mL、约350mL至约650mL、约350mL至约600mL、约350mL至约550mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约5L、约400mL至约4.5L、约400mL至约4L、约400mL至约3.5L、约400mL至约3L、约400mL至约2.5L、约400mL至约2L、约400mL至约1.5L、约400mL至约1.0L、约400mL至约950mL、约400mL至约900mL、约400mL至约850mL、约400mL至约800mL、约400mL至约750mL、约400mL至约700mL、约400mL至约650mL、约400mL至约600mL、约400mL至约550mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约3L、约450mL至约2.5L、约450mL至约2L、约450mL至约1.5L、约450mL至约1.0L、约450mL至约950mL、约450mL至约900mL、约450mL至约850mL、约450mL至约800mL、约450mL至约750mL、约450mL至约700mL、约450mL至约650mL、约450mL至约600mL、约450mL至约550mL、约450mL至约500mL、约500mL至约5L、约500mL至约4.5L、约500mL至约4L、约500mL至约3.5L、约500mL至约3L、约500mL至约2.5L、约500mL至约2L、约500mL至约1.5L、约500mL至约1.0L、约500mL至约950mL、约500mL至约900mL、约500mL至约850mL、约500mL至约800mL、约500mL至约750mL、约500mL至约700mL、约500mL至约650mL、约500mL至约600mL、约500mL至约550mL、约550mL至约5L、约550mL至约4.5L、约550mL至约4L、约550mL至约3.5L、约550mL至约3L、约550mL至约2.5L、约550mL至约2L、约550mL至约1.5L、约550mL至约1.0L、约550mL至约950mL、约550mL至约900mL、约550mL至约850mL、约550mL至约800mL、约550mL至约750mL、约550mL至约700mL、约550mL至约650mL、约550mL至约600mL、约600mL至约5L、约600mL至约4.5L、约600mL至约4L、约600mL至约3.5L、约600mL至约3L、约600mL至约2.5L、约600mL至约2L、约600mL至约1.5L、约600mL至约1.0L、约600mL至约950mL、约600mL至约900mL、约600mL至约850mL、约600mL至约800mL、约600mL至约750mL、约600mL至约700mL、约600mL至约650mL、约650mL至约5L、约650mL至约4.5L、约650mL至约4L、约650mL至约3.5L、约650mL至约3L、约650mL至约2.5L、约650mL至约2L、约650mL至约1.5L、约650mL至约1.0L、约650mL至约950mL、约650mL至约900mL、约650mL至约850mL、约650mL至约800mL、约650mL至约750mL、约650mL至约700mL、约700mL至约5L、约700mL至约4.5L、约700mL至约4L、约700mL至约3.5L、约700mL至约3L、约700mL至约2.5L、约700mL至约2L、约700mL至约1.5L、约700mL至约1.0L、约700mL至约950mL、约700mL至约900mL、约700mL至约850mL、约700mL至约800mL、约700mL至约750mL、约750mL至约5L、约750mL至约4.5L、约750mL至约4L、约750mL至约3.5L、约750mL至约3L、约750mL至约2.5L、约750mL至约2L、约750mL至约1.5L、约750mL至约1.0L、约750mL至约950mL、约750mL至约900mL、约750mL至约850mL、约750mL至约800mL、约800mL至约5L、约800mL至约4.5L、约800mL至约4L、约800mL至约3.5L、约800mL至约3L、约800mL至约2.5L、约800mL至约2L、约800mL至约1.5L、约800mL至约1.0L、约800mL至约950mL、约800mL至约900mL、约800mL至约850mL、约850mL至约5L、约850mL至约4.5L、约850mL至约4L、约850mL至约3.5L、约850mL至约3L、约850mL至约2.5L、约850mL至约2L、约850mL至约1.5L、约850mL至约1.0L、约850mL至约950mL、约850mL至约900mL、约900mL至约5L、约900mL至约4.5L、约900mL至约4L、约900mL至约3.5L、约900mL至约3L、约900mL至约2.5L、约900mL至约2L、约900mL至约1.5L、约900mL至约1.0L、约900mL至约950mL、约950mL至约5L、约950mL至约4.5L、约950mL至约4L、约950mL至约3.5L、约950mL至约3L、约950mL至约2.5L、约950mL至约2L、约950mL至约1.5L、约950mL至约1.0L、约1.0L至约5L、约1.0L至约4.5L、约1.0L至约4L、约1.0L至约3.5L、约1.0L至约3L、1.0L至约2.5L、1.0L至约2L、1.0L至约1.5L、约1.5L至约5L、约1.5L至约4.5L、约1.5L至约4L、约1.5L至约3.5L、约1.5L至约3L、约1.5L至约2.5L、约1.5L至约2L、约2L至约5L、约2L至约4.5L、约2L至约4L、约2L至约3.5L、约2L至约3L、约2L至约2.5L、约2.5L至约5L、约2.5L至约4.5L、约2.5L至约4L、约2.5L至约3.5L、约2.5L至约3L、约3L至约5L、约3L至约4.5L、约3L至约4L、约3L至约3.5L、约3.5L至约5L、约3.5L至约4.5L、约3.5L至约4L、约4L至约5L、约4L至约4.5L，或约4.5L至约5L。
在一些实例中，摇瓶可以用以下的搅动来温育：约0.1xg至约50xg(例如，约0.1xg至约40xg、约0.1xg至约30xg、约0.1xg至约20xg、约0.1xg至约15xg、约0.1xg至约10xg、约0.1xg至约9.5xg、约0.1xg至约9.0xg、约0.1xg至约8.5xg、约0.1xg至约8.0xg、约0.1xg至约7.5xg、约0.1xg至约7.0xg、约0.1xg至约6.5xg、约0.1xg至约6.0xg、约0.1xg至约5.5xg、约0.1xg至约5.0xg、约0.1xg至约4.5xg、约0.1xg至约4.1xg、约0.1xg至约4.0xg、约0.1xg至约3.5xg、约0.1xg至约3.0xg、约0.1xg至约2.5xg、约0.1xg至约2.0xg、约0.1xg至约1.78xg、约0.1xg至约1.6xg、约0.1xg至约1.4xg、约0.1xg至约1.2xg、约0.1xg至约1.0xg、约0.1xg至约0.8xg、约0.1xg至约0.6xg、约0.1xg至约0.4xg、约0.1xg至约0.23xg、约0.23xg至约50xg、约0.23xg至约40xg、约0.23xg至约30xg、约0.23xg至约20xg、约0.23xg至约15xg、约0.23xg至约10xg、约0.23xg至约9.5xg、约0.23xg至约9.0xg、约0.23xg至约8.5xg、约0.23xg至约8.0xg、约0.23xg至约7.5xg、约0.23xg至约7.0xg、约0.23xg至约6.5xg、约0.23xg至约6.0xg、约0.23xg至约5.5xg、约0.23xg至约5.0xg、约0.23xg至约4.5xg、约0.23xg至约4.1xg、约0.23xg至约4.0xg、约0.23xg至约3.5xg、约0.23xg至约3.0xg、约0.23xg至约2.5xg、约0.23xg至约2.0xg、约0.23xg至约1.78xg、约0.23xg至约1.6xg、约0.23xg至约1.4xg、约0.23xg至约1.2xg、约0.23xg至约1.0xg、约0.23xg至约0.8xg、约0.23xg至约0.6xg、约0.23xg至约0.4xg、约0.4xg至约50xg、约0.4xg至约40xg、约0.4xg至约30xg、约0.4xg至约20xg、约0.4xg至约15xg、约0.4xg至约10xg、约0.4xg至约9.5xg、约0.4xg至约9.0xg、约0.4xg至约8.5xg、约0.4xg至约8.0xg、约0.4xg至约7.5xg、约0.4xg至约7.0xg、约0.4xg至约6.5xg、约0.4xg至约6.0xg、约0.4xg至约5.5xg、约0.4xg至约5.0xg、约0.4xg至约4.5xg、约0.4xg至约4.1xg、约0.4xg至约4.0xg、约0.4xg至约3.5xg、约0.4xg至约3.0xg、约0.4xg至约2.5xg、约0.4xg至约2.0xg、约0.4xg至约1.78xg、约0.4xg至约1.6xg、约0.4xg至约1.4xg、约0.4xg至约1.2xg、约0.4xg至约1.0xg、约0.4xg至约0.8xg、约0.4xg至约0.6xg、约0.6xg至约50xg、约0.6xg至约40xg、约0.6xg至约30xg、约0.6xg至约20xg、约0.6xg至约15xg、约0.6xg至约10xg、约0.6xg至约9.5xg、约0.6xg至约9.0xg、约0.6xg至约8.5xg、约0.6xg至约8.0xg、约0.6xg至约7.5xg、约0.6xg至约7.0xg、约0.6xg至约6.5xg、约0.6xg至约6.0xg、约0.6xg至约5.5xg、约0.6xg至约5.0xg、约0.6xg至约4.5xg、约0.6xg至约4.1xg、约0.6xg至约4.0xg、约0.6xg至约3.5xg、约0.6xg至约3.0xg、约0.6xg至约2.5xg、约0.6xg至约2.0xg、约0.6xg至约1.78xg、约0.6xg至约1.6xg、约0.6xg至约1.4xg、约0.6xg至约1.2xg、约0.6xg至约1.0xg、约0.6xg至约0.8xg、约0.8xg至约50xg、约0.8xg至约40xg、约0.8xg至约30xg、约0.8xg至约20xg、约0.8xg至约15xg、约0.8xg至约10xg、约0.8xg至约9.5xg、约0.8xg至约9.0xg、约0.8xg至约8.5xg、约0.8xg至约8.0xg、约0.8xg至约7.5xg、约0.8xg至约7.0xg、约0.8xg至约6.5xg、约0.8xg至约6.0xg、约0.8xg至约5.5xg、约0.8xg至约5.0xg、约0.8xg至约4.5xg、约0.8xg至约4.1xg、约0.8xg至约4.0xg、约0.8xg至约3.5xg、约0.8xg至约3.0xg、约0.8xg至约2.5xg、约0.8xg至约2.0xg、约0.8xg至约1.78xg、约0.8xg至约1.6xg、约0.8xg至约1.4xg、约0.8xg至约1.2xg、约0.8xg至约1.0xg、约1.0xg至约50xg、约1.0xg至约40xg、约1.0xg至约30xg、约1.0xg至约20xg、约1.0xg至约15xg、约1.0xg至约10xg、约1.0xg至约9.5xg、约1.0xg至约9.0xg、约1.0xg至约8.5xg、约1.0xg至约8.0xg、约1.0xg至约7.5xg、约1.0xg至约7.0xg、约1.0xg至约6.5xg、约1.0xg至约6.0xg、约1.0xg至约5.5xg、约1.0xg至约5.0xg、约1.0xg至约4.5xg、约1.0xg至约4.1xg、约1.0xg至约4.0xg、约1.0xg至约3.5xg、约1.0xg至约3.0xg、约1.0xg至约2.5xg、约1.0xg至约2.0xg、约1.0xg至约1.78xg、约1.0xg至约1.6xg、约1.0xg至约1.4xg、约1.0xg至约1.2xg、约1.2xg至约50xg、约1.2xg至约40xg、约1.2xg至约30xg、约1.2xg至约20xg、约1.2xg至约15xg、约1.2xg至约10xg、约1.2xg至约9.5xg、约1.2xg至约9.0xg、约1.2xg至约8.5xg、约1.2xg至约8.0xg、约1.2xg至约7.5xg、约1.2xg至约7.0xg、约1.2xg至约6.5xg、约1.2xg至约6.0xg、约1.2xg至约5.5xg、约1.2xg至约5.0xg、约1.2xg至约4.5xg、约1.2xg至约4.1xg、约1.2xg至约4.0xg、约1.2xg至约3.5xg、约1.2xg至约3.0xg、约1.2xg至约2.5xg、约1.2xg至约2.0xg、约1.2xg至约1.78xg、约1.2xg至约1.6xg、约1.2xg至约1.4xg、约1.4xg至约50xg、约1.4xg至约40xg、约1.4xg至约30xg、约1.4xg至约20xg、约1.4xg至约15xg、约1.4xg至约10xg、约1.4xg至约9.5xg、约1.4xg至约9.0xg、约1.4xg至约8.5xg、约1.4xg至约8.0xg、约1.4xg至约7.5xg、约1.4xg至约7.0xg、约1.4xg至约6.5xg、约1.4xg至约6.0xg、约1.4xg至约5.5xg、约1.4xg至约5.0xg、约1.4xg至约4.5xg、约1.4xg至约4.1xg、约1.4xg至约4.0xg、约1.4xg至约3.5xg、约1.4xg至约3.0xg、约1.4xg至约2.5xg、约1.4xg至约2.0xg、约1.4xg至约1.78xg、约1.4xg至约1.6xg、约1.6xg至约50xg、约1.6xg至约40xg、约1.6xg至约30xg、约1.6xg至约20xg、约1.6xg至约15xg、约1.6xg至约10xg、约1.6xg至约9.5xg、约1.6xg至约9.0xg、约1.6xg至约8.5xg、约1.6xg至约8.0xg、约1.6xg至约7.5xg、约1.6xg至约7.0xg、约1.6xg至约6.5xg、约1.6xg至约6.0xg、约1.6xg至约5.5xg、约1.6xg至约5.0xg、约1.6xg至约4.5xg、约1.6xg至约4.1xg、约1.6xg至约4.0xg、约1.6xg至约3.5xg、约1.6xg至约3.0xg、约1.6xg至约2.5xg、约1.6xg至约2.0xg、约1.6xg至约1.78xg、约1.78xg至约50xg、约1.78xg至约40xg、约1.78xg至约30xg、约1.78xg至约20xg、约1.78xg至约15xg、约1.78xg至约10xg、约1.78xg至约9.5xg、约1.78xg至约9.0xg、约1.78xg至约8.5xg、约1.78xg至约8.0xg、约1.78xg至约7.5xg、约1.78xg至约7.0xg、约1.78xg至约6.5xg、约1.78xg至约6.0xg、约1.78xg至约5.5xg、约1.78xg至约5.0xg、约1.78xg至约4.5xg、约1.78xg至约4.1xg、约1.78xg至约4.0xg、约1.78xg至约3.5xg、约1.78xg至约3.0xg、约1.78xg至约2.5xg、约1.78xg至约2.0xg、约2.0xg至约50xg、约2.0xg至约40xg、约2.0xg至约30xg、约2.0xg至约20xg、约2.0xg至约15xg、约2.0xg至约10xg、约2.0xg至约9.5xg、约2.0xg至约9.0xg、约2.0xg至约8.5xg、约2.0xg至约8.0xg、约2.0xg至约7.5xg、约2.0xg至约7.0xg、约2.0xg至约6.5xg、约2.0xg至约6.0xg、约2.0xg至约5.5xg、约2.0xg至约5.0xg、约2.0xg至约4.5xg、约2.0xg至约4.1xg、约2.0xg至约4.0xg、约2.0xg至约3.5xg、约2.0xg至约3.0xg、约2.0xg至约2.5xg、约2.5xg至约50xg、约2.5xg至约40xg、约2.5xg至约30xg、约2.5xg至约20xg、约2.5xg至约15xg、约2.5xg至约10xg、约2.5xg至约9.5xg、约2.5xg至约9.0xg、约2.5xg至约8.5xg、约2.5xg至约8.0xg、约2.5xg至约7.5xg、约2.5xg至约7.0xg、约2.5xg至约6.5xg、约2.5xg至约6.0xg、约2.5xg至约5.5xg、约2.5xg至约5.0xg、约2.5xg至约4.5xg、约2.5xg至约4.1xg、约2.5xg至约4.0xg、约2.5xg至约3.5xg、约2.5xg至约3.0xg、约3.0xg至约50xg、约3.0xg至约40xg、约3.0xg至约30xg、约3.0xg至约20xg、约3.0xg至约15xg、约3.0xg至约10xg、约3.0xg至约9.5xg、约3.0xg至约9.0xg、约3.0xg至约8.5xg、约3.0xg至约8.0xg、约3.0xg至约7.5xg、约3.0xg至约7.0xg、约3.0xg至约6.5xg、约3.0xg至约6.0xg、约3.0xg至约5.5xg、约3.0xg至约5.0xg、约3.0xg至约4.5xg、约3.0xg至约4.1xg、约3.0xg至约4.0xg、约3.0xg至约3.5xg、约3.5xg至约50xg、约3.5xg至约40xg、约3.5xg至约30xg、约3.5xg至约20xg、约3.5xg至约15xg、约3.5xg至约10xg、约3.5xg至约9.5xg、约3.5xg至约9.0xg、约3.5xg至约8.5xg、约3.5xg至约8.0xg、约3.5xg至约7.5xg、约3.5xg至约7.0xg、约3.5xg至约6.5xg、约3.5xg至约6.0xg、约3.5xg至约5.5xg、约3.5xg至约5.0xg、约3.5xg至约4.5xg、约3.5xg至约4.1xg、约3.5xg至约4.0x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各种摇瓶是商品化的。摇瓶的其他非限制性方面是本领域已知的。
摇管
本文所述方法的一些方面包括使用摇管。在一些实例中，摇管可以具有以下的体积：约1mL至约500mL、约1mL至约450mL、约1mL至约400mL、约1mL至约350mL、约1mL至约300mL、约1mL至约250mL、约1mL至约200mL、约1mL至约180mL、约1mL至约160mL、约1mL至约140mL、约1mL至约120mL、约1mL至约100mL、约1mL至约80mL、约1mL至约60mL、约1mL至约40mL、约1mL至约20mL、约1mL至约10mL、约1mL至约5mL、约1mL至约2mL、约2mL至约500mL、约2mL至约450mL、约2mL至约400mL、约2mL至约350mL、约2mL至约300mL、约2mL至约250mL、约2mL至约200mL、约2mL至约180mL、约2mL至约160mL、约2mL至约140mL、约2mL至约120mL、约2mL至约100mL、约2mL至约80mL、约2mL至约60mL、约2mL至约40mL、约2mL至约20mL、约2mL至约10mL、约2mL至约5mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL，或约450mL至约500mL。
在一些实例中，可以用约0.1xg至约50xg(或本文所述的这个范围的任何子范围)的搅动温育摇管。
各种摇管是商品化的。摇管的其他非限制性方面是本领域已知的。
培养袋
本文所述方法的一些方面包括使用培养袋。在一些实例中，培养袋可以具有以下的体积：约50mL至约500L、约50mL至约400L、约50mL至约300L、约50mL至约200L、约50mL至约100L、约50mL至约50L、50mL至约25L、约50mL至约20L、约50mL至约15L、约50mL至约10L、约50mL至约8L、约50mL至约6L、约50mL至约5L、约50mL至约4L、约50mL至约3L、约50mL至约2.5L、约50mL至约2.0L、约50mL至约1.8L、约50mL至约1.6L、约50mL至约1.4L、约50mL至约1.2L、约50mL至约1.0L、约50mL至约900mL、约50mL至约800mL、约50mL至约700mL、约50mL至约600mL、约50mL至约500mL、约50mL至约450mL、约50mL至约400mL、约50mL至约350mL、约50mL至约300mL、约50mL至约250mL、约50mL至约200mL、约50mL至约150mL、约50mL至约100mL、约50mL至约75mL、约75mL至约500L、约75mL至约400L、约75mL至约300L、约75mL至约200L、约75mL至约100L、约75mL至约50L、75mL至约25L、约75mL至约20L、约75mL至约15L、约75mL至约10L、约75mL至约8L、约75mL至约6L、约75mL至约5L、约75mL至约4L、约75mL至约3L、约75mL至约2.5L、约75mL至约2.0L、约75mL至约1.8L、约75mL至约1.6L、约75mL至约1.4L、约75mL至约1.2L、约75mL至约1.0L、约75mL至约900mL、约75mL至约800mL、约75mL至约700mL、约75mL至约600mL、约75mL至约500mL、约75mL至约450mL、约75mL至约400mL、约75mL至约350mL、约75mL至约300mL、约75mL至约250mL、约75mL至约200mL、约75mL至约150mL、约75mL至约100mL、约100mL至约500L、约100mL至约400L、约100mL至约300L、约100mL至约200L、约100mL至约100L、约100mL至约50L、100mL至约25L、约100mL至约20L、约100mL至约15L、约100mL至约10L、约100mL至约8L、约100mL至约6L、约100mL至约5L、约100mL至约4L、约100mL至约3L、约100mL至约2.5L、约100mL至约2.0L、约100mL至约1.8L、约100mL至约1.6L、约100mL至约1.4L、约100mL至约1.2L、约100mL至约1.0L、约100mL至约900mL、约100mL至约800mL、约100mL至约700mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约150mL、约150mL至约500L、约150mL至约400L、约150mL至约300L、约150mL至约200L、约150mL至约100L、约150mL至约50L、150mL至约25L、约150mL至约20L、约150mL至约15L、约150mL至约10L、约150mL至约8L、约150mL至约6L、约150mL至约5L、约150mL至约4L、约150mL至约3L、约150mL至约2.5L、约150mL至约2.0L、约150mL至约1.8L、约150mL至约1.6L、约150mL至约1.4L、约150mL至约1.2L、约150mL至约1.0L、约150mL至约900mL、约150mL至约800mL、约150mL至约700mL、约150mL至约600mL、约150mL至约500mL、约150mL至约450mL、约150mL至约400mL、约150mL至约350mL、约150mL至约300mL、约150mL至约250mL、约150mL至约200mL、约200mL至约500L、约200mL至约400L、约200mL至约300L、约200mL至约200L、约200mL至约100L、约200mL至约50L、200mL至约25L、约200mL至约20L、约200mL至约15L、约200mL至约10L、约200mL至约8L、约200mL至约6L、约200mL至约5L、约200mL至约4L、约200mL至约3L、约200mL至约2.5L、约200mL至约2.0L、约200mL至约1.8L、约200mL至约1.6L、约200mL至约1.4L、约200mL至约1.2L、约200mL至约1.0L、约200mL至约900mL、约200mL至约800mL、约200mL至约700mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约500L、约250mL至约400L、约250mL至约300L、约250mL至约200L、约250mL至约100L、约250mL至约50L、250mL至约25L、约250mL至约20L、约250mL至约15L、约250mL至约10L、约250mL至约8L、约250mL至约6L、约250mL至约5L、约250mL至约4L、约250mL至约3L、约250mL至约2.5L、约250mL至约2.0L、约250mL至约1.8L、约250mL至约1.6L、约250mL至约1.4L、约250mL至约1.2L、约250mL至约1.0L、约250mL至约900mL、约250mL至约800mL、约250mL至约700mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约500L、约300mL至约400L、约300mL至约300L、约300mL至约200L、约300mL至约100L、约300mL至约50L、300mL至约25L、约300mL至约20L、约300mL至约15L、约300mL至约10L、约300mL至约8L、约300mL至约6L、约300mL至约5L、约300mL至约4L、约300mL至约3L、约300mL至约2.5L、约300mL至约2.0L、约300mL至约1.8L、约300mL至约1.6L、约300mL至约1.4L、约300mL至约1.2L、约300mL至约1.0L、约300mL至约900mL、约300mL至约800mL、约300mL至约700mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约500L、约350mL至约400L、约350mL至约300L、约350mL至约200L、约350mL至约100L、约350mL至约50L、350mL至约25L、约350mL至约20L、约350mL至约15L、约350mL至约10L、约350mL至约8L、约350mL至约6L、约350mL至约5L、约350mL至约4L、约350mL至约3L、约350mL至约2.5L、约350mL至约2.0L、约350mL至约1.8L、约350mL至约1.6L、约350mL至约1.4L、约350mL至约1.2L、约350mL至约1.0L、约350mL至约900mL、约350mL至约800mL、约350mL至约700mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约500L、约400mL至约400L、约400mL至约300L、约400mL至约200L、约400mL至约100L、约400mL至约50L、400mL至约25L、约400mL至约20L、约400mL至约15L、约400mL至约10L、约400mL至约8L、约400mL至约6L、约400mL至约5L、约400mL至约4L、约400mL至约3L、约400mL至约2.5L、约400mL至约2.0L、约400mL至约1.8L、约400mL至约1.6L、约400mL至约1.4L、约400mL至约1.2L、约400mL至约1.0L、约400mL至约900mL、约400mL至约800mL、约400mL至约700mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约500L、约450mL至约400L、约450mL至约300L、约450mL至约200L、约450mL至约100L、约450mL至约50L、450mL至约25L、约450mL至约20L、约450mL至约15L、约450mL至约10L、约450mL至约8L、约450mL至约6L、约450mL至约5L、约450mL至约4L、约450mL至约3L、约450mL至约2.5L、约450mL至约2.0L、约450mL至约1.8L、约450mL至约1.6L、约450mL至约1.4L、约450mL至约1.2L、约450mL至约1.0L、约450mL至约900mL、约450mL至约800mL、约450mL至约700mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约500L、约500mL至约400L、约500mL至约300L、约500mL至约200L、约500mL至约100L、约500mL至约50L、500mL至约25L、约500mL至约20L、约500mL至约15L、约500mL至约10L、约500mL至约8L、约500mL至约6L、约500mL至约5L、约500mL至约4L、约500mL至约3L、约500mL至约2.5L、约500mL至约2.0L、约500mL至约1.8L、约500mL至约1.6L、约500mL至约1.4L、约500mL至约1.2L、约500mL至约1.0L、约500mL至约900mL、约500mL至约800mL、约500mL至约700mL、约500mL至约600mL、约600mL至约500L、约600mL至约400L、约600mL至约300L、约600mL至约200L、约600mL至约100L、约600mL至约50L、600mL至约25L、约600mL至约20L、约600mL至约15L、约600mL至约10L、约600mL至约8L、约600mL至约6L、约600mL至约5L、约600mL至约4L、约600mL至约3L、约600mL至约2.5L、约600mL至约2.0L、约600mL至约1.8L、约600mL至约1.6L、约600mL至约1.4L、约600mL至约1.2L、约600mL至约1.0L、约600mL至约900mL、约600mL至约800mL、约600mL至约700mL、约700mL至约500L、约700mL至约400L、约700mL至约300L、约700mL至约200L、约700mL至约100L、约700mL至约50L、700mL至约25L、约700mL至约20L、约700mL至约15L、约700mL至约10L、约700mL至约8L、约700mL至约6L、约700mL至约5L、约700mL至约4L、约700mL至约3L、约700mL至约2.5L、约700mL至约2.0L、约700mL至约1.8L、约700mL至约1.6L、约700mL至约1.4L、约700mL至约1.2L、约700mL至约1.0L、约700mL至约900mL、约700mL至约800mL、约800mL至约500L、约800mL至约400L、约800mL至约300L、约800mL至约200L、约800mL至约100L、约8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在一些实例中，可以在以下的摇摆速率下温育培养袋：约每分钟5个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟30个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟25个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟20个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟15个摇摆周期、约每分钟5个摇摆周期至约每分钟10个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟30个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟25个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟20个摇摆周期、约每分钟10个摇摆周期至约每分钟15个摇摆周期、约每分钟15个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟15个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期、约每分钟15个摇摆周期至约每分钟30个摇摆周期、约每分钟15个摇摆周期至约每分钟25个摇摆周期、约每分钟15个摇摆周期至约每分钟20个摇摆周期、约每分钟20个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟20个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期、约每分钟20个摇摆周期至约每分钟30个摇摆周期、约每分钟20个摇摆周期至约每分钟25个摇摆周期、约每分钟25个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟25个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期、约每分钟25个摇摆周期至约每分钟30个摇摆周期、约每分钟30个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期、约每分钟30个摇摆周期至约每分钟35个摇摆周期，或约每分钟35个摇摆周期至约每分钟40个摇摆周期。
各种培养袋是商品化的。培养袋的其他非限制性方面是本领域已知的。
生物反应器
本文所述的方法的一些方面包括使用生物反应器(例如，灌注生物反应器)。在一些实例中，生物反应器(例如，灌注生物反应器)可以具有以下的体积：约500mL至约15,000L、约500mL至约12,500L、约500mL至约10,000L、约500mL至约8,000L、约500mL至约6,000L、约500mL至约4,000L、约500mL至约2,000L、约500mL至约1,000L、约500mL至约800L、约500mL至约600L、约500mL至约400L、约500mL至约200L、约500mL至约100L、约500mL至约50L、约500mL至约20L、约500mL至约10L、约500mL至约5L、约500mL至约1L、约500mL至约750mL、约750mL至约15,000L、约750mL至约12,500L、约750mL至约10,000L、约750mL至约8,000L、约750mL至约6,000L、约750mL至约4,000L、约750mL至约2,000L、约750mL至约1,000L、约750mL至约800L、约750mL至约600L、约750mL至约400L、约750mL至约200L、约750mL至约100L、约750mL至约50L、约750mL至约20L、约750mL至约10L、约750mL至约5L、约750mL至约1L、约1L至约15,000L、约1L至约12,500L、约1L至约10,000L、约1L至约8,000L、约1L至约6,000L、约1L至约4,000L、约1L至约2,000L、约1L至约1,000L、约1L至约800L、约1L至约600L、约1L至约400L、约1L至约200L、约1L至约100L、约1L至约50L、约1L至约20L、约1L至约10L、约1L至约5L、约5L至约15,000L、约5L至约12,500L、约5L至约10,000L、约5L至约8,000L、约5L至约6,000L、约5L至约4,000L、约5L至约2,000L、约5L至约1,000L、约5L至约800L、约5L至约600L、约5L至约400L、约5L至约200L、约5L至约100L、约5L至约50L、约5L至约20L、约5L至约10L、约10L至约15,000L、约10L至约12,500L、约10L至约10,000L、约10L至约8,000L、约10L至约6,000L、约10L至约4,000L、约10L至约2,000L、约10L至约1,000L、约10L至约800L、约10L至约600L、约10L至约400L、约10L至约200L、约10L至约100L、约10L至约50L、约10L至约20L、约20L至约15,000L、约20L至约12,500L、约20L至约10,000L、约20L至约8,000L、约20L至约6,000L、约20L至约4,000L、约20L至约2,000L、约20L至约1,000L、约20L至约800L、约20L至约600L、约20L至约400L、约20L至约200L、约20L至约100L、约20L至约50L、约50L至约15,000L、约50L至约12,500L、约50L至约10,000L、约50L至约8,000L、约50L至约6,000L、约50L至约4,000L、约50L至约2,000L、约50L至约1,000L、约50L至约800L、约50L至约600L、约50L至约400L、约50L至约200L、约50L至约100L、约100L至约15,000L、约100L至约12,500L、约100L至约10,000L、约100L至约8,000L、约100L至约6,000L、约100L至约4,000L、约100L至约2,000L、约100L至约1,000L、约100L至约800L、约100L至约600L、约100L至约400L、约100L至约200L、约200L至约15,000L、约200L至约12,500L、约200L至约10,000L、约200L至约8,000L、约200L至约6,000L、约200L至约4,000L、约200L至约2,000L、约200L至约1,000L、约200L至约800L、约200L至约600L、约200L至约400L、约400L至约15,000L、约400L至约12,500L、约400L至约10,000L、约400L至约8,000L、约400L至约6,000L、约400L至约4,000L、约400L至约2,000L、约400L至约1,000L、约400L至约800L、约400L至约600L、约600L至约15,000L、约600L至约12,500L、约600L至约10,000L、约600L至约8,000L、约600L至约6,000L、约600L至约4,000L、约600L至约2,000L、约600L至约1,000L、约600L至约800L、约800L至约15,000L、约800L至约12,500L、约800L至约10,000L、约800L至约8,000L、约800L至约6,000L、约800L至约4,000L、约800L至约2,000L、约800L至约1,000L、约1,000L至约15,000L、约1,000L至约12,500L、约1,000L至约10,000L、约1,000L至约8,000L、约1,000L至约6,000L、约1,000L至约4,000L、约1,000L至约2,000L、约2,000L至约15,000L、约2,000L至约12,500L、约2,000L至约10,000L、约2,000L至约8,000L、约2,000L至约6,000L、约2,000L至约4,000L、约4,000L至约15,000L、约4,000L至约12,500L、约4,000L至约10,000L、约4,000L至约8,000L、约2,000L至约6,000L、约6,000L至约15,000L、约6,000L至约12,500L、约6,000L至约10,000L、约6,000L至约8,000L、约8,000L至约15,000L、约8,000L至约12,500L、约8,000L至约10,000L、约10,000L至约15,000L、约10,000L至约12,500L，或约12,500L至约15,000L。
各种生物反应器(例如，灌注生物反应器)是商品化的。生物反应器(例如，灌注生物反应器)的其他非限制性方面是本领域已知的。
提供第二细胞培养物(步骤A)
在本文所述的任何方法中，步骤(a)包括将一定体积的红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)的第一细胞培养物布置到包含在器皿(例如，生物反应器(例如，灌注生物反应器)、摇瓶、摇管或培养袋)内的第二培养基(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性第二培养基)中，以提供具有以下初始细胞密度的第二细胞培养物：0.1x104个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约0.5x105个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约1x104个细胞/mL、约0.1x104个细胞/mL至约0.5x104个细胞/mL、0.5x104个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约0.5x105个细胞/mL、约0.5x104个细胞/mL至约1x104个细胞/mL,1x104个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约1x104个细胞/mL至约0.5x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL，或约0.5x107个细胞/mL至约1x107个细胞/mL。
在一些实施方案中，步骤(a)包括布置以下的体积：约0.1mL至约5,000L、约0.1mL至约4,500L、约0.1mL至约4,000L、约0.1mL至约3,500L、约0.1mL至约3,000L、约0.1mL至约2,500L、约0.1mL至约2,000L、约0.1mL至约1,500L、约1mL至约1,000L、约0.1mL至约800mL、约0.1mL至约600mL、约0.1mL至约500mL、约0.1mL至约450mL、约0.1mL至约400mL、约0.1mL至约350mL、约0.1mL至约300mL、约0.1mL至约250mL、约0.1mL至约200mL、约0.1mL至约150mL、约0.1mL至约100mL、约0.1mL至约50mL、约0.1mL至约20mL、约0.1mL至约10mL、约0.1mL至约5mL、约5mL至约5,000L、约5mL至约4,500L、约5mL至约4,000L、约5mL至约3,500L、约5mL至约3,000L、约5mL至约2,500L、约5mL至约2,000L、约5mL至约1,500L、约5mL至约1,000L、约5mL至约800mL、约5mL至约600mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约150mL、约5mL至约100mL、约5mL至约50mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约5,000L、约10mL至约4,500L、约10mL至约4,000L、约10mL至约3,500L、约10mL至约3,000L、约10mL至约2,500L、约10mL至约2,000L、约10mL至约1,500L、约10mL至约1,000L、约10mL至约800mL、约10mL至约600mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约150mL、约10mL至约100mL、约10mL至约50mL、约10mL至约20mL、约20mL至约5,000L、约20mL至约4,500L、约20mL至约4,000L、约20mL至约3,500L、约20mL至约3,000L、约20mL至约2,500L、约20mL至约2,000L、约20mL至约1,500L、约20mL至约1,000L、约20mL至约800mL、约20mL至约600mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约150mL、约20mL至约100mL、约20mL至约50mL、约50mL至约5,000L、约50mL至约4,500L、约50mL至约4,000L、约50mL至约3,500L、约50mL至约3,000L、约50mL至约2,500L、约50mL至约2,000L、约50mL至约1,500L、约50mL至约1,000L、约50mL至约800mL、约50mL至约600mL、约50mL至约500mL、约50mL至约450mL、约50mL至约400mL、约50mL至约350mL、约50mL至约300mL、约50mL至约250mL、约50mL至约200mL、约50mL至约150mL、约50mL至约100mL、约100mL至约5,000L、约100mL至约4,500L、约100mL至约4,000L、约100mL至约3,500L、约100mL至约3,000L、约100mL至约2,500L、约100mL至约2,000L、约100mL至约1,500L、约100mL至约1,000L、约100mL至约800mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约150mL、约150mL至约5,000L、约150mL至约4,500L、约150mL至约4,000L、约150mL至约3,500L、约150mL至约3,000L、约150mL至约2,500L、约150mL至约2,000L、约150mL至约1,500L、约150mL至约1,000L、约150mL至约800mL、约150mL至约600mL、约150mL至约500mL、约150mL至约450mL、约150mL至约400mL、约150mL至约350mL、约150mL至约300mL、约150mL至约250mL、约150mL至约200mL、约200mL至约5,000L、约200mL至约4,500L、约200mL至约4,000L、约200mL至约3,500L、约200mL至约3,000L、约200mL至约2,500L、约200mL至约2,000L、约200mL至约1,500L、约200mL至约1,000L、约200mL至约800mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约5,000L、约250mL至约4,500L、约250mL至约4,000L、约250mL至约3,500L、约250mL至约3,000L、约250mL至约2,500L、约250mL至约2,000L、约250mL至约1,500L、约250mL至约1,000L、约250mL至约800mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约5,000L、约300mL至约4,500L、约300mL至约4,000L、约300mL至约3,500L、约300mL至约3,000L、约300mL至约2,500L、约300mL至约2,000L、约300mL至约1,500L、约300mL至约1,000L、约300mL至约800mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约5,000L、约350mL至约4,500L、约350mL至约4,000L、约350mL至约3,500L、约350mL至约3,000L、约350mL至约2,500L、约350mL至约2,000L、约350mL至约1,500L、约350mL至约1,000L、约350mL至约800mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约5,000L、约400mL至约4,500L、约400mL至约4,000L、约400mL至约3,500L、约400mL至约3,000L、约400mL至约2,500L、约400mL至约2,000L、约400mL至约1,500L、约400mL至约1,000L、约400mL至约800mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约5,000L、约450mL至约4,500L、约450mL至约4,000L、约450mL至约3,500L、约450mL至约3,000L、约450mL至约2,500L、约450mL至约2,000L、约450mL至约1,500L、约450mL至约1,000L、约450mL至约800mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约5,000L、约500mL至约4,500L、约500mL至约4,000L、约500mL至约3,500L、约500mL至约3,000L、约500mL至约2,500L、约500mL至约2,000L、约500mL至约1,500L、约500mL至约1,000L、约500mL至约800mL、约500mL至约600mL、约600mL至约5,000L、约600mL至约4,500L、约600mL至约4,000L、约600mL至约3,500L、约600mL至约3,000L、约600mL至约2,500L、约600mL至约2,000L、约600mL至约1,500L、约600mL至约1,000L、约600mL至约800mL、约800mL至约5,000L、约800mL至约4,500L、约800mL至约4,000L、约800mL至约3,500L、约800mL至约3,000L、约800mL至约2,500L、约800mL至约2,000L、约800mL至约1,500L、约800mL至约1,000L、约1,000L至约5,000L、约1,000L至约4,500L、约1,000L至约4,000L、约1,000L至约3,500L、约1,000L至约3,000L、约1,000L至约2,500L、约1,000L至约2,000L、约1,000L至约1,500L、约1,500L至约5,000L、约1,500L至约4,500L、约1,500L至约4,000L、约1,500L至约3,500L、约1,500L至约3,000L、约1,500L至约2,500L、约1,500L至约2,000L、约2,000L至约5,000L、约2,000L至约4,500L、约2,000L至约4,000L、约2,000L至约3,500L、约2,000L至约3,000L、约2,000L至约2,500L、约2,500L至约5,000L、约2,500L至约4,500L、约2,500L至约4,000L、约2,500L至约3,500L、约2,500L至约3,000L、约3,000L至约5,000L、约3,000L至约4,500L、约3,000L至约4,000L、约3,000L至约3,500L、约3,500L至约5,000L、约3,500L至约4,500L、约3,500L至约4,000L、约4,000L至约5,000L、约4,000L至约4,500L、约4,500L至约5,000L。
在一些实施方案中，步骤(a)包括布置以下的体积：约10μL至约0.1mL、约10μL至约80μL、约10μL至约60μL、约10μL至约40μL、约10μL至约20μL、约20μL至约0.1mL、约20μL至约80μL、约20μL至约60μL、约20μL至约40μL、约40μL至约0.1mL、约40μL至约80μL、约40μL至约60μL、约60μL至约0.1mL、约60μL至约80μL，或约60μL至约0.1mL。
在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是生物反应器(例如，灌注生物反应器)(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)。可以用于步骤(a)中的生物反应器的其他实例和方面是本领域已知的。
在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇瓶(例如，具有本文所述的任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)。可以用于步骤(a)中的摇瓶的其他实例和方面是本领域已知的。
在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是摇管(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性摇管)。可以用于步骤(a)中的摇管的其他实例和方面是本领域已知的。在一些实施方案中，步骤(a)中的器皿是培养袋(例如，本文所述的任何示例性培养袋)。
在一些实例中，第二培养基包括以下的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：转铁蛋白(例如，约1μg/mL至约500μg/mL转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3或本文所述的这个范围的任何子范围)、干细胞因子(SCF)(例如，约1ng/mL至约1μg/mL SCF或本文所述的这个范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的这个范围的任何子范围)、红细胞生成素(EPO)或EPO-模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO或EPO-模拟肽或本文所述的这个范围的任何子范围)和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的这个范围的任何子范围)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1mM至约10mM(或本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括0.1％w/v至约4％w/v(例如，约0.1％w/v至约3.5％w/v、约0.1％w/v至约3.0％w/v、约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.2％w/v至约4％w/v、约0.2％w/v至约3.5％w/v、约0.2％w/v至约3.0％w/v、约0.2％w/v至约2.5％w/v、约0.2％w/v至约2.0％w/v、约0.2％w/v至约1.5％w/v、约0.2％w/v至约1.0％w/v、约0.2％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约4％w/v、约0.5％w/v至约3.5％w/v、约0.5％w/v至约3.0％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约4％w/v、约1.0％w/v至约3.5％w/v、约1.0％w/v至约3.0％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约4％w/v、约1.5％w/v至约3.5％w/v、约1.5％w/v至约3.0％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约4％w/v、约2.0％w/v至约3.5％w/v、约2.0％w/v至约3.0％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v、约2.5％w/v至约4％w/v、约2.5％w/v至约3.5％w/v、约2.5％w/v至约3.0％w/v、约3.0％w/v至约4％w/v、约3.0％w/v至约3.5％w/v，或约3.5％w/v至约4.0％w/v)人血清白蛋白。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v，或约2.5％w/v至约3％w/v)泊洛沙姆-188(P188)。
在一些实例中，第二培养基包含约1μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约480μg/mL、约1μg/mL至约460μg/mL、约1μg/mL至约440μg/mL、约1μg/mL至约420μg/mL、约1μg/mL至约400μg/mL、约1μg/mL至约380μg/mL、约1μg/mL至约360μg/mL、约1μg/mL至约340μg/mL、约1μg/mL至约320μg/mL、约1μg/mL至约300μg/mL、约1μg/mL至约280μg/mL、约1μg/mL至约260μg/mL、约1μg/mL至约240μg/mL、约1μg/mL至约220μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约180μg/mL、约1μg/mL至约160μg/mL、约1μg/mL至约140μg/mL、约1μg/mL至约120μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约1μg/mL至约60μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约480μg/mL、约10μg/mL至约460μg/mL、约10μg/mL至约440μg/mL、约10μg/mL至约420μg/mL、约10μg/mL至约400μg/mL、约10μg/mL至约380μg/mL、约10μg/mL至约360μg/mL、约10μg/mL至约340μg/mL、约10μg/mL至约320μg/mL、约10μg/mL至约300μg/mL、约10μg/mL至约280μg/mL、约10μg/mL至约260μg/mL、约10μg/mL至约240μg/mL、约10μg/mL至约220μg/mL、约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约180μg/mL、约10μg/mL至约160μg/mL、约10μg/mL至约140μg/mL、约10μg/mL至约120μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约10μg/mL至约60μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约500μg/mL、约20μg/mL至约480μg/mL、约20μg/mL至约460μg/mL、约20μg/mL至约440μg/mL、约20μg/mL至约420μg/mL、约20μg/mL至约400μg/mL、约20μg/mL至约380μg/mL、约20μg/mL至约360μg/mL、约20μg/mL至约340μg/mL、约20μg/mL至约320μg/mL、约20μg/mL至约300μg/mL、约20μg/mL至约280μg/mL、约20μg/mL至约260μg/mL、约20μg/mL至约240μg/mL、约20μg/mL至约220μg/mL、约20μg/mL至约200μg/mL、约20μg/mL至约180μg/mL、约20μg/mL至约160μg/mL、约20μg/mL至约140μg/mL、约20μg/mL至约120μg/mL、约20μg/mL至约100μg/mL、约20μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约60μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约500μg/mL、约40μg/mL至约480μg/mL、约40μg/mL至约460μg/mL、约40μg/mL至约440μg/mL、约40μg/mL至约420μg/mL、约40μg/mL至约400μg/mL、约40μg/mL至约380μg/mL、约40μg/mL至约360μg/mL、约40μg/mL至约340μg/mL、约40μg/mL至约320μg/mL、约40μg/mL至约300μg/mL、约40μg/mL至约280μg/mL、约40μg/mL至约260μg/mL、约40μg/mL至约240μg/mL、约40μg/mL至约220μg/mL、约40μg/mL至约200μg/mL、约40μg/mL至约180μg/mL、约40μg/mL至约160μg/mL、约40μg/mL至约140μg/mL、约40μg/mL至约120μg/mL、约40μg/mL至约100μg/mL、约40μg/mL至约80μg/mL、约40μg/mL至约60μg/mL、约60μg/mL至约500μg/mL、约60μg/mL至约480μg/mL、约60μg/mL至约460μg/mL、约60μg/mL至约440μg/mL、约60μg/mL至约420μg/mL、约60μg/mL至约400μg/mL、约60μg/mL至约380μg/mL、约60μg/mL至约360μg/mL、约60μg/mL至约340μg/mL、约60μg/mL至约320μg/mL、约60μg/mL至约300μg/mL、约60μg/mL至约280μg/mL、约60μg/mL至约260μg/mL、约60μg/mL至约240μg/mL、约60μg/mL至约220μg/mL、约60μg/mL至约200μg/mL、约60μg/mL至约180μg/mL、约60μg/mL至约160μg/mL、约60μg/mL至约140μg/mL、约60μg/mL至约120μg/mL、约60μg/mL至约100μg/mL、约60μg/mL至约80μg/mL、约80μg/mL至约500μg/mL、约80μg/mL至约480μg/mL、约80μg/mL至约460μg/mL、约80μg/mL至约440μg/mL、约80μg/mL至约420μg/mL、约80μg/mL至约400μg/mL、约80μg/mL至约380μg/mL、约80μg/mL至约360μg/mL、约80μg/mL至约340μg/mL、约80μg/mL至约320μg/mL、约80μg/mL至约300μg/mL、约80μg/mL至约280μg/mL、约80μg/mL至约260μg/mL、约80μg/mL至约240μg/mL、约80μg/mL至约220μg/mL、约80μg/mL至约200μg/mL、约80μg/mL至约180μg/mL、约80μg/mL至约160μg/mL、约80μg/mL至约140μg/mL、约80μg/mL至约120μg/mL、约80μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约480μg/mL、约100μg/mL至约460μg/mL、约100μg/mL至约440μg/mL、约100μg/mL至约420μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约380μg/mL、约100μg/mL至约360μg/mL、约100μg/mL至约340μg/mL、约100μg/mL至约320μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约280μg/mL、约100μg/mL至约260μg/mL、约100μg/mL至约240μg/mL、约100μg/mL至约220μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约180μg/mL、约100μg/mL至约160μg/mL、约100μg/mL至约140μg/mL、约100μg/mL至约120μg/mL、约120μg/mL至约500μg/mL、约120μg/mL至约480μg/mL、约120μg/mL至约460μg/mL、约120μg/mL至约440μg/mL、约120μg/mL至约420μg/mL、约120μg/mL至约400μg/mL、约120μg/mL至约380μg/mL、约120μg/mL至约360μg/mL、约120μg/mL至约340μg/mL、约120μg/mL至约320μg/mL、约120μg/mL至约300μg/mL、约120μg/mL至约280μg/mL、约120μg/mL至约260μg/mL、约120μg/mL至约240μg/mL、约120μg/mL至约220μg/mL、约120μg/mL至约200μg/mL、约120μg/mL至约180μg/mL、约120μg/mL至约160μg/mL、约120μg/mL至约140μg/mL、约140μg/mL至约500μg/mL、约140μg/mL至约480μg/mL、约140μg/mL至约460μg/mL、约140μg/mL至约440μg/mL、约140μg/mL至约420μg/mL、约140μg/mL至约400μg/mL、约140μg/mL至约380μg/mL、约140μg/mL至约360μg/mL、约140μg/mL至约340μg/mL、约140μg/mL至约320μg/mL、约140μg/mL至约300μg/mL、约140μg/mL至约280μg/mL、约140μg/mL至约260μg/mL、约140μg/mL至约240μg/mL、约140μg/mL至约220μg/mL、约140μg/mL至约200μg/mL、约140μg/mL至约180μg/mL、约140μg/mL至约160μg/mL、约160μg/mL至约500μg/mL、约160μg/mL至约480μg/mL、约160μg/mL至约460μg/mL、约160μg/mL至约440μg/mL、约160μg/mL至约420μg/mL、约160μg/mL至约400μg/mL、约160μg/mL至约380μg/mL、约160μg/mL至约360μg/mL、约160μg/mL至约340μg/mL、约160μg/mL至约320μg/mL、约160μg/mL至约300μg/mL、约160μg/mL至约280μg/mL、约160μg/mL至约260μg/mL、约160μg/mL至约240μg/mL、约160μg/mL至约220μg/mL、约160μg/mL至约200μg/mL、约160μg/mL至约180μg/mL、约180μg/mL至约500μg/mL、约180μg/mL至约480μg/mL、约180μg/mL至约460μg/mL、约180μg/mL至约440μg/mL、约180μg/mL至约420μg/mL、约180μg/mL至约400μg/mL、约180μg/mL至约380μg/mL、约180μg/mL至约360μg/mL、约180μg/mL至约340μg/mL、约180μg/mL至约320μg/mL、约180μg/mL至约300μg/mL、约180μg/mL至约280μg/mL、约180μg/mL至约260μg/mL、约180μg/mL至约240μg/mL、约180μg/mL至约220μg/mL、约180μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约480μg/mL、约200μg/mL至约460μg/mL、约200μg/mL至约440μg/mL、约200μg/mL至约420μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约380μg/mL、约200μg/mL至约360μg/mL、约200μg/mL至约340μg/mL、约200μg/mL至约320μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约280μg/mL、约200μg/mL至约260μg/mL、约200μg/mL至约240μg/mL、约200μg/mL至约220μg/mL、约220μg/mL至约500μg/mL、约220μg/mL至约480μg/mL、约220μg/mL至约460μg/mL、约220μg/mL至约440μg/mL、约220μg/mL至约420μg/mL、约220μg/mL至约400μg/mL、约220μg/mL至约380μg/mL、约220μg/mL至约360μg/mL、约220μg/mL至约340μg/mL、约220μg/mL至约320μg/mL、约220μg/mL至约300μg/mL、约220μg/mL至约280μg/mL、约220μg/mL至约260μg/mL、约220μg/mL至约240μg/mL、约240μg/mL至约500μg/mL、约240μg/mL至约480μg/mL、约240μg/mL至约460μg/mL、约240μg/mL至约440μg/mL、约240μg/mL至约420μg/mL、约240μg/mL至约400μg/mL、约240μg/mL至约380μg/mL、约240μg/mL至约360μg/mL、约240μg/mL至约340μg/mL、约240μg/mL至约320μg/mL、约240μg/mL至约300μg/mL、约240μg/mL至约280μg/mL、约240μg/mL至约260μg/mL、约260μg/mL至约500μg/mL、约260μg/mL至约480μg/mL、约260μg/mL至约460μg/mL、约260μg/mL至约440μg/mL、约260μg/mL至约420μg/mL、约260μg/mL至约400μg/mL、约260μg/mL至约380μg/mL、约260μg/mL至约360μg/mL、约260μg/mL至约340μg/mL、约260μg/mL至约320μg/mL、约260μg/mL至约300μg/mL、约260μg/mL至约280μg/mL、约280μg/mL至约500μg/mL、约280μg/mL至约480μg/mL、约280μg/mL至约460μg/mL、约280μg/mL至约440μg/mL、约280μg/mL至约420μg/mL、约280μg/mL至约400μg/mL、约280μg/mL至约380μg/mL、约280μg/mL至约360μg/mL、约280μg/mL至约340μg/mL、约280μg/mL至约320μg/mL、约280μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约480μg/mL、约300μg/mL至约460μg/mL、约300μg/mL至约440μg/mL、约300μg/mL至约420μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约380μg/mL、约300μg/mL至约360μg/mL、约300μg/mL至约340μg/mL、约300μg/mL至约320μg/mL、约320μg/mL至约500μg/mL、约320μg/mL至约480μg/mL、约320μg/mL至约460μg/mL、约320μg/mL至约440μg/mL、约320μg/mL至约420μg/mL、约320μg/mL至约400μg/mL、约320μg/mL至约380μg/mL、约320μg/mL至约360μg/mL、约320μg/mL至约340μg/mL、约340μg/mL至约500μg/mL、约340μg/mL至约480μg/mL、约340μg/mL至约460μg/mL、约340μg/mL至约440μg/mL、约340μg/mL至约420μg/mL、约340μg/mL至约400μg/mL、约340μg/mL至约380μg/mL、约340μg/mL至约360μg/mL、约360μg/mL至约500μg/mL、约360μg/mL至约480μg/mL、约360μg/mL至约460μg/mL、约360μg/mL至约440μg/mL、约360μg/mL至约420μg/mL、约360μg/mL至约400μg/mL、约360μg/mL至约380μg/mL、约380μg/mL至约500μg/mL、约380μg/mL至约480μg/mL、约380μg/mL至约460μg/mL、约380μg/mL至约440μg/mL、约380μg/mL至约420μg/mL、约380μg/mL至约400μg/mL、约400μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约480μg/mL、约400μg/mL至约460μg/mL、约400μg/mL至约440μg/mL、约400μg/mL至约420μg/mL、约420μg/mL至约500μg/mL、约420μg/mL至约480μg/mL、约420μg/mL至约460μg/mL、约420μg/mL至约440μg/mL、约440μg/mL至约500μg/mL、约440μg/mL至约480μg/mL、约440μg/mL至约460μg/mL、约460μg/mL至约500μg/mL、约460μg/mL至约480μg/mL，或约480μg/mL至约500μg/mL的转铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全转铁蛋白或其组合)。
在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL，或约180ng/mL至约200ng/mL的IL-3(例如，人IL-3)。
在一些实施方案中，第二培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约950ng/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约850ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约750ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约650ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约550ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约950ng/mL、约10ng/mL至约900ng/mL、约10ng/mL至约850ng/mL、约10ng/mL至约800ng/mL、约10ng/mL至约750ng/mL、约10ng/mL至约700ng/mL、约10ng/mL至约650ng/mL、约10ng/mL至约600ng/mL、约10ng/mL至约550ng/mL、约10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约450ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约350ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约250ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约950ng/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约850ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约750ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约650ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约550ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约1μg/mL、约40ng/mL至约950ng/mL、约40ng/mL至约900ng/mL、约40ng/mL至约850ng/mL、约40ng/mL至约800ng/mL、约40ng/mL至约750ng/mL、约40ng/mL至约700ng/mL、约40ng/mL至约650ng/mL、约40ng/mL至约600ng/mL、约40ng/mL至约550ng/mL、约40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约450ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约350ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约250ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约1μg/mL、约60ng/mL至约950ng/mL、约60ng/mL至约900ng/mL、约60ng/mL至约850ng/mL、约60ng/mL至约800ng/mL、约60ng/mL至约750ng/mL、约60ng/mL至约700ng/mL、约60ng/mL至约650ng/mL、约60ng/mL至约600ng/mL、约60ng/mL至约550ng/mL、约60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约450ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约350ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约250ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约1μg/mL、约80ng/mL至约950ng/mL、约80ng/mL至约900ng/mL、约80ng/mL至约850ng/mL、约80ng/mL至约800ng/mL、约80ng/mL至约750ng/mL、约80ng/mL至约700ng/mL、约80ng/mL至约650ng/mL、约80ng/mL至约600ng/mL、约80ng/mL至约550ng/mL、约80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约450ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约350ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约250ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约950ng/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约850ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约750ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约650ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约550ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约950ng/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约850ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约750ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约650ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约550ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约950ng/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约850ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约750ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约650ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约550ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约950ng/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约850ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约750ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约650ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约550ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约950ng/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约850ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约750ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约650ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约550ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约950ng/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约850ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约750ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约650ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约550ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约950ng/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约850ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约750ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约650ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约550ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约950ng/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约850ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约750ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约650ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约550ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约950ng/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约850ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约750ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约650ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约500ng/mL至约550ng/mL、约550ng/mL至约1μg/mL、约550ng/mL至约950ng/mL、约550ng/mL至约900ng/mL、约550ng/mL至约850ng/mL、约550ng/mL至约800ng/mL、约550ng/mL至约750ng/mL、约550ng/mL至约700ng/mL、约550ng/mL至约650ng/mL、约550ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约950ng/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约850ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约750ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约600ng/mL至约650ng/mL、约650ng/mL至约1μg/mL、约650ng/mL至约950ng/mL、约650ng/mL至约900ng/mL、约650ng/mL至约850ng/mL、约650ng/mL至约800ng/mL、约650ng/mL至约750ng/mL、约650ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约950ng/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约850ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约700ng/mL至约750ng/mL、约750ng/mL至约1μg/mL、约750ng/mL至约950ng/mL、约750ng/mL至约900ng/mL、约750ng/mL至约850ng/mL、约750ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约950ng/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约800ng/mL至约850ng/mL、约850ng/mL至约1μg/mL、约850ng/mL至约950ng/mL、约850ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL、约900ng/mL至约950ng/mL、约950ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，人干细胞因子)。
在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1nM至约200nM、约0.1nM至约180nM、约0.1nM至约160nM、约0.1nM至约140nM、约0.1nM至约120nM、约0.1nM至约100nM、约0.1nM至约80nM、约0.1nM至约60nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约40nM、约0.1nM至约30nM、约0.1nM至约25nM、约0.1nM至约20nM、约0.1nM至约15nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约5nM、约0.1nM至约2nM、约0.1nM至约1nM、约1nM至约200nM、约1nM至约180nM、约1nM至约160nM、约1nM至约140nM、约1nM至约120nM、约1nM至约100nM、约1nM至约80nM、约1nM至约60nM、约1nM至约50nM、约1nM至约40nM、约1nM至约30nM、约1nM至约25nM、约1nM至约20nM、约1nM至约15nM、约1nM至约10nM、约1nM至约5nM、约1nM至约2nM、约2nM至约200nM、约2nM至约180nM、约2nM至约160nM、约2nM至约140nM、约2nM至约120nM、约2nM至约100nM、约2nM至约80nM、约2nM至约60nM、约2nM至约50nM、约2nM至约40nM、约2nM至约30nM、约2nM至约25nM、约2nM至约20nM、约2nM至约15nM、约2nM至约10nM、约2nM至约5nM、约5nM至约200nM、约5nM至约180nM、约5nM至约160nM、约5nM至约140nM、约5nM至约120nM、约5nM至约100nM、约5nM至约80nM、约5nM至约60nM、约5nM至约50nM、约5nM至约40nM、约5nM至约30nM、约5nM至约25nM、约5nM至约20nM、约5nM至约15nM、约5nM至约10nM、约10nM至约200nM、约10nM至约180nM、约10nM至约160nM、约10nM至约140nM、约10nM至约120nM、约10nM至约100nM、约10nM至约80nM、约10nM至约60nM、约10nM至约50nM、约10nM至约40nM、约10nM至约30nM、约10nM至约25nM、约10nM至约20nM、约10nM至约15nM、约15nM至约200nM、约15nM至约180nM、约15nM至约160nM、约15nM至约140nM、约15nM至约120nM、约15nM至约100nM、约15nM至约80nM、约15nM至约60nM、约15nM至约50nM、约15nM至约40nM、约15nM至约30nM、约15nM至约25nM、约15nM至约20nM、约20nM至约200nM、约20nM至约180nM、约20nM至约160nM、约20nM至约140nM、约20nM至约120nM、约20nM至约100nM、约20nM至约80nM、约20nM至约60nM、约20nM至约50nM、约20nM至约40nM、约20nM至约30nM、约20nM至约25nM、约25nM至约200nM、约25nM至约180nM、约25nM至约160nM、约25nM至约140nM、约25nM至约120nM、约25nM至约100nM、约25nM至约80nM、约25nM至约60nM、约25nM至约50nM、约25nM至约40nM、约25nM至约30nM、约30nM至约200nM、约30nM至约180nM、约30nM至约160nM、约30nM至约140nM、约30nM至约120nM、约30nM至约100nM、约30nM至约80nM、约30nM至约60nM、约30nM至约50nM、约30nM至约40nM、约40nM至约200nM、约40nM至约180nM、约40nM至约160nM、约40nM至约140nM、约40nM至约120nM、约40nM至约100nM、约40nM至约80nM、约40nM至约60nM、约40nM至约50nM、约50nM至约200nM、约50nM至约180nM、约50nM至约160nM、约50nM至约140nM、约50nM至约120nM、约50nM至约100nM、约50nM至约80nM、约50nM至约60nM、约60nM至约200nM、约60nM至约180nM、约60nM至约160nM、约60nM至约140nM、约60nM至约120nM、约60nM至约100nM、约60nM至约80nM、约80nM至约200nM、约80nM至约180nM、约80nM至约160nM、约80nM至约140nM、约80nM至约120nM、约80nM至约100nM、约100nM至约200nM、约100nM至约180nM、约100nM至约160nM、约100nM至约140nM、约100nM至约120nM、约120nM至约200nM、约120nM至约180nM、约120nM至约160nM、约120nM至约140nM、约140nM至约200nM、约140nM至约180nM、约140nM至约160nM、约160nM至约200nM、约160nM至约180nM，或约180nM至约200nM的地塞米松。
在一些实施方案中，第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL、30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL,180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL、220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL、240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL、260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL，或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽。EPO模拟肽的非限制性示例包括，例如EPO模拟肽(EMP1；GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSEQ ID NO:1)或其使用确定的化学连接子或更大的聚合PEG接头的肽二聚体(诸如描述于Johnson and Jolliffe,Nephrology Dialysis Transplantation 15(9):1274-1277,2000中的那些)、ERB1–7(诸如描述于McConnell et al.,Biol.Chem.379(10):1279-86,1998中的那些)、EPO-R衍生肽(ERP)(诸如描述于Naranda et al.,PNAS96(13):7569-7574,1999中的那些)、EMP20(YSCHFGPLTWVCK(SEQ ID NO:2))描述于Johnson et al.,Biochemistry 37(11):3699-3710,1998,AGEM400(羟乙基淀粉)，和pegolsihematide(诸如描述于Gupta andWish,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.27(5):345-350,2018中的那些)。EPO模拟肽的其他实例在本领域已知。
在一些实施方案中，第二培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL，或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括约1μg/mL至约10μg/mL(或本文所述的这个范围的任何子范围)脂质(例如，脂质混合物)。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1mM至约10mM(或本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括0.1％w/v至约4％w/v(或本文所述的这个范围的任何子范围)人血清白蛋白。在本文所述的任何第二培养基的一些实施方案中，第二培养基包括约0.1％w/v至约3％w/v(或本文所述的这个范围的任何子范围)泊洛沙姆-188(P188)。
在一些实例中，第二培养基可以是，例如化学成分确定的液体培养基、无动物成分的液体培养基、或化学成分确定的无动物成分的液体培养基，和/或无血清的液体培养基。
步骤A之前任选的培养步骤
本文所述的任何方法的一些实施方案可以进一步包括，在步骤(a)之前，(i)将复数红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)布置于在包含在器皿(例如，生物反应器、摇管或摇瓶，例如，本文所述的任何示例性生物反应器、摇管或摇瓶)内的第一培养基中，以提供第一细胞培养物(例如，具有约0.1x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL(例如，约0.1x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约3x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL,0.1x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约0.1x105个细胞/mL至约0.5x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约3x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL,0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约3x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL,1x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约3x105个细胞/mL、约1.5x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约3x105个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约3x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约5x105个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约5x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约2x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL至约4x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL至约3x106个细胞/mL、约3x106个细胞/mL至约5x106个细胞/mL、约3x106个细胞/mL至约4x106个细胞/mL，或约4x106个细胞/mL至约5x106个细胞/mL)的初始细胞密度)；和(ii)培养(例如，分批、补料分批或灌注培养)第一细胞培养物约1天至约15天(例如，约1天至约14天、约1天至约13天、约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约15天、约2天至约14天、约2天至约13天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约15天、约3天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约15天、约4天至约14天、约4天至约13天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天，或约14天至约15天)。
在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)布置到包含在摇瓶(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)内的第一培养基中。在此类实施方案中，步骤(ii)包括在摇瓶中以0.1xg至约50xg(或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第一细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)布置到包含在摇管(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇管)内的第一培养基中。在此类实施方案中，步骤(ii)包括在摇管中以约0.1xg至约50xg(或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第一细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(i)包括将多个红系祖细胞(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性红系祖细胞)布置到具有本文所述任何示例性体积的本文所述的培养袋中)。在此类实施方案中，步骤(ii)包括在培养袋中以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期(或本文所述的这个范围的任何子范围)的摇摆速率温育第一细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(ii)包括分批培养第一细胞培养物。
补料分批培养
在一些实施方案中，步骤(ii)包括补料分批培养第一细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(ii)中的补料分批培养包括随时间添加额外体积的第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基)。在一些实例中，将额外体积的第一培养基随时间连续添加至第一细胞培养物。在一些实例中，将额外体积的第一培养基随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次或一天十二次)添加至第一个细胞培养。在一些实施方案中，在每个24小时增量中，步骤(i)后立即添加约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x，或约9.5x至约10x的体积的第一细胞培养物。在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到靶特定细胞密度，例如约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始添加额外体积的第一培养基至第一细胞培养物。
灌注培养
在一些实施方案中，步骤(ii)包括灌注培养第一细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(ii)包括用约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动第一细胞培养物(例如，在具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何生物反应器中)(例如，约10W/m3至约180W/m3、约10W/m3至约160W/m3、约10W/m3至约140W/m3、约10W/m3至约120W/m3、约10W/m3至约100W/m3、约10W/m3至约80W/m3、约10W/m3至约60W/m3、约10W/m3至约40W/m3、约10W/m3至约35W/m3、约10W/m3至约30W/m3、约10W/m3至约25W/m3、约10W/m3至约20W/m3、约10W/m3至约15W/m3、约15W/m3至约200W/m3、约15W/m3至约180W/m3、约15W/m3至约160W/m3、约15W/m3至约140W/m3、约15W/m3至约120W/m3、约15W/m3至约100W/m3、约15W/m3至约80W/m3、约15W/m3至约60W/m3、约15W/m3至约40W/m3、约15W/m3至约35W/m3、约15W/m3至约30W/m3、约15W/m3至约25W/m3、约15W/m3至约20W/m3、约20W/m3至约200W/m3、约20W/m3至约180W/m3、约20W/m3至约160W/m3、约20W/m3至约140W/m3、约20W/m3至约120W/m3、约20W/m3至约100W/m3、约20W/m3至约80W/m3、约20W/m3至约60W/m3、约20W/m3至约40W/m3、约20W/m3至约35W/m3、约20W/m3至约30W/m3、约20W/m3至约25W/m3、约25W/m3至约200W/m3、约25W/m3至约180W/m3、约25W/m3至约160W/m3、约25W/m3至约140W/m3、约25W/m3至约120W/m3、约25W/m3至约100W/m3、约25W/m3至约80W/m3、约25W/m3至约60W/m3、约25W/m3至约40W/m3、约25W/m3至约35W/m3、约25W/m3至约30W/m3、约30W/m3至约200W/m3、约30W/m3至约180W/m3、约30W/m3至约160W/m3、约30W/m3至约140W/m3、约30W/m3至约120W/m3、约30W/m3至约100W/m3、约30W/m3至约80W/m3、约30W/m3至约60W/m3、约30W/m3至约40W/m3、约30W/m3至约35W/m3、约35W/m3至约200W/m3、约35W/m3至约180W/m3、约35W/m3至约160W/m3、约35W/m3至约140W/m3、约35W/m3至约120W/m3、约35W/m3至约100W/m3、约35W/m3至约80W/m3、约35W/m3至约60W/m3、约35W/m3至约40W/m3、约40W/m3至约200W/m3、约40W/m3至约180W/m3、约40W/m3至约160W/m3、约40W/m3至约140W/m3、约40W/m3至约120W/m3、约40W/m3至约100W/m3、约40W/m3至约80W/m3、约40W/m3至约60W/m3、约60W/m3至约200W/m3、约60W/m3至约180W/m3、约60W/m3至约160W/m3、约60W/m3至约140W/m3、约60W/m3至约120W/m3、约60W/m3至约100W/m3、约60W/m3至约80W/m3、约80W/m3至约200W/m3、约80W/m3至约180W/m3、约80W/m3至约160W/m3、约80W/m3至约140W/m3、约80W/m3至约120W/m3、约80W/m3至约100W/m3、约100W/m3至约200W/m3、约100W/m3至约180W/m3、约100W/m3至约160W/m3、约100W/m3至约140W/m3、约100W/m3至约120W/m3、约120W/m3至约200W/m3、约120W/m3至约180W/m3、约120W/m3至约160W/m3、约120W/m3至约140W/m3、约140W/m3至约200W/m3、约140W/m3至约180W/m3、约140W/m3至约160W/m3、约160W/m3至约200W/m3、约160W/m3至约180W/m3，和约180W/m3至约200W/m3)。
在一些实施方案中，步骤(ii)中的灌注培养可以使用以下的灌注速率进行：约0.04nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.04nL/细胞/天至约0.1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约55nL/细胞/天，或约55nL/细胞/天至约60nL/细胞/天。在一些实施方案中，灌注速率随时间增加。
在一些实施例中，步骤(ii)中的灌注培养可以使用约0.1器皿体积每天(VVD)至约3VVD(例如约0.1VVD至约2.8VVD、约0.1VVD至约2.6VVD、约0.1VVD至约2.4VVD、约0.1VVD至约2.2VVD、约0.1VVD至约2.0VVD、约0.1VVD至约1.8VVD、约0.1VVD至约1.6VVD、约0.1VVD至约1.4VVD、约0.1VVD至约1.2VVD、约0.1VVD至约1.0VVD、约0.1VVD至约0.8VVD、约0.1VVD至约0.6VVD、约0.1VVD至约0.4VVD、约0.1VVD至约0.2VVD、约0.2VVD至约3VVD、约0.2VVD至约2.8VVD、约0.2VVD至约2.6VVD、约0.2VVD至约2.4VVD、约0.2VVD至约2.2VVD、约0.2VVD至约2.0VVD、约0.2VVD至约1.8VVD、约0.2VVD至约1.6VVD、约0.2VVD至约1.4VVD、约0.2VVD至约1.2VVD、约0.2VVD至约1.0VVD、约0.2VVD至约0.8VVD、约0.2VVD至约0.6VVD、约0.2VVD至约0.4VVD、约0.4VVD至约3VVD、约0.4VVD至约2.8VVD、约0.4VVD至约2.6VVD、约0.4VVD至约2.4VVD、约0.4VVD至约2.2VVD、约0.4VVD至约2.0VVD、约0.4VVD至约1.8VVD、约0.4VVD至约1.6VVD、约0.4VVD至约1.4VVD、约0.4VVD至约1.2VVD、约0.4VVD至约1.0VVD、约0.4VVD至约0.8VVD、约0.4VVD至约0.6VVD、约0.6VVD至约3VVD、约0.6VVD至约2.8VVD、约0.6VVD至约2.6VVD、约0.6VVD至约2.4VVD、约0.6VVD至约2.2VVD、约0.6VVD至约2.0VVD、约0.6VVD至约1.8VVD、约0.6VVD至约1.6VVD、约0.6VVD至约1.4VVD、约0.6VVD至约1.2VVD、约0.6VVD至约1.0VVD、约0.6VVD至约0.8VVD、约0.8VVD至约3VVD、约0.8VVD至约2.8VVD、约0.8VVD至约2.6VVD、约0.8VVD至约2.4VVD、约0.8VVD至约2.2VVD、约0.8VVD至约2.0VVD、约0.8VVD至约1.8VVD、约0.8VVD至约1.6VVD、约0.8VVD至约1.4VVD、约0.8VVD至约1.2VVD、约0.8VVD至约1.0VVD、约1.0VVD至约3VVD、约1.0VVD至约2.8VVD、约1.0VVD至约2.6VVD、约1.0VVD至约2.4VVD、约1.0VVD至约2.2VVD、约1.0VVD至约2.0VVD、约1.0VVD至约1.8VVD、约1.0VVD至约1.6VVD、约1.0VVD至约1.4VVD、约1.0VVD至约1.2VVD、约1.2VVD至约3VVD、约1.2VVD至约2.8VVD、约1.2VVD至约2.6VVD、约1.2VVD至约2.4VVD、约1.2VVD至约2.2VVD、约1.2VVD至约2.0VVD、约1.2VVD至约1.8VVD、约1.2VVD至约1.6VVD、约1.2VVD至约1.4VVD、约1.4VVD至约3VVD、约1.4VVD至约2.8VVD、约1.4VVD至约2.6VVD、约1.4VVD至约2.4VVD、约1.4VVD至约2.2VVD、约1.4VVD至约2.0VVD、约1.4VVD至约1.8VVD、约1.4VVD至约1.6VVD、约1.6VVD至约3VVD、约1.6VVD至约2.8VVD、约1.6VVD至约2.6VVD、约1.6VVD至约2.4VVD、约1.6VVD至约2.2VVD、约1.6VVD至约2.0VVD、约1.6VVD至约1.8VVD、约1.8VVD至约3VVD、约1.8VVD至约2.8VVD、约1.8VVD至约2.6VVD、约1.8VVD至约2.4VVD、约1.8VVD至约2.2VVD、约1.8VVD至约2.0VVD、约2.0VVD至约3VVD、约2.0VVD至约2.8VVD、约2.0VVD至约2.6VVD、约2.0VVD至约2.4VVD、约2.0VVD至约2.2VVD、约2.2VVD至约3VVD、约2.2VVD至约2.8VVD、约2.2VVD至约2.6VVD、约2.2VVD至约2.4VVD、约2.4VVD至约3VVD、约2.4VVD至约2.8VVD、约2.4VVD至约2.6VVD、约2.6VVD至约3VVD、约2.6VVD至约2.8VVD，或约2.8VVD至约3VVD)的灌注速率进行。
在一些实例中，步骤(ii)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间添加额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))至第一细胞培养物。在一些实例中，将额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))随时间连续添加至第一细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的培养基(例如，第一培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基))随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次，一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第一细胞培养物。培养基(例如，本文所述的任何示例性第一培养基)的添加可以机械地，例如使用蠕动泵或灌注泵进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。
在一些实例中，步骤(ii)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间除去一定体积的培养基(例如，基本上无细胞的培养基)。在一些实例中，随时间连续除去培养基(例如，基本上无细胞的培养基)。在一些实施方案中，随时间定期除去培养基(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次，一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)。培养基(例如，基本上无细胞的培养基)的除去可以机械地，例如使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的其他非限制性方面。在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如，切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如，切向流过滤或交替切向过滤)包括使用一种或多种具有以下平均孔径的过滤器：约10nm至约6.0μm、约10nm至约5.5μm、约10nm至约5.0μm、约10nm至约4.5μm、约10nm至约4.0μm、约10nm至约3.5μm、约10nm至约3.0μm、约10nm至约2.5μm、约10nm至约2.0μm、约10nm至约1.5μm、约10nm至约1.0μm、约10nm至约0.5μm、约10nm至约0.2μm、10nm至约0.1μm、约10nm至约50nm、约50nm至约6.0μm、约50nm至约5.5μm、约50nm至约5.0μm、约50nm至约4.5μm、约50nm至约4.0μm、约50nm至约3.5μm、约50nm至约3.0μm、约50nm至约2.5μm、约50nm至约2.0μm、约50nm至约1.5μm、约50nm至约1.0μm、约50nm至约0.5μm、约50nm至约0.2μm、约50nm至约0.1μm、约0.1μm至约6.0μm、约0.1μm至约5.5μm、约0.1μm至约5.0μm、约0.1μm至约4.5μm、约0.1μm至约4.0μm、约0.1μm至约3.5μm、约0.1μm至约3.0μm、约0.1μm至约2.5μm、约0.1μm至约2.0μm、约0.1μm至约1.5μm、约0.1μm至约1.0μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约0.2μm、约0.2μm至约6.0μm、约0.2μm至约5.5μm、约0.2μm至约5.0μm、约0.2μm至约4.5μm、约0.2μm至约4.0μm、约0.2μm至约3.5μm、约0.2μm至约3.0μm、约0.2μm至约2.5μm、约0.2μm至约2.0μm、约0.2μm至约1.5μm、约0.2μm至约1.0μm、约0.2μm至约0.5μm、约0.5μm至约6.0μm、约0.5μm至约5.5μm、约0.5μm至约5.0μm、约0.5μm至约4.5μm、约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约3.5μm、约0.5μm至约3.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.5μm至约2.0μm、约0.5μm至约1.5μm、约0.5μm至约1.0μm、约1.0μm至约6.0μm、约1.0μm至约5.5μm、约1.0μm至约5.0μm、约1.0μm至约4.5μm、约1.0μm至约4.0μm、约1.0μm至约3.5μm、约1.0μm至约3.0μm、约1.0μm至约2.5μm、约1.0μm至约2.0μm、约1.0μm至约1.5μm、约1.5μm至约6.0μm、约1.5μm至约5.5μm、约1.5μm至约5.0μm、约1.5μm至约4.5μm、约1.5μm至约4.0μm、约1.5μm至约3.5μm、约1.5μm至约3.0μm、约1.5μm至约2.5μm、约1.5μm至约2.0μm、约2.0μm至约6.0μm、约2.0μm至约5.5μm、约2.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约4.5μm、约2.0μm至约4.0μm、约2.0μm至约3.5μm、约2.0μm至约3.0μm、约2.0μm至约2.5μm、约2.5μm至约6.0μm、约2.5μm至约5.5μm、约2.5μm至约5.0μm、约2.5μm至约4.5μm、约2.5μm至约4.0μm、约2.5μm至约3.5μm、约2.5μm至约3.0μm、约3.0μm至约6.0μm、约3.0μm至约5.5μm、约3.0μm至约5.0μm、约3.0μm至约4.5μm、约3.0μm至约4.0μm、约3.0μm至约3.5μm、约3.5μm至约6.0μm、约3.5μm至约5.5μm、约3.5μm至约5.0μm、约3.5μm至约4.5μm、约3.5μm至约4.0μm、约4.0μm至约6.0μm、约4.0μm至约5.5μm、约4.0μm至约5.0μm、约4.0μm至约4.5μm、约4.5μm至约6.0μM、约4.5μm至约5.5μm、约4.5μm至约5.0μm、约5.0μm至约6.0μm、约5.0μm至约5.5μm，或约5.5μm至约6.0μm。
在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定的靶细胞密度，例如，约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始灌注第一细胞培养物。
在一些实施方案中，第一培养基包括以下的一种或多种(例如一种、两种、三种或四种)：Flt-3配体(例如，0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体或本文所述的这个范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mL SCF或本文所述的这个范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3或本文所述的这个范围的任何子范围)和IL-6(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6或本文所述的这个范围的任何子范围)。在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包括CellGenix SCGM培养基。在任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包括约0.1mM至约10mM(例如，约0.1mM至约9.5mM、约0.1mM至约9.0mM、约0.1mM至约8.5mM、约0.1mM至约8.0mM、约0.1mM至约7.5mM、约0.1mM至约7.0mM、约0.1mM至约6.5mM、约0.1mM至约6.0mM、约0.1mM至约5.5mM、约0.1mM至约5mM、约0.1mM至约4.5mM、约0.1mM至约4.0mM、约0.1mM至约3.5mM、约0.1mM至约3.0mM、约0.1mM至约2.5mM、约0.1mM至约2.0mM、约0.1mM至约1.5mM、约0.1mM至约1.0mM、约0.1mM至约0.5mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约9.5mM、约0.5mM至约9.0mM、约0.5mM至约8.5mM、约0.5mM至约8.0mM、约0.5mM至约7.5mM、约0.5mM至约7.0mM、约0.5mM至约6.5mM、约0.5mM至约6.0mM、约0.5mM至约5.5mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约4.5mM、约0.5mM至约4.0mM、约0.5mM至约3.5mM、约0.5mM至约3.0mM、约0.5mM至约2.5mM、约0.5mM至约2.0mM、约0.5mM至约1.5mM、约0.5mM至约1.0mM、约1.0mM至约10mM、约1.0mM至约9.5mM、约1.0mM至约9.0mM、约1.0mM至约8.5mM、约1.0mM至约8.0mM、约1.0mM至约7.5mM、约1.0mM至约7.0mM、约1.0mM至约6.5mM、约1.0mM至约6.0mM、约1.0mM至约5.5mM、约1.0mM至约5mM、约1.0mM至约4.5mM、约1.0mM至约4.0mM、约1.0mM至约3.5mM、约1.0mM至约3.0mM、约1.0mM至约2.5mM、约1.0mM至约2.0mM、约1.0mM至约1.5mM、约1.5mM至约10mM、约1.5mM至约9.5mM、约1.5mM至约9.0mM、约1.5mM至约8.5mM、约1.5mM至约8.0mM、约1.5mM至约7.5mM、约1.5mM至约7.0mM、约1.5mM至约6.5mM、约1.5mM至约6.0mM、约1.5mM至约5.5mM、约1.5mM至约5mM、约1.5mM至约4.5mM、约1.5mM至约4.0mM、约1.5mM至约3.5mM、约1.5mM至约3.0mM、约1.5mM至约2.5mM、约1.5mM至约2.0mM、约2.0mM至约10mM、约2.0mM至约9.5mM、约2.0mM至约9.0mM、约2.0mM至约8.5mM、约2.0mM至约8.0mM、约2.0mM至约7.5mM、约2.0mM至约7.0mM、约2.0mM至约6.5mM、约2.0mM至约6.0mM、约2.0mM至约5.5mM、约2.0mM至约5mM、约2.0mM至约4.5mM、约2.0mM至约4.0mM、约2.0mM至约3.5mM、约2.0mM至约3.0mM、约2.0mM至约2.5mM、约2.5mM至约10mM、约2.5mM至约9.5mM、约2.5mM至约9.0mM、约2.5mM至约8.5mM、约2.5mM至约8.0mM、约2.5mM至约7.5mM、约2.5mM至约7.0mM、约2.5mM至约6.5mM、约2.5mM至约6.0mM、约2.5mM至约5.5mM、约2.5mM至约5mM、约2.5mM至约4.5mM、约2.5mM至约4.0mM、约2.5mM至约3.5mM、约2.5mM至约3.0mM、约3.0mM至约10mM、约3.0mM至约9.5mM、约3.0mM至约9.0mM、约3.0mM至约8.5mM、约3.0mM至约8.0mM、约3.0mM至约7.5mM、约3.0mM至约7.0mM、约3.0mM至约6.5mM、约3.0mM至约6.0mM、约3.0mM至约5.5mM、约3.0mM至约5mM、约3.0mM至约4.5mM、约3.0mM至约4.0mM、约3.0mM至约3.5mM、约3.5mM至约10mM、约3.5mM至约9.5mM、约3.5mM至约9.0mM、约3.5mM至约8.5mM、约3.5mM至约8.0mM、约3.5mM至约7.5mM、约3.5mM至约7.0mM、约3.5mM至约6.5mM、约3.5mM至约6.0mM、约3.5mM至约5.5mM、约3.5mM至约5mM、约3.5mM至约4.5mM、约3.5mM至约4.0mM、约4.0mM至约10mM、约4.0mM至约9.5mM、约4.0mM至约9.0mM、约4.0mM至约8.5mM、约4.0mM至约8.0mM、约4.0mM至约7.5mM、约4.0mM至约7.0mM、约4.0mM至约6.5mM、约4.0mM至约6.0mM、约4.0mM至约5.5mM、约4.0mM至约5mM、约4.0mM至约4.5mM、约4.5mM至约10mM、约4.5mM至约9.5mM、约4.5mM至约9.0mM、约4.5mM至约8.5mM、约4.5mM至约8.0mM、约4.5mM至约7.5mM、约4.5mM至约7.0mM、约4.5mM至约6.5mM、约4.5mM至约6.0mM、约4.5mM至约5.5mM、约4.5mM至约5.0mM、约5.0mM至约10mM、约5.0mM至约9.5mM、约5.0mM至约9.0mM、约5.0mM至约8.5mM、约5.0mM至约8.0mM、约5.0mM至约7.5mM、约5.0mM至约7.0mM、约5.0mM至约6.5mM、约5.0mM至约6.0mM、约5.0mM至约5.5mM、约5.5mM至约10mM、约5.5mM至约9.5mM、约5.5mM至约9.0mM、约5.5mM至约8.5mM、约5.5mM至约8.0mM、约5.5mM至约7.5mM、约5.5mM至约7.0mM、约5.5mM至约6.5mM、约5.5mM至约6.0mM、约6.0mM至约10mM、约6.0mM至约9.5mM、约6.0mM至约9.0mM、约6.0mM至约8.5mM、约6.0mM至约8.0mM、约6.0mM至约7.5mM、约6.0mM至约7.0mM、约6.0mM至约6.5mM、约6.5mM至约10mM、约6.5mM至约9.5mM、约6.5mM至约9.0mM、约6.5mM至约8.5mM、约6.5mM至约8.0mM、约6.5mM至约7.5mM、约6.5mM至约7.0mM、约7.0mM至约10mM、约7.0mM至约9.5mM、约7.0mM至约9.0mM、约7.0mM至约8.5mM、约7.0mM至约8.0mM、约7.0mM至约7.5mM、约7.5mM至约10mM、约7.5mM至约9.5mM、约7.5mM至约9.0mM、约7.5mM至约8.5mM、约7.5mM至约8.0mM、约8.0mM至约10mM、约8.0mM至约9.5mM、约8.0mM至约9.0mM、约8.0mM至约8.5mM、约8.5mM至约10mM、约8.5mM至约9.5mM、约8.5mM至约9.0mM、约9.0mM至约10mM、约9.0mM至约9.5mM，或约9.5mM至约10mM)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包括约1μg/mL至约20μg/mL(例如，约1μg/mL至约19μg/mL、约1μg/mL至约18μg/mL、约1μg/mL至约17μg/mL、约1μg/mL至约16μg/mL、约1μg/mL至约15μg/mL、约1μg/mL至约14μg/mL、约1μg/mL至约13μg/mL、约1μg/mL至约12μg/mL、约1μg/mL至约11μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约9μg/mL、约1μg/mL至约8μg/mL、约1μg/mL至约7μg/mL、约1μg/mL至约6μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约4μg/mL、约1μg/mL至约3μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL至约19μg/mL、约2μg/mL至约18μg/mL、约2μg/mL至约17μg/mL、约2μg/mL至约16μg/mL、约2μg/mL至约15μg/mL、约2μg/mL至约14μg/mL、约2μg/mL至约13μg/mL、约2μg/mL至约12μg/mL、约2μg/mL至约11μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约9μg/mL、约2μg/mL至约8μg/mL、约2μg/mL至约7μg/mL、约2μg/mL至约6μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约2μg/mL至约4μg/mL、约2μg/mL至约3μg/mL、约3μg/mL至约20μg/mL、约3μg/mL至约19μg/mL、约3μg/mL至约18μg/mL、约3μg/mL至约17μg/mL、约3μg/mL至约16μg/mL、约3μg/mL至约15μg/mL、约3μg/mL至约14μg/mL、约3μg/mL至约13μg/mL、约3μg/mL至约12μg/mL、约3μg/mL至约11μg/mL、约3μg/mL至约10μg/mL、约3μg/mL至约9μg/mL、约3μg/mL至约8μg/mL、约3μg/mL至约7μg/mL、约3μg/mL至约6μg/mL、约3μg/mL至约5μg/mL、约3μg/mL至约4μg/mL、约4μg/mL至约20μg/mL、约4μg/mL至约19μg/mL、约4μg/mL至约18μg/mL、约4μg/mL至约17μg/mL、约4μg/mL至约16μg/mL、约4μg/mL至约15μg/mL、约4μg/mL至约14μg/mL、约4μg/mL至约13μg/mL、约4μg/mL至约12μg/mL、约4μg/mL至约11μg/mL、约4μg/mL至约10μg/mL、约4μg/mL至约9μg/mL、约4μg/mL至约8μg/mL、约4μg/mL至约7μg/mL、约4μg/mL至约6μg/mL、约4μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约19μg/mL、约5μg/mL至约18μg/mL、约5μg/mL至约17μg/mL、约5μg/mL至约16μg/mL、约5μg/mL至约15μg/mL、约5μg/mL至约14μg/mL、约5μg/mL至约13μg/mL、约5μg/mL至约12μg/mL、约5μg/mL至约11μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约5μg/mL至约9μg/mL、约5μg/mL至约8μg/mL、约5μg/mL至约7μg/mL、约5μg/mL至约6μg/mL、约6μg/mL至约20μg/mL、约6μg/mL至约19μg/mL、约6μg/mL至约18μg/mL、约6μg/mL至约17μg/mL、约6μg/mL至约16μg/mL、约6μg/mL至约15μg/mL、约6μg/mL至约14μg/mL、约6μg/mL至约13μg/mL、约6μg/mL至约12μg/mL、约6μg/mL至约11μg/mL、约6μg/mL至约10μg/mL、约6μg/mL至约9μg/mL、约6μg/mL至约8μg/mL、约6μg/mL至约7μg/mL、约7μg/mL至约20μg/mL、约7μg/mL至约19μg/mL、约7μg/mL至约18μg/mL、约7μg/mL至约17μg/mL、约7μg/mL至约16μg/mL、约7μg/mL至约15μg/mL、约7μg/mL至约14μg/mL、约7μg/mL至约13μg/mL、约7μg/mL至约12μg/mL、约7μg/mL至约11μg/mL、约7μg/mL至约10μg/mL、约7μg/mL至约9μg/mL、约7μg/mL至约8μg/mL、约8μg/mL至约20μg/mL、约8μg/mL至约19μg/mL、约8μg/mL至约18μg/mL、约8μg/mL至约17μg/mL、约8μg/mL至约16μg/mL、约8μg/mL至约15μg/mL、约8μg/mL至约14μg/mL、约8μg/mL至约13μg/mL、约8μg/mL至约12μg/mL、约8μg/mL至约11μg/mL、约8μg/mL至约10μg/mL、约8μg/mL至约9μg/mL、约9μg/mL至约20μg/mL、约9μg/mL至约19μg/mL、约9μg/mL至约18μg/mL、约9μg/mL至约17μg/mL、约9μg/mL至约16μg/mL、约9μg/mL至约15μg/mL、约9μg/mL至约14μg/mL、约9μg/mL至约13μg/mL、约9μg/mL至约12μg/mL、约9μg/mL至约11μg/mL、约9μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL至约19μg/mL、约10μg/mL至约18μg/mL、约10μg/mL至约17μg/mL、约10μg/mL至约16μg/mL、约10μg/mL至约15μg/mL、约10μg/mL至约14μg/mL、约10μg/mL至约13μg/mL、约10μg/mL至约12μg/mL、约10μg/mL至约11μg/mL、约11μg/mL至约20μg/mL、约11μg/mL至约19μg/mL、约11μg/mL至约18μg/mL、约11μg/mL至约17μg/mL、约11μg/mL至约16μg/mL、约11μg/mL至约15μg/mL、约11μg/mL至约14μg/mL、约11μg/mL至约13μg/mL、约11μg/mL至约12μg/mL、12μg/mL至约20μg/mL、约12μg/mL至约19μg/mL、约12μg/mL至约18μg/mL、约12μg/mL至约17μg/mL、约12μg/mL至约16μg/mL、约12μg/mL至约15μg/mL、约12μg/mL至约14μg/mL、约12μg/mL至约13μg/mL、13μg/mL至约20μg/mL、约13μg/mL至约19μg/mL、约13μg/mL至约18μg/mL、约13μg/mL至约17μg/mL、约13μg/mL至约16μg/mL、约13μg/mL至约15μg/mL、约13μg/mL至约14μg/mL、14μg/mL至约20μg/mL、约14μg/mL至约19μg/mL、约14μg/mL至约18μg/mL、约14μg/mL至约17μg/mL、约14μg/mL至约16μg/mL、约14μg/mL至约15μg/mL、15μg/mL至约20μg/mL、约15μg/mL至约19μg/mL、约15μg/mL至约18μg/mL、约15μg/mL至约17μg/mL、约15μg/mL至约16μg/mL、16μg/mL至约20μg/mL、约16μg/mL至约19μg/mL、约16μg/mL至约18μg/mL、约16μg/mL至约17μg/mL、17μg/mL至约20μg/mL、约17μg/mL至约19μg/mL、约17μg/mL至约18μg/mL、约18μg/mL至约20μg/mL、约18μg/mL至约19μg/mL，或约19μg/mL至约20μg/mL)胰岛素(例如，人胰岛素)。
在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。在本文所述的任何第一培养基的一些实施方案中，第一培养基包括转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)(例如，约50μg/mL至约400μg/mL、约50μg/mL至约350μg/mL、约50μg/mL至约300μg/mL、约50μg/mL至约250μg/mL、约50μg/mL至约200μg/mL、约50μg/mL至约150μg/mL、约50μg/mL至约100μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约350μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约250μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约150μg/mL、约150μg/mL至约400μg/mL、约150μg/mL至约350μg/mL、约150μg/mL至约300μg/mL、约150μg/mL至约250μg/mL、约150μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约350μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约250μg/mL、约250μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约350μg/mL、约250μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约350μg/mL，或约350至约400μg/mL的转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)。
在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL，或约190ng/mL至约200ng/mL的Flt-3配体(例如，重组人Flt-3配体)。
在一些实施方案中，第一培养基包括约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约950ng/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约850ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约750ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约650ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约550ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约950ng/mL、约5ng/mL至约900ng/mL、约5ng/mL至约850ng/mL、约5ng/mL至约800ng/mL、约5ng/mL至约750ng/mL、约5ng/mL至约700ng/mL、约5ng/mL至约650ng/mL、约5ng/mL至约600ng/mL、约5ng/mL至约550ng/mL、约5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约450ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约350ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约250ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约1μg/mL、约10ng/mL至约950ng/mL、约10ng/mL至约900ng/mL、约10ng/mL至约850ng/mL、约10ng/mL至约800ng/mL、约10ng/mL至约750ng/mL、约10ng/mL至约700ng/mL、约10ng/mL至约650ng/mL、约10ng/mL至约600ng/mL、约10ng/mL至约550ng/mL、约10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约450ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约350ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约250ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、约15ng/mL至约1μg/mL、约15ng/mL至约950ng/mL、约15ng/mL至约900ng/mL、约15ng/mL至约850ng/mL、约15ng/mL至约800ng/mL、约15ng/mL至约750ng/mL、约15ng/mL至约700ng/mL、约15ng/mL至约650ng/mL、约15ng/mL至约600ng/mL、约15ng/mL至约550ng/mL、约15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约450ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约350ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约250ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约150ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约50ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约950ng/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约850ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约750ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约650ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约550ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、约25ng/mL至约1μg/mL、约25ng/mL至约950ng/mL、约25ng/mL至约900ng/mL、约25ng/mL至约850ng/mL、约25ng/mL至约800ng/mL、约25ng/mL至约750ng/mL、约25ng/mL至约700ng/mL、约25ng/mL至约650ng/mL、约25ng/mL至约600ng/mL、约25ng/mL至约550ng/mL、约25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约450ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约350ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约250ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约150ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约1μg/mL、约50ng/mL至约950ng/mL、约50ng/mL至约900ng/mL、约50ng/mL至约850ng/mL、约50ng/mL至约800ng/mL、约50ng/mL至约750ng/mL、约50ng/mL至约700ng/mL、约50ng/mL至约650ng/mL、约50ng/mL至约600ng/mL、约50ng/mL至约550ng/mL、约50ng/mL至约500ng/mL、约50ng/mL至约450ng/mL、约50ng/mL至约400ng/mL、约50ng/mL至约350ng/mL、约50ng/mL至约300ng/mL、约50ng/mL至约250ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约950ng/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约850ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约750ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约650ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约550ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约950ng/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约850ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约750ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约650ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约550ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约950ng/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约850ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约750ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约650ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约550ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约950ng/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约850ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约750ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约650ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约550ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约950ng/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约850ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约750ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约650ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约550ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约950ng/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约850ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约750ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约650ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约550ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约950ng/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约850ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约750ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约650ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约550ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约950ng/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约850ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约750ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约650ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约550ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约950ng/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约850ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约750ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约650ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约500ng/mL至约550ng/mL、约550ng/mL至约1μg/mL、约550ng/mL至约950ng/mL、约550ng/mL至约900ng/mL、约550ng/mL至约850ng/mL、约550ng/mL至约800ng/mL、约550ng/mL至约750ng/mL、约550ng/mL至约700ng/mL、约550ng/mL至约650ng/mL、约550ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约950ng/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约850ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约750ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约600ng/mL至约650ng/mL、约650ng/mL至约1μg/mL、约650ng/mL至约950ng/mL、约650ng/mL至约900ng/mL、约650ng/mL至约850ng/mL、约650ng/mL至约800ng/mL、约650ng/mL至约750ng/mL、约650ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约950ng/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约850ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约700ng/mL至约750ng/mL、约750ng/mL至约1μg/mL、约750ng/mL至约950ng/mL、约750ng/mL至约900ng/mL、约750ng/mL至约850ng/mL、约750ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约950ng/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约800ng/mL至约850ng/mL、约850ng/mL至约1μg/mL、约850ng/mL至约950ng/mL、约850ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL、约900ng/mL至约950ng/mL，或约950ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，重组人干细胞因子)。
在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约0.1ng/mL至约2ng/mL、2ng/mL至约200ng/mL、约2ng/mL至约190ng/mL、约2ng/mL至约180ng/mL、约2ng/mL至约170ng/mL、约2ng/mL至约160ng/mL、约2ng/mL至约150ng/mL、约2ng/mL至约140ng/mL、约2ng/mL至约130ng/mL、约2ng/mL至约120ng/mL、约2ng/mL至约110ng/mL、约2ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约90ng/mL、约2ng/mL至约80ng/mL、约2ng/mL至约70ng/mL、约2ng/mL至约60ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL、约2ng/mL至约40ng/mL、约2ng/mL至约30ng/mL、约2ng/mL至约20ng/mL、约2ng/mL至约10ng/mL、约2ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL，或约190ng/mL至约200ng/mL的IL-3(例如，重组人IL-3)。
在一些实施方案中，第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL、约0.1ng/mL至约190ng/mL、约0.1ng/mL至约180ng/mL、约0.1ng/mL至约170ng/mL、约0.1ng/mL至约160ng/mL、约0.1ng/mL至约150ng/mL、约0.1ng/mL至约140ng/mL、约0.1ng/mL至约130ng/mL、约0.1ng/mL至约120ng/mL、约0.1ng/mL至约110ng/mL、约0.1ng/mL至约100ng/mL、约0.1ng/mL至约90ng/mL、约0.1ng/mL至约80ng/mL、约0.1ng/mL至约70ng/mL、约0.1ng/mL至约60ng/mL、约0.1ng/mL至约50ng/mL、约0.1ng/mL至约40ng/mL、约0.1ng/mL至约30ng/mL、约0.1ng/mL至约20ng/mL、约0.1ng/mL至约10ng/mL、约0.1ng/mL至约5ng/mL、约0.1ng/mL至约2ng/mL、2ng/mL至约200ng/mL、约2ng/mL至约190ng/mL、约2ng/mL至约180ng/mL、约2ng/mL至约170ng/mL、约2ng/mL至约160ng/mL、约2ng/mL至约150ng/mL、约2ng/mL至约140ng/mL、约2ng/mL至约130ng/mL、约2ng/mL至约120ng/mL、约2ng/mL至约110ng/mL、约2ng/mL至约100ng/mL、约2ng/mL至约90ng/mL、约2ng/mL至约80ng/mL、约2ng/mL至约70ng/mL、约2ng/mL至约60ng/mL、约2ng/mL至约50ng/mL、约2ng/mL至约40ng/mL、约2ng/mL至约30ng/mL、约2ng/mL至约20ng/mL、约2ng/mL至约10ng/mL、约2ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约190ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约170ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约130ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约110ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约90ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约70ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约190ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约170ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约150ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约130ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约110ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约90ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约70ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约50ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约190ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约170ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约130ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约110ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约90ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约70ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约190ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约170ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约150ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约130ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约110ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约90ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约70ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约50ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约190ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约170ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约150ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约130ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约110ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约90ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约70ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、约40ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约190ng/mL、约50ng/mL至约180ng/mL、约50ng/mL至约170ng/mL、约50ng/mL至约160ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约140ng/mL、约50ng/mL至约130ng/mL、约50ng/mL至约120ng/mL、约50ng/mL至约110ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约50ng/mL至约90ng/mL、约50ng/mL至约80ng/mL、约50ng/mL至约70ng/mL、约50ng/mL至约60ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约190ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约170ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约150ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约130ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约110ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约90ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、约60ng/mL至约70ng/mL、约70ng/mL至约200ng/mL、约70ng/mL至约190ng/mL、约70ng/mL至约180ng/mL、约70ng/mL至约170ng/mL、约70ng/mL至约160ng/mL、约70ng/mL至约150ng/mL、约70ng/mL至约140ng/mL、约70ng/mL至约130ng/mL、约70ng/mL至约120ng/mL、约70ng/mL至约110ng/mL、约70ng/mL至约100ng/mL、约70ng/mL至约90ng/mL、约70ng/mL至约80ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约190ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约170ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约150ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约130ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约110ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、约80ng/mL至约90ng/mL、约90ng/mL至约200ng/mL、约90ng/mL至约190ng/mL、约90ng/mL至约180ng/mL、约90ng/mL至约170ng/mL、约90ng/mL至约160ng/mL、约90ng/mL至约150ng/mL、约90ng/mL至约140ng/mL、约90ng/mL至约130ng/mL、约90ng/mL至约120ng/mL、约90ng/mL至约110ng/mL、约90ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约190ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约170ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约130ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、约100ng/mL至约110ng/mL、约110ng/mL至约200ng/mL、约110ng/mL至约190ng/mL、约110ng/mL至约180ng/mL、约110ng/mL至约170ng/mL、约110ng/mL至约160ng/mL、约110ng/mL至约150ng/mL、约110ng/mL至约140ng/mL、约110ng/mL至约130ng/mL、约110ng/mL至约120ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约190ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约170ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约150ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、约120ng/mL至约130ng/mL、约130ng/mL至约200ng/mL、约130ng/mL至约190ng/mL、约130ng/mL至约180ng/mL、约130ng/mL至约170ng/mL、约130ng/mL至约160ng/mL、约130ng/mL至约150ng/mL、约130ng/mL至约140ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约190ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约170ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、约140ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约150ng/mL至约190ng/mL、约150ng/mL至约180ng/mL、约150ng/mL至约170ng/mL、约150ng/mL至约160ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约190ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、约160ng/mL至约170ng/mL、约170ng/mL至约200ng/mL、约170ng/mL至约190ng/mL、约170ng/mL至约180ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、约180ng/mL至约190ng/mL，或约190ng/mL至约200ng/mL的IL-6(例如，重组人IL-6)。
在一些实例中，第一培养基可以是，例如化学成分确定的液体培养基、无动物成分的液体培养基、或化学成分确定的无动物成分的液体培养基，和/或无血清的液体培养基。
培养步骤B
灌注培养
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括灌注培养第二细胞培养物(例如，在具有本文所述任何示例性体积的任何示例性生物反应器中的任何第二细胞培养物)约2天到约15天(例如，约2天至约14天、约2天至约13天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约15天、约3天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约15天、约4天至约14天、约4天至约13天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天，或约14天至约15天)。在一些实施方案中，步骤(b)包括用约10W/m3至约200W/m3(例如，约10W/m3至约180W/m3、约10W/m3至约160W/m3、约10W/m3至约140W/m3、约10W/m3至约120W/m3、约10W/m3至约100W/m3、约10W/m3至约80W/m3、约10W/m3至约60W/m3、约10W/m3至约40W/m3、约10W/m3至约35W/m3、约10W/m3至约30W/m3、约10W/m3至约25W/m3、约10W/m3至约20W/m3、约10W/m3至约15W/m3、约15W/m3至约200W/m3、约15W/m3至约180W/m3、约15W/m3至约160W/m3、约15W/m3至约140W/m3、约15W/m3至约120W/m3、约15W/m3至约100W/m3、约15W/m3至约80W/m3、约15W/m3至约60W/m3、约15W/m3至约40W/m3、约15W/m3至约35W/m3、约15W/m3至约30W/m3、约15W/m3至约25W/m3、约15W/m3至约20W/m3、约20W/m3至约200W/m3、约20W/m3至约180W/m3、约20W/m3至约160W/m3、约20W/m3至约140W/m3、约20W/m3至约120W/m3、约20W/m3至约100W/m3、约20W/m3至约80W/m3、约20W/m3至约60W/m3、约20W/m3至约40W/m3、约20W/m3至约35W/m3、约20W/m3至约30W/m3、约20W/m3至约25W/m3、约25W/m3至约200W/m3、约25W/m3至约180W/m3、约25W/m3至约160W/m3、约25W/m3至约140W/m3、约25W/m3至约120W/m3、约25W/m3至约100W/m3、约25W/m3至约80W/m3、约25W/m3至约60W/m3、约25W/m3至约40W/m3、约25W/m3至约35W/m3、约25W/m3至约30W/m3、约30W/m3至约200W/m3、约30W/m3至约180W/m3、约30W/m3至约160W/m3、约30W/m3至约140W/m3、约30W/m3至约120W/m3、约30W/m3至约100W/m3、约30W/m3至约80W/m3、约30W/m3至约60W/m3、约30W/m3至约40W/m3、约30W/m3至约35W/m3、约35W/m3至约200W/m3、约35W/m3至约180W/m3、约35W/m3至约160W/m3、约35W/m3至约140W/m3、约35W/m3至约120W/m3、约35W/m3至约100W/m3、约35W/m3至约80W/m3、约35W/m3至约60W/m3、约35W/m3至约40W/m3、约40W/m3至约200W/m3、约40W/m3至约180W/m3、约40W/m3至约160W/m3、约40W/m3至约140W/m3、约40W/m3至约120W/m3、约40W/m3至约100W/m3、约40W/m3至约80W/m3、约40W/m3至约60W/m3、约60W/m3至约200W/m3、约60W/m3至约180W/m3、约60W/m3至约160W/m3、约60W/m3至约140W/m3、约60W/m3至约120W/m3、约60W/m3至约100W/m3、约60W/m3至约80W/m3、约80W/m3至约200W/m3、约80W/m3至约180W/m3、约80W/m3至约160W/m3、约80W/m3至约140W/m3、约80W/m3至约120W/m3、约80W/m3至约100W/m3、约100W/m3至约200W/m3、约100W/m3至约180W/m3、约100W/m3至约160W/m3、约100W/m3至约140W/m3、约100W/m3至约120W/m3、约120W/m3至约200W/m3、约120W/m3至约180W/m3、约120W/m3至约160W/m3、约120W/m3至约140W/m3、约140W/m3至约200W/m3、约140W/m3至约180W/m3、约140W/m3至约160W/m3、约160W/m3至约200W/m3、约160W/m3至约180W/m3和约180W/m3至约200W/m3)的P/V值搅动第二个细胞培养物(例如，在本文所述的任何生物反应器中具有本文所述的任何示例性体积)。
在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养可以使用以下的灌注速率进行：约0.1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约55nL/细胞/天，或约55nL/细胞/天至约60nL/细胞/天。在一些实施方案中，灌注速率随时间增加。
在一些实施方案中，步骤(b)中的灌注培养可以使用约0.1器皿体积每天(VVD)至约3VVD(例如，约0.1VVD至约2.8VVD、约0.1VVD至约2.6VVD、约0.1VVD至约2.4VVD、约0.1VVD至约2.2VVD、约0.1VVD至约2.0VVD、约0.1VVD至约1.8VVD、约0.1VVD至约1.6VVD、约0.1VVD至约1.4VVD、约0.1VVD至约1.2VVD、约0.1VVD至约1.0VVD、约0.1VVD至约0.8VVD、约0.1VVD至约0.6VVD、约0.1VVD至约0.4VVD、约0.1VVD至约0.2VVD、约0.2VVD至约3VVD、约0.2VVD至约2.8VVD、约0.2VVD至约2.6VVD、约0.2VVD至约2.4VVD、约0.2VVD至约2.2VVD、约0.2VVD至约2.0VVD、约0.2VVD至约1.8VVD、约0.2VVD至约1.6VVD、约0.2VVD至约1.4VVD、约0.2VVD至约1.2VVD、约0.2VVD至约1.0VVD、约0.2VVD至约0.8VVD、约0.2VVD至约0.6VVD、约0.2VVD至约0.4VVD、约0.4VVD至约3VVD、约0.4VVD至约2.8VVD、约0.4VVD至约2.6VVD、约0.4VVD至约2.4VVD、约0.4VVD至约2.2VVD、约0.4VVD至约2.0VVD、约0.4VVD至约1.8VVD、约0.4VVD至约1.6VVD、约0.4VVD至约1.4VVD、约0.4VVD至约1.2VVD、约0.4VVD至约1.0VVD、约0.4VVD至约0.8VVD、约0.4VVD至约0.6VVD、约0.6VVD至约3VVD、约0.6VVD至约2.8VVD、约0.6VVD至约2.6VVD、约0.6VVD至约2.4VVD、约0.6VVD至约2.2VVD、约0.6VVD至约2.0VVD、约0.6VVD至约1.8VVD、约0.6VVD至约1.6VVD、约0.6VVD至约1.4VVD、约0.6VVD至约1.2VVD、约0.6VVD至约1.0VVD、约0.6VVD至约0.8VVD、约0.8VVD至约3VVD、约0.8VVD至约2.8VVD、约0.8VVD至约2.6VVD、约0.8VVD至约2.4VVD、约0.8VVD至约2.2VVD、约0.8VVD至约2.0VVD、约0.8VVD至约1.8VVD、约0.8VVD至约1.6VVD、约0.8VVD至约1.4VVD、约0.8VVD至约1.2VVD、约0.8VVD至约1.0VVD、约1.0VVD至约3VVD、约1.0VVD至约2.8VVD、约1.0VVD至约2.6VVD、约1.0VVD至约2.4VVD、约1.0VVD至约2.2VVD、约1.0VVD至约2.0VVD、约1.0VVD至约1.8VVD、约1.0VVD至约1.6VVD、约1.0VVD至约1.4VVD、约1.0VVD至约1.2VVD、约1.2VVD至约3VVD、约1.2VVD至约2.8VVD、约1.2VVD至约2.6VVD、约1.2VVD至约2.4VVD、约1.2VVD至约2.2VVD、约1.2VVD至约2.0VVD、约1.2VVD至约1.8VVD、约1.2VVD至约1.6VVD、约1.2VVD至约1.4VVD、约1.4VVD至约3VVD、约1.4VVD至约2.8VVD、约1.4VVD至约2.6VVD、约1.4VVD至约2.4VVD、约1.4VVD至约2.2VVD、约1.4VVD至约2.0VVD、约1.4VVD至约1.8VVD、约1.4VVD至约1.6VVD、约1.6VVD至约3VVD、约1.6VVD至约2.8VVD、约1.6VVD至约2.6VVD、约1.6VVD至约2.4VVD、约1.6VVD至约2.2VVD、约1.6VVD至约2.0VVD、约1.6VVD至约1.8VVD、约1.8VVD至约3VVD、约1.8VVD至约2.8VVD、约1.8VVD至约2.6VVD、约1.8VVD至约2.4VVD、约1.8VVD至约2.2VVD、约1.8VVD至约2.0VVD、约2.0VVD至约3VVD、约2.0VVD至约2.8VVD、约2.0VVD至约2.6VVD、约2.0VVD至约2.4VVD、约2.0VVD至约2.2VVD、约2.2VVD至约3VVD、约2.2VVD至约2.8VVD、约2.2VVD至约2.6VVD、约2.2VVD至约2.4VVD、约2.4VVD至约3VVD、约2.4VVD至约2.8VVD、约2.4VVD至约2.6VVD、约2.6VVD至约3VVD、约2.6VVD至约2.8VVD，或约2.8VVD至约3VVD)的灌注速率进行。
在一些实例中，步骤(b)中的灌注培养包括，至少部分地，随时间添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))至第二细胞培养物。在一些实例中，将额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))随时间连续添加至第二细胞培养物。在一些实施方案中，将额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第二细胞培养物。培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)的添加可以机械地，例如使用蠕动泵或灌注泵进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。
在一些实例中，步骤(b)中的灌注培养至少部分地包括随时间除去一定体积的培养基(例如，基本上无细胞的培养基)。在一些实例中，将培养基(例如，基本上无细胞的培养基)随时间连续除去。在一些实施方案中，将培养基随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)除去。培养基(例如，基本上无细胞的培养基)的除去可以机械地，例如使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)进行，或手动(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的其他非限制性方面。
在这些方法的一些实例中，第二培养基包括以下的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：转铁蛋白(例如，约1μg/mL至约500μg/mL转铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3(例如，重组人IL-3)或本文所述的这个范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mL SCF(例如，重组人SCF)或本文所述的这个范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的这个范围的任何子范围)、红细胞生成素(EPO)或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽或本文所述的这个范围的任何子范围)和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的这个范围的任何子范围)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包括约0.1mM至约10mM(或本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如，切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如，切向流过滤或交替切向过滤)包括使用一种或多种具有以下平均孔径的过滤器：约10nm至约6.0μm、约10nm至约5.5μm、约10nm至约5.0μm、约10nm至约4.5μm、约10nm至约4.0μm、约10nm至约3.5μm、约10nm至约3.0μm、约10nm至约2.5μm、约10nm至约2.0μm、约10nm至约1.5μm、约10nm至约1.0μm、约10nm至约0.5μm、约10nm至约0.2μm、10nm至约0.1μm、约10nm至约50nm、约50nm至约6.0μm、约50nm至约5.5μm、约50nm至约5.0μm、约50nm至约4.5μm、约50nm至约4.0μm、约50nm至约3.5μm、约50nm至约3.0μm、约50nm至约2.5μm、约50nm至约2.0μm、约50nm至约1.5μm、约50nm至约1.0μm、约50nm至约0.5μm、约50nm至约0.2μm、约50nm至约0.1μm、约0.1μm至约6.0μm、约0.1μm至约5.5μm、约0.1μm至约5.0μm、约0.1μm至约4.5μm、约0.1μm至约4.0μm、约0.1μm至约3.5μm、约0.1μm至约3.0μm、约0.1μm至约2.5μm、约0.1μm至约2.0μm、约0.1μm至约1.5μm、约0.1μm至约1.0μm、约0.1μm至约0.5μm、约0.1μm至约0.2μm、约0.2μm至约6.0μm、约0.2μm至约5.5μm、约0.2μm至约5.0μm、约0.2μm至约4.5μm、约0.2μm至约4.0μm、约0.2μm至约3.5μm、约0.2μm至约3.0μm、约0.2μm至约2.5μm、约0.2μm至约2.0μm、约0.2μm至约1.5μm、约0.2μm至约1.0μm、约0.2μm至约0.5μm、约0.5μm至约6.0μm、约0.5μm至约5.5μm、约0.5μm至约5.0μm、约0.5μm至约4.5μm、约0.5μm至约4.0μm、约0.5μm至约3.5μm、约0.5μm至约3.0μm、约0.5μm至约2.5μm、约0.5μm至约2.0μm、约0.5μm至约1.5μm、约0.5μm至约1.0μm、约1.0μm至约6.0μm、约1.0μm至约5.5μm、约1.0μm至约5.0μm、约1.0μm至约4.5μm、约1.0μm至约4.0μm、约1.0μm至约3.5μm、约1.0μm至约3.0μm、约1.0μm至约2.5μm、约1.0μm至约2.0μm、约1.0μm至约1.5μm、约1.5μm至约6.0μm、约1.5μm至约5.5μm、约1.5μm至约5.0μm、约1.5μm至约4.5μm、约1.5μm至约4.0μm、约1.5μm至约3.5μm、约1.5μm至约3.0μm、约1.5μm至约2.5μm、约1.5μm至约2.0μm、约2.0μm至约6.0μm、约2.0μm至约5.5μm、约2.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约4.5μm、约2.0μm至约4.0μm、约2.0μm至约3.5μm、约2.0μm至约3.0μm、约2.0μm至约2.5μm、约2.5μm至约6.0μm、约2.5μm至约5.5μm、约2.5μm至约5.0μm、约2.5μm至约4.5μm、约2.5μm至约4.0μm、约2.5μm至约3.5μm、约2.5μm至约3.0μm、约3.0μm至约6.0μm、约3.0μm至约5.5μm、约3.0μm至约5.0μm、约3.0μm至约4.5μm、约3.0μm至约4.0μm、约3.0μm至约3.5μm、约3.5μm至约6.0μm、约3.5μm至约5.5μm、约3.5μm至约5.0μm、约3.5μm至约4.5μm、约3.5μm至约4.0μm、约4.0μm至约6.0μm、约4.0μm至约5.5μm、约4.0μm至约5.0μm、约4.0μm至约4.5μm、约4.5μm至约6.0μM、约4.5μm至约5.5μm、约4.5μm至约5.0μm、约5.0μm至约6.0μm、约5.0μm至约5.5μm，或约5.5μm至约6.0μm。
在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定的靶细胞密度，例如，约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始灌注第二细胞培养物。
分批或补料分批培养
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养第二细胞培养物(例如，在具有本文所述任何示例性体积的本文所述任何示例性摇瓶、摇管、培养袋或生物反应器中的任何第二细胞培养物)约2天至约15天(例如，约2天至约14天、约2天至约13天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约15天、约3天至约14天、约3天至约13天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约15天、约4天至约14天、约4天至约13天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天，或约14天至约15天)。
在一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养布置在生物反应器(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)中的第二细胞培养物。在此类实施方案中，步骤(b)包括在生物反应器中用约10W/m3至约200W/m3(或本文所述的这个范围的任何子范围)的P/V值温育第二细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养布置在摇瓶(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)中的第二细胞培养物。在此类实施方案中，步骤(b)包括在摇瓶中用约0.1xg至约50xg(或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第二细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养布置在摇管(例如，具有本文所述任何示例性体积的任何本文所述的示例性摇管(例如，锥形容器))中的第二细胞培养物。在此类实施方案中，步骤(b)包括在摇管中用约0.1xg至约50xg(或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第二细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括分批或补料分批培养布置在培养袋中的第二细胞培养物(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性培养袋)。在此类实施方案中，步骤(b)包括在培养袋中以每分钟10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期(或本文所述的这个范围的任何子范围)的摇摆速率温育第二细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括分批培养第二细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(b)包括补料分批培养第二细胞培养物。在一些实施方案中，步骤(b)中的补料分批培养包括随时间添加额外体积的第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)。在一些实例中，将额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))随时间连续添加至第二细胞培养物。在一些实例中，将额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第二细胞培养物。在一些实施方案中，在每个24小时增量中，步骤(a)后立即添加约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x，或约9.5x至约10x)的第二次细胞培养物的体积。在一些实施方案中，一旦第一个细胞培养物达到特定的目标细胞密度，例如，约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始添加额外体积的培养基(例如，第二培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基))至第二个细胞培养物。
培养基(例如，本文所述的任何示例性第二培养基)的添加可以机械地，例如使用蠕动泵进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。
在这些方法的一些实例中，第二培养基包括以下的一种或多种(例如，一种、两种、三种、四种、五种或六种)：转铁蛋白(例如，约1μg/mL至约500μg/mL转铁蛋白(例如，(例如，人脱铁运铁蛋白、人全转铁蛋白或其组合))或本文所述的这个范围的任何子范围)、IL-3(例如，约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3(例如，重组人IL-3)或本文所述的这个范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约1μg/mL SCF(例如，重组人SCF)或本文所述的这个范围的任何子范围)、地塞米松(例如，约0.1nM至约200nM地塞米松或本文所述的这个范围的任何子范围)、红细胞生成素(EPO)或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如重组人EPO)或EPO模拟肽(例如本文所述的任何EPO模拟肽)或本文所述的这个范围的任何子范围)，和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的这个范围的任何子范围)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包括脂质(例如，脂质混合物)。在这些方法的一些实例中，第二培养基包括约0.1mM至约10mM(或本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
提供第三细胞培养物(步骤C)
本文所述的方法包括将步骤(b)的一定体积的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)布置到包含在器皿(例如，生物反应器(例如，灌注生物反应器)、摇管、摇瓶或培养袋)内的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)中，以提供具有以下的初始细胞密度的第三细胞培养物的步骤(步骤(c))：约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约0.5x105个细胞/mL至约1x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约2x105个细胞/mL至约4x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约4x105个细胞/mL至约6x105个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约6x105个细胞/mL至约8x105个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约8x105个细胞/mL至约0.1x106个细胞/mL、约0.1x106个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.1x106个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.1x106个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约0.1x106个细胞/mL至约0.5x106个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL、约0.5x106个细胞/mL至约1x106个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约1x107个细胞/mL、约1x106个细胞/mL至约0.5x107个细胞/mL，或约0.5x107个细胞/mL至约1x107个细胞/mL。
在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)布置到包含在生物反应器(例如，具有本文所述的任何示例性体积的任何生物反应器(例如，灌注生物反应器)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL(或本文所述的这个范围的任何子范围)的初始细胞密度的第三细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)布置到包含在摇瓶(例如，具有本文所述的任何示例性体积的任何示例性摇瓶)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL(或本文所述的这个范围的任何子范围)的初始细胞密度的第三细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)布置到包含在摇管(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇管(例如，锥形容器)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL(或本文所述的这个范围的任何子范围)的初始细胞密度的第三细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(c)包括将一定体积的步骤(b)的第二细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第二细胞培养物)布置到包含在培养袋(例如，任何具有本文所述的任何示例性体积的示例性培养袋)内的第三培养基中，以提供具有约0.5x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL(或本文所述的这个范围的任何子范围)的初始细胞密度的第三细胞培养物。
在一些实例中，第三培养基包括一种或多种(例如，两种、三种或四种)以下：转铁蛋白(例如，约1μg/mL至约500μg/mL转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素(例如，重组人胰岛素)或本文所述的这个范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约500ng/mL SCF(例如，重组人SCF)或本文所述的这个范围的任何子范围)和EPO或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性EPO模拟肽)，或本文所述的这个范围的任何子范围)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包括Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包括约0.1％v/v至约10％v/v(例如，约0.1％v/v至约9.5％v/v、约0.1％v/v至约9.0％v/v、约0.1％v/v至约8.5％v/v、约0.1％v/v至约8.0％v/v、约0.1％v/v至约7.5％v/v、约0.1％v/v至约7.0％v/v、约0.1％v/v至约6.5％v/v、约0.1％v/v至约6.0％v/v、约0.1％v/v至约5.5％v/v、约0.1％v/v至约5.0％v/v、约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约10％v/v、约0.5％v/v至约9.5％v/v、约0.5％v/v至约9.0％v/v、约0.5％v/v至约8.5％v/v、约0.5％v/v至约8.0％v/v、约0.5％v/v至约7.5％v/v、约0.5％v/v至约7.0％v/v、约0.5％v/v至约6.5％v/v、约0.5％v/v至约6.0％v/v、约0.5％v/v至约5.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约10％v/v、约1.0％v/v至约9.5％v/v、约1.0％v/v至约9.0％v/v、约1.0％v/v至约8.5％v/v、约1.0％v/v至约8.0％v/v、约1.0％v/v至约7.5％v/v、约1.0％v/v至约7.0％v/v、约1.0％v/v至约6.5％v/v、约1.0％v/v至约6.0％v/v、约1.0％v/v至约5.5％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约10％v/v、约1.5％v/v至约9.5％v/v、约1.5％v/v至约9.0％v/v、约1.5％v/v至约8.5％v/v、约1.5％v/v至约8.0％v/v、约1.5％v/v至约7.5％v/v、约1.5％v/v至约7.0％v/v、约1.5％v/v至约6.5％v/v、约1.5％v/v至约6.0％v/v、约1.5％v/v至约5.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约10％v/v、约2.0％v/v至约9.5％v/v、约2.0％v/v至约9.0％v/v、约2.0％v/v至约8.5％v/v、约2.0％v/v至约8.000％v/v、约2.0％v/v至约7.5％v/v、约2.0％v/v至约7.0％v/v、约2.0％v/v至约6.5％v/v、约2.0％v/v至约6.0％v/v、约2.0％v/v至约5.5％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约10％v/v、约2.5％v/v至约9.5％v/v、约2.5％v/v至约9.0％v/v、约2.5％v/v至约8.5％v/v、约2.5％v/v至约8.0％v/v、约2.5％v/v至约7.5％v/v、约2.5％v/v至约7.0％v/v、约2.5％v/v至约6.5％v/v、约2.5％v/v至约6.0％v/v、约2.5％v/v至约5.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约10％v/v、约3.0％v/v至约9.5％v/v、约3.0％v/v至约9.0％v/v、约3.0％v/v至约8.5％v/v、约3.0％v/v至约8.0％v/v、约3.0％v/v至约7.5％v/v、约3.0％v/v至约7.0％v/v、约3.0％v/v至约6.5％v/v、约3.0％v/v至约6.0％v/v、约3.0％v/v至约5.5％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约10％v/v、约3.5％v/v至约9.5％v/v、约3.5％v/v至约9.0％v/v、约3.5％v/v至约8.5％v/v、约3.5％v/v至约8.0％v/v、约3.5％v/v至约7.5％v/v、约3.5％v/v至约7.0％v/v、约3.5％v/v至约6.5％v/v、约3.5％v/v至约6.0％v/v、约3.5％v/v至约5.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约10％v/v、约4.0％v/v至约9.5％v/v、约4.0％v/v至约9.0％v/v、约4.0％v/v至约8.5％v/v、约4.0％v/v至约8.0％v/v、约4.0％v/v至约7.5％v/v、约4.0％v/v至约7.0％v/v、约4.0％v/v至约6.5％v/v、约4.0％v/v至约6.0％v/v、约4.0％v/v至约5.5％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、约4.5％v/v至约10％v/v、约4.5％v/v至约9.5％v/v、约4.5％v/v至约9.0％v/v、约4.5％v/v至约8.5％v/v、约4.5％v/v至约8.0％v/v、约4.5％v/v至约7.5％v/v、约4.5％v/v至约7.0％v/v、约4.5％v/v至约6.5％v/v、约4.5％v/v至约6.0％v/v、约4.5％v/v至约5.5％v/v、约4.5％v/v至约5.0％v/v、约5.0％v/v至约10％v/v、约5.0％v/v至约9.5％v/v、约5.0％v/v至约9.0％v/v、约5.0％v/v至约8.5％v/v、约5.0％v/v至约8.0％v/v、约5.0％v/v至约7.5％v/v、约5.0％v/v至约7.0％v/v、约5.0％v/v至约6.5％v/v、约5.0％v/v至约6.0％v/v、约5.0％v/v至约5.5％v/v、约5.5％v/v至约10％v/v、约5.5％v/v至约9.5％v/v、约5.5％v/v至约9.0％v/v、约5.5％v/v至约8.5％v/v、约5.5％v/v至约8.0％v/v、约5.5％v/v至约7.5％v/v、约5.5％v/v至约7.0％v/v、约5.5％v/v至约6.5％v/v、约5.5％v/v至约6.0％v/v、约6.0％v/v至约10％v/v、约6.0％v/v至约9.5％v/v、约6.0％v/v至约9.0％v/v、约6.0％v/v至约8.5％v/v、约6.0％v/v至约8.0％v/v、约6.0％v/v至约7.5％v/v、约6.0％v/v至约7.000％v/v、约6.0％v/v至约6.5％v/v、约6.5％v/v至约10％v/v、约6.5％v/v至约9.5％v/v、约6.5％v/v至约9.0％v/v、约6.5％v/v至约8.5％v/v、约6.5％v/v至约8.0％v/v、约6.5％v/v至约7.5％v/v、约6.5％v/v至约7.0％v/v、约7.0％v/v至约10％v/v、约7.0％v/v至约9.5％v/v、约7.0％v/v至约9.0％v/v、约7.0％v/v至约8.5％v/v、约7.0％v/v至约8.0％v/v、约7.0％v/v至约7.5％v/v、约7.5％v/v至约10％v/v、约7.5％v/v至约9.5％v/v、约7.5％v/v至约9.0％v/v、约7.5％v/v至约8.5％v/v、约7.5％v/v至约8.0％v/v、约8.0％v/v至约10％v/v、约8.0％v/v至约9.5％v/v、约8.0％v/v至约9.0％v/v、约8.000％v/v至约8.5％v/v、约8.5％v/v至约10％v/v、约8.5％v/v至约9.5％v/v、约8.5％v/v至约9.0％v/v、约9.0％v/v至约10％v/v、约9.0％v/v至约9.5％v/v，或约9.5％v/v至约10％v/v)血清(例如，人AB血清)。在一些实施方案中，第三培养基包括0.1％v/v至约5％v/v(例如，约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v，或约4.5％v/v至约5％v/v)人血浆。在一些实施方案中，第三培养基包括约1U/mL至约5U/mL(例如，约1U/mL至约4U/mL、约1U/mL至约3U/mL、约1U/mL至约2U/mL、约2U/mL至约5U/mL、约2U/mL至约4U/mL、约2U/mL至约3U/mL、约3U/mL至约5U/mL、约3U/mL至约4U/mL，或约4U/mL至约5U/mL)肝素。在一些实例中，第三培养基包括约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v，或约2.5％w/v至约3％w/v)泊洛沙姆-188(P188)。)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包括约1mM至约8mM(例如，约1mM至约7mM、约1mM至约6mM、约1mM至约5mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM、约1mM至约2mM、约2mM至约8mM、约2mM至约7mM、约2mM至约6mM、约2mM至约5mM、约2mM至约4mM、约2mM至约3mM、约3mM至约8mM、约3mM至约7mM、约3mM至约6mM、约3mM至约5mM、约3mM至约4mM、约4mM至约8mM、约4mM至约7mM、约4mM至约6mM、约4mM至约5mM、约5mM至约8mM、约5mM至约7mM、约5mM至约6mM、约6mM至约8mM、约6mM至约7mM，或约7mM至约8mM)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
在一些实例中，第三培养基包括约1μg/mL至约500μg/mL、约1μg/mL至约450μg/mL、约1μg/mL至约400μg/mL、约1μg/mL至约350μg/mL、约1μg/mL至约300μg/mL、约1μg/mL至约250μg/mL、约1μg/mL至约200μg/mL、约1μg/mL至约180μg/mL、约1μg/mL至约160μg/mL、约1μg/mL至约140μg/mL、约1μg/mL至约120μg/mL、约1μg/mL至约100μg/mL、约1μg/mL至约80μg/mL、约1μg/mL至约60μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、5μg/mL至约500μg/mL、约5μg/mL至约450μg/mL、约5μg/mL至约400μg/mL、约5μg/mL至约350μg/mL、约5μg/mL至约300μg/mL、约5μg/mL至约250μg/mL、约5μg/mL至约200μg/mL、约5μg/mL至约180μg/mL、约5μg/mL至约160μg/mL、约5μg/mL至约140μg/mL、约5μg/mL至约120μg/mL、约5μg/mL至约100μg/mL、约5μg/mL至约80μg/mL、约5μg/mL至约60μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、10μg/mL至约500μg/mL、约10μg/mL至约450μg/mL、约10μg/mL至约400μg/mL、约10μg/mL至约350μg/mL、约10μg/mL至约300μg/mL、约10μg/mL至约250μg/mL、约10μg/mL至约200μg/mL、约10μg/mL至约180μg/mL、约10μg/mL至约160μg/mL、约10μg/mL至约140μg/mL、约10μg/mL至约120μg/mL、约10μg/mL至约100μg/mL、约10μg/mL至约80μg/mL、约10μg/mL至约60μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、20μg/mL至约500μg/mL、约20μg/mL至约450μg/mL、约20μg/mL至约400μg/mL、约20μg/mL至约350μg/mL、约20μg/mL至约300μg/mL、约20μg/mL至约250μg/mL、约20μg/mL至约200μg/mL、约20μg/mL至约180μg/mL、约20μg/mL至约160μg/mL、约20μg/mL至约140μg/mL、约20μg/mL至约120μg/mL、约20μg/mL至约100μg/mL、约20μg/mL至约80μg/mL、约20μg/mL至约60μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、40μg/mL至约500μg/mL、约40μg/mL至约450μg/mL、约40μg/mL至约400μg/mL、约40μg/mL至约350μg/mL、约40μg/mL至约300μg/mL、约40μg/mL至约250μg/mL、约40μg/mL至约200μg/mL、约40μg/mL至约180μg/mL、约40μg/mL至约160μg/mL、约40μg/mL至约140μg/mL、约40μg/mL至约120μg/mL、约40μg/mL至约100μg/mL、约40μg/mL至约80μg/mL、约40μg/mL至约60μg/mL、60μg/mL至约500μg/mL、约60μg/mL至约450μg/mL、约60μg/mL至约400μg/mL、约60μg/mL至约350μg/mL、约60μg/mL至约300μg/mL、约60μg/mL至约250μg/mL、约60μg/mL至约200μg/mL、约60μg/mL至约180μg/mL、约60μg/mL至约160μg/mL、约60μg/mL至约140μg/mL、约60μg/mL至约120μg/mL、约60μg/mL至约100μg/mL、约60μg/mL至约80μg/mL、80μg/mL至约500μg/mL、约80μg/mL至约450μg/mL、约80μg/mL至约400μg/mL、约80μg/mL至约350μg/mL、约80μg/mL至约300μg/mL、约80μg/mL至约250μg/mL、约80μg/mL至约200μg/mL、约80μg/mL至约180μg/mL、约80μg/mL至约160μg/mL、约80μg/mL至约140μg/mL、约80μg/mL至约120μg/mL、约80μg/mL至约100μg/mL、100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约450μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约350μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约250μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约100μg/mL至约180μg/mL、约100μg/mL至约160μg/mL、约100μg/mL至约140μg/mL、约100μg/mL至约120μg/mL、120μg/mL至约500μg/mL、约120μg/mL至约450μg/mL、约120μg/mL至约400μg/mL、约120μg/mL至约350μg/mL、约120μg/mL至约300μg/mL、约120μg/mL至约250μg/mL、约120μg/mL至约200μg/mL、约120μg/mL至约180μg/mL、约120μg/mL至约160μg/mL、约120μg/mL至约140μg/mL、140μg/mL至约500μg/mL、约140μg/mL至约450μg/mL、约140μg/mL至约400μg/mL、约140μg/mL至约350μg/mL、约140μg/mL至约300μg/mL、约140μg/mL至约250μg/mL、约140μg/mL至约200μg/mL、约140μg/mL至约180μg/mL、约140μg/mL至约160μg/mL、160μg/mL至约500μg/mL、约160μg/mL至约450μg/mL、约160μg/mL至约400μg/mL、约160μg/mL至约350μg/mL、约160μg/mL至约300μg/mL、约160μg/mL至约250μg/mL、约160μg/mL至约200μg/mL、约160μg/mL至约180μg/mL、180μg/mL至约500μg/mL、约180μg/mL至约450μg/mL、约180μg/mL至约400μg/mL、约180μg/mL至约350μg/mL、约180μg/mL至约300μg/mL、约180μg/mL至约250μg/mL、约180μg/mL至约200μg/mL、200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约450μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约350μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约200μg/mL至约250μg/mL、250μg/mL至约500μg/mL、约250μg/mL至约450μg/mL、约250μg/mL至约400μg/mL、约250μg/mL至约350μg/mL、约250μg/mL至约300μg/mL、300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约450μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约300μg/mL至约350μg/mL、350μg/mL至约500μg/mL、约350μg/mL至约450μg/mL、约350μg/mL至约400μg/mL、400μg/mL至约500μg/mL、约400μg/mL至约450μg/mL，或450μg/mL至约500μg/mL的转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白(holotransferrin)或其组合)。
在一些实例中，第三培养基包括约1ng/mL至约1μg/mL、约1ng/mL至约900ng/mL、约1ng/mL至约800ng/mL、约1ng/mL至约700ng/mL、约1ng/mL至约600ng/mL、约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约450ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约350ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约250ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约150ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约50ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、约5ng/mL至约1μg/mL、约5ng/mL至约900ng/mL、约5ng/mL至约800ng/mL、约5ng/mL至约700ng/mL、约5ng/mL至约600ng/mL、约5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约450ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约350ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约250ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约150ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约50ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约20ng/mL至约1μg/mL、约20ng/mL至约900ng/mL、约20ng/mL至约800ng/mL、约20ng/mL至约700ng/mL、约20ng/mL至约600ng/mL、约20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约450ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约350ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约250ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约150ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约50ng/mL、约50ng/mL至约1μg/mL、约50ng/mL至约900ng/mL、约50ng/mL至约800ng/mL、约50ng/mL至约700ng/mL、约50ng/mL至约600ng/mL、约50ng/mL至约500ng/mL、约50ng/mL至约450ng/mL、约50ng/mL至约400ng/mL、约50ng/mL至约350ng/mL、约50ng/mL至约300ng/mL、约50ng/mL至约250ng/mL、约50ng/mL至约200ng/mL、约50ng/mL至约150ng/mL、约50ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1μg/mL、约100ng/mL至约900ng/mL、约100ng/mL至约800ng/mL、约100ng/mL至约700ng/mL、约100ng/mL至约600ng/mL、约100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约450ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约350ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约250ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约150ng/mL、约150ng/mL至约1μg/mL、约150ng/mL至约900ng/mL、约150ng/mL至约800ng/mL、约150ng/mL至约700ng/mL、约150ng/mL至约600ng/mL、约150ng/mL至约500ng/mL、约150ng/mL至约450ng/mL、约150ng/mL至约400ng/mL、约150ng/mL至约350ng/mL、约150ng/mL至约300ng/mL、约150ng/mL至约250ng/mL、约150ng/mL至约200ng/mL、约200ng/mL至约1μg/mL、约200ng/mL至约900ng/mL、约200ng/mL至约800ng/mL、约200ng/mL至约700ng/mL、约200ng/mL至约600ng/mL、约200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约450ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约350ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约250ng/mL、约250ng/mL至约1μg/mL、约250ng/mL至约900ng/mL、约250ng/mL至约800ng/mL、约250ng/mL至约700ng/mL、约250ng/mL至约600ng/mL、约250ng/mL至约500ng/mL、约250ng/mL至约450ng/mL、约250ng/mL至约400ng/mL、约250ng/mL至约350ng/mL、约250ng/mL至约300ng/mL、约300ng/mL至约1μg/mL、约300ng/mL至约900ng/mL、约300ng/mL至约800ng/mL、约300ng/mL至约700ng/mL、约300ng/mL至约600ng/mL、约300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约450ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约350ng/mL、约350ng/mL至约1μg/mL、约350ng/mL至约900ng/mL、约350ng/mL至约800ng/mL、约350ng/mL至约700ng/mL、约350ng/mL至约600ng/mL、约350ng/mL至约500ng/mL、约350ng/mL至约450ng/mL、约350ng/mL至约400ng/mL、约400ng/mL至约1μg/mL、约400ng/mL至约900ng/mL、约400ng/mL至约800ng/mL、约400ng/mL至约700ng/mL、约400ng/mL至约600ng/mL、约400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约450ng/mL、约450ng/mL至约1μg/mL、约450ng/mL至约900ng/mL、约450ng/mL至约800ng/mL、约450ng/mL至约700ng/mL、约450ng/mL至约600ng/mL、约450ng/mL至约500ng/mL、约500ng/mL至约1μg/mL、约500ng/mL至约900ng/mL、约500ng/mL至约800ng/mL、约500ng/mL至约700ng/mL、约500ng/mL至约600ng/mL、约600ng/mL至约1μg/mL、约600ng/mL至约900ng/mL、约600ng/mL至约800ng/mL、约600ng/mL至约700ng/mL、约700ng/mL至约1μg/mL、约700ng/mL至约900ng/mL、约700ng/mL至约800ng/mL、约800ng/mL至约1μg/mL、约800ng/mL至约900ng/mL、约900ng/mL至约1μg/mL的SCF(例如，重组人SCF).
在一些实施方案中，第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL,10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL,15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL,20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL,25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL,30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL,40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL,60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL,80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL,100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL,120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL,140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL,160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL,180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL,200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL,220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL,240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL,260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL，或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽。本文描述了EPO模拟肽的非限制性示例。EPO模拟肽的其他实例在本领域已知。
在一些实施方案中，第三培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL，或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。
在一些实例中，第三培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物成分的液体培养基、或化学成分确定的无动物成分的液体培养基，和/或无血清的液体培养基。
培养步骤D
灌注培养
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括灌注培养第三细胞培养物(例如，在具有本文所述示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器(例如，灌注生物反应器)中的本文所述的任何第三细胞培养物)约5天至约20天(例如，约5天至约19天、约5天至约18天、约5天至约17天、约5天至约16天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约20天、约6天至约19天、约6天至约18天、约6天至约17天、约6天至约16天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约20天、约7天至约19天、约7天至约18天、约7天至约17天、约7天至约16天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约20天、约8天至约19天、约8天至约18天、约8天至约17天、约8天至约16天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约20天、约9天至约19天、约9天至约18天、约9天至约17天、约9天至约16天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约20天、约10天至约19天、约10天至约18天、约10天至约17天、约10天至约16天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约20天、约11天至约19天、约11天至约18天、约11天至约17天、约11天至约16天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约20天、约12天至约19天、约12天至约18天、约12天至约17天、约12天至约16天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约20天、约13天至约19天、约13天至约18天、约13天至约17天、约13天至约16天、约13天至约15天、约13天至约14天、约14天至约20天、约14天至约19天、约14天至约18天、约14天至约17天、约14天至约16天、约14天至约15天、约15天至约20天、约15天至约19天、约15天至约18天、约15天至约17天、约15天至约16天、约16天至约20天、约16天至约19天、约16天至约18天、约16天至约17天、约17天至约20天、约17天至约19天、约17天至约18天、约18天至约20天、约18天至约19天，或约19天至约20天)，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。在一些实施方案中，步骤(d)包括用约10W/m3至约200W/m3(例如，本文所述的任何范围的任何子范围)的P/V值搅动所述第三细胞培养物(例如，在具有本文所述示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器中)。
在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养可以使用以下的灌注速率进行：约0.1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约0.1nL/细胞/天至约0.5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约0.5nL/细胞/天至约1nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约1nL/细胞/天至约2nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约2nL/细胞/天至约4nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约4nL/细胞/天至约5nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约5nL/细胞/天至约6nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约6nL/细胞/天至约8nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约8nL/细胞/天至约10nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约10nL/细胞/天至约15nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约15nL/细胞/天至约20nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约20nL/细胞/天至约25nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约25nL/细胞/天至约30nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约30nL/细胞/天至约35nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约35nL/细胞/天至约40nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约40nL/细胞/天至约45nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约55nL/细胞/天、约45nL/细胞/天至约50nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约60nL/细胞/天、约50nL/细胞/天至约55nL/细胞/天，或约55nL/细胞/天至约60nL/细胞/天。在一些实施方案中，灌注速率随时间增加。
在一些实施方案中，步骤(d)中的灌注培养可以使用约0.1VVD至约3VVD(或本文所述的这个范围的任何子范围)的灌注速率进行。
在一些实例中，步骤(d)中的灌注培养包括：(i)添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；(ii)添加额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)连续添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；和/或将(ii)中的额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)连续添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
在一些实例中，将(i)中额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
培养基(例如，本文所述的示例性第三或第四培养基中的任一种)的添加可以机械地，例如使用蠕动泵进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。
培养基(例如，基本上无细胞的培养基)的除去可以机械地，例如使用切向流过滤(TFF)或交替流过滤(ATF)进行，或手动(例如，通过无菌移液)进行。本文描述了切向流过滤的其他非限制性方面。
在一些实例中，(i)中的第一时间段是约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天，或约11天至约12天.
在一些实例中，(i)中的第二时间段是约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天，或约11天至约12天。
在这些方法的一些实例中，第四培养基包括以下的一种或多种(例如，一种、两种或三种)：转铁蛋白(例如，约100μg/mL至约2mg/mL转铁蛋白(例如，人载脂蛋白，人全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、红细胞生成素(EPO)或模拟EPO肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽或本文所述的这个范围的任何子范围，和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的这个范围的任何子范围)。
在本文所述的任何第四培养基的一些实施方案中，第四培养基包括Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。在本文所述的任何第四培养基的一些实施方案中，第四培养基包括约0.1％v/v至约10％v/v(例如，约0.1％v/v至约9.5％v/v、约0.1％v/v至约9.0％v/v、约0.1％v/v至约8.5％v/v、约0.1％v/v至约8.0％v/v、约0.1％v/v至约7.5％v/v、约0.1％v/v至约7.0％v/v、约0.1％v/v至约6.5％v/v、约0.1％v/v至约6.0％v/v、约0.1％v/v至约5.5％v/v、约0.1％v/v至约5.0％v/v、约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约0.5％v/v至约10％v/v、约0.5％v/v至约9.5％v/v、约0.5％v/v至约9.0％v/v、约0.5％v/v至约8.5％v/v、约0.5％v/v至约8.0％v/v、约0.5％v/v至约7.5％v/v、约0.5％v/v至约7.0％v/v、约0.5％v/v至约6.5％v/v、约0.5％v/v至约6.0％v/v、约0.5％v/v至约5.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约10％v/v、约1.0％v/v至约9.5％v/v、约1.0％v/v至约9.0％v/v、约1.0％v/v至约8.5％v/v、约1.0％v/v至约8.0％v/v、约1.0％v/v至约7.5％v/v、约1.0％v/v至约7.0％v/v、约1.0％v/v至约6.5％v/v、约1.0％v/v至约6.0％v/v、约1.0％v/v至约5.5％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约10％v/v、约1.5％v/v至约9.5％v/v、约1.5％v/v至约9.0％v/v、约1.5％v/v至约8.5％v/v、约1.5％v/v至约8.0％v/v、约1.5％v/v至约7.5％v/v、约1.5％v/v至约7.0％v/v、约1.5％v/v至约6.5％v/v、约1.5％v/v至约6.0％v/v、约1.5％v/v至约5.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约10％v/v、约2.0％v/v至约9.5％v/v、约2.0％v/v至约9.0％v/v、约2.0％v/v至约8.5％v/v、约2.0％v/v至约8.000％v/v、约2.0％v/v至约7.5％v/v、约2.0％v/v至约7.0％v/v、约2.0％v/v至约6.5％v/v、约2.0％v/v至约6.0％v/v、约2.0％v/v至约5.5％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约10％v/v、约2.5％v/v至约9.5％v/v、约2.5％v/v至约9.0％v/v、约2.5％v/v至约8.5％v/v、约2.5％v/v至约8.0％v/v、约2.5％v/v至约7.5％v/v、约2.5％v/v至约7.0％v/v、约2.5％v/v至约6.5％v/v、约2.5％v/v至约6.0％v/v、约2.5％v/v至约5.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约10％v/v、约3.0％v/v至约9.5％v/v、约3.0％v/v至约9.0％v/v、约3.0％v/v至约8.5％v/v、约3.0％v/v至约8.0％v/v、约3.0％v/v至约7.5％v/v、约3.0％v/v至约7.0％v/v、约3.0％v/v至约6.5％v/v、约3.0％v/v至约6.0％v/v、约3.0％v/v至约5.5％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约10％v/v、约3.5％v/v至约9.5％v/v、约3.5％v/v至约9.0％v/v、约3.5％v/v至约8.5％v/v、约3.5％v/v至约8.0％v/v、约3.5％v/v至约7.5％v/v、约3.5％v/v至约7.0％v/v、约3.5％v/v至约6.5％v/v、约3.5％v/v至约6.0％v/v、约3.5％v/v至约5.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约10％v/v、约4.0％v/v至约9.5％v/v、约4.0％v/v至约9.0％v/v、约4.0％v/v至约8.5％v/v、约4.0％v/v至约8.0％v/v、约4.0％v/v至约7.5％v/v、约4.0％v/v至约7.0％v/v、约4.0％v/v至约6.5％v/v、约4.0％v/v至约6.0％v/v、约4.0％v/v至约5.5％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v、约4.5％v/v至约10％v/v、约4.5％v/v至约9.5％v/v、约4.5％v/v至约9.0％v/v、约4.5％v/v至约8.5％v/v、约4.5％v/v至约8.0％v/v、约4.5％v/v至约7.5％v/v、约4.5％v/v至约7.0％v/v、约4.5％v/v至约6.5％v/v、约4.5％v/v至约6.0％v/v、约4.5％v/v至约5.5％v/v、约4.5％v/v至约5.0％v/v、约5.0％v/v至约10％v/v、约5.0％v/v至约9.5％v/v、约5.0％v/v至约9.0％v/v、约5.0％v/v至约8.5％v/v、约5.0％v/v至约8.0％v/v、约5.0％v/v至约7.5％v/v、约5.0％v/v至约7.0％v/v、约5.0％v/v至约6.5％v/v、约5.0％v/v至约6.0％v/v、约5.0％v/v至约5.5％v/v、约5.5％v/v至约10％v/v、约5.5％v/v至约9.5％v/v、约5.5％v/v至约9.0％v/v、约5.5％v/v至约8.5％v/v、约5.5％v/v至约8.0％v/v、约5.5％v/v至约7.5％v/v、约5.5％v/v至约7.0％v/v、约5.5％v/v至约6.5％v/v、约5.5％v/v至约6.0％v/v、约6.0％v/v至约10％v/v、约6.0％v/v至约9.5％v/v、约6.0％v/v至约9.0％v/v、约6.0％v/v至约8.5％v/v、约6.0％v/v至约8.0％v/v、约6.0％v/v至约7.5％v/v、约6.0％v/v至约7.0％v/v、约6.0％v/v至约6.5％v/v、约6.5％v/v至约10％v/v、约6.5％v/v至约9.5％v/v、约6.5％v/v至约9.0％v/v、约6.5％v/v至约8.5％v/v、约6.5％v/v至约8.0％v/v、约6.5％v/v至约7.5％v/v、约6.5％v/v至约7.0％v/v、约7.0％v/v至约10％v/v、约7.0％v/v至约9.5％v/v、约7.0％v/v至约9.0％v/v、约7.0％v/v至约8.5％v/v、约7.0％v/v至约8.0％v/v、约7.0％v/v至约7.5％v/v、约7.5％v/v至约10％v/v、约7.5％v/v至约9.5％v/v、约7.5％v/v至约9.0％v/v、约7.5％v/v至约8.5％v/v、约7.5％v/v至约8.0％v/v、约8.0％v/v至约10％v/v、约8.0％v/v至约9.5％v/v、约8.0％v/v至约9.0％v/v、约8.0％v/v至约8.5％v/v、约8.5％v/v至约10％v/v、约8.5％v/v至约9.5％v/v、约8.5％v/v至约9.0％v/v、约9.0％v/v至约10％v/v、约9.0％v/v至约9.5％v/v，或约9.5％v/v至约10％v/v)血清(例如，人AB血清)。在一些实施方案中，第四培养基包括0.1％v/v至约5％v/v(例如，约0.1％v/v至约4.5％v/v、约0.1％v/v至约4.0％v/v、约0.1％v/v至约3.5％v/v、约0.1％v/v至约3.0％v/v、约0.1％v/v至约2.5％v/v、约0.1％v/v至约2.0％v/v、约0.1％v/v至约1.5％v/v、约0.1％v/v至约1.0％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.5％v/v至约5％v/v、约0.5％v/v至约4.5％v/v、约0.5％v/v至约4.0％v/v、约0.5％v/v至约3.5％v/v、约0.5％v/v至约3.0％v/v、约0.5％v/v至约2.5％v/v、约0.5％v/v至约2.0％v/v、约0.5％v/v至约1.5％v/v、约0.5％v/v至约1.0％v/v、约1.0％v/v至约5％v/v、约1.0％v/v至约4.5％v/v、约1.0％v/v至约4.0％v/v、约1.0％v/v至约3.5％v/v、约1.0％v/v至约3.0％v/v、约1.0％v/v至约2.5％v/v、约1.0％v/v至约2.0％v/v、约1.0％v/v至约1.5％v/v、约1.5％v/v至约5％v/v、约1.5％v/v至约4.5％v/v、约1.5％v/v至约4.0％v/v、约1.5％v/v至约3.5％v/v、约1.5％v/v至约3.0％v/v、约1.5％v/v至约2.5％v/v、约1.5％v/v至约2.0％v/v、约2.0％v/v至约5％v/v、约2.0％v/v至约4.5％v/v、约2.0％v/v至约4.0％v/v、约2.0％v/v至约3.5％v/v、约2.0％v/v至约3.0％v/v、约2.0％v/v至约2.5％v/v、约2.5％v/v至约5％v/v、约2.5％v/v至约4.5％v/v、约2.5％v/v至约4.0％v/v、约2.5％v/v至约3.5％v/v、约2.5％v/v至约3.0％v/v、约3.0％v/v至约5％v/v、约3.0％v/v至约4.5％v/v、约3.0％v/v至约4.0％v/v、约3.0％v/v至约3.5％v/v、约3.5％v/v至约5％v/v、约3.5％v/v至约4.5％v/v、约3.5％v/v至约4.0％v/v、约4.0％v/v至约5％v/v、约4.0％v/v至约4.5％v/v，或约4.5％v/v至约5％v/v)人血浆。在一些实施方案中，第四培养基包括约1U/mL至5U/mL(例如，约1U/mL至约4U/mL、约1U/mL至约3U/mL、约1U/mL至约2U/mL、约2U/mL至约5U/mL、约2U/mL至约4U/mL、约2U/mL至约3U/mL、约3U/mL至约5U/mL、约3U/mL至约4U/mL，或约4U/mL至约5U/mL)肝素。在一些实例中，第四培养基包括约0.1％w/v至约3％w/v(例如，约0.1％w/v至约2.5％w/v、约0.1％w/v至约2.0％w/v、约0.1％w/v至约1.5％w/v、约0.1％w/v至约1.0％w/v、约0.1％w/v至约0.5％w/v、约0.5％w/v至约3％w/v、约0.5％w/v至约2.5％w/v、约0.5％w/v至约2.0％w/v、约0.5％w/v至约1.5％w/v、约0.5％w/v至约1.0％w/v、约1.0％w/v至约3％w/v、约1.0％w/v至约2.5％w/v、约1.0％w/v至约2.0％w/v、约1.0％w/v至约1.5％w/v、约1.5％w/v至约3％w/v、约1.5％w/v至约2.5％w/v、约1.5％w/v至约2.0％w/v、约2.0％w/v至约3％w/v、约2.0％w/v至约2.5％w/v，或约2.5％w/v至约3％w/v)泊洛沙姆-188(P188)。在一些实施方案中，第四培养基包括约1mM至约8mM(例如本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
在一些实例中，第四培养基包括约100μg/mL至约2mg/mL、约100μg/mL至约1.8mg/mL、约100μg/mL至约1.6mg/mL、约100μg/mL至约1.5mg/mL、约100μg/mL至约1.4mg/mL、约100μg/mL至约1.3mg/mL、约100μg/mL至约1.2mg/mL、约100μg/mL至约1.1mg/mL、约100μg/mL至约1.0mg/mL、约100μg/mL至约900μg/mL、约100μg/mL至约800μg/mL、约100μg/mL至约700μg/mL、约100μg/mL至约600μg/mL、约100μg/mL至约500μg/mL、约100μg/mL至约400μg/mL、约100μg/mL至约300μg/mL、约100μg/mL至约200μg/mL、约200μg/mL至约2mg/mL、约200μg/mL至约1.8mg/mL、约200μg/mL至约1.6mg/mL、约200μg/mL至约1.5mg/mL、约200μg/mL至约1.4mg/mL、约200μg/mL至约1.3mg/mL、约200μg/mL至约1.2mg/mL、约200μg/mL至约1.1mg/mL、约200μg/mL至约1.0mg/mL、约200μg/mL至约900μg/mL、约200μg/mL至约800μg/mL、约200μg/mL至约700μg/mL、约200μg/mL至约600μg/mL、约200μg/mL至约500μg/mL、约200μg/mL至约400μg/mL、约200μg/mL至约300μg/mL、约300μg/mL至约2mg/mL、约300μg/mL至约1.8mg/mL、约300μg/mL至约1.6mg/mL、约300μg/mL至约1.5mg/mL、约300μg/mL至约1.4mg/mL、约300μg/mL至约1.3mg/mL、约300μg/mL至约1.2mg/mL、约300μg/mL至约1.1mg/mL、约300μg/mL至约1.0mg/mL、约300μg/mL至约900μg/mL、约300μg/mL至约800μg/mL、约300μg/mL至约700μg/mL、约300μg/mL至约600μg/mL、约300μg/mL至约500μg/mL、约300μg/mL至约400μg/mL、约400μg/mL至约2mg/mL、约400μg/mL至约1.8mg/mL、约400μg/mL至约1.6mg/mL、约400μg/mL至约1.5mg/mL、约400μg/mL至约1.4mg/mL、约400μg/mL至约1.3mg/mL、约400μg/mL至约1.2mg/mL、约400μg/mL至约1.1mg/mL、约400μg/mL至约1.0mg/mL、约400μg/mL至约900μg/mL、约400μg/mL至约800μg/mL、约400μg/mL至约700μg/mL、约400μg/mL至约600μg/mL、约400μg/mL至约500μg/mL、约500μg/mL至约2mg/mL、约500μg/mL至约1.8mg/mL、约500μg/mL至约1.6mg/mL、500μg/mL至约1.5mg/mL、约500μg/mL至约1.4mg/mL、约500μg/mL至约1.3mg/mL、约500μg/mL至约1.2mg/mL、约500μg/mL至约1.1mg/mL、约500μg/mL至约1.0mg/mL、约500μg/mL至约900μg/mL、约500μg/mL至约800μg/mL、约500μg/mL至约700μg/mL、约500μg/mL至约600μg/mL、约600μg/mL至约2mg/mL、约600μg/mL至约1.8mg/mL、约600μg/mL至约1.6mg/mL、约600μg/mL至约1.5mg/mL、约600μg/mL至约1.4mg/mL、约600μg/mL至约1.3mg/mL、约600μg/mL至约1.2mg/mL、约600μg/mL至约1.1mg/mL、约600μg/mL至约1.0mg/mL、约600μg/mL至约900μg/mL、约600μg/mL至约800μg/mL、约600μg/mL至约700μg/mL、约700μg/mL至约2mg/mL、约700μg/mL至约1.8mg/mL、约700μg/mL至约1.6mg/mL、约700μg/mL至约1.5mg/mL、约700μg/mL至约1.4mg/mL、约700μg/mL至约1.3mg/mL、约700μg/mL至约1.2mg/mL、约700μg/mL至约1.1mg/mL、约700μg/mL至约1.0mg/mL、约700μg/mL至约900μg/mL、约700μg/mL至约800μg/mL、约800μg/mL至约2mg/mL、约800μg/mL至约1.8mg/mL、约800μg/mL至约1.6mg/mL、约800μg/mL至约1.5mg/mL、约800μg/mL至约1.4mg/mL、约800μg/mL至约1.3mg/mL、约800μg/mL至约1.2mg/mL、约800μg/mL至约1.1mg/mL、约800μg/mL至约1.0mg/mL、约800μg/mL至约900μg/mL、约900μg/mL至约2mg/mL、约900μg/mL至约1.8mg/mL、约900μg/mL至约1.6mg/mL、约900μg/mL至约1.5mg/mL、约900μg/mL至约1.4mg/mL、约900μg/mL至约1.3mg/mL、约900μg/mL至约1.2mg/mL、约900μg/mL至约1.1mg/mL、约900μg/mL至约1.0mg/mL、约1.0mg/mL至约2mg/mL、约1.0mg/mL至约1.8mg/mL、约1.0mg/mL至约1.6mg/mL、约1.0mg/mL至约1.5mg/mL、约1.0mg/mL至约1.4mg/mL、约1.0mg/mL至约1.3mg/mL、约1.0mg/mL至约1.2mg/mL、约1.0mg/mL至约1.1mg/mL、约1.1mg/mL至约2mg/mL、约1.1mg/mL至约1.8mg/mL、约1.1mg/mL至约1.6mg/mL、约1.1mg/mL至约1.5mg/mL、约1.1mg/mL至约1.4mg/mL、约1.1mg/mL至约1.3mg/mL、约1.1mg/mL至约1.2mg/mL、约1.2mg/mL至约2mg/mL、约1.2mg/mL至约1.8mg/mL、约1.2mg/mL至约1.6mg/mL、约1.2mg/mL至约1.5mg/mL、约1.2mg/mL至约1.4mg/mL、约1.2mg/mL至约1.3mg/mL、约1.3mg/mL至约2mg/mL、约1.3mg/mL至约1.8mg/mL、约1.3mg/mL至约1.6mg/mL、约1.3mg/mL至约1.5mg/mL、约1.3mg/mL至约1.4mg/mL、约1.4mg/mL至约2mg/mL、约1.4mg/mL至约1.8mg/mL、约1.4mg/mL至约1.6mg/mL、约1.4mg/mL至约1.5mg/mL、约1.5mg/mL至约2mg/mL、约1.5mg/mL至约1.8mg/mL、约1.5mg/mL至约1.6mg/mL、约1.6mg/mL至约2mg/mL、约1.6mg/mL至约1.8mg/mL，或约1.8mg/mL至约2mg/mL的转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)。
在一些实例中，第四培养基包括约1ng/mL至约500ng/mL、约1ng/mL至约480ng/mL、约1ng/mL至约460ng/mL、约1ng/mL至约440ng/mL、约1ng/mL至约420ng/mL、约1ng/mL至约400ng/mL、约1ng/mL至约380ng/mL、约1ng/mL至约360ng/mL、约1ng/mL至约340ng/mL、约1ng/mL至约320ng/mL、约1ng/mL至约300ng/mL、约1ng/mL至约280ng/mL、约1ng/mL至约260ng/mL、约1ng/mL至约240ng/mL、约1ng/mL至约220ng/mL、约1ng/mL至约200ng/mL、约1ng/mL至约180ng/mL、约1ng/mL至约160ng/mL、约1ng/mL至约140ng/mL、约1ng/mL至约120ng/mL、约1ng/mL至约100ng/mL、约1ng/mL至约80ng/mL、约1ng/mL至约60ng/mL、约1ng/mL至约40ng/mL、约1ng/mL至约30ng/mL、约1ng/mL至约25ng/mL、约1ng/mL至约20ng/mL、约1ng/mL至约15ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约1ng/mL至约5ng/mL、5ng/mL至约500ng/mL、约5ng/mL至约480ng/mL、约5ng/mL至约460ng/mL、约5ng/mL至约440ng/mL、约5ng/mL至约420ng/mL、约5ng/mL至约400ng/mL、约5ng/mL至约380ng/mL、约5ng/mL至约360ng/mL、约5ng/mL至约340ng/mL、约5ng/mL至约320ng/mL、约5ng/mL至约300ng/mL、约5ng/mL至约280ng/mL、约5ng/mL至约260ng/mL、约5ng/mL至约240ng/mL、约5ng/mL至约220ng/mL、约5ng/mL至约200ng/mL、约5ng/mL至约180ng/mL、约5ng/mL至约160ng/mL、约5ng/mL至约140ng/mL、约5ng/mL至约120ng/mL、约5ng/mL至约100ng/mL、约5ng/mL至约80ng/mL、约5ng/mL至约60ng/mL、约5ng/mL至约40ng/mL、约5ng/mL至约30ng/mL、约5ng/mL至约25ng/mL、约5ng/mL至约20ng/mL、约5ng/mL至约15ng/mL、约5ng/mL至约10ng/mL、10ng/mL至约500ng/mL、约10ng/mL至约480ng/mL、约10ng/mL至约460ng/mL、约10ng/mL至约440ng/mL、约10ng/mL至约420ng/mL、约10ng/mL至约400ng/mL、约10ng/mL至约380ng/mL、约10ng/mL至约360ng/mL、约10ng/mL至约340ng/mL、约10ng/mL至约320ng/mL、约10ng/mL至约300ng/mL、约10ng/mL至约280ng/mL、约10ng/mL至约260ng/mL、约10ng/mL至约240ng/mL、约10ng/mL至约220ng/mL、约10ng/mL至约200ng/mL、约10ng/mL至约180ng/mL、约10ng/mL至约160ng/mL、约10ng/mL至约140ng/mL、约10ng/mL至约120ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约10ng/mL至约80ng/mL、约10ng/mL至约60ng/mL、约10ng/mL至约40ng/mL、约10ng/mL至约30ng/mL、约10ng/mL至约25ng/mL、约10ng/mL至约20ng/mL、约10ng/mL至约15ng/mL、15ng/mL至约500ng/mL、约15ng/mL至约480ng/mL、约15ng/mL至约460ng/mL、约15ng/mL至约440ng/mL、约15ng/mL至约420ng/mL、约15ng/mL至约400ng/mL、约15ng/mL至约380ng/mL、约15ng/mL至约360ng/mL、约15ng/mL至约340ng/mL、约15ng/mL至约320ng/mL、约15ng/mL至约300ng/mL、约15ng/mL至约280ng/mL、约15ng/mL至约260ng/mL、约15ng/mL至约240ng/mL、约15ng/mL至约220ng/mL、约15ng/mL至约200ng/mL、约15ng/mL至约180ng/mL、约15ng/mL至约160ng/mL、约15ng/mL至约140ng/mL、约15ng/mL至约120ng/mL、约15ng/mL至约100ng/mL、约15ng/mL至约80ng/mL、约15ng/mL至约60ng/mL、约15ng/mL至约40ng/mL、约15ng/mL至约30ng/mL、约15ng/mL至约25ng/mL、约15ng/mL至约20ng/mL、20ng/mL至约500ng/mL、约20ng/mL至约480ng/mL、约20ng/mL至约460ng/mL、约20ng/mL至约440ng/mL、约20ng/mL至约420ng/mL、约20ng/mL至约400ng/mL、约20ng/mL至约380ng/mL、约20ng/mL至约360ng/mL、约20ng/mL至约340ng/mL、约20ng/mL至约320ng/mL、约20ng/mL至约300ng/mL、约20ng/mL至约280ng/mL、约20ng/mL至约260ng/mL、约20ng/mL至约240ng/mL、约20ng/mL至约220ng/mL、约20ng/mL至约200ng/mL、约20ng/mL至约180ng/mL、约20ng/mL至约160ng/mL、约20ng/mL至约140ng/mL、约20ng/mL至约120ng/mL、约20ng/mL至约100ng/mL、约20ng/mL至约80ng/mL、约20ng/mL至约60ng/mL、约20ng/mL至约40ng/mL、约20ng/mL至约30ng/mL、约20ng/mL至约25ng/mL、25ng/mL至约500ng/mL、约25ng/mL至约480ng/mL、约25ng/mL至约460ng/mL、约25ng/mL至约440ng/mL、约25ng/mL至约420ng/mL、约25ng/mL至约400ng/mL、约25ng/mL至约380ng/mL、约25ng/mL至约360ng/mL、约25ng/mL至约340ng/mL、约25ng/mL至约320ng/mL、约25ng/mL至约300ng/mL、约25ng/mL至约280ng/mL、约25ng/mL至约260ng/mL、约25ng/mL至约240ng/mL、约25ng/mL至约220ng/mL、约25ng/mL至约200ng/mL、约25ng/mL至约180ng/mL、约25ng/mL至约160ng/mL、约25ng/mL至约140ng/mL、约25ng/mL至约120ng/mL、约25ng/mL至约100ng/mL、约25ng/mL至约80ng/mL、约25ng/mL至约60ng/mL、约25ng/mL至约40ng/mL、约25ng/mL至约30ng/mL、30ng/mL至约500ng/mL、约30ng/mL至约480ng/mL、约30ng/mL至约460ng/mL、约30ng/mL至约440ng/mL、约30ng/mL至约420ng/mL、约30ng/mL至约400ng/mL、约30ng/mL至约380ng/mL、约30ng/mL至约360ng/mL、约30ng/mL至约340ng/mL、约30ng/mL至约320ng/mL、约30ng/mL至约300ng/mL、约30ng/mL至约280ng/mL、约30ng/mL至约260ng/mL、约30ng/mL至约240ng/mL、约30ng/mL至约220ng/mL、约30ng/mL至约200ng/mL、约30ng/mL至约180ng/mL、约30ng/mL至约160ng/mL、约30ng/mL至约140ng/mL、约30ng/mL至约120ng/mL、约30ng/mL至约100ng/mL、约30ng/mL至约80ng/mL、约30ng/mL至约60ng/mL、约30ng/mL至约40ng/mL、40ng/mL至约500ng/mL、约40ng/mL至约480ng/mL、约40ng/mL至约460ng/mL、约40ng/mL至约440ng/mL、约40ng/mL至约420ng/mL、约40ng/mL至约400ng/mL、约40ng/mL至约380ng/mL、约40ng/mL至约360ng/mL、约40ng/mL至约340ng/mL、约40ng/mL至约320ng/mL、约40ng/mL至约300ng/mL、约40ng/mL至约280ng/mL、约40ng/mL至约260ng/mL、约40ng/mL至约240ng/mL、约40ng/mL至约220ng/mL、约40ng/mL至约200ng/mL、约40ng/mL至约180ng/mL、约40ng/mL至约160ng/mL、约40ng/mL至约140ng/mL、约40ng/mL至约120ng/mL、约40ng/mL至约100ng/mL、约40ng/mL至约80ng/mL、约40ng/mL至约60ng/mL、60ng/mL至约500ng/mL、约60ng/mL至约480ng/mL、约60ng/mL至约460ng/mL、约60ng/mL至约440ng/mL、约60ng/mL至约420ng/mL、约60ng/mL至约400ng/mL、约60ng/mL至约380ng/mL、约60ng/mL至约360ng/mL、约60ng/mL至约340ng/mL、约60ng/mL至约320ng/mL、约60ng/mL至约300ng/mL、约60ng/mL至约280ng/mL、约60ng/mL至约260ng/mL、约60ng/mL至约240ng/mL、约60ng/mL至约220ng/mL、约60ng/mL至约200ng/mL、约60ng/mL至约180ng/mL、约60ng/mL至约160ng/mL、约60ng/mL至约140ng/mL、约60ng/mL至约120ng/mL、约60ng/mL至约100ng/mL、约60ng/mL至约80ng/mL、80ng/mL至约500ng/mL、约80ng/mL至约480ng/mL、约80ng/mL至约460ng/mL、约80ng/mL至约440ng/mL、约80ng/mL至约420ng/mL、约80ng/mL至约400ng/mL、约80ng/mL至约380ng/mL、约80ng/mL至约360ng/mL、约80ng/mL至约340ng/mL、约80ng/mL至约320ng/mL、约80ng/mL至约300ng/mL、约80ng/mL至约280ng/mL、约80ng/mL至约260ng/mL、约80ng/mL至约240ng/mL、约80ng/mL至约220ng/mL、约80ng/mL至约200ng/mL、约80ng/mL至约180ng/mL、约80ng/mL至约160ng/mL、约80ng/mL至约140ng/mL、约80ng/mL至约120ng/mL、约80ng/mL至约100ng/mL、100ng/mL至约500ng/mL、约100ng/mL至约480ng/mL、约100ng/mL至约460ng/mL、约100ng/mL至约440ng/mL、约100ng/mL至约420ng/mL、约100ng/mL至约400ng/mL、约100ng/mL至约380ng/mL、约100ng/mL至约360ng/mL、约100ng/mL至约340ng/mL、约100ng/mL至约320ng/mL、约100ng/mL至约300ng/mL、约100ng/mL至约280ng/mL、约100ng/mL至约260ng/mL、约100ng/mL至约240ng/mL、约100ng/mL至约220ng/mL、约100ng/mL至约200ng/mL、约100ng/mL至约180ng/mL、约100ng/mL至约160ng/mL、约100ng/mL至约140ng/mL、约100ng/mL至约120ng/mL、120ng/mL至约500ng/mL、约120ng/mL至约480ng/mL、约120ng/mL至约460ng/mL、约120ng/mL至约440ng/mL、约120ng/mL至约420ng/mL、约120ng/mL至约400ng/mL、约120ng/mL至约380ng/mL、约120ng/mL至约360ng/mL、约120ng/mL至约340ng/mL、约120ng/mL至约320ng/mL、约120ng/mL至约300ng/mL、约120ng/mL至约280ng/mL、约120ng/mL至约260ng/mL、约120ng/mL至约240ng/mL、约120ng/mL至约220ng/mL、约120ng/mL至约200ng/mL、约120ng/mL至约180ng/mL、约120ng/mL至约160ng/mL、约120ng/mL至约140ng/mL、140ng/mL至约500ng/mL、约140ng/mL至约480ng/mL、约140ng/mL至约460ng/mL、约140ng/mL至约440ng/mL、约140ng/mL至约420ng/mL、约140ng/mL至约400ng/mL、约140ng/mL至约380ng/mL、约140ng/mL至约360ng/mL、约140ng/mL至约340ng/mL、约140ng/mL至约320ng/mL、约140ng/mL至约300ng/mL、约140ng/mL至约280ng/mL、约140ng/mL至约260ng/mL、约140ng/mL至约240ng/mL、约140ng/mL至约220ng/mL、约140ng/mL至约200ng/mL、约140ng/mL至约180ng/mL、约140ng/mL至约160ng/mL、160ng/mL至约500ng/mL、约160ng/mL至约480ng/mL、约160ng/mL至约460ng/mL、约160ng/mL至约440ng/mL、约160ng/mL至约420ng/mL、约160ng/mL至约400ng/mL、约160ng/mL至约380ng/mL、约160ng/mL至约360ng/mL、约160ng/mL至约340ng/mL、约160ng/mL至约320ng/mL、约160ng/mL至约300ng/mL、约160ng/mL至约280ng/mL、约160ng/mL至约260ng/mL、约160ng/mL至约240ng/mL、约160ng/mL至约220ng/mL、约160ng/mL至约200ng/mL、约160ng/mL至约180ng/mL、180ng/mL至约500ng/mL、约180ng/mL至约480ng/mL、约180ng/mL至约460ng/mL、约180ng/mL至约440ng/mL、约180ng/mL至约420ng/mL、约180ng/mL至约400ng/mL、约180ng/mL至约380ng/mL、约180ng/mL至约360ng/mL、约180ng/mL至约340ng/mL、约180ng/mL至约320ng/mL、约180ng/mL至约300ng/mL、约180ng/mL至约280ng/mL、约180ng/mL至约260ng/mL、约180ng/mL至约240ng/mL、约180ng/mL至约220ng/mL、约180ng/mL至约200ng/mL、200ng/mL至约500ng/mL、约200ng/mL至约480ng/mL、约200ng/mL至约460ng/mL、约200ng/mL至约440ng/mL、约200ng/mL至约420ng/mL、约200ng/mL至约400ng/mL、约200ng/mL至约380ng/mL、约200ng/mL至约360ng/mL、约200ng/mL至约340ng/mL、约200ng/mL至约320ng/mL、约200ng/mL至约300ng/mL、约200ng/mL至约280ng/mL、约200ng/mL至约260ng/mL、约200ng/mL至约240ng/mL、约200ng/mL至约220ng/mL、220ng/mL至约500ng/mL、约220ng/mL至约480ng/mL、约220ng/mL至约460ng/mL、约220ng/mL至约440ng/mL、约220ng/mL至约420ng/mL、约220ng/mL至约300ng/mL、约220ng/mL至约380ng/mL、约220ng/mL至约360ng/mL、约220ng/mL至约340ng/mL、约220ng/mL至约320ng/mL、约220ng/mL至约400ng/mL、约220ng/mL至约280ng/mL、约220ng/mL至约260ng/mL、约220ng/mL至约240ng/mL、240ng/mL至约500ng/mL、约240ng/mL至约480ng/mL、约240ng/mL至约460ng/mL、约240ng/mL至约440ng/mL、约240ng/mL至约420ng/mL、约240ng/mL至约400ng/mL、约240ng/mL至约380ng/mL、约240ng/mL至约360ng/mL、约240ng/mL至约340ng/mL、约240ng/mL至约320ng/mL、约240ng/mL至约300ng/mL、约240ng/mL至约280ng/mL、约240ng/mL至约260ng/mL、260ng/mL至约500ng/mL、约260ng/mL至约480ng/mL、约260ng/mL至约460ng/mL、约260ng/mL至约440ng/mL、约260ng/mL至约420ng/mL、约260ng/mL至约400ng/mL、约260ng/mL至约380ng/mL、约260ng/mL至约360ng/mL、约260ng/mL至约340ng/mL、约260ng/mL至约320ng/mL、约260ng/mL至约300ng/mL、约260ng/mL至约280ng/mL、280ng/mL至约500ng/mL、约280ng/mL至约480ng/mL、约280ng/mL至约460ng/mL、约280ng/mL至约440ng/mL、约280ng/mL至约420ng/mL、约280ng/mL至约400ng/mL、约280ng/mL至约380ng/mL、约280ng/mL至约360ng/mL、约280ng/mL至约340ng/mL、约280ng/mL至约320ng/mL、约280ng/mL至约300ng/mL、300ng/mL至约500ng/mL、约300ng/mL至约480ng/mL、约300ng/mL至约460ng/mL、约300ng/mL至约440ng/mL、约300ng/mL至约420ng/mL、约300ng/mL至约400ng/mL、约300ng/mL至约380ng/mL、约300ng/mL至约360ng/mL、约300ng/mL至约340ng/mL、约300ng/mL至约320ng/mL、320ng/mL至约500ng/mL、约320ng/mL至约480ng/mL、约320ng/mL至约460ng/mL、约320ng/mL至约440ng/mL、约320ng/mL至约420ng/mL、约320ng/mL至约400ng/mL、约320ng/mL至约380ng/mL、约320ng/mL至约360ng/mL、约320ng/mL至约340ng/mL、340ng/mL至约500ng/mL、约340ng/mL至约480ng/mL、约340ng/mL至约460ng/mL、约340ng/mL至约440ng/mL、约340ng/mL至约420ng/mL、约340ng/mL至约400ng/mL、约340ng/mL至约380ng/mL、约340ng/mL至约360ng/mL、360ng/mL至约500ng/mL、约360ng/mL至约480ng/mL、约360ng/mL至约460ng/mL、约360ng/mL至约440ng/mL、约360ng/mL至约420ng/mL、约360ng/mL至约400ng/mL、约360ng/mL至约380ng/mL、380ng/mL至约500ng/mL、约380ng/mL至约480ng/mL、约380ng/mL至约460ng/mL、约380ng/mL至约440ng/mL、约380ng/mL至约420ng/mL、约380ng/mL至约400ng/mL、400ng/mL至约500ng/mL、约400ng/mL至约480ng/mL、约400ng/mL至约460ng/mL、约400ng/mL至约440ng/mL、约400ng/mL至约420ng/mL、420ng/mL至约500ng/mL、约420ng/mL至约480ng/mL、约420ng/mL至约460ng/mL、约420ng/mL至约440ng/mL、440ng/mL至约500ng/mL、约440ng/mL至约480ng/mL、约440ng/mL至约460ng/mL、约460ng/mL至约500ng/mL、约460ng/mL至约480ng/mL，或约480ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽。本文描述了EPO模拟肽的非限制性示例。EPO模拟肽的其他实例在本领域已知。
在一些实施方案中，第四培养基包括约0.1μg/mL至约50μg/mL、约0.1μg/mL至约45μg/mL、约0.1μg/mL至约40μg/mL、约0.1μg/mL至约35μg/mL、约0.1μg/mL至约30μg/mL、约0.1μg/mL至约25μg/mL、约0.1μg/mL至约20μg/mL、约0.1μg/mL约15μg/mL、约0.1μg/mL至约10μg/mL、约0.1μg/mL至约5μg/mL、约0.1μg/mL至约2μg/mL、约0.1μg/mL至约1μg/mL、约1μg/mL至约50μg/mL、约1μg/mL至约45μg/mL、约1μg/mL至约40μg/mL、约1μg/mL至约35μg/mL、约1μg/mL至约30μg/mL、约1μg/mL至约25μg/mL、约1μg/mL至约20μg/mL、约1μg/mL约15μg/mL、约1μg/mL至约10μg/mL、约1μg/mL至约5μg/mL、约1μg/mL至约2μg/mL、约2μg/mL至约50μg/mL、约2μg/mL至约45μg/mL、约2μg/mL至约40μg/mL、约2μg/mL至约35μg/mL、约2μg/mL至约30μg/mL、约2μg/mL至约25μg/mL、约2μg/mL至约20μg/mL、约2μg/mL约15μg/mL、约2μg/mL至约10μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约5μg/mL至约50μg/mL、约5μg/mL至约45μg/mL、约5μg/mL至约40μg/mL、约5μg/mL至约35μg/mL、约5μg/mL至约30μg/mL、约5μg/mL至约25μg/mL、约5μg/mL至约20μg/mL、约5μg/mL约15μg/mL、约5μg/mL至约10μg/mL、约10μg/mL至约50μg/mL、约10μg/mL至约45μg/mL、约10μg/mL至约40μg/mL、约10μg/mL至约35μg/mL、约10μg/mL至约30μg/mL、约10μg/mL至约25μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约10μg/mL约15μg/mL、约15μg/mL至约50μg/mL、约15μg/mL至约45μg/mL、约15μg/mL至约40μg/mL、约15μg/mL至约35μg/mL、约15μg/mL至约30μg/mL、约15μg/mL至约25μg/mL、约15μg/mL至约20μg/mL、约20μg/mL至约50μg/mL、约20μg/mL至约45μg/mL、约20μg/mL至约40μg/mL、约20μg/mL至约35μg/mL、约20μg/mL至约30μg/mL、约20μg/mL至约25μg/mL、约25μg/mL至约50μg/mL、约25μg/mL至约45μg/mL、约25μg/mL至约40μg/mL、约25μg/mL至约35μg/mL、约25μg/mL至约30μg/mL、约30μg/mL至约50μg/mL、约30μg/mL至约45μg/mL、约30μg/mL至约40μg/mL、约30μg/mL至约35μg/mL、约35μg/mL至约50μg/mL、约35μg/mL至约45μg/mL、约35μg/mL至约40μg/mL、约40μg/mL至约50μg/mL、约40μg/mL至约45μg/mL，或约45μg/mL至约50μg/mL的胰岛素(例如，人胰岛素)。
在一些实施方案中，灌注培养包括使用切向过滤(例如，切向流过滤(TFF)或交替切向过滤(ATF))。在一些实施方案中，切向过滤(例如，TFF或ATF)包括使用一个或多个具有约10nm至约6.0μM(或本文所述的这个范围的任何子范围)的平均孔径的过滤器。
在一些实例中，第四培养基可以是例如化学成分确定的液体培养基、无动物成分的液体培养基、或化学成分确定的无动物成分的液体培养基，和/或无血清的液体培养基。
在一些实施方案中，一旦第一细胞培养物达到特定的靶细胞密度，例如，约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始灌注第三细胞培养物。
在一些实施方案中，步骤(d)的灌注培养进行约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天，或约14天至约15天。
在一些实施方案中，步骤(d)产生以下的细胞密度：约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约8x106个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约6x106个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约8x106个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约6x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约6x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约8x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL。
分批或补料分批培养
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，步骤(d)包括分批或补料分批培养第三细胞培养物(例如，在具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶、摇管、培养袋或生物反应器中的本文所述的任何示例性第三细胞培养物)约5天至约20天(例如，约5天至约19天、约5天至约18天、约5天至约17天、约5天至约16天、约5天至约15天、约5天至约14天、约5天至约13天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约20天、约6天至约19天、约6天至约18天、约6天至约17天、约6天至约16天、约6天至约15天、约6天至约14天、约6天至约13天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约20天、约7天至约19天、约7天至约18天、约7天至约17天、约7天至约16天、约7天至约15天、约7天至约14天、约7天至约13天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约20天、约8天至约19天、约8天至约18天、约8天至约17天、约8天至约16天、约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约20天、约9天至约19天、约9天至约18天、约9天至约17天、约9天至约16天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约20天、约10天至约19天、约10天至约18天、约10天至约17天、约10天至约16天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约20天、约11天至约19天、约11天至约18天、约11天至约17天、约11天至约16天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约20天、约12天至约19天、约12天至约18天、约12天至约17天、约12天至约16天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约20天、约13天至约19天、约13天至约18天、约13天至约17天、约13天至约16天、约13天至约15天、约13天至约14天、约14天至约20天、约14天至约19天、约14天至约18天、约14天至约17天、约14天至约16天、约14天至约15天、约15天至约20天、约15天至约19天、约15天至约18天、约15天至约17天、约15天至约16天、约16天至约20天、约16天至约19天、约16天至约18天、约16天至约17天、约17天至约20天、约17天至约19天、约17天至约18天、约18天至约20天、约18天至约19天，或约19天至约20天)，其中在步骤(d)之后，第三培养基包括去核红系细胞群(例如，本文所述的任何示例性去核红系细胞)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括分批或补料分批培养布置在生物反应器(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性生物反应器)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在此类实施方案中，步骤(d)包括在生物反应器中以约10W/m3至约200W/m3(或本文所述的这个范围的任何子范围)的P/V值搅动温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括分批或补料分批培养布置在摇瓶(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇瓶)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在此类实施方案中，步骤(d)包括在摇瓶中以约0.1xg至约50xg(例如，或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括分批或补料分批培养布置在摇管(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性摇管(例如，锥形容器))中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在此类实施方案中，步骤(d)包括在摇管中以约0.1xg至约50xg(例如，或本文所述的这个范围的任何子范围)温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括分批或补料分批培养布置到培养袋(例如，具有本文所述任何示例性体积的本文所述的任何示例性培养袋)中的第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在此类实施方案中，步骤(d)包括以每分钟10个摇摆循环至每分钟约50个摇摆循环(或本文所述的这个范围的任何子范围)的摇摆速率温育第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括分批培养第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。
在一些实施方案中，步骤(d)包括补料分批培养第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在一些实施方案中，步骤(d)中的补料分批培养包括随时间添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)和/或第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在一些实例，将额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)和/或第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)随时间连续添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在一些实例中，将额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)和/或第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)随时间定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次或一天十二次)添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)。在一些实施方案中，在每个24小时增量中，步骤(c)后立即添加约0.1x至约10x(例如，约0.1x至约9.5x、约0.1x至约9.0x、约0.1x至约8.5x、约0.1x至约8.0x、约0.1x至约7.5x、约0.1x至约7.0x、约0.1x至约6.5x、约0.1x至约6.0x、约0.1x至约5.5x、约0.1x至约5.0x、约0.1x至约4.5x、约0.1x至约4.0x、约0.1x至约3.5x、约0.1x至约3.0x、约0.1x至约2.5x、约0.1x至约2.0x、约0.1x至约1.5x、约0.1x至约1.0x、约0.1x至约0.5x、约0.1x至约0.3x、约0.1x至约0.2x、约0.2x至约10x、约0.2x至约9.5x、约0.2x至约9.0x、约0.2x至约8.5x、约0.2x至约8.0x、约0.2x至约7.5x、约0.2x至约7.0x、约0.2x至约6.5x、约0.2x至约6.0x、约0.2x至约5.5x、约0.2x至约5.0x、约0.2x至约4.5x、约0.2x至约4.0x、约0.2x至约3.5x、约0.2x至约3.0x、约0.2x至约2.5x、约0.2x至约2.0x、约0.2x至约1.5x、约0.2x至约1.0x、约0.2x至约0.5x、约0.2x至约0.3x、约0.3x至约10x、约0.3x至约9.5x、约0.3x至约9.0x、约0.3x至约8.5x、约0.3x至约8.0x、约0.3x至约7.5x、约0.3x至约7.0x、约0.3x至约6.5x、约0.3x至约6.0x、约0.3x至约5.5x、约0.3x至约5.0x、约0.3x至约4.5x、约0.3x至约4.0x、约0.3x至约3.5x、约0.3x至约3.0x、约0.3x至约2.5x、约0.3x至约2.0x、约0.3x至约1.5x、约0.3x至约1.0x、约0.3x至约0.5x、约0.5x至约10x、约0.5x至约9.5x、约0.5x至约9.0x、约0.5x至约8.5x、约0.5x至约8.0x、约0.5x至约7.5x、约0.5x至约7.0x、约0.5x至约6.5x、约0.5x至约6.0x、约0.5x至约5.5x、约0.5x至约5.0x、约0.5x至约4.5x、约0.5x至约4.0x、约0.5x至约3.5x、约0.5x至约3.0x、约0.5x至约2.5x、约0.5x至约2.0x、约0.5x至约1.5x、约0.5x至约1.0x、约1.0x至约10x、约1.0x至约9.5x、约1.0x至约9.0x、约1.0x至约8.5x、约1.0x至约8.0x、约1.0x至约7.5x、约1.0x至约7.0x、约1.0x至约6.5x、约1.0x至约6.0x、约1.0x至约5.5x、约1.0x至约5.0x、约1.0x至约4.5x、约1.0x至约4.0x、约1.0x至约3.5x、约1.0x至约3.0x、约1.0x至约2.5x、约1.0x至约2.0x、约1.0x至约1.5x、约1.5x至约10x、约1.5x至约9.5x、约1.5x至约9.0x、约1.5x至约8.5x、约1.5x至约8.0x、约1.5x至约7.5x、约1.5x至约7.0x、约1.5x至约6.5x、约1.5x至约6.0x、约1.5x至约5.5x、约1.5x至约5.0x、约1.5x至约4.5x、约1.5x至约4.0x、约1.5x至约3.5x、约1.5x至约3.0x、约1.5x至约2.5x、约1.5x至约2.0x、约2.0x至约10x、约2.0x至约9.5x、约2.0x至约9.0x、约2.0x至约8.5x、约2.0x至约8.0x、约2.0x至约7.5x、约2.0x至约7.0x、约2.0x至约6.5x、约2.0x至约6.0x、约2.0x至约5.5x、约2.0x至约5.0x、约2.0x至约4.5x、约2.0x至约4.0x、约2.0x至约3.5x、约2.0x至约3.0x、约2.0x至约2.5x、约2.5x至约10x、约2.5x至约9.5x、约2.5x至约9.0x、约2.5x至约8.5x、约2.5x至约8.0x、约2.5x至约7.5x、约2.5x至约7.0x、约2.5x至约6.5x、约2.5x至约6.0x、约2.5x至约5.5x、约2.5x至约5.0x、约2.5x至约4.5x、约2.5x至约4.0x、约2.5x至约3.5x、约2.5x至约3.0x、约3.0x至约10x、约3.0x至约9.5x、约3.0x至约9.0x、约3.0x至约8.5x、约3.0x至约8.0x、约3.0x至约7.5x、约3.0x至约7.0x、约3.0x至约6.5x、约3.0x至约6.0x、约3.0x至约5.5x、约3.0x至约5.0x、约3.0x至约4.5x、约3.0x至约4.0x、约3.0x至约3.5x、约3.5x至约10x、约3.5x至约9.5x、约3.5x至约9.0x、约3.5x至约8.5x、约3.5x至约8.0x、约3.5x至约7.5x、约3.5x至约7.0x、约3.5x至约6.5x、约3.5x至约6.0x、约3.5x至约5.5x、约3.5x至约5.0x、约3.5x至约4.5x、约3.5x至约4.0x、约4.0x至约10x、约4.0x至约9.5x、约4.0x至约9.0x、约4.0x至约8.5x、约4.0x至约8.0x、约4.0x至约7.5x、约4.0x至约7.0x、约4.0x至约6.5x、约4.0x至约6.0x、约4.0x至约5.5x、约4.0x至约5.0x、约4.0x至约4.5x、约4.5x至约10x、约4.5x至约9.5x、约4.5x至约9.0x、约4.5x至约8.5x、约4.5x至约8.0x、约4.5x至约7.5x、约4.5x至约7.0x、约4.5x至约6.5x、约4.5x至约6.0x、约4.5x至约5.5x、约4.5x至约5.0x、约5.0x至约10x、约5.0x至约9.5x、约5.0x至约9.0x、约5.0x至约8.5x、约5.0x至约8.0x、约5.0x至约7.5x、约5.0x至约7.0x、约5.0x至约6.5x、约5.0x至约6.0x、约5.0x至约5.5x、约5.5x至约10x、约5.5x至约9.5x、约5.5x至约9.0x、约5.5x至约8.5x、约5.5x至约8.0x、约5.5x至约7.5x、约5.5x至约7.0x、约5.5x至约6.5x、约5.5x至约6.0x、约6.0x至约10x、约6.0x至约9.5x、约6.0x至约9.0x、约6.0x至约8.5x、约6.0x至约8.0x、约6.0x至约7.5x、约6.0x至约7.0x、约6.0x至约6.5x、约6.5x至约10x、约6.5x至约9.5x、约6.5x至约9.0x、约6.5x至约8.5x、约6.5x至约8.0x、约6.5x至约7.5x、约6.5x至约7.0x、约7.0x至约10x、约7.0x至约9.5x、约7.0x至约9.0x、约7.0x至约8.5x、约7.0x至约8.0x、约7.0x至约7.5x、约7.5x至约10x、约7.5x至约9.5x、约7.5x至约9.0x、约7.5x至约8.5x、约7.5x至约8.0x、约8.0x至约10x、约8.0x至约9.5x、约8.0x至约9.0x、约8.0x至约8.5x、约8.5x至约10x、约8.5x至约9.5x、约8.5x至约9.0x、约9.0x至约10x、约9.0x至约9.5x，或约9.5x至约10x)的体积的第三细胞培养物。在一些实施方案中，一旦第三细胞培养物达到特定的目标细胞密度，例如，约1.0x106个细胞/mL、约1.5x106个细胞/mL、约2.0x106个细胞/mL、约2.5x106个细胞/mL、约3.0x106个细胞/mL、约3.5x106个细胞/mL、约4.0x106个细胞/mL、约4.5x106个细胞/mL、约5.0x106个细胞/mL、约5.5x106个细胞/mL、约6.0x106个细胞/mL、约6.5x106个细胞/mL、约7.0x106个细胞/mL、约7.5x106个细胞/mL、约8.0x106个细胞/mL、约8.5x106个细胞/mL、约9.0x106个细胞/mL、约9.5x106个细胞/mL，或约1.0x107个细胞/mL，则开始添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的示例性第三培养基中的任一种)和/或第四培养基(例如，本文所述的示例性第四培养基中的任一种)至第三细胞培养物。
在一些实例中，第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)包括以下的一种或多种(例如，两种、三种或四种)：转铁蛋白(例如，约1μg/mL至约500μg/mL转铁蛋白(例如，人脱铁运铁蛋白、人全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素(例如，重组人胰岛素)或本文所述的这个范围的任何子范围)、SCF(例如，约1ng/mL至约500ng/mL SCF(例如，重组人SCF)或本文所述的这个范围的任何子范围)，和EPO或EPO模拟肽(例如，约1ng/mL至约500ng/mL EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性EPO模拟肽)，或本文所述的这个范围的任何子范围)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包括约0.1％v/v至约10％v/v(例如本文所述的这个范围的任何子范围)血清(例如，人AB血清)。在本文所述的任何第三培养基的一些实施方案中，第三培养基包括约1mM至约8mM(例如本文所述的这个范围的任何子范围)L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。
在一些实例中，步骤(d)中的补料分批培养包括：(i)添加额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基中)至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；(ii)添加额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
在一些实施方案中，将(i)中额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)连续添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；和/或将(ii)中额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)连续添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
在一些实例中，将(i)中额外体积的第三培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基)定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第一时间段；和/或(ii)将(ii)中额外体积的第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)定期(例如，三天一次、两天一次、一天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次、一天六次、一天七次、一天八次、一天九次、一天十次、一天十一次，或一天十二次)添加至第三细胞培养物(例如，本文所述的任何示例性第三细胞培养物)持续第二时间段。
培养基(例如，本文所述的任何示例性第三培养基和/或本文所述的任何示例性第四培养基)的添加可以机械地，例如使用蠕动泵进行，或手动地(例如，通过无菌移液)进行。
在一些实例中，(i)中的第一时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天，或约11天至约12天。
在一些实例中，(ii)中的第二时间段为约1天至约12天、约1天至约11天、约1天至约10天、约1天至约9天、约1天至约8天、约1天至约7天、约1天至约6天、约1天至约5天、约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天、约2天至约7天、约2天至约6天、约2天至约5天、约2天至约4天、约2天至约3天、约3天至约12天、约3天至约11天、约3天至约10天、约3天至约9天、约3天至约8天、约3天至约7天、约3天至约6天、约3天至约5天、约3天至约4天、约4天至约12天、约4天至约11天、约4天至约10天、约4天至约9天、约4天至约8天、约4天至约7天、约4天至约6天、约4天至约5天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天、约5天至约7天、约5天至约6天、约6天至约12天、约6天至约11天、约6天至约10天、约6天至约9天、约6天至约8天、约6天至约7天、约7天至约12天、约7天至约11天、约7天至约10天、约7天至约9天、约7天至约8天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约12天、约10天至约11天，或约11天至约12天。
在这些方法的一些实例中，第四培养基(例如，本文所述的任何示例性第四培养基)包括以下的一种或多种(例如，一种、两种或三种)：转铁蛋白(例如，约100μg/mL至约2mg/mL转铁蛋白(例如，脱铁运铁蛋白、全转铁蛋白或其组合)或本文所述的这个范围的任何子范围)、红细胞生成素(EPO)或模拟EPO肽(例如，本文所述的任何示例性EPO模拟肽)(例如，约1ng/mL至约500ng/mL的EPO(例如，重组人EPO)或EPO模拟肽或本文所述的这个范围的任何子范围)和胰岛素(例如，约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素或本文所述的这个范围的任何子范围)。在本文所述的任何第四培养基的一些实施方案中，第四培养基包括约0.1％v/v至约10％v/v(例如，本文所述的这个范围的任何子范围)血清(例如，人AB血清)。在本文所述的任何第四培养基的一些实施方案中，第四培养基包括约1mM至约8mM(例如，本文所述的这个范围的任何子范围)的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
在一些实施方案中，步骤(d)的分批或补料分批培养进行约8天至约15天、约8天至约14天、约8天至约13天、约8天至约12天、约8天至约11天、约8天至约10天、约8天至约9天、约9天至约15天、约9天至约14天、约9天至约13天、约9天至约12天、约9天至约11天、约9天至约10天、约10天至约15天、约10天至约14天、约10天至约13天、约10天至约12天、约10天至约11天、约11天至约15天、约11天至约14天、约11天至约13天、约11天至约12天、约12天至约15天、约12天至约14天、约12天至约13天、约13天至约15天、约13天至约14天，或约14天至约15天。
在一些实施方案中，步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL(或任何以下范围：约5x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约8x106个去核红系细胞/mL、约5x106个去核红系细胞/mL至约6x106个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约6x106个去核红系细胞/mL至约8x106个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约8x106个去核红系细胞/mL至约1x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约1x107个去核红系细胞/mL至约2x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约2x107个去核红系细胞/mL至约4x107个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约4x107个去核红系细胞/mL至约6x107个去核红系细胞/mL、约6x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL、约6x107个去核红系细胞/mL至约8x107个去核红系细胞/mL、约8x107个去核红系细胞/mL至约1x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
去核红系细胞
在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)对一种或多种次要血型抗原呈阴性(即不包括种或多种次要血型抗原)，例如Le(a-b-)(对于Lewis抗原系统)、Fy(a-b-)(对于Duffy系统)、Jk(a-b-)(对于Kidd系统)、M-N-(对于MNS系统)、K-k-(对于Kell系统)、Lu(a-b-)(对于Lutheran系统)和H抗原阴性(孟买表型)或其任何组合。在一些实施方案中，去核红系细胞也是O型和/或Rh-型。例如，次要血型描述于Agarwal et al.,“Blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary carehospital in north India,”Blood Res.48(1):51–54,2013和Mitra et al.,“Bloodgroups systems,”Indian J.Anaesth.58(5):524–528,2014中，其描述通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)展现出与不包含外源性蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何外源性蛋白质)的分离的、未培养的去核红系细胞基本上相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，去核红系细胞群在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％NaCl下具有小于50％细胞裂解的渗透脆性。在一些实施方案中，使用WO 2015/073587的实施例59中描述的方法(其描述通过引用并入本文)测定渗透脆性。
在一些实施方案中，去核红系细胞(例如，人去核红系细胞)具有与野生型、未处理的去核红系细胞大致相同的直径或体积。在一些实施方案中，去核红系细胞群(例如，人去核红系细胞)具有以下的平均直径：约4、5、6、7、8、9、10、11或12微米，或约4.0至约12.0微米、约4.0至约11.5微米、约4.0至约11.0微米、约4.0至约10.5微米、约4.0至约10微米、约4.0至约9.5微米、约4.0至约9.0微米、约4.0至约8.5微米、约4.0至约8.0微米、约4.0至约7.5微米、约4.0至约7.0微米、约4.0至约6.5微米、约4.0至约6.0微米、约4.0至约5.5微米、约4.0至约5.0微米、约4.0至约4.5微米、约4.5至约12.0微米、约4.5至约11.5微米、约4.5至约11.0微米、约4.5至约10.5微米、约4.5至约10.0微米、约4.5至约9.5微米、约4.5至约9.0微米、约4.5至约8.5微米、约4.5至约8.0微米、约4.5至约7.5微米、约4.5至约7.0微米、约4.5至约6.5微米、约4.5至约6.0微米、约4.5至约5.5微米、约4.5至约5.0微米、约5.0至约12.0微米、约5.0至约11.5微米、约5.0至约11.0微米、约5.0至约10.5微米、约5.0至约10.0微米、约5.0至约9.5微米、约5.0至约9.0微米、约5.0至约8.5微米、约5.0至约8.0微米、约5.0至约7.5微米、约5.0至约7.0微米、约5.0至约6.5微米、约5.0至约6.0微米、约5.0至约5.5微米、约5.5至约12.0微米、约5.5至约11.5微米、约5.5至约11.0微米、约5.5至约10.5微米、约5.5至约10.0微米、约5.5至约9.5微米、约5.5至约9.0微米、约5.5至约8.5微米、约5.5至约8.0微米、约5.5至约7.5微米、约5.5至约7.0微米、约5.5至约6.5微米、约5.5至约6.0微米、约6.0至约12.0微米、约6.0至约11.5微米、约6.0至约11.0微米、约6.0至约10.5微米、约6.0至约10.0微米、约6.0至约9.5微米、约6.0至约9.0微米、约6.0至约8.5微米、约6.0至约8.0微米、约6.0至约7.5微米、约6.0至约7.0微米、约6.0至约6.5微米、约6.5至约12.0微米、约6.5至约11.5微米、约6.5至约11.0微米、约6.5至约10.5微米、约6.5至约10.0微米、约6.5至约9.5微米、约6.5至约9.0微米、约6.5至约8.5微米、约6.5至约8.0微米、约6.5至约7.5微米、约6.5至约7.0微米、约7.0至约12.0微米、约7.0至约11.5微米、约7.0至约11.0微米、约7.0至约10.5微米、约7.0至约10.0微米、约7.0至约9.5微米、约7.0至约9.0微米、约7.0至约8.5微米、约7.0至约8.0微米、约7.0至约7.5微米、约7.5至约12.0微米、约7.5至约11.5微米、约7.5至约11.0微米、约7.5至约10.5微米、约7.5至约10.0微米、约7.5至约9.5微米、约7.5至约9.0微米、约7.5至约8.5微米、约7.5至约8.0微米、约8.0至约12.0微米、约8.0至约11.5微米、约8.0至约11.0微米、约8.0至约10.5微米、约8.0至约10.0微米、约8.0至约9.5微米、约8.0至约9.0微米、约8.0至约8.5微米、约8.5至约12.0微米、约8.5至约11.5微米、约8.5至约11.0微米、约8.5至约10.5微米、约8.5至约10.0微米、约8.5至约9.5微米、约8.5至约9.0微米、约9.0至约12.0微米、约9.0至约11.5微米、约9.0至约11.0微米、约9.0至约10.5微米、约9.0至约10.0微米、约9.0至约9.5微米、约9.5至约12.0微米、约9.5至约11.5微米、约9.5至约11.0微米、约9.5至约10.5微米、约9.5至约10.0微米、约10.0至约12.0微米、约10.0至约11.5微米、约10.0至约11.0微米、约10.0至约10.5微米、约10.5至约12.0微米、约10.5至约11.5微米、约10.5至约11.0微米、约11.0至约12.0微米、约11.0至约11.5微米，或约11.5至约12.0微米，以及任选地群体的标准差小于1、2或3微米。可以测量去核红系细胞直径，例如，使用Advia 120血液学系统、Vi-cellTM细胞存活力分析仪(Beckman Coulter)或Moxi Z细胞计数器(Orflo)。
在一些实施方案中，去核红系细胞的平均红细胞体积的体积为约10fL至约175fL、约10fL至约160fL、约10fL至约140fL、约10fL至约120fL、约10fL至约100fL、约10fL至约95fL、约10fL至约90fL、约10fL至约85fL、约10fL至约80fL、约10fL至约75fL、约10fL至约70fL、约10fL至约65fL、约10fL至约60fL、约10fL至约55fL、约10fL至约50fL、约10fL至约45fL、约10fL至约40fL、约10fL至约35fL、约10fL至约30fL、约10fL至约25fL、约10fL至约20fL、约10fL至约15fL、约15fL至约175fL、约15fL至约160fL、约15fL至约140fL、约15fL至约120fL、约15fL至约100fL、约15fL至约95fL、约15fL至约90fL、约15fL至约85fL、约15fL至约80fL、约15fL至约75fL、约15fL至约70fL、约15fL至约65fL、约15fL至约60fL、约15fL至约55fL、约15fL至约50fL、约15fL至约45fL、约15fL至约40fL、约15fL至约35fL、约15fL至约30fL、约15fL至约25fL、约15fL至约20fL、约20fL至约175fL、约20fL至约160fL、约20fL至约140fL、约20fL至约120fL、约20fL至约100fL、约20fL至约95fL、约20fL至约90fL、约20fL至约85fL、约20fL至约80fL、约20fL至约75fL、约20fL至约70fL、约20fL至约65fL、约20fL至约60fL、约20fL至约55fL、约20fL至约50fL、约20fL至约45fL、约20fL至约40fL、约20fL至约35fL、约20fL至约30fL、约20fL至约25fL、约25fL至约175fL、约25fL至约160fL、约25fL至约140fL、约25fL至约120fL、约25fL至约100fL、约25fL至约95fL、约25fL至约90fL、约25fL至约85fL、约25fL至约80fL、约25fL至约75fL、约25fL至约70fL、约25fL至约65fL、约25fL至约60fL、约25fL至约55fL、约25fL至约50fL、约25fL至约45fL、约25fL至约40fL、约25fL至约35fL、约25fL至约30fL、约30fL至约175fL、约30fL至约160fL、约30fL至约140fL、约30fL至约120fL、约30fL至约100fL、约30fL至约95fL、约30fL至约90fL、约30fL至约85fL、约30fL至约80fL、约30fL至约75fL、约30fL至约70fL、约30fL至约65fL、约30fL至约60fL、约30fL至约55fL、约30fL至约50fL、约30fL至约45fL、约30fL至约40fL、约30fL至约35fL、约35fL至约175fL、约35fL至约160fL、约35fL至约140fL、约35fL至约120fL、约35fL至约100fL、约35fL至约95fL、约35fL至约90fL、约35fL至约85fL、约35fL至约80fL、约35fL至约75fL、约35fL至约70fL、约35fL至约65fL、约35fL至约60fL、约35fL至约55fL、约35fL至约50fL、约35fL至约45fL、约35fL至约40fL、约40fL至约175fL、约40fL至约160fL、约40fL至约140fL、约40fL至约120fL、约40fL至约100fL、约40fL至约95fL、约40fL至约90fL、约40fL至约85fL、约40fL至约80fL、约40fL至约75fL、约40fL至约70fL、约40fL至约65fL、约40fL至约60fL、约40fL至约55fL、约40fL至约50fL、约40fL至约45fL、约45fL至约175fL、约45fL至约160fL、约45fL至约140fL、约45fL至约120fL、约45fL至约100fL、约45fL至约95fL、约45fL至约90fL、约45fL至约85fL、约45fL至约80fL、约45fL至约75fL、约45fL至约70fL、约45fL至约65fL、约45fL至约60fL、约45fL至约55fL、约45fL至约50fL、约50fL至约175fL、约50fL至约160fL、约50fL至约140fL、约50fL至约120fL、约50fL至约100fL、约50fL至约95fL、约50fL至约90fL、约50fL至约85fL、约50fL至约80fL、约50fL至约75fL、约50fL至约70fL、约50fL至约65fL、约50fL至约60fL、约50fL至约55fL、约60fL至约175fL、约60fL至约160fL、约60fL至约140fL、约60fL至约120fL、约60fL至约100fL、约60fL至约95fL、约60fL至约90fL、约60fL至约85fL、约60fL至约80fL、约60fL至约75fL、约60fL至约70fL、约60fL至约65fL、约70fL至约175fL、约70fL至约160fL、约70fL至约140fL、约70fL至约120fL、约70fL至约100fL、约70fL至约95fL、约70fL至约90fL、约70fL至约85fL、约70fL至约80fL、约70fL至约75fL、约80fL至约175fL、约80fL至约160fL、约80fL至约140fL、约80fL至约120fL、约80fL至约100fL、约80fL至约95fL、约80fL至约90fL、约80fL至约85fL、约100fL至约175fL、约100fL至约160fL、约100fL至约140fL、约100fL至约120fL、约120fL至约175fL、约120fL至约160fL、约120fL至约140fL、约140fL至约175fL、约140fL至约160fL，或约160fL至约175fL，以及任选地，群体的标准差小于50、40、30、20、10、5或2fL。可以测量平均红细胞体积，例如，使用血液学分析仪器，例如Coulter计数器、Moxi Z细胞计数器(Orflo)或Sysmex血液学分析仪。
在一些实施方案中，去核红系细胞是人(例如，衍生自人供体的红系祖细胞)去核红系细胞。
在一些实施方案中，去核红系细胞是工程化人去核红系细胞。在一些实例中，工程化去核红系细胞包含单一外源性蛋白质(例如，存在于工程化去核红系细胞的胞质溶胶中或存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质)(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性外源性蛋白质)。
在其他实例中，工程化去核红系细胞包含两种或更多种外源性蛋白质(例如，本文所述的任何示例性外源性蛋白质)。在一些实例中，两种或更多种外源性蛋白质中的至少一种可以存在于工程化去核红系细胞的胞质溶胶中(例如，酶，例如苯丙氨酸解氨酶)。在一些实例中，两种或更多种外源性蛋白质中的至少一种可以存在于工程化去核红系细胞的膜上(例如，Fc结合分子、细胞因子受体、T细胞活化配体、T细胞受体、免疫抑制分子、MHC分子、APC结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如受体激动剂或受体拮抗剂)，或者抗体或抗体片段)。
除了包含外源性蛋白质的工程化红系细胞可以用于治疗的相应疾病或病况之外，本文所述的任何工程化红系细胞可以包含的一种或多种外源性蛋白质的非限制性实例列于下表A-D中。本文所述的任何红系细胞可以包含的外源性蛋白质的其他实例是本领域已知的。
表A.示例性外源性蛋白质
表B.示例性外源性蛋白质
表C.示例性外源性蛋白质
表D示例性外源性蛋白质
在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质可以是点击化学反应的产物(例如，可以使用本文所述的任何方法将外源性蛋白质与存在于细胞膜上的蛋白质(例如，第二外源性蛋白质或内源性蛋白质)缀合)。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质可以是使用分选酶的缀合反应的产物(例如，可以使用本文所述的任何方法将外源性蛋白质与存在于细胞膜上的蛋白质(例如，第二外源性蛋白质或内源蛋白质)缀合)。使用分选酶的缀合反应的非限制性实例可以在美国专利号10,260,038和美国专利号2016/0082046A1中找到，两者均通过引用并入。
本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括将一种或多种外源性蛋白质与细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如去核红系细胞、工程化去核红系细胞或本文所述的任何祖红系细胞)点击缀合(例如，使用本文所述的任何方法)。本文所述的任何方法的一些实施方案还包括低渗加载细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如，去核红系细胞，工程化去核红系细胞，或本文所述的任何祖红系细胞)(例如，使用本文所述的任何方法)。本文所述的任何方法的一些实施方案还包括通过物理操作加载细胞(例如，本文所述的任何细胞，例如去核红系细胞、工程化去核红系细胞或任何本文所述的祖红系细胞)(例如，使用本文所述的任何方法)。
在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质可以是脂质锚定蛋白，例如GPI锚、N-肉豆蔻酰化蛋白或S-棕榈酰化蛋白。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质可以是跨膜蛋白(例如，单次通过或多次通过跨膜蛋白)或外周膜蛋白。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质可以是包含跨膜域的融合蛋白(例如，包含小整合膜蛋白1(SMIM1)或血型糖蛋白A(GPA)的跨膜域的融合蛋白)。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞的膜上的外源性蛋白质不具有任何伸入细胞外空间中的氨基酸。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞膜上的外源性蛋白质不具有任何伸入工程化去核红系细胞的胞质溶胶中的氨基酸。在一些实施方案中，存在于工程化去核红系细胞膜上的外源性蛋白质具有伸入细胞外间隙中的氨基酸和突出到工程化去核红系细胞的胞质溶胶中的氨基酸。
本文所述的方法可以进一步包括在步骤(a)之前或在步骤(a)期间(例如，在步骤(a)期间任何时间上的一到三天，例如在步骤(a)开始时的一到三天)，将编码一种或多种重组蛋白的核酸引入红系祖细胞。可以通过将编码一种或多种外源性蛋白质(例如，本文所述或本领域已知的任何外源性蛋白质)的一种或多种核酸(例如，DNA表达载体或mRNA)引入红系祖细胞(例如，本文所述或本领域已知的任何红系祖细胞)中来生产工程化去核红系细胞。将DNA表达载体引入红系祖细胞的示例性方法包括但不限于脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移(例如，使用病毒载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体和基于逆转录病毒的载体进行)。将DNA表达载体引入红系细胞祖细胞的其他示例性方法包括使用例如，裸DNA、CaPO4沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质体转染和细胞显微注射。
可以任选地在引入编码一种或多种外源性蛋白质的一种或多种核酸之前，在允许分化为工程化去核红系细胞的合适条件下培养红系祖细胞。在一些实施方案中，所得工程化去核红系细胞包含与成熟红系细胞相关的蛋白质，例如血红蛋白(例如，成人血红蛋白和/或胎儿血红蛋白)、血型糖蛋白A，以及可以通过标准方法(例如Western印迹或FACS分析)来验证和量化的外源性蛋白质。
在一些实例中，去核红系细胞或红系祖细胞可以用编码外源性蛋白质的mRNA转染以生成工程化去核红系细胞。信使RNA可以衍生自含有编码外源性蛋白质的序列的cDNA质粒构建体的体外转录。例如，可以将编码外源性蛋白质的cDNA序列插入到含有与特定RNA聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体ZAP
pBK-CMV(Stratagene,La Jolla,CA,USA)含有分别与T3和T7 RNA聚合酶相容的T3和T7启动子序列。对于有义mRNA的体外转录，将质粒在对应于编码外源性蛋白质的序列末端的终止密码子下游的限制性位点处线性化。使用商品化的试剂盒，例如
高产率转录试剂盒(来自Stratagene，La Jolla，CA，USA)从线性DNA模板转录mRNA。在某些情况下，可能期望生成5'-m7GpppG-加帽的mRNA。因此，可以使用例如来自Ambion(Austin,Tex.,USA)的mMESSAGE mMACHINE高产加帽RNA转录试剂盒进行线性化cDNA模板的转录。转录可以在20-100μl的反应体积中在37℃下进行30min至4h。通过用DNase I短暂处理以消除线性化DNA模板，然后在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵存在的情况下在70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mRNA。可以使用琼脂糖-甲醛凝胶或商品化的Novex预制TBE凝胶(Novex,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用电泳评估转录的mRNA的完整性。
可以使用多种方法，包括例如脂质体转染和电穿孔，将编码外源性蛋白质的信使RNA引入去核红系细胞或红系祖细胞中(van Tandeloo et al.,Blood98:49-56,2001)。例如，对于脂质体转染，将Opti-MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中5μg体外转录的mRNA与阳离子脂质DMRIE-C(Invitrogen)以1:4的比率温育5-15min。
或者，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物可以用于与mRNA转染红系祖细胞或去核红系细胞，包括例如DOTAP、各种形式的聚乙烯亚胺和聚L-赖氨酸(Sigma-Aldrich,SaintLouis,Mo.,USA)和Superfect(Qiagen,Inc.,Valencia,Calif.,USA；参见，例如Bettingeret al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891,2001)。将所得的mRNA/脂质复合物与细胞(1-2x106个细胞/mL)在37℃下温育2小时，清洗并返回培养。例如，对于电穿孔，将500μL的Opti-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中的约5至20x106个细胞与约20μg的体外转录mRNA混合，并在0.4cm比色皿中使用例如，Easyject Plus装置(EquiBio,Kent,UnitedKingdom)电穿孔。在某些情况下，测试各种电压、电容和电穿孔体积，以确定将特定mRNA转染到红系细胞祖细胞中的有用条件可能是必要的。一般而言，用mRNA有效转染细胞所需要的电穿孔参数似乎比DNA电穿孔所需的电穿孔参数对细胞的危害小(van Tandeloo etal.,Blood 98:49-56,2001)。
或者，可以使用肽介导的RNA递送策略将mRNA转染到红系祖细胞或去核红系细胞中(参见，例如，Bettinger et al.,Nucleic Acids Res.29:3882-3891,2001)。例如，阳离子脂质聚乙烯亚胺2kDA(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA)可以与蜂毒肽(AltaBiosciences,Birmingham,UK)结合以提高mRNA转染的效率，特别是在有丝分裂后的原代细胞中。蜂毒肽可以使用二硫化物交联剂，例如杂双功能交联剂琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯与PEI缀合。将体外转录的mRNA与蜂毒肽-PEI预温育5到15min，以形成RNA/肽/脂质复合物。然后将此复合物添加到无血清培养基中的细胞中，在37℃下，在5％CO2加湿环境中持续2至4h，然后除去，并进一步培养转染的细胞。
在一些实施方案中，通过将编码一种或多种外源性蛋白质(例如，本文所述的任何外源性蛋白质或外源性蛋白质的任何组合)的核酸(例如，本文所述的任何示例性核酸)引入红系祖细胞来生成去核红系细胞。在一些实施方案中，外源性蛋白质由引入红系细胞祖细胞的DNA编码。在一些实施方案中，外源性蛋白质由引入红系细胞祖细胞的RNA编码。
编码一种或多种外源性蛋白质的核酸可以在终末分化为去核红系细胞之前使用多种DNA技术，包括例如瞬时或稳定转染和基因治疗方法，来引入红系祖细胞中。
病毒基因转移可用于用编码一种或多种外源性蛋白质的核酸转染细胞。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、慢病毒如人类免疫缺陷病毒1(HIV1)和泡沫病毒属诸如泡沫病毒(参见，例如，Osten et al.,HEP 178:177-202,2007)。例如，逆转录病毒有效地转导哺乳动物细胞(包括人细胞)并整合到染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
可以将编码一种或多种外源性蛋白质的核酸转染到红系细胞祖细胞中。合适的载体是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)载体(Malik et al.,Blood91:2664-2671,1998)。基于MMLV(一种致癌逆转录病毒)的载体目前用于基因疗法临床试验(Hassle et al.,NewsPhysiol.Sci.17:87-92,2002)。例如，可以使用标准分子生物学技术在MMLV载体骨架中生成包含编码外源性蛋白质的cDNA的DNA构建体。将构建体转染到包装细胞系中诸如，例如PA317细胞，并且使用病毒上清液转染生产者细胞诸如，例如PG13细胞。将PG13病毒上清液与红系祖细胞一起温育。外源性蛋白质的表达可以使用FACS分析(荧光激活细胞分选)进行监测，例如，如果其存在于工程人去核红系细胞的膜上，则使用针对外源性蛋白质的荧光标记抗体。可以使用类似的方法使得外源性蛋白质存在于工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。
任选地，可以使用基于病毒的方法将编码荧光追踪分子诸如，例如绿色荧光蛋白(GFP)的核酸转染到红系祖细胞中(Tao et al.,Stem Cells 25:670-678,2007)。使用包装细胞诸如，例如Phoenix-Eco细胞系(由Orbigen,San Diego,Calif.分发)包装含有编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或红色荧光蛋白(例如DsRed-Express)的DNA的同向性(Ecotropic)逆转录病毒载体。包装细胞系稳定表达适当病毒包装所需要的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。使用来自Phoenix-Eco细胞的上清液(病毒颗粒已经脱落)转导红系祖细胞。在一些情况下，转导可以在特殊包被的表面诸如，例如重组纤连蛋白的片段上进行以提高逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如，RetroNectin,Takara Bio USA,Madison,Wis.)。在RetroNectin包被的板中将细胞与逆转录病毒Phoenix-Eco上清液加合适的辅因子一起温育。次日，可以重复转导。在这种情况下，可以通过FACS评估表达EGFP或DsRed-Express的红系祖细胞的百分比。可以用于评估转导效率的其他报告基因包括，例如，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶，以及低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)和人类细胞表面CD24抗原(Bierhuizen et al.,Leukemia 13:605-613,1999)。
非病毒载体可用于将编码一种或多种外源性蛋白质的核酸引入红系祖细胞以生成工程化去核红系细胞。许多递送方法可以用于将非病毒载体引入红系祖细胞，包括化学和物理方法。
可以使用合成大分子，例如阳离子脂质和聚合物，将编码外源性蛋白质的非病毒载体引入到红系祖细胞中(Papapetrou et al.,Gene Therapy12:S118-S130,2005)。例如，阳离子脂质体通过电荷相互作用与DNA形成复合物。带正电荷的DNA/脂质复合物与负细胞表面结合并通过内吞被细胞吸收。该方法可用于，例如，转染造血细胞(参见，例如，Kelleret al.,Gene Therapy6:931-938,1999)。对于红系祖细胞，将质粒DNA(在无血清培养基中，诸如，例如，OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA))与阳离子脂质体(在无血清培养基中)，例如商品化的转染试剂LipofectamineTM(Invitrogen,Carlsbad,CA)混合，并且允许温育至少20分钟以形成复合物。将DNA/脂质体复合物添加到红系祖细胞中，并允许温育5-24小时，然后可以测定外源性蛋白质的转基因表达。或者，可以使用其他商品化的脂质体转染剂(例如，In vivo GeneSHUTTLETM,Qbiogene,Carlsbad,Calif.)。
任选地，阳离子聚合物诸如，例如聚乙烯亚胺(PEI)可用于有效转染红系祖细胞，例如造血和脐带血衍生的CD34+细胞(参见，例如Shin et al.,Biochim.Biophys.Acta1725:377-384,2005)。从人脐带血中分离出人CD34+细胞，并在补充有200ng/ml干细胞因子和20％热灭活血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养。将编码外源性蛋白质的质粒DNA与大小从0.8K至750K不等的分支或线性PEI(Sigma Aldrich,Saint Louis,Mo.,USA；Fermetas,Hanover,Md.,USA)一起温育。PEI制备为4.2mg/mL蒸馏水的储备溶液，并使用HCl轻微酸化至pH 5.0。根据1μg DNA含有3nmol磷酸盐和1μL PEI储备溶液含有10nmol胺氮的计算，DNA可以在室温下以各种氮/磷酸盐比率与PEI结合30min。分离的CD34+细胞用DNA/阳离子复合物接种，以280xg离心5分钟，并在培养基中温育4小时或以上，直到评估外源性蛋白质的表达。
可以使用物理方法将质粒载体引入合适的红系祖细胞，例如颗粒介导的转染、“基因枪”、生物射弹或颗粒轰击技术(Papapetrou,et al.,Gene Therapy12:S118-S130,2005)。在这种情况下，将编码外源性蛋白质的DNA吸纳到金颗粒上，并通过颗粒枪施用至细胞。该方法可用于例如转染红系祖细胞，例如衍生自脐带血的造血干细胞(参见，例如，Verma et al.,Gene Therapy5:692-699,1998)。因此，将脐带血分离并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。使用抗CD34单克隆抗体联合用二抗包被的磁微珠和磁分离系统(例如，Miltenyi MiniMac System,Auburn,Calif.,USA)纯化CD34+细胞。CD34+富集的细胞可以如本文所述进行培养。对于转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，将编码外源性蛋白质的质粒DNA沉淀到颗粒(例如金珠)上。在用乙醇清洗DNA包被的珠子之后，可以使用例如BiolisticPDS-1000/He系统(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)将珠递送到培养的细胞中。报告基因诸如，例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白可用于评估转染效率。
任选地，可以使用电穿孔方法将质粒载体引入到红系祖细胞中。电穿孔在细胞膜上产生瞬时孔，允许将各种分子引入细胞，包括例如DNA和RNA。因此，如本文所述分离和培养CD34+细胞。在电穿孔之前，立即通过在室温下以250x离心10min来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml重悬于电穿孔缓冲液中诸如，补充有1.0％人血清白蛋白(HSA)的X-VIVO 10。将质粒DNA(1-50μg)与500μL细胞悬液一起添加至合适的电穿孔试管中。
可以使用例如具有200V至280V的电压范围和范围为25至70毫秒的脉冲长度的ECM600电穿孔仪(Genetronics,San Diego,Calif.,USA)进行电穿孔。许多替代的电穿孔仪器是商品化的并且可以用于这个目的(例如，Gene Pulser XcellTM,BioRad,Hercules,Calif.；Cellject Duo,Thermo Science,Milford,Mass.)。或者，可以使用以下参数对分离的CD34+细胞进行有效的电穿孔：4mm比色皿、1600μL、550V/cm和10μg DNA/500μL细胞，以1x105个细胞/mL(Oldak et al.,Acta Biochim.Polonica 49:625-632,2002)。
核转染(电穿孔的形式)也可以用于转染红系祖细胞。在这种情况下，在细胞类型特异性溶液中使用电参数进行转染，该溶液使DNA(或其他试剂)能够直接运输到细胞核，从而降低细胞质中可能降解的风险。例如，人CD34细胞NucleofectorTM试剂盒(来自AmaxaInc.)可以用于转染红系祖细胞。在这种情况下，将人CD34细胞NucleofectorTM溶液中的1-5x106个细胞与1-5μg DNA混合，并使用预编程设置在NucleofectorTM仪器中进行转染，如制造商所确定的。
红系祖细胞可以用常规表达载体以非病毒转染，该常规表达载体不能在哺乳动物细胞中自我复制，除非将其整合到基因组中。或者，可以用附加体载体转染红系祖细胞，该载体可以作为自主复制的遗传单位持续存在于宿主细胞核中而不整合到染色体中(Papapetrou et al.,Gene Therapy 12:S118-S130,2005)。这些载体利用衍生自病毒的遗传元件，该病毒通常在潜伏感染后在细胞中进行染色体外复制，例如EBV、人多瘤病毒BK、牛乳头状瘤病毒-1(BPV-1)、单纯疱疹病毒-1(HSV)和猿猴病毒40(SV40)。哺乳动物人工染色体也可用于非病毒基因转移(Vanderbyl et al.,Exp.Hematol.33:1470-1476,2005)。
编码一种或多种外源性蛋白质的外源性核酸可以通过本领域已知的标准分子生物学方法，例如限制性消化、重叠-延伸PCR和Gibson组装来组装到表达载体中。
外源性核酸可以包含编码通常不存在于细胞表面，例如去核红系细胞表面上的外源性蛋白质的基因，该基因与编码内源或天然膜蛋白质的基因融合，使得外源性蛋白质在细胞表面上表达。例如，编码外源性蛋白质的外源性基因可以克隆在1型膜蛋白前导序列后的N端、2型膜蛋白的C端或GPI连接的膜蛋白的GPI附着位点上游。
标准克隆方法可用于在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸聚丝氨酸接头，诸如[Gly4Ser]3(SEQ ID NO:3)，其通常用于从全长抗体生成单链抗体片段(Antibody Engineering:Methods&Protocols,B.Lo,ed.,Humana Press,2004,576pp.)或Ala-Gly-Ser-Thr(SEQ ID NO:4)多肽，诸如用于生成单链Arc阻遏物的那些(Robinson&Sauer,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95:5929-34,1998)。在一些实施方案中，与没有柔性接头的等效构建体相比，柔性接头为外源性蛋白质提供了更大的柔性和空间自由度。这种增加的柔性可用于需要结合靶标(例如抗体或蛋白质)或蛋白质(对于该蛋白质，其活性位点必须可接近底物(例如靶标))的酶促反应的应用。
在一些实施方案中，所提供的方法包括通过使红系祖细胞与核酸接触并在有效递送所述核酸至细胞的条件，诸如本文所述的那些条件下通过电穿孔引入核酸，将大核酸(特别是RNA，例如mRNA)递送到红系祖细胞中。合适的电穿孔仪包括但不限于Bio-Rad GENEPULSER和GENE PULSER II；Life Technologies NEON；BTX GEMINI系统；和MAXCYTE电穿孔仪。这些方法不需要病毒递送或使用病毒载体。合适的核酸包括RNA，例如mRNA。合适的核酸还包括DNA，包括转座元件、稳定附加体、质粒DNA或线性DNA。
细胞系的电穿孔的条件已在文献中描述，例如Van Tendeloo et al.,Blood98(l):49-56,2001。适用于本文所述方法的电穿孔条件对于Life Technologies Neon转染系统包括：范围为约500至约2000V，约800至约1800V，或约850至约1700V的脉冲电压；范围为约5至约50msec，或约10至约40msec的脉冲宽度；范围为1至2次脉冲、1至3次脉冲、1至4次脉冲、1至5次脉冲的脉冲数。
用于红系祖细胞的电穿孔的特别合适的条件包括，例如，持续4天：a)脉冲电压1300-1400，脉冲宽度：10-20msec，脉冲数：1-3；b)脉冲电压1400，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3；c)脉冲电压1400，脉冲宽度：20msec，脉冲数：1；以及d)脉冲电压1300，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3。
用于红系祖细胞的电穿孔的特别合适的条件包括，例如，持续8-9天：a)脉冲电压：1400-1600，脉冲宽度：20，脉冲数：1；b)脉冲电压：1100-1300，脉冲宽度：30，脉冲数：1；c)脉冲电压：1000-1200，脉冲宽度：40，脉冲数：1；d)脉冲电压：1100-1400，脉冲宽度：20，脉冲数：2；e)脉冲电压：950-1150，脉冲宽度：30，脉冲数：2；f)脉冲电压：1300-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3。这些条件通常导致至少约60％或更多(例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的转染效率，以及至少约70％或更多(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的细胞存活力。
在分化条件下培养中的红系祖细胞的电穿孔的特别合适的条件包括例如，持续12-13天：a)脉冲电压：1500-1700，脉冲宽度：20，脉冲数：1；b)脉冲电压：1500-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3。这些条件通常导致至少约50％或更多(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的转染效率，和至少约70％或更多(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的细胞存活力。
本领域普通技术人员可以容易地调整本文中关于Life Technologies Neon系统公开的条件，以仅通过常规实验适应不同的电穿孔仪和/或不同的电穿孔装置，并且本文所述的特定电穿孔仪对于公开的方法不是限制性的。
在一些实施方案中，使用本文所述的电穿孔条件，对培养的红系祖细胞进行第一次电穿孔，然后培养期望的时间段(任选地在分化条件下)，然后再电穿孔第二次。在一些实施方案中，第一次电穿孔培养的红系祖细胞，然后培养期望的时间段(任选地在分化条件下)，然后再电穿孔第二次、第三次、第四次、第五次或第六次。任选地，可以改变第一次和第二次、第二次和第三次等电穿孔之间的培养期。例如，可以根据需要调整电穿孔之间的时段，例如时段可以是30分钟、1小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或21天。例如，红系祖细胞可以在第1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、1和10、1和11、1和12、1和13、1和14、1和15或1和16天进行电穿孔。在另一个实例中，细胞可以在第2和3、2和4、2和5、2和6、2和7、2和8、2和9、2和10、2和11、2和12、2和13、2和14、2和15或2和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第3和4、3和5、3和6、3和7、3和8、3和9、3和10、3和11、3和12、3和13、3和14、3和15或3和16天进行电穿孔。在又一个实例中，细胞可以在第4和5、4和6、4和7、4和8、4和9、4和10、4和11、4和12、4和13、4和14、4和15或4和16天进行电穿孔。在又一个实例中，细胞可以在第5和6、5和7、5和8、5和9、5和10、5和11、5和12、5和13、5和14、5和15或5和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第6和7、6和8、6和9、6和10、6和11、6和12、6和13、6和14、6和15或6和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第7和8、7和9、7和10、7和11、7和12、7和13、7和14、7和15或7和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第8和9、8和10、8和11、8和12、8和13、8和14、8和15或8和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第910、9和11、9和12、9和13、9和14、9和15或9和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第10和11、10和12、10和13、10和14、10和15或10和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第11和12、11和13、11和14、11和15或11和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第12和13、12和14、12和15或12和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第13和14、13和15或13和16天进行电穿孔。在又一个实例中，红系祖细胞可以在第14和15或14和16天进行电穿孔。任选地，可以将红系祖细胞电穿孔两次以上，例如三次、四次、五次或六次，并且可以根据需要在细胞分化过程的任何点选择间隔。
在一些实施方案中，使用本文所述的电穿孔条件，培养的红系祖细胞在分化的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16天进行电穿孔。
在一些实施方案中，工程化去核红系细胞可以是点击缀合的工程化去核红系细胞。形成催化键的多肽域可以在例如红系祖细胞之上或之中表达，存在于胞质溶胶中或存在于膜上。存在许多催化键形成多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括衍生自Spy0128(从酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)分离的蛋白质)的那些。已经证明了分裂Spy0128的自催化异肽键形成亚基(CnaB2域)产生两种不同的多肽，它们保留了彼此特异性的催化活性。此系统中的多肽称为SpyTag和SpyCatcher。混合后，SpyTag和SpyCatcher在SpyTag上的Aspl 17和SpyCatcher上的Lys31之间经历异肽键生成(Zakeri and Howarth,JACS 132:4526,2010)。该反应与细胞环境相容并且对蛋白质/肽缀合具有高度特异性(Zakeri et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109:E690-E697,2012)。已经显示了SpyTag和SpyCatcher指导弹性蛋白样蛋白的翻译后拓扑修饰。例如，将SpyTag放置于N端，将SpyCatcher放置于C端可以指导环状弹性蛋白样蛋白的形成(Zhang et al,J.Am.Chem.Soc.2013)。
SpyTag和SpyCatcher的组分可以互换，使得分子A与SpyTag融合且分子B与SpyCatcher融合的系统在功能上等同于分子A与SpyCatcher融合且分子B与SpyTag融合的系统。就本公开而言，当使用SpyTag和SpyCatcher时，应理解互补分子可以在其位置替换。
催化键形成多肽，例如SpyTag/SpyCatcher系统，可用于将外源性蛋白质附着到例如红系祖细胞或去核红系细胞的表面。SpyTag多肽序列可以在红系细胞或去核红系细胞的细胞外表面上表达。SpyTag多肽可以例如与1型或3型跨膜蛋白(例如血型糖蛋白A)的N端融合，与2型跨膜蛋白(例如Kell)的C端融合，符合读码框地插入多次通过跨膜蛋白(例如Band3)的胞外端处或胞外环中，与GPI受体多肽(例如CD55或CD59)融合、与脂质链锚定多肽融合，或与外周膜蛋白融合。外源性蛋白质可以与SpyCatcher融合。可以表达编码SpyCatcher融合物的核酸，并且从表达SpyTag融合物的同一红系祖细胞或去核红系细胞系分泌。或者，编码SpyCatcher融合物的核酸序列可以外源产生，例如在细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞生产系统中。在SpyTag和SpyCatcher多肽反应后，将形成共价键，将外源性蛋白质附着到红系祖细胞或去核红系细胞的表面。
在一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系细胞中在Gatal启动子的控制下表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源性蛋白质可以在同一红系细胞中在Gatal启动子的控制下表达。在两种融合多肽表达后，SpyTag和SpyCatcher多肽之间将形成异肽键，从而在红系细胞表面和外源性蛋白质之间形成共价键。
在另一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系祖细胞或去核的红系细胞中在Gatal启动子的控制下表达为与血型糖蛋白A的N端的融合物。与SpyCatcher多肽序列融合的外源性蛋白质可以在合适的哺乳动物细胞表达系统，例如HEK293细胞中表达。在红系祖细胞或去核红系细胞上表达SpyTag融合多肽后，可以使SpyCatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，SpyTag和SpyCatcher多肽之间会形成异肽键，从而在红系祖细胞表面或去核红系细胞表面和外源性蛋白质之间形成共价键。
催化键形成多肽，例如SpyTag/SpyCatcher系统，可用于将外源性蛋白质锚定到红系祖细胞或去核红系细胞的细胞内空间。SpyTag多肽序列可以通过多种方法在红系细胞或去核红系细胞的细胞内空间中表达，该方法包括转基因的直接表达、与内源性细胞内蛋白质诸如例如血红蛋白的融合、与内源性细胞表面蛋白(诸如例如Band 3、血型糖蛋白A、Kell)的胞内域融合，或与细胞骨架的结构组分融合。SpyTag序列不限于多肽末端，并且可以整合在内源多肽的内部序列内，使得多肽翻译和定位不受干扰。外源性蛋白质可以与SpyCatcher融合。编码SpyCatcher融合物的核酸序列可以在表达SpyTag融合物的同一红系祖细胞或去核红系细胞内表达。在SpyTag和SpyCatcher多肽反应后，将形成共价键，其作用是将外源性蛋白质锚定在红系祖细胞或去核红系细胞的细胞内空间中。
在一个实施方案中，红系祖细胞或去核红系细胞包括在细胞内与血红蛋白β融合的SpyTag。可以用包括血红蛋白启动子、β珠蛋白基因和SpyTag序列的基因序列对红系祖细胞进行遗传修饰，使得在翻译时，细胞内β珠蛋白在其C端与SpyTag融合。此外，红系祖细胞或去核红系细胞表达Gatal启动子引导的基因，该基因编码驱动外源性多肽表达的SpyCatcher，使得在翻译时，外源性多肽在其N端与SpyCatcher融合。在表达两种融合蛋白后，SpyTag结合的β珠蛋白通过异肽键连接到细胞内空间中与SpyCatcher结合的外源性多肽，允许外源性多肽锚定到β珠蛋白并在成熟过程中得到保留。
在另一个实施方案中，SpyTag多肽可以在红系祖细胞或去核红系细胞内表达为与外源性蛋白质的融合物。SpyCatcher多肽可以在同一红系祖细胞或去核红系细胞内表达为与血型糖蛋白A的C端(细胞内)的融合物。在两种融合多肽表达后，SpyTag和SpyCatcher多肽之间将形成异肽键，从而在膜锚定的内源性红系细胞多肽和外源性蛋白质之间形成共价键。
多肽之间可以形成其他分子融合物，并且包括直接或间接缀合。多肽可以彼此直接缀合或通过接头间接缀合。接头可以是肽、聚合物、适体或核酸。聚合物可以是例如天然的、合成的、线性的或支化的。外源性蛋白质可以包括包含第一多肽和第二多肽的异源融合蛋白，该融合蛋白包含彼此直接连接或在一端或两端用居间的接头序列和/或其他序列连接的多肽。与接头的缀合可以通过共价键或离子键进行。
在一些实施方案中，工程化的去核红系细胞是低渗加载的人去核红系细胞。对于低渗加载/裂解，红系祖细胞或去核红系细胞暴露于低离子强度缓冲液中，导致它们破裂。外源性蛋白质分布在细胞内。去核红系细胞或红系祖细胞可以通过向分离的去核红系细胞团粒中添加30-50倍体积过量的5mM磷酸盐缓冲液(pH 8)进行低渗裂解。通过离心分离所得裂解的细胞膜。重悬裂解的细胞膜团粒，并且在外源性蛋白质存在的情况下在低离子强度缓冲液中，例如温育30min。或者，裂解的细胞膜可以与外源性蛋白质一起温育短至一分钟或长至几天，这取决于确定有效加载去核红系细胞或红系祖细胞的最佳条件。为了低渗加载编码一种或多种外源性蛋白质(例如，本文所述的或本领域已知的任何示例性外源性蛋白质)的核酸，可以将核酸悬浮在低渗Tris-HCl溶液(pH 7.0)中并注射到红系细胞祖细胞中。Tris-HCl的浓度可以为约20mmol/l至约150mmol/l，这取决于确定有效加载去核红系细胞的最佳条件。
或者，可以使用针对低渗溶液的受控透析使以使细胞膨胀并在细胞膜中产生孔，用外源性蛋白质加载红系祖细胞或去核的红系细胞(参见，例如，美国专利号4,327,710；5,753,221；6,495,351和10,046,009)。例如，将细胞团粒重悬在10mM HEPES、140mM NaCl、5mM葡萄糖pH 7.4中，并在含有10mM NaH2PO4、10mM NaHCO3、20mM葡萄糖和4mM MgCl2的低离子强度缓冲液中透析，pH 7.4。30-60min后，将细胞针对含有外源性蛋白质的16mM NaH2PO4(pH7.4)溶液进一步透析额外的30-60min。所有这些程序都可以有利地在4℃的温度下进行。在一些情况下，通过透析方法加载大量红系祖细胞或去核红系细胞可能是有益的，并且可以使用为此目的而设计的特定装置(参见，例如，美国专利号4,327,710、6,139,836和6,495,351)。
分离和配制去核红系细胞
在一些实施方案中，本文提供的方法可以进一步包括(e)从步骤(d)中的第三细胞培养物中分离工程化去核红系细胞群。可以使用本领域已知的方法，诸如但不限于离心(例如，密度梯度离心)、FACS和MACS，分离工程化去核红系细胞。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括(f)配制在步骤(e)中分离的工程化去核红系细胞群。在一些实例中，配制工程化去核红系细胞群可以包括将分离的工程化去核红系细胞群与一种或多种药学上可接受的缓冲剂或赋形剂(例如，磷酸盐缓冲盐水)混合。
在一些实施方案中，将工程化去核红系细胞群配制成适合于贮存、运输和/或施用细胞至受试者的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括向有此需要的受试者(例如，先前经鉴定或经诊断为需要存在于工程化去核红系细胞中的一种或多种外源性蛋白质的受试者，或经鉴定为需要输血和/或红系细胞增加的受试者)施用步骤(f)中的经配制的工程化去核红系细胞群。在这些方法的一些实施方案中，受试者先前已经鉴定或诊断为需要存在于施用的工程化去核红系细胞中的一种或多种的外源性蛋白质。在这些方法的一些实施方案中，通过静脉内施用向受试者施用经配制的工程化去核红系细胞群。
组合物
本文还提供了通过本文所述的任何方法生产的去核红系细胞群。本文还提供了包括通过本文所述的任何方法生产的任何去核红系细胞群的组合物。本文还提供了通过本文所述的任何方法生产的配制剂(例如，药物组合物)。在一些实施方案中，配制剂适合于静脉内施用至受试者(例如，本文所述的任何受试者)。在本文所述的任何组合物或配制剂的一些实施方案中，组合物或配制剂是本文所述的任何去核红系细胞的剂型。
试剂盒
本文还提供了试剂盒，其包括本文提供的任何组合物、配制剂或去核红系细胞群。本文还提供了试剂盒，其包括一个或多个含有本文所述的任何组合物、配制剂或去核红系细胞群的无菌器皿(例如，无菌锥形管、无菌培养皿、无菌小瓶(例如，硼硅酸盐玻璃小瓶)和无菌塑料袋(二-2-乙基己基邻苯二甲酸酯(DEHP)-增塑聚氯乙烯(PVC)袋，或正丁酰基-三(正己基)-柠檬酸酯(BTHC)-增塑PVC袋)。在一些实施方案中，本文提供的任何试剂盒可以进一步包括向有此需要的受试者施用本文所述的任何组合物、配制剂或去核红系细胞群的说明书。
本文所述的试剂盒的一些实施方案包括本文所述的任何组合物、配制剂和去核红系细胞群的合适的单一剂型。例如，本文所述的任何组合物或配制剂的单一剂型可以具有以下的体积，例如，约0.5mL至约2L、约0.5mL至约1800mL、约0.5mL至约1500mL、约0.5mL至约1200mL、约0.5mL至约1000mL、约0.5mL至约800mL、约0.5mL至约600mL、约0.5mL至约500mL、约0.5mL至约450mL、约0.5mL至约400mL、约0.5mL至约350mL、约0.5mL至约300mL、约0.5mL至约250mL、约0.5mL至约200mL、约0.5mL至约180mL、约0.5mL至约160mL、约0.5mL至约140mL、约0.5mL至约120mL、约0.5mL至约100mL、约0.5mL至约80mL、约0.5mL至约60mL、约0.5mL至约40mL、约0.5mL至约20mL、约0.5mL至约10mL、约0.5mL至约5mL、约0.5mL至约1.0mL、约1.0mL至约2L、约1.0mL至约1800mL、约1.0mL至约1500mL、约1.0mL至约1200mL、约1.0mL至约1000mL、约1.0mL至约800mL、约1.0mL至约600mL、约1.0mL至约500mL、约1.0mL至约450mL、约1.0mL至约400mL、约1.0mL至约350mL、约1.0mL至约300mL、约1.0mL至约250mL、约1.0mL至约200mL、约1.0mL至约180mL、约1.0mL至约160mL、约1.0mL至约140mL、约1.0mL至约120mL、约1.0mL至约100mL、约1.0mL至约80mL、约1.0mL至约60mL、约1.0mL至约40mL、约1.0mL至约20mL、约1.0mL至约10mL、约1.0mL至约5mL、约5mL至约2L、约5mL至约1800mL、约5mL至约1500mL、约5mL至约1200mL、约5mL至约1000mL、约5mL至约800mL、约5mL至约600mL、约5mL至约1800mL、约5mL至约500mL、约5mL至约450mL、约5mL至约400mL、约5mL至约350mL、约5mL至约300mL、约5mL至约250mL、约5mL至约200mL、约5mL至约180mL、约5mL至约160mL、约5mL至约140mL、约5mL至约120mL、约5mL至约100mL、约5mL至约80mL、约5mL至约60mL、约5mL至约40mL、约5mL至约20mL、约5mL至约10mL、约10mL至约2L、约10mL至约1800mL、约10mL至约1500mL、约10mL至约1200mL、约10mL至约1000mL、约10mL至约800mL、约10mL至约600mL、约10mL至约500mL、约10mL至约450mL、约10mL至约400mL、约10mL至约350mL、约10mL至约300mL、约10mL至约250mL、约10mL至约200mL、约10mL至约180mL、约10mL至约160mL、约10mL至约140mL、约10mL至约120mL、约10mL至约100mL、约10mL至约80mL、约10mL至约60mL、约10mL至约40mL、约10mL至约20mL、约20mL至约2L、约20mL至约1800mL、约20mL至约1500mL、约20mL至约1200mL、约20mL至约1000mL、约20mL至约800mL、约20mL至约600mL、约20mL至约500mL、约20mL至约450mL、约20mL至约400mL、约20mL至约350mL、约20mL至约300mL、约20mL至约250mL、约20mL至约200mL、约20mL至约180mL、约20mL至约160mL、约20mL至约140mL、约20mL至约120mL、约20mL至约100mL、约20mL至约80mL、约20mL至约60mL、约20mL至约40mL、约40mL至约2L、约40mL至约1800mL、约40mL至约1500mL、约40mL至约1200mL、约40mL至约1000mL、约40mL至约800mL、约40mL至约600mL、约40mL至约500mL、约40mL至约450mL、约40mL至约400mL、约40mL至约350mL、约40mL至约300mL、约40mL至约250mL、约40mL至约200mL、约40mL至约180mL、约40mL至约160mL、约40mL至约140mL、约40mL至约120mL、约40mL至约100mL、约40mL至约80mL、约40mL至约60mL、约60mL至约2L、约60mL至约1800mL、约60mL至约1500mL、约60mL至约1200mL、约60mL至约1000mL、约60mL至约800mL、约60mL至约600mL、约60mL至约500mL、约60mL至约450mL、约60mL至约400mL、约60mL至约350mL、约60mL至约300mL、约60mL至约250mL、约60mL至约200mL、约60mL至约180mL、约60mL至约160mL、约60mL至约140mL、约60mL至约120mL、约60mL至约100mL、约60mL至约80mL、约80mL至约2L、约80mL至约1800mL、约80mL至约1500mL、约80mL至约1200mL、约80mL至约1000mL、约80mL至约800mL、约80mL至约600mL、约80mL至约500mL、约80mL至约450mL、约80mL至约400mL、约80mL至约350mL、约80mL至约300mL、约80mL至约250mL、约80mL至约200mL、约80mL至约180mL、约80mL至约160mL、约80mL至约140mL、约80mL至约120mL、约80mL至约100mL、约100mL至约2L、约100mL至约1800mL、约100mL至约1500mL、约100mL至约1200mL、约100mL至约1000mL、约100mL至约800mL、约100mL至约600mL、约100mL至约500mL、约100mL至约450mL、约100mL至约400mL、约100mL至约350mL、约100mL至约300mL、约100mL至约250mL、约100mL至约200mL、约100mL至约180mL、约100mL至约160mL、约100mL至约140mL、约100mL至约120mL、约120mL至约2L、约120mL至约1800mL、约120mL至约1500mL、约120mL至约1200mL、约120mL至约1000mL、约120mL至约800mL、约120mL至约600mL、约120mL至约500mL、约120mL至约450mL、约120mL至约400mL、约120mL至约350mL、约120mL至约300mL、约120mL至约250mL、约120mL至约200mL、约120mL至约180mL、约120mL至约160mL、约120mL至约140mL、约140mL至约2L、约140mL至约1800mL、约140mL至约1500mL、约140mL至约1200mL、约140mL至约1000mL、约140mL至约800mL、约140mL至约600mL、约140mL至约500mL、约140mL至约450mL、约140mL至约400mL、约140mL至约350mL、约140mL至约300mL、约140mL至约250mL、约140mL至约200mL、约140mL至约180mL、约140mL至约160mL、约160mL至约500mL、约160mL至约450mL、约160mL至约400mL、约160mL至约350mL、约160mL至约300mL、约160mL至约250mL、约160mL至约200mL、约160mL至约180mL、约180mL至约2L、约180mL至约1800mL、约180mL至约1500mL、约180mL至约1200mL、约180mL至约1000mL、约180mL至约800mL、约180mL至约600mL、约180mL至约500mL、约180mL至约450mL、约180mL至约400mL、约180mL至约350mL、约180mL至约300mL、约180mL至约250mL、约180mL至约200mL、约200mL至约2L、约200mL至约1800mL、约200mL至约1500mL、约200mL至约1200mL、约200mL至约1000mL、约200mL至约800mL、约200mL至约600mL、约200mL至约500mL、约200mL至约450mL、约200mL至约400mL、约200mL至约350mL、约200mL至约300mL、约200mL至约250mL、约250mL至约2L、约250mL至约1800mL、约250mL至约1500mL、约250mL至约1200mL、约250mL至约1000mL、约250mL至约800mL、约250mL至约600mL、约250mL至约500mL、约250mL至约450mL、约250mL至约400mL、约250mL至约350mL、约250mL至约300mL、约300mL至约2L、约300mL至约1800mL、约300mL至约1500mL、约300mL至约1200mL、约300mL至约1000mL、约300mL至约800mL、约300mL至约600mL、约300mL至约500mL、约300mL至约450mL、约300mL至约400mL、约300mL至约350mL、约350mL至约2L、约350mL至约1800mL、约350mL至约1500mL、约350mL至约1200mL、约350mL至约1000mL、约350mL至约800mL、约350mL至约600mL、约350mL至约500mL、约350mL至约450mL、约350mL至约400mL、约400mL至约2L、约400mL至约1800mL、约400mL至约1500mL、约400mL至约1200mL、约400mL至约1000mL、约400mL至约800mL、约400mL至约600mL、约400mL至约500mL、约400mL至约450mL、约450mL至约2L、约450mL至约1800mL、约450mL至约1500mL、约450mL至约1200mL、约450mL至约1000mL、约450mL至约800mL、约450mL至约600mL、约450mL至约500mL、约500mL至约2L、约500mL至约1800mL、约500mL至约1500mL、约500mL至约1200mL、约500mL至约1000mL、约500mL至约800mL、约500mL至约600mL、约600mL至约2L、约600mL至约1800mL、约600mL至约1500mL、约600mL至约1200mL、约600mL至约1000mL、约600mL至约800mL、约800mL至约2L、约800mL至约1800mL、约800mL至约1500mL、约800mL至约1200mL、约800mL至约1000mL、约1000mL至约2L、约1000mL至约1800mL、约1000mL至约1500mL、约1000mL至约1200mL、约1200mL至约2L、约1200mL至约1800mL、约1200mL至约1500mL、约1500mL至约2L、约1500mL至约1800mL，或约1800mL至约2L。
治疗受试者的方法
本文还提供了治疗有此需要的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的本文所述的任何组合物、配制剂或去核红系细胞群。在一些实施方案中，通过静脉内给药进行施用。
本文所述的任何方法的一些实施方案进一步包括向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方案中，可以在与本文提供的任何组合物基本上同时向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。在一些实施方案中，可以在向受试者施用本文所述的任何组合物之前或之后向受试者施用一种或多种额外的治疗剂。
实施例
下列实施例对本发明作进一步说明，但不限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1：红系细胞的灌注培养
在红系细胞分化的晚“M”期(本文所述的任何方法中的步骤(d))中将交替切向流(ATF)系统连接到生物反应器。将阶段特异性培养基灌注到生物反应器系统中，所有其他条件保持恒定。使用0.01-0.2nL/细胞/天的细胞特异性灌注率(CSPR)。
在“M”期的过程中测量灌注培养的(ATF)和对照红系细胞(补料分批培养的)的去核百分比。如图1所示，与补料分批培养的对照细胞相比，灌注培养的红系细胞达到了显著更高的去核率，在培养的第13天时具有在70％-80％之间的去核率。
在“M”期过程(本文所述方法中的步骤(d))中使用NovoCyte细胞计数器测量灌注培养的红系细胞和对照红系细胞的细胞密度。如图2所示，灌注培养的细胞达到了约1.4x107个细胞/mL的峰值细胞密度。相比之下，对照补料分批培养细胞的密度不超过2x106个细胞/mL。
使用类似的ATF系统设置来测试在红系细胞分化的“D”期期间的灌注培养(对应于本文所述方法中的步骤(b))。在“D”期的过程中，使用NovoCyte细胞计数器测量灌注培养的红系细胞的细胞密度。如图3所示，灌注培养的红系细胞在维持高存活力的情况下达到约1.3-1.7x107个细胞/mL的峰值密度。在“D”期结束时，相比于达到1.5-3x106个细胞/mL的密度的对照补料分批培养细胞(数据未显示)，灌注培养的红系细胞达到1.0x107个细胞/mL的密度。
这些结果令人惊讶地证明，在“M”期和/或“D”期期间灌注培养红系细胞导致增加的细胞密度和分化中的红系祖细胞的去核。
其他实施方案
应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。
Claims (529)
1.生成去核红系细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；
(b)灌注培养所述第二细胞培养物约2天至约15天；
(c)将一定体积的步骤(b)的所述第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；
(d)灌注培养步骤(c)的所述第三细胞培养物约5天至20天，
其中在步骤(d)之后，所述第三培养基包含去核红系细胞群。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法在步骤(a)之前进一步包括：
(i)将多个红系祖细胞布置于包含在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的所述第一细胞培养物；和
(ii)分批或补料分批培养所述第一细胞培养物约1天至约15天。
3.权利要求2所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇瓶。
4.权利要求3所述的方法，其中所述摇瓶具有约15mL至约5L的体积。
5.权利要求4所述的方法，其中所述摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。
6.权利要求5所述的方法，其中所述摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。
7.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以0.1xg至约4.1xg温育所述摇瓶。
8.权利要求7所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇瓶。
9.权利要求2所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇管。
10.权利要求9所述的方法，其中所述摇管具有约2mL至约500mL的体积。
11.权利要求10所述的方法，其中所述摇管具有约10mL至约250mL的体积。
12.权利要求11所述的方法，其中所述摇管具有约50mL至约200mL的体积。
13.权利要求9-12中任一项所述的方法，其中所述摇管是锥形容器。
14.权利要求9-13中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇管。
15.权利要求14所述的方法，其中所述步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇管。
16.权利要求2所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是培养袋。
17.权利要求16所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约25L的体积。
18.权利要求17所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约5L的体积。
19.权利要求18所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
20.权利要求16-19中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
21.权利要求20所述的方法，其中步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
22.权利要求2-21中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括分批培养所述第一细胞培养物。
23.权利要求2-21中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括补料分批培养所述第一细胞培养物。
24.权利要求23所述的方法，其中补料分批培养包括随时间添加额外体积的所述第一培养基至所述第一细胞培养物。
25.权利要求24所述的方法，其中将所述额外体积的第一培养基随时间连续添加至所述第一细胞培养物。
26.权利要求24所述的方法，其中将所述额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至所述第一细胞培养物。
27.权利要求2-26中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。
28.权利要求27所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
29.权利要求27或28所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mLFlt-3配体。
30.权利要求29所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约150ng/mL Flt-3配体。
31.权利要求2-30中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
32.权利要求31所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约500ng/mL SCF。
33.权利要求2-32中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
34.权利要求2-33中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。
35.权利要求34所述的方法，其中所述第一培养基包含约10ng/mL至约100ng/mLIL-6。
36.权利要求2-35中任一项所述的方法，其中所述第一培养基进一步包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
37.权利要求36所述的方法，其中所述第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。
38.权利要求2-37中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
39.权利要求38所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺。
40.权利要求38所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
41.权利要求38所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM的L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
42.权利要求38所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
43.权利要求2-42中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含脂质。
44.权利要求2-43中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。
45.权利要求44所述的方法，其中所述第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。
46.权利要求45所述的方法，其中所述第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。
47.权利要求46所述的方法，其中所述第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
48.权利要求2-47中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约12天。
49.权利要求48的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
50.权利要求2-49中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
51.权利要求50的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
52.权利要求1-51中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。
53.权利要求52所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
54.权利要求53所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
55.权利要求54所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。
56.权利要求1-55中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
57.权利要求56所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
58.权利要求1-57中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。
59.权利要求58所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。
60.权利要求59所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
61.权利要求1-60中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养包括随时间添加额外体积的所述第二培养基至所述第二细胞培养物。
62.权利要求61所述的方法，其中将所述额外体积的第二培养基随时间连续添加至所述第二细胞培养物。
63.权利要求61所述的方法，其中将所述额外体积的第二培养基随时间定期添加至所述第二细胞培养物。
64.权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。
65.权利要求64所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
66.权利要求65所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
67.权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
68.权利要求67所述的方法，其中所述第二培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
69.权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
70.权利要求69所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约100ng/mLIL-3。
71.权利要求70所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约10ng/mLIL-3。
72.权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
73.权利要求72所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
74.权利要求73所述的方法，其中所述第二培养基包含约10ng/mL至约200ng/nL SCF。
75.权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约200nM地塞米松。
76.权利要求75所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约100nM地塞米松。
77.权利要求76所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约25nM地塞米松。
78.权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
79.权利要求78所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
80.权利要求79所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约100ng/mL EPO。
81.权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
82.权利要求81所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
83.权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
84.权利要求83所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM的L-谷氨酰胺。
85.权利要求83所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
86.权利要求83所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM的L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
87.权利要求83所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
88.权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含脂质。
89.权利要求1-88中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述灌注培养进行约4天至约10天。
90.权利要求89的方法，其中步骤(b)的所述灌注培养进行约5天至约8天。
91.权利要求1-90中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
92.权利要求91的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
93.权利要求1-92中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。
94.权利要求93所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
95.权利要求94所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
96.权利要求95所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。
97.权利要求1-96中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第三细胞培养物。
98.权利要求97所述的方法，其中步骤(d)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第三细胞培养物。
99.权利要求1-98中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。
100.权利要求99所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。
101.权利要求100所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
102.权利要求1-101中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养包括：
(i)添加额外体积的所述第三培养基至所述第三细胞培养物持续第一时间段，和
(ii)添加额外体积的第四培养基至所述第三细胞培养物持续第二时间段。
103.权利要求102所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
104.权利要求102所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
105.权利要求102-104中任一项所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约1天至约7天。
106.权利要求105所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约3天至约5天。
107.权利要求102-106中任一项所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约1天至约10天。
108.权利要求107所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约3天至约7天。
109.权利要求1-108中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
110.权利要求109所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
111.权利要求110所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
112.权利要求1-111中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
113.权利要求112所述的方法，其中所述第三培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
114.权利要求1-113中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
115.权利要求114所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
116.权利要求115所述的方法，其中所述第三培养基包含约10ng/mL至约200ng/nLSCF。
117.权利要求1-116中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
118.权利要求117所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
119.权利要求118所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约100ng/mL EPO。
120.权利要求1-119中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
121.权利要求120所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
122.权利要求1-121中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
123.权利要求122所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
124.权利要求123所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺。
125.权利要求123所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
126.权利要求1-125中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
127.权利要求126所述的方法，其中所述第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
128.权利要求102-127中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
129.权利要求128所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
130.权利要求129所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
131.权利要求102-130中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。
132.权利要求131所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
133.权利要求102-132中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
134.权利要求133所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
135.权利要求134所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
136.权利要求102-135中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL的胰岛素。
137.权利要求136所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL的胰岛素。
138.权利要求102-137中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
139.权利要求138所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
140.权利要求139所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺。
141.权利要求139所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
142.权利要求102-141中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
143.权利要求142所述的方法，其中所述第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
144.权利要求1-143中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述灌注培养进行约8天至约15天。
145.权利要求144所述的方法，其中步骤(d)的所述灌注培养进行约9天至约13天。
146.权利要求1-145中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。
147.权利要求146所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
148.权利要求1-147中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(d)中的所述灌注培养包括使用切向过滤。
149.权利要求148所述的方法，其中所述切向过滤是交替切向过滤(ATF)。
150.权利要求148或149所述的方法，其中所述切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。
151.权利要求150所述的方法，其中所述过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
152.权利要求1-151中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
153.权利要求152所述的方法，其中步骤(d)产生约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
154.权利要求153所述的方法，其中步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
155.生成去核红系细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在器皿内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；
(b)分批或补料分批培养所述第二细胞培养物约2天至约15天；
(c)将一定体积的步骤(b)的所述第二细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；
(d)灌注培养步骤(c)的所述第三细胞培养物约5天至20天，
其中在步骤(d)之后，所述第三培养基包含去核红系细胞群。
156.权利要求155所述的方法，其中所述方法在步骤(a)之前进一步包括：
(i)将多个红系祖细胞布置于包含在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的所述第一细胞培养物；和
(ii)分批或补料分批培养所述第一细胞培养物约1天至约15天。
157.权利要求156所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇瓶。
158.权利要求157所述的方法，其中所述摇瓶具有约15mL至约5L的体积。
159.权利要求158所述的方法，其中所述摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。
160.权利要求159所述的方法，其中所述摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。
161.权利要求156-160中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇瓶。
162.权利要求161所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇瓶。
163.权利要求156所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇管。
164.权利要求163所述的方法，其中所述摇管具有约2mL至约500mL的体积。
165.权利要求164所述的方法，其中所述摇管具有约10mL至约250mL的体积。
166.权利要求165所述的方法，其中所述摇管具有约50mL至约200mL的体积。
167.权利要求163-166中任一项所述的方法，其中所述摇管是锥形容器。
168.权利要求163-167中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇管。
169.权利要求168所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇管。
170.权利要求156所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是培养袋。
171.权利要求170所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约25L的体积。
172.权利要求171所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约5L的体积。
173.权利要求172所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
174.权利要求170-173中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
175.权利要求174所述的方法，其中步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
176.权利要求156-175中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括分批培养所述第一细胞培养物。
177.权利要求156-175中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括补料分批培养所述第一细胞培养物。
178.权利要求177所述的方法，其中补料分批培养包括随时间添加额外体积的所述第一培养基至所述第一细胞培养物。
179.权利要求178所述的方法，其中将所述额外体积的第一培养基随时间连续添加至所述第一细胞培养物。
180.权利要求178所述的方法，其中将所述额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至所述第一细胞培养物。
181.权利要求156-180中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。
182.权利要求181所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
183.权利要求181或182所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体。
184.权利要求183所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约150ng/mLFlt-3配体。
185.权利要求156-184中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
186.权利要求185所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约500ng/mLSCF。
187.权利要求156-186中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mLIL-3。
188.权利要求156-187中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。
189.权利要求188所述的方法，其中所述第一培养基包含约10ng/mL至约100ng/mL IL-6。
190.权利要求156-189中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
191.权利要求190所述的方法，其中所述第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL胰岛素。
192.权利要求156-191中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
193.权利要求192所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。
194.权利要求192所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
195.权利要求192所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
196.权利要求192所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-乙酰基-L-谷氨酰胺。
197.权利要求156-196中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含脂质。
198.权利要求156-197中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。
199.权利要求198所述的方法，其中所述第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。
200.权利要求199所述的方法，其中所述第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。
201.权利要求200所述的方法，其中所述第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
202.权利要求156-201中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约12天。
203.权利要求202所述的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
204.权利要求156-203中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
205.权利要求204所述的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
206.权利要求155-205中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述器皿是摇瓶。
207.权利要求206所述的方法，其中所述摇瓶具有约15mL至约3L的体积。
208.权利要求207所述的方法，其中所述摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。
209.权利要求208所述的方法，其中所述摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。
210.权利要求155-209中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以0.1xg至约4.1xg温育摇瓶。
211.权利要求210所述的方法，其中步骤(b)包括以约0.23xg至约1.78xg温育摇瓶。
212.权利要求155-205中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述器皿是摇管。
213.权利要求212所述的方法，其中所述摇管具有约2mL至约500mL的体积。
214.权利要求213所述的方法，其中所述摇管具有约10mL至约250mL的体积。
215.权利要求214所述的方法，其中所述摇管具有约50mL至约200mL的体积。
216.权利要求212-215中任一项所述的方法，其中所述摇管是锥形容器。
217.权利要求212-216中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇管。
218.权利要求217所述的方法，其中步骤(b)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇管。
219.权利要求155-205中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述器皿是培养袋。
220.权利要求219所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约25L的体积。
221.权利要求220所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约5L的体积。
222.权利要求221所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
223.权利要求219-222中任一项所述的方法，其中步骤(b)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
224.权利要求223所述的方法，其中步骤(b)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
225.权利要求155-205中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述器皿是生物反应器。
226.权利要求225所述的方法，其中所述生物反应器具有1L至约15,000L的体积。
227.权利要求226所述的方法，其中步骤(a)中的所述生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
228.权利要求227所述的方法，其中步骤(a)中的所述生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
229.权利要求228所述的方法，其中步骤(a)中的所述生物反应器具有约5L至约100L的体积。
230.权利要求225-229中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
231.权利要求230所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
232.权利要求155-231中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括分批培养所述第二细胞培养物。
233.权利要求155-231中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括补料分批培养所述第二细胞培养物。
234.权利要求233所述的方法，其中补料分批培养包括随时间添加额外体积的所述第二培养基至所述第二细胞培养物。
235.权利要求234所述的方法，其中将所述额外体积的第二培养基随时间连续添加至所述第二细胞培养物。
236.权利要求235所述的方法，其中将所述额外体积的第二细胞培养基随时间定期添加至所述第二细胞培养物。
237.权利要求155-236中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。
238.权利要求237所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
239.权利要求238所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
240.权利要求155-239中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
241.权利要求240所述的方法，其中所述第二培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
242.权利要求155-241中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
243.权利要求242所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约100ng/mLIL-3。
244.权利要求243所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约10ng/mLIL-3。
245.权利要求155-244中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
246.权利要求245所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
247.权利要求246所述的方法，其中所述第二培养基包含约10ng/mL至约200ng/nLSCF。
248.权利要求155-247中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约200nM地塞米松。
249.权利要求248所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约100nM地塞米松。
250.权利要求249所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约25nM地塞米松。
251.权利要求155-250中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
252.权利要求251所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
253.权利要求252所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
254.权利要求155-253中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
255.权利要求254所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
256.权利要求155-255中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
257.权利要求256所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。
258.权利要求256所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
259.权利要求256所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
260.权利要求256所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
261.权利要求155-260中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含脂质。
262.权利要求155-261中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述分批或补料分批培养进行约4天至约10天。
263.权利要求262所述的方法，其中步骤(b)的所述分批或补料分批培养进行约5天至约8天。
264.权利要求155-263中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
265.权利要求264所述的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
266.权利要求155-265中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。
267.权利要求266所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
268.权利要求267所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
269.权利要求268所述的方法，其中步骤(c)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。
270.权利要求155-269中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第三细胞培养物。
271.权利要求270所述的方法，其中步骤(d)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第三细胞培养物。
272.权利要求155-271中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。
273.权利要求272所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。
274.权利要求273所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
275.权利要求155-274中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养包括：
(i)添加额外体积的所述第三培养基至所述第三细胞培养物持续第一时间段，和
(ii)添加额外体积的第四培养基至所述第三细胞培养物持续第二时间段。
276.权利要求275所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
277.权利要求275所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
278.权利要求275-277中任一项所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约1天至约7天。
279.权利要求278所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约3天至约5天。
280.权利要求275-279中任一项所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约1天至约10天。
281.权利要求280所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约3天至约7天。
282.权利要求155-281中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
283.权利要求282所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
284.权利要求283所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
285.权利要求155-284中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
286.权利要求285所述的方法，其中所述第三培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
287.权利要求155-286中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
288.权利要求287所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
289.权利要求288所述的方法，其中所述第三培养基包含约10ng/mL至约200ng/nLSCF。
290.权利要求155-289中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
291.权利要求290所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
292.权利要求291所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
293.权利要求155-292中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
294.权利要求293所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
295.权利要求155-294中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
296.权利要求295所述的方法，其中所述第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或其组合。
297.权利要求296所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。
298.权利要求296所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
299.权利要求155-298中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
300.权利要求299所述的方法，其中所述第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
301.权利要求275-300中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
302.权利要求301所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
303.权利要求302所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
304.权利要求275-303中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。
305.权利要求304所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
306.权利要求275-305中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
307.权利要求306所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
308.权利要求307所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
309.权利要求275-308中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
310.权利要求309所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
311.权利要求275-310中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
312.权利要求311所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺或L-甘氨酰-L-谷氨酰胺或其组合。
313.权利要求312所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM L-谷氨酰胺。
314.权利要求312所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
315.权利要求275-314中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
316.权利要求315所述的方法，其中所述第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
317.权利要求155-316中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述灌注培养进行约8天至约15天。
318.权利要求317所述的方法，其中步骤(d)的所述灌注培养进行约9天至约13天。
319.权利要求155-318中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。
320.权利要求319所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
321.权利要求155-320中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述灌注培养包括使用切向过滤。
322.权利要求321所述的方法，其中所述切向过滤是交替切向过滤(ATF)。
323.权利要求321或322所述的方法，其中所述切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。
324.权利要求323所述的方法，其中所述过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
325.权利要求155-324中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
326.权利要求325所述的方法，其中步骤(d)产生约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
327.权利要求326所述的方法，其中步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
328.生成去核红系细胞群的方法，所述方法包括：
(a)将一定体积的红系祖细胞的第一细胞培养物布置到包含在灌注生物反应器内的第二培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第二细胞培养物；
(b)灌注培养所述第二细胞培养物约2天至约15天；
(c)将一定体积的步骤(b)的所述第二细胞培养物布置到包含在器皿内的第三培养基中，以提供具有约1x105至约1x107个细胞/mL的初始细胞密度的第三细胞培养物；
(d)分批或补料分批培养步骤(c)的所述第三细胞培养物约5天至20天，其中在步骤(d)之后，所述第三培养基包含去核红系细胞群。
329.权利要求328所述的方法，其中所述方法在步骤(a)之前进一步包括：
(i)将多个红系祖细胞布置于包含在器皿内的第一培养基中，以提供具有约0.1x105个细胞/mL至约2x106个细胞/mL的初始细胞密度的所述第一细胞培养物；和
(ii)分批或补料分批培养所述第一细胞培养物约1天至约15天。
330.权利要求329所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇瓶。
331.权利要求330所述的方法，其中所述摇瓶具有约15mL至约3L的体积。
332.权利要求331所述的方法，其中所述摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。
333.权利要求332所述的方法，其中所述摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。
334.权利要求329-333中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇瓶。
335.权利要求334所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇瓶。
336.权利要求329所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是摇管。
337.权利要求336所述的方法，其中所述摇管具有约2mL至约500mL的体积。
338.权利要求337所述的方法，其中所述摇管具有约10mL至约250mL的体积。
339.权利要求338所述的方法，其中所述摇管具有约50mL至约200mL的体积。
340.权利要求336-339中任一项所述的方法，其中所述摇管是锥形容器。
341.权利要求336-340中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇管。
342.权利要求341所述的方法，其中步骤(ii)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇管。
343.权利要求329所述的方法，其中步骤(i)中的所述器皿是培养袋。
344.权利要求343所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约25L的体积。
345.权利要求344所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约5L的体积。
346.权利要求345所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
347.权利要求343-346中任一项所述的方法，其中步骤(ii)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
348.权利要求347所述的方法，其中步骤(ii)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
349.权利要求329-348中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括分批培养所述第一细胞培养物。
350.权利要求329-348中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括补料分批培养所述第一细胞培养物。
351.权利要求350所述的方法，其中补料分批培养包括随时间添加额外体积的所述第一培养基至所述第一细胞培养物。
352.权利要求351所述的方法，其中将所述额外体积的第一培养基随时间连续添加至所述第一细胞培养物。
353.权利要求351所述的方法，其中将所述额外体积的第一细胞培养基随时间定期添加至所述第一细胞培养物。
354.权利要求329-353中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、干细胞因子(SCF)、IL-3和IL-6中的一种或多种。
355.权利要求354所述的方法，其中所述第一培养基包含Flt-3配体、SCF、IL-3和IL-6中的每一种。
356.权利要求354或355所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL Flt-3配体。
357.权利要求356所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约150ng/mLFlt-3配体。
358.权利要求329-357中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
359.权利要求358所述的方法，其中所述第一培养基包含约50ng/mL至约500ng/mLSCF。
360.权利要求329-359中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
361.权利要求329-360中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-6。
362.权利要求361所述的方法，其中所述第一培养基包含约10ng/mL至约100ng/mL IL-6。
363.权利要求329-362中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含约1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
364.权利要求363所述的方法，其中所述第一培养基包含约8μg/mL至约12μg/mL的胰岛素。
365.权利要求329-364中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
366.权利要求365所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。
367.权利要求365所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
368.权利要求365所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
369.权利要求365所述的方法，其中所述第一培养基包含约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
370.权利要求329-369中任一项所述的方法，其中所述第一培养基脂质。
371.权利要求329-370中任一项所述的方法，其中所述第一培养基包含约50μg/mL至约400μg/mL转铁蛋白。
372.权利要求371所述的方法，其中所述第一培养基包含约150μg/mL至约250μg/mL转铁蛋白。
373.权利要求372所述的方法，其中所述第一培养基包含约160μg/mL至约240μg/mL转铁蛋白。
374.权利要求373所述的方法，其中所述第一培养基包含约180μg/mL至约220μg/mL转铁蛋白。
375.权利要求329-374中任一项所述的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约12天。
376.权利要求375所述的方法，其中步骤(ii)中的所述分批或补料分批培养进行约5天至约9天。
377.权利要求329-376中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
378.权利要求377所述的方法，其中步骤(i)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
379.权利要求328-378中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约500mL至约15,000L的体积。
380.权利要求379所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
381.权利要求380所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
382.权利要求381所述的方法，其中步骤(a)中的所述灌注生物反应器具有约5L至约100L的体积。
383.权利要求328-382中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
384.权利要求383所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
385.权利要求328-384中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约0.5nL/细胞/天至约40nL/细胞/天的灌注速率进行。
386.权利要求385所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约5nL/细胞/天至约35nL/细胞/天的灌注速率进行。
387.权利要求386所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养使用约10nL/细胞/天至约25nL/细胞/天的灌注速率进行。
388.权利要求328-387中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养包括随时间添加额外体积的所述第二培养基至所述第二细胞培养物。
389.权利要求388所述的方法，其中将所述额外体积的第二培养基随时间连续添加至所述第二细胞培养物。
390.权利要求388所述的方法，其中将所述额外体积的第二培养基随时间定期添加至所述第二细胞培养物。
391.权利要求328-390中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、红细胞生成素(EPO)和胰岛素。
392.根据权利要求391所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的三种或更多种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
393.权利要求392所述的方法，其中所述第二培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、IL-3、SCF、地塞米松、EPO和胰岛素。
394.权利要求328-393中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
395.权利要求394所述的方法，其中所述第二培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
396.权利要求328-395中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约200ng/mL IL-3。
397.权利要求396所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约100ng/mLIL-3。
398.权利要求397所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1ng/mL至约10ng/mLIL-3。
399.权利要求328-398中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
400.权利要求399所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
401.权利要求400所述的方法，其中所述第二培养基包含约10ng/mL至约200ng/nLSCF。
402.权利要求328-401中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约200nM地塞米松。
403.权利要求402所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约100nM地塞米松。
404.权利要求403所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1nM至约25nM地塞米松。
405.权利要求328-404中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
406.权利要求405所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
407.权利要求406所述的方法，其中所述第二培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
408.权利要求328-407中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
409.权利要求408所述的方法，其中所述第二培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
410.权利要求328-409中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含约1mM至约10mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
411.权利要求410所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-谷氨酰胺。
412.权利要求410所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
413.权利要求410所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM L-甘氨酰-L-谷氨酰胺。
414.权利要求410所述的方法，其中所述第二培养基包含约5mM至约7mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺。
415.权利要求328-414中任一项所述的方法，其中所述第二培养基包含脂质。
416.权利要求328-415中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述灌注培养进行约4天至约10天。
417.权利要求416所述的方法，其中步骤(b)的所述灌注培养进行约5天至约8天。
418.权利要求328-417中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.1x105个细胞/mL至约2x105个细胞/mL。
419.权利要求418所述的方法，其中步骤(a)中的所述初始细胞密度为约0.5x105个细胞/mL至约1.5x105个细胞/mL。
420.权利要求328-419中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述器皿是摇瓶。
421.权利要求420所述的方法，其中所述摇瓶具有约15mL至约3L的体积。
422.权利要求421所述的方法，其中所述摇瓶具有约50mL至约1.5L的体积。
423.权利要求422所述的方法，其中所述摇瓶具有约100mL至约500mL的体积。
424.权利要求328-423中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇瓶。
425.权利要求424所述的方法，其中步骤(d)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇瓶。
426.权利要求328-419中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述器皿是摇管。
427.权利要求426所述的方法，其中所述摇管具有约2mL至约500mL的体积。
428.权利要求427所述的方法，其中所述摇管具有约10mL至约250mL的体积。
429.权利要求428所述的方法，其中所述摇管具有约50mL至约200mL的体积。
430.权利要求426-429中任一项所述的方法，其中所述摇管是锥形容器。
431.权利要求426-430中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括以约0.1xg至约4.1xg温育所述摇管。
432.权利要求431所述的方法，其中步骤(d)包括以约0.23xg至约1.78xg温育所述摇管。
433.权利要求328-419中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述器皿是培养袋。
434.权利要求433所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约25L的体积。
435.权利要求434所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约5L的体积。
436.权利要求435所述的方法，其中所述培养袋具有约50mL至约500mL的体积。
437.权利要求433-436中任一项所述的方法，其中步骤(d)进一步包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约50个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
438.权利要求437所述的方法，其中步骤(d)包括以每分钟约10个摇摆周期至每分钟约25个摇摆周期的摇摆速率温育所述培养袋。
439.权利要求328-419中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述器皿是生物反应器。
440.权利要求439所述的方法，其中所述生物反应器具有1L至约15,000L的体积。
441.权利要求440所述的方法，其中所述生物反应器具有5L至约5,000L的体积。
442.权利要求441所述的方法，其中所述生物反应器具有约5L至约2,500L的体积。
443.权利要求442所述的方法，其中所述生物反应器具有约5L至约100L的体积。
444.权利要求439-443中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约200W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
445.权利要求444所述的方法，其中步骤(b)包括以约10W/m3至约100W/m3的P/V值搅动所述第二细胞培养物。
446.权利要求328-445中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括分批培养所述第三细胞培养物。
447.权利要求328-445中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括补料分批培养所述第三细胞培养物。
448.权利要求447所述的方法，其中补料分批培养包括随时间添加额外体积的所述第三培养基至所述第三细胞培养物。
449.权利要求448所述的方法，其中将所述额外体积的第三培养基随时间连续添加至所述第三细胞培养物。
450.权利要求448所述的方法，其中将所述额外体积的第三细胞培养基随时间定期添加至所述第三细胞培养物。
451.权利要求328-450中任一项所述的方法，其中步骤(d)中的所述分批和补料分批培养包括：
(i)添加额外体积的所述第三培养基至所述第三细胞培养物持续第一时间段，和
(ii)添加额外体积的第四培养基至所述第三细胞培养物持续第二时间段。
452.权利要求451所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基连续添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
453.权利要求451所述的方法，其中：
将(i)中所述额外体积的第三培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第一时间段；和/或
将(ii)中所述额外体积的第四培养基定期添加至所述第三细胞培养物持续所述第二时间段。
454.权利要求451-453中任一项所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约1天至约7天。
455.权利要求454所述的方法，其中(i)中的所述第一时间段为约3天至约5天。
456.权利要求451-455中任一项所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约1天至约10天。
457.权利要求456所述的方法，其中(ii)中的所述第二时间段为约3天至约7天。
458.权利要求328-457中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
459.权利要求458所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
460.权利要求459所述的方法，其中所述第三培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素、SCF和EPO。
461.权利要求328-460中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1μg/mL转铁蛋白至约500μg/mL转铁蛋白。
462.权利要求461所述的方法，其中所述第三培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约300μg/mL转铁蛋白。
463.权利要求328-462中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约1μg/mL SCF。
464.权利要求463所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL SCF。
465.权利要求464所述的方法，其中所述第三培养基包含约10ng/mL至约200ng/nLSCF。
466.权利要求328-465中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
467.权利要求466所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
468.权利要求467所述的方法，其中所述第三培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
469.权利要求328-468中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
470.权利要求469所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
471.权利要求328-470中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
472.权利要求471所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
473.权利要求472所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺。
474.权利要求472所述的方法，其中所述第三培养基包含约3mM至约5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
475.权利要求328-474中任一项所述的方法，其中所述第三培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
476.权利要求475所述的方法，其中所述第三培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
477.权利要求451-476中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的一种或多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
478.权利要求477所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的两种或更多种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
479.权利要求478所述的方法，其中所述第四培养基包含以下的每一种：转铁蛋白、胰岛素和EPO。
480.权利要求451-479中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约2mg/mL转铁蛋白。
481.权利要求480所述的方法，其中所述第四培养基包含约100μg/mL转铁蛋白至约1.5mg/mL转铁蛋白。
482.权利要求451-481中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约500ng/mL EPO。
483.权利要求482所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约200ng/mL EPO。
484.权利要求483所述的方法，其中所述第四培养基包含约1ng/mL至约100mg/mL EPO。
485.权利要求451-484中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约50μg/mL胰岛素。
486.权利要求485所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.1μg/mL至约20μg/mL胰岛素。
487.权利要求451-486中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约1mM至约8mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
488.权利要求487所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-甘氨酰-L-谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其组合。
489.权利要求488所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-谷氨酰胺。
490.权利要求488所述的方法，其中所述第四培养基包含约3mM至约5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
491.权利要求451-490中任一项所述的方法，其中所述第四培养基包含约0.5％v/v至约10％v/v血清。
492.权利要求491所述的方法，其中所述第四培养基包含约4％v/v至约6％v/v血清。
493.权利要求328-492中任一项所述的方法，其中步骤(d)的所述分批或补料分批培养进行约8天至约15天。
494.权利要求493所述的方法，其中步骤(d)的所述分批或补料分批培养进行约9天至约13天。
495.权利要求328-494中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约2.0x105个细胞/mL至约8.0x105个细胞/mL。
496.权利要求495所述的方法，其中步骤(c)中的所述初始细胞密度为约4.0x105个细胞/mL至约6.0x105个细胞/mL。
497.权利要求328-496中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述灌注培养包括使用切向过滤。
498.权利要求497所述的方法，其中所述切向过滤是交替切向过滤(ATF)。
499.权利要求497或498所述的方法，其中所述切向过滤包括使用具有约10nm至约6.0μm的平均孔径的过滤器。
500.权利要求499所述的方法，其中所述过滤器具有约0.1μm至约3.0μm的平均孔径。
501.权利要求328-500中任一项所述的方法，其中步骤(d)产生约5x106个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
502.权利要求501所述的方法，其中步骤(d)产生约1x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
503.权利要求502所述的方法，其中步骤(d)产生约5x107个去核红系细胞/mL至约2x108个去核红系细胞/mL的细胞密度。
504.权利要求1-503中任一项所述的方法，其中所述红系祖细胞是人红系祖细胞。
505.权利要求504所述的方法，其中所述红系祖细胞获得自O阴性人供体。
506.权利要求505所述的方法，其中所述红系祖细胞获得自O阴性和Kell阴性人供体。
507.权利要求1-506中任一项所述的方法，其中所述去核红系细胞群是去核人红系细胞群。
508.权利要求1-507中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(e)从步骤(d)中的所述第三细胞培养物中分离所述去核红系细胞群。
509.权利要求508所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(f)配制在步骤(e)中分离的所述去核红系细胞群。
510.权利要求509所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(g)向有此需要的受试者施用步骤(f)中的配制的去核红系细胞群。
511.权利要求1-506中任一项所述的方法，其中：
所述方法进一步包括，在步骤(a)之前，将核酸引入所述第一细胞培养物中的所述红系祖细胞中，和
所述方法导致工程化去核红系细胞群的生产。
512.权利要求511所述的方法，其中所述工程化去核红系细胞群是工程化去核人红系细胞。
513.权利要求511或512所述的方法，其中所述核酸编码一种或多种外源性多肽。
514.权利要求511-513中任一项所述的方法，其中所述工程化人去核红系细胞包含一种或多种外源性蛋白质。
515.权利要求514所述的方法，其中所述方法进一步包括将一种或多种外源性蛋白质与所述细胞进行点击缀合。
516.权利要求514所述的方法，其中所述方法进一步包括低渗加载所述细胞。
517.权利要求514所述的方法，其中所述方法进一步包括通过物理操作加载所述细胞。
518.权利要求514-517中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源性蛋白质中的一种存在于所述工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。
519.权利要求514-518中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源性蛋白质中的一种是存在于所述工程化人去核红系细胞的膜上的蛋白质。
520.权利要求514-517中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源性蛋白质中的一种是苯丙氨酸解氨酶，其中所述苯丙氨酸解氨酶存在于所述工程化人去核红系细胞的胞质溶胶中。
521.权利要求514-517中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源性蛋白质包含免疫调节分子。
522.权利要求514-517中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源性蛋白质包含抗原呈递分子。
523.权利要求511-522中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(e)从步骤(d)中的所述第三细胞培养物中分离所述工程化去核红系细胞群。
524.权利要求523所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(f)配制在步骤(e)中分离的所述工程化去核红系细胞群。
525.权利要求524所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(g)向有此需要的受试者施用步骤(f)中的配制的工程化去核红系细胞群。
526.通过权利要求1-508中任一项所述的方法产生的去核红系细胞群。
527.通过权利要求509所述的方法产生的配制剂。
528.通过权利要求511-523中任一项所述的方法产生的去核红系细胞群。
529.通过权利要求524所述的方法产生的配制剂。
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2021
- 2021-11-17 IL IL288208A patent/IL288208A/en unknown
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