JPH03503767A

JPH03503767A - 好中球活性化ペプチド‐２

Info

Publication number: JPH03503767A
Application number: JP2500533A
Authority: JP
Inventors: バギオリニ、マルコ; クレメトソン、ケンネス・ヨハン; ワルツ、アルフレッド
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト; テオドール・コヘル・インスティテュート
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-11-17
Publication date: 1991-08-22
Anticipated expiration: 2015-06-12
Also published as: GR890100810A; KR910700260A; GB2231872A; CA2004685A1; AU634508B2; BE1003636A4; CH681625A5; NL8921262A; FR2640142A1; WO1990006321A1; SE9002589L; DK188690D0; GB2231872B; GB9011468D0; GR1000455B; AU4655689A; FR2640142B1; IL92557A0; JP3051160B2; DK188690A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】好中球活性化ペプチド−２本発明は、免疫調節物質に関るものである。

より具体的には、好中白血球、とりわけヒト好中白血球を活性化する免疫刺激因子に関るものである。これは、今後、好中球刺激活性１（ＮＳＡ−１）または、同義的に好中球刺激ペプチド（ＮＡＰ−２）と称する。

１、背景好中白血球（好中球）は、最も一般的な白血球であり、ヒト血液中の白血球の約２／３をしめる。これらは、宿主有機体を微生物感染から護るのが、主な機能である。好中球は可動性であり、感染により引きおこされる走化性刺激に応答し、感染した組織中に移動し、微生物を殺すことができる。微生物を殺すのは、好中球が微生物をのみこみ、酵素ラジカルおよび殺微生物性酵素を放出する能力に依存する。このような産生物の放出は、好中球の活性に依存する。

数種のタンパクが、このような活性を有していることは周知である。たとえば好中球活性化因子（Ｎ　Ａ　Ｆ　ＸＰ−ペベリら、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メチ４２２１６フ巻１５４７頁（１９８８年））であり、好中球活性化ペプチド１（ＮＡＰ−１）とも称せられる。

２、本発明の要旨好中球刺激活性は、刺激を受けた培養白血球により産み出され、培養液から得ることができるということが、現在明らかになっている。好中球刺激活性は、本明細書ではＮ５Ａ−１または同義的に好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）と称する。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２は、構造的にはβ−スロンボグロプリン（β−ＴＧ）、結合組織活性化ペプチドｍｃｃＴＡＰ−ｍ）および血小板基礎タンパク（ＰＢＰ）に極めて類似していることも、明らかになっている。

本発明の目的は、さらに特性化することができる程度に十分に精製された、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２、またはこの生物学的活性を有するその機能的変種、フラグメントもしくは誘導体、たとえば突然変異タンパク、たとえば組み換えＤ　Ｎ　Ａ技法による製造、並びにその薬剤としての使用を提供することである。

本発明は、さらに、たとえばヒト血液白血球および／または血小板からＮ５Ａ− １／ＮＡＰ−２を調製する方法を提供するものである。

本発明は、さらに、好中白血球の活性化およびそれに伴う、感染に対する抵抗性の増強における、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の使用を提供するものである。

本発明は、さらに、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に内因性の天然の先導配列を含有する対応する遺伝子のクローニングし、それを適当な宿主内で発現させること、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用して、ペプチド産生物を適当に回収することから成る組み換えＤＮＡ技法により、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ −２または、それの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体もしくはそれの生物学的活性を有する構造相関物、たとえばβ−ＴＧＳＣＴＡＰ−ＩＩＩもしくはＰＢＰｃ／）Ｉ製方法を提供するものである。

３、略語ＢＳＡ：　　　　　ウシ血清アルブミンＣＴＡＰ−ｍ：　　結合組織活性化ペプチド■ＤＤＳ：　　　　　　ドデシル硫酸ナトリウムＤＴＴ：　　　　　　ジチオスレイトールｆＭＬＰ：　　　　Ｎ−ホルミル−し−メチオニル−し−ロイシル−し−フェニルアラニンＬＰＳ：　　　　　　エシェリキア・コリ０５５：Ｄ５のリボ多糖類ＭＥＭ：　　　　　イーグル最小必須培地（ゼロメト・ゲゼルシャフトーミット会ベシュレンクテル・ハフランク、ミューニッヒ、西ドイツ）に２５μ９／顧ネオマイシンを加え、２５ａ＋Ｍ炭酸水素ナトリウムおよび２０ａＭＨＥＰＥＳでｐＨ７，４に緩衝したものＭＥＭ−ＰＰＬ：　　１％低温殺菌血しょうタンパク液（５％ＰＰＬ−ＳＲＫ、スイス赤十字研究所、ベルン、スイス）並びに１００　Ｉ　ＩＪ／ｘＱペニシリンおよびストレプトマイシン（ギブコ・アクリチェンゲゼルシャフト、バーゼル、スイス）を含有したものＭｏＡｂｓ；　　　　　モノクローナル抗体ｍＲＮ　Ａ　：　　　　メッセンジ＋−ＲＮＡＮＡＦ：　　　　　好中球活性化因子（＝ＮＡＰ−１）ＮＡＰ−１：　　　好中球活性化ペプチド１（＝ＮＡＦ）ＮＡＰ−２：　　　好中球活性化ペプチド２（＝ＮＳＡ−１）ＮＥＭ：　　　　　　Ｎ−エチルマレイミドＮ５Ａ−１：　　　好中球刺激活性１（＝ＮＡＰ−２）ＰＢＰ：　　　　　血小板塩基性タンパクＰＢＳ：　　　　　　Ｃａ” ＋およびＭｇ＋＋不含リン酸す緩衝生理食塩水ＰＢＳ−ＢＳＡ：　　０．９ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭ塩化マグネシウムおよび２．５ｘ９／ｎρＢＳＡを加えたＰＢＳＰＲＰ：　　　　　血小板に富む血しようＰＨＡ−Ｐ：　　　植物性赤血球凝集素（ディフコ・ラボラトリーズ、デトロイト、ミシシッピー州、米国）Ｐ　Ｍ　Ｎ　：　　　　　多形核細胞−好中球ＦＭＳ　Ｆ　：　　　　フェニルメタン−スルホニル−フルオライド５ＤＳ−ＰＡＧＥ：　　ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動５ＳＰＥ：　　　　　１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸二水酸素水水素ウム、１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ７，４β−ＴＧ：　　　β−スロンボグロプリン４、詳細な説明Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２は、好中球活性化特性、とりわけ顆粒酵素放出を誘起するという生物学的特徴がある。分子の見地がら、ＮＳＡ　　１／ＮＡＰ　　２は、分子量約７５００、算出等電点的８．７という特徴を有する。

これは、刺激された血液白血球および／または血小板の培養液からのリン酸セルロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによる精製から成る方法により、たとえばヒト血液白血球および／または血小板から産生ずる。

ヒト以外の種のＮ５ＡＩ／ＮＡＰ　　２は、対応する血液白血球および／または血小板から、類似の方法で産生ずることができる。

刺激は、既知の任意の試薬、たとえばＬＰＳおよびＰＨＡ−Ｐで行ってよい。

リン酸セルロースクロマトグラフィーは、たとえばリン酸カリウム／塩化ナトリウム／ＥＤＴＡ／グリセロール緩衝液、おおよそ中性のｐＨまたとえばｐＨ７，２で平衡にしたリン酸セルロースカラムを用い、続いてたとえば同じ緩衝液中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配で溶出して行う。

逆相クロマトグラフィーは、リン酸セルロースクロマトグラフィーの後に行うのが好ましく、最初に、予備逆相Ｃ４カラムを用い、たとえば、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルを０〜８０％勾配にした溶出液で溶出し、その後ＣＮ−プロピルカラムを用い、たとえば０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０〜８０％勾配にしｆ二溶出液で溶出し、次いで、活性フラクションを、ＣＮ−プロピルクロマトグラフィーで用いたのと同様な条件下で、分析用逆相Ｃ４カラムに再び流すのが好ましい。

精製の経過は、第１ａ、ｌｂおよびＩｃに示す。

精製したものは、引き続いて好中球刺激活性を、たとえばサイトカラシンＢ（Ｂ、デヮルドおよびＭ、バギオリニ、バイオケミカル・７７−　マ：）　ウジ−３６巻２５０５〜２５１０頁（１９８７年））テ前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能カとして測定する。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２は、２０％尿素−５ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、約６５００の見かけの分子量を有していることが明らかになった。

見かけの等電点は約８．３である。

アミノ酸配列分析によれば、最初の２ＯＮ−末端アミノ酸は、血小板基礎タンパク（ＰＢＰ）およびそれの構造誘導体ＣＴＡＰ−１１１（Ｃ１Ｗ、カスドールら、ＰＮＡＳ８０巻７６５〜７６９頁（１９８３年））およびβ−スロンボグロプリン（Ｇ、Ｓ、ベツグら、バイオケミストリ−１７＠１７３９〜１７４４頁（１９８７年））の共通した部分の配列と正確に一致することが示された（第２図）。Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２のアミノ末端は、ＣＴＡＰ−Ｉ［［のアミノ酸１６およびβ−ＴＧのアミノ酸１２に対応する。カルボキシペプチダーゼＹで分解すると、Ｃ末端アミノ酸配列も同一（−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｐ）であることが示された。Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２はβ−ＴＧの配列と完全に並び、算出分子量は７６２８、算出等電点は８．７で７０のアミノ酸から構成される。７０のアミノ酸の全配列は、第４図に示す。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ　　２とＮＡＦ／ＮＡＰ−１の全体の相同性は４６％である。Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２配列は、見かけ上、Ｎ−グリコジル化のための部位を全く含まない。プロティンキナーゼＣによるホスホリル化のための潜在的な部位（Ｔｈｒ）が３９位に、アミド化が可能な部位（Ａｓｐ）が４２位にある。

従って、Ｎ　Ｓ　Ａ　−１／　Ｎ　Ａ　Ｐ　−２は、β−ＴＧのフラグメントであると考えられる。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の配列は、ＮＡＦ／ＮＡＰ−１の配列と、２つの最初のシスティン残基に基づいて（ＮＳＡ−１／ＮＡＰ−２のＣｙｓ５およびＣｙｓ７、並びにＮＡＦ／ＮＡＰ　　ＩのＣｙｓ７およびＣｙｓ９）並べることができる。このように並べた場合、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２およびＮＡＦ’／ＮＡＰ−１の最初の２０アミノ酸の約１／２が同一である。従って、２つの因子は、機能的だけでなく、ある程度構造的にも相関している。

ＮＳＡ　　１／ＮＡＰ　　２のアミノ酸配列の入手可能性は、上述の天然資源からの単離に加え、別の方法による製造可能性をひらくことになる。すなわち、ペプチドは７０アミノ酸しか含まないので、たとえばメリーフィールドの同相法を用いて、および２個のジスルフィド結合の存在に必要な注意を払って、従来のやり方で全合成が可能である。

別の産生方法には、所望によりコドンの最適化をした後で、たとえば対応する合成遺伝子をクローニングおよび発現化する、組み換えＤＮＡ技法がある。遺伝子をコード化したＣＴＡＰ−Ｉ［［の化学合成および酵母中での発現については、既に報告されており（Ｇ、Ｔ。

ムーレンバッハら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー２６１巻７１９頁（１９８６年））、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２のような関連したペプチドの産生にも適用できる。しかし、生成したＣＴＡＰ−ｍの一部しか生物学的活性を有さない。折りたたみの誤り、およびジスルフィド結合が正しく形成されていないことが、主な問題であったと思われる。この種の化合物の、このような先導配列は既知ではないので、先導配列のＤＮＡコードは、合成遺伝子中に組み込まれていなかった。

さらに、組み換えＤＮＡ技術による産生方法には、たとえば適当な発現ライブラリーから選択した相補的ＤＮＡのクローニングおよび発現化、並びにＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２またはＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２を包含するより大きなペプチド、たとえばβ−ＴＧＳＣＴＡＰ−ｍもしくはＰＢＰのコード化、および発現産生物から常法によるＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の回収により、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に固有の天然先導配列を含有する遺伝子をクローニングおよび発現化する方法がある。このような先導配列は、第５図の配列中では最初の３４のアミノ酸、またはそれの機能的フラグメントもしくは誘導体である。実施例７では、ヒト血小板由来λｇｔｌ１発現ライブラリーから、ＣＴＡＰ−Ｉ［［の相補的Ｄ　Ｎ　Ａのコードのクローニングについて記載している。より大きな親ペプチドから望ましいペプチド産生物の回収は、たとえば、常法により、セリンプロテアーゼなどのプロテアーゼで、より大きなペプチドを適当に短くきることにより行うことができる。

適当なプロテアーゼは、たとえば常法により精製単球から単離できる。これは、ＰＭＳＦに対する感受性が高く、レウペチンには穏やかな感受性を示し、ＥＤＴＡには感受性がない。

変法としては、先導配列を、望ましいペプチドの遺伝子コードに直接つけることができる。

天然の先導配列を含有する遺伝子のクローニングを行う調製の結果、十分な生物学的活性を示すため、たとえば哺乳動物の細胞中で発現化した場合、α顆粒を標的にするために適当な折りたたみを有するペプチド産生物ができる。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の機能的なフラグメントまたは誘導体、たとえばムティンは、当業界で既知の方法に従って調製できる。

いく分生勧学的活性を減じたＮＳＡ　　１／ＮＡＰ　　２の３種の変種をも見出されており、第４図で示された７０のアミノ酸配列を宵しているが、対応するＣＴＡＰ−ＩＩＩのアミノ酸配列をそれぞれ３．４および５個、Ｎ末端で延長されている。すなわち、これらは各々、Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ−１Ｓｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−およびＡ　ｓｐ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｓｐ　 −Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ　−で始まる、第４図で示した配列を有しており、長さは各々、７３．７４および７５アミノ酸になる。

これらは、刺激された血液白血球および／または血小板からＮＡＰ−２の調製について上に記載されたように産生ずることができる。

すなわち、単球培養上清の存在下、ＬＰＳで刺激すると、ＮＡＰ−２に加え、ＮＡＰ−２の７３−７５残基変種を含有する小さな中間ピークが得られる。この付加的なピークは、７４．７５および７３残基体により、各々６５．２０および１５％まで作られる。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２並びにそれの機能的変種、フラグメントおよび誘導体は、薬学的な使用を示唆する生物学的活性を有する。

たとえば、これらは、ラットにおいて動物の体重あたり約１μ９／に９〜約１００μ９／に９の投与量で、好中球の浸入を誘起する。

従って、ＮＳＡ　　ｌ／ＮＡＰ　　２並びにそれの機能的変種、フラグメントおよび誘導体は、ＰＭＮ（多形核細胞−好中球）の数の変化または活性化状態により、局所的または全身的に伴うかまたは引き起こされる症状の処置の使用に適用される。これらは、このＰＭＮパラメーターを広範に変化させ、それ故に、たとえば細菌、マイクプラズマ、酵母および真菌、並びにウィルスの感染において、ＰＭＮの数の増加や、活性状態の増強が臨床改善をもたらすような症状の処置のための使用に適用される。゛さらに、炎症性疾患たとえば乾癖、関節炎の症状およびぜん息、または好中球のカウントが異常に低い、および／または常時好中球レベルが低い状態、並びにこれらの適用時に使用される拮抗物質、たとえばモノクローナル抗体の調製時の使用のために適用される。

これらは、ＮＡＰ−１と同様、Ｔリンパ球に対して走化性をもつことが示されているので、ある種の免疫不全状態における使用のためにも適用される。

これらの適用のために適した投与量は、もちろん、たとえば宿主、投与方法並びに処置すべき状態の性質および重篤度に依存して変化させる。しかし、一般的に、１日投与量が動物の体重あたり約１゜／に９〜約１００　ｘ９／に９で全身的に満足のいく結果が得られる。対象がより大きい場合、１日投与量は、約０　、１　Ｑ〜約１００２９の範囲内であり、約０　、１　ｍ９〜約１０ｍｇが好ましく、たとえば１日４回までに分割して投与すると都合よい。

化合物を少なくとも１種の薬学的に許容できる担体または希釈物と組み合わせた薬学的組成物は、常法で、薬学的に許容できる担体または希釈物と混合して製造することができる。単位投与形態にはたとえば化合物は約０．０２５ｘｇ〜約５０π９が含まれる。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２は、機能的にはＮＡＰ−１に大部分が類似しているにもかかわらず、ＰＢＰおよび／またはＣＴＡＰ−ＩＩＩを血小板から遊離した時に、おそらくイン・ビボでしか発生できないが、一方、単核食細胞および組繊細胞のさまざまな変種によるＮＡＦ／ＮＡＰ−１の産生は、腫瘍壊死因子およびインターロイキンｌのような炎症性サイトキネースにより誘起される。従って、２種のペプチドは、異なる生物学的状態で、および異なる部位で発生するにちがいない。ＮＡＰ−２は、血小板に由来するので、主に血管内で産生され、その血管内では、たとえば血栓およびアテローム性動脈硬化性障害時に、血小板の活性化および凝集が起こるが、一方、ＮＡＦ／ＮＡＰ　　１は組織中でほぼ定まって生成する。

Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２およびそれの変種は、血小板または単核細胞培養の他の成分からは見出されず、遊離に引き続いて産生されるようだ。これらは典型的な走化性受容体作用物質の特性を呈し、ＮＡＦ／ＮＡＰ−１と同じモル濃度範囲で、細胞質ゾル中の遊離カルシウムの変化、走化性およびエクソサイトーシスを引き起こす。

一方、ＰＢＰ、ＣＴＡＰ−［１およびＰＦ−４は、１００〜１００００倍の高濃度で、活性があるとしてもごくわずかである。これらは、好中球の補給において、ＮＡＦ／ＮＡＰ　　ｌおよびＣ５ａと同じように有効で、血栓症において、ふさがれた血管を再び通す働きをする好中球を集める役割を果たすであろうと期待される。

５、図の説明第１ａ図二　０４カラムを用いた、Ｎ５Ａ−１の予備逆相高圧液体クロマトグラフィー。上のグラフ：光学密度２２６ｒ＋ｎ＋におけるタンパクの分布：下のグラフ：Ｎ５Ａ−１の活性、ヒト好中球からの相対的なエラスターゼの放出。２本のピークが明示：小さいピークは、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２に相当し、大きいピークはＮＡＦ／ＮＡＰ−１に相当する。

第１ｂ図：　ＣＮ−プロピルカラムを用いた、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の逆相高圧液体クロマトグラフィー。詳細は第１ａ図と同様。

第１ｃ図二　０４カラムを用いた、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の逆相高圧液体クロマトグラフィー。詳細は第１ａ図と同様。

第２図：　　　Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２のアミノ末端配列。最初の２０残基を示す。これらはβ−スロンボグロプリンの配列の一部に相当する。

第３図；　サイトカラシンＢ処理ヒト好中球における、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２誘起エクソサイト〜シス。濃度依存的。

第４図：　　ＮＳＡ　　１／ＮＡＰ　　２のアミノ酸配列第５図：　　ＰＢＰ（ヌクレオチド１０３で開始）、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ（ヌクレオチド１３０で開始）、β−ＴＧ（ヌクレオチド１４２で開始）、ＮＳＡ　　１／ＮＡＰ−２（ヌクレオチド１７５で開始）の前駆体の相補的ＤＮＡ配列および解読されたアミノ酸配列。２個の内部のジスルフィド結合は、各々アステリスクおよび四角の印で示す。ポリアデニル化信号が推定されるところ（ヌクレオチド５８１−５８６）は下線で示す。ＥｃｏＲＩ認識部位は上線で示す。

６、実施例以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものである。

第１部：　ヒト血液からのＮＳＡ　　ｉ／ＮＡＰ　　２の産生、精製および特性化実施例１：　ＬＰＳ刺激したヒト血液白血球および／または血小板による、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の産生スイス赤十字研究所から得られた供給血液は、抗凝固処理し、４〜ｌＯ℃で２０時間以内の保存のものを用いた。単核細胞（単球とリンパ球の構成比は約１：５）は、単一の軟膜から、フィコール−ハイバーク勾配上に単離しくＡ、ボユム、スカンド・ジェイ・イムツール、５巻９〜１５頁（１９７６年））、ＭＥＭで洗浄した。６個の軟膜から採った洗浄細胞を、ＭＥＭ−ＰＰＬに再懸濁しく５ｘｌＯ＠セル／ｌρ）、撹拌装置をつけたガラスビン中で、■μ９／Ｒ（ｌＬ　Ｐ　Ｓの存在下、２０時間培養した。経時的に培養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカラシンＢで前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出の誘起能力として測定した（Ｂ、デワルドおよびＭ、バギオリニ、バイオケミカル・ファーマクロジー３６巻２５０５〜２５１Ｏ頁（１９８７年））。この試験より、Ｎ５Ａ −１およびＮＡＦは、前述のとおり、好中球活性化因子であることが判明した（Ｐ、ぺべりら、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディスン１６７巻１５４７〜１５５９頁（１９８８年））。好中球刺激活性は経時的に増強し、２４〜４８時間後に一定値に達した。

実施例２：　ＰＨＡ−Ｐ刺激したヒト血液白血球および／または血小板によるＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の産生スイス赤十字研究所から得た供給血液は、抗凝固処理し、４〜ＩＯ℃で２０時間以内の保存のものを用いた。単核細胞（単球およびリンパ球の構成比は約１＝５）は単一のバッフイー・コートから、フィコール− ハイバーク勾配上に単離しくボユム、１９７６年）、ＭＥＭで洗浄した。６個の軟膜から採り洗浄した細胞を、ＭＥＭ−Ｐ　Ｐ　Ｌ中に再懸濁（５Ｘ１０６セル／ｊｌＱ）シ、撹拌装置をつけたガラスビン中で、５μｇ／１（２ＰＨＡ−Ｐ存在下２０時間培養した。経時的に培養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカラシンＢで前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能力として測定した。好中球刺激活性は経時的に増強され、２４〜４８時間で一定値に達した。

実施例３：刺激したヒト血液白血球および／またはＬＰＳ刺激した血小板の培養液からのＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の精製ａ）　リン酸セルロースクロマトグラフィー実施例１記載のとおり刺激したヒト白血球の細胞で不含培養液７００ｘＱを、緩衝液Ａ（２０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡおよび５％グリセロールを含有する２０１１１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ＰＨ７，２）で平衡にした１５ｉ１２リン酸セルロースカラム（ファツトマンｐＨ）に直接入れた。カラムは同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液Ａ中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配（０，０２〜１．５Ｍ）１２０ｘ（で流出＜２４ｍ（１／時間）した。各フラクシヨンは好中球刺激活性を測定した。

ｂ）逆相クロマトグラフィーリン酸セルロースクロマトグラフィーによる分離により得られた、活性フラクションは、貯蔵し、広孔予備逆相Ｃ４カラム（ＩＱＸ２５０ｚｘ、７μ夏、マシェレイーナゲル、デュエレン、西ドイツ）に繰り返し流して、さらに精製した。カラムは０．１％トリフルオロ酢酸中、０〜８０％アセトニトリル勾配を０．６６％／分で増加させたものを用い、２好／分で溶出した。

保持時間２０〜２６分の活性フラクションは、貯蔵し、スピード・バック遠心で濃縮し、分析用逆相ＣＮ−プロピルカラム（４，６ｘ２５０■、５μ！、店長、ベーカー・リサーチ・プロダクツ、フィリップスバーブ、ニュージューシー州、米国）に入れる。カラムは０．１％トリフルオロ酢酸中Ｏ〜８０％アセトニトリル勾配を０．６６％／分で増加させたものを用い、０　、５　Ｒ（１／分で流出した。保持時間２２〜２５分の活性フラクションは、貯蔵し、濃縮し、分析用逆相Ｃ４−カラム（４，６ｘ　２５０ｘｘ、　５　μｘ、広孔店長−カー・リサーチ・プロダクツ）に、ＣＮ−プロピルカラムの場合に記載した条件下で流した。

保持時間４２．５分の活性フラクションは、スピード・バック遠心中で乾燥し、無菌水に再懸濁した後、気相配列分析および生物学的試験に供した。第１図は、ＮＡＰ／ＮＡＰ　　１からのＮ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の分離、およびアミノ酸配列分析に用いたフラクションを示す。

実施例４：精製ＮＳＡ　　Ｉ／ＮＡＰ　　２のゲル電気泳動精製したＮＳＡ　　Ｉ／ＮＡＰ−２は、２０％尿素−９ＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、Ｂ、カデンバッハら、アナリティカル・バイオケミストリー１２９巻５１７〜５２１頁（１９８３年）に準じて分析した。銀染色による発色により、見掛けの分子量が６５゜Ｏの単一のバンドが得られた。ＮＡＰ−２はＮＡＦ／ＮＡＰ−１よりわずかに速く移動した。

実施例５：　Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２のアミノ酸配列分析アミノ酸配列分析は、アプライド・バイオシステムズ気相シークエンサーモデル４７７Ａを用いた自動フェニルイソチオシアン化勾配で行った。Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の試料（５００ピコモル）は、直接または化学修飾した後、適用した。還元およびアルキル化は以下のとおり実施した：Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２１ナノモルを６Ｍ塩酸グアニジニウム、２ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ、０．２Ｍ）リス−塩酸、ｐ）（８，３の溶液１５０μｇに溶解し、アセトニトリル１５μｇ中、トリブチルホスフィン２２５ｎＣを加え、室温でインキュベートした。６０分後、アセトニトリルｌＯμＱ中、４−ビニルピリジン１６０ｎ（！を加えた。３０分後、同量のトリブチルホスフィンおよびビニルピリジンを加え、さらに４０分、窒素存在下で反応を持続させた。溶液はトリフルオロ酢酸で、ｐＨ２，０まで酸性にし、アセトニトリル勾配のある０、１％トリフルオロ酢酸中、逆相ＨＰＬＣで脱塩した。

カルボキシ末端は、ＮＡＰ−２０，５ナノモルおよびカルボキシペプチダーゼＰまたはカルボキシペプチダーゼＹ（配列決定用、ベーリンガー）０．４μｇを用いて決定した。

第２図は、最初の２０アミノ末端アミノ酸を示す。

実施例６：　Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の好中球活性化効果好中球はヒト血液から単離し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に懸濁し、次いで、デワルドおよびバギオリニのマイクロタイター・プレート・アッセイ法（１９８７年）を用いて、ＮＳＡ　　１／ＮＡＰ　　２のエラスターゼ放出誘起能力の評価に用いた。Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ −２は濃度依存的に選択的なエラスターゼ放出を誘起した。濃度依存性は、ＮＡＦ／ＮＡＰ−１で観察されたものに類似しており、強度はＮＡＦの場合の約］／２、ｆＭＬＰの場合の約１／３であった。

第３図は、Ｎ５Ａ−１／ＮＡＰ−２の、濃度依存的な活性を示す。

第■部：ヒト血小板由来λｇｔｌ１発現ライブラリからのＣＴＡＰ−■の相補的ＤＮＡコードのクローニング実施例７：ａ）血小板の単離および洗浄血小板は、クエン酸処理血液を１６０９で１０分間遠心して単離し、血小板に富む血しょう（プレートレット・リッチ・プラズマ：ＰＲＰ）を得、さらに１１００ｆで１０分間遠心にかけて血小板塊を得た。血小板は３０ミリモル／１２グルコース、１２０ミリモル／Ｑ塩化ナトリウム、１２９ミリモル／Ｉ２クエン酸ナトリウム、１０ミリ−１１，／１２　ＥＤＴＡ、ｐＨ６，５の溶液で２回洗浄し、ｌＯミリモル／ａトリス／塩酸、１５４ミリモル／Ｑ塩化ナトリウム、１０ミリモル／１２　ＥＤＴＡＳｐＨ７，４の溶液で１回洗浄した。

ｂ）　ヒト巨核球これらは、反核芽球性白血病の患者の末梢血から、フィコール−メトリシェード密度勾配遠心により単離した。これら白血病性細胞の反核芽球の表現型は、血小板ＧＰＩｒｂ、　ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩの複合体および（ｖＷＦ）フォノ・ウィレブランド・ファクターに対する、モノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）との反応性に基づいている。これらの細胞からのメツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮ　Ａ　）とのノーイン・プロッティングにおいて、血小板ＧＰ　Ｉｂの相補的ＤＮＡプローブを用いても、２．４ｋｂのｍＲＮＡ（血小板の場合と同じ大きさ）との陽性の信号が得られた。

Ｃ）抗体の調製洗浄した血小板は、Ｎ−エチルマレイミド（Ｎ　Ｅ　Ｍ　）およびフェニルメタン−スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、メタノールに溶解）を各々最終濃度２ミリモル／Ｑで存在する１％トリトンＸ−１１４に溶解し、バイオケム・バイオフィズ、アクタ７７８巻４６３頁（１９８４年）に記載のとおり、相分離を行った。水相は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＤＤＳ）、０．１モル／ａ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７，４の溶液を用いたＡｃＡ−３４ウルトロゲル（ＬＫＢ）排除クロマトグラフィーに供した。８−９−にαの範囲でタンパクを含有するフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で評価されるように、ウサギの免疫化に用いた。

ｄ）　イムノブロッティング脱顆粒産生物は、スロンビン刺激（２Ｕ／　４　Ｘ　１０　”／ｘＱ、５分、３７℃）した洗浄血小板の上清から得られ、２ミリモル／ＱＰＭＳＦおよび２ミリモル／（ＮＥＭで処理した。これらを１％ＳＤＳに溶解し、０．１％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、半乾燥エレクトロプロッターを用いて１５０ｍＡで９０分間、ニトロセルロース（ＢＡ８５、シュライヒヤー＆シュエル、フェルトバッハ、スイス）に電気泳動的に移した。

抗ＣＴＡＰ−ｎｕウサギポリクロナール抗血清とインキュベートした後、アルカリ性フォスファターゼに結合したヤギ抗つサギ２次抗体（バイオ−ラド・ラボラトリーズ、グラットブルク、スイス）を、基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートでの染色に用いた。

ｅ）相補的ＤＮＡ発現ライブラリーの構成ｔｓｏｐの血液から採った血小板の全ＲＮＡ１よ、グアニジン塩酸法を用いて調製した。ポリＡｍＲＮｌよ、第１ノゴ（ｄＴ）セルロース（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）親和クロマトグラフィー１こより単離した。１本目の鎖は、オリゴ（ｄＴ）ブライマー（）７）レマシアＰ−Ｌバイオケミカルズ）および逆転写酵素（ベセスダ・１ノサーチ・ラボラトリーズ、ギブコ、／（−ゼル、スイス）を用Ｌ）て合成した。

２本目の鎖は、ＲＮアーゼＨ（二ニー・イングランド・）くイオラブズ、シュバルバツノ−・Ｉくイ・フランクフルト、西トイ゛ソ）およびエシェリキア・コリＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■（べ−１ノンガー・マンノ１イム、ロットクロイン、スイス）で調製した。Ｔ４ＤＮＡボ１ツメラーゼおよびフレナラ酵素でプラント末端を作り、ＥｃｏＲＩメチルイヒし、ＥｃｏＲＩリンカ−に連結した後、結果的１こできる相補的ＤＮＩよ、λｇｔｌｌパッケージング抽出物（ギガノくツク・ゴールド、ストラツタジーン、サン・デイエゴ、カリフォルニア列（）中（ニアくツケージし、エシェリキア・コリｙｔｏｓｓ中、増幅した。

血小板λｇｔｌｌ相補的ＤＮＡ発現ライブラリーは、ポリクローナル・ウサギ抗血清を用いる一般法で、ふるい分けした。エシェリキア・コリ特異的抗体は、ニトロセルロース結合した、エシェリキア・コリＢＮＮ９７のリゼイトに免疫吸着させて除去した。陽性組み換えファージは、イムノブロッティングの場合と同じ２次抗体および色素原基質で検出した。精製した後、λ−ＤＮＡをＥｃｏＲＩ　（ベーリンガー・マンハイム）で分解し、挿入物は、０．８％アガロース・ゲル電気泳動およびバイオ・トラップ（シュライヒャー＆シュエル）中に電気溶出して単離した。ＤＮＡはエタノールで沈澱させ、Ｔ４リガーゼ（パイオーラブ）を用いて５　ｎｇＥ　ｃｏＲＩ直線化Ｍ１３ブルースクリプト（ストラッタジーン）に結合し、エシェリキア・コリＪＭＩＯＩに導入した。白色コロニーは、アルカリ性抽出法により、陽性組み換えプラスミドの試験を行い、１末鎖相補的Ｄ　Ｎ　Ａ鋳型は、Ｍ１３ＫＯ７ヘルバーフアージで感染させて調製した。両方の鎖のＤＮＡ配列は、シークエナーゼキット（ユナイテッド・ステーブ・バイオケミカル・コーポレーション）およびｆｉｓＳα−標識化ｄＡＴＰ（二ニー・イングランド・ニューフレアー、デュ・ボンド）を用いたジデオキシ鎖末端法により決定した。

ｇ）ノーイン・プロット分析１％アガロースゲルで電気泳動を行った後、ｍＲＮＡは、ハイボンドＮ（アメルシャム）上にプロットし、次いでスルホニル化した相補的ＤＮＡプローブと、６８℃で１８時間、１００μｙ／ｘρサケ精子ＤＮＡを含有する４ＸＳＳＰＥ、０．１％ニリン酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ％　ｏ　、　５　ｍｇ／ｌρヘパリン中でハイブリダイズした。ｌＸ５ＳＰＥ、１％ＳＤＳ、０．１％ユニリン酸ナトリウム中温で５分間の洗浄を２回行い、０．２ｘＳＳＰＥＳＯ，１％ＳＤＳ、０．１％ニリン酸ナトリウム中６８℃で３０分間の洗浄を２回行った後、対応するｍＲＮＡは、スルホニル化ＤＮＡに対するネズミのモノクロナール抗体（ＭｏＡ　Ｂ　；　シグマ、ディーセンホーフェン、西ドイツ）およびアルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体で免疫染色し、検出した。基質は上記と同一であった。

ｈ）結果８〜９Ｋｄの範囲の血小板水溶性タンパクを含有するゲル濾過フラクションでウサギを免疫して産生じたポリクローナル抗体は、イムノプロット上で、高度な結合活性および特異性を示し、血小板由来λｇｔｌｌ相浦的ＤＮＡ発現ライブラリーのふるい分けに用いた。

１０００００の最初にふるい分けされた組み換えファージからの２個の陽性のクローンが、精製されたプラークであり、２個の介在ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｍ１３ブルースクリプト（商標）中でサブクローン化した。両方の鎖のヌクレオチド配列は、ジデオキシ鎖末端法により決定した。６９０塩基対の全長の相補的ＤＮＡクローン（λＣＴ）が得られ（第５図）、これは６６塩基対の５°非コ一ド化部分、１２Ｂアミノ酸残基（１３８９４ｄａ）のタンパクをコード化する転写解読枠および終止コドン（ＴＡＡ）を含有する３′非コ一ド化部分、推定上のポリアデニル化信号、並びにポリＡテールを含有していた。

相対位置−９で開始した２次クローン（λＣ２）は同一のヌクレオチド配列を示した。

真核生物のｍＲＮＡ（５’ＣＣＡＣＣＡＵＧＡ３°）における翻訳開始のコンセンサス配列は、ヌクレオチド−５で始まる。

反核球性白血病セルライン、反核球、および血小板から採ったｍＲＮＡであって、肝細胞コントロールからのｍＲＮＡではないものの、ノーイン・プロット・ハイブリダイゼーションにより、ＣＴＡＰ−■前駆体のｌｌＲＮＡの約Ｑ　、　Ｆｌ　ｋｂの陽性信号が得られた。このことは、対応する相補的ＤＮＡが全長であることを示している。ＨＥＬｍＲＮＡでは信号は得られなかったが、これは恐らく、相補的ＤＮＡプローブのための非放射性標識化法の感受性が低く、および／または用いたＨＥＬセルラインのＣＴＡＰ−ＩＩＩ特異的ｒＩＲＮＡ含量が低いためであろう。

推測されるアミノ酸配列（第５図）は、ヒト血小板ＣＴＡＰ−ｍの十分に確立された配列と同一である。ＣＴＡＰ−ＩＩＩのアミノ末端は、翻訳された配列の４４位のアミノ酸であり、ミトゲン的に不活性なプラスミンまたはトリプシン分解産物β−スロンボグロプリンの開始部は、下流方向４８位の４残基である。これらのタンパクの前駆体であるＰＢＰは、ＣＴＡＰ−ＩＩＩの最初の１０残基を共有しているが、アミノ末端は上流方向３５位の９残基であることが示されている。これらの３種のタンパクに関する全ての既知の構造的な情報は、コード化した相補的ＤＮＡクローンに由来するアミノ酸配列に、正確に合致する。このことは、３種のタンパク全ての前駆体が単一のものであるという、強力な証拠になっている。

従って、第５図に示されたＣＴＡＰ−ｍの３４アミノ酸先導配列は、例外的に長く、古典的なシグナルペプチドと異なり、恐らくタンパクを、成熟巨核球のα顆粒に対する標的にする原因となる。

第１ａ図フラクション番号第１ｂ図フラクション番号第１Ｃ図フラクション番号Ｆｉｇｕｒ＠２第３図濃度（ｎＭ）Ｆｉｇｕｒｅ　４Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ａｒｇ−Ｃ）ｒｓ−Ｍｅｔ−Ｃ）ｒｇ−工１＊−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−５＠ｒ−Ｇユ）ｒＪユ会−１ｉ１ｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−＾５ｎ−Ｘ１＊−Ｇｍ−２１：？５　　　　　　　　　　　　３０Ｓ＠ｒ−Ｌａｕ −Ｇｌｕ−Ｖａｌ−工１曇−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｈｌｓ−Ｃｙｓ −Ａｓｎ−ＧＴｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖｄ−Ｘ１ｍ−ＡＸａ−Ｔｈｒ−Ｌ＠ｕ− Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−社ｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｃ）ｒｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＡＬａ−Ｐｒｏ−社ｇ−工１＠−Ｌｙｓ−ＬｙｓＪ１ａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−４１，ｕ−５＊ｒ−ムｌａ−ＡｓｐＦｉｇｕｒ＠５Ｓ９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６２４国際調査報告 ′１１１１“０ρＣＴ／εＰ　８９１０１３８９−ｒ帥ｍ−＾ｔｅｈｅａｗ＊　ｌ軸　ＰＣＴ／εＰ　８９１０１３８９国際調査報告ンエハー−３０６５ボルリゲン、フルう゛ソケル　四番エバー−３０９８ケニツ、フエルドラインストラ゛ソセ　７

Claims

【特許請求の範囲】

１．好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
２．７０アミノ酸配列：【配列があります】を有する請求項１記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
３．リン酸セルロースクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによる、刺激した血液白血球の培養液からの精製を含む、ＮＳＡ−１／ＮＡＰ−２の調製方法。
４．天然の先導配列を含有する対応遺伝子をクローニングし、適当な宿主で遺伝子を発現し、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用してペプチド産生物を適当に回収することから成る、ＮＳＡ−１／ＮＡＰ−２もしくはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体、またはそれの生物学的活性のある構造相関物、たとえばβ−ＴＧ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩもしくはＰＢＰの調製方法。
５．請求項１記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体を医薬的に許容できる担体または希釈液と共に含有して成る、医薬組成物。
６．医薬として使用するための、請求項１記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
７．アミノ酸配列：【配列があります】を有する先導ペプチドまたはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
８．請求項１記載の因子またはそれの機能的変種、フラグメントもしくは誘導体を、処置を必要とする対象に投与することから成る、処置方法。
９．請求項３または４記載の方法により得られる、請求項１記載の因子または機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。
１０．β−ＴＧ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩもしくはＰＢＰから、またはβ−ＴＧ、ＣＴＡＰ−ＩＩＩもしくはＰＢＰをコード化した遺伝子から得られる、請求項１記載の因子または機能的変種、フラグメントもしくは誘導体。