JPH03503767A - 好中球活性化ペプチド‐2 - Google Patents
好中球活性化ペプチド‐2Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
好中球活性化ペプチド−2
本発明は、免疫調節物質に関るものである。
より具体的には、好中白血球、とりわけヒト好中白血球を活性化する免疫刺激因
子に関るものである。これは、今後、好中球刺激活性1(NSA−1)または、
同義的に好中球刺激ペプチド(NAP−2)と称する。
1、背景
好中白血球(好中球)は、最も一般的な白血球であり、ヒト血液中の白血球の約
2/3をしめる。これらは、宿主有機体を微生物感染から護るのが、主な機能で
ある。好中球は可動性であり、感染により引きおこされる走化性刺激に応答し、
感染した組織中に移動し、微生物を殺すことができる。微生物を殺すのは、好中
球が微生物をのみこみ、酵素ラジカルおよび殺微生物性酵素を放出する能力に依
存する。このような産生物の放出は、好中球の活性に依存する。
数種のタンパクが、このような活性を有していることは周知である。たとえば好
中球活性化因子(N A F XP−ペベリら、ジャーナル・オブ・エクスベリ
メンタル・メチ42216フ巻1547頁(1988年))であり、好中球活性
化ペプチド1(NAP−1)とも称せられる。
2、本発明の要旨
好中球刺激活性は、刺激を受けた培養白血球により産み出され、培養液から得る
ことができるということが、現在明らかになっている。好中球刺激活性は、本明
細書ではN5A−1または同義的に好中球活性化ペプチド−2(NAP−2)と
称する。
N5A−1/NAP−2は、構造的にはβ−スロンボグロプリン(β−TG)、
結合組織活性化ペプチドmccTAP−m)および血小板基礎タンパク(PBP
)に極めて類似していることも、明らかになっている。
本発明の目的は、さらに特性化することができる程度に十分に精製された、N5
A−1/NAP−2、またはこの生物学的活性を有するその機能的変種、フラグ
メントもしくは誘導体、たとえば突然変異タンパク、たとえば組み換えD N
A技法による製造、並びにその薬剤としての使用を提供することである。
本発明は、さらに、たとえばヒト血液白血球および/または血小板からN5A−
1/NAP−2を調製する方法を提供するものである。
本発明は、さらに、好中白血球の活性化およびそれに伴う、感染に対する抵抗性
の増強における、N5A−1/NAP−2の使用を提供するものである。
本発明は、さらに、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に内因性の天然の先導
配列を含有する対応する遺伝子のクローニングし、それを適当な宿主内で発現さ
せること、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用して、ペプチド産生物
を適当に回収することから成る組み換えDNA技法により、N5A−1/NAP
−2または、それの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体もしくはそれの生
物学的活性を有する構造相関物、たとえばβ−TGSCTAP−IIIもしくは
PBPc/)I製方法を提供するものである。
3、略語
BSA: ウシ血清アルブミンCTAP−m: 結合組織活性化ペプ
チド■DDS: ドデシル硫酸ナトリウムDTT: ジチ
オスレイトールfMLP: N−ホルミル−し−メチオニル−し−ロイシ
ル−し−フェニルアラニン
LPS: エシェリキア・コリ055:D5のリボ多糖類MEM:
イーグル最小必須培地(ゼロメト・ゲゼルシャフトーミット会ベシュレ
ンクテル・ハフランク、ミューニッヒ、西ドイツ)に25μ9/顧ネオマイシン
を加え、25a+M炭酸水素ナトリウムおよび20aMHEPESでpH7,4
に緩衝したものMEM−PPL: 1%低温殺菌血しょうタンパク液(5%P
PL−SRK、スイス赤十字研究所、ベルン、スイス)並びに100 I IJ
/xQペニシリンおよびストレプトマイシン(ギブコ・アクリチェンゲゼルシャ
フト、バーゼル、スイス)を含有したものMoAbs; モノクローナ
ル抗体mRN A : メッセンジ+−RNANAF: 好中球
活性化因子(=NAP−1)NAP−1: 好中球活性化ペプチド1(=N
AF)NAP−2: 好中球活性化ペプチド2(=NSA−1)NEM:
N−エチルマレイミドN5A−1: 好中球刺激活性1(=NA
P−2)PBP: 血小板塩基性タンパクPBS: Ca”
+およびMg++不含リン酸す緩衝生理食塩水PBS−BSA: 0.9mM
塩化カルシウム、0.49mM塩化マグネシウムおよび2.5x9/nρBSA
を加えたPBSPRP: 血小板に富む血しようPHA−P: 植
物性赤血球凝集素(ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシシッピー州、
米国)
P M N : 多形核細胞−好中球FMS F : フェニル
メタン−スルホニル−フルオライド5DS−PAGE: ドデシル硫酸ポリア
クリルアミドゲル電気泳動5SPE: 180mM塩化ナトリウム、1
0mMリン酸二水酸素水水素ウム、1mMEDTA%pH7,4β−TG:
β−スロンボグロプリン4、詳細な説明
N5A−1/NAP−2は、好中球活性化特性、とりわけ顆粒酵素放出を誘起す
るという生物学的特徴がある。分子の見地がら、NSA 1/NAP 2は
、分子量約7500、算出等電点的8.7という特徴を有する。
これは、刺激された血液白血球および/または血小板の培養液からのリン酸セル
ロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによる精製から成る方
法により、たとえばヒト血液白血球および/または血小板から産生ずる。
ヒト以外の種のN5AI/NAP 2は、対応する血液白血球および/または
血小板から、類似の方法で産生ずることができる。
刺激は、既知の任意の試薬、たとえばLPSおよびPHA−Pで行ってよい。
リン酸セルロースクロマトグラフィーは、たとえばリン酸カリウム/塩化ナトリ
ウム/EDTA/グリセロール緩衝液、おおよそ中性のpHまたとえばpH7,
2で平衡にしたリン酸セルロースカラムを用い、続いてたとえば同じ緩衝液中直
線的な塩化ナトリウム濃度勾配で溶出して行う。
逆相クロマトグラフィーは、リン酸セルロースクロマトグラフィーの後に行うの
が好ましく、最初に、予備逆相C4カラムを用い、たとえば、0.1%トリフル
オロ酢酸中、アセトニトリルを0〜80%勾配にした溶出液で溶出し、その後C
N−プロピルカラムを用い、たとえば0.1%トリフルオロ酢酸中、アセトニト
リル0〜80%勾配にしf二溶出液で溶出し、次いで、活性フラクションを、C
N−プロピルクロマトグラフィーで用いたのと同様な条件下で、分析用逆相C4
カラムに再び流すのが好ましい。
精製の経過は、第1a、lbおよびIcに示す。
精製したものは、引き続いて好中球刺激活性を、たとえばサイトカラシンB(B
、デヮルドおよびM、バギオリニ、バイオケミカル・77− マ:) ウジ−3
6巻2505〜2510頁(1987年))テ前処理したヒト好中球からのエラ
スターゼ放出誘起能カとして測定する。
N5A−1/NAP−2は、20%尿素−5DSポリアクリルアミドゲル電気泳
動によれば、約6500の見かけの分子量を有していることが明らかになった。
見かけの等電点は約8.3である。
アミノ酸配列分析によれば、最初の2ON−末端アミノ酸は、血小板基礎タンパ
ク(PBP)およびそれの構造誘導体CTAP−111(C1W、カスドールら
、PNAS80巻765〜769頁(1983年))およびβ−スロンボグロプ
リン(G、S、ベツグら、バイオケミストリ−17@1739〜1744頁(1
987年))の共通した部分の配列と正確に一致することが示された(第2図)
。N5A−1/NAP−2のアミノ末端は、CTAP−I[[のアミノ酸16お
よびβ−TGのアミノ酸12に対応する。カルボキシペプチダーゼYで分解する
と、C末端アミノ酸配列も同一(−G lu −S er −A la −A
sp)であることが示された。N5A−1/NAP−2はβ−TGの配列と完全
に並び、算出分子量は7628、算出等電点は8.7で70のアミノ酸から構成
される。70のアミノ酸の全配列は、第4図に示す。
N5A−1/NAP 2とNAF/NAP−1の全体の相同性は46%である
。N5A−1/NAP−2配列は、見かけ上、N−グリコジル化のための部位を
全く含まない。プロティンキナーゼCによるホスホリル化のための潜在的な部位
(Thr)が39位に、アミド化が可能な部位(Asp)が42位にある。
従って、N S A −1/ N A P −2は、β−TGのフラグメントで
あると考えられる。
N5A−1/NAP−2の配列は、NAF/NAP−1の配列と、2つの最初の
システィン残基に基づいて(NSA−1/NAP−2のCys5およびCys7
、並びにNAF/NAP IのCys7およびCys9)並べることができる
。このように並べた場合、N5A−1/NAP−2およびNAF’/NAP−1
の最初の20アミノ酸の約1/2が同一である。従って、2つの因子は、機能的
だけでなく、ある程度構造的にも相関している。
NSA 1/NAP 2のアミノ酸配列の入手可能性は、上述の天然資源か
らの単離に加え、別の方法による製造可能性をひらくことになる。すなわち、ペ
プチドは70アミノ酸しか含まないので、たとえばメリーフィールドの同相法を
用いて、および2個のジスルフィド結合の存在に必要な注意を払って、従来のや
り方で全合成が可能である。
別の産生方法には、所望によりコドンの最適化をした後で、たとえば対応する合
成遺伝子をクローニングおよび発現化する、組み換えDNA技法がある。遺伝子
をコード化したCTAP−I[[の化学合成および酵母中での発現については、
既に報告されており(G、T。
ムーレンバッハら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー261巻
719頁(1986年))、N5A−1/NAP−2のような関連したペプチド
の産生にも適用できる。しかし、生成したCTAP−mの一部しか生物学的活性
を有さない。折りたたみの誤り、およびジスルフィド結合が正しく形成されてい
ないことが、主な問題であったと思われる。この種の化合物の、このような先導
配列は既知ではないので、先導配列のDNAコードは、合成遺伝子中に組み込ま
れていなかった。
さらに、組み換えDNA技術による産生方法には、たとえば適当な発現ライブラ
リーから選択した相補的DNAのクローニングおよび発現化、並びにN5A−1
/NAP−2またはN5A−1/NAP−2を包含するより大きなペプチド、た
とえばβ−TGSCTAP−mもしくはPBPのコード化、および発現産生物か
ら常法によるN5A−1/NAP−2の回収により、天然の先導配列、たとえば
ヒト血小板に固有の天然先導配列を含有する遺伝子をクローニングおよび発現化
する方法がある。このような先導配列は、第5図の配列中では最初の34のアミ
ノ酸、またはそれの機能的フラグメントもしくは誘導体である。実施例7では、
ヒト血小板由来λgtl1発現ライブラリーから、CTAP−I[[の相補的D
N Aのコードのクローニングについて記載している。より大きな親ペプチド
から望ましいペプチド産生物の回収は、たとえば、常法により、セリンプロテア
ーゼなどのプロテアーゼで、より大きなペプチドを適当に短くきることにより行
うことができる。
適当なプロテアーゼは、たとえば常法により精製単球から単離できる。これは、
PMSFに対する感受性が高く、レウペチンには穏やかな感受性を示し、EDT
Aには感受性がない。
変法としては、先導配列を、望ましいペプチドの遺伝子コードに直接つけること
ができる。
天然の先導配列を含有する遺伝子のクローニングを行う調製の結果、十分な生物
学的活性を示すため、たとえば哺乳動物の細胞中で発現化した場合、α顆粒を標
的にするために適当な折りたたみを有するペプチド産生物ができる。
N5A−1/NAP−2の機能的なフラグメントまたは誘導体、たとえばムティ
ンは、当業界で既知の方法に従って調製できる。
いく分生勧学的活性を減じたNSA 1/NAP 2の3種の変種をも見出
されており、第4図で示された70のアミノ酸配列を宵しているが、対応するC
TAP−IIIのアミノ酸配列をそれぞれ3.4および5個、N末端で延長され
ている。すなわち、これらは各々、Asp −Leu −Tyr−1
Set−Asp−Leu−Tyr−およびA sp −S er −A sp
−L eu −T yr −で始まる、第4図で示した配列を有しており、長さ
は各々、73.74および75アミノ酸になる。
これらは、刺激された血液白血球および/または血小板からNAP−2の調製に
ついて上に記載されたように産生ずることができる。
すなわち、単球培養上清の存在下、LPSで刺激すると、NAP−2に加え、N
AP−2の73−75残基変種を含有する小さな中間ピークが得られる。この付
加的なピークは、74.75および73残基体により、各々65.20および1
5%まで作られる。
N5A−1/NAP−2並びにそれの機能的変種、フラグメントおよび誘導体は
、薬学的な使用を示唆する生物学的活性を有する。
たとえば、これらは、ラットにおいて動物の体重あたり約1μ9/に9〜約10
0μ9/に9の投与量で、好中球の浸入を誘起する。
従って、NSA l/NAP 2並びにそれの機能的変種、フラグメントお
よび誘導体は、PMN(多形核細胞−好中球)の数の変化または活性化状態によ
り、局所的または全身的に伴うかまたは引き起こされる症状の処置の使用に適用
される。これらは、このPMNパラメーターを広範に変化させ、それ故に、たと
えば細菌、マイクプラズマ、酵母および真菌、並びにウィルスの感染において、
PMNの数の増加や、活性状態の増強が臨床改善をもたらすような症状の処置の
ための使用に適用される。゛さらに、炎症性疾患たとえば乾癖、関節炎の症状お
よびぜん息、または好中球のカウントが異常に低い、および/または常時好中球
レベルが低い状態、並びにこれらの適用時に使用される拮抗物質、たとえばモノ
クローナル抗体の調製時の使用のために適用される。
これらは、NAP−1と同様、Tリンパ球に対して走化性をもつことが示されて
いるので、ある種の免疫不全状態における使用のためにも適用される。
これらの適用のために適した投与量は、もちろん、たとえば宿主、投与方法並び
に処置すべき状態の性質および重篤度に依存して変化させる。しかし、一般的に
、1日投与量が動物の体重あたり約1゜/に9〜約100 x9/に9で全身的
に満足のいく結果が得られる。対象がより大きい場合、1日投与量は、約0 、
1 Q〜約10029の範囲内であり、約0 、1 m9〜約10mgが好まし
く、たとえば1日4回までに分割して投与すると都合よい。
化合物を少なくとも1種の薬学的に許容できる担体または希釈物と組み合わせた
薬学的組成物は、常法で、薬学的に許容できる担体または希釈物と混合して製造
することができる。単位投与形態にはたとえば化合物は約0.025xg〜約5
0π9が含まれる。
N5A−1/NAP−2は、機能的にはNAP−1に大部分が類似しているにも
かかわらず、PBPおよび/またはCTAP−IIIを血小板から遊離した時に
、おそらくイン・ビボでしか発生できないが、一方、単核食細胞および組繊細胞
のさまざまな変種によるNAF/NAP−1の産生は、腫瘍壊死因子およびイン
ターロイキンlのような炎症性サイトキネースにより誘起される。従って、2種
のペプチドは、異なる生物学的状態で、および異なる部位で発生するにちがいな
い。NAP−2は、血小板に由来するので、主に血管内で産生され、その血管内
では、たとえば血栓およびアテローム性動脈硬化性障害時に、血小板の活性化お
よび凝集が起こるが、一方、NAF/NAP 1は組織中でほぼ定まって生成
する。
N5A−1/NAP−2およびそれの変種は、血小板または単核細胞培養の他の
成分からは見出されず、遊離に引き続いて産生されるようだ。これらは典型的な
走化性受容体作用物質の特性を呈し、NAF/NAP−1と同じモル濃度範囲で
、細胞質ゾル中の遊離カルシウムの変化、走化性およびエクソサイトーシスを引
き起こす。
一方、PBP、CTAP−[1およびPF−4は、100〜10000倍の高濃
度で、活性があるとしてもごくわずかである。これらは、好中球の補給において
、NAF/NAP lおよびC5aと同じように有効で、血栓症において、ふ
さがれた血管を再び通す働きをする好中球を集める役割を果たすであろうと期待
される。
5、図の説明
第1a図二 04カラムを用いた、N5A−1の予備逆相高圧液体クロマトグラ
フィー。上のグラフ:光学密度226r+n+におけるタンパクの分布:下のグ
ラフ:N5A−1の活性、ヒト好中球からの相対的なエラスターゼの放出。2本
のピークが明示:小さいピークは、N5A−1/NAP−2に相当し、大きいピ
ークはNAF/NAP−1に相当する。
第1b図: CN−プロピルカラムを用いた、N5A−1/NAP−2の逆相高
圧液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同様。
第1c図二 04カラムを用いた、N5A−1/NAP−2の逆相高圧液体クロ
マトグラフィー。詳細は第1a図と同様。
第2図: N5A−1/NAP−2のアミノ末端配列。最初の20残基を示
す。これらはβ−スロンボグロプリンの配列の一部に相当する。
第3図; サイトカラシンB処理ヒト好中球における、N5A−1/NAP−2
誘起エクソサイト〜シス。濃度依存的。
第4図: NSA 1/NAP 2のアミノ酸配列第5図: PBP(
ヌクレオチド103で開始)、CTAP−III(ヌクレオチド130で開始)
、β−TG(ヌクレオチド142で開始)、NSA 1/NAP−2(ヌクレ
オチド175で開始)の前駆体の相補的DNA配列および解読されたアミノ酸配
列。2個の内部のジスルフィド結合は、各々アステリスクおよび四角の印で示す
。ポリアデニル化信号が推定されるところ(ヌクレオチド581−586)は下
線で示す。EcoRI認識部位は上線で示す。
6、実施例
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものである。
第1部: ヒト血液からのNSA i/NAP 2の産生、精製および特性
化
実施例1: LPS刺激したヒト血液白血球および/または血小板による、N5
A−1/NAP−2の産生
スイス赤十字研究所から得られた供給血液は、抗凝固処理し、4〜lO℃で20
時間以内の保存のものを用いた。単核細胞(単球とリンパ球の構成比は約1:5
)は、単一の軟膜から、フィコール−ハイバーク勾配上に単離しくA、ボユム、
スカンド・ジェイ・イムツール、5巻9〜15頁(1976年))、MEMで洗
浄した。6個の軟膜から採った洗浄細胞を、MEM−PPLに再懸濁しく5xl
O@セル/lρ)、撹拌装置をつけたガラスビン中で、■μ9/R(lL P
Sの存在下、20時間培養した。経時的に培養液を採取し、好中球刺激活性を、
サイトカラシンBで前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出の誘起能力と
して測定した(B、デワルドおよびM、バギオリニ、バイオケミカル・ファーマ
クロジー36巻2505〜251O頁(1987年))。この試験より、N5A
−1およびNAFは、前述のとおり、好中球活性化因子であることが判明した(
P、ぺべりら、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン167巻1
547〜1559頁(1988年))。好中球刺激活性は経時的に増強し、24
〜48時間後に一定値に達した。
実施例2: PHA−P刺激したヒト血液白血球および/または血小板によるN
5A−1/NAP−2の産生スイス赤十字研究所から得た供給血液は、抗凝固処
理し、4〜IO℃で20時間以内の保存のものを用いた。単核細胞(単球および
リンパ球の構成比は約1=5)は単一のバッフイー・コートから、フィコール−
ハイバーク勾配上に単離しくボユム、1976年)、MEMで洗浄した。6個の
軟膜から採り洗浄した細胞を、MEM−P P L中に再懸濁(5X106セル
/jlQ)シ、撹拌装置をつけたガラスビン中で、5μg/1(2PHA−P存
在下20時間培養した。経時的に培養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカ
ラシンBで前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能力として測定し
た。好中球刺激活性は経時的に増強され、24〜48時間で一定値に達した。
実施例3:刺激したヒト血液白血球および/またはLPS刺激した血小板の培養
液からのN5A−1/NAP−2の精製a) リン酸セルロースクロマトグラフ
ィー実施例1記載のとおり刺激したヒト白血球の細胞で不含培養液700xQを
、緩衝液A(20mM塩化ナトリウム、1mMEDTAおよび5%グリセロール
を含有する20111Mリン酸カリウム緩衝液、PH7,2)で平衡にした15
i12リン酸セルロースカラム(ファツトマンpH)に直接入れた。カラムは同
じ緩衝液で洗浄し、緩衝液A中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配(0,02〜1
.5M)120x(で流出<24m(1/時間)した。各フラクシヨンは好中球
刺激活性を測定した。
b)逆相クロマトグラフィー
リン酸セルロースクロマトグラフィーによる分離により得られた、活性フラクシ
ョンは、貯蔵し、広孔予備逆相C4カラム(IQX250zx、7μ夏、マシェ
レイーナゲル、デュエレン、西ドイツ)に繰り返し流して、さらに精製した。カ
ラムは0.1%トリフルオロ酢酸中、0〜80%アセトニトリル勾配を0.66
%/分で増加させたものを用い、2好/分で溶出した。
保持時間20〜26分の活性フラクションは、貯蔵し、スピード・バック遠心で
濃縮し、分析用逆相CN−プロピルカラム(4,6x250■、5μ!、店長、
ベーカー・リサーチ・プロダクツ、フィリップスバーブ、ニュージューシー州、
米国)に入れる。カラムは0.1%トリフルオロ酢酸中O〜80%アセトニトリ
ル勾配を0.66%/分で増加させたものを用い、0 、5 R(1/分で流出
した。保持時間22〜25分の活性フラクションは、貯蔵し、濃縮し、分析用逆
相C4−カラム(4,6x 250xx、 5 μx、広孔店長−カー・リサー
チ・プロダクツ)に、CN−プロピルカラムの場合に記載した条件下で流した。
保持時間42.5分の活性フラクションは、スピード・バック遠心中で乾燥し、
無菌水に再懸濁した後、気相配列分析および生物学的試験に供した。第1図は、
NAP/NAP 1からのN5A−1/NAP−2の分離、およびアミノ酸配
列分析に用いたフラクションを示す。
実施例4:精製NSA I/NAP 2のゲル電気泳動精製したNSA
I/NAP−2は、20%尿素−9DSポリアクリルアミドゲルを用いて、B、
カデンバッハら、アナリティカル・バイオケミストリー129巻517〜521
頁(1983年)に準じて分析した。銀染色による発色により、見掛けの分子量
が65゜Oの単一のバンドが得られた。NAP−2はNAF/NAP−1よりわ
ずかに速く移動した。
実施例5: N5A−1/NAP−2のアミノ酸配列分析アミノ酸配列分析は、
アプライド・バイオシステムズ気相シークエンサーモデル477Aを用いた自動
フェニルイソチオシアン化勾配で行った。N5A−1/NAP−2の試料(50
0ピコモル)は、直接または化学修飾した後、適用した。還元およびアルキル化
は以下のとおり実施した:N5A−1/NAP−21ナノモルを6M塩酸グアニ
ジニウム、2a+M EDTA、0.2M)リス−塩酸、p)(8,3の溶液1
50μgに溶解し、アセトニトリル15μg中、トリブチルホスフィン225n
Cを加え、室温でインキュベートした。60分後、アセトニトリルlOμQ中、
4−ビニルピリジン160n(!を加えた。30分後、同量のトリブチルホスフ
ィンおよびビニルピリジンを加え、さらに40分、窒素存在下で反応を持続させ
た。溶液はトリフルオロ酢酸で、pH2,0まで酸性にし、アセトニトリル勾配
のある0、1%トリフルオロ酢酸中、逆相HPLCで脱塩した。
カルボキシ末端は、NAP−20,5ナノモルおよびカルボキシペプチダーゼP
またはカルボキシペプチダーゼY(配列決定用、ベーリンガー)0.4μgを用
いて決定した。
第2図は、最初の20アミノ末端アミノ酸を示す。
実施例6: N5A−1/NAP−2の好中球活性化効果好中球はヒト血液から
単離し、PBS/BSA中に懸濁し、次いで、デワルドおよびバギオリニのマイ
クロタイター・プレート・アッセイ法(1987年)を用いて、NSA 1/
NAP 2のエラスターゼ放出誘起能力の評価に用いた。N5A−1/NAP
−2は濃度依存的に選択的なエラスターゼ放出を誘起した。濃度依存性は、NA
F/NAP−1で観察されたものに類似しており、強度はNAFの場合の約]/
2、fMLPの場合の約1/3であった。
第3図は、N5A−1/NAP−2の、濃度依存的な活性を示す。
第■部:ヒト血小板由来λgtl1発現ライブラリからのCTAP−■の相補的
DNAコードのクローニング実施例7:
a)血小板の単離および洗浄
血小板は、クエン酸処理血液を1609で10分間遠心して単離し、血小板に富
む血しょう(プレートレット・リッチ・プラズマ:PRP)を得、さらに110
0fで10分間遠心にかけて血小板塊を得た。血小板は30ミリモル/12グル
コース、120ミリモル/Q塩化ナトリウム、129ミリモル/I2クエン酸ナ
トリウム、10ミリ−11,/12 EDTA、pH6,5の溶液で2回洗浄し
、lOミリモル/aトリス/塩酸、154ミリモル/Q塩化ナトリウム、10ミ
リモル/12 EDTASpH7,4の溶液で1回洗浄した。
b) ヒト巨核球
これらは、反核芽球性白血病の患者の末梢血から、フィコール−メトリシェード
密度勾配遠心により単離した。これら白血病性細胞の反核芽球の表現型は、血小
板GPIrb、 GPIIb/GPIIIの複合体および(vWF)フォノ・ウ
ィレブランド・ファクターに対する、モノクローナル抗体(MoAbs)との反
応性に基づいている。これらの細胞からのメツセンジャーRN A (m RN
A )とのノーイン・プロッティングにおいて、血小板GP Ibの相補的D
NAプローブを用いても、2.4kbのmRNA(血小板の場合と同じ大きさ)
との陽性の信号が得られた。
C)抗体の調製
洗浄した血小板は、N−エチルマレイミド(N E M )およびフェニルメタ
ン−スルホニルフルオライド(PMSF、メタノールに溶解)を各々最終濃度2
ミリモル/Qで存在する1%トリトンX−114に溶解し、バイオケム・バイオ
フィズ、アクタ778巻463頁(1984年)に記載のとおり、相分離を行っ
た。水相は、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(DDS)、0.1モル/a炭酸
水素アンモニウム、pH7,4の溶液を用いたAcA−34ウルトロゲル(LK
B)排除クロマトグラフィーに供した。8−9−にαの範囲でタンパクを含有す
るフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(SDS−PAGE)で評価されるように、ウサギの免疫化に用いた。
d) イムノブロッティング
脱顆粒産生物は、スロンビン刺激(2U/ 4 X 10 ”/xQ、5分、3
7℃)した洗浄血小板の上清から得られ、2ミリモル/QPMSFおよび2ミリ
モル/(NEMで処理した。これらを1%SDSに溶解し、0.1%ジチオスレ
イトール(DTT)で還元し、20%5DS−PAGEにより分離し、半乾燥エ
レクトロプロッターを用いて150mAで90分間、ニトロセルロース(BA8
5、シュライヒヤー&シュエル、フェルトバッハ、スイス)に電気泳動的に移し
た。
抗CTAP−nuウサギポリクロナール抗血清とインキュベートした後、アルカ
リ性フォスファターゼに結合したヤギ抗つサギ2次抗体(バイオ−ラド・ラボラ
トリーズ、グラットブルク、スイス)を、基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム
および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェートでの染色に用い
た。
e)相補的DNA発現ライブラリーの構成tsopの血液から採った血小板の全
RNA1よ、グアニジン塩酸法を用いて調製した。ポリAmRNlよ、第1ノゴ
(dT)セルロース(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)親和クロマトグ
ラフィー1こより単離した。1本目の鎖は、オリゴ(dT)ブライマー()7)
レマシアP−Lバイオケミカルズ)および逆転写酵素(ベセスダ・1ノサーチ・
ラボラトリーズ、ギブコ、/(−ゼル、スイス)を用L)て合成した。
2本目の鎖は、RNアーゼH(二ニー・イングランド・)くイオラブズ、シュバ
ルバツノ−・Iくイ・フランクフルト、西トイ゛ソ)およびエシェリキア・コリ
D N Aポリメラーゼ■(べ−1ノンガー・マンノ1イム、ロットクロイン、
スイス)で調製した。T4DNAボ1ツメラーゼおよびフレナラ酵素でプラント
末端を作り、EcoRIメチルイヒし、EcoRIリンカ−に連結した後、結果
的1こできる相補的DNIよ、λgtllパッケージング抽出物(ギガノくツク
・ゴールド、ストラツタジーン、サン・デイエゴ、カリフォルニア列()中(ニ
アくツケージし、エシェリキア・コリytoss中、増幅した。
血小板λgtll相補的DNA発現ライブラリーは、ポリクローナル・ウサギ抗
血清を用いる一般法で、ふるい分けした。エシェリキア・コリ特異的抗体は、ニ
トロセルロース結合した、エシェリキア・コリBNN97のリゼイトに免疫吸着
させて除去した。陽性組み換えファージは、イムノブロッティングの場合と同じ
2次抗体および色素原基質で検出した。精製した後、λ−DNAをEcoRI
(ベーリンガー・マンハイム)で分解し、挿入物は、0.8%アガロース・ゲル
電気泳動およびバイオ・トラップ(シュライヒャー&シュエル)中に電気溶出し
て単離した。DNAはエタノールで沈澱させ、T4リガーゼ(パイオーラブ)を
用いて5 ngE coRI直線化M13ブルースクリプト(ストラッタジーン
)に結合し、エシェリキア・コリJMIOIに導入した。白色コロニーは、アル
カリ性抽出法により、陽性組み換えプラスミドの試験を行い、1末鎖相補的D
N A鋳型は、M13KO7ヘルバーフアージで感染させて調製した。両方の鎖
のDNA配列は、シークエナーゼキット(ユナイテッド・ステーブ・バイオケミ
カル・コーポレーション)およびfisSα−標識化dATP(二ニー・イング
ランド・ニューフレアー、デュ・ボンド)を用いたジデオキシ鎖末端法により決
定した。
g)ノーイン・プロット分析
1%アガロースゲルで電気泳動を行った後、mRNAは、ハイボンドN(アメル
シャム)上にプロットし、次いでスルホニル化した相補的DNAプローブと、6
8℃で18時間、100μy/xρサケ精子DNAを含有する4XSSPE、0
.1%ニリン酸ナトリウム、0.2%SDS% o 、 5 mg/lρヘパリ
ン中でハイブリダイズした。lX5SPE、1%SDS、0.1%ユニリン酸ナ
トリウム中温で5分間の洗浄を2回行い、0.2xSSPESO,1%SDS、
0.1%ニリン酸ナトリウム中68℃で30分間の洗浄を2回行った後、対応す
るmRNAは、スルホニル化DNAに対するネズミのモノクロナール抗体(Mo
A B ; シグマ、ディーセンホーフェン、西ドイツ)およびアルカリ性ホス
ファターゼに結合したヤギ抗マウスIgG2次抗体で免疫染色し、検出した。基
質は上記と同一であった。
h)結果
8〜9Kdの範囲の血小板水溶性タンパクを含有するゲル濾過フラクションでウ
サギを免疫して産生じたポリクローナル抗体は、イムノプロット上で、高度な結
合活性および特異性を示し、血小板由来λgtll相浦的DNA発現ライブラリ
ーのふるい分けに用いた。
100000の最初にふるい分けされた組み換えファージからの2個の陽性のク
ローンが、精製されたプラークであり、2個の介在EcoRIフラグメントは、
M13ブルースクリプト(商標)中でサブクローン化した。両方の鎖のヌクレオ
チド配列は、ジデオキシ鎖末端法により決定した。690塩基対の全長の相補的
DNAクローン(λCT)が得られ(第5図)、これは66塩基対の5°非コ一
ド化部分、12Bアミノ酸残基(13894da)のタンパクをコード化する転
写解読枠および終止コドン(TAA)を含有する3′非コ一ド化部分、推定上の
ポリアデニル化信号、並びにポリAテールを含有していた。
相対位置−9で開始した2次クローン(λC2)は同一のヌクレオチド配列を示
した。
真核生物のmRNA(5’CCACCAUGA3°)における翻訳開始のコンセ
ンサス配列は、ヌクレオチド−5で始まる。
反核球性白血病セルライン、反核球、および血小板から採ったmRNAであって
、肝細胞コントロールからのmRNAではないものの、ノーイン・プロット・ハ
イブリダイゼーションにより、CTAP−■前駆体のllRNAの約Q 、 F
l kbの陽性信号が得られた。このことは、対応する相補的DNAが全長であ
ることを示している。HELmRNAでは信号は得られなかったが、これは恐ら
く、相補的DNAプローブのための非放射性標識化法の感受性が低く、および/
または用いたHELセルラインのCTAP−III特異的rIRNA含量が低い
ためであろう。
推測されるアミノ酸配列(第5図)は、ヒト血小板CTAP−mの十分に確立さ
れた配列と同一である。CTAP−IIIのアミノ末端は、翻訳された配列の4
4位のアミノ酸であり、ミトゲン的に不活性なプラスミンまたはトリプシン分解
産物β−スロンボグロプリンの開始部は、下流方向48位の4残基である。これ
らのタンパクの前駆体であるPBPは、CTAP−IIIの最初の10残基を共
有しているが、アミノ末端は上流方向35位の9残基であることが示されている
。これらの3種のタンパクに関する全ての既知の構造的な情報は、コード化した
相補的DNAクローンに由来するアミノ酸配列に、正確に合致する。このことは
、3種のタンパク全ての前駆体が単一のものであるという、強力な証拠になって
いる。
従って、第5図に示されたCTAP−mの34アミノ酸先導配列は、例外的に長
く、古典的なシグナルペプチドと異なり、恐らくタンパクを、成熟巨核球のα顆
粒に対する標的にする原因となる。
第1a図
フラクション番号
第1b図
フラクション番号
第1C図
フラクション番号
Figur@2
第3図
濃度(nM)
Figure 4
Ala−Glu−Lau−Arg−C)rs−Met−C)rg−工1*−Ly
s−Thr−Thr−5@r−Gユ)rJユ会−1i1g−Pro−Lys−^
5n−X1*−Gm−21:?5 30S@r−Lau
−Glu−Val−工1曇−Gly−Lys−Gly−τhr−Hls−Cys
−Asn−GTh−Val−Glu−Vd−X1m−AXa−Thr−L@u−
Lys−Asp−Gly−社g−Lys−工1e−C)rs−Leu−Asp−
Pro−Asp−ALa−Pro−社g−工1@−Lys−LysJ1a−Va
l−Gln−Lys−Lys−Lau−Ala−Gly−Asp−41,u−5
*r−ムla−AspFigur@5
S90 624国際調査報告
′1111“0ρCT/εP 89101389−r帥m−^teheaw*
l軸 PCT/εP 89101389国際調査報告
ン
エハー−3065ボルリゲン、フルう゛ソケル 四番エバー−3098ケニツ、
フエルドラインストラ゛ソセ 7
Claims (10)
- 1.好中球活性化ペプチド−2(NAP−2)またはそれの機能的変種、フラグ メントもしくは誘導体。
- 2.70アミノ酸配列: 【配列があります】 を有する請求項1記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘 導体。
- 3.リン酸セルロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによる 、刺激した血液白血球の培養液からの精製を含む、NSA−1/NAP−2の調 製方法。
- 4.天然の先導配列を含有する対応遺伝子をクローニングし、適当な宿主で遺伝 子を発現し、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用してペプチド産生物 を適当に回収することから成る、NSA−1/NAP−2もしくはそれの機能的 変種、フラグメントもしくは誘導体、またはそれの生物学的活性のある構造相関 物、たとえばβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPの調製方法。
- 5.請求項1記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体 を医薬的に許容できる担体または希釈液と共に含有して成る、医薬組成物。
- 6.医薬として使用するための、請求項1記載の因子またはそれの機能的変種、 フラグメントもしくは誘導体。
- 7.アミノ酸配列: 【配列があります】 を有する先導ペプチドまたはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
- 8.請求項1記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体 を、処置を必要とする対象に投与することから成る、処置方法。
- 9.請求項3または4記載の方法により得られる、請求項1記載の因子または機 能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
- 10.β−TG、CTAP−IIIもしくはPBPから、またはβ−TG、CT AP−IIIもしくはPBPをコード化した遺伝子から得られる、請求項1記載 の因子または機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
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