JPH06500003A - 蛋白質，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質、ＤＮＡおよびその用途 且ユ五立互 本発明は線維芽細胞成長因子（以下、ＦＧＦと略称することもある。

）蛋白質を受容する作用を有する動物蛋白質の水溶性ムティン、それをコードす る塩基配列を有する組換えＤＮＡおよび該ムティンの製造のための技術に関する 。

且皿辺豊見 ＦＧＦには、視床下部、脳、網膜などに局在する分子量約１，６万。

等電点が５〜７の酸性線維芽細胞成長因子（以下、ａＦＧＦと略称することもあ る。）と各種組織および臓器に広く存在する分子量約１゜７万、等電点が８〜１ ０の塩基性線維芽細胞成長因子（以下、ｂＦＧＦと略称することもある。）があ る。共にヘパリンと強く結合するという特徴があり、当初線維芽細胞に強い増殖 促進作用を示す因子として分離されたが、その後中胚葉由来の殆ど全ての細胞に 対して増殖促進作用を示すことが判明した。特に内皮細胞の増殖促進因子あるい は血管新生因子として一般に知られている。はとんどの癌細胞はｂＦＧＦを産生 じ、このｂＦＧＦが癌細胞自身を増殖させるのである。

ＦＧＦの各種細胞に対するこのような作用には、全てＦＧＦと細胞表面に存在す るＦＧＦ受容体との相互作用が不可欠であると考えられている。またａＦＧＦと ｂＦＧＦは共通の受容体に結合する可能性が示唆されているが、その実体は不明 の点が多い。

上記した通り、各種細胞において重要な役割をなすＦＧＦ受容体であるが、ＦＧ Ｆ受容体の蛋白質としての性状やその遺伝子については実体が不明で、またＦＧ Ｆ受容体を遺伝子組換え技術によって製造したとの報告はない。ＦＧＦ受容体を 遺伝子組換え技術を用いて大量に製造することができれば、抗癌剤のような医薬 などとして使用できる。

特にヒトＦＧＦを受容する作用を有する蛋白質を大量生産する方法の確立が望ま れていた。

一般に、近縁種の動物の蛋白質はそのアミノ酸配列において高い相同性があり、 アミノ酸の異なっている部分もその大部分は遺伝子のコドンの　ｏｎｅ　ｐ○ｉ ｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎによって導びかれるものである。従って前記したトリの ＦＧＦ受容体遺伝子のＤＮＡ配列の一部は、ヒトＦＧＦを受容する作用を有する 蛋白質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列に極めて良く似ているものと推定される 。そこで本発明者らはこのような考えに基づいて、トリＦＧＦ受容体遺伝子の一 部と同じ塩基配列をもつＤＮＡをプローブとして合成し、これを用いてヒトＦＧ Ｆを受容する作用を有する蛋白質をコードする遺伝子をヒト細胞よりクローニン グし、該遺伝子を含む組換えＤＮＡを構築し、該ＤＮＡで形質転換された形質転 換体を培養すると、ヒトＦＧＦを受容する作用を有する蛋白質が生産されること を見い出した。

また、ＦＧＦ蛋白質を受容する作用を有する動物蛋白質の水溶性ムティンは、有 利にＦＧＦ蛋白質を受容することを見い出した。

本発明者らは、これらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完成した 。

且玉辺ｌ豊 本発明は、（１）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）蛋白質を受容する作用を有す る動物蛋白質の水溶性ムティン。

（２）、上記（１）の水溶性ムティンをコードする塩基配列を有する組換えＤＮ Ａ。

（３）、上記（２）の組換えＤＮＡを含むベクター。

（４）、上記（３）のベクターを保持する形質転換体、および（５）、上記（４ ）の形質転換体を培地に培養することを特徴とする上記（１）の水溶性ムティン の製造法である。

皿皿二囚星ｌ五豆 図１は、実施例１で得られたヒトＦＧＦ受容作用を有する蛋白質をコードするｃ ＤＮＡの塩基配列の一部およびこれから推定されるアミノ酸配列を示す。

図２は、実施例２で得られた、ＦＧＦ受容体ｃＤＮＡの制限酵素地図を示す。

図３は、実施例２で得られた、プラスミドｐＴＢ１２２８のｃＤＮＡの塩基配列 を示す。また、コードされるアミノ酸配列をその下段に示す。

図４は、実施例２で得られた、プラスミド　ｐＴＢ１２２９のｃＤＮＡの塩基配 列を示す。また、コードされるアミノ酸配列をその下段に示す。

図５は、実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ１２８３の構築図を示す。

図６は、実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ１２８４の構築図を示す。

図７は、実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ１２８４のｃＤＮＡの塩基配列を 示す。また、コードされるアミノ酸配列をその下段に示す。

図８は、実施例３で得られたプラスミドｐＴＢ１２８３のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの塩基 配列を示す。また、コードされるアミノ酸配列をその下段に示す。

図９は、実施例４で得られたプラスミドｐＴ８１２８９の構築図を示す。

図１０は、実施例４で得られたプラスミドｐＴＢ１２９０の構築図を示す。

図１１は、実施例４で得られたプラスミドｐＴＢ１２８９のｃＤＮＡの塩基配列 、およびそれが産生じたＦＧＦ受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。

図１２は、実施例４で得られたプラスミドｐＴＢ１２９０のｃＤＮＡの塩基配列 、およびそれが産生したＦＧＦ受容体細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。

図１３は、実施例３（２）で得られたプラスミドｐＴＢ１３１３の構築図を示す 。

図１４は、実施例４（２）で得られたプラスミドｐＴＢ１３１５の構築図を示す 。

図１５は、大腸菌中で産生されたＦＧＦ受容体細胞外ドメインのＱセファロース カラムでの精製を示すグラフである。

藍工旦と脂血 本発明でいうＦＧＦ蛋白質としては、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦおよびそれらの ムティンが挙げられる。なかでも、塩基性ＦＧＦおよびそのムティンが好ましい 。

該ＦＧＦとしては、哺乳動物由来のものが好ましい。該哺乳動物としては、たと えばヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げ少なくとも１個の構成ア ミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの、少なくとも１個のアミノ酸が付加 されたものが挙げられる。

ＦＧＦ蛋白質の具体例としては、たとえばヨーロッパ特許出願公開公報第２３７ ，９６６号、第２８１，８２２号、第３２６，９０７号。

第３９４，９５１号に開示されたものが挙げられる。

ＦＧＦ蛋白質を受容する作用としては、細胞外ドメインにＦＧＦ蛋白質と特異的 に結合する性質があり、さらに、ＦＧＦ蛋白質との結合による構造変化によって 、細胞内ドメインにあるチロシン−リン酸化酵素に相当する部分が活性化される ことを指す、一般的にこのようなチロシンリン酸化の作用は、細胞の分化・増殖 に深く間っていると考えられる。

ＦＧＦ蛋白質分子と特異的に結合する蛋白としては、抗ＦＧＦ抗体が考えられる が、抗体分子には酵素活性もなく、細胞の分化・増殖とは関係もない。したがっ て、ＦＧＦ蛋白質分子と受容する作用を有する蛋白質と抗ＦＧＦ抗体とは本質的 に異なるものである。

本発明の水溶性ムティンの基本となるＦＧＦ蛋白質を受容する作用を有する動物 蛋白質（以下、成熟型ＦＧＦ受容体と称することもある。

）としては、ヒト型のもの、ニワトリ型のもの、マウス型のもの、カエル型のも の、ウオ型のものなどが挙げられる。

該ヒト型の成熟型ＦＧＦ受容体としては、たとえば、図７のアミノ酸配列を有す るもの、図８のアミノ酸配列を有するもの、ヌグレイツク・アシッズ・リサーチ （Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　＋上呈、１９０６　（１ ９９０）に記載されたアミノ酸配列を有するもの、ＥＭＢＯジャーナル（Ｔｈｅ 　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）　９．２６８５　（１９９０）に記載のｆｌｇと称 して記載されたアミノ酸配列を有するもの、モレキュラーアンドセルラーバイオ ロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　 ｌ旦、　５５４１−５５４４　（１９８８）およびＴｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎ ａｌ、旦、　２６８５　（１９９０）に記載のｂｅｋと称して記載されたアミノ 酸配列を有するもの。

プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　８工、５９８３　（１９ ９０）にに−ｓａｗ遺伝子が発現する蛋白として記載されたアミノ酸配列を有す るものが挙げられる。

該ニワトリ型のものとしては、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２４５　。

５７−６０　（１９８９）に記載されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる 。

該マウス型のものとしては、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ 　ＳＡ、　８７４３７８−４３８２（１９９ｏ）に記載されたアミノ酸配列を有 するものが挙げられる。

本発明の水溶性ムティンとしては、成熟型ＦＧＦ受容体のＣ末端側から少なくと も１個のアミノ酸が欠失しているもの、成熟型ＦＧＦ受容体の膜透過部分（トラ ンスメンプレイン・ドメイン）に相当するアミノ酸配列が欠失したものが挙げら れる。

該成熟型ＦＧＦ受容体のＣ末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠失しているも のとしては、Ｃ末端から膜透過部分までを欠失したもの、すなわち細胞外ドメイ ンに相当する部分が挙げられる。

該細胞外ドメインは、そのＣ末端からさらに１〜３８個のアミノ酸を欠失してい てもよい。さらに、そのＣ末端から１２３個までのアミノ酸を欠失していてもよ い。

上記成熟型ＦＧＦ受容体の膜透過部分に相当するアミノ酸配列が欠失したものは 、さらにそのＣ末端から１〜１１個のアミノ酸を欠失していてもよい。

上記欠失型ムティンから、さらに、Ｎ末端から少なくとも１個のアミノ酸の欠失 が同時に行われていてもよい。

該Ｎ末端からの欠失としては、Ｎ末端から１〜２５７個のアミノ酸の欠失、さら に好ましくは１〜１３１個のアミノ酸の欠失が挙げられる。アミノ酸番号は、Ｎ 末端のシグナル配列の次のアミノ酸から数えるものとする。

本発明の水溶性ムティンを製造するためには、従来の組換えＤＮＡ技術に加え、 特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ ｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイザー（Ｌａｔ ｈｅｒ、Ｒ，Ｆ、　）及びジェイ・ビー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、Ｊ、　Ｐ。

）、ジェネティック−ｘ）ジニアリング　（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ）、アカデミツクブレス社（１９８３年）第３１−５０頁、に示されてい る。オリゴヌクレオチドで指示された変異誘発はエム・スミス（Ｓｍｉｔｈ、　 Ｍ、　）及びニス・ギラム（Ｇｉｌｌａｍ、Ｓ、　）　、ジエネテイツク・エン ジニアリング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻１−３２頁に 示されている。

本発明のムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには、たとえば、 （ａ）成熟型ＦＧＦ受容体の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変 異オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形成させる、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ によりプライマーを伸長させ、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌ ｅｘ）を形成させる、及び（Ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。

オリゴヌクレオチドブライマーの大きさは、突然変異を導入すべき遺伝子領域へ のプライマーの安定な雑種形成に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴ ヌクレオチド合成法の限界によって決まる。

オリゴヌクレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドを 設計するに当たるで、考慮すべき因子（例えば全体の大きさ、突然変異サイトを 迂回する部分の大きさ）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）によって記 述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、突然変異サイトでの安定 でユニークな雑種形成を最適化するような長さであり、突然変異サイトから５′ 及び３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）は、ＤＮＡポリメラーゼ のエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の修復をさけるのに十分な大きさとす る。

上記成熟型ＦＧＦ受容体をコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型 ベクターは、例えば、 （ｉ）成熟型ＦＧＦ受容体をコードするＲＮＡを分離し、（ｉｉ）該ＲＮＡから 単鎖の相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、 （ｉｉｉ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ｉｖ）得られた組み換えプ ラスミドで宿主を形質転換し、（Ｖ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体 から適当な方法、例えばＤＮＡプローブを用いたコロニーハイブリダイゼーショ ン法、により目的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、（ｖｉ）そのプ ラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（ｖｉｉ）該クローン化 ＤＮＡをビーグル中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造すること ができる。

さらに上記ｃＤＮＡは、化学合成により製造することもできる。

該成熟型ＦＧＦ受容体をコードするＲＮＡは、種々のＦＧＦ受容体産生細胞、例 えばヒト内皮由来細胞あるいはヒト線維芽細胞から得ることができる。該ヒト線 維芽細胞としては、ＷＩ３８　（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）　あ６いＧ！ＩＭ Ｒ９０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８６）などがあげられる、上記細胞Ｗ１３Ｂお よびＩＭＲ９０は、ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈ ｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）発 行のカタログ・オブ・セル・ライング・アンド・ハイブリドーマズ（Ｃａｔａｌ ｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　＆　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）　５　ｔ ｈｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５に掲載されている。

成熟型ＦＧＦ受容体産生細胞からＲＮＡを調製する方法としては、グアニジンチ オシアネート法［Ｊ、　Ｍ、　Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、バイオケミストリー　（Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ）　、上８，５２９４　（１９７９）コなどが挙げられ る。

このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用いて、例えばＨｌＯ ｋａｙａｍａらの方法［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２．　１６１ 　（１９８２）および同誌３，２８０　（１９８３）］に従いｃＤＮＡを合成し 、得られたｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。

ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由来のｐＢＲ３２２［ ジーン（ｇｅｎｅ）、２．９５　（１９７７）］　、ｐＢＲ３２５［ジーン、土 、１２１　（１９７８）］、ｐＵｃ１２　［ジーン、ユ。

２５９　（１９８２）］、ｐＵｃ１３　［ジーン、ユ、２５９　（１９８２）　 ］　、　ｐＵｃ１１８．　ｐＵｃｌ　１９　［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙｌ　５ユ、３−１１　（１９８７）］、枯草菌由来のｐＵＢｌｌｏ ［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏ ＋ｕｕｎｉｃａｔｉｏｎ）　、’上上主、６７８（１９８３）］などが挙げられ るが、その他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれ をも用いることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら。

モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＣＬｏｎｉｎｇ）　）−ル ド°スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ）　！第２３９頁（１９８２）に記載の方法などが挙げられる。

上記ｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドとしては、ヒト正常２倍体細胞ｍＲＮＡ より合成したｃＤＮＡをｐＣＤベクター［Ｏｋａｙａｍａら、モレキュラー・セ ル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、　３ ゜２８０　（１９８３）参照コに組み込んで作成した大腸菌ｘ１７７６を宿主と したｃＤＮＡライブラリー（大阪大学微生物病研究所の岡山博士より分与を受け ることができる。）を用いて得られたプラスミドでもよい。

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たとえばエシェリキア（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する 。

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２　ＤＨ１［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｕｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、旦旦。

１６０　（１９６８）コ、Ｍ１０３［ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ’Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　９．３０９　（１９８１）　 ］　、　ＪＡ２２１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕ ｒｎａｌｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ４ｏ１ｏｇいコ」じ２０，５１７　（１ ９７８）コ、ＨＢ１ｏ１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、土 工、４５９　（１９６９）］　、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ）　、　３旦、４４０　（１９５４）コなどが挙げられる、上記バチルス属菌 としては、たとえばバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ ）　、　Ｍ　Ｉ　１１４　（ジーン、２４，２５５　（１９８３）コ。

２０７−２１　［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　。

ｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　９５．８７　（１９８４）　］などが挙げら れる。

形質転換する方法としては、たとえばＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、モレキュラー ・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、　ｍｌ−ルド・ス プリング。

ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｌｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ）第２４９頁（１９８２）に記載のカルシウムクロライド法あるいは カルシウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方法、例えばコロニー・ハ イブリダイゼーション法Ｃジーン１０，６３　（１９８０）コおよびＤＮＡ塩基 配列決定法しＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７４ ．５６０　（１９７７）］を用い請求めるクローンを選出する。

このようにして、クローン化された成熟型ＦＧＦ受容体をコードする塩基配列を 含有するＤＮＡを有するベクターを保持する微生物が得られる。

次に、該微生物からプラスミドを単離する。

該単離法としては、アルカリ法［Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｍｂｏｉｍら、ヌクレイツク・ アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）土、１ ５１３　（１９７９）］などが挙げられる。

上記クローン化された成熟型ＦＧＦ受容体をコードする塩基配列を含有するＤＮ Ａを有するプラスミドはそのまま、または所望により制限酵素で切り出して利用 することができる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビーグル（ベクター）中のプロモータ ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる。

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ ３２５，ｐＵｃｌ　２．ｐＵｃｌ　３．ｐＵｃｌ　１８．ｐＵｃｌｌ　９）、　 枯’ＨＷＮ由来ブ５スミＦ　（例、ｐＵＢ　１１０．　ｐＴＰ　５．　、ｐＣ１ ９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨｌ　９．ｐＳＨｌ　５）、あるいはλ ファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルス などの動物ウィルスなどがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′末端 には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。

さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本発明で 用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な プロモーターであればいかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ７プロモータ ー、　ｔｒｐプロモーター、　ｌａｃプロモーター、　ｒｅＣＡプロモーター、 λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場 合は、ＳＰ○１プロモーター、５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターな ど、宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｇ ＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェ リキア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたはＴ７プロモーターである ことが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルス のプロモーターなどが挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好まし い。

このようにして構築されたＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製 造する。

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属菌、酵母。

動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては、前記したものと同様の ものが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＨ２２Ｒ，ＮＡ８７−１１　Ａ、　Ｄ ＫＤ　−５Ｄなどが挙げられる。

動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ３−７，Ｖｅｒｏ、チャイニーズハム スター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９．２１１０　（１９７２）、ジーン、エユ。

１０７　（１９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル ・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓ）、±６８，１１１　（１９７９）などに記載の方法に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ　ＳＡ工５；１９２９　（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２ ．４５６　（１９７３）に記載の方法に従って行なわれる。

このようにして、ＤＮＡを含有するベクターで形質転換された形質転換体が得ら れる。

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に 使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育 に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、 たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては 、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチーブ・リカー、ペプトン、 カゼイン。

肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物として はたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが あげられる。また、酵母エキス、ビタミン類。

生長促進因子などを添加してもよい。

培地のｐＨは約６〜８が望ましい。

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース。

カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍｉｌｌｅｒ、ジャーナル・オブ・エクスベリメン ツ・イン・モレキュラー・ジェネテイックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、　４３１ −４３３．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２）　］が好ましい。

二二に必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イン ドリル　アクリル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行 い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない 、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばパークホー ルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７、４５０５　（１９ ８０）　］が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養 は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加 える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜 ２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）上２２， ５０１　（１９５２）コ、ＤＭＥＭ培地［ヴイロロジ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、 　８．３９６　（１９５９）　］　、　ＲＰＭＩ　１６４０培地［ジャーナル・ オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏ ｎ）　１９９．５１９　（１９６７）］、１９９培地［プロシーディング・オブ ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メデイスン（Ｐｒｏｃｅｅ ｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｃａ ｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）ヱ旦。

１（１９５０）］などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養 は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や 撹拌を加える。

上記培養物から本発明のムティンを分離精製するには、例えば下記の方法により 行うことができる。

本発明のムティンを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公 知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤 を含む緩衝液に懸濁して菌体外に目的のムティンを溶出させる方法、超音波、リ ゾチームおよび（または）凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離により本発明のムティンを得る方法などが適宜用い得る。とりわけ、リ ゾチームと超音波処理を併用する方法が好ましい。

上記上澄液から本発明のムティンを精製するには、自体公知の分離・精製法を適 切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、 塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過 法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の 差を利用する方法、イオン交換グロマトグラフイーなどの荷電の差を利用する方 法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆 相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳 動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

この様にして得られた本発明のムティンは透析、凍結乾燥を行い、乾燥粉末とす ることもできる。さらに、担体として血清アルブミンなどを添加して保存するこ とは、本発明のムティンの容器への吸着を防ぐことができ好適である。

このようにして、実質的に純粋な本発明の水溶性ムティンが得られる。本発明の 実質的に純粋な蛋白質としては、蛋白質含量として９５％（Ｗ／Ｗ）以上である もの、さらに好ましくは９８％（Ｗ／Ｗ）以上であるものが挙げられる。

遺伝子組み換え技術によって得られた本発明のムティンの一例として、例えば図 １１のアミノ酸配列または図１２のアミノ酸配列で示されるポリペプチドを含有 する蛋白質を挙げることができる。該蛋白質はそのＮ末端にＭｅｔを有していて もよい。　本発明の水溶性ムティンのＣ末端に膜透過ドメインおよび細胞内ドメ インに相当するアミノ酸配列が付加されたもの（以下、アミノ酸付加物と称する こともある。）でもよく、その例としては、たとえば図７のアミノ酸配列または 図８のアミノ酸配列を含有するポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチドは、 たとえば、上記した方法でｃＤＮＡを製造し、プラスミドに組み込み、形質転換 体を作製し、培養および生成物の精製を行なうことにより、製造することができ る。

かくして得られる本発明の水溶性ムティンもしくはアミノ酸付加物の活性は、Ｆ ＧＦの細胞への結合効果などにより測定することができる。

本発明の組換えＤＮＡで遺伝子感染または形質転換した細胞では、本来わずかの ＦＧＦ受容体しか合成されない、あるいは全く合成されない各種細胞においても 大量の本発明のムティンを産生せしめることができる。

本発明の水溶性ムティンをコードする遺伝子を含有する発現型プラスミドは、こ れを各種細胞に導入することにより該細胞に本発明の水溶性ムティンを産生させ ることができるため、本発明の水溶性ムティンを大量に取得することができる。

本発明の水溶性ムティンは、糖鎖が付加しているものでもよい。該糖鎖としては 、一般に知られている糖タンパクに見い出される糖ならば何でもよく、特に種類 を問わない。例えば、Ｎ−アセチルグリコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン 、マンノース、ガラクトース、フコース、シアル酸などをあげることが出来る。

また、糖鎖の長さは、１種以上の糖が付加していればよい。好ましくは、１０〜 ２０の糖鎖が付加しているものが挙げられる。

このようにして製造される本発明の水溶性ムティンもしくはアミノ酸付加物を用 いて本来、細胞表面上に存在するＦＧＦ受容体とＦＧＦ分子との結合を阻害する ことができる。この様な阻害により、ＦＧＦに依存した細胞増殖が抑制されるた め、多発性内分泌腺腫症、前立腺肥大症、Ｎ法肩性網膜炎あるいは癌などの治療 薬として用いることができる。また毒性は低い。

さらに本来ＦＧＦ受容体を有さない各種動物細胞（リンパ球系細胞など）を、本 発明のＤＮＡで遺伝子感染または形質転換することにより本発明の水溶性ムティ ンまたはアミノ酸付加物を産生せしめることができるので、これら細胞をＦＧＦ 含有培地中で培養することにより、インビトロで長期にわたり、増殖、継代した り、株化したり、クローン化することができる。

本発明のＤＮＡを用いて増殖等が可能となった上記動物細胞を大量に培養するこ とにより、これら細胞が本来産生ずる各種有用物質を大量に取得することができ る。

また、本発明のＤＮＡおよび本発明の水溶性ムティンまたはアミノ酸付加物によ り製造される抗体を用いて、細胞に発現するＦＧＦ受容体量を検出することによ り癌や前立腺肥大症などの診断を行うことができる。

本発明の水溶性ムティンまたはアミノ酸付加物を医薬として用いるには、そのま ま粉末として、または他の薬理学的に許容されつる担体。

賦形副、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤９錠剤、カプセル剤。

液剤、軟膏）として、温血哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、 ウサギ、犬、ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与することができ る。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖やその他の補助薬を含む水 溶液を用い、常法に従って行なわれる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法 に従って調製しつる。

本発明の水溶性ムティンまたはアミノ酸付加物を上述した医薬として哺乳動物に 用いる場合の一日投与量としては、たとえば約０．２μｇ／ｋｇ　〜０．２　ｍ ｇ／ｋｇテあり、さらに好ましくは約２　μｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇである 。

また、本発明の水溶性ムティンまたはアミノ酸付加物をコードする遺伝子を導入 した細胞の細胞培養を促進させる場合、ＦＧＦを培地１リツトルあたり約ｏ、０ １〜１０μｇ、さらに好ましくは約０．１〜ｌＯμｇとなるように培地に加える ことが好ましい。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 Ｉ　ＵＰＡＣ−Ｉ　ＵＢ　Ｃｏｍｍ１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｎ。

ｍｅｎｃｌａｃｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくも のであり、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合 は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。

ＤＮＡ　：デオキシリポ核酸 ｃＤＮＡ　：相補的デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　：リボ核酸 ｄＡＴＰ　：デオキシアデノシン三すン酸ｄＴＴＰ　：デオキシチミジン三すン 酸ｄＧＴＰ　：デオキシグアノシン三すン酸ｄＣＴＰ　：デオキシシチジン三す ン酸ＡＴＰ　、アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ　：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｉ、Ｉｌｅ　：イソロイシン Ｓ、Ｓｅｒ：セリン Ｔ、Ｔｈｒ　：スレオニン Ｃ，Ｃｙｓ　ニジスティン Ｍ、Ｍｅｔ　：メチオニン Ｅ、Ｇｌｕ　：グルタミン酸 り、Ａｓｐ　：アスパラギン酸 に、Ｌｙｓ　：リジン Ｒ，Ａｒｇ　：アルギニン Ｈ，Ｈｉｓ　：ヒスチジン Ｆ、Ｐｈｅ　：フエニールアラニン Ｙ、Ｔｙｒ　：チロシン Ｗ、Ｔｒｐ　：　ｈリブトファン Ｐ、Ｐｒｏ　ニブロリン Ｎ、　Ａｓｎ　：アスパラギン Ｑ、Ｇｉｎ　：グルタミン 以下に示す実施例において得られた形質転換体の寄託の受託臼および受託番号に つき、第１表に示す。第１表において、ＩＦＯ番号で示されているものは、財団 法人発酵研究所（ＩＦＯ）の寄託を示す。ＦＥＲＭ　ＢＰで示されているものは 、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基 づく寄託を示す。

第１表 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定 されるものではない。

叉施且土 （１）　ヒト癌細胞株ＫａｔｏｌｌＩ　ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーの 作成： ヒト癌細胞株ＫａｔｏｌｌＩよりｍＲＮＡをｍＲＮＡ分離用キット（ＦａｓｔＴ ｒａｃｋ、インヴイトロジエン、ＵＳＡ）を用いて抽出した。このｍＲＮＡを鋳 型としてｃＤＮＡライブラリーを、１ｌｉａｔ、ｓｏｎとＪａｃｋｓｏｎの方法 （Ｗａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｊ、　Ｆ、、　ＤＮＡク ローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　 Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏｃｈ）Ｉ　ＲＬ　ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏ ｒｄ、　ｐ７９．　１９８５）　）に従って、λファージベクターλｇｔ　１０ 　（Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、ら、ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・ アプローチ、Ｉ　ＲＬ　ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　ｐ４９．　１９８５） を用いて作成した。１０Ｍｇのポリ（Ａ）ＲＮＡより出発して、約１．５Ｘ１０ ’個のクローンよりなる大腸菌Ｃ６００，Ｈｆ１Ａ　（Ｈｕｙｎｈ　Ｔ、Ｖ、ら 、同上）を宿主としたｃＤＮＡライブラリーを得ることができた。

（２）　ヒトｂＦＧＦ受容作用を有する蛋白質のｃＤＮＡを含むファージの単離 とそのＤＮＡ塩基配列の決定上記ファージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｃ６０ ０，Ｈｆ１Ａを宿主として、寒天プレート上に、約ｌＸｌ０°クローンずつ、１ ０枚まき、これを２枚ずつのニトロセルロースフィルター（ミリポア社、ＨＡＴ Ｆフィルター）上に移した後、０．５Ｎ　ＮａＯＨ溶液でとかし露出変性したフ ァージＤＮＡをフィルター上に乾燥固定した。　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「モレ キュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌｌｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｊ　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐ３２０．　ｌ 　９８２）　。

一方、Ｐ、　Ｌｅｅら　（Ｐａｕｌｉｎｅ　Ｌｅｅら、　５ｃｉｅｎｃｅ７　： 　５７．　１９８９）の報告にあるトリのｂＦＧＦ受容体のアミノ酸配列の一部 （５２９〜５４１アミノ酸）から推定される塩基配列を持つオリゴヌクレオチド ５’　−ＡＴＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＣＧＡＴＣＡＴＱＴＴＣＡＴを化学合成 した。

このオリゴヌクレオチドに対してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）を 用いて５０μリツトルの反応液［オリゴヌクレオチド０．１　μｇ、５０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣリットルｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ、、１０ｍＭメルカプ トエタノール、５０μｃｉ　ｙ−”Ｐ　ＡＴＰ　Ｄ　５０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ ｅ）　、　３ユニツト　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ］中で３７℃１時間反応 させた、オリゴヌクレオチドの５′末端を”Ｐで標識した。

上記方法で標識したオリゴヌクレオチドをプローブとして、ＤＮＡを固定したレ プリカフィルターに会合させた。会合反応は、１０μＣ１のプローブを含む５Ｘ ＳＳＰＥ［１８０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＮａＨ，ＰＯ４，１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ　（ｐＨ７，４）］　、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、Ｏ。

１％Ｓ　Ｄ　Ｓ、１００　μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ｍ１中で、３ ５℃１６時間行い、反応後フィルターを５ｘＳＳＣｌ″Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ１、 ０，０１５Ｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅコ０．１％ＳＤＳ溶液で室温で３ ０分ずつ３回さらに４５℃３０分ずつ２回洗浄した［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら 。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ″Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐ。

３０９　（１９８２）　コ　。

洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、プローブに対して反応する 菌株を一組２枚のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重ね合わせること により探した。

この結果、プローブに対して反応する３個のｃＤＮＡクローンが得られ、これら をλＦＲＫＩ、λＦＲＫ２．λＦＲＫ３と名付けた。さらに、それぞれのｃＤＮ Ａ部分の塩基配列の一部をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（ＪｏＭＢｓｓ ｉｎｇら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、）旦、３０９　（１９８１））によって決定した。

この結果により、ヒトＦＧＦ受容作用を有する蛋白質の一部のアミノ酸配列を決 定することが出来た。ｃＤＮＡの塩基配列とその配列から推定されるアミノ酸配 列を図１に示す。該アミノ酸配列は報告されているトリｂＦＧＦ受容体のアミノ 酸配列と非常によく似ており、このｃＤＮＡがヒトＦＧＦ蛋白質を受容する作用 を有する蛋白質をコードするものであることを示している。

ここで得られた蛋白質は、ニワトリのＦＧＦ受容体［５ｃｉｅｎｃｅ、　７　。

５７　（１９８９）］のＣ末端の約１９０個のアミノ酸に対応する部分は欠損し ていると考えられるが、中央部のトランスメンブレン配列〜Ｎ末端に対応するア ミノ酸配列を少なくとも含むと考えられる。

！Ｌ医呈 ＦＲＫ３のｃＤＮＡ部分をプラスミドｐＵｃ１１８およびｐＵｃ１１９（宝酒造 ）のマルチクローニング部位に挿入して、それぞれ大腸菌ＭＶｌ　１８４を形質 転換することにより形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４／ｐＴＢ１２２ ７．Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶＩ　１８４／ｐＴＢ１２２８　（ＩＦＯ１５０７１、Ｆ ＥＲＭ　ＢＰ−３０４１）およびＥ、　ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４／ｐＴＢ１２ ２９　（ＩＦＯ１５０７２，ＦＥＲＭ　ＢＰ−３０４２）をそれぞれ得た。

これらの形質転換体より得られるプラスミドｐＴＢ　１２２７．　ｐＴＢｌ　２ ２８．ｐＴＢｉ　２２９のｃＤＮＡｔｌｕ分の制限酵素地図を図２に示す。

ｐＴＢ１２２７．ｐＴＢ１２２８．ｐＴＢ１２２９のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ部分を制限 酵素で消化して得られた切断部位の位置を示す。使用した制限酵素はＫｐｎＩ、 ＮｃｏＩ、ＰｖｕＩ、ＳｍａＩ、Ｂａ１Ｉである。

図２において、口は非コード領域を、口を黒くぬった印はコード領域を、■は、 欠失部分をそれぞれ示す。

さらに、これらｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、最も長いｃＤＮＡクロー ンｐＴＢ１２２９の塩基配列は１９５４塩基よりなることが分かった。その塩基 配列とそれがコードするアミノ酸配列を図４に示す。またｐＴＢ１２２８のｃＤ ＮＡを図３の塩基配列で示すが、これは図４に示された塩基配列における１３４ 〜４７８番目および１３０９〜１３１４番目の塩基が欠失していた。このためコ ードされるアミノ酸はＥｏ“〜に′およびＶ″＠およびＴ″。が欠損し、Ｒ゛° ′がＧとなる。さらにｐＴＢ１２２９のｃＤＮＡの塩基配列（図４）のうち１０ ２９番目のＧがｐＴＢ１２２８ではＴになっていた。またｐＴＢ１２２７のｃＤ ＮＡは１３９５〜１９５４番目に相当することがわかった。これらのｃＤＮＡの 塩基配列をアミノ酸に翻訳しても翻訳停止コドンが現れないことからヒトＦＧＦ 受容体のカルボキシル末端はさらに３′端側をクローニングしなければ得られな いと考えられる。翻訳されたアミノ酸をニワトリＦＧＦ受容体と比較すると約６ ６％の相同性がある。この比較からシグナルペプチドはＭ°〜Ａ”の２１個のア ミノ酸配列からなると予想される。また、同様にトランスメンブレン配列は１１ “〜Ｃ′１°と考えられる。

ｌ舅且且 （１）前記実施例１で得られたｍＲＮＡに対しｃＤＮＡ合成キット（ＣＤ　Ｎ　 Ａ合成システム・プラス、アマジャムＵ、に、）を用いてｃＤＮＡ合成を行った 。

前記実施例２で得られたｃＤＮＡ塩基配列（１６１８〜１６３８）をもとにプラ イマー５　’　−ＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧ　−３’　（２ １−ｍａｒ）を合成し、オリゴ（ｄＴ）、、−、、（アマジャム、Ｕ、に、）と ともに上記で得られたｃＤＮＡに対してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａ ｉｎ　ｒｅａｃｊｉｏｎ）法によりＦＧＦレセプターのカルボキシル末端をコー ドする部分を増幅した。ここで増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＵ ｃ１１８（宝酒造）のＳｍａｒ部位にクローニングして大腸菌旦、ｃｏｌｉ　Ｍ Ｖ１１８１形質転換シテ形質転換体旦、　ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４／ｐＴＢ　 １２８１を得た。

この形質転換体より得られるプラスミドｐＴＢ１２８１のＤＮＡを制限酵素Ｂａ ｍＨＩとＫｐｎ　Ｉで消化して得られたｃＤＮＡの長さは約１ｋｂｐであった。

さらにこのｃＤＮＡの塩基配列の解析を行った結果、この配列はＦＧＦレセプタ ーのＥｏ“１からカルボキシル末端をコードする部分と３′側の非翻訳領域を含 んでいることが確認された。

このｃＤＮＡ塩基配列は図３の塩基番号１６１８以降が重複しており、この部分 に存在する制限酵素ＳｍａＩの認識部位を利用して、完全なＦＧＦレセプターを コードするｃＤＮＡを有するプラスミドｐＴＢ１２８３（図５）とプラスミドｐ ＴＢ１２８４（図６）を構築した。このプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌ＭＶ１ １８４を形質転換して２種の形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶＩ　１８４／ｐＴＢ １２８３　（ＩＦＯｌ　５０８９、ＦＥＲＭ　ＢＰ−３２１４）およびＥ、　ｃ ｏｉｉ　ＭＶＩ　１８４／ｐＴＢ１２８４　（ＩＦＯ１５０９０，ＦＥＲＭ　Ｂ Ｐ−３２１５）を得た。

プラスミドｐＴＢ１２８４の有するｃＤＮＡ塩基配列を図７の塩基配列の連続し たもので示す。またプラスミドｐＴＢ１２８３の有するｃＤＮＡ塩基配列は図８ の連続したもので示すが、これは図７のうち１３４〜４７８番目および１３０９ 〜１３１４番目の塩基が欠失しており、その結果コードされるアミノ酸Ｅ”−に ’“およびＶ４１”およびＴｏ”。

が欠損し、Ｒ１”がＧとなる。さらにこのｃＤＮＡは１０２９番目のＧがＴであ る。

（２）ＦＧＦレセプターの動物細胞での発現（ａ）ＦＧＦレセプター発現用プラ スミドｐＴＢ　１３１３およびｐＴＢ１３１４の構築 前記（１）で得られた２種のＦＧＦレセプターの全構造領域を含むプラスミドｐ Ｔ８１２８４およびｐＴＢ１２８３をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩ−ＢｓｍＩで切 断し、Ｔ４ポリメラーゼ反応後、両末端にＢａｍＨＩリンカ−［ＣＧＧＡＴＣＣ Ｇ］を付加して、２．６ｋｂまたは２．２ｋｂ　Ｄ’ＮＡ断片を単離した。

一方、動物細胞ベクターｐＴ８１３０８は、プラスミドｐＴＢ３９９　（Ｃｅｌ ｌ　５ｔｒｕｃｔ、　Ｆｕｎｃｔ、１２．　２０５−２１７　（１９８７）　） のＩＬ−２ｃＤＮＡ領域を除去するため、プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、Ｋ ｌｅｎｏｗ　断片反応後、Ｂｇｌ　ＩＩリンカ−［ＣＡＧＡＴＣＴＧ］を付加し たのち、ＢｇｌＩＩで切断して得られた約３．８ｋｂ　ＤＮＡ断片を、Ｔ４リガ ーゼを用いて環状化した。

このｐＴＢ１３０８のＢｇｌＩＩ切断部位に、前記のＦＧＦレセプターｃＤＮＡ の２，６ｋｂまたは２．２ｋｂ断片を挿入して、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウ ィルス（ＭｕＬＶ）ＬＴＲの支配下に動物細胞でＦＧＦレセプターｃＤＮＡを発 現させつる発現用プラスミドｐＴＢ１３０９およびｐＴＢ　１３１０をそれぞれ 構築した。さらに、これらをそれぞれ５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して発現 ユニット部分（プロモーター遺伝子−ポリ（Ａ）シグナル）を、ハムスタージヒ ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）発現用プラスミドｐＴＢ３’４８　（Ｃｅ　１１ 　５ｔｒｕｃｔ、　Ｆｕｎｃｔ、１２，２０５　（１９８７））のＳＶ４０プロ モーター上流にあるＳａｌ　ｌ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ部位に挿入して、プラスミド ｐＴＢ　１３１３およびｐＴＢ１３１４をそれぞれ構築した。プラスミドｐＴＢ １３１３の構築図をｒ！Ｉ！Ｊ１３に示す。

（ｂ）動物細胞における発現 サルＣ０Ｓ７細胞を１０％牛脂児血清を含むＤＭＥＭ培地で直径６ｃｍの組織培 養用ディシュに播種し、翌日、同培地で培地交換した。

４時間後にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈａｍら、　Ｖｉｒｏｌｏｚｙ　５２． ４５６（１９７３））によりプラスミドｐＴＢ　１３１３およびプラスミドｐＴ Ｂ１３１４ＤＮＡ１０μｇをそれぞれトランスフェクトした。翌日０．５％牛脂 児血清を含むＤＭＥＭ培地に加えて培養を続け、４８時間後に培養液および細胞 を集めた。細胞はＰＢＳで２回洗ったのち、ＰＢＳにけんだくし、短時間の超音 波処理ののち、１５０００ｒｐｍで１５分遠心し上清液および細胞残渣を分離し た。これら培養液０゜５ｍｌ　（５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿）、細胞抽 出液および細胞残渣について５ＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスつンブロッティング法に よる解析を行った。−次抗体としては、ＦＧＦレセプターｃＤＮＡから推定され たＦＧＦレセプターのアミノ酸配列２７番目から３６番目に相当する合成ペプチ ド（ＬＶＥＤＴＴＬＥＰＥ）を抗原として得られたウサギポリクローナル抗体を 用いた。

ウェスタンブロッティングの結果、ｐＴＢ　１３１３感染ＣＯ３７細胞残渣から 約１４０〜１５０Ｋｄ、ｐＴＢ１３１４感染ＣＯ３７細胞残渣からは約１００Ｋ ｄの産物が検出された。

ｌ鳳医土 （＋）　ａｏｌｕｂｌｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒの大腸菌での発現系の構築：前記実 施例２で得られた形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ　１１８４／ｐＴＢ１２２８お よびＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ　ｌ　１８４／ｐＴＢ　１２２９それぞれにヘルパーフ ァージＫＱ７を感染させ、培地から一本鎖ＤＮＡを調整した。この−重鎖ＤＮＡ を鋳型とし、２本の合成プライマー５’−ＡＡＴＧＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＴ ＡＧＴＣＴＧＧＧＧ−３’　（２６ｍｅｒ）５’−ＧＡＡＧＧＡＧＧＧＣＣＧＣ ＡＴＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＧＴＴＧＣ−３’　（３０ｍｅｒ）を用いて、インヴ イトロミュータジェネシスシステム（アマジャム、　Ｕ、　Ｋ、）による部位特 異的突然変異を行った。この結果、（１）のプライマーにより図７の塩基配列に おける１１５２番目の塩基がＡに変異して翻訳停止コドンがＹｌ　ｔ“の代わり に導入され、さらに１１５５〜１１６０番目の塩基に制限酵素Ｂａｎ＋Ｈｒの認 識部位が導入されたプラスミドｐＴＢ１２８５およびｐＴＢ１２８６をそれぞれ 得た。

次いで、８３〜８７番目の塩基がＡＴＡＴＧに置換され、Ａ”のコドンがＭのコ ドンに変更され、さらにこの部分に制限酵素ＮｄｅＩの認識部位が導入されたプ ラスミドｐＴ８１２８７およびプラスミドｐＴＢ１２８８をそれぞれ得た。

これらのミュータントのＤＮＡからＮｄｅＩとＢａｍＨＩにより切り出される断 片０．７に塩基対と１に塩基対をプラスミドｐＥＴ３ｃのＴ７プロモーターの下 流にそれぞれ組み込んでプラスミドｐＴＢ１２８９およびｐＴＢ１２９０をそれ ぞれ得た。プラスミドｐＴＢ１２８９およびプラスミドｐＴＢ１２９０の構築図 を図９および図１０にそれぞれ示す。これらのプラスミドを用いて大腸菌ＭＭ２ ９４　（ＤＥ３）　／ｐＬｙｓＳを形質転換することによりＦＧＦレセプターの 細胞外ドメインを発現する形質転換体Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＶ２９４　（ＤＥ　３ ）　／ｐＬｙｓＳ、　ｐＴＢ　１２８９　（ＩＦＯ１５０９１，ＦＥＲＭ　ＢＰ −３２１６）およびＥ。

ｃａｌｆ　ＭＶ２９４　（ＤＥ３）　／ｐＬｙｓＳ、　Ｉ）ＴＢ　１２９０　（ Ｉ　ＦＯ１５０９２、ＦＥＲＭ　ＢＰ−３２１７）をそれぞれ得た。

（２）ＦＧＦレセプター細胞外ドメインの大腸菌での発現：Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ ２９４　（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴＢｌ　２８９およびＥ、ｃｏｌｉ　ＭＶ ２９４　（ＤＥ３）　／ｐＬｙｓＳ、　ｐＴＢ　１２９０をそれぞれＬＢ培地で 培養し、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトシドで発現を誘導した後、菌体全蛋白 質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより調べると、それぞれに特異的なバンドがコマシーブ ルー染色により確認された。分子量マーカーとの相対的位置関係からこれらのバ ンドはｃＤＮＡにコードされるタンパクの予想分子量に一致すると考えられ、Ｆ ＧＦレセプターの細胞外ドメインの大腸菌における産生が確認された。得られた ＦＧＦレセプター細胞外ドメインのアミノ酸配列については、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｍ Ｖ２９４　（ＤＥ３）　／ｐＬｙｓＳ、　ｐＴ１３１２８９が発現する蛋白のそ れを図１１の配列で示し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ２９４　（ＤＥ　３）　／ｐＬｙ ｓＳ、　ｐＴ１３１２９ｏが発現する蛋白のアミノ酸配列を図１２の配列で示す 。

（３）ＦＧＦレセプター細胞外ドメインの動物細胞での発現（ａ）発現用プラス ミドｐＴＢ１３１５およびｐＴＢ１３１６の構築 前記（１）で得られた２種のＦＧＦレセプターの細胞外ドメインをコードするｃ ＤＮＡを有するプラスミドｐＴＢ１２８６およびｐＴＢ１２８５をそれぞれ制限 酵素ＢｓｔＥＩ　Ｉ−ＢａｍＨＩで切断して。

１、ｌｋｂおよび０．７５ｋｂＤＮＡ断片をそれぞれ得た。一方、前記実施例３ （２）で構築したＦＧＦレセプター発現用プラスミドｐＴＢ１３０９を同じ制限 酵素で切断して、上記の１．Ｉｋｂおよび０゜７５ｋｂＤＮＡ断片でそれぞれ置 換して、発現用プラスミドｐＴＢ１３１１およびｐＴＢ　ｌ　３１２をそれぞれ 構築した。

ｐＴＢ１３１１およびｐＴＢ　１３１２はＭｕＬＶＬＴＲの支配下に２種のＦＧ Ｆレセプターの細胞ドメインを発現させつるプラスミドである。

さらに、これらをそれぞれ、５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して発現ユニット 部分を、前記実施例３（２）と同様に５ａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてＤ ＨＦＲ発現用プラスミドｐＴＢ３４８に挿入し、プラスミドｐＴＢ１３１５およ びｐＴＢ１３１６をそれぞれ構築した。プラスミドｐＴＢ　１３１５の構築図を 図１４に示す。

（ｂ）動物細胞における発現 前記実施例３（２）と同様の方法でプラスミドｐＴＢ　１３１３およびｐＴＢ１ ３１４をそれぞれサルＣ０Ｓ７＠胞にトランスフェクトした。ウェスタンブロッ ティングにより感染細胞を培養上清、細胞抽出液および細胞残渣を解析した結果 、ｐＴＢ１３１５およびｐＴＢ１３１６感染Ｃ０Ｓ７細胞培養液中に、約５０〜 ６０ｋｄおよび約３５〜５０ｋｄの産物を、それぞれ検出した。

ＦＧＦ蛋白質を受容する作用を有する動物蛋白質の水溶性ムティンは、腫瘍の治 療薬としであるいはＦＧＦ依存性のない細胞にＦＧＦに対する反応性を付与して 細胞増殖能を増大させることに有用である。

！ニガｉ。

大腸菌で産生されたＦＧＦレセプター細胞外ドメインの精製Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＶ ２９４　（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ、ｐＴ８１２８９を３５μｇ　／　ｍ　Ｑアン ピシリン、１０μｇ／ｍＱクロラムフェニコールを含む培地で３７℃で培養し、 濁度がＫｌｅｔｔ　１２０になったときイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド を最終濃度が０．５ｍＭになるように添加し、更に２時間培養を継続した。菌体 を遠心によす集め、氷冷したフォスフェートバッファードセラム（ＰＢＳ）で洗 った後回集菌し使用時まで一２０’Ｃに保管した。

１Ω培地から集めた大腸菌を２５ｍＱの水冷７Ｍ尿素；０．ＩＭＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　（ｐＨ８）、１０ｍＭジオスレイトール（ＤＴＴ）に懸濁して、１時間水中 に放置した。

この溶液を１７００Ｏｒｐｍで１時間遠心した後上清を、７Ｍ尿素。

０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８）、１ｍＭジオスレイトール（ＤＴＴ） で平衡化したＱ−セファロースカラム（径２．５ｃｍＸ５ｃｍ）にかけた。カラ ムの平衡化に用いた緩衝液で洗浄した後、Ｏ−ＬＭのＮａＣ１直線的濃度勾配を 流速１　ｒｎＱ／分で３００分にわたってかけ、８分毎に分画した（第１５図） 、各画分についてウェスタンブロッティングを行った結果、分画番号１０及び１ １にＦＧＦレセプター細胞外ドメインＢＦＲ−２ｅｘ　（アミノ酸配列は図１１ に示される。）が溶出されていることが認められた。

このＱ−セファロースカラムの溶出画分をさらに７Ｍ尿素０．１ＭＴｒｉ　５− ＭＣｌ　（ｐＨ８）、０．３Ｍ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＤＴＴで平衡化したセファ クリルＳ−２００カラム（径２．５ａｎＸ　１００ａ１１）にかけて、流速４０ ｍＱ／ｈｒでゲル濾過を行った。この結果ＦＧＦレセプター細胞外ドメインＢＦ Ｒ−２ｅｘは分子量約３２０００の位置に溶出されることがわかった。この画分 は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とコマシーブルー染色により単一の バンドを示した。

１舅且旦。

ＦＧＦレセプター細胞外ドメインを産生ずるＣＨＯ細胞株の樹立実施例４　（３ ）（ａ）記載の発現用プラスミドｐＴＢ１３１５およびｐＴＢ１３１６をそれぞ れＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　７ヱ、４２１６（１９８０））にリン酸カルシウム法（Ｇｒａｈ ａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５呈、４５６　（１９７３））により導入した。

２日後に選択培地（１０％透析牛脂児血清および３５μｇ　／　ｍ　Ｑプロリン を含むＤＭＥＭ）にかえて、培養を続け、ｄｈｆ　ｒ　となって増殖する形質転 換体を得た。

これらＣＨＯｄｈｆｒ　細胞をリミティングダイリューション法によりクローニ ングし、それぞれのプラスミドをトランスフェクトして得られたＣＨ○細胞につ き各２４クローンを樹立した。

つぎに各ＣＨＯｄｈｆｒ　クローンをまず、Ｏ，ｌμＭメトトレキセート（ＭＴ Ｘ）を含むＤＭＥＭ　（５％牛脂児血清、３５μｇ／ｍＱプロリンを含む）で培 養し、遺伝子増幅によるＭＴＸＱ性獲得細胞を選択した。以後順次１μＭ、１０ μＭ　ＭＴＸ耐性細胞を選択した。

このようにして得られたそれぞれのＣＨＯｄｈｆｒ　細胞クローンおよびそのＭ ＴＸ耐性細胞株について、培養液中に分泌されたＦＧＦレセプター細胞外ドメイ ンをウェスタンブロッティング法を用いて検出することにより、産生細胞株をス クリーニングした。すなわち、２４穴プレートで８０％コンフルエントまで増殖 させた各細胞株を０゜５％牛脂児血清および１０μｇ／ｍＱインシュリンを含む つＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ培地（１：　１）で３日間培養し、その培養液０．５ｍＡ （５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿）について、５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、−次抗 体として実施例３（ｂ）記載のウサギポリクローナル抗体を用いてウェスタンブ ロッティングをおこなった。

その結果、ｐＴＢ１３１５をトランスフェクトし、１μＭまたは１０μＭ　ＭＴ Ｘ耐性細胞として得られたＣＨＯＩ　３１５−１１５゜ＣＨＯ１３１５−１２３ およびＣＨＯ１３１５−１０２３（ＩＦ○５０２３６、　ＦＥＲＮ　ＢＰ−３３ ６２）細胞が、６０〜７ＯＫＤａのＦＧＦレセプター細胞ドメイン（ＢＦＲ−１ ｅｘ）（アミノ酸配列は、図１２に示される。）を産生、分泌していることが判 明した。また、ｐＴ８１３１６をトランスフェクトし、１μＭまたは１０μＭ　 ＭＴＸ耐性細胞として得られたＣＨＯ１３１６−１６１，ＣＨｏ　１３１６−１ ７２゜（ＩＦ○５０３２７．　ＦＥＲＭＢＰ−３３６３）　、　ＣＨＯ１３１６ −１０５３細胞が４０〜５０ＫＤａのＦＧＦレセプター細胞外ドメイン（ＢＦＲ −２ｅｘ）を産生、分泌していることが判明した。

これらＢＦＲ−１ｅｘまたはＢＦＲ−２ｅｘ産生ＣＨＯ細胞株を、ツニカマイシ ン（５μｇ　／　ｍ、　Ｑ　）存在下および非存在下に°゛ＳＳ−メチオニン０ ００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、５０μＣｉ／ｍＱ）を加えて培養し、°″ＳＳ−メチオ ニン標識た培養液中のタンパクを、上記ウサギポリクローナル抗体を用いて免疫 沈降を行った後、５ＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果、これらの形質転換Ｃ ＨＯ細胞の産生するＢＦＲ−１ｅｘは、４６ＫＤａのタンパクがグリコジル化さ れて７０ＫＤａに、ＢＦＲ−２ｅｘは、３５ＫＤａのタンパクがグリコジル化さ れて４５ＫＤａになっていることが示唆された。

次の文献は本出願において種々の観点からその開示が引用されているものであり 、ここに導入記載するものである。

ヨーロッパ特許出願公開公報　第２３７，９６６号ヨーロッパ特許出願公開公報 　第２８１，８２２号ヨーロッパ特許出願公開公報　第３２６，９０７号ヨーロ ッパ特許出願公開公報　第３９４，９５１号ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ 、１８．１９０６　（１９９０）ＥＭＢＯジャーナル　旦、２６８５　（１９９ ０）モレキュラーアンドセルラーバイオロジー、８．５５４１−５５プロシーデ ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、ＵＳＡ　旦ヱ 、４３７８−４３８２　（１９９０）サイエンス、呈土旦、５７−６０　（１９ ８９）ジェネティック・エンジニアリング、アカデミツクブレス社（１９８３年 ）第３１−５０頁 ジェネティック・エンジニアリング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１ 年）３巻　１−３２頁 カタログ・オブ・セル・ライング・アンド・ハイブリドーマズ、５ｔｈｅｄｉｔ ｉｏｎ、　１９８５．　ＡＴＣＣ発行バイオケミストリー、■、５２９４　（１ ９７９）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー　２，１６１　（１９ モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー　３，２８０　（１９ジーン、 ２．９５　（１９７７） ジーン、土、１２１　（１９７８） ジーン、１９，２５９　（１９８２） メソッズ・イン・エンザイモロジ−上５３．３−１１　（１９８７）バイオケミ カル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション。

土工２，６７８　（１９８３） モレキュラー・クローニング　コールド・スプリング・ラボラトリ−第２３９頁 （１９８２） プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、Ｕ ＳＡ　ミニ、１６０　（１９６８）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、９，３ ０９　（１９８１）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー　１２０　 ５１７ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、土工、　４５９　（１ ジエネティックス、二、４４０　（１９５４）ジーン、２４，２５５　（１９８ ３） ジャーナル・オブ・バイオケミストリー　エ旦、８７　（１９８４）モレキュラ ー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−第２４９頁 （１９８２） プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、Ｕ ＳＡ　Ｉ±、５６０　（１９７７）ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ　上、１ ５１３　（１９７９）プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ、ＵＳＡ、６９．２１１０　（１９７２）ジーン、上ヱ、１０ ７　（１９８２） モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス、±６８，１プロシーデ ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ、ＵＳＡ　７５ ；１９２９（１９７８）ヴイロロジー　ｌス、４５６　（１９７３）ジャーナル ・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス、４３１− ４３３．コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 （１９７２）プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズ、ＵＳＡ、７７．４５０５　（１９８０）サイエンス　１２２，５０１ 　（１９５２）ヴイロロジー、盈、３９６　（１９５９）ジャーナル・オブ・ザ ・アメリカン・メディカル・アソシエーションーＬ旦」工５１９　（１９６７） プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエテイ・フォー・ザ・バイオロジカル・メ ディスン　７３．１　（１９５０）ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・ アプローチ、第４９頁。

Ｉ　ＲＬ　ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、（１９８５）ＤＮＡクローニング・ア ・プラクティカル・アプローチ　ＩＲＬｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　ｐ７９ ．　１９８５）モレキュラー・クローニング　コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−、ｐ３２０．１９８２）。

サイエンス　’１５７．　（１９８９）モレキュラー・クローニング　コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、’ｐ、３０９　（１９８２）セル・ス トラクチュアル・ファンクション　１２．　２０５−２１７図５ＥｃｏＲ工 図６ ｃｏＲＩ 図９−１ 図９−２ 図１０−１ 図１５ 国際調査報告 −１−−ａｍｌｋｍ−１陶ＰＣＴ／ＪＰ　９１１００５５７フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　ｉ／２ １ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　２／２４５２５６（３２）優先日　１９９０年９月１ ４日（３３）優先権主張国　日本（Ｊ　Ｐ）Ｉ （３１）優先権主張番号　２／４１５８０１（３２）優先日　１９９０年１２月 ２８日（３３）優先権主張国　日本（Ｊ　Ｐ）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　Ｃ Ａ、ＪＰ、　ＵＳ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）蛋白質を受容する作用を有する動物蛋白質の 水溶性ムテイン。
2. ２．Ｃ末端欠失型ムテインである請求項１記載の水溶性ムテイン。
3. ３．細胞外ドメインに相当する請求項２記載の水溶性ムテイン。
4. ４．第１１図に示されたアミノ酸配列を有する請求項３記載の水溶性ムテイン。
5. ５．第１２図に示されたアミノ酸配列を有する請求項３記載の水溶性ムテイン。
6. ６．請求項１記載の水溶性ムテインをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ 。
7. ７．請求項６記載の組換えＤＮＡを含むベクター。
8. ８．請求項７記載のベクターで形質転換された形質転換体。
9. ９．大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ＰＬｙｓＳ，ｐＴＢ１２８９の特徴を有する 請求項６記載の形質転換体。
10. １０．大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ＰＬｙｓＳ，ｐＴＢ１２９０の特徴を有す る請求項６記載の形質転換体。
11. １１．請求項８記載の形質転換体を培地に培養することを特徴とする請求項１記 載の水溶性ムテインの製造法。