KR20090095473A - 생체내에서 조혈 자극제로서 사용하기 위한 재조합 ｔａｔ-ｈｏｘｂ４ｈ 단백질의 제조 방법 - Google Patents
생체내에서 조혈 자극제로서 사용하기 위한 재조합 ｔａｔ-ｈｏｘｂ４ｈ 단백질의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 증가된 안정성 및 수율과 같은 예상치 못한 이점을 제공하여 단백질의 생체내 투여를 허여하는, C-말단에서 적어도 6개의 히스티딘 잔기를 함유하는 C-말단 히스티딘 태깅된 TAT-HOXB4 융합 단백질(TAT-HOXB4H)을 제조하는 신규하고 비자명한 방법, 및 조혈 세포의 생산에 대한 자극 활성을 갖는 유효 성분, TAT-HOXB4H를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 특히 화학요법 또는 방사선조사 이후에, 골수 이식편의 착상, 조혈 재구성, 골수 증식(re-population) 및 순환성 줄기 세포의 개수를 증가시킨다.
히스티딘 잔기, TAT-HOXB4 융합 단백질, 조혈 세포, 조혈 자극제
Description
본 발명은 C-말단에서 적어도 6개의 히스티딘 잔기를 함유하는 C-말단 히스티딘 태깅된 TAT-HOXB4 융합 단백질(TAT-HOXB4H)을 제조하는 신규하고 비자명한 방법에 관한 것이다. 이러한 제조 방법은 증가된 안정성 및 수율과 같은 예상치 못한 이점을 제공하며, 이는 상기 단백질의 생체내 투여에서 성공을 가능하게 한다.
재생 의약에서는 기관 특이적 줄기 세포 또는 자기복제(self-renewing) 세포에 대한 연구가 점점 더 증가되고 있다. 가장 잘 연구된 자기복제 세포 집단은 조혈 줄기 세포(Hematopoietic stem cell: HSC)로서, 이것은 암에서부터 대사질환과 면역결핍에 이르는 질병을 치료하기 위한 혁신적 선택이기 때문이다.
적혈구 및 백혈구 세포가 골수에 위치한 HSC의 분열을 통하여 교체되는 혈액 세포 형성 과정은 조혈(hematopoiesis)라 불린다. HSC는 자기복제되고 또 림프양 및 골수양(myeloid)의 성숙 세포로 분화될 수 있는 주요 특성을 갖는다. 그러나 HSC 분열의 자기 복제 및 분화 결과의 대조에 관여하는 유전자 메카니즘은 대개 알 려져 있지 않다.
현재, 성인 골수, 이동한 말초혈액 및 제대혈(UCB)로부터 얻은 인간 HSC의 이식은 조혈 암(백혈병 및 림프종)을 임상적으로 치료하고 또 고투여량 화학요법의 비-조혈성 암으로부터 면역계 회복을 위하여 사용되어 왔다. 그러나, 효과적인 이식은 상이한 공급원으로부터 얻은 상당량의 HSC를 필요로 하고 또 팽창을 필요로 할 수 있다.
HSC는 골수, 말초혈액 및 UCB로부터 기인할 수 있다. 골수 세포의 추출은 수술과 고통스런 과정을 필요로 하므로, 덜 바람직한 방법이다. 말초혈액을 사용하는 것은 질병이나 화학요법으로 고통받는 환자의 조혈로부터 정량된 HSC를 얻기가 어려운 문제가 있다. UCB는 비교적 얻기 쉽고 또 HSC의 품질도 훨씬 더 높지만, 이러한 방법으로 얻은 HSC의 수는 여전히 제한된다. 이러한 추출로부터 얻은 세포 수는 어린이에게는 충분하지만, 성인에게는 불충분할 수 있다. 이러한 잠재된 문제를 극복하기 위하여, 줄기 세포 자기복제 과정에 의해 시험관내 HSC 증식을 촉진시키는 새로운 방법이 HSC 이식을 위해 필요하다.
전사 인자가 줄기 세포에서 유전자 발현 및 분화의 조절에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다(Orkin, S. H. Nature Reviews Genetics 1, 57-64, 2000). 전사 인자는 특정 유전자 표적에 대한 결합을 통하여 다양한 세포 과정을 전환하며, 이러한 조절은 그의 세포 농도에 따라 달라진다. DNA 결합 호메오박스(homeobox: HOX)로 불리는 전사 인자 그룹은 배아형성에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 최근, HOX 패밀리는 HSC의 발달에 관여하는 것으로 또한 밝혀졌다(Buske, C. et. al., J. Hematol. 71, 301-308, 2000). HOX 전사 인자에 의한 HSC 자기복제의 조절은 몬트리올 대학의 Guy Sauvageau 박사에 의해 연구되었다. Sauvageau의 그룹은 골수에서 HSC 집단을 유지하는 능력으로 인하여 HSC 자기 복제의 조절에 중요함을 밝혀내었다. 혈액 세포에서 발현된 HOX 유전자는 인간 및 마우스 세포주에서 최초로 관찰되었다. 일부 유형의 HOX 유전자는 다양한 세포 유형에서 도처에서 발현되는 반면에, 다른 것들은 특정 유형의 세포 또는 발달하는 동안 특정 시점에서 특이적으로 발현된다. 예컨대, 인간 HOXB 클러스터의 8개 멤버는 적혈구 발달의 초기 단계에서 발현된다. 그러나, HOXB4 및 HOXB7과 같은 HOXB 유전자는 T 세포 및 B 세포에서 발현된다. Sauvageau 그룹은 9개의 HOXA, 8개의 HOXB 및 4개의 HOXC 유전자는 CD34+ 골수 세포에서 발현됨을 확인하였다. 이들 중에서 CD34+ 골수 세포, HOXB2, HOXB9 및 HOXA10은 적혈구 전구세포에서 가장 잘 농축되어 있다. 그러나, HOX 유전자는 CD34- 세포에서 발현되지 않는다. 인간 호메오박스 B4 (HOXB4) 유전자는 최근 레트로바이러스 또는 재조합 단백질 형태로 HSC를 효과적으로 팽창시키는 것으로 밝혀졌다. 재조합 TAT-HOXB4 단백질은 레트로바이러스 삽입 또는 골수 간질세포와의 공동배양의 우려없이 실험실 규모로 줄기 세포를 팽창시키기 위해 사용된다(참고 KrosI, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003). 따라서, HOXB4 단백질은 시험관내에서 HSC 팽창을 증진시키기 위한 자극제로서 규칙적으로 사용된다(도 1).
최근의 증거는 TAT 단백질 서열 태그를 HOXB4의 N-말단에 부가하는 것에 의 해, 외인성 HOXB4rk 세포로 전달될 수 있음을 나타낸다. 이러한 TAT 서열은 HOXB4가 세포외측으로부터 세포내측으로 수송되게 한다. 세포질에 들어가면, HOXB4는 샤퍼론(chaperon) HSP90에 의해 천연 형태로 리폴딩(refolded)될 수 있다. TAT-HOXB$는 HSC 증식을 2-6배 증진시킬 수 있다(Amsellem, S. et. al., Nature Medicine 9, 1423-1427, 2003; Krosl, J. et. al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003). 그러나, 보통의 정제 과정을 이용하여 대장균으로부터 재조합 TAT-HOXB4 단백질을 얻은 수율은 아주 낮다.
재조합 TAT-HOXB4 단백질의 수율을 증가시키기 위한 노력으로서, C-말단에서 태깅된 부가적인 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 재조합 TAT-HOXB4 단백질의 제조방법이 개발되었고, 이것은 정제 후 원래의 단백질과 비교하여 3-4배 수율을 초래하였다. 이러한 재조합 단백질(TAT-HOXB4H)은 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기를 함유한다. 이러한 방법은 PCT 출원 PCT/CN2006/000646호에 자세하게 기재되었다.
재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 인간의 말초혈액 또는 UCB 줄기 세포를 팽창시키기 위하여 사용될 수 있고 또 팽창된 줄기 세포는 이들의 다능성(pluripotency)을 보유함이 밝혀졌다. 또한, NOD-SCID(nonobese diabetic-severe ocmbined immunodeficiency) 마우스의 골수에 혼입된 재조합 TAT-HOXB4H 단백질 및 인간 밸혁구로 처리된 줄기 세포는 말초 백혈구 세포에서 겸출되었고, 이는 마우스에서 면역 및 조혈 재구성을 나타낸다.
그러나, 재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 이전에는 조혈 재구성, 팽창, 골수 재증식을 향상시키기 위하여 또 특히 화학요법 또는 조사후에 말초 순환 줄기 세포의 수를 증가시키기 위하여 생체내에서 조혈 자극제로서 사용된 바 없다. Krosl et al. (2003) 및 Amsellm et al. (2003)은 HSC를 팽창시키는 임상 연구에 사용하기 위한 고도로 안정한 다량의 HOXB4 단백질을 얻을 수 없었다. 본 발명에서는, 정제후 얻은 TAT-HOXB4H 단백질의 전체량은 일반적으로 1 리터 배양액으로부터 6-10 mg 범위인 반면에, 종래 기술의 방법을 이용하여 1리터 배양액으로부터 정제한 후 얻은 TAT-HOXB4 단백질의 전체량은 일반적으로 1-2 mg 범위이다. 종래 기술의 방법을 이용하여 TAT-HOXB4 단백질을 발현하기 위하여 사용된 pTAT-HA-HOXB4 플라스미드는 캐나다 몬트리올 대학의 Guy Sauvageau 박사로부터 선물로 받았다. 본 발명을 이용하여 TAT-HOXB4H 단백질을 정제하는 방법은 생체내 투여를 위해 필요한 단백질의 수율 증대를 분명히 나타낸다. Krosl et al. (2003)은 또한 이들의 TAT-HOXB4 단배질의 대부분은 혈청을 갖는 배지에서 4시간 배양한 후 상실되었다고 보고하였다. 본 발명은 4주후에도 TAT-HOXB4H 단백질의 현저히 높은 안정성을 나타내며, 이것은 임상 연구에서 TAT-HOXB4H 단백질을 사용하는데 있어 중요한 인자이다.
본 발명은 높은 수율 및 안정성을 갖는 TAT-HOXB4H 단백질을 제조하는 신규하고 비자명한 방법을 기본으로 하며, 또 재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 투여를 필요로 하는 검체에게 투여될 때 생체내에서 골수 및 말초 혈액 모두에서 HSC 수를 증가시키는 발견을 기초로 하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 높은 수율 및 안정성을 갖는 TAT-HOXB4H 단백질을 제조하는 신규하고 비자명한 방법을 기본으로 하며, 또 재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 투여를 필요로 하는 검체에게 투여될 때 생체내에서 골수 및 말초 혈액 모두에서 HSC 수를 증가시키는 발견을 기초로 하고 있다.
본 발명의 제1 요지는 TAT-HOXB4H 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고; (b) 단백질을 숙주 세포에서 발현하며; (c) 발현된 단백질의 불순 용액을 수집하고; (d) (i) 상기 용액을 HisTrap 칼럼에 적용하고; (ii) 상기 HisTrap 칼럼을 세척하며; (iii) 상기 HisTrap 칼럼으로부터 부분적으로 정제된 단백질을 용출시켜 부분적으로 정제된 단백질 용액을 형성하고; (iv) 부분적으로 정제된 단백질 용액을 MonoSP 칼럼에 적용하며; (v) MonoSP 칼럼을 세정하고; (vi) MonoSP 칼럼으로부터 변성된 형태의 정제된 단백질을 용출하는 것에 의해 용액으로부터 단백질을 정제하며; (e) (i) 용출된 변성 단백질 및 소수성 화합물의 용액을 조합하여 단백질과 소수성 화합물의 용액을 형성하고; (ii) 단백질과 소수성 화합물의 용액을 탈염시켜 탈염된 단백질 및 소수성 화합물 용액을 얻으며; (iii) 소수성 화합물을 탈염된 단백질 용액으로부터 한외여과(ultrafiltration)에 의해 제거하는 것에 의해 용출된 변성 단백질은 소수성 화합물을 사용하여 리폴딩하는 것을 포함한다.
본 발명의 1개 요지는 골수로부터 말초혈액으로 HSC 이동을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 a) 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 TAT-HOXB4H 유효량을, 투여를 필요로 하는 검체에 투여하고, 및 b) TAT-HOXB4H 단백질이 검체의 골수에서 조혈 줄기 세포의 절대 수를 증가시키도록 함으로써 조혈 줄기 세포가 검체의 말초 혈액으로 이동하는 것을 증진시키는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 요지는 HSC 이식, 조사 또는 화학요법을 거친 환자의 회복 시간을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 a) 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 TAT-HOXB4H 유효량을, 투여를 필요로 하는 검체에 투여하고, 및 b) TAT-HOXB4H 단백질이 검체의 골수에 대한 HSC의 절대 수를 증가시키게 하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 요지는 투여를 필요로 하는 검체에서 HSC가 골수로부터 말초 혈액으로 이동시키기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 환자의 골수에서 HSC의 절대 수를 증가시키기에 충분한 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 TAT-HOXB4H 유효량을 포함하며, HSC가 검체의 말초혈액으로 이동하는 것을 향상시킨다.
본 발명의 약학적 조성물은 HSC 이식 이후 회복 시간을 개선시키기 위하여 자가 HSC 이식을 거친 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 HSC를 말초 혈액으로 이동시키기 위한 G-CSF의 대체물로서 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 둔감한(insensitive) 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 HSC 공여자에게 투여되어 상기 공여자의 골수에 비하여 말초 혈액으로부터 훨씬 덜한 비침습적 과정으로 이식용으로 수집되는 충분 량의 HSC를 허용한다.
본 발명의 다른 요지는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 유료량의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 유전성 HSC 결핍 질병에 걸린 환자에게 전신적으로 투여하는 것에 의해 유전성 HSC 결핍에 의해 유발된 질병을 치료하는 것에 관한 것이다. 재조합 TAT-HOXB4H 단백질의 투여는 검체의 골수에서 HSC의 전체 수를 증가시킨다.
본 발명의 다른 요지는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 유료량의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을, 투여를 필요로 하는 검체에 전신적으로 투여함으로써 HSC 이식 이후 회복 시간을 개선하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 유료량의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여를 필요로 하는 검체에 전신적으로 투여함으로써 방사선 조사 또는 화학요법을 받는 환자의 HSC 회복을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
상세한 설명
1.
TAT
-
HOXB4H
단백질
본 발명은 증가된 안정성 및 수율의 예상치 못한 이점을 제공하며 생체내 투여를 허용하는 TAT-HOXB4H 단백질의 신규하고 비자명한 제조방법에 관한 것이다. TAT-HOXB4H 단백질은 3개 요소, 즉 TAT, HOXB4 및 히스티딘 태그를 포함하는 작제 물이다. HOXB4는 전사인자의 HOX 패밀리의 구성원으로서 HSC 팽창을 증진시킨다. TAT는 HOXB4 잔기가 세포로 수송되도록 한다. 히스티딘 태그는 재조합 발현 태그로부터 초기 증가된 수율을 허용하지만, 그 제조방법은 단백질의 수율을 또한 증가시킨다. pTAT-HOXB4H는 도 2에 도시된 바와 같이 작제되며, 또 DNA 서열은 도 3에 도시된다. 재조합 TAT-HOXB4H 단백질은 C-말단에 태깅된 부가적인 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 TAT-HOXB4H 융합 단백질을 지칭한다(도 4).
다르게 나타내지 않는 한, 단백질의 아미노산 서열(즉, 그의 "기본적인 구조" 또는 "기본적인 서열")은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 기재될 수 있다. 비-생물학적 계(예컨대, 고상 합성법을 적용하는 경우)에서, 단백질의 일차 구조(디설피드(시스테인) 결합 위치를 포함하는)는 사용자에 의해 결정될 수 있다.
"결실"은 1 이상의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 부재하는 것에 기인한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 지칭한다. 용어 "삽입" 또는 "부가"는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에서의 변화로 인하여 참조 서열, 예컨대천연 산출 서열과 비교하여 분자 또는 표시에 대하여 1 이상의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드의 부가를 초래하는 것을 의미한다. "치환"은 1 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 상이한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 치환되는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 서열에 대한 서열 유사성 또는 상동성(예컨대 적어도 약 85% 서열 상동성)은 본 출원의 일부이다. 일부 구체예로서, 서열 상동성은 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 다르게는, 핵산 분절(segment)이 선택적 혼성화 조건(hybridization conidtions)(예컨대, 고 스트린젠트(high stringent) 혼성화 조건)하에서 상보적 스트랜드와 혼성화될 수 있다면 실질적인 상동성이 존재한다. 핵산은 전체 세포, 세포 용균물, 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.
2개 서열 사이의 "상동성" 또는 "서열 동일성"(이들 용어는 상호 교환적으로 사용된다)은 다음과 같이 실시한다. 최적 대조 목적을 위하여 서열을 정렬시킨다(예컨대, 최적 정렬 및 비상동성 서열이 대조적 목적을 위해 무시될 수 있도록 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열의 하나 또는 양쪽 모두에 갭을 도입할 수 있다). 바람직한 구체예로서, 대조 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100% 이다. 상응하는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 어떤 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치에서와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되어 있으면, 상기 분자들은 그 위치에서 동일하다(본 명세서에 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"에 상응한다). 2개 서열 사이의 % 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭(gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유된 동일 위치의 수의 함수이다.
서열 대조 및 2개 서열의 % 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 2개 아미노산 서열의 % 동일성은 Needeleman 및 Wunsch ((1970) J. Mol . Biol . 48:444-453) 알고리즘을 이용하여 측정될 수 있으며, 이것은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와, 갭 중량 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 GCG 소프트웨어 팩케이지(http://www.gcg.com에서 입수가능) 중의 GAP 프로그램에 혼입되어 있다. 더욱 바람직한 구체예로서, 2개 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스와 갭 중량 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 중량 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 이용하여 GCG 소프트웨어 팩케이지( http://www.gcg.com에서 입수가능) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 결정한다. 특히 바람직한 변수 세트(및 분자가 본 발명의 서열 동일성 또는 상동성 내에 존재하면 어떤 변수가 적용될 수 있는지 실시자가 확실히 모를 때 사용될 수 있는 변수)는 갭 패널티 12, 갭 연장 페널티 4 및 프레임 시프트 갭 페널티 5인 Blossum 62 스코링 매트릭스(scoring matrix)이다. 2개 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 PAM 120 중량 잔기 표, 갭 길이 패널티 12 및 갭 페널티 4를 이용하여 ALIGN 프로그램 (버젼 2.0)에 혼입된 E. Meyers and W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
II
.
재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 제조 방법
A.
클로닝
및 발현
다양한 숙주 세포에서 단백질을 클로닝하고 발현하는 계는 당해 분야에 공지되어 있다. 단백질을 제조하기에 적합한 세포는 예컨대 Fernandez et al. (1999) Gene Expression Systems, Academic Press 편찬에 에 기재되어 있다. 요컨대, 적합 한 숙주 세포는 포유동물, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 원핵생물 세포, 예컨대 대장균(E. coli)을 포함한다. 이질 단백질 발현용으로 당해 분야에서 유용한 포유동물 세포는 림프성 세포주(예컨대 NSO), HEK293 세포, CHO(Chinese hamster ovary), COS 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, 난모세포, 및 트랜스제닉 동물의 세포, 예컨대 포유류 상피세포를 포함한다. 적합한 벡터는 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인헨서(enhancer) 서열, 마커 유전자 및 다른 서열을 비롯하여 적합한 조절 서열을 함유하도록 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 또한 플라스미드 또는 바이러스성 백본(backbone)을 함유할 수 있다. 자세한 내용은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)를 참조할 수 있다. 조작, 제조, 돌연변이, 서열화 및 DNA의 형질전환을 비롯한 벡터를 사용하여 사용된 다수의 확립된 수법은 Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons (1992)에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 요지는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법을 제공한다. 진핵생물 세포의 경우, 적합한 형질감염 수법은 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 엘렉트로포레이션(electroporation), 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예컨대 백시니아(vaccinia) 또는 배큘로바이러스(baculovirus)를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 세균 세포의 경우, 적합한 수법은 염화칼슘 형질전환, 엘렉트로포레이션, 및 박테리오파아지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다. DNA 도입은 핵산을 함유하는 세포를 선택하도록 선택 방법(예컨대, 약물 내성)에 의해 실시될 수 있다.
B.
정제 및 리폴딩(
refolding
)
TAT-HOXB4H 단백질은 당해 분야에 공지된 적합한 수단에 의해 재조합 숙주 세포로부터 먼저 분리될 수 있다. 예컨대, 상기 단백질은 상기 단백질이 분비될 수 있으면 세포 상청액으로부터 제거될 수 있으며, 또는 상기 단백질은 세포 용균물로부터 제거될 수 있다.
TAT-HOXB4H 단백질은 (a) 단백질이 용액에 분비되면, 세포 용균물 또는 세포 상청액을 HisTrap 칼럼에 적용하고; b) HisTrap 칼럼을 완충액으로 세정하며; (c) 부분적으로 정제된 단백질을 HisTrap 칼럼으로부터 용출시키고; (d) HisTrap 칼럼으로부터 얻은 부분적으로 정제된 단백질을 MonoSP 칼럼에 적용하며; (e) MonoSP 칼럼을 완충액으로 세정하고; (f) 정제된 TAT-HOXB4H 단백질을 MonoSP 칼럼으로부터 용출시키는 것을 포함하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제될 수 있다.
단백질이 용액으로 분비될 수 있으면 세포 용균물 또는 세포 상청액은 4℃에서 20,000 x g 에서 30분간 원심분리하는 것에 의해 청정하게 될 수 있으며, 이 상청액은 10 mM 이미다졸에 부가하여 HisTrap 킬레이팅 칼럼(Amersham Pharmacia) 상에 로딩한다. 이 칼럼은 8 M 우레아, 20 mM HEPES, 0.5 mM DTT, 10 mM NaCl, pH 8.0 및 10 mM 이미다졸로 세정하여 미결합 단백질을 제거한다. 부분적으로 순수한 TAT-HOXB4H 단백질은 고농도의 이미다졸 및 염을 사용하여 HisTrap 칼럼으로부터 용출될 수 있다.
더 정제하기 위하여, HisTrap 칼럼으로부터 얻은 부분적으로 정제된 단백질은 MonoSP 칼럼 (Amersham Pharmacia)에 적용될 수 있다. 이 칼럼은 4 M 우레아, 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 6.5으로 세정되어 미결합 단백질을 제거한다. 결합된 TAT-HOXB4H는 고염(high salt)에 의해 용출될 수 있다. 상기 정제 과정으로부터 수집한 정제된 TAT-HOXB4H 단백질은 변성 형태(denatured form)이다.
또한 MonoSP 칼럼으로부터 용출된 변성된 TAT-HOXB4H 단백질은 (i) 용출된 변성 단백질을 소수성 화합물의 용액과 조합하여 단백질과 소수성 화합물의 용액을 형성하고; (ii) 단백질과 소수성 화합물의 용액을 탈염시켜 탈염된 단백질 및 소수성 화합물 용액을 얻으며; 또 (iii) 한외여과에 의해 소수성 화합물을 탈염된 단백질 용액으로부터 제거하는 것에 의해 소수성 화합물을 사용하여 리폴딩될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 "소수성 화합물"은 소망하는 단백질이 변성 염 제거 단계 동안 불용성 응집물을 형성하지 않게 보호할 수 있는 소수성 화합물을 지칭한다. 본 발명에 사용하기 적합한 소수성 화합물은 Oganesyan et al., Pharmagenomics (2004) 71, 22-26에 기재되어 있다. 적합한 소수성 화합물은 비제한적으로 Triton X-100, 트윈-20 또는 폴리벤젠 화합물을 포함한다. 한외여과 또는 완충액 교환은 센트리콘 또는 교반-셀에 의해 실시될 수 있다. 한외여과 또는 완충액 교환 조건은 당업자가 인식하고 있는 바와 같이 소망하는 단백질의 유형에 따라서 다양할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 변성 HOXB4H 단백질을 함유하는 탈염 용액 중의 소수성 화합물은 저농도 또는 고농도의 대형 소수성 화합물, 예컨대 베타-시클로덱 스트린을 함유하는 용액을 사용하여 완충액 교환(각기 1000-2500 x g에서 10분간 원심분리에 의해 실시함으로써 변성된 HOXB4H 단백질은 그의 천연 형태로 리폴딩된다)을 5-10회 함으로써 제거한다.
일 구체예로서, 정제된 TAT-HOXB4H 단백질은 4 oC 또는 -20 oC의 시판되는 IMDM (HyClone) 배지(저장 완충액 1)에서 저장될 수 있다.
다른 구체예로서, 정제된 TAT-HOXB4H 단백질은 4 oC 또는 -20oC의 시판되는 DMEM (HyClone) 배지 (저장 완충액 2) 에서 저장될 수 있다.
일 구체예로서, TAT-HOXB4H의 C-말단에 있는 His 태그는 생체내 투여 전에 제거될 수 있다.
다른 구체예로서, TAT-HOXB4H의 N-말단에 있는 Hig 태그는 생체내 투여 전에 제거될 수 있다.
다른 구체예로서, N- 및 C-말단에 있는 양쪽 Hig 태그는 생체내 투여 전에 제거될 수 있다.
A.
약학적 조성물의 제조
TAT-HOXB4H는 약학적으로 허용되는 담체와 조합될 때 약학적 조성물로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 TAT-HOXB4H 단백질 및 담체 이외에, 다양한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 기타 당해 분야에 공지된 물질을 함유할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는"은 활성성분의 생물학적 활성의 효능을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 따라 달리 할 수 있다.
투여의 용이성 및 투여의 균일성을 위하여 투여 단위 형태의 조성물을 제형화할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 환자에 대한 단위 투여량에 적합하도록 물리적으로 분리된 단위를 지칭한다; 소정량의 활성 화합물을 함유하는 각 단위는 필요한 약학적 담체와 조합되어 소망하는 치료 효과를 내는 것으로 계산된다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 자세한 내용은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성할 특정 치료 효과 및 개별 치료를 위한 활성 화합물을 배합하는 관련 분야의 고유한 제한에 의해 직접적으로 지령을 받는다.
전형적인 투여 경로는 비제한적으로 경구, 국소, 비경구(예컨대 설하 또는 볼내), 설하, 직장, 질내 및 경비 투여를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 비경구적은 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사, 흉곽내, 음경해면체내, 수막공간내, 내이강, 요도내 주사 또는 주입 수법을 포함한다. 약학적 조성물은 조성물을 환자에게 투여할 때 그 속에 함유된 활성 성분이 생체 이용될 수 있도록 배합된다. 환자에게 투여될 수 있는 조성물은 1 이상의 투여 단위 형태를 취하며, 예컨대, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 또 에어로졸 형태의 본 발명의 1 이상의 화합물의 용기에 복수의 투여 단위를 포함할 수 있다.
치료적 유효량의 TAT-HOXB4H 단백질을 경구적으로 투여할 때, 결합제는 정제, 캡슐, 분말, 용액 또는 엘릭서 형태일 수 있다. 정제 형태로 투여될 때, 본 발명의 약학적 조성물은 부가적으로 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체 담체를 부가적으로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐 및 분말은 약 5 내지 95 % 결합제, 및 바람직하 게는 약 25 내지 90 % 결합제를 함유한다. 그 예는 수크로오스, 카올린, 글리세린, 녹말 덱스트린, 나트륨 알지네이트, 카르복시메틸셀룰로오스 및 에틸 셀룰로오스이다. 착색제 및/또는 향미제도 존재할 수 있다. 코팅 쉘이 이용될 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 물, 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 광유, 콩유, 또는 참기름, 또는 합성 오일과 같은 액체 담체가 부가될 수 있다, 약학적 조성물의 액체 형태는 또한 생리학적 염수 용액, 덱스트로오스 또는 기타 사카라이드 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 더 함유할 수 있다. 액체 형태로 투여될 때, 약학적 조성물은 약 0.5 내지 90 중량%의 결합제, 바람직하게는 약 1 내지 50 중량%의 결합제를 함유한다.
치료 유효량의 TAT-HOXB4H 단백질을 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있고, 결합제는 무-발열원, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 수 있다. pH, 등장성, 안정성 등을 갖는 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조는 당해 분야에 속한다. 일부 구체예로서, 정맥, 피부 또는 피하 주사용 약학적 조성물은 결합제 이외에, 염화 나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로오스 주사, 덱스트로오스 및 염화 나트륨 주사, 락테이트화된 링거 주사, 또는 기타 당해 분야에 공지된 부형제와 같은 등장 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 안정화제, 보존제, 완충제, 산화방지제 또는 기타 당해 분야에 공지된 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명의 치료 방법 또는 용도를 실시함에 있어서, 치료 유효량의 TAT-HOXB4H 단백질을 검체, 예컨대 포유동물(예컨대 인간)에게 투여한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 예컨대, 증상의 완화, 치료 또는 질병의 치료율 증가와 같은 의미있는 환자 이득을 나타내기에 충분한 약학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 전체 양을 의미한다. 개별 활성성분을 단독으로 투여할 때, 상기 용어는 성분 단독을 의미한다. 조합되어 투여될 때, 상기 용어는 조합되어, 순차적으로 또는 동시에 투여됨에 관계없이 활성성분의 조합량을 지칭한다.
본 발명의 약학적 조성물에서 TAT-HOXB4H 단백질의 양은 치료할 질병의 성질 및 심각도, 및 환자가 받은 전 처리 성질, 및 환자의 나이 및 성별에 따라 달라진다. 궁극적으로, 주치의는 개별 환자를 치료하기 위한 활성 성분의 양을 결정할 수 있다. 먼저, 주치의는 최저 투여량의 활성 성분을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 수 있다. 최적 치료 효과가 환자에서 나타낼 때까지 더 많은 투여량의 활성성분을 투여하며 또 투여량이 일반적으로 더 증가하지 않을 시점까지 투여한다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 다양한 약학적 조성물은 약 1 ㎍/kg 체중 내지 약 1 mg/kg 체중의 TAT-HOXB4H 단백질을 함유할 수 있다. 검체에게 투여될 수 있는 투여량 범위의 예는 다음으로부터 선택될 수 있다: 1 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 1 ㎍/kg 내지 0.5 mg/kg, 1 ㎍/kg 내지 0.1 mg/kg, 10 ㎍/kg 내지 0.5 mg/kg, 10 ㎍/kg 내지 0.1 mg/kg, 100 ㎍ 내지 0.5 mg/kg, 250 ㎍/kg 내지 0.5 mg/kg. 또한, 선택될 수 있는 투여량 범위의 예는 다음과 같다: 50 mg 내지 100 mg, 100 mg 내지 50 mg, 500 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 50 mg. 본 발명의 약학적 조성물을 사용한 정맥 요법의 기간은 처리할 질병의 심각도 및 각 개별 환자의 잠재적 특이약물반응에 따라서 달라질 수 있다. 일 구체예로서, TAT-HOXB4H 단백질의 각 투여 기간은 연속적 인 정맥내 투여 12 내지 24시간 범위일 수 있다. 다른 구체예로서, TAT-HOXB4H 단백질의 투여 기간은 환자의 방사선 또는 화학요법이 진행되는 한 지속될 수 있다. TAT-HOXB4H 단백질은 10-100 ㎍/kg 범위로 정맥내로 하루에 2회씩 4.5 내지 5일간 투여될 수 있다. 생체내에서 HSC를 팽창시키기에는 1주기의 치료가 충분할 수 있다. 궁극적으로 주치의는 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 정맥내 요법의 적합한 지속시간에 따라 결정할 수 있다.
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약학적 과정에 의해, 예컨대 LD50 (집단의 50% 치사시키는 투여량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 투여량)을 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며 LD50/ED50 로 표시될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 산출하는데 이용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 적거나 거의 없는 ED50 을 포함한다. 투여량은 이용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위내에서 다양할 수 있다. TAT-HOXB4H 의 치료 유효 투여량은 세포 배양 분석으로부터 산출될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 세포 배양액에서 측정된 바와 같은 IC50 (즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 시험 단백질의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 배합될 수 있다. 혈장에서 수준은 고성능 액첼 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 특정 투여량의 효과는 적합한 생체분석(bioassay)에 의해 모니터링될 수 있다. 적합한 생체분석의 예는 비제한적으로, CD34+ 줄기 세포에 대한 형광 프로브(예컨대 FITC) 태깅된 항체를 사용하고 말초 혈액 또는 골수 HSC에서 플로우 사이토미트리에 의해 LY5 세포의 %를 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 단백질은 이하에 확인된 바와 같은 1 이상의 용도 또는 생물학적 활성을 나타낼 것으로 예상된다. 본 발명의 단백질에 대해 기재된 용도 또는 활성은 이러한 단백질의 투여 또는 사용에 의해 또는 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사용(예컨대 유전자 요법 또는 DNA의 도입을 위해 적합한 벡터)에 의해 제공될 수 있다.
III
.
생체내에서
조혈을 자극하는 방법
A. 치료를 필요로 하는 환자
본 발명의 약학적 조성물은 비제한적으로 자가면역 장애, 면역결핍 장애, 및 혈액작용성 장애를 포함하는 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 HSC 이식 후 회복 시간을 개선하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비제한적으로, 림프종, 백혈병, 호지킨 질병 및 골수증식성 장애에 걸리거나 또는 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 것을 포함한다. 부가적으로, HSC 결핍에 의해 유발된 유전성 질병 및 재생불량성 빈혈은 본 발명의 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있다.
본 발명의 다른 약학적 조성물은 HSC 공여자 및 G-CSF 둔감한 환자에게 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, TAT-HOXB4H는 HSC의 이동을 위하여 투여된 유일 한 활성제이며, 또 플루오로우라실(5-FU)은 전처리 또는 조합 요법 구획으로서 공여자에게 투여되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물에 의해 치료될 수 있는 증가된 세포 생존과 관련된 부가적 질병 또는 상태는 비제한적으로 악성 및 관련 장애의 진행 및/또는 전이, 예컨대 백혈병(급성 백혈병 (예컨대, 급성 림프성 백혈구, 급성 골수성 백혈병 (골수모세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수단구성, 단구성 및 적백혈병) 및 만성 백혈병(예컨대 만성 골수성 (과립구성) 백혈병 및 만성 (림프성 백혈병)), 골수형성이상 증후군 진성적혈구증가증, 림프종(예컨대 호지킨 질병 및 비-호지킨 질병), 다발골수증, 발덴스트롬의 고분자글로불린혈증, 및 비제한적으로 육종 및 암종을 비롯한 고형암, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 에빙 종양, 평활근 육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 샘암종, 땀샘 암종, 피지샘 암종, 유두암종, 유두 샘암종, 유두 샘암종, 낭샘암종, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암종, 담즙관 암종, 융모막암종, 고환종, 배아 암종, 빌름 종양, 경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경아교종, 별아교세포종, 속질세포종, 머리인두종, 뇌실막세포종, 솔방울샘종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 병리수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함한다.
본 발명은 이하에 기재한 특정 방법, 순서, 세포주, 동물 종 또는 속, 및 시 약에 한정되지 않는다. 특정 구체예를 개시하기 위해 사용된 용어는 본 발명의 범위를 한정하지 않으며, 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태를 나타내는 "하나" "및" 그리고 "그"는 특별히 다르게 정의하지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 예컨대, "하나의 세포"는 1 이상의 세포를 지칭할 뿐만 아니라 당해 분야의 업자에게 공지된 상응하는 물질도 포함한다.
다르게 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 상기 방법, 장치 및 물질이 본 발명을 실시하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 다음에 기재한다. 모든 특허문헌 및 방법은 본 발명을 개시하고 기재하기 위한 참조문헌으로 포함되며, 예컨대 상기 문헌에 기재된 작제물 및 방법들은 본 명세서에 기재된 것과 관련하여 사용될 수 있다. 상기 및 명세서 전반에 걸쳐 논의된 공고문헌은 본 발명의 효과일 이전에 이들의 기재 내용을 제공한다. 본 명세서에 기재된 어떠한 내용도 본 발명자들이 종래 기술에 의해 상기 기재를 앞서가지 않는 것으로 이해된다.
정의
줄기 세포는 자가증식하고, 미분화상태를 유지하며 또 분화되는 능력을 갖는 다능성 또는 다잠재적 세포이다. 줄기 세포는 비제한적으로 분열될 수 있으며, 적어도 이들이 천연적으로 존재하는 동물의 생애 동안 분열된다. 줄기 세포는 최종적 으로 분화되지 않으며, 즉 이들은 분화 경로의 마지막이 아니다. 줄기 세포가 분열되면, 각 딸세포는 줄기 세포로 잔존하거나 또는 경로 중에 들어가 말단 분화를 초래한다. "키메라" 줄기 세포는 이질 생물에 속하는 DNA의 일부를 갖는 줄기 세포이다.
"조혈" 세포는 조혈 과정, 즉 전구세포로부터 성숙 혈액 세포를 형성하는 과정에 관여된 세포이다. 성인에서, 조혈은 골수에서 생긴다. 발생 초기에, 조혈은 발달의 상이한 단계 동안 상이한 부위에서 생긴다; 원시 혈액 세포는 난황주머니에서 생기며, 이후에 혈액 세포는 간, 비장, 및 골수에서 형성된다. 조혈은 예컨대 에리쓰로포이에틴; 생장인자, 예컨대 콜로니 자극인자; 및 사이토카인, 예컨대 인터루킨을 비롯한 호르몬에 의한 조절을 비롯하여 복잡한 조절을 거친다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 1개 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이것은 부가적 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형의 이중 스트랜드 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로서, 부가적 DNA 절편이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 박테리아성 복제 기점을 갖는 박테이아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예컨대 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입되면 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으므로, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작용가능하게(operably) 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 수 법에서 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본 발명의 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있는데, 플라스미드는 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 상동 작용을 제공하는 바이러스 벡터(예컨대 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련된 바이러스)와 같은 발현 벡터의 다른 형태를 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "형질전환"은 삽입에 사용된 방법에 상관없이 숙주 세포에 외인성 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것을 지칭하며; 예컨대 직접 흡수, 형질감염, 감염 등에 의한 형질감염. 특히 형질감염의 방법의 경우, 이하 참조 바람. 외인성 폴리뉴클레오티드는 예컨대 에피솜과 같은 비통합된 벡터로서 유지되거나, 또는 다르게는 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
일반적으로, 용어 "단백질"은 1개 아미노산(또는 아미노산 잔기)의 α-탄소에 결합된 카르복시산 기의 카르복실 탄소 원자가 인접 아미노산의 α-탄소에 결합된 아미노 기의 아미노 질소 원자에 공유결합될 때 생기는 펩티드 결합을 통하여 결합된 2 이상의 개별 아미노산(천연산출 또는 비천연산출)의 임의의 중합체를 지칭한다. 이들 펩티드 결합 및 이들을 포함하는 원자(즉, α-탄소원자, 카르복실 탄소원자(및 이들의 치환기 산소 원자), 및 아미노 질소 원자(및 이들의 치환기 수송 원자)가 단백질의 "폴리펩티드 주쇄"를 형성한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"(때때로 상호교환적으로 사용될 수 있다)를 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 단백질 단편, 유사체, 유도체 및 변이체는 "단백질"을 지칭하는 것일 수 있으며, 다르게 나타내지 않는 한 " 단백질"인 것으로 본다. 단백질의 용어 "단편"은 단백질의 아미노산 잔기 전체 보다 적은 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 "단편"은 아미노 말단, 카르복시 말단 및/또는 내부적으로(천연 결찰에 의해)절단된 단백질 형태일 수 있고 또 변이체 및/또는 유도체일 수 있다. 단백질의 "도메인"은 단편이며 또 천연 산출 단백질의 생화학적 활성을 부여하기에 필요한 단백질 아미노산 잔기를 포함한다.
핵산 분자를 기술하기 위해 본 발명에 사용된 바와 같은 "재조합"은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드로서, 그의 기원 또는 조작으로 인하여 자연에서 결합된 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부와 결합되어 있지 않다. 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 본 발명에서 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드를 의미한다.
"분리된", '정제된", "실질적으로 분리된" 또는 "실질적으로 순수한" 분자(폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은)는 자연에서보다 고 농도로 존재하도록 조작된 것을 의미한다. 예컨대, 자연에서 결합되어 있는 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 비-객체 단백질 물질이 제거될 때 객체(subject) 단백질이 분리되고, 정제되고, 실질적으로 분리되고, 또는 실질적으로 정제된 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "분리된", "정제된", "실질적으로 분리된" 또는 "실질적으로 정제된" 분자는 재조합 분자를 포함한다.
"SCID 마우스"는 면역계 발달에 심각한 결함을 유발하는 심각하게 결합된 면역결핍 증후군(SCID)에 대한 마우스 모델이다. 이들 마우스는 T 및 B 림프구가 부족하거나 또는 완전히 결핍된 것이다. SCID 돌연변이는 항원 수용체 유전자의 재조합을 손상시켜, 기능적 T 및 B 림프구의 결여를 초래한다. 다른 조혈 세포 유형은 정상적으로 발당하고 작용하는 것으로 보인다. SCID 마우스는 용이하게 정상적인 림프구 분화를 지지하며 또 동계(syngeneic) 또는 동종(allogeneic) 마우스로부터 얻은 정상 림프구와 함께, 또는 인간 림프구와 함께 재구성될 수 있다. 이들 마우스는 동종 및 이종 종양의 생장을 또한 지지한다. 따라서, 다수의 인간 종양, 특히 혈액작용 장애 및 악성 흑색종의 산재된 생장을 허용하는 SCID 마우스는 악성을 조사하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "검체", "개인", "숙주" 및 "환자"는 인간 및 비인간 동물을 비롯하여 살아있는 동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 검체는 예컨대 항원성 자극에 반응할 수 있는 면역 세포, 및 세포 표면 수용체 결합을 통한 자극 및 억제성 시그널 형질도입(transduction)을 보유하는 생물일 수 있다. 검체는 인간 또는 비인간 포유동물과 같은 포유동물, 예컨대 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트, 및 마우스를 포함한다. 용어 "검체"는 질병에 대하여 완전히 정상이거나 또는 모든 면에서 정상인 개인을 제외하지 않는다.
용어 "치료"는 치료적 또는 예방적 수단을 지칭한다. 치료는 질병 또는 재발성 질병의 1 이상의 증상의 심각성을 예방, 치료, 지연, 감소시키거나 또는 완화시키기 위하여, 또는 그러한 치료가 없다면 예상되는 검체의 생존을 연장시키기 위하여 의료적 장애를 갖는 검체 또는 질병에 걸릴 우려가 있는 검체에게 투여될 수 있 다.
용어 "치료적 유효량"은 연구자, 수의과의사, 의료 의사 또는 기타 임상의가 찾고 있는 소망하는 반응, 예컨대 조직, 계, 동물, 인간의 생물학적 또는 의료적 반응을 유발할 수 있는 객체 화합물의 양을 의미한다.
실시예
이하의 특정 실시예는 단순한 예시로서 작성된 것이고, 어떠한 의미로든 발명의 내용을 한정하지 않는다. 본 명세서에 기재된 내용을 기초로 하여 당업자라면 더 이상 상술하지 않더라도 본 발명을 최대한 이용할 수 있을 것이다.
실시예
1: 플라스미드
pET21b
-
His
-
pTAT
-
HOXB4
-
His
의
작제
(a) N- 및 C-말단
His
태그 및
TAT
시그널 펩티드를 함유하는
pET21b
플라스미드의 변형
N-말단 His 태그 및 TAT 시그널 펩티드를 함유하는 발현 벡터 pET21b는 올리고뉴클레오티드 5'-TATGCACCACCACCACCACCACTAC-3'(센스) 및 5'-CTAGCGGCGCTGGCGGCGTTTCTTGCGGCCGTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCA-3' (안티센스)를 pET21b 플라스미드에 삽입하는 것에 의해 생성하였다. C-말단 His-태그는 pET21b 벡터내에 이미 존재한다.
(b) 변형된
pET21b
발현 벡터에
HOXB4
의
클로닝
HOXB4의 오픈 리딩 프레임(ORF) 및 부가적인 6개 히스티딘 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편은 플라스미드 MGC54130 (GeneDiscovery, Taipei, Taiwan. Cat. No. 5533346)를 주형으로 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻었고, 또 PCR-생성된 HOXB4 cDNA 단편은 변형된 pET21b 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 플라스미드 작제 및 핵산 서열은 도 2 및 3에 도시한다.
실시예
2:
대장균에서
재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 발현
pET21b-His-TAT-HOXB4-His 발현 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3)pLysS (Novagen)로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포는 37oC에서 철야로 생장시켰다. 철야 생장한 배양액은 초기 OD600이 0.05이도록 희석시켰다. 이어 이 배양액을 37oC에서 OD600이 0.5로 되도록 생장시키고, 1 mM 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 사용하여 37oC에서 3시간 동안 급격하게 교반하면서 유도하였다.
실시예
3: 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 정제
유도에 이어, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 완충액 A(8 M 우레아, 20 mM HEPES, 0.5 mM DTT 및 100 mM NaCl, pH 8.0)에 재현탁시켰다. 이 세포 현탁액을 프렌치 프레스를 3회 통과시키고, 또 20,000 x g에서 30분간 4℃에서 원심분리함으로써 세포 용균물을 청정하게 만들고, 이 상청액을 10 mM 이미다졸에 부가하고 HisTrap 킬레이팅 칼럼(Amersham Pharmacia)에 로딩하였다. 결합된 단백질은 완충액 A 중의 50, 100 및 250 mM 이미다졸을 이용하여 용출시켰다. TAT-HOXB4H 함유 분획을 완충액 B (4 M 우레아, 20 mM HEPES 및 50 mM NaCl, pH 6.5) 중의 MonoSP 칼럼에 로딩하고, 1.5 M NaCl 및 20 mM HEPES (pH 8.0)을 사용하여 용출시켰다.
실시예
4: 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 원형재현(
renaturation
)
용출된 분획 중의 TAT-HOXB4H 단백질은 변성 염 (예컨대, 구아니딘 히드로클 로라이드)을 함유하는 용액 중에 가용화되어 변성된 다음 D-PBS-T 완충액 (2x PBS 중의 0.1% Triton X-100)과 혼합하였다. D-PBS-T 완충액 에 대한 TAT-HOXB4H 단백질 용액의 비율은 1:4 이었다. 생성한 혼합물을 물(10 ml 또는 3 ml)로 전처리된 10K 센트리콘 튜브(50 ml 또는 15 ml)에 부가한 다음, 3000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이 단계에서, 변성 염은 D-PBS-T 완충액으로 교체되며, 이때 Triton X-100은 HOXB4H 단백질의 소수성 영역과 결합할 수 있다.
10K 센트리콘을 사용한 한외여과 또는 완충액 교환 단계는 상이한 농도의 베타-시클로덱스트린을 함유하는 용액을 사용하여 1000-2500 x g에서 10분간 원심분리에 의해 10회(저장 완충액 IMDM 중의 각 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM 및 5 mM 베타-시클로덱스트린을 사용하여 2회씩) 실시하였다. 10K 센트리콘 튜브 중의 잔류하는 샘플을 수집하고 또 -80℃에서 저장하였다.
정제된 TAT-HOXB4H 단백질의 동질성은 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 이어 쿠마씨 염색(도 5)에 의해 분석하였다. 도 5에 도시한 바와 같이, HisTrap 및 MonoSP 로부터 정제된 TAT-HOXB4H는 TAT-HOXB4 단백질과 비교하여 3-4배 수율을 초래하였다. pTAT-HOXB4 플라스미드는 캐나다 몬트리올 대학의 Guy Sauvageau 박사로부터 선물이었다. 이 플라스미드는 BL21(DE3)pLysS (Novagen)으로 형질전환되며, TAT-HOXB4 단백질의 정제는 Krosl et al., 2003에 기재된 바와 같이 실시하였다.
실시예
5: 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 안정성
TAT-HOXB4H의 안정성은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석에 의해 측정하였다. 저장시 전장(full length) TAT-HOXB4H는 30 kD 및 10 kD 단편으로 분해될 수 있다. 도 6에 도시한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조한 TAT-HOXB4H 단백질은 4oC의 PBS에서 16시간 저장한 후에도 안정하였다.
또한 PBS 및 저장 완충액 IMDM 중, 4℃ 및 -20℃에서 저장된 TAT-HOXB4H 단백질의 안정성은 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 이어 쿠마씨 염색에 의해 분석하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, IMDM이 저장 완충액으로 사용되면, TAT-HOXB4H 단백질의 안정성은 4주 후에도 유지되었다.
실시예
6: 야생형
Balb
/c 마우스에서 조혈에 대한 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 효과
골수로부터 말초혈액에 이르는 HSC의 이동에 대한 재조합 TAT-HOXB4H 단백질의 가능한 효과를 조사하기 위하여 Balb/c 마우스를 사용하였다. 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중의 TAT-HOXB4H 재조합 단백질을 피하 주사로 하루에 4회씩 4일간 투여하였다. 투여량 반응성을 조사하기 위하여, 실험군(n = 21)은 마우스당 1 ㎍, 5 ㎍, 10 ㎍, 15 ㎍ 내지 100 ㎍/kg BW 투여량 범위로 투여되었다. 별개의 대조군 마우스는 포스페이트 완충된 염수만으로 처리되었고, 다른 대조군 마우스는 마우스당 5 ㎍/kg BW의 투여량으로 하루에 2회 4일간 피하 주사를 맞았다.
말초 혈액을 모든 마우스로부터 수집하고 플로우 사이토미터에 의해 분석하여 단핵 세포(MNC) 중의 CD34+ 줄기 세포의 %를 얻었다. 결과를 평균±s.d (표준편차)로 기록하여 표 1에 수록한다.
처리된 마우스로부터 수집된 말초혈액 중의 CD34+/MNC %는 표 1에 나타낸다. TAT-HOXB4H 처리된 실험 그룹 3-21 (10 ㎍/kg BW의 투여량을 투여받음)은 G-CSF 처리된 대조 그룹과 실질적으로 동일한 이동 효과를 나타내었다.
TAT-HOXB4H 처리된 마우스 (실험 그룹 3은 10 ㎍/kg BW의 투여량을 투여받음), G-CSF 처리된 마우스, 및 PBS 주사된 마우스로부터 얻은 골수는 CD34+ (Becton Dickinson)에 대한 FITC-콘쥬게이트된 항체를 사용하여 표현형을 구별하며 또 플로우 사이토미터에 의해 분석하였다. TAT-HOXB4H로 처리된 마우스로부터 얻은 골수(도 5C)는 G-CSF (도 5A) 및 PBS (도 5B) 주사된 마우스로부터 얻은 골수에 비하여 CD34+ 줄기 세포가 더 풍부한 것으로 보인다. 따라서, 이들 결과는 재조합 TAT-HOXB4H 단백질의 주사가 마우스의 골수 및 말초혈액 모두에서 HSC의 수를 증가시켰음을 나타낸다.
실시예
7:
리서스
원숭이에서
조혈에 대한 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 효과
웅성 성체 리서스 원숭이를 사용하여 원숭이에서 재조합 TAT-HOXB4H 단백질의 효능을 조사하였다. 실험 그룹 I (n=5)은 10 ㎍/kg BW의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질을 하루에 4회씩 4일간 정맥내 주사하였다. 실험 그룹 II (n=5)는 5 ㎍/kg BW의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질을 하루에 4회씩 4일간 정맥내 주사하였다. 대조 그룹 I은 PBS만을 투여받았고, 또 대조 그룹 II는 5 ㎍/kg BW의 G-CSF를 하루에 2번씩 4일간 피하주사로 투여받았다. 모든 원숭이로부터 말초 혈액을 수집하고 플로우 사이토미터에 의해 분석하여 단핵성 세포(MNC)에서 CD34+ 줄기 세포의 %를 얻었다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
도 2에 도시한 바와 같이, TAT-HOXB4H으로만 처리된 원숭이 (실험그룹)는 G-CSF 처리된 원숭이(대조그룹 II)에서 효과보다 현저히 우수한 이동 효과를 나타내었다. TAT-HOXB4H 및 G-CSF (실험그룹 II)으로 처리된 원숭이는 G-CSF 처리된 원숭이(대조 그룹 II)에 비하여 약간 우수한 이동 효과를 나타내었다.
TAT-HOXB4H, G-CSF 또는 PBS로 처리된 원숭이로부터 얻은 골수 시편은 CD34+ (Becton Dickinson)에 대한 FITC-콘쥬게이트된 항체를 사용하여 표현형 구별되었고 또 플로우 사이토미터에 의해 분석하였다. TAT-HOXB4H (도 6C)로 처리된 원숭이로부터 얻은 골수 시편은 G-CSF(도 6A), TAT-HOXB4H + G-CSF (도 6B) 및 PBS (도 6D) 주사된 원숭이로부터 얻은 골수 시편에 비하여 CD34+ 줄기 세포 면에서 현저히 풍부하였다.
실시예
8:
NOD
-
SCID
마우스에서 조혈 회복에 대한 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 효과
104 인간 Lin- CD34+ 세포를, 105 CD34- 방사선조사된 액서서리 세포와 함께 방사선조사된(2.5 Gy) NOD-LtSz-scid/scid (NOD-SCID) 마우스에 주사하였다. 이 마우스들을 2개 그룹으로 임의로 나누었다: 1개 그룹(n = 28)은 하루에 2회씩 10 ㎍/kg BW의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질을 주사하였고, 다른 그룹(n=28)은 하루에 2회씩 PBS를 투여받았다. 모든 마우스의 말초혈액 세포에서 인간 CD45+ 세포의 존재는 이식 후 플로우 사이토미트리에 의해 주기적으로 측정하였다. 조혈 회복은 이식 후 말초 혈액(PB)에서 인간 CD45+ 세포가 > 0.1% 수준에 도달한 마우스의 수로 평가하였다. 도 7에 도시한 바와 같이, 개선된 조혈 회복은 재조합 TAT-HOXB4H 단백질이 주사된 마우스에서 관찰되었다.
실시예
9:
시스플라틴
화학요법 후
Balb
/c 마우스에서 조혈 회복에 대한 재조합
TAT
-
HOXB4H
단백질의 효과
5 주령 Balb/c 마우스는 마우스의 말초 혈액에서 Lys5(쥐 CD45) 세포의 수가 원래 개수의 약 10%로 감소될 때까지 시스플라틴을 반복적으로 정맥내 주사로 투여받았다. 시스플라틴으로 처리된 마우스는 임의로 2개 그룹으로 나누었다: 1개 그룹(n = 28)은 하루에 2회씩 10 ㎍/kg BW의 재조합 TAT-HOXB4H 단백질을 주사하였고, 다른 그룹(n=28)은 하루에 2회씩 PBS를 투여받았다. 모든 마우스의 말초혈액 세포에서 Ly5 세포의 존재는 이식 후 플로우 사이토미트리에 의해 주기적으로 측정하였다. 조혈 회복율은 원래 개수에 대한 말초 혈액에서 Ly5 세포의 개수의 %로서 측정하였다. 도 8에 도시한 바와 같이, 개선된 조혈 회복은 재조합 TAT-HOXB4H 단백질이 주사된 마우스에서 관찰되었다.
이들 실험에 사용된 동물 모델은 인간 환자에서 얻을 수 있는 결과의 예상치로서 본 발명에서 인식되었다. 참고: Broxmeyer et al. (2005) The Journal of experimental Medicine, 201, 1307-1318; Larochelle et al. (2006) Blood 107, 3772-3778.
본 발명은 다양한 구체예를 참조하여 설명되었지만, 이후에 기재한 특허청구범위와 같은 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않는 한 여러 가지 다양한 변형 및 변이가 가능함을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 상술한 요지와 이점은 첨부한 도면을 참조한 상세한 설명으로부터 분명할 수 있다.
도 1은 생체내 팽창에 의해 CD34 세포로부터 HSC가 말초혈액(PB)으로 이동하는 것을 나타내는 개략도를 도시한다.
도 2는 변형된 pET21b 벡터에서 pTAT-HOXB4H의 작성 및 클로닝의 개략도를 도시한다.
도 3은 pTAT-HOXB4H의 DNA 서열을 도시한다. pTAT-HOXB4H의 N- 및 C-말단에 도입된 부가적인 6개의 히스티딘 잔기는 밑줄쳐 나타내고 또 TAT는 진하게 나타낸다.
도 4는 pTAT-HOXB4H 단백질의 단백질 서열을 도시한다.
도 5는 pTAT-HOXB4H 단백질를 정제하는 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(1.5 mm)을 도시한다. SDS-폴리아크릴아미드 겔을 쿠마씨 블루로 염색하였다. 레인 1, 분자량 마커 (M), 0.3 ㎍ 단백질; 레인 2, TAT-HOXB4H 단백질을 발현하는 비유도된 BL21(DE3)pLysS 세포로부터 얻은 세포 용균물, 1㎍ 단백질; 레인 3, 1 mM IPTG에 의해 TAT-HOXB4H 단백질을 발현하는 유도된 BL21(DE3)pLysS 세포로부터 얻은 세포 용균물, 1 ㎍ 단백질; 레인 4, 정제된 TAT-HOXB4H, 0.7 mg 단백질; 레인 5, 정제된 TAT-HOXB4 (0.2 mg 단백질). TAT-HOXB4 단백질(레인 5)를 발현하기 위해 사용된 pTAT-HA-HOXB4 플라스미드는 캐나다 몬트리올 대학의 Guy Sauvageau 박사로부터 선물로 받았다. MonoSP 칼럼으로부터 수집한 동 부피의 분획을 레인 4 및 5에 로딩 하였다.
도 6은 4℃에서 PBS 중에 0 시간(A) 및 16 시간(B) 동안 저장된 정제 TAT-HOXB4H 단백질의 안정성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석한 것을 도시한다. M은 분자량 마커, O는 4℃에서 0시간 배양을 나타내고, 16은 4℃에서 16시간 배양을 나타낸다.
도 7은 PSB 및 저장 완충액, IMDM 중 4℃ 및 -20℃에서 저장된 다음 코마시 염색에 의해 10% SDS-폴리아크릴아미드에 의해 분석된 TAT-HOXB4H 단백질의 안정성을 도시한다. 화살표는 TAT-HOXB4H 단백질 밴드를 나타낸다.
도 8A는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 마우스의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 G-CSF의 자극 효과를 도시한다.
도 8B는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 마우스의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 PBS의 효과를 도시한다.
도 8C는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 마우스의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 TAT-HOXB4H의 자극 효과를 도시한다.
도 9A는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 리서스(rhesus) 원숭이의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 G-CSF의 자극 효과를 도시한다.
도 9B는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 리서스(rhesus) 원숭이의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 G-CSF와 TAT-HOXB4H의 자극 효과를 도시한다.
도 9C는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 리서스(rhesus) 원숭이의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 TAT-HOXB4H의 자극 효과를 도시한다.
도 9D는 플로우 사이토미터(flow cytometer)에 의해 분석된 리서스(rhesus) 원숭이의 골수에서 CD34+ 줄기 세포의 수에 대한 PBS의 효과를 도시한다.
도 10은 NOD-SCID 마우스에서 조혈 회복에 대한 TAT-HOXB4H 단백질의 효과를 도시한다.
도 11은 시스플라틴 화학요법 이후 Balb/c 마우스에서 조혈 회복에 대한 TAT-HOXB4H 단백질의 효과를 도시한다.
Sequence Listing
<110> WU, KOU-JUEY
HUANG, CHI-HUNG
<120> METHOD OF PRODUCING RECOMBINANT TAT-HOXB4H
PROTEIN FOR USE AS A STIMULANT OF HEMATOPOIESIS
IN VIVO
<130> 10712.0001-00000
<140> 12/042,097
<141> 2008-03-04
<160> 5
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 1
tatgcaccac caccaccacc actacggccg caagaaacgc cgccagcgcc gccggcg 57
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide
<400> 2
ctagcggcgc tggcggcgtt tcttgcggcc gtagtggtgg tggtggtggt gca 53
<210> 3
<211> 840
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide
<400> 3
atgcaccacc accaccacca ctacggccgc aagaaacgcc gccagcgccg ccgcgctagc 60
atggctatga gttctttttt gatcaactca aactatgtcg accccaagtt ccctccatgc 120
gaggaatatt cacagagcga ttacctaccc agcgaccact cgcccgggta ctacgccggc 180
ggccagaggc gagagagcag cttccagccg gaggcgggct tcgggcggcg cgcggcgtgc 240
accgtgcagc gctacgcggc ctgccgggac cctgggcccc cgccgcctcc gccaccaccc 300
ccgccgcccc cgccaccgcc cggtctgtcc cctcgggctc ctgcgccgcc acccgccggg 360
gccctcctcc cggagcccgg ccagcgctgc gaggcggtca gcagcagccc cccgccgcct 420
ccctgcgccc agaaccccct gcaccccagc ccgtcccact ccgcgtgcaa agagcccgtc 480
gtctacccct ggatgcgcaa agttcacgtg agcacggtaa accccaatta cgccggcggg 540
gagcccaagc gctctcggac cgcctacacg cgccagcagg tcttggagct ggagaaggaa 600
tttcactaca accgctacct gacacggcgc cggagggtgg agatcgccca cgcgctctgc 660
ctctccgagc gccagatcaa gatctggttc cagaaccggc gcatgaagtg gaaaaaagac 720
cacaagttgc ccaacaccaa gatccgctcg ggtggtgcgg caggctcagc cggagggccc 780
cctggccggc ccaatggagg cccccgcgcg ctcctcgagc accaccacca ccaccactga 840
<210> 4
<211> 279
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
1 5 10 15
Arg Arg Ala Ser Met Ala Met Ser Ser Phe Leu Ile Asn Ser Asn Tyr
20 25 30
Val Asp Pro Lys Phe Pro Pro Cys Glu Glu Tyr Ser Gln Ser Asp Tyr
35 40 45
Leu Pro Ser Asp His Ser Pro Gly Tyr Tyr Ala Gly Gly Gln Arg Arg
50 55 60
Glu Ser Ser Phe Gln Pro Glu Ala Gly Phe Gly Arg Arg Ala Ala Cys
65 70 75 80
Thr Val Gln Arg Tyr Ala Ala Cys Arg Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro
85 90 95
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ser Pro Arg
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ala Gly Ala Leu Leu Pro Glu Pro Gly Gln
115 120 125
Arg Cys Glu Ala Val Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Cys Ala Gln
130 135 140
Asn Pro Leu His Pro Ser Pro Ser His Ser Ala Cys Lys Glu Pro Val
145 150 155 160
Val Tyr Pro Trp Met Arg Lys Val His Val Ser Thr Val Asn Pro Asn
165 170 175
Tyr Ala Gly Gly Glu Pro Lys Arg Ser Arg Thr Ala Tyr Thr Arg Gln
180 185 190
Gln Val Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His Tyr Asn Arg Tyr Leu Thr
195 200 205
Arg Arg Arg Arg Val Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Ser Glu Arg
210 215 220
Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp
225 230 235 240
His Lys Leu Pro Asn Thr Lys Ile Arg Ser Gly Gly Ala Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Gly Gly Pro Pro Gly Arg Pro Asn Gly Gly Pro Arg Ala Leu Leu
260 265 270
Glu His His His His His His
275
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6x
his tag
<400> 5
His His His His His His
1 5
Claims (27)
- (a) 단백질을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고;(b) 단백질을 숙주 세포에서 발현하며;(c) 발현된 단백질의 불순 용액을 수집하고;(d) (i) 상기 용액을 HisTrap 칼럼에 적용하고;(ii) HisTrap 칼럼을 세척하며;(iii) HisTrap 칼럼으로부터 부분적으로 정제된 단백질을 용출시켜 부분적으로 정제된 단백질 용액을 형성하고;(iv) 부분적으로 정제된 단백질 용액을 MonoSP 칼럼에 적용하며;(v) MonoSP 칼럼을 세정하고;(vi) MonoSP 칼럼으로부터 변성된 형태의 정제된 단백질을 용출하는 것에 의해 상기 용액으로부터 단백질을 정제하며;(e) (i) 용출된 변성 단백질 및 소수성 화합물의 용액을 조합하여 단백질과 소수성 화합물의 용액을 형성하고;(ii) 단백질과 소수성 화합물의 용액을 탈염시켜 탈염된 단백질 및 소수성 화합물 용액을 얻으며;(iii) 소수성 화합물을 탈염된 단백질 용액으로부터 한외여과(ultrafiltration)에 의해 제거하는 것에 의해 용출된 변성 단백질을 소수성 화합물을 사용하여 리폴딩하는 것을 포함하는, TAT-HOXB4H 단백질의 제조 방법.
- 제 1항에 있어서, HisTrap 칼럼 세정 완충액은 8 M 우레아, 20 mM HEPES, 0.5 mM DTT, 100 mM NaCl, pH 8.0 및 10 mM 이미다졸을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 부분적으로 정제된 단백질을 HisTrap 칼럼으로부터 용출시키기 위한 용출 완충액은 8 M 우레아, 20 mM HEPES, 0.5 mM DTT, 100 mM NaCl, pH 8.0 중에 적어도 50 mM 이미다졸을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 부분적으로 정제된 단백질을 HisTrap 칼럼으로부터 용출시키기 위한 용출 완충액은 50-100 mM 이미다졸을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 부분적으로 정제된 단백질을 HisTrap 칼럼으로부터 용출시키기 위한 용출 완충액은 100-250 mM 이미다졸을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, MonoSP 칼럼 세정 완충액은 4 M 우레아, 20 mM HEPES 및 50 mM NaCl, pH 6.5을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, MonoSP 칼럼으로부터 정제된 단백질을 용출시키기 위한 용출 완충액은 1. 5 M NaCl 및 20 mM HEPES, pH 8.0을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 소수성 화합물은 Triton X-100, tween-20 또는 폴리벤젠 화합물을 포함하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 한외여과 과정은 센트리콘 튜브 또는 교반-셀에 의해 실시되는 방법.
- 제 1항에 있어서, 정제된 단백질은 IMDM 또는 DMEM에 저장되는 방법.
- 제 1항의 방법에 의해 제조된 TAT-HOXB4H 단백질.
- a) 제 1항의 방법에 의해 제조된 TAT-HOXB4H 유효량을 투여를 필요로 하는 검체에 투여하고, 및b) TAT-HOXB4H 단백질이 검체의 골수에서 조혈 줄기 세포의 절대 수를 증가시키도록 함으로써 조혈 줄기 세포가 검체의 말초 혈액으로 이동하는 것을 증진시키는 것을 포함하는, 골수로부터 말초혈액으로 HSC 이동을 향상시키는 방법.
- 제 12항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 HSC 공여자인 방법.
- 제 12항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 상동 HSC 이식을 거친 환자인 방법.
- 제 12항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 G-CSF 둔감한 환자인 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 검체는 유전성 HSC 결핍에 의해 유발된 질병에 걸린 환자인 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 검체는 유전성 재생불량성빈혈에 걸린 환자인 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 검체는 혈액작용성 장애, 고형암, 및 면역학적 질병 중의 하나에 걸린 환자인 방법.
- 제 12항에 있어서, 혈액작용성 장애가 림프종, 백혈병, 호지킨 질병 및 골수증식성 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- a) 제 1항의 방법에 의해 제조된 TAT-HOXB4H 유효량을 투여를 필요로 하는 검체에 투여하고, 및b) TAT-HOXB4H 단백질이 검체의 골수에 대한 HSC의 절대 수를 증가시키는 것을 포함하는, HSC 이식, 방사선조사 또는 화학요법처리 받은 환자의 회복 시간을 개선하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 HSC 공여자인 방법.
- 제 20항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 자가 HSC 이식을 받은 환자인 방법.
- 제 20항에 있어서, 투여를 필요로 하는 검체가 G-CSF-둔감한 환자인 방법.
- 제 23항에 있어서, 상기 검체는 유전성 HSC 결핍에 의해 유발된 질병에 걸린 환자인 방법.
- 제 24항에 있어서, 상기 검체는 유전성 재생불량성 빈혈 환자인 방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 검체는 혈액작용성 장애, 고형암, 및 면역학적 질병 중의 하나에 걸린 환자인 방법.
- 제 26항에 있어서, 혈액작용성 장애가 림프종, 백혈병, 호지킨 질병 및 골수증식성 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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| KR1020090015907A KR101160381B1 (ko) | 2008-03-04 | 2009-02-25 | 생체내에서 조혈 자극제로서 사용하기 위한 재조합 ｔａｔ-ｈｏｘｂ４ｈ 단백질의 제조 방법 |
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