PL193281B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, gospodarz, polipeptyd, dimer peptydu z funkcją biologiczną lektyny jemiołowej, sposób wytwarzania polipeptydu, toksyna odpornościowa, środek leczniczy i środek diagnostyczny - Google Patents

Abstract

1. Czasteczka kwasu nukleinowego lub jej nic antysensowna, ewentualnie primer lub para primerów hybrydyzujaca swoiscie z ta czasteczka kwasu nukleinowego lub z komplementarna do niej nicia, znamienna tym, ze: (a) koduje preproproteine, która po dojrzeniu ma dzialanie biologiczne dimeru lektyny jemio- lowej i posiada sekwencje nukleotydowa przedstawiona na fig. 4c; (b) koduje fragment preproproteiny wedlug (a), przy czym fragment ten jest biologicznie czynnym skladnikiem dimeru lektyny jemiolowej; (c) rózni sie degeneracja kodu genetycznego od czasteczki kwasu nukleinowego wedlug (a) lub (b); lub (d) hybrydyzuje w scisle okreslonych warunkach z czasteczka kwasu nukleinowego wedlug (a), (b) lub (c) i która koduje polipeptyd z wymienionymi w (a) lub (b) funkcja biologiczna albo ak- tywnoscia. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka kwasu nukleinowego, wektor, gospodarz, polipeptyd, dimer peptydu z funkcją biologiczną lektyny jemiołowej, sposób wytwarzania polipeptydu, toksyna odpornościowa, środek leczniczy i środek diagnostyczny. Wynalazek dotyczy zwłaszcza cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują preproproteiny, mające po dojrzeniu aktywność biologiczną dimeru lektyny jemiołowej, wektorów, które zawierają te cząsteczki kwasu nukleinowego, gospodarzy transformowanych tymi wektorami i polipeptydów oraz dimerów polipeptydów, które są kodowane przez te cząsteczki kwasu nukleinowego. Polipeptydy oraz dimery polipeptydów znajdują, szerokie zastosowanie do celów leczniczych. Wynalazek dotyczy, zatem toksyny odpornościowej i środków leczniczych, które zawierają polipeptydy oraz dimery polipeptydów według wynalazku. Ponadto wynalazek dotyczy preparatów diagnostycznych, które zawierają polipeptydy oraz dimery polipeptydów i/lub primery, które swoiście hybrydyzują z cząsteczkami kwasu nukleinowego według wynalazku.

Wyciągi z jemioły od szeregu stuleci są używane do celów leczniczych. Od początku tego stulecia preparaty jemiołowe stosuje się z różnymi skutkami do leczenia raka, [Bocci, 1993; Gabuis et al., 1993; Gabius & Gabius, 1994; Ganguby & Das, 1994]. Hajto et al. [1989, 1990] wykazał, że w osiąganiu wyników leczniczych pośredniczy, zwłaszcza tak zwana lektyna jemiołowa (wiskumina, aglutynina z Viscum album, VAA). Oprócz działania cytotoksycznego jest obecnie dyskutowana zwłaszcza (nieswoista) stymulacja odporności, której dodatnie wyniki wykorzystuje się do leczenia towarzyszącego i uzupełniającego pacjentów chorych na raka. Polepszenie jakości życia takich pacjentów następuje być może wskutek wydzielania, endorfiny ustrojowej [Heiny i Beuth, 1994].

Liczne badania in vitro [Hajto et al., 1990; Mannel et al., 1991; Beuth et al., 1993] oraz in vivo [Hajto, 1986; Hajto et al., 1989, Beuth et al., 1991; Beuth et al., 1992] jak również badania kliniczne wykazały wzrost wydzielania cytokin zapalnych (TNF-a, IL-1, IL-6) jak również aktywację składników komórkowych układu odpornościowego (komórek TH, komórek NK).

Obecnie uważa się, że aktywnym składnikiem wyciągów z jemioły jest proteina lektyny jemiołowej o ciężarze cząsteczkowym 60 kDa, którą można otrzymać z wyciągów na drodze biochemicznej. [Franz et al., 1977; Gabius et al., 1992]. Proteina ML składa się z dwóch kowalencyjnie połączonych podjednostek mostków dwusiarczkowych S-S, której łańcuch A jest odpowiedzialny za inaktywowanie enzymatyczne rybosomów [Endo et al., 1988] a łańcuch B za wiązanie węglowodanów. Na podstawie dotychczasowego stanu wiedzy aktywność biologiczną tłumaczy się głównie aktywnością lektyny łańcucha B [Hajto et al., 1990].

Znajomość wzajemnych powiązań między strukturą i działaniem lektyny jemiołowej (ML) jest jednak do dzisiaj mała. Niejasny jest udział wnoszony przez poszczególne łańcuchy i ichróżne aktywności biochemiczne i enzymatyczne do obserwowanego działania lub wyników leczniczych. Analiza powiązań struktura-działanie jest utrudniona przez zanieczyszczenia preparatów substancjami zawartymi w jemiole [Stein & Berg, 1994]. Zależność aktywności preparatów wyciągowych od różnic w składzie wyciągów jest także dyskutowana z uwzględnieniem gatunku drzewa-gospodarza (np. jabłoni, sosny, topoli) [H^sen et al., 1996]. Zarówno dla wiskotoksyny [Garcia-Olmedo et al., 1983; Mendez et al., 1990] jak idla innych wiskumin (np. ML-2, ML-3) przyjmuje się podobne działanie [Eifler et al., 1994]. Nawet wysokooczyszczone na drodze biochemicznej (za pomocą chromatografii powinowactwa) preparaty ML odznaczają się znaczną niejednorodnością (fig. 8). Ta niejednorodność przejawia się w mierzalnych biochemicznie aktywnościach łańcuchów, w efektach wywoływanych in vitro i in vivo, jak również w samych strukturach protein. Warianty strukturalne dyskutuje się dla glikozylowanych łańcuchów A i B ML jak również dla odmian sekwencji. Gabius et al.,[1992] i Dietrich et al.,[1992] wskazują na zmienność sekwencji łańcuchów A1i A2 ML-1.

W celu szczegółowego zbadania skutków leczniczych lektyny jemiołowej pożądane jest otrzymanie jej w stanie czystym, jako strukturalnie jednorodnej substancji. Ponadto fachowcy są zainteresowani możliwością wytwarzania lektyny jemiołowej lub jej składników w czystej postaci, aby można było ją/je stosować np. na skalę techniczną jako składnik czynny środków leczniczych. Te cele nie mogły być jednak dotychczas nawet w przybliżeniu zrealizowane sposobami znanymi w stanie techniki. W wyniku wyodrębniania z materiału roślinnego według obecnego stanu techniki otrzymuje się zawsze niejednorodną mieszaninę substancji. Niejednorodność preparatów roślinnych lektyny jemiołowej wynika między innymi z posttranslacyjnego przekształcania się ML-1 w izoformy ML-2 i ML-3, tak, że preparaty lektyny jemiołowej w zależności od metody wyodrębniania lub czasu trwania fermentacji posiadają zmienną zawartość ML-1, ML-2 i ML-3 [Jaggy et al., 1995]. Każda z wymienionych izoform

PL 193 281 B1 posiada ponadto dalej posuniętą, mikroniejednorodność, która jest pokazana na fig. 8 dla ML-1 przez izoelektryczne ogniskowanie barwne.

Celem wynalazku było, więc otrzymanie lektyny jemiołowej w czystej postaci i w ilościach umożliwiających użytkowanie jej na skalę techniczną.

Tak, więc wynalazek dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego lub jej nici antysensownej, ewentualnie primera lub pary primerów hybrydyzujących swoiście z tą cząsteczką kwasu nukleinowego lub z komplementarną do niej nicią, charakteryzującą się tym, że:

(a) koduje preproproteinę, która po dojrzeniu ma działanie biologiczne dimeru lektyny jemiołowej i posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 4c;

(b) koduje fragment, preproproteiny według (a), przy czym fragment ten jest biologicznie czynnym składnikiem dimeru lektyny jemiołowej;

(c) różni się degeneracją kodu genetycznego od cząsteczki kwasu nukleinowego według (a) lub (b); lub (d) hybrydyzuje w ściśle określonych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego według (a), (b) lub (c) i która koduje polipeptyd z wymienionymi w (a) lub (b) funkcją biologiczną albo aktywnością.

W wyniku wytwarzania sekwencji genowej lektyny jemiołowej, wychodząc z tej sekwencji można po raz pierwszy otrzymywać rekombinantowe łańcuchy pojedyncze (rMLA, rMLB) o dużej czystości, które mogą reasocjować in vitro dając w ten sposób holoproteinę ML, która pod względem chemicznym, enzymatycznym i strukturalnym jest jednorodna. Reasocjowana proteina rekombinantowa nie wykazuje żadnej zmienności i mikroniejednorodności, zwłaszcza w zakresie jej struktury pierwotnej i modyfikacji posttranslacyjnych (glikozylowań, fosforylowań) i zarówno jako holoproteina, jako łańcuch częściowy i w postaci subfragmentów szczególnie dobrze nadaje się do celów leczniczych.

Pod pojęciem „fragment” preproproteiny lektyny jemiołowej rozumie się według wynalazku każdy fragment, a więc nie tylko fragment występujący w stanie naturalnym, który jest biologicznie aktywną częścią składową dimeru lektyny jemiołowej. Należy wyjaśnić, że przez takie biologicznie aktywne części składowe dimeru lektyny jemiołowej specjalista oczywiście rozumie także takie części składowe, które są częściami poszczególnych łańcuchów dimeru. Przedmiotem wynalazku są, więc oczywiście także poszczególne łańcuchy lub ich części, które są składnikami sekwencji przedstawionej na fig. 4c.

Pojęcie „oczywiście” w połączeniu z pojęciem „część składowa lektyny jemiołowej” oznacza według wynalazku, że tak scharakteryzowany fragment stanowi łańcuch, dimeru lektyny jemiołowej lub jest subfragmentem łańcucha, który oczywiście występuje w łańcuchu. Te fragmenty są przeważnie biologicznie aktywne.

Pod pojęciem „biologicznie aktywny” rozumie się według wynalazku, że te fragmenty posiadają, co najmniej jedną funkcję biologiczną łańcuchów lub, dimeru spośród funkcji opisanych w niniejszym zgłoszeniu lub inną funkcję biologiczną poszczególnych łańcuchów lub dimeru. Ponadto pod pojęciem „biologicznie aktywny rozumie się także aktywność farmakologiczną i/lub odpornościową.

Dodatkowo za pomocą rekombinantowej proteiny ML można po raz pierwszy ustalić doświadczalnie wkłady poszczególnych domen i subdomen. Rekombinantowa proteina ML i rekombinantowe podjednostki/łańcuchy częściowe stanowią podstawę odpowiednich zdefiniowanych preparatów jedno-składnikowych jako materiałów zastępczych preparatów wyciągowych i standaryzowanych wyciągów.

Klonowanie genu kodującego lektynę jemiołową niespodziewanie mogło być wykonane za pomocą nowej strategii klonowania, gdy zawiodły konwencjonalne strategie klonowania:

Dla lektyny jemiołowej jest znany cały szereg danych chemicznych. Tak, więc oprócz ciężaru cząsteczkowego i struktury podjednostek są zwłaszcza znane krótkie peptydy N-terminalne, dla których sekwencje aminokwasowe zostały opisane niezależnie przez Dietricha et al. [1992] i Gabiusa et al., [1992] [patrz także DE 4221836]. Praktycznie jest niemożliwe, aby wychodząc z N-terminalnych peptydów łańcucha A lub B wytwarzać na bazie ich składów aminokwasowych i związanego z tym dużego stopnia degeneracji możliwych do wyprowadzenia sekwencji kwasów nukleinowych syntetyczne oligonukleotydy, których stopień degeneracji jest wystarczająco niski, i stosując klasyfikowanie bibliotek genowych dojść do zidentyfikowania fragmentów genu ML. Dotyczy to także banków genowych, cDNA, które wytworzono wychodząc z poli-(A+) RNA Viscum album.

Reakcja łańcuchowa polimerazy pozwala na amplifikację odcinków DNA, które leżą między znanymi odcinkami [Erlich et al., 1988]. Z „sensownym” oligonukleotydem, wychodząc z N-końca MLA, i „antysensownym” oligonukleotydem N-końca MLB byłaby możliwa amplifikacja leżącego między nimi odcinka genu przy założeniu swobody wprowadzania genu ML (fig. 1a). W praktyce analiza N-terminalnej sekwencji łańcucha pokazuje, że stopień degeneracji możliwych kombinacji oligonukle4

PL 193 281 B1 otydów do skutecznego wykonania tego przedłużenia jest o wiele za duży. Jest to uzasadnione zwłaszcza tym, że sekwencja, N-końca łańcucha B jest niekorzystna dla konstrukcji oligonukleotydowej, wskutek czego nie można wykonać amplifikacji sekwencji genu ML wychodząc ze znanych obszarów sekwencji aminokwasowych (fig. 1b).

Próbując klonować gen ML stosując zmienioną strategię, PCR do konstruowania oligonukleotydów amplifikacyjnych badacze próbowali wprowadzać dane dotyczące białka zwłaszcza na podstawie 1989, właściwości związków powinowactwa lektyny jemiołowej do klasy inaktywujących rybosomy protein typu I i typu II [Stirpe et al., 1992]. Bazując na wielokrotnym ustawianiu w linii (a) protein RIP typu I i łańcuchów A rycyny jak również (b) łańcuchów B abryny i rycyny zidentyfikowano zakonserwowane regiony w łącznie 8 obszarach sekwencyjnych. Wychodząc z tych regionów sekwencyjnych i korzystając z tablic stosowania kodonów powinowatych gatunków skonstruowano łącznie 21 oligonukleotydów i zastosowano je w różnych kombinacjach w powyżej 200 doświadczeniach amplifikacyjnych. W żadnym przypadku nie można było jednak otrzymać swoistych produktów amplifikacji, chociaż zmieniano w szerokich granicach warunki PCR obejmujące temperaturę wygrzewania, zawartość Mg ²⁺ jak również parametry cyklu.

Zarówno klasyfikowanie banków genowych i banków cDNA jak również stosowanie technik, PCR nie umożliwiło, więc na podstawie przeprowadzonych rozważań dotarcia do specjalnych sekwencji ML-DNA.

Poszukiwano, więc na nowych drogach sposobu wywierania wpływu dalszych właściwości strukturalnych struktury rycyny i abryny na konstrukcję oligonukleotydów amplifikacyjnych.

Ponieważ mechanizm enzymatyczny inaktywując rybosomy protein (RIPs), tu zwłaszcza typu II-RIP rycyny, jest taki sam jak w przypadku ML [Endo et al., 1988a+19S8b], więc nie można było wykluczyć, że na płaszczyźnie czynnościowych obszarów struktur pierwszo- i trzeciorzędowych także występują zgodności strukturalne. Wychodząc ze struktury kryształów rycyny [Katzin et al., 1991; Rutenber & Robertus, 1991; Weston et al., 1994] analiza giętkości łańcucha rycyny A dała wskazówkę o małej ruchliwości Arg 180, który leży wewnątrz zakonserwowanego obszaru sekwencji. Ponadto na bazie konfiguracji przestrzennej łańcucha została wykonana analiza możliwości podstawiania aminokwasów w tym obszarze aktywnego centrum z uwzględnieniem wzajemnego oddziaływania substratów. Wyniki tych rozważań zostały obecnie wzięte pod uwagę z równoczesnym dokonaniem oceny rozległych zmian rozmieszczenia sekwencji w łańcuchu A rycyny i w dalszych RIPs typu I.

Wraz z rozszerzeniem wyników porównywania sekwencji przez włączenie danych strukturalnych powstało prawdopodobieństwo występowania pewnych reszt aminokwasów w określonych pozycjach. Dzięki temu stało się możliwe zaproponowanie dla tego obszaru szeregu teoretycznych sekwencji aminokwasowym ML i skonstruowanie przy ich użyciu odpowiedniego bardzo mało zdegenerowanego oligonukleotydu (RMLA2)(fig. 1c).

Teraz, więc z kombinacji RMLA1 (zdegenerowanego oligonukleotydu, który został wyprowadzony z N-terminalnej sekwencji aminokwasowej łańcucha MLA; porównaj fig. 1b) i skonstruowanego na podstawie powyższych rozwiązań oligonukleotydu RMLA2 miejsce aktywne przy zdefiniowanych parametrach PCR i wychodząc z kompleksowego genomowego ML-DNA można było otrzymać potrzebne fragmenty, podczas gdy wszystkie wyżej opisane alternatywne układy były nieprzydatne.

Uzupełnienie informacji sekwencyjnej genu zostało, więc wykonane przez swoisty niezdegenerowany primer oligonukleotydowy, wywiedziony z obecnej w wyniku klonowania i sekwencjonowania fragmentu a (fig. 3) sekwencji częściowej genu MLA, i zdegenerowanego oligonukleotydu, wywiedzionego z RIP I i układu sekwencyjnego rycyna/abaryna, za pomocą dalszych amplifikacji PCR. Do skonstruowania zdegenerowanego oligonukleotydu łańcucha, B użyto układy sekwencyjne łańcuchów

B rycyny i abaryny, gdzie również zostały znalezione obszary o dużym stopniu konserwacji.

W celu otrzymania końców 5' i 3' holoproteiny, fragmentów częściowych łańcuchów B oraz nie poddawanych translacji odcinków 5' i 3' zsyntetyzowano na drodze transkrypcji odwróconej wychodząc z wyodrębnionego RNA jemioły analogiczny cDNA i za pomocą techniki RACE [Frohman et al.,

1989] otrzymano odpowiednie odcinki genu. Gdy była już obecna duża ilość zachodzących na siebie fragmentów genu (fig. 3), wytworzono następnie całkowite odcinki genu łańcuchów A i łańcuchów B wychodząc z kompleksowego genomowego DNA jemioły i stosując ponownie specyficzną technikę PGR. Sekwencje genowe rMLA i rMLB, zaopatrzone w modyfikacje terminalne, są przedstawione na fig. 4a i 4b. Całkowita sekwencja genowa ML obejmująca także nie poddawane translacji obszary 5' i 3' jak również odcinki genu kodujące endopeptyd i peptyd sygnałowy, jest przedstawiona na fig. 4c.

PL 193 281 B1

W korzystnej postaci wykonania cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku znajduje się fragment, który jest łańcuchem A lektyny jemiołowej i który koduje się za pomocą przedstawionej na fig. 4a (MLA) sekwencji nukleotydowej.

W dalszej korzystnej postaci wykonania cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku znajduje się fragment, który jest łańcuchem B lektyny jemiołowej i który koduje się za pomocą przedstawionej na fig. 4b (MLB) sekwencji nukleotydowej.

Dalsza korzystne postać wykonania wynalazku dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego, która jest cząsteczką DNA.

Według wynalazku pod nazwą „cząsteczka DNA” należy rozumieć zarówno cząsteczkę genomową, jak i cząsteczkę cDNA lub (pół)syntetyczną cząsteczkę DNA. Sposoby wytwarzania tych różnych cząsteczek DNA są znane specjaliście z dziedziny będącej przedmiotem wynalazku.

W dalszej korzystnej postaci wykonania wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego jest cząsteczką RNA.

Wynalazek dotyczy także cząsteczki kwasu nukleinowego, która jest nicią antysensowną w stosunku do poprzednio opisanej cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku. Taka nić antysensowna może być stosowana, np. w celu hamowania transkrypcji a więc do badania ekspresji i regulacji w roślinie.

Wynalazek dotyczy także wektora, który zawiera, co najmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.

Wektor według wynalazku może zawierać np. jedną jedyną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, która koduje całą preproproteinę lektyny jemiołowej. Jeżeli ten wektor jest wektorem ekspresyjnym, wówczas preproproteina może być procesowana w odpowiednim transformowanym gospodarzu a jednostki monomerowe można łączyć ze sobą do postaci dimeru lektyny in vivo lub in vitro. W innej postaci wykonania wektorem według wynalazku jest wektor, który stosuje się tylko do propagacji kwasu nukleinowego według wynalazku.

W korzystnej postaci wykonania wektor według wynalazku zawiera zarówno cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch A lektyny jemiołowej lub jego fragment, jak i cząsteczkę kwasu nukleinowego, która koduje łańcuch B lub jego fragment. Zwłaszcza fragmenty monomerów są biologicznie czynne.

W dalszej korzystnej postaci wykonania wektorem według wynalazku jest wektor ekspresyjny. Dla specjalisty jest jasne jak należy wytwarzać odpowiednie wektory ekspresyjne dla organizmów różnych gospodarzy.

Według wynalazku przedstawiono nadającą się do ekspresji heterologicznej sekwencję kodującą łańcuch A lektyny jemiołowej wytwarzaną za pomocą swoistej PCR wychodząc z kompleksowego genomowego DNA jemioły. Doczepiono przy tym przez niekomplementarne obszary zastosowanych oligonukleotydów primerowych elementy kontrolne translacji jak również sekwencje rozpoznawcze endonukleaz restrykcyjnych, co wychodząc z występującego w genomie genu preprolektyny, jemiołowej umożliwiło klonowanie i oddzielną ekspresję łańcucha A lektyny jemiołowej.

Obszar 5' sekwencji kodującej rMLA odpowiadający resztom aminokwasowym tyrozyna¹-tyrozyna¹⁷ [Dietrich et al., 1992; Gabius et al., 1992] został po włączeniu z przodu kodonu startowego translacji wytworzony jako syntetyczny fragment genu przez hybrydyzację i klonowanie dwóch oligonukleotydów.

W ten sposób zoptymalizowano sekwencję genową pod względem wyboru kodonu, jak to opisano dla genów poddanych silnej ekspresji w Escherichia coli [Gribskov et al., 1984]. Na końcu 3' syntetycznego fragmentu genu rMLA oraz na końcu 5' wytworzonego za pomocą PGR fragmentu genu rMLA wprowadzono poprzez celowaną wymianę kodonu tyrozyny¹⁷ z TAC na TAT miejsce cięcia restrykcyjnego SspI, które umożliwiło fuzję obydwóch fragmentów genu rMLA przy równoczesnym wytworzeniu wektora pML14-17 (fig. 5). Sekwencja kodująca rMLA została potwierdzona przez sekwencjonowanie DNA (fig. 4a). W celu wykonania ekspresji rMLA w Escherichia coli wyodrębniono sekwencję genową z wektora PML14-17 i przez insercję wstawiono w wektor ekspresji pT7-7 [Studier & Moffart, 1986] pod kontrolą promotora polimerazy T7-RNA jak również terminatora transkrypcji. Za pomocą wynikowego wektora ekspresji pT7-MLA (fig. 5) transformowano szczep ekspresyjny BL21 E. coli. Indukcja ekspresji genu jest przedstawiona przez występujące pasmo proteinowe odpowiadające nieglikozylowanemu, rekombinantowemu łańcuchowi A lektyny jemiołowej, posiadającemu względną masę cząsteczkową 25 kDa. Wykrywanie i identyfikowanie rekombinantowego produktu ekspresji wykonano za pomocą analizy Western-Blot przy użyciu swoistego przeciwciała anty-MLA (fig. 7).

PL 193 281 B1

W celu wykonania ekspresji heterologicznej łańcucha B lektyny jemiołowej amplifikowano całkowitą sekwencję kodującą MLB za pomocą specyficznej PCR z kompleksowego genomowego DNA Viscum album, przy czym przez nie-komplementarne obszary zastosowanych oligonukleotydów primerowych wprowadzono elementy kontrolne translacji jak również sekwencje rozpoznawcze endonukleaz restrykcyjnych (fig. 6). Wynikowy produkt PCR 0,8 kpz został po klonowaniu w wektorze klonującym TA, pCRII wstawiony przez insercję w wektor ekspresji PT7-7 pod kontrolą elementu kontroli transkrypcji a wynikowym wektorem ekspresji PT7-MLB transformowano szczep ekspresyjny BL21 E. coli.

Kompletność sekwencji kodującej rMLB potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA (fig. 4b). Ekspresję wykrywano za pomocą analizy Western-Blot przy użyciu swoistego przeciwciała anty-MLB [TB33, Tonevitsky et al., 1995], przy czym po upływie 2h od indukcji ekspresji genu pojawiła się proteina immunoreaktywna o względnej masie cząsteczkowej 31 kDa odpowiadająca nieglikozylowanemu, rekombinantowemu łańcuchowi B lektyny jemiołowej (fig. 7b). Analiza frakcji komórkowych po całkowitym rozłożeniu komórek E. coli wykazała podział zsyntetyzowanego łańcucha rMLB, na część rozpuszczalną w przesączu oraz na nierozpuszczalne „inclusion bodies” (ciała wtrącone) w osadzie z rozłożonej masy komórkowej E. coli, przy czym po upływie 4h od indukcji część rozpuszczalna oraz nie-rozpuszczalna stanowiły po 50% całkowitego wydatku (fig. 7b).

Ponadto wynalazek dotyczy gospodarza, którego transformuje się za pomocą, co najmniej jednego wektora według wynalazku.

Zależnie od postawionego zadania specjalista może wytwarzać za pomocą gospodarza według wynalazku tylko jeden z obydwóch monomerów lub kombinację obydwóch monomerów, zwłaszcza jako zasocjowany dimer. Gospodarzem może być komórka eukariontyczna lub prokariontyczna, roślina transgeniczna lub zwierzę transgeniczne.

Gospodarzem według wynalazku jest, zwłaszcza komórka ssacza, komórka roślinna, bakteria, komórka grzyba, komórka drożdżowa, komórka owadzia lub roślina transgeniczna.

W szczególnie korzystnej postaci wykonania gospodarzem według wynalazku jest bakteria E. coli, komórka Aspergillus lub komórka Spodoptera, zwłaszcza komórka Spodoptera frugiperda.

Wynalazek dotyczy także polipeptydu, który koduje się za pomocą cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku lub wektora według wynalazku i/lub wytwarza w odpowiednim gospodarzu według wynalazku.

Polipeptyd według wynalazku posiada, zwłaszcza aktywność biologiczną łańcucha A lub łańcucha B lektyny jemiołowej. W innych postaciach wykonania polipeptyd według wynalazku może mieć tylko część aktywności biologicznej lub może nie posiadać żadnej aktywności biologicznej. Pod pojęciem „część aktywności biologicznej rozumie się według wynalazku obniżoną aktywność i/lub pewną liczbę aktywności z widma aktywności biologicznych. Polipeptydem według wynalazku może być także fragment łańcucha A lub B, który ma jedną z wyżej wymienionych właściwości.

Badanie właściwości rMLA, rMLB i holoproteiny rML.

(I) Względne masy molowe i struktura

Względne masy molowe zostały oznaczone przez elektroforezę poliakryloamidową SDS w warunkach redukujących i następnie zabarwienie proteiny za pomocą srebra oraz błękitu brylantowego Coomassie oraz przez zabarwienie immunologiczne w ramach analizy Western-Blot.

Niespodziewanie stwierdzono przy tym, że rekombinantowy, nieglikozylowany łańcuch A lektyny jemiołowej ma względną masę molową 25 kDa i tym znacząco różni się od naturalnych łańcuchów A lektyny jemiołowej A1z 31 kDa oraz A2 z 29 kDa. Ta różnica względnych ciężarów cząsteczkowych jest niespodziewana przede wszystkim, dlatego, bo w stanie techniki przyjmowano, że łańcuch A jest nieglikozylowany. Rekombiantowy łańcuch B lektyny jemiołowej ma względną masę molową, 31 kDa, jest, więc znacznie lżejszy, niż glikozylowany naturalny łańcuch B lektyny jemiołowej z 36 kDa (fig. 7).

Niejednorodność naturalnych protein ML występująca w wyniku glikozylowania i/lub zmian sekwencyjnych, które w żelu, SDS pokazują się jako szerokie pasma, nie występuje w żadnym z badanych rodzajów rekombinantowych.

Względne masy molowe reasocjowanej holoproteiny rMLA/rMLB (rML) sumują się do wielkości, 56 kDa w porównaniu do cięższej nML z 65-67 kDa.

(II) Jednorodność izoelektryczna

Okazało się, że rMLA jest izoelektrycznie jednorodną proteiną o punkcie izoelektrycznym 6,8 w przeciwieństwie do wysokooczyszczonych naturalnych łańcuchów A lektyny jemiołowej, które dzielą się na 4 rodzaje o punktach izoelektrycznych 5,2; 5,4; 5,7 i 6,2 (fig. 8).

PL 193 281 B1

Okazało się, że rMLB jest izoelektrycznie jednorodną proteiną o punkcie izoelektrycznym 5,1 w przeciwieństwie do naturalnego łańcucha B lektyny jemiołowej, który dzieli się, na co najmniej 2 rodzaje o punktach izoelektrycznych 7,1 i 7,3 (fig. 8).

Dla naturalnej, holoproteiny ML wynikła, więc możliwość występowania znacznej liczby wariantów i kombinacji cząsteczkowych (fig. 8 dół), podczas gdy, dla rekombinantowej proteiny lektyny jemiołowej wystąpiła tylko jedna jednolita ruchliwość w ogniskowaniu barwnym IEF co udowodnią jednorodność rML w stosunku do mikro-niejednorodności rodzajów protein naturalnych.

(III) Aktywność enzymatyczna rMLA

Przez zastosowanie oczyszczonych za pomocą powinowactwa odpornościowego preparatów rMLA w sprzężonym badaniu transkrypcji/translacji zbadano aktywność hamowania translacji, dla rMLA (wyodrębnionego z rozpuszczalnego składnika produktu ekspresji) i rMLA (wyodrębnionego z nierozpuszczalnego składnika, „inclusion bodies”).

rMLA posiada w porównaniu z naturalnym łańcuchem A lektyny jemiołowej różną charakterystykę hamowania w zakresie zależności hamowania translacji od wielkości dawki jak również w zakresie nie ulegającej hamowaniu resztkowej aktywności translacyjnej w zastosowanym lizacie retykulocytów, patrz fig. 9. Właściwość enzymatyczna, która stanowi podstawę działania toksycznego holoprotein ML, jest znacząco zmniejszona w rodzajach rekombinantowych.

(IV) Aktywność wiązania węglowodanów przez rMLB

Łańcuchy rMLB, które zostały otrzymane przez renaturację i reoksydację z pierwotnych produktów ekspresji, jak również holoproteiny rMLA/rMLB, rMLA/MLB i MLA/rMLB wykazują aktywność wiązania węglowodanów, którą można zbadać za pomocą testu „Enzyme-Linked-Lektin-Assay (ELLA) przez wiązanie na matrycach węglowodanowych asialofetuiny lub fetuiny. Specyficzność węglowodanową, rekombinantowego łańcucha rMLB można oznaczać i kwantyfikować w układzie ELLA w warunkach współzawodnictwa dla galaktozy, b-laktozy, N-acetylo-galaktozoaminy (GalNAc) i kwasu sialowego (kwasu N-acetylo-neurami-nowego, NANA). Test ELLA pokazuje przy tym niespodziewanie różne specyficzności węglowodanowe dla nMLB i rMLB. Powinowactwo wiązania opisuje się przy tym przez specyficzne w układzie wartości LC50 dla pół-maksymalnego wypierania protein z unieruchomionego ligandu asialofetuiny przez galaktozę (LC50 nMLB : 4,5 mM; LC50 rMLB : nieoznaczalna z powodu za małego oddziaływania wzajemnego), b-laktozę (LC50 nMLB : 4,9 mM; LC50 rMLB : >70 mM) lub z unieruchomionego ligandu fetuiny przez kwas sialowy (LC50 nMLB : 49,8 mM; LC50 rMLB : 47,1 mM).

Podczas gdy łańcuch nMLB opisany jako lektyna specyficzna dla galaktozy jak oczekiwano może współzawodniczyć z galaktozą i b-laktozą, wytworzony rekombinacyjnie w E. coli łańcuch rMLB nie pokazuje żadnego dającego się wykazać wzajemnego oddziaływania między nim a galaktozą i tylko małe oddziaływanie między nim a b-laktozą. Rekombinantowy rMLB ma za to wyraźne powinowactwo do N-acetylo-galaktozoaminy i kwasu sialowego a więc w porównaniu z roślinnym nMLB niespodziewanie wykazuje wyraźne przesunięcie specyficzności węglowodanowej do lektyny specyficznej dla N-acetylogalaktozoaminy/kwasu sialowego. Ze względu na aktywność biologiczną rMLB i holoprotein zawierających rMLB wynika z tego możliwość rozszerzenia lub zróżnicowania w porównaniu z roślinnymi proteinami lektyny jemiołowej widma ligandów, receptorów lub komórek docelowych.

W korzystnej postaci wykonania polipeptyd według wynalazku posiada co najmniej jedną modyfikację chemiczną lub enzymatyczną.

Ta modyfikacja może zmienić, zmniejszyć lub zwiększyć ewentualnie obecną aktywność biologiczną polipeptydu. Modyfikację tego rodzaju można przeprowadzić np. po translacji i wyodrębnieniu polipeptydu. Takie modyfikacje mogą być także wykonywane podczas chemicznego lub półsyntetycznego wytwarzania polipeptydu według wynalazku. Modyfikacje tego rodzaju mogą być wprowadzane przez specjalistę znanymi metodami, w celu zmiany aktywności farmakologicznej lektyny jemiołowej, zwłaszcza polepszenia jej.

W dalszej korzystnej postaci wykonania polipeptyd według wynalazku jest proteiną fuzyjną. Proteina fuzyjna ma zwłaszcza poprzednio zdefiniowaną aktywność biologiczną.

Także ta postać wykonania polipeptydu według wynalazku jest nakierowana zwłaszcza na to, aby zmieniać a zwłaszcza polepszać właściwości farmakologiczne polipeptydów lektyny jemiołowej jako dalszych tarczy na powierzchni komórek.

Wynalazek dotyczy także dimeru polipeptydu o aktywnościach biologicznych lektyny jemiołowej, przy czym obydwa monomery koduje się za pomocą cząsteczek kwasu nukleinowego według wynalazku.

PL 193 281 B1

Pod pojęciem „aktywności biologicznej pektyny jemiołowej” rozumie się każdą aktywność biologiczną z widma wszystkich aktywności biologicznych lektyny jemiołowej. Taką czynnością jest np. działanie farmakologiczne lektyny jemiołowej.

Roślinna lektyna jemiołowa 1 indukowała w licznych liniach ludzkich i mysich komórek nowotworowych śmierć tych komórek za pomocą mechanizmów apoptotycznych [Janssen, 1993]. Lektyna jemiołowa 1lub sam łańcuch B indukowały wydzielanie cytokin z obwodowych jednojądrowych komórek zdrowych, krwiodawców ludzkich [Hajto, 1990]. Lektyna jemiołowa 1 indukowała wydzielanie anionów supernadtlenowych z granulocytów neutrofilowych pacjentów chorych na raka [Timoshenko, 1993]. Lektyna jemiołowa 1 indukowała ekspresję łańcucha A receptora interleukiny-2 (CD25) oraz antygenu HLA-DQ na obwodowych limfocytach zdrowych, krwiodawców ludzkich [Beuth, 1992]. Po zastosowaniu lektyny jemiołowej 1 w myszy zmierzono przyrost liczby komórek grasicy, ilości cytotoksycznych limfocytów T (Lyt-2+) i komórek pomocniczych T (L3T4+) w grasicy oraz liczby makrofagów otrzewnowych, także zwłaszcza tych, które nosiły znacznik aktywności MAC-3 [Beuth, 1994]. Wzrósł także stosunek L3T4+/Lyt2+ w grasicy zwierząt doświadczalnych. W krwi obwodowej myszy na ogół wzrosła po leczeniu lektyną jemiołową 1 gęstość leukocytów, limfocytów, monocytów a zwłaszcza limfocytów, które poddaje ekspresji na powierzchni komórek receptor interleukiny-2 jako znacznik aktywności, jak również mononocytów, które poddają ekspresji znacznik aktywności MAC-3 [Beuth, 1994]. Lektyna jemiołowa 1 zwiększyła we krwi pacjentów chorych na raka gęstość limfocytów T (CD4+, CD8+), naturalnych krwinek białych o działaniu cytotoksycznym i limfocytów B [Beuth, 1992].

Ponadto stwierdzono także zwiększenie ilości endogennych mediatorów opiatów b-endorfiny w osoczu krwi pacjentek chorych na raka sutka po podaniu im lektyny jemiołowej 1 [Heiny, 1994], Ponadto stwierdzono, że lektyna jemiołowa 1 zwiększa działanie cytotoksyczne obwodowych, naturalnych krwinek białych przeciwko komórkom nowotworowym K-562 i gęstość dużych limfocytów ziarnistych (LGL) we krwi obwodowej [Hajto, 1989]. Udokumentowano przeciwprzerzutową aktywność lektyny jemiołowej 1w stosunku do komórek mięsaka w myszach [Beuth, 1991].

W innej postaci wykonania dimer polipeptydowy według wynalazku ma takie samo widmo aktywności biologicznych jak naturalny dimer lektyny jemiołowej.

(V) Aktywności biologiczne rekombinantowej pektyny jemiołowej.

Holoproteiny rML wytwarzano przy użyciu oddzielnie zsyntetyzowanych pojedynczych łańcuchów wychodząc z fałdowanych, rozpuszczalnych łańcuchów lub wychodząc z denaturowanych łańcuchów rMLA i rMLB w ramach współfałdowania, przy czym zwłaszcza reasocjowano in vitro rMLB z molowym nadmiarem rMLA w obecności glutationowego układu redoks i częściowo w obecności izomerazy proteinowo-disiarczkowej. Holoproteinę rML odpowiadającą heterodimerowi wyodrębniono z zestawu reasocjacyjnego i oczyszczono oddzielając wolny rMLA i dimer rMLA na drodze chromatografii powinowactwa na N-acetylogalaktozoamino-agarozie lub laktozylo-agarozie. Postępując analogicznie wytworzono holoproteiny heterodimerowe rMLA/rMLB (rML) i rMLA/nMLB.

Aktywność cytotoksyczna

Działanie cytotoksyczne jako przykład aktywności biologicznej reasocjowanej holoproteiny testowano na linii ludzkich komórek białaczki monocytowej (MOLT4). Do zaobserwowanego efektu cytotoksycznego przyczynił się zarówno łańcuch B (wiązanie powierzchniowe) jak i łańcuch A (inaktywacja enzymatyczna rybosomów). Holoproteinę rMLA/rMLB reasocjowaną in vitro jak również holoproteinę rMLA/nMLB reasocjowaną in vitro porównano z dwiema szarżami naturalnej holoproteiny nML. Holoproteiny rekombinantowa rMLA/rMLB i rMLA/nMLB wykazały porównywalnie silne właściwości cytotoksyczne o wartościach LC50 około 10 - 30 pg/ml (fig. 11) co udokumentowało jednolitość funkcyjną i aktywność biologiczną holoproteiny rML reasocjowanej in vitro przy użyciu łańcuchów rekombinanowych. Do wywierania aktywności cytotoksycznej jest przy tym niezbędne połączenie funkcyjne łańcuchów B z aktywnym enzymatycznie łańcuchem A, gdyż sam wyodrębniony łańcuch rMLB niespodziewanie nie wykazywał żadnej aktywności cytotoksycznej. Dotychczas dyskutowaną aktywność cytotoksyczną łańcuchów B roślinnej lektyny jemiołowej należy więc najprawdopodobniej wytłumaczyć resztkową zawartością holoproteiny nML. Dzięki rekombinantowemu wytwarzaniu poszczególnych łańcuchów powstała po raz pierwszy możliwość oddzielnego opisywania i wykorzystywania wiążącej węglowodany i enzymatycznej aktywności lektyny jemiołowej.

Indukcja apoptozy

Zdolność indukowania apoptozy jako przykład aktywności biologicznej lektyny jemiołowej zbadano dla rekombinantowej holoproteiny rML na monocytowej linii komórkowej U937. W wyniku działania na komórki 70 pg/ml wykryto po 24 h indukcję apoptozy przez holoproteinę rML (fig. 12). DoświadPL 193 281 B1 czenia z działaniem lektyny jemiołowej na komórki MOLT-4 i jednojądrowe komórki krwi obwodowej (PBMC) wykazały, że w obszarze małych dawek indukcja procesów apoptotycznych stanowi podstawę aktywności cytotoksycznej pektyny jemiołowej. Ponieważ w obszarze stężeń niskiej cytotoksyczności występuje indukcja cytokiny (fig. 13, fig. 14), więc korelacja z aktywnością w zakresie indukowania apoptozy jest zrozumiała. Natomiast w obszarze dużych dawek jak również przy dłuższym czasie inkubacji apoptoza jest zakryta przez efekty martwicowe. Nie udało się stwierdzić cytotoksyczności jako następstwa apoptozy w wyniku działania rekombinantowym łańcuchem B na nadwrażliwe komórki MOLT-4, tak że aktywność biologiczną polegającą na indukcji apoptozy w obszarze małych dawek można wytłumaczyć tylko działaniem holoproteiny.

Aktywność stymulowania odporności

Działania powodujące stymulowanie odporności jako aktywności biologicznej rekombinantowej holoproteiny lektyny jemiołowej udowodniono na przykładzie indukcji wydzielania czynnika a guza martwiczego (TNF-a) i interferonu g z jednojądrowych komórek zdrowych krwiodawców ludzkich (model PBMC) jak również na przykładzie indukcji wydzielania interleukiny 1a (IL-1a) i interleukiny 6 (IL-6) we współhodowli ludzkich pierwotnych keratynocytów i fibroblastów skóry (model skin² ZK 1200). Tak więc w modelu PBMC w wyniku użycia 3-48 ng/ml rekombinantowej holoproteiny rML nastąpiło zależne od dawki wydzielanie TNF-a i IFN-g a w modelu skin² w wyniku użycia 0,25 -8 ng/ml rekombinantowej holoproteiny rML zależne od dawki wydzielanie IL-1a i IL-6.

Wszystkie wymienione cytokiny są ważnymi, stymulującymi mediatorami ludzkiego układu odpornościowego, które pełnią główną rolę przede wszystkim w aktywowaniu komórkowej odpowiedzi odpornościowej.

Wbrew dotychczasowemu stanowi wiedzy, według którego aktywność stmulowania odporności tłumaczy się głównie aktywnością lektyny łańcucha B [Hajto et al., 1990], za pomocą samego rekombinantowego łańcucha rMLB nie można indukować wydzielania żadnych wyżej wymienionych cytokin. Aktywność stymulowania odporności można było osiągnąć w obszarze małych dawek wyłącznie za pomocą funkcyjnie połączonej holoproteiny rML. Ten niespodziewany wynik pozwala na przypuszczenie, że stymulujące odporność preparaty łańcucha roślinnego nMLB zawierały jeszcze ślady holoproteiny nML i przypisywane łańcuchowi nMLB działanie stymulujące odporność należy wytłumaczyć pozostałością resztkową nML. Podczas gdy dotychczas opisane sposoby preparowania nMLB nie umożliwiają ilościowego oddzielenia holoproteiny, to obecnie dzięki rekombiantowemu wytwarzaniu poszczególnych łańcuchów lektyny jemiołowej po raz pierwszy istnieje możliwość badania i otrzymywania preparatów jednorodnych łańcuchów B lektyny jemiołowej. Pozwala to po raz pierwszy na oddzielne opisywanie i stosowanie aktywności biologicznych łańcucha A i łańcucha B jak również rozróżnianie aktywności biologicznych poszczególnych łańcuchów i funkcyjnie połączonej holoproteiny.

(VI) Aktywności biologiczne rekombinantowego łańcucha B lektyny jemiołowej (rMLB)

Jako znacznik aktywacji komórek kompetentnych dla odporności zbadano indukcję proteiny (CD69) powierzchni komórek. CD69 pojawia się jako jeden z pierwszych antygenów powierzchni komórek po aktywacji komórek T, komórek B a zwłaszcza komórek „natural killer” (naturalnych komórekzabójców czyli krwinek białych o działaniu cytotoksycznym, komórek NK). CD69 stanowi przy tym znacznik aktywności wyżej wymienionych populacji komórek kompetentnych dla odporności, gdyż proteina powierzchni komórek nie jest poddawana ekspresji na limfocytach w spoczynku. Ponadto wykryto działanie indukowalnej proteiny CD69 wspomagające aktywność cytolityczną komórek NK i komórek T TcRg / d [Moretta et al., 1991]. Za pomocą cytometrii przepływowej (FACS) przy użyciu anti-CD69 mAK stwierdzono w zakresie stężeń 1-100 ng/ml aktywację komórek jednojądrowych zarówno pod względem występowania CD69 na powierzchni komórek jak i pod względem zawartości CD69 - dodatnich komórek. Powstała przy tym na wykresie krzywa zależności dawkowej w kształcie dzwonu, co wskazuje na konieczność sieciowania receptorów komórkowych przez obydwa miejsca wiązania ligandów łańcucha rMLB. Nie stwierdzono działania toksycznego na badany tu PBMC także przy największym stężeniu rMLB wynoszącym 100 ng/ml.

W uprzywilejowanej postaci wykonania dimer polipeptydowy według wynalazku posiada jako co najmniej jeden z monomerów zmodyfikowany chemicznie lub enzymatycznie polipeptyd według wynalazku lub proteinę fuzyjną.

Przez modyfikacje można optymalizować siłę działania, jak również przez wyłączanie poszczególnych rodzajów aktywności (np. miejsc wiązania węglowodanów w łańcuchu B lub aktywności glikozydazowej łańcucha B) rozszerzać możliwości zastosowań leczniczych, wyłączając przy tym ewentualne działania uboczne. Polipeptydy o zmienionych właściwościach mogą także służyć jako narzędzia

PL 193 281 B1 do wyjaśniania mechanizmów działania. Dla pewnych terapii może być niezbędne zmniejszanie antygenowości i zdolności wzbudzania odpowiedzi odpornościowej i/lub optymalizowanie ich właściwości farmakokinetycznych, co byłoby możliwe przez odpowiednią wymianę pojedynczych aminokwasów.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania polipeptydów według wynalazku lub dimerów polipeptydów, przy czym hoduje się w odpowiednich warunkach gospodarza według wynalazku i wyodrębnia tak otrzymany polipeptyd lub dimer polipeptydu.

Specjaliście są znane odpowiednie warunki hodowli i wyodrębniania gospodarza. Polipeptyd lub dimer polipeptydu według wynalazku można np. wyodrębnić z gospodarza za pomocą odpowiedniego układu ekspresyjnego i zebrać w pożywce. Polipeptydy lub dimery polipeptydów mogą także pozostawać w komórkach, z których wyodrębnia się je. Poniżej została przedstawiona dalsza uprzywilejowana postać wykonania sposobu według wynalazku:

W celu wyodrębnienia rMLA rozkłada się wszystkie komórki E. coli transformowane odpowiednim wektorem ekspresji i rozdziela rozpuszczone części komórek od nierozpuszczonych przez odwirowanie. Analiza frakcji komórek pokazała, że łańcuch A rekombinantowej lektyny jemiołowej w zależności od warunków ekspresji i czasu jej trwania gromadzi się w 5 -50% w postaci rozpuszczalnej oraz w 50 -95% w postaci nierozpuszczalnych agregatów proteinowych („inclusion bodies”).

Proteiny rozpuszczalne i nierozpuszczalne występują wtedy, gdy jest możliwe fałdowanie zwrotne lub renaturacja proteiny rMLA. Są co najmniej dwa sposoby wyodrębniania rMLA. rMLA zagregowany do postaci ciał wtrętowych po przemyciu osadów w celu usunięcia protein E. coli [Babbit et al., 1990] rozpuszcza się w denaturujących warunkach i przez 90-krotne rozcieńczenie w buforze fałdującym (50 mM tris-HCl, 2mM DTT, 1mM EDTA, pH 8,0) poddaje zwrotnemu fałdowaniu.

Po wykonaniu tej procedury powstały rozpuszczalne, pofałdowane rodzaje protein, które jak pokazano na fig. 9, również jak renaturowane, początkowo nierozpuszczalne, denaturowane rodzaje rMLA są całkowicie aktywne enzymatycznie. Wyodrębnianie renaturowanego rMLA jak i wyodrębnianie rozpuszczalnego rMLA można przeprowadzić za pomocą chromatografii powinowactwa odpornościowego przy użyciu swoistego przeciwciała anti-MLA TA5 [Tonevitsky i wsp., 1995].

Wskutek występowania rMLB w postaci rozpuszczalnej i ciał wtrętowych w postaci nierozpuszczalnej, stosuje się dwa sposoby wyodrębniania łańcucha B rekombinantowej lektyny jemiołowej.

W celu wyodrębnienia rozpuszczalnego łańcucha rMLB z silnie redukującego środowiska cytoplazmy E. coli prowadzi się w celu wytworzenia wewnątrzchenarnych mostków disiarczkowychinkubację w obecności układu redoks ze zredukowanego i utlenionego glutationu jak również, w celu ustabilizowania aktywnych produktów fałdowania, w obecności ligandu b-laktozy.

Z zestawu fałdującego wyodrębnia się selektywnie oraz oczyszcza w 1-stadiowej operacji aktywny, wiążący węglowodany łańcuch rMLB za pomocą chromatografii powinowactwa na laktozyloagarozie lub N-acetylo-ga-laktozoaminoagarozie.

W celu wyodrębnienia rMLB z nierozpuszczalnych ciał wtrętowych składnika produktu ekspresji przemywa się osad z rozdrobnionych komórek E.coli w celu usunięcia protein E.coli [Babbit et al., 1990] i rozpuszcza w denaturujących i redukujących warunkach. Renaturacja zachodzi w wyniku rozcieńczenia w obecności układu redoks ze zredukowanego i utlenionego glutationu jak również ligandu b-galaktozy, przy czym wyodrębnia się selektywnie z zestawu renaturacyjnego oraz oczyszcza aktywny, wiążący węglowodany łańcuch rMLB za pomocą chromatografii powinowactwa na N-acetylogalaktozoamin-agarozie lub laktozylo-agarozie.

Wynalazek dotyczy ponadto środka leczniczego, który zawiera polipeptyd według wynalazku lub dimer polipeptydu według wynalazku i/lub poniżej opisaną toksynę odpornościową razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

Polipeptydy według wynalazku, produkty ich asocjacji, lub modyfikacje nadają się do różnych zastosowań w lecznictwie raka i zakażeń odpowiednio do znanych właściwości farmakologicznych naturalnej lektyny jemiołowej.

Działania stymulujące odporność można wykorzystywać do leczenia nowotworów, gdy przez bezpośrednią i/lub pośrednią stymulację własnej obrony odpornościowej organizmu uzyskuje możliwość skuteczniejszego zwalczania nowotworu i ewentualnych przerzutów.

To samo dotyczy także zakażeń, zwłaszcza chorób wirusowych. Polipeptydy według wynalazku mogą być także podawane w postaci mieszanin z innymi stymulantami odporności, np. z interferonami, cytokinami lub czynnikami stymulującymi kolonie, aby osiągnąć działanie synergiczne lub zmniejszyć potrzebną dawkę składników mieszaniny i dzięki temu zmniejszyć ich działania uboczne.

PL 193 281 B1

W połączeniu z cytostatykami lub naświetlaniem daje się złagodzić lub zmniejszyć działanie uboczne leukopenii/myelosupresji, tak że wywoływane dotychczas przez stosowanie tych metod leczenia osłabienie układu odpornościowego zostaje zredukowane.

Bezpośrednie działanie cytotoksyczne polipeptydów z aktywnością glikozydazową prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych i może być również wykorzystane do leczenia. Ta zasada może być swoiściej ukształtowana w przypadku stosowania toksyn odpornościowych, gdy polipeptydy według wynalazku sprzęga się z odpowiednimi przeciwciałami.

Wynalazek dotyczy więc także toksyn odpornościowych, które obejmują co najmniej jeden polipeptyd lub dimer polipeptydu według wynalazku. Przykładowo można sprzęgać metodami chemii protein aktywny łańcuch A lub holoproteinę z przeciwciałem lub jego fragmentem.

Takie sposoby sprzęgania są znane specjaliście a odpowiednie produkty sprzęgania znajdują wielostronne zastosowania [Vitetta, 1993]. Alternatywnie mogą być także stosowane do ekspresji odpowiednio zbudowane konstrukty protein fuzyjnych, zawierające wiążące antygen domeny np. z przeciwciał i dodatkowo cytotoksyczne fragmenty polipeptydu według wynalazku.

Ponadto można także zapobiegać powstawaniu przerzutów przez hamowanie wiązania się komórek nowotworowych z innymi komórkami. Temu wiązaniu się komórek nowotworowych można zapobiegać za pomocą peptydu według wynalazku przez wiązanie lektyny na za zasadzie współzawodnictwa.

Ponadto wynalazek dotyczy środka diagnostycznego, który zawiera:

(a) cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku;

(b) primer i/lub parę primerów, który/która hybrydyzuje swoiście na cząsteczce kwasu nukleinowego według wynalazku lub na komplementarnej do niej nici; i/lub (c) polipeptyd według wynalazku i/lub dimer polipeptydu według wynalazku.

Środek diagnostyczny według wynalazku, w postaci wykonania zawierającej ewentualnie primer lub też parę primerów, można stosować do przeszukiwania organizmów na obecność genu lektyny, aby np. móc w ten sposób wykrywać nowe geny lektyny, które ewentualnie kodują lektyny interesujące pod względem farmakologicznym. Także zawarta w środku diagnostycznym według wynalazku cząsteczka kwasu nukleinowego może być stosowana, np. w metodzie Southern-Blot lub w metodzie Northern-Blot, do przeszukiwania organizmów na obecność odpowiednich genów lektyny.

Poprzez zmianę ostrości warunków hybrydyzacji można także poszukiwać powinowatych genów. Polipeptyd jak i dimer polipeptydu można stosować np. do generowania przeciwciał lub surowic odpornościowych, za pomocą których można np. znanymi metodami wykrywać odpowiednie lektyny (jemiołowe) w różnych organizmach.

Figury przedstawiają:

Figura 1 - konstrukcję głównego oligonukleotydu amplifikacyjnego,

Figura 2 - główny produkt amplifikacji ML Viscum album,

Figura 3 - strategię klonowania dla wytwarzania genu ML,

Figura 4 - włączenia wektorów ekspresji dla rMLA i rMLB i całkowitą sekwencję genu ML;

Figura 5 - schemat konstrukcji wektora ekspresji dla rMLA,

Figura 6 - schemat konstrukcji wektora ekspresji dla rMLB,

Figura 7 - ekspresję rMLA, rMLB i detekcję odpornościową,

Figura 8 - ogniskowanie barwne IEF rMLA i rMLB z udz. nat. ML,

Figura 9 - aktywność enzymatyczną rMLA (RLP),

Figura 10 - charakterystykę wiązania węglowodanu przez rMLB,

Figura 11 - cytotoksyczność MOLT4 powodowaną przez rML,

Figura 12 - indukcję apoptozy przez rML,

Figura 13 - stymulujące odporność działanie rekombinantowej lektyny jemiołowej w modelu PBMC,

Figura 14 - stymulujące odporność działanie rekombinantowej lektyny jemiołowej w modelu ₂ skin² oraz

Figura 15 - indukcję znacznika CD69 powierzchni komórek w PBMC.

Przykład 1. Konstrukcja głównego oligonukleotydu amplifikacyjnego

Lektyna jemiołowa (ML) należy do inaktywujących rybosomy protein [Stirpe et al., 1992], które stanowią rodzinę protein szeroko rozpowszechnioną w roślinach o różnym pochodzeniu taksonomicznym. ML na podstawie aktywności jej podjednostek została przyporządkowana do grupy protein typu II inaktywujących rybosomy [Endo et al., 1988a].

PL 193 281 B1

Do ustalenia sekwencji genu ML nie nadaje się jednak nasuwająca się metoda polegająca na szczegółowym przeglądaniu banków cDNA Viscum album i banków genomowych genów. Tak więc w bankach genów z Viscum album poly-A+RNA mimo stosowania różnych sond DNA nie można było zidentyfikować żadnych ML-swoistych klonów. Przyjmując, że sekwencja genu ML nie zawiera intronów, zastosowano strategię PCR. Ponieważ N-terminalne sekwencje aminokwasowe zarówno łańcucha MLA jak i łańcucha MLB były znane [Dietrich et al., 1992; Gabius et al., 1992], więc amplifikacja obszaru kodującego MLA przy użyciu zdegenerowanych, wywodzących się ze znanych peptydów oligonukleotydów amplifikacyjnych, okazała się możliwa (fig. 1a). Podczas gdy użyteczny oligonukleotyd o małym stopniu degeneracji może być wyprowadzony z końca N łańcucha MLA (RMLA1, fig. 1b), to jednak nie jest możliwe skonstruowanie odpowiednich nukleotydów o wystarczającej swoistości z końca N łańcucha MLB (RMLB1, RMLB2, RLMB3, fig. 1b).

Dlatego musiały być rozwinięte odpowiednie strategie, które przez uwzględnienie danych dotyczących pokrewnych protein umożliwiały wyprowadzenie nukleotydów amplifikacyjnych z jeszcze nieznanych obszarów sekwencji ML. Analiza sekwencji aminokwasów typu I i typu II protein inaktywujących rybosomy wykazała obecność pewnej ilości zakonserwowanych obszarów o dużej jednorodności sekwencji. Figura 1c pokazuje duży stopień pokrewieństwa typu l i typu II RIP na przykładzie centrum aktywnego rycyny. Wewnątrz motywu sekwencyjnego MISEAARF dyskutowano dla E 177 i R180 udział w mechanizmie enzymatycznym [Kim et al., 1992; Lord et al., 1994]. Wywnioskowano z tego, że co najmniej te obydwie reszty mogą być obecne w sekwencji ML. Z dalszych rozważań na temat obecności poszczególnych reszt, przy czym szczególnie były uwzględniane reszty o małym stopniu degeneracji, wynikła konstrukcja oligonukleotydu amplifikacyjnego RMLA2. Sekwencja tego oligonukleotydu jest przedstawiona na fig. 1c.

Przykład 2. Wytwarzanie swoistych dla genu ML fragmentów DNA

Wysokocząsteczkowy, genomowy DNA wyodrębniono ze świeżych liści Viscum album (drzewogospodarz Populus wilsonii) metodą według Baera et al. [1993]. Do wytwarzania swoistych dla genu ML fragmentów DNA przez PCR użyto na każdy zestaw amplifikacyjny 100 ng genomowego DNA. Amplifikacja zachodziła w objętości całkowitej 50 ml, zawierającej bufor PCR (10 mM tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,25 mM dNTP, pH 8,3), 78 pmoli primera RMLA1 i 50 pmoli (zestaw 2) lub 100 pmoli (zestaw 1) RMLA2. PCR nastąpiło z polimerazą Taq-DNA (1,5 E/zestaw) z Boehringer Mannheim z Biometra Thermocycler. Parametry PCR były następujące: 1 min denaturacji w temperaturze 90°C, 1min ogrzewania w temperaturze 50°C, 1min elongacji w temperaturze 72°C przy łącznie 30 cyklach. Produkty amplifikacji analizowano za pomocą elektroforezy w 5% żelu poliakryloamidowym i przez zabarwienie bromkiem etydioniowym (fig. 2). Swoisty produkt amplifikacji otrzymany w zestawie 2 o wielkości około 500 pz wyodrębniono przez elucję żelu i doprowadzono do klonowania w wektorze TA.

Przykład 3. Strategia klonowania

Wyprowadzenie nukleotydu amplifikacyjnego użytego do głównego PCR jest przedstawione w przykładzie 1 (fig. 1a), wytwarzanie głównego fragmentu genu ML Viscum album, oznaczonego dalej przez „a”, - w przykładzie 2 (fig. 2). Wychodząc z sekwencji klonowanego fragmentu „a” genu i z założenia, że gen ML nie zawiera żadnych intronów, było teraz możliwe wyprowadzenie swoistych sekwencyjnie oligonukleotydów 5', które umożliwiły amplifikację fragmentów „b”, „c”, „d” i „e”. Podczas gdy oligonukleotyd 3' dla „c” również został wyprowadzony z sekwencji DNA dla „a”, to konstrukcja zdegenerowanego primera 3' do amplifikacji fragmentów „b”, „d”, „e” i „g” genu musiała nastąpić w wyniku analizy jednorodnych obszarów protein RIP typu I („b”) i typu II („d”, „e”, „g”). Wnioskowano przy tym ponownie o obecności poszczególnych reszt z porównań sekwencji wewnątrz rodzin protein, przy czym przede wszystkim zostały uwzględnione reszty o małym stopniu degeneracji użytego kodonu. Do konstrukcji około 50 ML-swoistych kombinacji oligonukleotydów włączono, zwłaszcza znane sekwencje proteinowe cDNA rycyny i abryny i ich pochodne. Na fig. 3 są pokazane tylko fragmenty genu, które były klonowalne jako swoiste produkty amplifikacji i mogły być użyte do dalszej analizy. Wychodząc z innych kombinacji oligonukleotydów nie można było generować żadnych ML-swoistych produktów amplifikacji. Wytwarzanie fragmentu „f” genu (kodującego łańcuch MLA) i fragmentu „g” genu (kodującego łańcuch B) jest opisane szczegółowo w przykładzie 5 i przykładzie 6.

Dla analizy regionów 5' i 3' poddanych i nie poddanych translacji obszarów sekwencji genu ML przyjęto warunki do 5' i 3'-RACE [Frohmann et al., 1988], które prowadziły do generowania fragmentów „h”, „i” oraz „j”. Amplifikacja fragmentu „j” za pomocą RACE-PCR stanowi więc alternatywę wytwarzania całkowitego fragmentu genu MLB. Reakcje RACE wykonano przy użyciu cDNA, który sprepaPL 193 281 B1 rowano przez transkrypcję odwróconą całkowitego RNA Viscum album wyodrębnionego z liści jemioły (drzewo-gospodarz Populus wilsonii).

Przykład 4. Sekwencja DNA i produkty translacji rMLA i rMLB

Insercje wektorów ekspresji pT7-MLA i pT7-MLB sekwencjonuje się standardową metodą za pomocą strategii „primer walking” (wykrywania całkowicie zachodzących na siebie sekwencji obydwóch nici) przy użyciu różnych ML-swoistych oligonukleotydów (fig. 4a, b). Podkreślone obszary sekwencji oznaczają miejsca cięć restrykcyjnych do klonowania w wektorach ekspresji pT7. Obydwa fragmenty genu są zmodyfikowane zgodnie ze schematem konstrukcyjnym wektorów ekspresji opisanym w przykładzie 5 i przykładzie 6.

Figura4c pokazuje całkowitą sekwencję genu ML wywodzącą się z wymienionych fragmentów. Obejmuje ona także nie poddane translacji obszary 5' i 3' jak również odcinki kodujące endopeptyd i peptyd sygnałowy.

Przykład 5. Konstrukcja wektora ekspresji pT7-MLA

Dla potrzeb ekspresji heterologicznej wytworzono i zmodyfikowano terminalnie sekwencję kodującą łańcuch A lektyny jemiołowej wychodząc z kompleksowego genomowego DNA jemioły. Przy tym poprzez niekomplementarne obszary użytych oligonukleotydów primerowych doczepiono elementy kontroli translacji jak również sekwencje rozpoznawcze endonukleaz restrykcyjnych, przez co wychodząc z występującego w genomie genu preprolektyny jemiołowej umożliwiono klonowanie i oddzielną ekspresję łańcucha A lektyny jemiołowej.

Figura5 pokazuje wytwarzanie przez PCR fragmentów genu kodujących MLA. Do amplifikacji sekwencji genu kodującej MLA użyto 200 ng genomowego DNA Viscum album, 1,5 mM (zestaw 1) oraz 2,5 mM (zestaw 2) chlorku magnezu, 40 pmoli każdego z oligonukleotydów primerowych RML16 i RML17 w buforze PCR (10 mM tris-HCl, 50 mM KCl, 0,25 mM każdego z dNTP, pH 8,3) o objętości całkowitej 50 ml. PCR nastąpiło przy użyciu polimerazy Taq (1,5 E/zestaw Boehringer Mannheim) w przeciągu łącznie 30 cykli o profilu temperaturowym obejmującym 1min denaturowania w temperaturze 94°C, 1min ogrzewania w temperaturze 52 C, 1,5 min elongacji w temperaturze72°C. Produkty amplifikacji zanalizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozy i przez zabarwienie bromkiem etydioniowym (fig. 5b) oraz przez elucję żelu doprowadzono do klonowania w wektorze TA.

Obszar 5' sekwencji kodującej rMLA obejmujący reszty aminokwasowe tyrozyny¹-tyrozyny¹⁷ [Dietrich et al., 1992; Gabius et al., 1992] wytworzono jako syntetyczny fragment genu włączając z przodu kodon startowy translacji i przeprowadzając hybrydyzację i klonowanie dwóch nukleotydów. Osiągnięto przy tym optymalizację sekwencji genu pod względem wyboru kodonu, jak to opisano dla genów podlegających silnej ekspresji w Escherichia coli[Gribskov et al., 1984]. Na końcu 3' syntetycznego fragmentu genu rMLA jak również na końcu 5' otrzymanego za pomocą PCR fragmentu genurMLA wprowadzono przez celowaną wymianę kodonu tyrozyny¹⁷ z TAC na TAT miejsce cięcia restrykcyjnego SspI, które umożliwiło fuzję obydwóch fragmentów genu rMLA w czasie wytwarzania wektora pML14-17(fig. 5).

Generowana całkowita sekwencja, kodująca rMLA, została potwierdzona przez sekwencjonowanieDNA (fig. 4a). W celu przeprowadzenia ekspresji rMLA w Escherichia coliwyodrębniono sekwencję genu z wektora pML14-17 i wstawiono jąw wektor ekspresji pT7-7 pod kontrolą promotora polimerazy T7-RNA jak również terminatora transkrypcji. Wynikowym wektorem ekspresji pT7-MLA (fig. 5) transformowano szczep ekspresyjny BL21 E. coli.

Przykład 6. Konstrukcja wektora ekspresji pT7-MLB

Dla potrzeb ekspresji heterologicznej łańcucha B lektyny jemiołowej amplifikowano całkowitą sekwencję kodującą MLB za pomocą swoistego PGR z kompleksowego genomowego DNA Viscum album, przy czym poprzez niekomplementarne obszary użytych oligonukleotydów primerowych wprowadzono elementy kontroli translacji jak również sekwencje rozpoznawcze dla endonukleaz restrykcyjnych.

Figura6 pokazuje wytwarzanie za pomocą PCR całego fragmentu genu kodującego całkowicie rMLB. Amplifikację fragmentu DNA kodującego rMLB wykonano wychodząc każdorazowo z 200 ng genomowego DNA Viscum album w zestawach PCR zawierających każdorazowo 50 pmoli oligonukleotydu primerowego RML 25 i 30 pmoli (zestaw 1) lub 10 pmoli (zestaw 2) oligonukleotydu primerowego RML 26 w objętości całkowitej 50 ml buforu PCR (10 mM tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM każdego dNTP, pH 8,3). PCR nastąpiło przy użyciu polimerazy Taq (1,5 E/zestaw, Boehringer Mannheim) w przeciągu 30 cykli, z których każdy obejmował 1min denaturowania w temperaturze 94°C, 1min ogrzewania w temperaturze 52°C i 1,5 min elongacji w temperaturze 72°C. Produkty PCR

PL 193 281 B1 zanalizowano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozy i przez zabarwienie bromkiem etydioniowym. Otrzymano produkt PCR 0,8 kpz, który wyodrębniono przez elucję żelu i doprowadzono do klonowania w wektorze TA. Przez insercję w wektor ekspresji pT7-7 fragment genu kodujący rMLB został postawiony pod kontrolę elementu kontroli transkrypcji i wynikowym wektorem ekspresji PT7-MLB transformowano szczep ekspresyjny BL21 E. coli. Kompletność generowanej przez PCR, całkowitej sekwencji kodującej rMLB potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA (fig. 4b).

P r z y k ł a d 7. Ekspresja, badania odpornościowe, fałdowanie zwrotne i asocjacja in vitro rMLA i rMLB.

(I) Ekspresja rMLA w E. coli

W celu przeprowadzenia ekspresji rekobinantowego łańcucha A lektyny jemiołowej zaszczepiono w 1000 ml pożywki LBamp w 2-litrowej rowkowanej kolbie hodowlanej 5 ml hodowanej stacjonarnie kultury wstępnej LBamp E .coli BL21/pT7-MLA i hodowano w temperaturze 37°C stosując potrząsanie, przy czym śledzono wzrost przez wykonywanie pomiarów zmętnienia przy 578 nm. Ekspresję genu indukowano po osiągnięciu gęstości komórek odpowiadającej OD578 » 0,9 -1przez dodanie 0,5 mM ITPG. W celu uzyskania plonu poddano komórki po upływie 2 h sedymentacji przez odwirowanie w ciągu 20 min przy 5000 obrotów na minutę i w temperaturze 4°C w wirówce GS-3 (Sorvall) oraz zdekantowano pożywkę hodowlaną, przy czym wychodząc z 1 l objętości hodowli wyodrębniono 3 -4 g masy komórkowej (ciężar na mokro).

Rozkład komórek wykonano za pomocą French-Press (SLM Instruments), przeprowadzając w tym celu osad komórek w stan zawiesiny w 20 ml buforu rozbijającego (50 mM tris-HCl, 100 mM NaCl, 1mM EDTA, 5 mM DDT, 1mM PMSF, pH 8,0) i przeciskając zawiesinę przez 2 przeloty urządzenia French Press przy 1500 psi. Następnie przez odwirowanie zawiesiny przez 30 min przy 10000 obrotów na minutę w wirówce SS-34 (Sorvall) poddano sedymentacji składniki komórek jak również zawarte w zawiesinie ciała wtrętowe i oddzielono od pozostających w przesączu protein E. coli oraz rozpuszczalnych produktów ekspresji.

W celu wykonania analizy ekspresji zbadano jednakowe objętości frakcji rozłożonych komórek przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym SDS i przez barwienie błękitem brylantowym Coomassie jak również za pomocą Western-Blot przy użyciu specyficznej dla MLA surowicy odpornościowej TA5 (fig. 7a). Przeciwciała monoklonalne TA5 [Tonevitsky et al., 1995] zostały dostarczone przez autora. Tak samo jak inne stosowane tu przeciwciała są one wytwarzalne standardową metodą przy użyciu odpowiedniego pełnowartościowego antygenu (w przypadku TA5 jest to ML-1 lub MLA). W celu wykrycia ekspresji zbadano jednakowe objętości rozpuszczalnych frakcji (ślady 2, 4, 6, 8) oraz nierozpuszczalnych frakcji „inclusion bodies” (ślady 1, 3, 5, 7) rozłożonych E. coli dla ustalenia w nich zawartości rMLA. W celu przedstawienia przebiegu ekspresji zastosowano przy tym próbki przed indukcją ekspresji genu (ślady 1+2), po 2 h od początku indukcji (ślady 3+4), po 4 h (ślady 5+6) i po 6 h (ślady 7+8). Ekspresja jest zaznaczona już po 1h indukcji przez pojawienie się reaktywnego odpornościowo produktu ekspresji 25 kD odpowiadającego rMLA, którego maksimum ekspresji zostaje osiągnięte już po 2 h indukcji. Rozdzielenie rMLA między rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje rozłożonych komórek wynosi po 2 h indukcji po ~ 50%, przy czym dłuższy czas trwania ekspresji powoduje wzrost tworzenia się nierozpuszczalnych ciał wtrętowych „inclusion bodies”.

(II) Wyodrębnianie rMLA z nierozpuszczalnych ciał wtrętowych

Osad z produktu całkowitego rozkładu komórek E. coli przemyto według Babitta et al., [1990] w celu usunięcia protein E.coli 2 x porcjami po 20 ml buforu STET (50 mM tris-HCl, 8% (wag./obj.) sukrozy, 50 mM EDTA, 1,5% (obj./obj.) trytonu X-100, pH 4,7). Przemyty osad z zawartymi w nim „inclusion bodies” rozpuszczono w 20 ml buforu denaturującego (6 m chlorku guanidyniowego, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) przez inkubację w ciągu 16 h w temperaturze pokojowej, stosując potrząsanie.

W celu renaturowania rMLA wkroplono powoli roztwór protein znajdujący się w buforze denaturującym do 90-krotnej objętości buforu fałdującego (50 mM tris-HCl, 2 mM DTT, 1mM EDTA, pH 8,0) i mieszając inkubowano przez 16 h w temperaturze pokojowej. Ponownie wytrąconą proteinę oddzielono przez odwirowywanie w ciągu 30 min przy 6000 obrotów na minutę i w temperaturze 4°C w wirówce GS-3 (Sorvall). Przesącz nastawiono w celu składowania na 20% (obj./obj.) gliceryny i przechowywano w temperaturze 4°C.

(III) Oczyszczanie rMLA w chromatografii immunopowinowactwa

W celu 1-etapowego oczyszczenia rMLA (rozpuszczalny składnik produktu ekspresji lub wtórnie sfałdowana proteina) za pomocą chromatografii immumopowinowactwa, unieruchomiono kowalentnie 260 mg monoklonalnego przeciwciała anty-nMLA-lgG skierowanego przeciwko łańcuchowi A lektyny

PL 193 281 B1 jemiołowej, (TA5, Tonevitsky et al., 1995) na proteinowej A-sefarozie CL4B (Sigma, Deisenhofen) według metody von Harlowa & Spura [1988]. Po inkubacji macierzy powinowactwa odpornościowego z próbką rMLA i przemyciu macierzy 10 porcjami (o objętości złoża kolumny) buforu myjącego 1 (1M NaCl, 10 mM buforu fosforanowego, pH 7,0)i 10 porcjami (o objętości złoża kolumny) buforu myjącego2(10 mM buforu fosforanowego, pH 7,0) w celu usunięcia nieswoiście związanych protein eluowano swoiście związany rMLA buforem elucyjnym (0,1 M glicyny, pH 2,5). Elucja następowała do czasu osiągnięcia w odbieralniku 1M buforu fosforanowego wartości pH 8,0.

(IV) Ekspresja rMLB w E. coli

W celu wykonania ekspresji rekombinantowego łańcucha B lektyny jemiołowej zaszczepiono 1000 ml pożywki LBamp w 2-litrowej rowkowanej kolbie do hodowli tkankowej 5 ml stacjonarnej wstępnej hodowli LBamp E. coli BL21/pT7-MLB i hodowano w temperaturze 37°C stosując potrząsanie, przy czym rozwój śledzono przez wykonywanie pomiaru mętności przy 578 nm. Ekspresję genu indukowano po osiągnięciu gęstości komórek odpowiadającej OD578 » 0,9 -1przez dodanie 0,5 mM ITPG. Po upływie 4 h indukcji w celu zebranie plonu poddano komórki sedymentacji przez odwirowanie w ciągu 20 min przy 5000 obrotów na minutę i w temperaturze 4°C w wirówce GS-3 (Sorvall) oraz zdekantowano pożywkę hodowlaną.

Komórki rozłożono za pomocą French-Press^TM (SLM Instruments). W tym celu osad komórek przeprowadzono w stan zawiesiny w 20 ml buforu rozkładającego (20 mM buforu fosforanowego, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM PMSF, pH 7,2) i rozłożono go przeciskając przez 2 przeloty Frencz-Press przy 1500 psi. Następnie przez odwirowanie w ciągu 30 min przy 10000 obrotów na minutę i w temperaturze 4°C w wirówce SS-34 (Sorvall) poddano sedymentacji nierozpuszczalne składniki komórek jak również zawarte w nich „inclusion bodies” i oddzielono od pozostających w przesączu, rozpuszczalnych protein E.coli oraz rozpuszczalnego produktu ekspresji.

W celu wykrycia ekspresji zbadano jednakowe objętości frakcji rozłożonych komórek za pomocą elektroforezy w 12,5% żelu poliokryloamidowym SDS i przez zabarwienie błękitem brylantowym Coomassie jak również za pomocą Western Błot przy użyciu swoistej dla MLB surowicy odpornościowej TB33 (fig. 7b). Przeciwciała monoklonalne TB33 [Tonevitsky et al., 1995] zostały dostarczone przez autora. Były one wytworzone standardową metodą. Odpowiednie przeciwciała są również wytwarzalne przez specjalistę standardowymi metodami z ML-1 lub MLB jako immunogenów (antygenów białkowych). Wcelu wykrycia ekspresji zbadano jednakowe objętości rozpuszczalnych frakcji (ślady 2, 4, 6, 8) oraz nierozpuszczalnych frakcji „inclusion bodies” (ślady 1, 3, 5, 7) rozłożonych komórek E. coli pod względem zawartości rMLB. Przy tym w celu przedstawienia przebiegu ekspresji zastosowano próbki przed indukcją ekspresji genu (ślady 1+2), po upływie 2 h indukcji (ślady 3+4), 4 h (ślady 5+6) i 6 h (ślady 7+8). Analiza Western-Blot pokazała już po upływie 1h indukcji występowanie reagujących odpornościowo pasm proteinowych 31 kD odpowiadających rMLB, przy czym maksimum ekspresji zostało osiągnięte po 4 h trwania indukcji. Po 4 h indukcji ilość rMLB rozdziela się w ilości po ~ 50% na frakcję rozpuszczalną oraz nierozpuszczalną rozłożonych komórek. Dłuższe czasy trwania inkubacji prowadzą do stopniowego wzrastania akumulacji poddawanego ekspresji rMLB w postaci nierozpuszczalnych „inclusion bodies”.

(V) Wyodrębnianie rMLB z nierozpuszczalnych „inclusion bodies”

Osad z całkowitej ilości rozłożonych komórek E. coli przemyto według Babbitta et al. [1990] w celu usunięcia protein 2 x porcjami po 20 ml buforu STET (50 mM tris-HCl, 8% (wag./obj.) sukrozy, 50 mM EDTA, 1,5% (obj./obj.) trytonu X-100, pH 7,4). Pozostający osad z zawartymi w nim „inclusion bodies” rozpuszczono w 20 ml buforu denaturującego (6 M chlorku guanidyniowego, 100 mM DTT, 50 mM tris-HCl, pH 8,0) przez trwającą 16 h inkubację w temperaturze pokojowej i stosowanie potrząsania.

W celu renaturacj i rMLB wkroplono powoli znajdujący się w buforze denaturującym roztwór protein do 90-krotnej objętości buforu fałdującego (20 mM buforu fosforanowego, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 100 mM glikozy, 10% (obj./obj.) gliceryny, 10 mM b-laktozy, pH 5,5) i inkubowano 16 h w temperaturze pokojowej stosując mieszanie. Ponownie wytrąconą proteinę oddzielono przez odwirowanie w ciągu 30 min przy 6000 obrotów na minutę i w temperaturze 4°C w wirówce GS-3 (Sorval) od frakcji rozpuszczalnego, pofałdowanego rMLB.

(VI) Wyodrębnianie rMLB przez chromatografię powinowactwa na N-acetylo-D-galaktozoamino-agarozie

W celu wyodrębnienia aktywnego, wiążącego węglowodany rMLB zrównoważono macierz powinowactwa z N-acetylo-galaktozoamino-agarozy (PIERCE, USA) 10 porcjami o objętości złoża kolumny buforu chromatograficznego (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM NaCl, 1mM EDTA, 10%

PL 193 281 B1 (obj./obj.) gliceryny, 0,05% (obj./obj.) Tween®-20, pH 7,0). Nanoszenie próbek odbywało się przez inkubację „batch” (wsadową) macierzy powinowactwa w roztworze zawierającym próbki rMLB przez co najmniej 2 h w temperaturze 4°C. Po przemyciu macierzy powinowactwa buforem chromatograficznym w celu usunięcia nieswoiście związanej proteiny związany rMLB został wyeluowany przez wyparcie na zasadzie współzawodnictwa za pomocą 0,3 M N-acetylo-galaktozoaminy w buforze chromatograficznym, pH 4,0.

(VII) Reasocjacja łańcuchów lektyny jemiołowej in vitro w celu wytworzenia holoproteiny

Rekombinantową holoproteinę lektyny jemiołowej można wytwarzać zarówno z wyodrębnionych, pofałdowanych jak i z denaturowanych ale renaturowanych w operacji współfałdowania łańcuchów A lektyny jemiołowej i łańcuchów B lektyny jemiołowej. Wcelu reasocjacji wyodrębnionych, pofałdowanych łańcuchów pojedynczych inkubowano wyodrębnione łańcuchy B lektyny jemiołowej (nMLB lub rMLB) przez 16 -48 h w temperaturze 4°C z molowym nadmiarem rMLA w 20mM buforu fosforanowego, 50 mM NaCl i 1 mM EDTA, pH 7,2.W celu wytworzenia śródłańcuchowego mostka disiarczkowego prowadzono inkubację w obecności układu redoks z 6 mM glutationu (stosunek zredukowanego do utlenionego 5 : 1) lub 10 mM glutationu (stosunek zredukowanego do utlenionego 2 : 1) + 1 mM izomerazy proteinowo-disiarczkowej (Boehringer Mannheim). W celu reasocjacji zdenaturowanych łańcuchów pojedynczych w ramach współfałdowania rozpuszczono łańcuchy rMLA w 6 M chlorku guanidyniowym, 2 mM DTT, 50 mM tris-HCl, pH 8,0 do stężenia 2 mg/ml. Łańcuchy rMLB rozpuszczono w celu całkowitego zredukowania reszt cysteinowych w 6 M chlorku guanidyniowym, 100 mM DTT, 50 mM tris HCl, pH 8,0 i po trwającej 20 min inkubacji w temperaturze pokojowej przebuforowano na 6 M chlorku guanidyniowym, 50 mM tris-HCl, pH 8,0 za pomocą przenikalności żelowej na PD-10 (Pharmacia, Szwecja) i nastawiono na stężenie 200 mg/ml. Reasocjacja nastąpiła w ramach współfałdowania rMLB z molowym nadmiarem rMLA przez powolne rozcieńczenie 1: 30 roztworów guanidyniowych w buforze sprzęgającym (50 mM fosforanu sodu jako buforu, 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 10% (obj./obj.) gliceryny, 100 mM glikozy, 20 mM laktozy, pH 8,0) i inkubację w ciągu 16 h w temperaturze 4°C. W celu wytworzenia interchenarnego mostka disiarczkowego prowadzono inkubację w obecności układu redoks z 2 mM glutationu (stosunek zredukowanego do utlenionego 1:1).

Zestawy sprzęgające dializowano do buforu składowego (50 mM fosforanu sodu jako buforu, 300 mM NaCl, 1mM EDTA, 10% (obj./obj.) gliceryny, 0,05% (obj./obj.) Tween®-20, pH 8,0). Wykrywanie i identyfikowanie wytworzonego heterodimeru przeprowadzono za pomocą SDS-PAGE w nieredukujących warunkach i następnie analizy Western-Blot przy użyciu swoistych, monoklonalnych przeciwciał przeciwko łańcuchowi A lektyny jemiołowej (TA5) oraz łańcuchowi B lektyny jemiołowej (TB33). Wyodrębnianie wytworzonej holoproteiny oraz oddzielanie wolnego rMLA oraz agregatów rMLA odbywało się na drodze chromatografii powinowactwa na N-acetylo-galaktozoamino-sefarozie lub laktozylo-agarozie w sposób opisany pod (VI).

Przykład 8. Jednorodność izoelektryczna rMLA i rMLB 1-2 m g rMLA, naturalnego MLA, rMLB, naturalnego MLB lub holoproteiny ML poddano ogniskowaniu razem ze standardami IEF (BioRad, USA) na Servalyt PreNets IEF-Gelen (pH 3-10, 125 x 125 mm, 150 mm, Serva Heidelberg). Do wykrywania unieruchomiono proteiny za pomocą „semi-dry electroblotting” na membranach nitrocelulozowych (0,2 mm, Schleicher & Schmi, Dassel). Zabarwienie odpornościowe wykonano za pomocą monoklonalnego, swoistego dla MLA przeciwciała (TA5, Tonevitsky et al., 1995) dla rMLA i nMLA oraz za pomocą monoklonalnego, swoistego dla MLB przeciwciała (TB3, Tonevitsky et al., 1995). Kompleksy odpornościowe zabarwiono przy użyciu sprzężonego z fosfatazą zasadową anty-mysiego IgG-lgG (Sigma, Deisenhofen) i przekształcenie substratów NTB i BCIP (fig. 8).

Podczas gdy łańcuch A roślinnej lektyny jemiołowej o wysokiej czystości jak i łańcuch B roślinnej lektyny jemiołowej o wysokiej czystości przedstawiają się jako izoelektrycznie niejednorodne proteiny z punktami izoelektrycznymi nMLA 5,2 : 5,4 : 5,5 : 6,2 oraz nMLB 7,1 : 7,3, rekombinantowy łańcuch rMLAz punktem izoelektrycznym 6,8 jak i rekombinantowy łańcuch rLMB z punktem izoelektrycznym 5,1 okazały się jednorodnymi proteinami (fig. 8). Wynika z tego dla naturalnej holoproteiny ML wiele niejednorodnych wariantów cząsteczkowych (fig. 8, na dole), podczas gdy jednolita ruchomość rekombinantowych protein lektyny jemiołowej udokumentowuje jednorodność rML w stosunku do mikroniejednorodnosci roślinnej lektyny jemiołowej.

Przykład 9. Wykrywanie enzymatycznej, inaktywującej rybosomy aktywności rMLA

Stężenia proteiny w oczyszczonym za pomocą chromatografii powinowactwa rMLA (powtórnie sfałdowanym) i rMLA (rozpuszczalnym) jak również w naturalnym łańcuchu MLA (nMLA) zostały oznaczone według Bradforda [1976] przy użyciu standardu BSA.

PL 193 281 B1

Do wykrywania i kwantyfikacji rRNA-N-glikozydazowej aktywności enzymatycznej MLA stworzono przy użyciu „TNT coupled reticulocyte system” (Promega, USA) nieradioaktywny układ testowy. Dla każdego zestawu inkubowano wstępnie jednakową ilość (20 ml) układu TNT w ciągu 15 min w temperaturze 30°C. W celu kwantyfikacji hamowania translacji dodano do zestawów kontrolnych po 2 ml odpowiedniego buforu oraz do zestawów testowych po 2 ml próbek z rosnącym rozcieńczeniem MLA (w zakresie stężeń 350 - 0 pM). Z każdego zestawu pobierano w odstępie 8 min 2 próbki i w celu zatrzymania reakcji zamrażano je w ciekłym azocie. Jako miarę aktywności translacyjnej oznaczano za pomocą testu bioluminescencji w mierniku scyntylacyjnym względną ilość lucyferazy (sqrt-cpm). Przy tym dla każdego zestawu oznaczano różnicę zmierzonych ilości sqrt-cpm obydwóch prób czasowych jako miarę względnej aktywności translacyjnej, przy czym aktywność w zestawie kontrolnym bez RIP została przyjęta jako 0% prędkości inaktywacji (IAR).

Przez naniesienie względnych prędkości inaktywacji translacji w zależności od stosowanych stężeń rMLA oznaczono za pomocą regresji nieliniowej takie stężenie proteiny, które prowadzi do 50% hamowania aktywności translacji w porównaniu do zestawu kontrolnego. Ta wartość IC50 stanowi wielkość zależną od układu, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikowanie aktywności enzymatycznej rMLA (rozpuszczalnego), rMLA (powtórnie sfałdowanego) w porównaniu do nMLA (fig. 9).

Figura 9 pokazuje wyniki badania enzymatycznej, inaktywującej rybosomy aktywności rekombinantowego łańcucha MLA, przy czym enzymatycznie aktywny produkt otrzymuje się zarówno przez wyodrębnianie rozpuszczalnego składnika produktu ekspresji (rozpuszczalnego rMLA) jak i przez powtórne fałdowanie proteiny wyodrębnionej z „inclusion bodies” (powtórnie sfałdowanego rMLA). rMLA (rozpuszczalny) i rMLA (powtórnie sfałdowany) posiadają aktywności zgodne z wartościami 10,7±1,3 pM oraz 15,6 ±6,6 pM. Mają one więc mniejszą aktywność toksyczną niż naturalny łańcuch MLA (IC501,1 ±0,7 pM).

Przykład 10. Aktywność wiązania węglowodanów przez łańcuch B lektyny jemiołowej

Aktywność wiązania węglowodanów przez rekombinantowy łańcuch B lektyny jemiołowej jak również porównywanie aktywności wiązania węglowodanów i swoistości rekombinantowego i roślinnego łańcucha B lektyny jemiołowej wykonuje się za pomocą „Enzyme-Linked-Lectin-Assay” (ELLA) w obecności współzawodniczących węglowodanów. Wiązanie łańcuchów nMLB i rMLB przeprowadzono przy użyciu macierzy asialofetuinowej unieruchomionej, zwłaszcza na resztach galaktozy i N-acetylo-galaktozoaminy jak również przy użyciu macierzy fetuinowej unieruchomionej, zwłaszcza na resztach kwasu sialowego.

W celu unieruchomienia macierzy węglowodanowej wprowadzono 100 ml roztworu 1,1 mg asialofetuiny (Sigma, Deisenhofen) lub 1,1 mg fetuiny (Sigma, Deisenhofen) do11 ml PBS we wgłębieniach płytek mikromianowanych MaxiScorp C96 (Nunc, Wiesbaden) i inkubowano przez 16 h w temperaturze pokojowej. Po przemyciu płytek mikromianowanych 3 x porcjami po 150 ml/wgłębienie PBS-T (10 mM fosforanu sodu jako buforu, 130 mM NaCl, 0,1% (obj./obj.) Tween®-20, pH 7,2) płytki mikromianowane zostały w celu zablokowania nieswoistych miejsc wiązania inkubowane za pomocą 200 ml/wgłębienie PBS-T-1% BSA (10 mM fosforanu sodu jako buforu, 130 mM NaCl, 0,1% (obj./obj.) Tween®-20, 1% (wag./obj.) BSA, pH 7,2) przez 1 h w temperaturze 36°C i następnie przemyte w opisany sposób. Do testu zastosowano 100 ml próbki zawierające łańcuchy B o stężeniu 100 - 500 ng/ml, zwłaszcza 400 ng/ml, przy czym stężenie testowe nastawiono przez rozcieńczanie próbek w PBS-0,05% BSA (10 mM fosforanu sodu jako buforu, 130 mM NaCl, 0,05% (wag./obj.) BSA, pH 7,2). Dla stężenia testowego i kontroli przygotowano 2-3 repliki. Ślepe próby wykonywano z pBS-0,05% BSA lub z każdorazowym buforem próbki. W celu oznaczenia specyficzności wiązań wykonywano inkubację próbek w obecności wolnych, współzawodniczących cukrów. Do wypierania rMLB, nMLB lub holoprotein ML z wiązania do macierzy asialofetuinowej lub fetuinowej stosowano galaktozę, zwłaszcza w zakresie stężeń 0 - 280 mM, N-acetylo-galaktozoaminę w zakresie stężeń 0 -280 mM, laktozę w zakresie stężeń 0 - 140 mM lub kwas sialowy w zakresie stężeń 0 - 140 mM.

Po załadowaniu płytek inkubowano je przez 2 h w temperaturze 36°C i następnie przemywano w wyżej opisany sposób. Do załadowanych wgłębień dodano po 100 ml/wgłębienie surowicy odpornościowej przeciw lektynie jemiołowej z kozy (surowicy mieszanej rozcieńczonej w stosunku 1 : 19800 w PBS-T-0,1% BSA-Tx (10 mM fosforanu sodu jako buforu, 130 mM NaCl, 0,1% (obj./obj.) Tween®-20, 0,1% (wag./obj.) BSA, 1% (obj./obj.) Triton® X100, pH 7,2), inkubowano przez 2 h w temperaturze 36°C i następnie przemyto w opisany sposób. W celu wykrycia kompleksów odpornościowych dodano do każdego załadowanego wgłębienia 100 ml anty-koziego IgG-lgG, sprzężonego z peroksydazą chrzanową (Sigma, Deisenhofen) w rozcieńczeniu 1 : 3500 w PBS-1% BSA (10 mM fosforanu sodu jako

PL 193 281 B1 buforu, 130 mM NaCl, 1% (wag./obj.) BSA, pH 7,2 i inkubowano przez 1 h w temperaturze 36°C. Wgłębienia przemyto następnie 6x porcjami po 150 ml/wgłębienie PBS-T. W celu wywołania dodano po 100 ml/wgłębienie roztworu substratu (1 tabletkę o-fenylenodiaminy (Sigma, Deisenhofen) w 25 ml 65 mM kwasu cytrynowego, pH 5,0 ± 10 ml 30% nadtlenku wodoru i inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Zatrzymanie reakcji nastąpiło przez dodanie 100 ml 1M kwasu siarkowego/wgłębienie. Ocenę wykonano przez zmierzenie absorpcji przy 450 nm ze wzorcową długością fali 690 nm i obliczenie wartości IC50 przez opisanie danych pomiarowych za pomocą zestawu 4 parametrów.

Figura 10 pokazuje wyniki zaobserwowanego w układzie ELLA wypierania rMLB i nMLB z unieruchomionych ligandów asialofetuinowych przez rosnące ilości D-galaktozy (fig. 10b), b-laktozy (fig. 10b) lub N-acetylo-galaktozoaminy (fig. 10c) jak również wypieranie unieruchomionych ligandów fetulinowych przez rosnące ilości kwasu sialowego (fig. 10d). Charakterystyki wiązania nMLB i rMLB opisują wartości IC50 odpowiadające półmaksymalnemu wypieraniu.

Podczas gdy z wiązaniem węglowodanu przez roślinny łańcuch nMLB może współzawodniczyć przede wszystkim galaktoza (IC50 = 4,5 mM) i b-laktoza (IC50 = 4,9 mM), to rekombinantowy łańcuch rMLB niespodziewanie pokazuje wyraźnie zmienioną swoistość węglowodanową. W przeciwieństwie do nMLB z aktywnością wiązania węglowodanu przez rMLB nie może współzawodniczyć galaktoza (LC50 nie jest oznaczalne) a b-laktoza tylko w małym stopniu (LC50 > 70 mM). Oprócz drastycznie zmniejszonego powinowactwa w porównaniu z galaktoza i b-laktozą rekombinantowy łańcuch rMLB ma jednak wyraźną swoistość dla N-acetylo-galaktozoaminy (LC50 109 mM). Dalsza, opisana dla nMLB aktywność wiązania z ligandami kwasu sialowego mogła być także zbadana dla rekombinantowego łańcucha MLB (fig. 10d). Okazało się przy tym, że roślinny łańcuch nMLB (LC50 = 49,8 mM) i rekombinantowy łańcuch rMLB (1C50 = 47,1 mM) mają jednakowe powinowactwa wiązania.

W przeciwieństwie do roślinnego łańcucha nMLB, który jest przede wszystkim gaalaktozo/b -laktozo-swoisty, otrzymany rekombinantowo łańcuch rMLB ma wyraźnie inną, przesuniętą w stronę wiązania N-acetylo-galaktozo-aminy/kwasu sialowego swoistość węglowodanową.

Przykład11. Oznaczanie cytotoksyczności in vitro reasocjowanej holoproteiny rML w stosunku do ludzkich limfatycznych komórek białaczkowych

Integralność holoproteiny z lektyny jemiołowej została zbadana przez oznaczenie cytotoksyczności w stosunku do linii MOLT-4 ludzkich jednojądrowych (limfa-tycznych) komórek białaczkowych (European Collection of Animal Cell Cultures No. 85011413).

Komórki MOLT-4 hodowano w wolnej od osocza pożywce MDC-1 (PAN SYSTEMS, Aidenbach) i dla potrzeb testu nastawiono gęstość posiewu komórkowego 1,6 x 10⁵ komórek MOLT-4/ml przy żywotności > 98%. W celu oznaczenia toksyczności umieszczono w każdym wgłębieniu 96-otworowej płytki mikromianowanej 90 ml zawiesiny komórek MOLT-4 zawierającej 18000 komórek/wgłębienie w dodano 10 m l roztworu próbki. Do testu zastosowano preparaty holoproteiny z lektyny jemiołowej (szarże #220793 (Madaus) i BRAIN 12/94, które zostały wyodrębnione z liści jemioły lub z naparu jemiołowego standardową metodą na laktozylo-sefarozie [Franz et al., 1977]) jak również reasocjowaną in vitro holoproteinę rML w zakresie stężeń 1-100 pg/ml odpowiadających (1,6 fM -1,66 pM), przy czym wytworzono szeregi stężeniowe w pożywce komórkowej MDC-1. Dla każdego stężenia próbki i kontroli wykonano 6 replik.

Komórki inkubowano przez 72 godziny w temperaturze 37°Ci przy zawartości 5% CO2 w wysterylizowanej szafce wylęgarniowej. Kwantyfikację efektu cytotoksycznego wykonano przez oznaczenie żywotności komórek za pomocą rozpuszczalnego barwnika formazanu metodą WST-1 [Scudiero et al., 1988] i przy użyciu odpowiedniego odczynnika rozmnażania komórek WST-1 (Boehringer Mannheim).

Rekomblnantowa holoproteina jak również chimeryczna holoproteina rMLB/nMLA wykazały w stosunku do cytotoksyczności MOLT-4 aktywność biologiczną zgodną z naturalną proteiną przy wartościach LC-50 około 10 - 30 pg/ml. Natomiast rMLB nie wykazała w przetestowanym zakresie stężeń (rMLB do 1 ng/ml) żadnej aktywności cytotoksycznej.

Przykład 12. Indukcja apoptozy na przykładzie ludzkiej monocytowej linii komórkowej U937 przez rekombinantową lektynę jemiołową (rML)

Wykrywanie indukcji procesów apoptycznych powodowanych przez rekombinantową lektynę jemiołową (rMLA/rMLB) wykonano przez zabarwienie jąder komórek barwnikiem fluorescencyjnym DAPI [Holz et al., 1992]. Typowe zmiany apoptotyczne morfologii jądra mogły być dzięki temu widoczne w mikroskopie i skwantyfikowane przez policzenie 500 -1000 komórek w każdej próbce. Dla czułości oznaczenia jest ważne stosowanie pożywki wolnej od osocza, gdyż obecność białek osocza draPL 193 281 B1 stycznie zmniejsza rozporządzalną ilość lektyny (około 40-krotnie 40 przy 10%FCS, Ribereau-Gayon et al., 1995). Czas indukcji 24 h pozwala na bezpośrednią korelację z oznaczeniem MOLT tylko warunkowo, gdyż efekt cytotoksyczny wyraża się całkowicie w oznaczeniu żywotności dopiero po upływie 72 h, natomiast apoptoza jest zjawiskiem wcześniejszym. Przy zbyt długim czasie inkubacji apoptoza jest zakryta przez wtórną martwicę.

Rysunek12 pokazuje wyraźnie zwiększenie ilości apoptycznych komórek U937 po działaniu rekombinantowej holoproteiny ML. Przy 70 pg/ml liczba apoptycznych komórek po 24 h w dwóch różnych hodowlach w pożywce wolnej od osocza wzrosła 3-krotnie. Rekombinantowa lektyna jemiołowa posiada więc tak samo jak proteina naturalna [Jenssen et al., 1993] zdolność indukowania apoptycznej śmierci komórek.

Przykład 13. Stymulujące odporność działanie rekombinantowej lektyny jemiołowej w modelu PBMC

W przypadku cytokin TNF-a (monocytów, makrofagów) i LFN-g (komórek wspomagających T) mamy do czynienia z centralnymi pośrednikami wewnątrz kompleksowej sieci ludzkiego układu odpornościowego. Ludzkie komórki jednojądrowe (PBMC, obejmujące monocyty i limfocyty) od zdrowych krwiodawców zostały wyodrębnione za pomocą odwirowywania gradientów gęstości FICOLL-PAQUE® według danych producenta (Pharmacia, Szwecja).

W celuindukcji wydzielenia TNF-a komórki (4 x 10⁶ jednojądrowych komórek/ml) w pożywce RPMI1640 z 1 0% (obj./obj.) płodowego osocza cielęcego, 100 E/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny inkubowano najpierw przez 18 h z samymi proteinami rekombinantowej lektyny jemiołowej i potem przez dalsze 24 h z 1 mg/ml lipopolisacharydów z Salmonella abortus equi jako czynnika współstymulującego w temperaturze 37°C, przy zawartości 5% CO2 i wilgotności względnej powietrza > 95% w mikromianowanych płytkach do hodowli komórek w kształcie litery U w wysterylizowanej szafce do wylęgania. Potem w wolnych od komórek przesączach natychmiast kwantyfikowano za pomocą ELISA (Genzyme Diagnostics, Rϋsselheim) stężenie TNF-a.

Dla indukcji wydzielania TNF-g inkubowano w opisany sposób komórki w wyżej wymienionej pożywce najpierw przez 1 h z proteinami lektyny jemiołowej a potem przez dalsze 65 h z 0,5 mg/ml fitohemoglutyniny-L jako współstyulującego czynnika. Następnie natychmiast skwantyfikowano w wolnych od komórek przesączach za pomocą ELISA (ENDOGEN INC., Cambridge, USA) każdorazowo stężenie TNF-a.

Przykład14. Stymulujące odporność działanierekombinantowej lektyny jemiołowej w modelu skin²-ZK1200 ₂

Opracowany jako test biologiczny model skin² składa się z trójwymiarowej skóry właściwej zawierającej fibroblasty i z upostaciowanego naskórka z niezrogowaciałych keratynocytów w jej własnej, naturalnie oddzielonej macierzy [Joller et al., 1996]. Kawałeczki tkanki skórnej (11 x 11 mm wytworzone z pierwotnych komórek ludzkich; Advanced Tissue Sciences Lnc. (ATS), La Jolla, USA) zostały postawione do dyspozycji każda na siateczce tkaniny nylonowej w agarozie i natychmiast po dostarczeniu umieszczono je w specjalnej pożywce A (ATS, La Jolla, USA).

Zarówno IL-1 a jak i IL-6 są ważnymi stymulującymi cytokinami ludzkiego układu odpornościowego. Dla indukcji wydzielania IL-1 a oraz IL-6 inkubowano kawałeczki tkanki skin² zawsze z substancją badaną w 2 ml specjalnej pożywki B (ATS, La Jolla, USA) przez 24 h w temperaturze 37°C, 5% CO2 w powietrzu i przy wilgotności względnej powietrza > 95% w 12-miseczkowych płytkach hodowlanych komórek (Corning Glass Works, Corning, USA). Potem kwantyfikowano w wolnych od komórek przesączach za pomocą ELISA każdorazowo stężenie IL-1 a (Quantikine human IL-1 a Assay, R&D

Systems Inc., Minneapolis, USA) oraz IL-6 (interleukin h ELISA, Boehringer Mannheim GmbH).

₂

W modelu skin² nastąpiło zależne od dawki, indukowane przez 0,25 -8 ng rML/ml wydzielanie IL-1ajak również zależne od dawki, indukowane przez 0,5 -8 ng rML/ml wydzielanie IL-6 (fig. 14).ZsamymrekombinantowymłańcuchemrMLBniespodziewanie nie dało się indukować wydzielania żadnej z wyżej wymienionych cytokin, co sprzeciwia się dotychczasowemu stanowi wiedzy, według którego aktywność stymulującą odporność tłumaczono głównie aktywnością lektyny łańcucha B [Hajto et al., 1990].

Przykład15. Aktywowanie komórek kompetentnych odpornościowo przez rekombinantowy łańcuch B lektyny jemiołowej (rMLB)

Aktywowanie komórek kompetentnych odpornościowe badano zapomocą indukcji proteiny powierzchniowej CD69 komórek. CD69 pojawia się jako jeden z pierwszych antygenów powierzchni komórek po aktywowaniu komórek T, komórek B a zwłaszcza komórek „Natural Killer”(komórek NK), którym ze względu na ich zdolność rozpoznawania i rozpuszczania komórek nowotworowych przypa20

PL 193 281 B1 da główne znaczenie w naturalnej obronie przed nowotworami. CD69 stanowi znacznik aktywności wyżej wymienionych kompetentnych odpornościowo populacji komórek, gdyż proteina powierzchniowa nie ulega ekspresji na nieruchomych limfocytach. Ponadto wykryto u indukowalnej proteiny powierzchniowej CD69 funkcję wspierającą aktywność cytolityczną komórek NK i komórek T TcRg/d [Moretta et al., 1991].

W celu wykrycia znacznika powierzchniowego na ludzkich komórkach jednojądrowych przy użyciu Flow Cytometrie (FACS) wyodrębniono PBMC za pomocą gradientu gęstości na Hypaque (Sigma) analogicznie jak w przykładzie 13. Po umieszczeniu komórek w pożywce RPMI 160 z 5% FCS i zasianiu około 250000 komórek/miseczkę płytki mikromianowanej przeprowadzono 4-godzinną inkubację z 1, 10, 30 i 100 ng substancji testowanej rMLB. Po 20-minutowej inkubacji ze znaczonym fluorescencyjnie anty-CD69 MAK w kąpieli lodowej nastąpił proces przemywania w roztworze Hank's Solution z 5% FCS. Wytrącone znaczone komórki umieszczono w 200 ml „Sheath Fluid” i pomierzono w FACScan (Becton Dickinson). Naniesiona jest średnia fluorescencja odpowiadająca liczbie znaczników powierzchni komórek CD69 na komórkę jak również zawartość komórek CD69-dodatnich w całej populacji komórek.

W zakresie stężeń 1-100 ng/ml można było stwierdzić aktywacje komórek jednojądrowych zarówno pod względem występowania CD69 na powierzchni komórek jak i pod względem zawartości CD69-dodatnich komórek. Powstała przy tym krzywa zależności od dawki w kształcie dzwonu. Nie stwierdzono przy tym działania cytotoksycznego na badanym tu PBMC także przy najwyższym stężeniu 100 ng/ml rMLB.

Claims (19)

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego lub jej nić antysensowna, ewentualnie primer lub para primerów hybrydyzująca swoiście z tą cząsteczką kwasu nukleinowego lub z komplementarną do niej nicią, znamienna tym, że:

(a) koduje preproproteinę, która po dojrzeniu ma działanie biologiczne dimeru lektyny jemiołowej i posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 4c;

(b) koduje fragment preproproteiny według (a), przy czym fragment ten jest biologicznie czynnym składnikiem dimeru lektyny jemiołowej;

(c) różni się degeneracją kodu genetycznego od cząsteczki kwasu nukleinowego według (a) lub (b); lub (d) hybrydyzuje w ściśle określonych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego według (a), (b) lub (c) i która koduje polipeptyd z wymienionymi w (a) lub (b) funkcją biologiczną albo aktywnością.

2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że fragment preproproteiny jest łańcuchem A lektyny jemiołowej, kodowanym przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 4a.

3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że fragment preproproteiny jest łańcuchem Blektyny jemiołowej, kodowanym przez sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 4b.

4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że jest cząsteczką DNA.

5. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że jest cząsteczką RNA.

6. Wektor, znamienny tym, że zawiera co najmniej jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1.

7. Wektor według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera zarówno cząsteczkę DNA kodującą fragment preproproteiny będący łańcuchem A lektyny jemiołowej kodowanym przez sekwencję nuklePL 193 281 B1 otydową przedstawioną na fig 4a, jak i cząsteczkę DNA kwasu nukleinowego kodującą fragment preproproteiny będący łańcuchem B lektyny jemiołowej kodowanym przez sekwencję nuklotydową przedstawiona na fig. 4b.

8. Wektor według zastrz. 6albo 7, znamienny tym, że jest wektorem ekspresji.

9. Gospodarz, znamienny tym, że jest transformowany wektorem, jak zdefiniowano w zastrz. 6, przy czym gospodarz wybrany jest z grupy obejmującej komórkę bakterii, komórkę grzyba, komórką drożdżową lub komórka owadzią.

10. Gospodarz według zastrz. 9, znamienny tym, że bakterią jest E. coli, komórką grzyba jest komórka Aspergillus a komórką owadzią komórka Spodoptera, korzystnie komórka Spodoptera frugiperda.

11. Polipeptyd, znamienny tym, że jest kodowany cząsteczką kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1lub wektorem jak zdefiniowano w zastrz. 6 i/lub jest wytwarzany w gospodarzu jak zdefiniowano w zastrz. 9.

12. Polipeptyd według zastrz. 11, znamienny tym, że posiada co najmniej jedną modyfikację z wykluczeniem modyfikacji enzymatycznej glikozylowania występującego wViscum album.

13. Polipeptyd według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że jest proteiną fuzyjną.

14. Dimer polipeptydu z funkcją biologiczną lektyny jemiołowej, znamienny tym, że jeden monomer jest kodowany cząsteczką DNA lub RNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig.4a, a drugi monomer jest kodowany cząsteczką DNA lub RNA o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 4b,przy czy dimer jest wytwarzany przez gospodarza zdefiniowanego w zastrz. 9.

15. Dimer polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14, znamienny tym, że co najmniej jeden z monomerów jest polipeptydem posiadającym co najmniej jedną modyfikację z wykluczeniem modyfikacji enzymatycznej glikolizowania występującego w viscum album lub proteiną fuzyjną.

16. Sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, lub dimeru polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14, znamienny tym, że hoduje się w odpowiednich warunkach gospodarza jak zdefiniowano w zastrz. 9 i wyodrębnia się tak otrzymany polipeptyd lub dimer polipeptydu.

17. Toksyna odpornościowa, znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 11 lub dimer polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14.

18. Środek leczniczy, znamienny tym, że zawiera polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 11 i/lub dimer polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14 i/lub toksynę odpornościową jak zdefiniowano w zastrz. 17, oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

19. Środek diagnostyczny, znamienny tym, że zawiera co najmniej:

(a) cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1; lub (b) polipeptyd jak zdefiniowano w zastrz. 11 i/lub dimer polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 14.