KR100292918B1 - 재조합 겨우살이 s렉틴 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성숙후 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 활성을 갖는 전구프로단백질로 코딩되는 핵산분자, 상기 핵산분자로 구성되는 벡터, 상기 벡터로 형질전환되는 숙주 및 상기 핵산분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체에 관한 것으로서, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체는 치료적으로 널리 사용가능하며, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체를 함유하는 약학적 조성물 뿐만 아니라 면역독소에 관하고, 부가적으로 본 발명은 본 발명의 핵산분자, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체 및/또는 본 발명의 핵산분자와 특이하게 잡종화되는 프라이머로 구성된 진단 조성물에 관하고, 마지막으로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드 이량체로 구성된 식물 보호제에 관한 것을 특징으로 한다.

Description

재조합 겨우살이 렉틴
제1도는 1차 증폭 올리고누클레오티드의 구조를 나타내며,
제2도는 1차 겨우살이 ML 증폭 생성물을 나타내며,
제3도는 ML 유전자를 수득하기 위한 클로닝 계획을 나타내며,
제4도는 rMLA 및 rMLB에 대한 발현벡터 및 완전한 ML 유전자 서열의 삽입을 나타내며,
제5도는 rMLA에 대한 발현벡터의 구조 도식도를 나타내며,
제6도는 rMLB에 대한 발현벡터의 구조 도식도를 나타내며,
제7도는 rMLA, rMLB의 발현 및 면역적 검출을 나타내며,
제8도는 자연발생 ML에 대한 rMLA 및 rMLB의 IEF 크로마토포커싱을 나타내며,
제9도는 rMLA의 효소적 활성(RIP)을 나타내며,
제10도는 rMLB의 탄수화물-결합 특성을 나타내며,
제11도는 rML의 MOLT4 세포독성을 나타내며,
제12도는 rML에 의한 세포자멸의 유도를 나타내며,
제13도는 PBMC 모델에서 재조합 겨우살이 렉틴의 면역촉진 효과를 나타내며,
제14도는 피부2모델에서 재조합 겨우살이 렉틴의 면역촉진 효과를 나타내며,
제15도는 PBMC에서 세포표면 마커 CD69의 유도를 나타낸다.
실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다.
본 발명은 성숙 후 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 활성을 갖는 전구프로 단백질(preproprotein)로 코딩되는 핵산분자, 상기 핵산분자로 구성된 벡터, 상기 벡터로 형질전환되는 숙주 및 상기 핵산분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체는 치료적으로 널리 이용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체를 함유하는 약학적 조성물 뿐만 아니라 항독소에 관한 것이다. 부가적으로 본 발명은 본 발명의 핵산분자, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체 및/또는 본 발명의 핵산분자로 특이적으로 잡종화되는 프라이머로 구성된 진단용 조성물에 관한 것이다. 최종적으로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 폴리펩티드 이량체로 구성된 식물 보호제에 관한 것 이다.
겨우살이 추출물은 오랫동안 치료적으로 사용되어 왔다. 사용하기 시작한 이래로, 겨우살이 제제는 암치료에 성공적으로 사용되어 왔다[보시(Bocci), 1993; 가비우스(Gabius) 등, 1993; 가비우스 및 가비우스, 1994; 간굴리(Ganguly) 및 다스(Das), 1994]. 하즈토(Hajto) 등[1989, 1990]은 치료적 효과가 소위 겨우살이 렉틴(겨우살이속, 겨우살이(Viscum album) 응집소, VAA)에 의해 매개된다는 사실을 알 수 있었다. 또한 오늘날 당 분야에서는 세포독성 효과로 특히 (비특이적) 면역 촉진, 치료와 병행되어 사용되는 양성효과 및 암 환자의 회복기 치료를 검토하고 있다. 상기 환자들은 내인성 엔돌핀의 분비에 의해 수명을 증가시킬 수 있다[헤이니(Heiny) 및 베우트(Beuth), 1994].
실험관내[하즈토 등, 1990; 만넬(Maennel)등, 1991; 베우트 등, 1993] 및 생체내(하즈토, 1986; 하즈토 등, 1989; 베우트 등, 1991; 베우트 등, 1992] 다양한 연구 뿐만 아니라 임상 연구[베우트 등, 1992]에서 염증성 시토킨(TNF-α, IL-1, IL-6)의 분비가 증가될 뿐만 아니라 면역 시스템의 세포성분(TH세포, NK 세포)이 활성화된다고 보고하였다.
오늘날 60kDa 겨우살이 렉틴 단백질이 추출물로부터 생화학적으로 수득될 수 있는 겨우살이 추출물의 유효성분이라고 생각된다[프란츠(Franz) 등, 1977; 가비우스 등, 1992]. ML 단백질은 두개의 공유결합으로 S-S 결합된 서브유닛, 리보솜의 효소적 불활성의 원인이 되는 A 사슬[엔도(Endo) 등, 1988] 및 탄수화물 결합의 원인이 되는 B사슬로 구성되어 있다. 오늘날 생물학적 활성은 주로 B사슬의 렉틴 활성에 의한 것이다[하즈토 등, 1990].
그러나 겨우살이 렉틴(ML)의 구조/기능 관계에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 단일 사슬과 그들의 다른 생화학적 및 효소적 활성의 작용 방법 및/또는 관찰되는 치료적 효과를 내는 기여도는 아직 명확하지 않다. 겨우살이의 다른 식물성분으로 제제가 오염되어 구조/기능 관계를 분석하기가 어렵게 된다[스테인(Stein) 및 베르그(Berg), 1994]. 추출 제제의 활성은 제제의 다른 조성에 의존하며, 숙주 식물의 종류(예를 들면, 사과, 소나무, 사시나무)에 의존한다고 논의되고 있다[휠센(Huelsen) 등, 1986]. 비스코톡신[가르시아-올메도(Garcia-0lmedo) 등, 1983; 멘데즈(Mendez)등, 1990]과 다른 겨우살이속 예를 들면, (ML-2, ML-3) 모두는 유사한 효과를 가지는 것으로 언급되어 있다[에이플러(Eifler) 등, 1994]. 매우 생화학적으로 정제된(친화성 크로마토그래피) ML제제도 실질적으로 불균질하다(도 8).
상기 불균질성은 사슬의 생화학적으로 평가가능한 활성, 유발된 실험관내 및 생체내 효과 및 상기와 같은 단백질 구조에 관한 것이다. 구조적 변이체는 ML A 및 B사슬의 당부가(glycosylation) 뿐만 아니라 서열 변이에 대해 논의된다. 가비우스 등[1992]과 디에트리흐(Dietrich) 등[1992]은 ML-1의 A1 및 A2 사슬의 서열 변이성을 발견하였다.
겨우살이 렉틴의 치료적 효과를 더 상세히 분석하기 위해, 순수한 형태로 구조적으로 균질한 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 게다가 다량의 순수한 형태로 겨우살이 렉틴 또는 그의 성분을 제조하는 것이 과학자들에게 중요하므로, 이들은 대규모로 치료적 조성물의 활성 요소로서 사용될 수 있다. 상기 목적은 당 분야에 공지되어 있는 방법으로 거의 달성될 수 없다. 당 분야의 현 상태에 따라 식물 물질로부터 분리하면, 항상 물질의 불균질 혼합물을 수득할 것이다.
특히 식물 겨우살이 렉틴 제제의 불균질성은 이소형 ML-2 및 ML-3으로 ML-1을 후해독적으로 처리되는 것에 기인하여 겨우살이 렉틴 제제는 분리방법 또는 발효기간에 의존하는 다양한 함량의 ML-1, ML-2 및 ML-3을 가진다[재기(Jaeggy) 등, 1995]. 추가적으로 상기 언급된 이소형 중 하나는 ML-1에 대해 등전성 크로마토포커싱(chromatofocusing)으로 도 8에 설명된 바와 같이 매우 미세불균질하다.
본 발명의 근본적인 문제는 대규모로 사용할 수 있는 양과 순수한 형태의 겨우살이 렉틴을 제공하는 것에 있다. 상기 문제는 하기 청구범위에 특징화되어 있는 실시예에 의해 해결된다.
본 발명은 성숙후 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 기능을 갖고, 도 4c에서 나타낸 누클레오티드 서열을 갖는 (a)전구프로단백질; 단편이 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적으로 활성성분인 (a)에 따른 전구프로단백질의 (b)단편; (c)유전적 코드의 퇴화로 (a) 또는 (b)에 따른 핵산분자로부터 구별되는 것; 또는 (d)엄격한 조건하에서 (a), (b) 또는 (c)에 따른 핵산분자로 잡종화되는 것을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, (a) 또는 (b)에서 나타낸 생물학적 기능 및/또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
먼저 겨우살이 렉틴의 유전자 서열을 제공함에 의해서, 실험관내에서 재결합되어 단백질 화학, 그의 효소적 활성 및 그의 구조면에서 균질한 rML 홀로단백질을 제공할 수 있는 매우 정제된 재조합 각 사슬(rMLA, rMLB)은 상기 서열로부터 개시하여 수득될 수 있었다. 재결합된 재조합 단백질은 특히 일차 구조와 후해독적 변형(당부가, 인산화)에 관해 미세불균질성이 아니므로, 특히 홀로단백질로서, 부분적 사슬 및 서브단편의 형태로 치료에 유용하다.
본 발명에 따라서, 겨우살이 렉틴 전구프로단백질의 "단편"은 본래 존재하는 단편이 아니고 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 활성성분인 특정한 단편으로 이해되고 있다. 명쾌한 이유를 위해, 당업자들은 겨우살이 렉틴 이량체의 상기 생물학적 활성성분을 단일 사슬의 이량체 성분인 상기 성분으로 명백하게 이해한다고 지적된다. 그러므로 또한 도 4c에 나타낸 서열의 일부를 형성하는 그의 단일 사슬 또는 단편은 본 발명에 속하게 된다.
본 발명에서, "겨우살이 렉틴 성분"과 연결되는 "본래"라는 용어는 상기 특징화된 단편이 겨우살이 렉틴 이량체의 사슬 또는 상기 사슬내에 본래 존재하는 사슬의 서브단편으로 이해된다. 상기 단편은 바람직하게 생물학적으로 활성이다.
본 발명에서, "생물학적 활성"이라는 용어는 상기 단편이 본 발명에 기술된 사슬 또는 이량체의 적어도 하나의 생물학적 기능 또는 단일 사슬 또는 이량체의 다른 생물학적 기능을 갖는 단편으로 이해된다. 그리고, "생물학적 활성"이라는 용어는 또한 약물학적 및/또는 면역학적 활성에 관한 것을 의미한다.
그리고 처음엔 재조합 ML 단백질을 사용하는 실험에 의해서 각 도메인과 서브도메인의 기여도를 조사하였다. 재조합 ML 단백질과 재조합 서브유닛/부분 사슬은 추출 제제와 표준 추출물대신에 사용될 수 있는 상응되게 정의된 단일물질(monosubstance)의 기초가 된다.
새로운 클로닝 계획에 기초하여 겨우살이 렉틴을 코딩하는 유전자를 클로닝할 수 있으며, 그후 종래의 클로닝 계획은 실패되어 왔다.
다수의 단백질-케미칼 데이타는 겨우살이 렉틴 ML-1에 대해 공지되어 있다. 그의 분자량과 서브유닛구조에 더하여, 특히 짧은 N-말단 펩티드는 디에트리히 등[1992]과 가비우스 등[1992](또한 DE4221836 참조)에 의해 각각 기술된 공지된 아미노산 서열이다. 상기 펩티드로부터 개시하는 A 및/또는 B사슬의 N-말단 펩티드의 관련된 높은 변성도 및 아미노산 조성물로 인해, 게놈 유전자 라이브러리를 선별할때 ML 유전자 단편을 확인하기에 변성도가 충분히 낮은 합성 올리고누클레오티드를 제조하는 것은 거의 불가능하다. 이는 또한 겨우살이 폴리-(A+)RNA에 기초하여 제조된 cDNA 유전자 라이브러리에도 마찬가지이다.
중합효소 연쇄반응으로 공지된 신장(stretch)(에리히 (Erlich) 등, 1988)사이에 위치되어 있는 DNA 신장을 증폭시킨다. MLA의 N-말단으로부터 시작하는 "센스" 올리고누클레오티드와 MLB N-말단의 "안티센스" 올리고누클레오티드를 사용하여, 간섭 유전부를 증폭하면 ML 유전자에 인트론이 없게 될 수 있다(도 1a). 그러나 실제로, B 사슬의 N-말단 서열의 분석은 올리고누클레오티드의 가능한 조합의 변성도가 상기 시험을 성공적으로 하기 위해 매우 높다는 것을 나타낸다. 그 이유는 올리고누클레오티드 구조에 대해 불리하고, 공지된 아미노산 서열부위로부터 시작하는 ML 유전자 서열을 실시불가능하게 증폭시키게 하는 B사슬 N-말단서열이다(도 1b).
변형된 PCR 계획을 사용하여 ML 유전자를 클론하려고 시도할때, 과학자들은 특히 증폭 올리고누클레오티드[스팁(stirpe) 등, 1992)를 구성하는 1급 및 2급 리보솜 불활성 단백질(RIPs)에 대한 겨우살이 렉틴의 혈족관계에 기초하여 추가적으로 단백질 데이타를 결합시키려고 노력했다. (a) Ⅰ형 RIP 단백질과 리신 A 사슬 뿐만 아니라 (b)아브린과 리신의 B사슬의 다중 배열에 기초하여 보존부는 총 8개의 서열신장으로 확인되었다. 상기 서열부로부터 시작하고, 관련종의 코돈 사용표를 고려하여 총 21개의 올리고누클레오티드는 200번 이상의 증폭시험으로 다양한 조합형태로 구성되고 사용되었다. 그러나 어떤 경우에도, PCR 조건이 어닐온도, Mg2+함량 뿐만 아니라 주기 매개변수에 있어서 다양해도 특정 증폭 생성물이 수득될 수 있었다.
게놈 및 cDNA 라이브러리를 선별하고, PCR 기술을 사용하여 모두 상기에 따를때 특정 ML DNA 서열로 도달시킬 수 없다.
그러므로 증폭 올리고누클레오티드의 구성내 리신 및 아브린 구조의 구조적특징을 포함하여 새로운 방법을 모색되는 것이 시도되어 왔다.
리보솜-불활성 단백질(RIPs), 특히 Ⅱ형 RIP 리신의 효소적 기작은 ML의 기작과 유사하기 때문에(엔도 등, 1988a+1988b) 기능적 1차 및 3차 구조의 수준과 또한 구조적으로 유사한 것은 배제되지 않는다. 리신의 결정구조로부터 시작하여[카트진(Katzin) 등, 1991, 루텐버(Rutenber)와 로베르투스 등, 1991; 웨스톤(Weston) 등, 1994] 리신 A 사슬내 사슬 유연성을 분석하면, 보존 서열부내에 위치되어 있는 Arg180의 낮은 이동도에서 지적되었다. 부가적으로 기질의 상호작용을 적당히 고려하는 반면 사슬의 "주사슬(backborn)"의 입체적 배열로 인해 발생하는 활성중심의 영역에서 가능한 아미노산 치환으로 분석될 수 있다. 상기로 인한 결과는 리신 A 사슬과 Ⅰ형 RIPs의 신장서열 배열의 계산과 서로 관련되어 있다.
이와같이 구조 데이터를 포함하는 서열비교의 결과를 보충하면 특정 위치에서 특정 아미노산 잔기의 발생에 대한 확률 데이터를 얻는다. 상기 데이타는 상기 부위에 대한 이론적인 다수의 ML 아미노산 서열을 가정하고, 후자에 기초하여 낮은 변성도(도 1c)의 상응하는 올리고누클레오티드(RMLA2)를 구성하는데 사용될 수 있었다.
RMLA1(MLA 사슬의 N-말단 아미노산서열로부터 유래된 변성 올리고누클레오티드; 도 1b 참조)과 상기 숙고에 기초하여 구성된 "활성자리" 올리고누클레오티드 RMLA2를 결합시켜, 상기 모든 선택적인 접근이 실패된 후, 복합 게놈 ML-DNA로부터 시작하는 정의된 PCR 매개변수에서 단편이 수득될 수 있다.
유전자의 서열정보는 부가적인 PCR 증폭법을 사용하여 리신/아브린 서열 배열과 RIP Ⅰ로부터 유래된 단편(a)(도 3)과 변성 올리고누클레오티드를 클로닝 및 서열화하여 수득된 MLA의 부분적 유전자 서열로부터 유도되는, 특정의 변성되지 않은 올리고누클레오티드 프라이머를 통해서 완수된다. 변성 B사슬 올리고누클레오티드를 구성하기 위해, 리신과 아브린의 B사슬의 서열 배열은 매우 높게 보존된 부위가 발견되는 곳에 사용되었다.
홀로단백질의 5' 및 3' 말단, B사슬 부분적 단편 및 5' 및 3' 비해독 부위를 결정하기 위해 분리된 겨우살이 RNA로부터 시작하는 역전사에 의해 상동한 cDNA가 합성되었으며, 각 유전자 절편은 RACE 기술[프로만(Frohman) 등,1988]을 사용하여 수득되었다. 유전자 단편의 중첩크기는 완전한 A사슬 및 B사슬 유전자에 유용하고 (도 3), 복합 게놈 겨우살이 DNA로부터의 각 개시는 특정 PCR에 의해 수득되었다. 말단 변형으로 제공된 rMLA와 rMLB의 유전자 서열은 도 4a와 도 4b에 나타나 있다. 또한 5' 및 3' 비해독 부위 뿐만 아니라 엔도펩티드로 구성된 완전한 ML 유전자 서열과 신호 펩티드를 코딩하는 유전자 절편은 도 4c에 나타나 있다.
본 발명의 핵산분자의 바람직한 실시예에서, 상기 단편은 도 4a에 나타낸 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 겨우살이 렉틴의 A사슬(MLA)이다.
본 발명의 핵산분자의 더 바람직한 실시예에서, 상기 단편은 도 4b에 나타낸 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 겨우살이 렉틴의 B사슬(MLB)이다.
본 발명의 더 바람직한 실시예는 DNA분자인 핵산분자에 관한 것이다.
본 발명에서, "DNA분자"라는 용어는 게놈 및 cDNA 분자 모두 또는 (반)합성 DNA분자와 관련되어 이해되고 있다. 본 발명의 기술을 이해하는데 있어서, 상기 다양한 DNA분자의 제조방법은 당 분야에 기술을 가진 사람에게 공지되어 있다.
본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 핵산분자는 RNA분자이다.
본 발명은 상기 핵산분자에 대해 안티센스 가닥인 핵산분자에 관한 것이다. 상기 안티센스 가닥은 전사 억제 및 식물내 발현 및 조절 연구에 예로서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 한개의 핵산분자를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벡터는 예를 들면, 전체 겨우살이 렉틴 전구프로단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 단일 핵산분자를 함유할 수 있다. 상기 벡터는 발현벡터이고, 상기 전구프로단백질은 적당한 형질전환된 숙주내에서 처리될 수 있으며, 단량체 단위는 겨우살이 렉틴 이량체를 제공하기 위해 생체내 또는 실험관내에서 결합될 수 있다고 제공되어 있다. 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 벡터는 본 발명에 따른 핵산의 증식에만 사용되는 벡터이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 벡터는 겨우살이 렉틴의 A사슬 또는 그의 단편으로 코딩되는 핵산분자 및 B사슬 또는 그의 단편으로 코딩되는 핵산분자 모두를 함유한다. 바람직하게, 단량체의 단편은 생물학적으로 활성이다.
또한 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 벡터는 발현벡터이다. 다양한 숙주 유기체에 대한 적당한 발현벡터를 제공하는 방법은 당 분야에 기술을 가진 사람들에게 명확하다.
본 발명에 따라서, 겨우살이 렉틴 A사슬로 코딩되는 서열은 복합 게놈 겨우살이 DNA로부터 시작하는 특정 PCR에 의해 비정형 발현을 위해 제조되었다. 제한 엔도누클레아제의 인식서열을 뿐만아니라 해독조절요소를 사용하는 프라이머 올리고누클레오티드의 비상보적인 부위가 첨가됨에 의해서 게놈형으로 존재하는 전구프로겨우살이(prepromistletoe) 렉틴 유전자에 기초하여 겨우살이 렉틴 A사슬의 발현을 클로닝하고 분리시킨다.
아미노산 잔기 티로신1-티로신17에 상응하는 rMLA로 코딩되는 서열의 5' 부위[디에트리히 등, 1992; 가비우스 등, 1992]는 두개의 올리고누클레오티드를 잡종화 및 클로닝하고, 해독 개시코돈을 첨가하여 합성 유전자 단편으로서 제조되었다. 상기 방법으로 유전자 서열은 대장균(Escherichia coli)내 강하게 발현된 유전자에 대해 기술된 것과 같은 코돈 선택면에서 최적화되었다[그립스코프(Gribskov) 등, 1984]. 합성 rMLA 유전자 단편의 3' 말단 뿐만 아니라 PCR에 의해 수득된 rMLA 유전자 단편의 5' 말단에서, Ssp Ⅰ제한위치는 TAC부터 TAT까지의 티로신17코돈을 특이적으로 교환하여 삽입되었으며, 상기 제한위치에서는 벡터 pML 14-17을 수득하는 동안 두개의 rMLA 유전자 단편을 융합시킨다(도 5). rMLA로 코딩되는 서열은 DNA서열화에 의해 확인되었다(도 4a). 대장균내 rMLA를 발현시키기 위해, 유전자 서열은 벡터 pML14-17로부터 분리되었으며, 전사 종결자를 발현벡터 pT7-7로 삽입하여 T7-RNA 중합효소 프로모터의 조절하에 놓았다[스투디어와 모파르트(Studier ＆ Moffart), 1986]. 수득되는 발현벡터 pT7-MLA(도 5)는 대장균 발현균주 BL21을 형질전환시키는데 사용되었다. 유전자 발현의 유도는 25kDa의 상대 분자량을 갖는 당부가되지않은, 재조합 겨우살이 렉틴 A사슬에 상응하는 단백질 밴드를 발생시킴으로써 특징화된다. 특정 항-MLA 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 재조합 발현 생성물을 분석하고 확인하였다(도 7).
겨우살이 B사슬의 완전한 비정형 발현을 위해, MLB을 코딩하는 서열은 복합 게놈 겨우살이 DNA로부터 특정 PCR에 의해 증폭되었다. 제한 엔도누클레아제에 대한 해독조절인자와 인식 서열에 의해 사용된 프라이머 올리고누클레오티드의 비상보적인 부위를 통해 삽입되었다(도 6). 수득되는 0.8 kbp PCR 생성물은 발현벡터 pT7-7내에 삽입되어 TA 클로닝 벡터 PCRⅡ내에서 클로닝한 후 전사 조절요소의 조절하에 놓였으며, 발현 균주 대장균 BL21은 생성된 발현벡터 pT7-7-MLB로 형질전환되었다.
rMLB를 코딩하는 서열의 완성은 DNA 서열화에 의해 확인되었다[도 4b]. 특정 항-MLB 항체[TB33, 토네비트스키(Tonevitsky) 등, 1995]를 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 발현이 검출되었으며, 발현 유전자를 유도하고 2시간후, 당부가되지않은 재조합 겨우살이 렉틴 B사슬에 상응하는 31 kDA의 상대 분자량을 갖는 면역반응성 단백질이 발생된다(도 7b). 대장균 세포의 완전한 세포 파괴후 세포 프랙션을 분석하면, 상청액내 용해성 프랙션 뿐만 아니라 대장균 세포 파괴의 침사내 불용성 봉입체 프랙션으로 합성 rMLB 사슬이 분배된다. 유도하고 4시간후, 용해성 및 불용성 프랙션은 각각 총 수득량의 50%로 계산되었다(도 7b).
본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되는 숙주에 관한 것이다.
당 분야에 기술을 가진 사람에 의해 수행되는 목적에 의존하여, 본 발명에 따른 숙주는 바람직하게 조합된 이량체로서 단량체 중 하나 또는 두개의 단량체를 조합한 것을 제조하는데만 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 숙주는 진핵 또는 원핵세포, 유전자 도입 식물 또는 유전자 도입 동물일 수 있다.
바람직하게 본 발명에 따른 숙주는 포유류 세포, 식물 세포, 박테리아, 균류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 유전자 도입 식물이다.
특히 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 숙주는 박테리아 대장균, 아스페르길루스(Aspergillus) 세포 또는 스포돕테라(Spodoptera) 세포, 바람직하게 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산분자 또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 코딩되는 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 숙주에 의해 생성되는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 바람직하게 겨우살이 렉틴의 A사슬 또는 B사슬의 생물학적 활성을 갖는다. 그러나 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 생물학적 활성을 부분적으로나마 나타내거나 또는 생물학적 활성을 전혀 나타내지 않는다. 본 발명에서, "부분적 생물학적 활성"은 감소된 활성 및/또는 생물학적 활성의 범위로부터의 많은 활성과 관련되어 이해되고 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 특성을 나타내는 A또는 B사슬의 단편이 될 수 있다.
rMLA, rMLB 및 rML 홀로단백질의 특성 조사
(Ⅰ) 상대 분자량 및 구조
상대 분자량은 환원조건하에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하고, 은 또는 코마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 단백질을 염색시키거나 또는 웨스턴 블롯 분석에서 면역적으로 염색하여 측정하였다.
재조합, 당부가되지않은 겨우살이 렉틴 A사슬은 25kDa의 상대 분자량을 갖고, 본래 존재하는 31 kDa의 겨우살이 렉틴 A사슬 A1및 29 kDa의 A2와 상당히 다르다는 것이 발견되었다. 상대 분자량에 있어서의 차이는 종래 분야에서 A사슬은 당부가되지않은 것으로 가정되었기 때문에 특히 놀라운 것이다. 상기 재조합 겨우살이 B사슬은 31kDa의 상대 분자량을 가지며, 당부가되고 본래 존재하는 36kDa의 겨우살이 렉틴 B사슬보다 더 가볍다.
글리코실화 및/또는 서열 변이 때문에 SDS겔에서 넓은 밴드로 명확해지는 본래 존재하는 ML 단백질의 이질성은 조사된 경우중 어느 경우에서도 재조합 종내에서는 존재하지 않는다.
재결합 rMLA/rMLB 홀로단백질(rML)의 상대 분자량은 65-67 kDa의 더 무거운 nML에 비해 56kDa이다.
(Ⅱ) 등전성 균질도
rMLA는 5.2; 5.4; 5.7 및 6.2의 등전점을 갖는 4개의 종으로 분류되는 잘 정제된 본래 존재하는 겨우살이 렉틴 A사슬에 비해 6.8의 등전점을 갖는 등전적으로 균일한 단백질이라고 밝혀진다(도 8).
rMLB는 7.1 및 7.3의 등전점을 갖는 적어도 두개의 종으로 분류되는 본래 존재하는 겨우살이 렉틴 B사슬에 비해 5.1의 등전점을 갖는 등전적으로 균일한 단백질이라는 것이 입증된다(도 8).
본래 존재하는 ML 홀로단백질에 있어서, 다수의 분자 변이체 및 조합체가 있는 반면(도 8 아래), 재조합 겨우살이 렉틴 단백질에 있어서는 IEF 크로마토포커싱에서 균일한 유동성이 있으며, 이는 본래 존재하는 단백질 종의 미세이질성에 비해 rML의 균질성을 나타낸다.
(Ⅲ) rMLA의 효소적 활성
조합된 전사/해독 분석에서 면역친화적 정제된 rMLA 제제을 사용할때, 해독저해 활성은 rMLA(용해성 발현 생성물 프랙션으로부터 분리됨) 및 rMLA(불용성 "봉입체"프랙션으로부터 분리됨)로 검출될 수 있었다.
rMLA는 사용된 망상적혈구 용해질내 비저해성 잔기의 해독활성 뿐만아니라 해독저해의 투여량 의존성에 있어서 자연 발생되는 겨우살이 렉틴 A사슬과 다른 저해 특성을 나타내었다(도 9 참조). ML 홀로단백질의 독성 효과에 대해 토대를 형성하는 효소적 특성은 재조합 종에서 상당히 감소되어 있다.
(Ⅳ) rMLB의 탄수화물-결합 활성
실험관내 재결합된 rMLA/rMLB, rMLA/MLB 및 MLA/rMLB 홀로단백질과 같이 1차 발현 생성물로부터 재변성 및 재산화하여 생성된 rMLB 사슬은 탄수화물 기질 아시알로페투인(asialofetuin) 또는 페투인(fetuin)과 결합하여 효소-결합 렉틴 분석(ELLA)에 의해 검출될 수 있는 탄수화물-결합 활성을 갖는다. 재조합 rMLB 사슬의 탄수화물 특이성은 갈락토오스, β-락토오스, N-아세틸갈락토스아민(GalNAc) 및 시알산(N-아세틸 뉴라민산, NANA)에 대한 경쟁적 조건하 ELLA 시스템에서 측정되고 정량화될 수 있다. 경쟁적 ELLA 시험은 nMLB 및 rMLB에 대해 다른 탄수화물 특이성을 나타낸다. 결합 친화도는 갈락토오스(IC50 nMLB: 4.5mM; IC50 rMLB: 매우 낮은 상호반응으로 인해 측정불가능), β-락토오스(IC50 nMLB: 4.9mM; IC50 rMLB:〉70mM), N-아세틸-칼락토스아민(IC50 nMLB: 20.7mM; IC50 rMLB: 109mM)에 의한 고정된 아시알로페투인 리간드 또는 시알산(IC50 nMLB; 49.8mM; IC50 rMLB: 47.1mM)에 의한 고정된 페투인 리간드의 단백질의 반-최대 배치에 대한 시스템-특이 IC50 값으로 특징화된다.
갈락토오스-특이 렉틴으로 기술된 nMLB 사슬이 갈락토오스 및 β-락토오스에 의해 치환될 수 있는 반면, 대장균에서 재조합으로 수득된 rMLB 사슬은 갈락토오스의 검출가능한 상호반응을 나타내지 않으며, β-락토오스와는 드문 상호반응을 나타낸다. 재조합 rMLB는 N-아세틸갈락토오스아민과 시알산에 대한 명확한 친화성을 차례로 가지며, 식물 nMLB에 비해 N-아세틸갈락토스아민/시알산 특이 렉틴쪽으로 탄수화물 특이성이 실질적인 전이를 나타낸다. rMLB와 홀로단백질을 함유하는 rMLB의 생물학적 활성에 관해, 리간드, 수용체 또는 표적세포의 범위의 가능성내에서 상기 결과는 식물 겨우살이 렉틴 단백질의 생물학적 활성과 다르거나 확장되어 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 적어도 하나의 화학적 또는 효소적 변형을 가진다.
상기 변형은 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변화시키고, 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 해독 및 폴리펩티드 분리후 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 또는 반합성적 제조동안 변형될 수 있다. 그리고 겨우살이 렉틴의 약물학적 활성을 바꾸고, 바람직하게 향상시키는 공지된 방법에 의해 당업자에 의해 변형될 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 융합단백질(fusion protein)이다. 융합단백질은 바람직하게 상기 정의된 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 상기 실시예는 또한 바람직하게 세포성 수준상의 목표에 대한 겨우살이 렉틴 폴리펩티드의 약물학적 특성을 변경시키고, 바람직하게 이 특성들을 향상시키도록 고안된다.
본 발명은 또한 두개의 단량체가 본 발명에 따른 핵산분자에 의해 코딩되고, 겨우살이 렉틴의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 이량체에 관한 것이다.
"겨우살이 렉틴의 생물학적 활성"이라는 용어는 겨우살이 렉틴의 전체 생물학적 활성의 스펙터(specter)로부터 특정한 생물학적 활성을 포함하는 것으로 이해되고 있다. 상기 기능은 예를 들면, 겨우살이 렉틴의 약물학적 효과이다.
식물 겨우살이 1은 세포자멸 기작(apoptotic mechanism)으로 사람 및 쥐과 발생의 다양한 종양세포 계통내 세포용해를 유도하였다[얀센(Janssen), 1993]. 겨우살이 렉틴 1 또는 B사슬은 단독으로 건강한 사람 혈액 주개의 주변 단핵세포로부터 시토킨의 방출을 유도한다[하즈토, 1990]. 겨우살이 렉틴 1은 암환자의 신경섬유성 과립구로부터 과산화물 음이온의 분비를 유도한다[티모센코(Timoshenko), 1993]. 겨우살이 렉틴 1은 건강한 사람 혈액 주개의 말초 임파구상 인터로이킨(interleukin) 2 수용체(CD25)의 A사슬 및/또는 HLA DQ 항원의 발현을 유도한다[베우트, 1992]. 쥐내에 겨우살이 렉틴 1을 사용한후, 흉선내 세포독성 T-임파구(Lyt-2+)와 헬퍼(helper) T-세포(L3T4+)의 수 및 복막의 대식세포의 수, 특히 활성마커 MAC-3을 운반하는 것의 수에 있어서 증가되는 것이 관찰될 수 있다[베우트, 1994]. 실험용 동물의 흉선내 L3T4+/Lyt2+의 관계는 증가되었다. 쥐의 주변혈액내에서 백혈구, 세포표면상에서 활성마커로서 인터로이킨 2 수용체를 발현하는 임파구, 활성마커 MAC3을 발현하는 단핵세포의 밀도는 겨우살이 렉틴 1로 처리된 후에 증가되었다[베우트, 1994]. 암환자의 혈액내에서, 겨우살이 렉틴 1은 T-임파구(CD4+, CD8+), 자연 킬러세포 및 B-임파구의 밀도를 증가시킨다[베우트, 1992].
그리고 겨우살이 렉틴 1을 사용한 후 유방암 환자의 혈장내 내인성 아편제 매개자 β-엔돌핀(endorphin)이 증가되는 것이 발견될 수 있었다[헤이니(Heiny), 1994]. 게다가 겨우살이 렉틴 1은 K-562 암세포에 비해 주변 킬러세포의 독성 효과 및 주변 혈액내의 큰 과립성 임파구(LGL)의 밀도를 증가시킨다[하즈토, 1989]. 쥐내 육종세포상에의 겨우살이 렉틴 1의 전이(antimetastatic) 활성이 또한 발견될 수 있었다[베우트, 1991].
다른 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 이량체는 본래 존재하는 겨우살이 렉틴 이량체로서 같은 범위의 생물학적 활성을 가진다.
(Ⅴ) 재조합 겨우살이 렉틴의 생물학적 활성
rML 홀로단백질은 중첩(folded) 용해성 사슬 또는 중첩 단계에서 변성된 rMLA 및 rMLB 사슬로부터 시작하는 실험관내 분리단계에서 재조합적으로 합성된 단일사슬을 사용하여 생성되었는데, 여기서 상기 rMLB는 글루타티온 산화환원 시스템의 존재 및 부분적으로 단백질 이황산염 이소머라제의 존재내에서 rMLA의 몰초과량과 바람직하게 재결합되었다. 이종이량체에 상응하는 rML 홀로단백질은 N-아세틸 갈락토스아민 아가로스 또는 락토실 아가로스상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 재결합반응으로부터 분리 및 정제되어, 유리 rMLA 및 rMLA 이량체로 분리되었다. 유사한 방법으로 rMLA/rMLB(rML) 및 rMLA/nMLB 이종이량체 홀로단백질이 제조되었다.
[세포독성 활성]
재결합된 홀로단백질의 생물학적 활성을 예로 함으로써 사람 단핵세포 백혈구 세포계통(line)(MOLT4)상에서 세포독성 효과가 시험되었다. B사슬(표면 결합)과 A사슬(효소적 리보솜 불활성) 모두는 관찰되는 세포독성 효과에 이바지한다. 실험관내 재결합된 rMLA/rMLB 홀로단백질 뿐만 아니라 실험관내 재결합된 rMLA/nMLB 홀로단백질은 본래 존재하는 nML 홀로단백질의 두 개의 치환과 비교되었다. 재조합 rMLA/rMLB와 rMLA/nMLB 홀로단백질은 약 10-30pg/㎖의 IC값을 갖는 비교적 높은 세포독성을 나타내며(도 11), 이는 재조합 사슬을 사용하여 실험관내에서 재결합된 rML 홀로단백질의 생물학적 활성과 기능적 완성을 나타낸다. 세포독성 활성에 있어서 효과를 내기 위해서는 분리된 rMLB 사슬은 단독으로 세포독성 활성을 가지지 않기 때문에 B사슬이 효소적으로 활성인 A사슬과 실시가능하게 연결되는 것이 필요하다. 그러므로 논의되어온 식물 겨우살이 렉틴 B 사슬 제제의 세포 독성 활성은 nML 홀로단백질의 잔류량에 있다. 첫번째로 단일 사슬의 재조합 생성물은 겨우살이 렉틴의 탄수화물-결합 및 효소적 활성을 각각 기술하고 사용할 수 있게 한다.
[세포자멸사(apoptosis) 유도]
겨우살이 렉틴의 생물학적 활성을 예로 함으로써, 세포자멸 유도 가능성은 재조합 rML 홀로단백질에 대해 단핵세포계통 U937을 사용하여 입증되었다. 세포 70pg/㎖를 처리하고 24시간후, rML 홀로단백질에 의한 세포자멸 유도가 관찰될 수 있었다(도 12). MOLT-4 세포와 주변 혈액 단핵세포(PBMC)상에서 겨우살이 렉틴으로 시험하면, 적은 용량범위로 세포자멸 방법을 유도하는 것이 겨우살이 렉틴의 세포독성 활성에 기초가 된다는 것이 나타났다. 낮은 세포독성의 농도 범위에서 시토킨이 유도되기 때문에(도 13, 도 14), 세포자멸-유도 활성과의 상관성은 그럴듯한 반면, 과범위 뿐만 아니라 더 긴 배양시간으로 세포자멸사가 괴사 효과에 의해 첨가된다. 세포자멸의 결과로서의 세포독성은 민감성 MOLT-4 세포를 재조합 B사슬로 처리할때 발견될 수 없었기 때문에 적은 용량범위내 세포자멸 유도의 생물학적 활성은 홀로단백질의 효과에만 한정될 수 있다.
[면역촉진 활성]
재조합 겨우살이 렉틴 홀로단백질의 생물학적 활성의 예로 함으로써 면역촉진 효과는 건강한 혈액 주개(PBMC 모델)의 사람 단핵세포로부터 종양 괴사인자 α(TNF-α) 및 인터페론 γ(IFN-γ)방출의 유도 뿐만 아니라 사람 1차 케라틴세포 및 피부 섬유아세포(피부2ZK1200 모델)의 배양물내 인터로이킨-1α(IL-1α) 및 인터로이킨-6(IL-6)의 유도를 시험하였다. PBMC 모델에서, 3-48ng/㎖의 재조합 rML 홀로단백질이 TNF-α 및 IFN-γ을 용량에 의존하여 방출시키고, 피부2모델에서는 0.25-8ng/㎖의 재조합 rML 홀로단백질이 IL-1α 및 IL-6을 용량에 의존하여 방출시킨다.
언급된 모든 시토킨은 사람 면역시스템의 적절한 자극 매개자이며, 이는 세포성 면역반응의 활성에 있어서 중심기능을 한다.
면역촉진 활성이 B사슬의 렉틴활성에 주기능을 할 수 있는데[하즈토 등, 1990] 따라 당 분야의 상태에 비해 상기 시토킨 방출은 재조합 rMLB 사슬 단독으로 만 유도될 수 없었다. 면역촉진 활성은 실시가능하게 결합된 rML 홀로단백질에 의해 적은 용량범위에서만 수득될 수 있었다. 상기는 식물 rMLB 사슬의 면역촉진 제제에 흔적량의 nML 홀로단백질이 함유되고, nMLB 사슬에 한정되는 면역촉진 효과는 잔류량의 nML에 한정되어야 한다는 사실이 제시하였다. 상기된 nMLB를 제조하는 방법이 홀로단백질을 정량적으로 분리시키지 않는 반면, 처음에 겨우살이 렉틴 사슬의 재조합 수득은 균질한 겨우살이 렉틴 B사슬 제제을 조사하고 제공할 수 있게 한다. 이는 처음에 A 및 B사슬의 생물학적 활성을 각각 기술 및 사용하며, 단일 사슬 및 실시가능하게 결합된 홀로단백질의 생물학적 활성을 구별시킨다.
(Ⅵ) 재조합 겨우살이 렉틴 B사슬(rMLB)의 생물학적 활성
면역능력 세포의 활성화에 대한 마커로서, 세포 표면 단백질 CD69의 유도가 시험되었다. CD69는 T 세포, B 세포 및 특히 자연 킬러세포(NK 세포)의 활성후, 제1 세포 표면 항원중 하나로 나타난다. CD69는 세포 표면 단백질이 휴면 임파구상에서 발현되지 않기 때문에, 상기 면역능력 세포구의 활성 마커로 기능한다. 그리고 유도가능한 CD69 표면 단백질은 NK 세포 및 TcRγ/δT세포의 세포분해 활성을 위한 중심 기능을 한다는 것이 입증되었다[모레타(Moretta)등, 1991].
항-CD69 mAb를 사용한 흐름 세포계량법(FACS)은 세포 표면상의 CD69 발생과 CD69-양성 세포의 분배 모두에 관해 단핵세포의 활성이 1-100 ng/㎖의 농도범위로 검출되도록 사용되었다. 용량-의존성에 대한 곡선은 종 모양이며, 이는 rMLB 사슬의 두 리간드 결합 위치를 통해 세포성 수용체가 상호연결될 필요성이 있음을 지적한다. 상기 시험에서 조사된 PBMC상의 세포독성 효과는 100 ng/㎖ rMLB의 고농도에서도 입증될 수 없었다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 이량체는 단량체중 적어도 하나로서 본 발명에 따른 화학적 또는 효소적으로 변형된 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 융합 단백질을 나타낸다.
변형은 특정량(예를 들면, B 사슬의 탄수화물 결합위치 또는 A 사슬의 글리코시다아제 활성)을 제거하고 가능한 부작용을 제거하여 효능을 최적화하고 가능한 치료적 용도를 넓히는데 사용될 수 있다. 변형된 특성을 갖는 폴리펩티드는 또한 작용기작을 설명하기 위한 기구로 제공될 수 있다. 폴리펩티드의 항원성 및 면역 유전성의 감소 및/또는 그들의 약물동력학적 특성을 최적화하는 특정 요법에 필요하게 될 수 있으며, 이는 아미노산을 특이적으로 교환하여 가능해졌다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드 이량체를 특이적으로 결합시키는 항체 또는 그의 단편 또는 유도체에 관한 것이다. 그러므로 이들은 본래 존재하는 겨우살이 렉틴 또는 그의 단일 사슬을 인식하지 못한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 항체는 본래 존재하는 겨우살이 렉틴의 당부가에 의해 차폐되는 에피토프에 결합된다. 상기 항체는 단일클론성, 다중클론성 또는 (반)합성 항체일 수 있다. 상기 단편은 예를 들면, Fab', F(ab)2또는 Fv 단편일 수 있다. 항체 유도체는 또한 당 분야에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에서 본 발명에 따른 숙주는 적당한 조건에서 배양되며, 수득된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체가 분리된다.
당업자들은 숙주를 배양하고 분리하기 위한 적당한 조건에 정통하다. 예를 들면, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체는 적당한 발현 시스템을 통해 숙주로부터 나올 수 있으며, 배지내에서 수집될 수 있다. 한편, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체는 세포내에 남아있을 수 있으며, 그로부터 분리될 수 있다. 다음으로 본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 실시예를 논의할 것이다.
rMLA를 분리하기 위해, 적당한 발현벡터로 형질전환된 대장균 세포를 파괴되었으며, 원심분리에 의해 용해성 및 불용성 세포 프랙션으로 분리되었다. 세포 프렉션의 분석은 재조합 겨우살이 렉틴 A 사슬이 발현 조건과 발현 지속에 의존하여 용해성 형태로 5-50% 및 불용성 단백질 집합체("봉입체")의 형태로 50-95%로 축적된다는 것이 나타났다.
용해성 및 불용성 단백질을 발생시키는 데는 rMLA 단백질의 재중첩 또는 재변성이 가능하다면, rMLA를 분리하는 적어도 두가지 방법이 있는 것이 지적된다. "봉입체"로 집합된 rMLA는 변성조건하에서 대장균 단백질[바비트(Babbitt) 등, 1990]을 제거하기 위해 침전물을 세척 후, 용해시키고, 중첩 완충액(50mM Tris-HCl, 2mM DTT, 1mM EDTA, pH 8.0)내에서 90-중첩 희석으로 재중첩되었다.
상기 처리로 도 9에 나타난 바와 같이 재변성되고, 본래 불용성이고, 변성된 rMLA 종과 같은 완전한 효소적 활성을 갖는 용해성, 중첩 단백질 종이 수득되었다. 재변성된 rMLA는 특이 항-MLA 항체 TA5를 사용한 면역친화도 크로마토그래피로 용해성 rMLA와 같이 분리될 수 있다[토네비트스키 등, 1995].
용해성 형태 뿐만 아니라 불용 "봉입체" 형태로 rMLB가 존재하는 것은 재조합 겨우살이 렉틴 B사슬을 분리하는데 두가지 방법이 있다는 것을 의미한다.
대장균 세포질의 강한 환원성 환경으로부터 용해성 rMLB 사슬을 분리하기 위해, 사슬내 이황화물 브릿지를 형성하기 위해 환원 및 산화된 글루타티온으로 구성된 산화환원 시스템의 존재하에서 배양되고, 활성 접힙 생성물을 안정화시키기 위해 리간드 β-락토오스의 존재내에서 배양된다. 중첩 반응활성으로부터, 탄수화물-결합 rMLB 사슬은 락토오실 아가로스 또는 N-아세틸갈락토스아민 아가로스상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 한단계 방법으로 선택적으로 분리 및/또는 정제되었다.
"봉입체"로서 대장균 세포의 세디먼트가 존재했던 불용성 발현 생성물 프랙션으로부터 rMLB를 분리하기 위해, 완전한 세포 파괴물은 대장균 단백질을 제거하기 위해 세척되고[바비트 등, 1990], 변성 및 환원조건하에서 용해되었다. 환원 및 산화된 글루타티온으로 구성된 산화환원시스템의 존재뿐만 아니라 리간드 β-락토오스의 존재하에서 희석하여 재변성되었다. 활성 탄수화물-결합 rMLB 사슬은 N-아세틸갈락토스아민 아가로스 또는 락토실 아가로스상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 재변성 반응으로부터 선택적으로 분리정제되었다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 이량체 및/또는 하기에 기술될 선택적으로 약학적으로 하용가능한 담체와 혼합되는 본 발명에 따른 항독소로 구성된 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 그들의 결합체 또는 그들의 변형체는 본래 존재하는 겨우살이 렉틴에 대해 공지된 약물학적 특성으로 유사한 암 또는 감염의 치료에 다양하게 사용된다.
면역촉진 효과는 몸의 면역적 방어를 직접 및/또는 간접적으로 자극하고, 더 효과적으로 암을 치료하고 물질대사를 가능하게 하여 암 치료에 사용될 수 있다. 감염, 특히 비루스성 감염도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 상승 효과를 이루거나 또는 필요한 양의 조합 제제를 감소시키고 그의 부작용을 감소시키기 위해, 인터페론, 시토킨 또는 콜로니-자극인자와 같은 다른 면역촉진제와 조합되어 투여될 수 있다.
세포안정제 또는 방사치료를 조합하여, 로이코페니아(leucopenia)/골수억제(myelosuppression)의 부작용이 완화되거나 또는 감소되어 종래 치료방법으로 인해 면역시스템의 약화가 감소되었다.
글리코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 직접적인 세포독성 효과는 종양세포가 세포자멸되고, 또한 치료적 목적으로 사용될 수 있다. 상기 원리는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 적당한 항체와 결합된다면 항독성을 더 특이적으로 사용할 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체로 구성된 항독소에 관한 것이다. 예를 들면, 활성 A 사슬 또는 홀로단백질은 단백질 화학방법으로 항체 또는 그의 단편과 결합될 수 있다. 상기 결합방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 상응하는 결합물은 많은 목적에 유용하다[비테타 (Vitetta) 등, 1993]. 선택적으로, 제조된 융합단백질 구조물은 발현될 수 있으며, 예를 들면 항체로부터 항원-결합 도메인을 함유하고, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 세포독성 단편도 발현될 수 있다.
그리고 물질대사 형성은 종양세포의 다른 세포로의 결합이 저해된다면, 방해받을 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 경쟁적인 렉틴 결합을 사용하여 상기 결합을 방해하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산분자 또는 그의 상보적인 가닥으로 특이적으로 잡종화시키는 프라이머 및/또는 프라이머 쌍에 관한 것이다.
본 발명은 적어도 하기를 함유하는 진단용 조성물에 관한 것이다;
a) 본 발명에 따른 핵산분자;
b) 본 발명에 따른 핵산분자 또는 그의 상보적인 가닥을 특이적으로 잡종화시키는 프라이머 및/또는 프라이머 쌍
c) 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 이량체.
프라이머 및/또는 프라이머 쌍을 함유하는 본 발명의 진단용 조성물은 렉틴 유전자와 같이 렉틴으로 약학적으로 코딩되는 새로운 유전자를 발견하기 위해 렉틴 유전자의 존재에 대해서 유기체를 선별하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 진단용 조성물내에 함유된 본 발명의 핵산분자는 예를 들면, 서던 블롯 또는 노던 블롯 방법으로 상기 렉틴 유전자의 존재에 대해서 유기체를 선별하는데 사용될 수 있다. 잡종화를 다양화하여, 관련 렉틴 유전자가 선별될 수 있다. 폴리펩티드(이량체)는 다양한 유기체내에서 각 (겨우살이) 렉틴을 공지된 방법으로 검출하는데 사용될 수 있는 항체 또는 면역혈청을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 본 발명에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 식물 보호제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드, 그들의 결합체 또는 변형체는 식물 겨우살이 렉틴에 대해 논의된 기능에 따라 식물 보호제로 사용될 수 있다. 항비루스성 보호로서의 겨우살이 렉틴의 기능은 먹힘에 대한 식물의 보호대책으로서의 독성을 갖거나, 또한 막의 투과성 및 구성에 영향을 주는 특성으로 논의된다.
[실시예 1]
[1차 증폭 올리고누클레오티드 제조]
겨우살이 렉틴(ML)은 다양한 분류적 기원의 식물에 넓게 공통되는 단백질을 나타내는 리보솜 불활성 단백질 부류에 속한다[스팁 등, 1992]. ML은 그의 서브유닛의 불활성으로 인해 Ⅱ형 리보솜-불활성 단백질 그룹에 한정되었다[엔도 등, 1988a].
그러나 겨우살이 cDNA와 게놈 라이브러리를 선별하는 접근 방법은 ML 유전자 서열을 발견하기에 매우 부적절하다. 다양한 DNA 프로브를 사용하여도, 겨우살이 폴리-A+ RNA로부터 유전자 라이브러리에서 ML 특이적 클론을 확인할 수 없었다. ML 유전자 서열이 인트론을 함유하지 않는 가정을 토대로 PCR 계획을 계속하였다. N-말단 아미노산 서열은 MLA와 MLB 사슬로 공지되어 있기 때문에[디에트리히 등, 1992; 가비우스 등, 1992], 공지된 펩티드로부터 유도된 변성 증폭 올리고누클레오티드를 사용하여 MLA 코딩부위를 증폭시킬 수 있게 되었다(도 1a). 낮은 변성도의 유용한 올리고누클레오티드를 MLA 사슬의 N-말단으로부터 유도할 수 있는 반면(RMLA1, 도 1b), MLB 사슬의 N-말단으로부터 상응하는 충분히 특이적인 올리고누클레오티드를 제조할 수 없다(RMLB1, RMLB2, RMLB3, 도 1b).
그러므로 선택적인 계획은 관련 단백질의 단백질 데이타를 포함하여 비공지된 ML 서열 부위로부터 증폭 올리고누클레오티드를 유도할 수 있도록 발달되어 왔었다. Ⅰ형 및 Ⅱ형 리보솜 불활성 단백질의 아미노산 서열 분석은 높은 서열 상 동성을 갖는 다수의 보존 부위를 나타내었다. 도 1c는 리신의 활성중심에 대한 Ⅰ형과 Ⅱ형 사이의 높은 유사정도를 나타낸다. 서열 모티프 MISEAARF내에서 효소적 기작에서 역할을 담당하는 E177과 R18O에 관해 논의되었다[김(Kim) 등, 1992; 로드(Lord) 등, 1994]. 적어도 두개의 잔기가 ML 서열내에 존재될 수 있다고 결정되었다. 각각의 잔기의 존재에 관한 구조적 숙고로 코돈 사용법의 낮은 변형도를 갖는 데 특히 유의하여 증폭 올리고누클레오티드 RMLA2를 제조하였다. 상기 올리고누클레오티드의 서열은 도 1c에 나타나 있다.
[실시예 2]
[ML-유전자 특이적 DNA 단편 제조]
고분자 게놈 DNA는 새로운 겨우살이 잎(숙주 나무 포플러스 윌소니(Populus wilsonii))으로부터 바우어(Baur) 등[1993]의 방법으로 분리하였다. PCR로 ML-유전자 특이적 DNA 단편을 제조하기 위해 게놈 DNA 100ng을 각 증폭 반응에 사용하였다. 증폭은 PCR 완충액(10mM Tris-HCl, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.25mM dNTP, pH 8.3), 78pmol 프라이머 RMLA1 및 50pmol(반응2) 또는 100pmol(반응1) RMLA2를 함유하는 50㎕의 총부피내에서 실시하였다. PCR은 바이오메트라 열순환기(Biometra thermocycler)내에서 보에링거 만하임의 Taq DNA 중합효소(1.5U/반응)로 실시하였다. PCR 매개변수는 총 30주기에 있어서, 90℃에서 1분 변성, 50℃에서 1분 어닐(annealing), 72℃에서 1분 신장이었다 증폭 생성물은 에티듐 브롬화물로 염색하고, 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다(도 2). 약 500bp의 크기를 갖는 반응2에서 수득된 특이적 증폭 생성물은 겔 용출로 분리하고, TA 벡터에서 클론하였다.
[실시예 3]
[클로닝 계획]
1차 PCR에 사용한 증폭 올리고누클레오티드의 유도는 실시예 1(도 1a)에 나타나 있으며, 하기에 "a"로 언급한 겨우살이 ML유전자의 1차 유전자 단편의 제조는 실시예 2(도 2)에 나타나 있다. 클론된 유전자 단편 "a"의 서열 및 ML 유전자가 특정한 인트론을 가지고 있지 않다는 가정으로부터 시작하여, 단편 "b", "c", "d" 및 "e"를 증폭시키는 서열특이성 5' 올리고누클레오티드를 유도할 수 있었다. "c" 에 대한 3' 올리고누클레오티드가 "a"의 DNA 서열로부터 유도된 반면, 유전자 단편 "b", "d", "e" 및 "g'를 증폭시키는 변성 3' 프라이머는 Ⅰ형("b") 및 Ⅱ형("d", "e", "g") RIP 단백질의 상동부위를 분석함으로써 제조되었다. 단백질 종류내의 서열비교는 코돈 사용법의 낮은 변형도를 갖는 잔기에 특히 주의를 갖고 각 잔기의 존재내에서 추론하는데 다시 사용하였다. 특히 공지된 리신 및 아브린 cDNA와 유도된 단백질 서열은 약 50ML-특이적 올리고누클레오티드 조합물을 제조하는데 사용하였다. 도 3은 특이 증폭 생성물로서 클론되어 추가적으로 분석될 수 있던 유전자 단편만 나타낸다. 다른 올리고누클레오티드 조합물로부터 시작하면 ML-특이 증폭 생성물은 발생될 수 없었다. 유전자 단편 "f"(MLA 사슬로 코딩됨) 및 "g"(MLB 사슬로 코딩됨)의 제조는 실시예 5와 실시예 6에 각각 상세히 기술되어 있다.
ML 유전자의 해독 및 비해독된 서열부위의 5' 및 3' 부위를 분석하는데 있어서, 5' 및 3' RACE에 대한 조건[프로만 등, 1988]이 성립되어 단편 "h", "i" 및 "j"을 발생시킨다. RACE-PCR로 단편 "j"를 증폭시키는 것은 완전한 MLB 유전자 단편의 제조에 대한 선택예이다. RACE 반응은 역전사에 의해 겨우살이 잎(숙주 나무 포플러스 윌소니)으로부터 분리된 겨우살이 전체 RNA로 제조되는 cDNA를 사용하여 실시하였다.
[실시예 4]
[DNA 서열 및 해독 생성물 rMLA 및 rMLB]
발현 벡터 pT7-MLA 및 pT7-MLB를 삽입한 것은, 다양한 ML-특이적 올리고누클레오티드를 사용한 "프라이머 워킹" 계획(두 가닥의 완전한 중첩서열을 발견)을 사용한 표준 방법으로 서열화되었다(도 4a,4b). 밑줄이 그어져 있는 서열부위는 pT7 발현벡터로 클론되기 위한 제한 위치를 의미한다. 두 유전자 단편은 실시예 5와 실시예 6에 기술된 것과 같은 발현벡터의 구성 모식도에 따라 변형되어왔다. 도 4c는 상기 단편으로부터 유도된 완전한 ML 유전자 서열을 나타낸다. 또한 5' 및 3' 비해독 부위 뿐만 아니라 엔도펩티드 및 신호-펩티드가 코딩된 영역으로 구성되어 있다.
[실시예 5]
[발현벡터 pT7-MLA 구조]
이질성 발현을 위해, 겨우살이 렉틴 A사슬로 코딩되는 서열을 복합 게놈 겨우살이 DNA로부터 시작하는 특이 PCR로 제조하고, 말단을 변형시켰다. 해독조절인자 뿐만 아니라 제한 엔도누클레아제의 인지서열을 사용된 프라이머 올리고누클레오티드의 비상보적인 부위를 통해 첨가하여, 게놈 전구프로겨우살이 렉틴을 토대로 겨우살이 렉틴 A사슬을 클론링, 분리발현시켰다.
도 5b는 PCR에 의해 유전자 단편으로 코딩되는 MLA를 제조하는 것을 나타낸다. 유전자 서열로 코딩되는 MLA를 증폭시키기 위해, PCR 완충액(10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 0.25mM 각 dNTP, pH 8.3)내 게놈 겨우살이 DNA 200ng, 1.5mM(반응1) 또는 2.5mM(반응2) 염화 마그네슘, 40pmol의 각 프라이머 올리고누클레오티드 RML16 및 RML17을 총 부피 50㎕로 사용하였다. PCR은 94℃에서 1분 변성, 52℃에서 1분 어닐, 72℃에서 1.5분 신장시키는 온도 프로파일의 총 30주기에 의해서 Taq 중합효소(1.5 U/반응, 보에링거 만하임)를 사용하여 실시하였다. 증폭 생성물은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고 에티듐 브롬화물로 염색(도 5b)하여, 겔 용출로 TA 벡터내에서 클론하는데 제공하였다.
아미노산 잔기 티로신1-티로신17에 상응하는 rMLA로 코딩되는 서열의 5' 부위 [디에트리히 등, 1992; 가비우스 등, 1992]는 두개의 올리고누클레오티드를 잡종화 및 클로닝하고, 해독개시 코돈을 첨가하여 합성 유전자 단편으로서 제조하였다. 상기 방법에서, 유전자 서열은 대장균내 강하게 발현된 유전자로 기술된 것과 같이 코돈 선택에 관해 최적화되었다[그립스코프 등, 1984]. 합성 rMLA 유전자 단편의 3' 말단 뿐만 아니라 PCR에 의해 수득된 rMLA 유전자 단편의 5' 말단에서, Ssp Ⅰ 제한위치는 벡터 pML14-17을 수득하는 동안 두개의 rMLA 유전자 단편을 융합시키고, TAC로부터 TAT까지 티로신17코돈을 특이적으로 교환함에 의해서 삽입되었다(도 5).
rMLA로 코딩되는 완전히 발생한 서열은 DNA 서열화로 확인하였다(도 4a). 대장균에서 rMLA를 발현시키기 위해 유전자 서열을 벡터 pML14-17로부터 분리하고, 발현벡터 pT7-7로 삽입하여 T7-RNA 중합효소 프로모터 및 전사 종결자의 조절하에 놓았다. 수득된 발현벡터 pT7-MLA(도 5)는 대장균 발현균주 BL21을 형질전환시키는데 사용하였다.
[실시예 6]
[발현벡터 pT7-MLB 구조]
겨우살이 렉틴 B사슬의 이질성 발현을 위해, MLB로 코딩되는 완전한 서열은 사용된 프라이머 올리고누클레오티드의 비상보적인 부위를 통해 해독 조절인자 뿐만 아니라 제한 엔도누클레아제에 대한 인식 서열을 삽입하여 특이 PCR로 복합 게놈 겨우살이 DNA로부터 증폭시켰다.
도 6b는 PCR에 의해 rMLB로 완전히 코딩되는 전체 유전자 단편을 제조하는 것을 나타낸다. DNA 단편으로 코딩되는 rMLB의 증폭은 200ng 게놈 겨우살이 DNA를 갖는 총 부피 50㎕의 PCR 완충액(10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.25mM 각 dNTP, pH 8.3) 및 50pmol 프라이머 올리고누클레오티드 RML25 및 프라이머 올리고누클레오티드 RML26의 30pmol(반응1)과 10pmol(반응2)로 PCR 반응에 의해 실시되었다. PCR은 94℃에서 1분 변성, 52℃에서 1분 어닐, 72℃에서 1.5분 신장하는 총 30주기로 Taq 중합효소(1.5 U/반응, 보에링거 만하임)를 사용하여 실시하였다. PCR 생성물은 1% 아가로스 겔 전기영동 및 에티듐 브롬화물로 염색하여 분석하였다. 상기로 인해 겔 용출에 의해 분리되고, TA 벡터에서 클로닝하기 위해 제공된 0.8kbp PCR 생성물을 수득하였다. 유전자 단편으로 코딩되는 rMLB를 발현벡터 pT7-7로 삽입하여 전사조절 요소의 조절하에 놓았으며, 발현균주 대장균 BL21은 수득 발현벡터 pT7-MLB로 형질전환시켰다. PCR-발생의 보전, rMLB로 코딩되는 완전한 서열은 DNA 서열화로 확인하였다(도 4b).
[실시예 7]
[rMLA 및 rMLB의 발현, 면역적 분석, 재중첩 및 실험관내 재결합]
(Ⅰ) 대장균내 rMLA 발현
재조합 겨우살이 렉틴 A사슬의 발현을 위해 1000ml LBAmp배지를 대장균 BL21/pT7-MLA의 증감되지 않고 성장하는 LBAmp전배양의 5ml로 21 홈이 있는 조직 배양 플라스크에 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 578nm에서 혼탁도 측정으로 성장을 관찰하였다. OD578≒0.9-1.0의 세포 밀도에 도달되었을 때 0.5mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 수득하기위해서 상기 세포는 GS-3 로우터 (소르발, Sorvall)내 4℃에서 5,000rpm으로 20분동안 원심분리하여 유도하고 2시간 후 침전되고, 배양 배지를 따라내었다. 1l 배양배지로부터 시작하여, 3-4g(습량)의 세포량을 분리하였다.
세포파괴는 프렌치-프레스(French-Press, SML Instruments)를 사용하여 실시하였다. 세포 침전물을 20ml 파괴 완충액 B(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT, 1mM PMSF, pH 8.0)에 현탁시키고, 1,500psi에서 2 프렌치-프레스 단계로 파괴하였다. 불용성 세포 프랙션과 가능한 "봉입체"를 SS-34 로우터 (Sorvall)내 4℃에서 30분동안 10,000rpm으로 원심분리하여 침전시키고, 상징액내 남은 용해성 대장균 단백질 또는 용해성 발현 생성물로부터 분리시켰다.
발현을 분석하기 위해, 동일 체적의 세포 파괴 프랙션을 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 시험하고, 코마시 브릴리언트 블루로 염색할 뿐만 아니라 MLA 특이 항혈청 TA5를 사용한 웨스턴 블롯으로 시험하였다(도 7a). 단일클론 항체 TA5[토네비트스키 등, 1995]는 토네비트스키에 의해 제공되었다. 본 발명에 사용한 다른 항체와 같이 이들은 각 면역원(TA5의 경우에는 ML-1 또는 MLA임)을 사용한 표준 기술로 제조할 수 있다. 발현을 검출하기 위해, 대장균 파괴물의 동일 체적의 용해성 프랙션(레인 2,4,6,8) 뿐만 아니라 불용성 "봉입체" 프랙션(레인 1,3,5,7)을 그들의 rMLA 함량에 대해 조사하였다. 발현 과정을 설명하기 위해, 유전자 발현 유도후 샘플을 전(레인 1+2), 2시간(레인 3+4), 4시간(레인 5+6) 및 6시간(레인 7+8)으로 사용하였다. 발현은 발현 최대가 유도하고 2시간후에 이미 도달된 rMLA에 상응하는 면역반응성 25kDa 발현 생성물의 발생에 의해 유도되고 1시간 후 특징화되었다. 유도후 2시간된 용해성 및 불용성 세포 파괴 프랙션상의 rMLA의 분포는 각 ~50%이며, 발현을 더 오래 함으로써 불용성 "봉입체"의 형성을 증가시킨다.
(Ⅱ) 불용성 "봉입체"로부터 rMLA 분리
대장균 완전 세포 파괴물의 침전물이 바비트 등[1990]의 20㎖ STET-완충액(50mM Tris-HCl, 8% (w/v) 수크로오스, 50mM EDTA; 1.5% (v/v) 트리톤 X-100, pH 7.4)으로 각각 두번 세척하여 대장균단백질을 제거하였다. 상기에 함유된 "봉입체"를 갖는 잔류 침전물을 일정한 교반하에 실온에서 16시간동안 배양시켜 20㎖ 변성 완충액(6M 구아니디늄클로라이드, 100mM DTT, 50mM Tris-HCl, pH 8.0)에 용해시켰다.
rMLA를 재변성시키기 위해, 변성 완충액내 존재하는 단백질 용액을 90배 부피의 중첩 완충액(50mM Tris-HCl, 2mM DTT, 1mM EDTA, pH 8.0)에 서서히 적상첨가하고, 교반하면서 실온에서 16시간동안 배양하였다. 침전된 단백질을 GS-3V 로우터(Sorvall)내 4℃에서 30분동안 6,000rpm으로 원심분리하여 분리시켰다. 상청액에 함유된 rMLA는 저장을 위해 20% (v/v) 글리세롤로 조정하여 4℃에서 저장하였다.
(Ⅲ) 면역친화도 크로마토그래피에 의한 rMLA 정제
면역친화도 크로마토그래피로 rMLA(용해성 발현 생성물 프랙션 또는 재중첩 단백질)를 1-단계 정제하기 위해, 겨우살이 렉틴 A사슬에 대한 단일클론성 항체 항-nMLA-IgG(TA5, 토네비트스키 등, 1995) 260㎍을 할로우와 스퍼(Harlow ＆ Spur, 1988) 방법으로 단백질 A 세파로오스 CL4B(시그마, 다이센호펜)상에서 공유적으로 고정시켰다. 비특이적 결합단백질을 제거하기 위해, rMLA 샘플로 면역친화성 기질을 배양시키고, 10 컬럼 베드 부피의 세척 완충액 1(1M NaCl, 10mM 인산 완충액, pH 7.0) 및 10 컬럼 베드 부피의 세척 완충액 2(10mM 인산 완충액, PH 7.0)으로 상기 기질을 세척한후, 특이적으로 결합된 rMLA를 용출 완충액(0.1M 글리신, pH 2.5)으로 용출하였다. 상기 용출은 1M 인산 완충액을 함유하는 용기내 pH를 pH8.0으로 재조정함에 의해서 실시하였다.
(Ⅳ) 대장균내 rMLB 발현
재조합 겨우살이 렉틴 B사슬을 발현시키기 위해, 1000㎖ LBAmp배지를 대장균 BL21/pT7-MLB의 정지기의 LBAmp전배양물 5㎖가 있는 21 홈이있는 조직 배양 플라스크로 접종하고, 진탕하면서 37℃에서 배양하였다. 성장은 578nm에서 혼탁계량법으로 관찰되었다. 유전자 발현은 OD578≒0.9-1.0의 세포 밀도에 도달되었을때, 0.5mM IPTG를 첨가하여 유도하였다. 세포를 수득하기위해서 세포는 GS-3 로우터(Sorvall)내 4℃에서 20분동안 5,000rpm으로 원심분리하여 유도후 4시간후에 침전되고, 배양 배지는 따라내었다.
세포를 프렌치-프레스(상품명)(SLM Instruments)를 사용하여 파괴시켰다. 20㎖ 파괴 완충액 B(20mM 인산 완충액, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, pH 7.2)내에 세포 침전물을 현탁시켰고, 1,500psi에서 2번의 프렌치-프레스 단계로 파괴시켰다. 불용성 세포 프랙션과 "봉입체"를 SS-34 로우터(Sorvall)내 4℃에서 30분동안 10,000rpm으로 원심분리를 계속하여 침전시키고, 상청액내 남아있는 용해성 대장균 단백질 또는 용해성 발현 생성물로부터 분리시켰다.
발현을 분석하기 위해, 동일 체적의 세포 파괴 프랙션을 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 코마시 브릴런트 블루로 염색하고 뿐만 아니라 MLB-특이면역혈청 TB33을 사용한 웨스턴 블롯으로 조사하였다(도 7b). 단일클론성 항체 TB33[토네비트스키 등, 1995]은 토네비트스키에 의해 제공되었다. 이들은 표준 기술을 사용하여 제조하였다. 상응하는 항체는 면역원으로서 ML-1 또는 MLB를 사용한 표준 기술로 당업자들에 의해 제조될 수 있다. 발현을 분석하기 위해, 대장균의 동일 체적의 용해성 프랙션(레인 2,4,6,8) 뿐만 아니라 불용성 "봉입체" 프랙션 (레인 1,3,5,7)을 그들의 rMLB 함량으로 조사하였다. 발현 과정을 설명하기 위해, 유전자 발현 유도후 샘플을 전(레인 1+2), 2시간(레인 3+4), 4시간(레인 5+6) 및 6시간(레인 7+8)으로 사용하였다. 발현은 발현 최대가 유도하고 4시간후에 이미 도달된 rMLB에 상응하는 면역반응성 31kDa 발현 생성물의 발생에 의해 유도후 1시간 후 특징화되었다. 유도후 4시간된 용해성 및 불용성 세포 파괴 프랙션상의 rMLB의 분포는 각 ~50%이며, 발현을 더 지속하여 불용성 "봉입체"의 형태로 발현된 rMLB를 축적시킨다.
(Ⅴ) 불용성 "봉입체"로부터 rMLB 분리
대장균 완전 세포 파피물의 침전물을 바비트 등[1990]의 20㎖ STET-완충액 (50mM Tris-HCl, 8% (w/v) 수크로오스, 50mM EDTA; 1.5% (v/v) 트리톤 X-100, pH 7.4)으로 각각 두번 세척하여 대장균 단백질을 제거하였다. 상기에 함유된 "봉입체"를 갖는 잔류 침전물은 진탕하면서 실온에서 16시간동안 배양하여 20㎖ 변성 완충액(6M 구아니디늄클로라이드, 100mM DTT, 50mM Tris-HCl, pH 8.0)에 용해시켰다.
rMLB를 재변성시키기 위해, 변성 완충액내 존재하는 단백질 용액을 90배 부피의 중첩 완충액(20mM 인산 완충액, 50mM KCl, 1mM EDTA, 100mM 글루코오스, 10% (v/v) 글리세롤, 10mM β-락토오스, pH 5.5)에 서서히 적상첨가하고, 교반하면서 실온에서 16시간동안 배양하였다. 침전된 단백질을 GS-3 로우터(Sorvall)내 4℃에서 30분동안 6,000rpm으로 원심분리하여 용해성, 중첩된 rMLG 프랙션으로부터 분리시켰다.
(Ⅵ) N-아세틸-D-갈락토오스아민 아가로스상에서 친화도 크로마토그래피에 의한 rMLB 분리
활성 탄수화물-결합 rMLB를 분리하기 위해, N-아세틸-갈락토오스아민 아가로스 친화성 기질(PIERCE, USA)을 10컬럼 베드 체적의 크로마토그래피 완충액(50mM 인산 완충액, 300mM NaCl, 1mM EDTA, 10% (v/v) 글리세롤, 0.05% (v/v) Tween(상품명)-20, pH 7.0)으로 평형시켰다. 4℃에서 적어도 2시간동안 rMLB-함유 시료 용액에서 친화성 기질을 배치 배양하여 상기 시료를 사용하였다. 크로마토그래피 완충액으로 친화성 기질을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 제거한후, pH 4.0의 크로마토그래피 완충액에서 0.3M N-아세틸-갈락토오스아민으로 경쟁적으로 치환시킴에 의해서 결합된 rMLB를 용출시켰다.
(Ⅶ) 홀로단백질을 제조하기 위한 겨우살이 렉틴 사슬의 실험관내 재결합
재조합 겨우살이 렉틴 홀로단백질(rML)은 분리되고 중첩된 겨우살이 렉틴 A 및 겨우살이 렉틴 B사슬로부터 시작하거나 또는 중첩에 의해 변성된 것으로부터 시작하여 제조될 수 있다.
분리되고 중첩된 단일 사슬을 재결합시키기 위해, 분리된 겨우살이 렉틴 B사슬(nMLB 또는 rMLB)을 20mM 인산 완충액, 50mM NaCl, 1mM EDTA; pH 7,2, 4℃에서 16-48시간동안 몰과량의 rMLA로 배양하였다. 내부사슬의 이황화 브릿지를 형성시키기 위해, 6mM 글루타티온(산화된 것에 대한 환원된 것의 비율 5:1) 또는 10mM 글루타티온(산화된 것에 대한 환원된 것의 비율 2:1)+1㎛ 단백질 이황화 이소머라아제(보에링거 만하임)의 산화환원 시스템의 존재내에서 상기 반응물을 배양시켰다.
중첩으로 변성된 단일 사슬로부터 재결합을 시작하기 위해, 6M 구아니디늄클로라이드, 2mM DTT, 50mM Tris-HCl, pH 8.0 내지 2mg/㎖의 농도에 rMLA사슬을 용해시켰다. 시스테인 잔기를 완전히 환원시키기 위해, 6M 구아니디늄 클로라이드, 100mM DTT; 50mM Tris-HCl, pH 8.0에 rMLB 사슬을 용해시키고, PD-10(Pharmacia, Sweden)상에서 겔 투과로 6M 구아니디늄 클로라이드, 50mM Tris-HCl, pH 8.0에 20분동안 실온에서 배양한 후, 재완충하고 200㎍/㎖의 농도로 조정하였다. 재결합은 몰과량의 rMLA로 rMBL를 중첩하고, 결합 완충액(50mM 인산 나트륨 완충액, 50mM KCl, 1mM EDTA; 10% (v/v) 글리세롤, 100mM 글루코오스, 20mM 락토오스, pH 8.0)에서 1:30으로 구아니디늄 용액을 천천히 희석시키고, 16시간동안 4℃에서 배양하여 실시하였다. 내부사슬 이황화 브릿지를 형성시키기 위해, 2mM 글루타티온(산화된 것에 대한 환원된 것의 비율 1:1)의 산화환원 시스템의 존재내에서 상기 반응물을 배양하였다.
상기 결합 반응물을 저장 완충액(50mM 인산 나트륨 완충액, 300mM NaCl, 1mM EDTA, 10% (v/v) 글리세롤, 0.05% (v/v) Tween(상품명)-20, PH 8.0)에 대해 투석하였다. 겨우살이 렉틴 A사슬(TA5) 또는 겨우살이 렉틴 B사슬(TB33)에 대한 특이적이고 단일클론성 항체를 사용하여 비환원조건하에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 상기 형성된 이종이량체를 분석하고 확인하였다. 형성된 홀로단백질을 분리하거나 유리 rMLA 또는 rMLA 집합물을 분리하는 것은 (Ⅵ)에 기술된 바와 같이 N-아세틸-갈락토오스아민 세파로오스 또는 락토실-아가로스상에서 친화도 크로마토그래피에 의 해서 실시되었다.
[실시예 8]
[rMLA 및 rMLB의 등전 균질성]
서발리트 프레네트(Servalyt PreNets) IEF-겔(pH 3-10, 125×125mm, 150㎛, Serva Heidelberg)상에서 IEF 단백질 표준(BioRad, USA)으로 1-2㎍ rMLA, 본래 존재하는 MLA, rMLB, 본래 존재하는 MLB 또는 ML 홀로단백질을 함께 모아놓았다. 분석하기 위해, 니트로셀룰로오스 막(0.2㎛, Schleicher ＆ Schull, Dassel)상에 반-건조 전기블롯팅으로 상기 단백질을 고정시켰다. rMLA 및 nMLA에 대한 단일클론성 MLA-특이성 항체(TA5, 토네비트스키 등, 1995)를 사용하거나 또는 rMLB, nMLB 및 ML 홀로단백질에 대한 단일클론성 MLB-특이적 항체(TB33, 토네비트스키 등, 1995)를 사용하여, 면역적 염색을 실시하였다. 알칼리성 포스파타아제와 결합된 항-쥐 IgG-IgG(시그마, 다이센호펜)를 사용하고, 기질 NBT 및 BCIP를 반응시켜 면역 복합물을 염색시켰다(도 8).
매우 정제된 식물 겨우살이 렉틴 A사슬 뿐만 아니라 매우 정제된 겨우살이 렉틴 B사슬이 5.2:5.4:5.5:6.2의 nMLA 및 7.1:7.3의 nMLB의 등전점을 갖는 등전적으로 불균질한 단백질인 반면, 6.8의 등전점을 갖는 재조합 rMLA사슬과 5.1의 등전점을 갖는 재조합 rMLB사슬은 균일한 단백질이다(도 8). 그러므로 재조합 겨우살이 렉틴 단백질의 균일한 이동성이 식물 겨우살이 렉틴의 미세이질성에 비해 rML의 균질성을 나타내는 반면, 본래 존재하는 ML 홀로단백질에 대한 다수의 이종성 분자 변이체가 있다(도 8 아래)
[실시예 9]
[rMLA의 효소적, 리보솜-불활성의 활성도 검출]
면역친화도 크로마토그래피에 의해 정제된 rMLA(재중첩) 및 rMLA(용해성) 뿐만 아니라 본래 존재하는 MLA 사슬(nMLA)의 단백질 농도는 BSA 표준을 사용하여 브래드포드[1976]에 따라 측정하였다.
MLA의 효소적 rRNA-N-글리코시다아제 활성을 검출 및 정량화하기 위해, 비방사성 시험 시스템은 "TNT 결합성 망상적혈구 시스템"(Promega, USA)을 사용하여 실시하였다. 반응당 같은 양(20㎕)의 TNT 시스템은 30℃에서 15분동안 전배양하였다. 해독 저해를 정량화하기 위해, 상응하는 완충액 20㎕를 반응 대조군에 첨가하고, 구배 MLA 희석액(농도범위 350-OpM) 2㎕를 시험 반응물에 첨가하였다. 각 반응으로부터 두개의 시료를 8분 간격으로 취하여 반응을 정지시키기 위해 액체질소내에서 동결시켰다. 해독 활성을 측정하는데 있어서, 상대적 루시퍼라아제 양(sqrt-cpm)을 섬광 계수기로 생물발광 시험에 의해 측정하였다. 각 반응에 대해 다른 시간에 취해진 시료의 sqrt-cpm의 차이는 상대 해독활성을 측정하여 계산되었다. RIP없이 반응 대조군내 활성은 0% 불활성율(IAR)로 설정되었다.
사용된 rMLA 농도에 대한 상대적인 해독 불활성율을 적용하여, 단백질 농도는 대조군 반응에 비해독 활성을 50% 저해하는 비선형 감소로 측정되었다. 상기 IC50값은 nMLA에 비해 rMLA(용해성), rMLB(재중첩)의 효소적 활성의 검출 및 정량화하는 시스템-의존적 값이다(도 9).
도 9는 재조합 MLA사슬의 효소적, 리보솜-불활성화 활성의 검출을 나타낸다. 용해성 발현 생성물 함량(rMLA 용해성)을 분리하고 "봉입체"로부터 분리된 단백질을 재중첩하여(rMLA 재중첩) 효소적으로 활성인 발현 생성물을 수득할 수 있다. rMLA(용해성) 및 rMLA(재중첩)는 10.7±1.3 pM 또는 15.6±6.6 pM의 IC50값을 갖는 활성을 나타낸다. 이들은 본래 존재하는 MLA사슬(IC501.1±0.7 pM)보다 더 낮은 독성 활성을 나타낸다.
[실시예 10]
[겨우살이 렉틴 B사슬의 탄수화물-결합 활성]
재조합 겨우살이 렉틴 B사슬의 탄수화물-결합 활성의 검출 뿐만 아니라 재조합과 식물 겨우살이 렉틴 B사슬의 탄수화물-결합 활성 및 특이성의 비교는 경쟁적인 탄수화물의 존재내에서 효소 결합 렉틴 분석(Enzyme Linked Lectin Assay, ELLA)으로 실시하였다. nMLB 및 rMLB사슬의 결합은 갈락토오스 및 N-아세틸-갈락토오스아민 잔기로 고정된 아시올로페투인 기질을 사용할 뿐만 아니라 시알산 잔기로 우세하게 고정된 페투인 기질을 사용하여 형성되었다.
탄수화물 기질을 고정시키기 위해, 11㎖ PBS내 1.1mg 아시올로페투인(시그마, 다이센호펜) 또는 1.1mg 페투인(시그마, 다이센호펜) 용액 100㎕을 Maxisorp C96 미세역가 플레이트(microtiter plate)(Nunc, 비에스바덴)의 웰로 옮기고, 실온에서 16시간동안 배양하였다. 미세역가 플레이트를 150㎕/웰 PBS-T(10mM 인산 나트륨 완충액, 130mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween(상품명)-20, pH 7.2)로 3번 세척한후, 비특이적인 결합 위치를 차단하기 위해 200㎕/웰 PBS-T-1% BSA(10mM 인산 나트륨 완충액, 130mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween(상품명)-20, 1% (w/v) BSA, pH 7.2)로 1시간동안 36℃에서 배양하고, 상기와 같이 세척하였다. 시험하기 위해 100㎕ B사슬을 함유하는 제제를 100-500ng/㎖, 바람직하게 400ng/㎖의 농도로 사용하였다. 상기 시험농도는 PBS-0.05% BSA(10mM 인산나트륨 완충액, 130mM NaCl, 0.05% (w/v) BSA, pH 7.2)내 시료를 희석하여 조정하였다. 시험당 농도 및 대조군 2-3개의 레플리카를 제조하였다. 상기 대조군은 PBS-0.05% BSA 또는 각 제제 완충액으로 측정하였다. 결합특성을 측정하기 위해, 유리되고 경쟁적인 당의 존재내에서 상기 시료를 배양하였다. 아시알로페투인 또는 페투인 기질에 대한 결합으로부터 rMLB, nMLB 또는 ML 홀로단백질의 치환을 위해, 바람직하게 0-28OmM 농도범위의 갈락토오스, 0-280mM 농도범위의 N-아세틸-갈락토오스아민, 0-140mM 농도범위의 락토오스 또는 0-140mM 농도범위의 시알산을 사용하였다.
상기 판은 부하후 2시간동안 36℃에서 배양하고, 상기와 같이 세척하였다. PBS-T-0.1% BSA-Tx(10mM 인산 나트륨 완충액, 130mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween(상품명)-20, 0 1% (w/v) BSA, 1% (v/v) Triton(상품명) X1OO, pH 7.2)내 혈청 풀의 100 ㎕/웰 염소 항-겨우살이 렉틴 혈청 희석액(1:19800)을 상기 부하된 웰에 첨가하고, 36℃에서 2시간동안 배양하고, 상기와 같이 세척하였다. 부하된 웰 당 면역 복합체를 분석하기 위해, 고추냉이 퍼옥시다아제(시그마, 다이센호펜)와 결합된 100㎕ 항-염소 IgG-IgG를 PBS-1% BSA(10mM 인산나트륨 완충액, 130mM NaCl, 1% (w/v) BSA, pH 7.2)내 1:3500 희석액에 첨가하고, 36℃에서 1시간동안 배양하였다. 상기 웰을 150㎕/웰 PBS-T로 6회 세척하였다. 현상을 위해, 100㎕/웰 기질 용액(25㎖ 65mM 시트르산 내 1 o-페닐렌 디아민 정제(시그마, 다이센호펜), pH 5.0+10㎕ 30% 과산화수소)을 첨가하고 암실에서 20분동안 실온에서 배양하였다. 100㎕/1 M 황산/ 웰을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 690nm의 참고파장으로 450nm에서 흡광측광법으로 평가하고, 4-매개변수 피트로 측정된 데이타를 설명하여 IC50값을 계산하였다.
도 10은 D-갈락토오스(도 10a), β-락토오스(도 1Ob) 또는 N-아세틸-갈락토오스아민(도 1Oc)의 양을 증가시켜 고정된 아시올로페투인 리간드로부터 rMLB 및 nMLB를 치환할 뿐만 아니라 ELLA 시스템에서 발견된 시알산(도 10d)의 양을 증가시켜 고정된 페투인 리간드를 치환한 값을 나타낸다. nMLB 및 rMLB의 결합특성은 반-최대 치환에 관계하여 IC50값으로 기술되어 있다.
식물 nMLB 사슬의 탄수화물 결합이 주로 갈락토오스(IC50=4.5mM)와 β-락토오스(IC50=4.9mM)에 의해 주로 경쟁할 수 있는 반면, 재조합 rMLB 사슬은 교체된 탄수화물-특성을 가진다. nMLB에 비해, rMLB의 탄수화물 결합 활성은 갈락토오스(IC50은 측정되지 않음)에 의해 경쟁할 수 없으며, β-락토오스(IC50〉70mM)에 의해 제한된다. 갈락토오스 및 β-락토오스에 대한 감소된 친화성으로부터 떨어져, 재조합 rMLB사슬은 N-아세틸-갈락토오스아민(IC50=109mM)에 대한 특이성을 차단시킨다. nMLB로 기술된 시알산 리간드에 대한 다른 결합활성은 또한 재조합 MLB 사슬에 대해 발견될 수 있었다(도 10d). 식물 nMLB 사슬(IC50=49.8mM) 및 재조합 rMLB사슬(IC50=47.1mM)에 있어서 동일한 결합 친화성이 발견되었다.
식물, 주로 갈락토오스/β-락토오스-특이적 nMLB사슬에 비해 재조합하여 제조된 rMLB사슬은 N-아세틸-갈락토오스아민/시알산 결합 방향으로 전이되는 구별된 탄수화물 특이성을 가진다.
[실시예 11]
[사람 임파구 백혈구상의 실험관내 재결합된 rML 홀로단백질의 세포독성 검출]
겨우살이 렉틴 홀로단백질의 보전은 사람 단일클론성 (임파구) 백혈구 세포 계통 MOLT-4(European Collection of Animal Cell Cultures No. 85011413)에 대한 세포독성을 정량적으로 분석함에 의해서 검출되었다.
MOLT-4 세포를 혈청-유리 MDC-1배지(PAN SYSTEMS, Aidenbach)에서 배양하고, 시험하기 위해 〉98%의 생활력에서 1.5×105MOLT-4 세포/㎖의 세포밀도로 조정하였다. 세포독성을 측정하기 위해, 96-웰 미세역가 플레이트의 웰당 18000세포/웰에 상응하는 MOLT-4 세포 현탁액 90㎕를 첨가하고 시료용액 10㎕과 혼합하였다.
시험을 위해, 겨우살이 렉틴 홀로단백질 제제(락토실 세파로오스를 사용한 표준 기술[프란츠 등, 1977]로 겨우살이 잎 또는 겨우살이 차로부터 분리된 배치 #220793(마드아우스)과 BRAIN 12/94) 뿐만 아니라 1-100pg/㎖의 농도범위로 실험관 내 재결합된 rML 홀로단백질을 MDC-1 세포 배양배지에서 제조된 희석 시리즈로 사용(1.6fM-1.66pM)하였다. 시료 농도 및 대조군 당 6개의 레플리카를 제조하였다.
상기 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 72시간동안 배양기에서 배양하였다. 세포독성 효과의 정량화는 상응하는 세포 분열 제제 WST-1(보에링거 만하임)를 사용한 WST-1방법[스쿠디에로(Scudiero) 등, 1988]에 따른 용해성 포르마잔 염료를 사용하고, 세포의 생활력을 측정하여 실시하였다.
재조합 홀로단백질 뿐만 아니라 키메르성 홀로단백질 rMLB/nMLB는 MOLT4-세포독성으로서 간주되는 약 10-30pg/㎖의 IC50값을 갖는 자연적으로 발생하는 단백질에 비해 동일한 생물학적 활성을 나타낸다. 그러나 상기 시험된 농도범위(rMLB 1ng/㎖ 미만)에서 rMLB는 세포독성 활성을 나타내지 않는다.
[실시예 12]
[재조합 겨우살이 렉틴(rML)에 의한 사람 단핵세포계 U937의 예를 나타내는 세포자멸 유도]
재조합 겨우살이 렉틴(rMLA/rMLB)에 의한 세포자멸 과정의 유도를 검출하는 것은 형광염료 DAPI[호츠(Hotz) 등, 1992]로 핵을 염색하여 실시한다. 핵 형태에 있어서 전형적인 세포자멸 변화는 현미경하에서 볼 수 있으며, 시료당 500-100개의 세포를 세어 정량화할 수 있다. 혈청 단백질이 있으면 렉틴의 양을 감소(10% FCS 에서 약 인자 40정도, 리베류-겡온 등, 1995)시키기 때문에 혈청이 없는 배지를 사용하여 민감도를 분석하는 것이 필수적이다. 세포독성 효과는 72시간후에 생활력 분석에서 명백히 볼 수 있으나 세포자멸은 더 일찍 발견될 수 있기 때문에, M0LT 분석으로 부분적으로 직접적인 상호 관계를 유도하는데 24시간이 걸린다. 배양시간이 너무 길면, 세포자멸은 2차 괴사에 의해 제거된다.
도 12는 재조합 ML 홀로단백질로 처리한후, 세포자멸 U937 세포의 비율이 증가되는 것을 나타낸다. 70pg/㎖에서 혈청이 없는 배지내 두개의 다른 배양물에서 24시간후 다수의 자멸 세포는 인자 3으로 증가한다. 본래 존재하는 단백질과 같은 재조합 겨우살이 렉틴[얀센 등, 1993]은 자멸 세포 치사를 유도할 수 있다.
[실시예 13]
[PBMC 모델내 재조합 겨우살이 렉틴의 면역촉진 효과]
시토킨 TNF-α(단핵세포, 대식세포) 및 IFN-γ(T 헬퍼세포)는 사람 면역 시스템의 복합 네트워크내에서 중앙 매개자이다.
건강한 혈액 주개로부터 사람 단일 클론성 세포(PBMC, 단핵세포와 임파구 함유)는 제작자(Pharmacia, Sweden)의 지시에 따라 FICOLL-PAQUE(상품명) 밀도구배 원심분리로 분리하였다. TNF-α의 방출을 유도하기 위해, 상기 세포(4×106단핵세포/㎖)는 가스가 공급되는 배양기내 U자형 미세역가 세포 배양물 플레이트내 〉95%의 상대습도, 5% CO2, 37℃에서 공동촉진 인자로서 Salmonella abortus equi로부터 재조합 겨우살이 렉틴 단백질 단독으로 18시간동안, 그리고 1㎍/㎖ 리포폴리사카라이드로 24시간동안 10% (v/v) 암송아지 혈청, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640배지에서 배양하였다. 그리고 TNF-α의 농도는 특정한 ELISA(겐자임 다이아그노스틱스, 뤼셀세임)에 의해 세포-유리 상청액에서 정량화되었다.
IFN-γ의 방출을 유도하기 위해, 상기 세포를 상기 기술한 바와 같은 공동촉진 인자로서 재조합 겨우살이 렉틴 단백질 단독으로 1시간동안, 그리고 0.5㎍/㎖ 파이토헤마글루티닌-L으로 65시간동안 상기된 배지에서 배양하였다. 그리고 IFN-γ의 농도는 각각 특정한 ELISA에 의해 세포-유리 상청액에서 정량화되었다(ENDOGEN INC., Cambridge, USA).
[실시예 14]
[피부2ZK1200 모델에서 재조합 겨우살이 렉틴의 면역촉진 효과]
바이오어세이로서 형성된 피부2모델은 2차 섬유아세포-함유 피부 및 저절로 분비된 기질에서 케라틴화되지 않은 케라틴세포로부터 구조 표피로 구성되어 있다[졸러(Joller)등, 1996]. 피부조직 조각(11×11 mm2, 사람으로부터 제조됨, 1차 세포; Advanced Tissue Sciences Inc. (ATS), La Jolla, USA)은 아가로스내 나일론 그리드상에서 제공되고, 수용체상에서 즉시 특이적 배지 A(ATS, La Jolla, USA)에 전달되었다.
IL-1α와 IL-6 모두는 사람 면역 시스템의 시토킨을 자극하는데 적절하다.
IL-1α와 IL-6의 분비를 유도하기 위해, 피부2조직조각을 12-컵 세포 배양물 플레이트(Corning Glass Works, Corning, USA)내 〉95%의 상대습도, 공기중 5% CO2, 37℃에서 24시간동안 특별한 배지 B(ATS; La Jolla, USA) 2㎖에서 시험물질과 함께 배양하였다. 그리고나서, IL-1α(퀀터킨 사람 IL-1α분석, R＆D 시스템 Inc., 미네아폴리스, USA)와 IL-6(h-인터로이킨 6 ELISA, 보에링거 만하임 GmbH)의 농도는 ELISA의 의해 세포-유리 상청액에서 정량화되었다.
피부2모델은 0.25-8 ng rML/㎖에 의해 유도된 IL-1α의 투여량 의존성 분비 및 0.5-8 ng rML/㎖로 유도된 IL-6의 투여량 의존성 분비에 의해 특징화되었다(도 14). 재조합 rMLB 사슬 단독으로 상기 시토킨을 방출할 수 없었다. 이는 면역촉진 활성이 주로 B사슬의 렉틴 활성에 영향을 주는 데 있어서 종래 기술에 절대적으로 반대되는 것이다[하즈토 등, 1990].
[실시예 15]
[재조합 겨우살이 렉틴 B사슬(rMLB)에 의한 면역적격성 세포 활성화]
면역적격성 세포의 활성화는 세포표면 단백질 CD69을 유도시켜 시험하였다. CD69는 종양에 대한 자연적 방어에 있어서 중심기능을 하는 종양 세포를 인식하여 분해하는 기능으로 인해 T세포, B세포 및 특히 자연 킬러세포(NK 세포)의 활성화후 제1 세포 표면 항원중 하나로서 나타난다. CD69는 세포표면 단백질이 나머지 임파구상에서 발현되지 않기 때문에, 상기 면역적격성 세포수의 활성화 마커이다. 그리고 유도가능한 CD69 표면 단백질에 있어서, NK 세포 및 TcRγ/δT세포의 세포분해성 활성을 위한 중심 기능이 발견될 수 있었다[모레타 등, 1991].
흐름 세포계량법(FACS)에 의해 사람 단일클론성 세포상의 표면 마커를 발견하기 위해, PBMC는 실시예 13과 유사하게 Hypaque(시그마)상에서 밀도 구배로 분리되었다. RPMI 160 배지내 세포를 5% FCS와 용해시키고, 미세역가 플레이트의 약 250000 세포/컵을 파종한후, 1, 10, 30 및 100 ng의 시험물질 rMLB와 함께 4시간동안 배양하였다. 얼음 배쓰내에서 형광-마커된 항-CD69 MAb로 20분동안 배양하고 5% FCS를 갖는 행크 용액(Hank's solution)으로 세척하였다. 침전된 라벨링된 세포를 200㎕ 쉬쓰액(Sheath Fluid)에 첨가하고 FACScan(Becton Dickinson)에서 측정하였다. 중간 형광물질은 세포당 CD69 세포 표면 마커의 수 뿐만 아니라 전체 세포수내 CD69-양성 세포의 분배에 상응하여 사용되었다.
1-100 ng/㎖의 농도범위에서, 세포표면상에서 CD69를 발생시키는 것에 관한 것 뿐만 아니라 CD69-양성 세포의 분배에 관해 핵 세포의 활성화를 발견할 수 있었다. 종모양의 투여량 의존 곡선이 관찰될 수 있었다. 본 실시예에서 시험된 PBMC 상의 세포독성 효과는 발견되지 않았으며, 100ng/㎖ rMLB의 고농도에서도 발견되지 않았다.

Claims (45)

  1. (a) 성숙후, 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 기능을 나타내고, 도 4c에 나타난 바와 같은 핵산서열을 갖는 전구프로단백질을 코딩하고;
    (b) 겨우살이 렉틴 이량체의 생물학적 활성 부분인 (a)에 따른 전구프로단백질의 단편을 코딩하고;
    (c) 유전자 코드의 변성도로 인해 (a) 또는 (b)에 따른 핵산분자와는 구별되고; 또는
    (d) 엄격한 조건하에서 (a), (b) 또는 (c)에 따른 핵산분자로 잡종화되고, (a) 또는 (b)에 지시된 생물학적 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편은 도 4a에 나타난 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 겨우살이 렉틴의 A사슬인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단편은 도 4b에 나타난 누클레오티드 서열에 의해 코딩되는 겨우살이 렉틴의 B사슬인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산분자는 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산분자는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자에 대해 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 핵산분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 제2항에 따른 핵산분자와 제3항에 따른 핵산분자 모두를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제7항에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 이. 콜리(E.coli) BL21.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 제9항에 따른 벡터에 의해 코딩되고, 제10항에 따른 이. 콜리 BL21에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 보통 비스쿰 알붐(Viscum album)에서 발생되지 않는 당부가와 같은 적어도 하나의 화학적 또는 효소적 변형을 나타내는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 하나의 단량체는 제2항에 따른 핵산분자에 의해 코딩되며, 제 2 단량체는 제3항에 따른 핵산분자에 의해 코딩되며, 상기 폴리펩티드 이량체는 제10항에 따른 이. 콜리 BL21에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 겨우살이 렉틴의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드 이량체.
  15. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단량체는 제12항에 따른 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 이량체.
  16. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 특이적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 Fab', F(ab)2또는 Fv 단편.
  17. 제10항에 따른 이. 콜리 BL21은 적당한 조건하에서 배양되고, 수득된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체가 분리되는 것을 특징으로 하는 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 제조하는 방법.
  18. 제12항 또는 제13항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체로 구성된 것을 특징으로 하는 항독소.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 그의 상보적인 가닥으로 특이적으로 잡종화시키는 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프라이머 쌍.
  20. (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자;
    (b) 제19항에 따른 프라이머 및/또는 프라이머 쌍; 및/또는
    (c) 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 겨우살이 렉틴 핵산 분자 및/또는 펩티드의 존재에 대해서 생물체를 선별하기 위한 진단용 조성물.
  21. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 식물 보호제.
  22. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
  23. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 기피제.
  24. 제4항에 따른 핵산분자에 대해 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  25. 제5항에 따른 핵산분자에 대해 안티센스 가닥인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  26. 제4항에 따른 적어도 하나의 핵산분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. 제5항에 따른 적어도 하나의 핵산분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  28. 제6항에 따른 적어도 하나의 핵산분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  29. 제8항에 있어서, 상기 벡터는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제8항에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 이. 콜리 BL21.
  31. 제9항에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 이. 콜리 BL21.
  32. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 제7항에 따른 벡터에 의해 코딩되고, 제10항에 따른 이. 콜리 BL21에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 핵산분자 또는 제8항에 따른 벡터에 의해 코딩되고, 제10항에 따른 이. 콜리 BL21에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  34. 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  35. 하나의 단량체는 제2항에 따른 핵산분자에 의해 코딩되며, 제 2 단량체는 제3항에 따른 핵산분자에 의해 코딩되며, 상기 폴리펩티드 이량체는 제10항에 따른 이. 콜리 BL21에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 겨우살이 렉틴의 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드 이량체.
  36. 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단량체는 제13항에 따른 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 이량체.
  37. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제14항에 따른 폴리펩티드 이량체를 특이적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는 Fab', F(ab)2또는 Fv 단편.
  38. 제10항에 따른 이. 콜리 BL21은 적당한 조건하에서 배양되고, 수득된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 이량체가 분리되는 것을 특징으로 하는 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 또는 제14항에 따른 폴리펩티드 이량체를 제조하는 방법.
  39. 제12항 또는 제13항에 따른 적어도 하나의 폴리펩티드 또는 제14항에 따른 폴리펩티드 이량체로 구성된 것을 특징으로 하는 항독소.
  40. 제4항에 따른 핵산분자 또는 그의 상보적인 가닥으로 특이적으로 잡종화시키는 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프라이머 쌍.
  41. 제5항에 따른 핵산분자 또는 그의 상보적인 가닥으로 특이적으로 잡종화시키는 것을 특징으로 하는 프라이머 또는 프라이머 쌍.
  42. (a) 제4항에 따른 핵산분자;
    (b) 제19항에 따른 프라이머 및/또는 프라이머 쌍; 및/또는
    (c) 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 겨우살이 렉틴 핵산 분자 및/또는 펩티드의 존재에 대해서 생물체를 선별하기 위한 진단용 조성물.
  43. (a) 제5항에 따른 핵산분자;
    (b) 제19항에 따른 프라이머 및/또는 프라이머 쌍; 및/또는
    (c) 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제15항에 따른 폴리펩티드 이량체를 적어도 함유하는 것을 특징으로 하는 겨우살이 렉틴 핵산 분자 및/또는 펩티드의 존재에 대해서 생물체를 선별하기 위한 진단용 조성물.
  44. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제14항에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제.
  45. 제12항 또는 제13항에 따른 폴리펩티드 및/또는 제14항에 따른 폴리펩티드 이량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 기피제.
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