FR2640142A1

FR2640142A1 - Peptide-2 d'activation des neutrophiles

Info

Publication number: FR2640142A1
Application number: FR8916207A
Authority: FR
Inventors: Baggiolini Marco; Clemetson Kenneth John; Walz Alfred
Original assignee: Kocher Theodor Institut; Sandoz AG
Current assignee: Kocher Theodor Institut; Sandoz AG
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-12-07
Publication date: 1990-06-15
Anticipated expiration: 2009-12-07
Also published as: JPH03503767A; GR890100810A; KR910700260A; GB2231872A; CA2004685A1; AU634508B2; BE1003636A4; CH681625A5; NL8921262A; WO1990006321A1; SE9002589L; DK188690D0; GB2231872B; GB9011468D0; GR1000455B; AU4655689A; FR2640142B1; IL92557A0; JP3051160B2; DK188690A

Abstract

L'invention décrit un nouveau facteur qui a une activité de stimulation des neutrophiles et est isolé à partir de leucocytes et/ou de plaquettes du sang. Sa structure et sa fonction sont apparentées à celles du facteur d'activation des neutrophiles NAF/NAP-1 et sa structure est aussi apparentée à celle de la beta-thromboglobuline, du PBP et du CTAP-III. La séquence a été déterminée. La masse moléculaire du facteur est d'environ 6500-7700. On en a également découvert 3 variantes. Le facteur peut être préparé à partir de sources naturelles ou par des techniques d'ADN recombinant.

Description

La présente invention concerne une substance immunomo-

dulatrice.

Elle concerne plus particulièrement un facteur immuno-

stimulantqui active les leucocytes neutrophiles, en parti- culier les leucocytes neutrophiles humains. On l'appelle

donc ici l'activité 1 de stimulation des neutrophiles (NSA-

1) ou, ce qui est synonyme, le peptide 2 d'activation des

neutrophiles.-

Les leucocytes neutrophiles (neutrophiles) sont les leucocytes les plus courants et constituent environ les deux tiers des globules blancs dans le sang humain. Ils ont une fonction principale qui est de protéger l'organisme hôte des

infections microbiennes. Les neutrophiles sont mobiles, pré-

sentent une réponse aux stimulations chimiotactiques créées lors d'une infection et sont capables de pénétrer dans les

tissus infectés pour tuer les microorganismes. Cette des-

truction dépend de la capacité des neutrophiles à englober les microorganismes et à libérer des radicaux oxygène et des enzymes microbicides. La libération de ces produits dépend

de l'activation des neutrophiles.

On connaît quelques protéines ayant une telle activité,

comme le facteur d'activation des neutrophiles (NAF) (P. Pe-

veri et coll., J. Exp. Med. 167 (1988) 1547), appelé aussi

peptide 1 d'activation des neutrophiles (NAP-1).

On a maintenant découvert qu'une activité de stimula-

tion des neutrophiles est produite en culture par des leuco-

cytes stimulés et peut être obtenue à partir du liquide de

culture. L'activité de stimulation des neutrophiles est ap-

pelée ici NSA-1 ou, ce qui est synonyme, peptide-2 d'activa-

tion des neutrophiles (NAP-2).

On a également découvert que le NSA-1/NAP-2 a une structure très similaire à celle de la g-thromboglobuline (<-TG), du peptide III d'activation des tissus conjonctifs (CTAP-III) et de la protéine fondamentale des plaquettes

(PBP).

L'invention a pour objet le NSA-1/NAP-2 ou une variante

fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de celui-ci ayant en-

core cette activité biologique, par exemple une mutéine, avec un degré de pureté suffisant pour permettre ensuite sa caractérisation et sa préparation, par exemple, par des

techniques d'ADN recombinant, et son utilisation pharmaceu-

tique.

L'invention a en outre pour objet un procédé de prépa-

ration du iSA-1/NAP-2 à partir, par exemple, de leucocytes

et/ou de plaquettes de sang humain.

Elle a en outre pour objet l'utilisation du NSA-1/NAP-2 pour activer les leucocytes neutrophiles et améliorer ainsi

la résistance aux infections.

Elle a également pour objet un procédé de préparation

du NSA-1/NAP-2 ou d'une variante fonctionnelle, d'un frag-

ment ou d'un dérivé de celui-ci, ou d'un de ses parents structurels biologiquement actifs comme la g-TG, le CTAP-III ou le PBP par des techniques d'ADN recombinant, qui comprend le clonage d'un gène correspondant, renfermant une séquence leader naturelle, par exemple une séquence leader naturelle endogène des plaquettes humaines, son expression dans un hôte convenable et la récupération appropriée du produit

peptidique, le cas échéant, au moyen d'une protéase appro-

priée.

On utilise les abréviations suivantes: BSA sérumalbumine de bovin; CTAPIII peptide III d'activation des tissus conjonctifs DDS dodécylsulfate de sodium DTT dithiothréitol fMLP N-formyl-L-méthionyl-L-leucyl-Lphénylalanine LPS lipopolysaccharide de E. coli 055:D5 MEM Milieu essentiel minimal d'Eagle (Seromed GmbH,

Munich, RFA), complété avec 25 ig/ml de néomy-

cine, tamponné à pH 7,4 avec 25mM de NaHCO3 et 20 mM de HEPES MEM-PPL contient en plus une solution pasteurisée à 1% de protéine plasmatique (PPL-SRK 5%, Laboratoire de Berne la Croix Rouge Suisse, Berne,Suisse) et 100 UI/ml de pénicilline et de streptomycine (Gibco AG, Bâle, Suisse) AMo anticorps monoclonaux ARNm ARN messager NAF facteur d'activation des neutrophiles (= NAP-1) NAP-1 peptide 1 d'activation des neutrophiles (= NAF) NAP-2 peptide 2 d'activation des neutrophiles (= NSA-1) NEM Néthylmaléimide

NSA-1 activité 1 de stimulation des neutrophiles (= NAP-

2) PBP Protéine plaquettaire fondamentale PBS Solution saline tamponnée sans Ca++ et Mg++; PBS-BSA PBS supplémenté avec 0,9mM de CaC12, 0,49mM de MgCl2 et 2,5 mg/ml de BSA PRP Plasma riche en plaquettes PHA-P phytohémagglutinine (Difco Laboratories, Détroit,

MI, USA)

PMN cellules - neutrophiles polymorphonucléaires PMSF fluorure de phénylméthanesulfonyle

SDS-PAGE électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de so-

dium-polyacrylamide SSPE 180mM de NaCl; 10mM de NaH2P04; lmM d'EDTA; pH 7, 4

g-TG g-thromboglobuline.

Le NSA-1/NAP-2 est caractérisé biologiquement par ses propriétés d'activation des neutrophiles, en particulier pour produire la libération des enzymes de granulation. En termes moléculaires, le NSA-1/NAP-2 est caractérisé par une masse moléculaire d'environ 7500 et un point isoélectrique

d'environ 8,7.

Il est produit par exemple à partir de leucocytes et/ou de pla-

quettes de sang humain par un procédé qui consiste à puri-

fier, dans des liquides de culture, des leucocytes sanguins et/ou des plaquettes sanguines stimulés, par chromatographie sur phosphocellulose et chromatographie à polarité de phases inversée. On peut produire un NSA1/NAP-2 d'autres espèces que l'espèce humaine, d'une manière analogue, à partir des

leucocytes et/ou des plaquettes du sang correspondants.

On peut effectuer une stimulation avec n'importe quel

agent connu comme LPS et PHA-P.

On peut réaliser, par exemple, la chromatographie sur

phosphocellulose, sur une colonne de phosphocellulose équi-

librée avec un tampon phosphate de potassium/NaCl/EDTA/gly-

cérol, au voisinage du pH neutre, par exemple à pH 7,2, en faisant ensuite une élution dans un gradient linéaire de

concentration de NaCl, par exemple, dans le même tampon.

Une chromatographie à polarité de phases inversée suit de préférence la chromatographie sur phosphocellulose et est de préférence effectuée d'abord sur une colonne préparative C4 à polarité de phases inversée éluée avec, par exemple, un

gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluo-

roacétique à 0,1%; puis sur une colonne CN-propyle éluée avec, par exemple, un gradient de 0-80% d'acétonitrile dans

de l'acide trifluoroacétique à 0,1%; puis les fractions ac-

tives sont renvoyées sur une colonne C4 analytique à pola-

rité de phases inversée, dans des conditions analogues à

celles utilisées pour la chromatographie sur CN-propyle.

On peut suivre le déroulement de la purification sur

les figures la, lb et lc.

On suit le déroulement de la purification par analyse de l'activité de stimulation des neutrophiles, par exemple en termes de capacité à amorcer la libération de l'élastase

à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cyto-

chalasine B (B. Devald et M. Baggiolini, Biochem. Pharmacol.

36 (1987) 2505-2510).

On constate que le NSA-1/NAP-2 a une masse moléculaire

apparente d'environ 6500 par électrophorèse sur gel de SDS-

polyacrylamide à 20% d'urée. Le point isoélectrique apparent

est d'environ 8,3.

L'analyse de la séquence en acides aminés (figure 2)

montre que les 20 premiers acides aminés N-terminaux corres-

pondent exactement à une partie commune de la séquence de la protéine plaquettaire fondamentale (PBP) et de ses dérivés structuraux CTAP-III (C. W. Castor et coll., PNAS 80 (1983)

765-769) et P-thromboglobuline (G. S. Berg et coll., Bio-

chemistry 17 (1978) 1739-1744). La terminaison amino de NSA-

1/NAP-2 correspond à l'acide aminé 16 de CTAP-III et à l'a-

cide aminé 12 de la P-TG. La digestion avec la carboxypepti-

dase Y montre que les séquences en acides aminés C-termina-

les sont identiques (-Glu-Ser-Ala-Asp). Le NSA-1/NAP-2 s'a-

ligne entièrement sur la séquence de la P-TG et est consti-

tué par 70 acides aminés ayant une masse moléculaire calcu-

lée de 7-628 et un point isoêlectrique calculé de 8,7. La fi-

gure 4 montre la totalité de la séquence des 70 acides ami-

nés. L'homologie globale entre le NSA-1/NAP-2 et le NAF/NAP-

1 est de 46%. La séquence de NSA-1/NAP-2 ne contient pas de

sites de N-glycosylation apparents. Il existe un site poten-

tiel de phosphorylation par la protéine kinase C (Thr) en

position 39 et un site possible d'amidation (Asp) en posi-

tion 42.

On peut ainsi considérer que le NSA-1/NAP-2 est un

fragment de la P-TG.

La séquence du NSA-1/NAP-2 peut s'aligner sur celle du NAF/NAP-1, sur la base des deux premiers résidus cystéine (Cys 5 et Cys 7 pour NSA-1/NAP-2 et Cys 7 et Cys 9 pour NAF/NAP-1). Lorsqu'elles sont alignées de cette manière, en- viron la moitié des 20 premiers acides aminés du NSA-1/NAP-2 et du NAF/NAP-1 sont identiques. Les deux facteurs sont ainsi liés non seulement fonctionnellement, mais aussi, dans

une certaine mesure, structurellement.

La disponibilité de la séquence en acides aminés de NSA-1/NAP-2 permet de le préparer par d'autres procédés en plus de l'isolement à partir d'une source naturelle décrite ci-dessus. Ainsi, comme le peptide renferme seulement 70 acides aminés, la synthèse totale est possible d'une manière classique, par exemple au moyen du procédé à l'état solide

de Merrifield en tenant compte de la présence de deux liai-

sons bisulfure.

D'autres procédés de production englobent les tech-

niques d'ADN recombinant, par exemple par clonage et expres-

sion d'un gène synthétique correspondant, éventuellement

après optimisation d'un codon. On a décrit la synthèse chi-

mique et l'expression dans la levure d'un gène codant pour CTAP-III (G. T. Mullenbach et coll., J. Biol. Chem. 261 (1986) 719) et on peut ainsi l'appliquer à la production de peptides apparentés comme le NSA-1/NAP-2. Cependant, seule une partie du CTAP-III produit a une activité biologique. Il semble probable qu'un mauvais repliement et une formation

incorrecte des liaisons bisulfure sont des problèmes ma-

jeurs. Aucune séquence d'ADN codant pour une séquence lea-

der n'est incorporée dans le gène synthétique, car on ne connaît pas encore une telle séquence leader pour cette

classe de composés.

Un autre procédé de production par des techniques d'ADN

recombinant est le clonage et l'expression d'un gène renfer-

mant une séquence leader naturelle, par exemple une séquence leader naturelle endogène aux plaquettes humaines, par exemple par clonage et expression d'un ADNc choisi dans une

bibliothèque d'expression appropriée et codant pour le NSA-

1/NAP-2 ou un peptide plus grand englobant le NSA-1/NAP-2, comme la E-TG, le CTAP-III ou le PBP, et récupération du NSA-1/NAP-2 d'une manière classique à partir du produit de l'expression. Une telle séquence leader est, par exemple, constituée des 34 premiers acides aminés dans la séquence de

la figure 5 ou d'un fragment ou dérivé fonctionnel de celle-

ci. L'exemple 7 décrit le clonage d'un ADNc codant pour le CTAP-III à partir d'une bibliothèque d'expression de;ftll dérivée de plaquettes humaines. La récupération du produit peptidique recherché à partir d'une molécule mère peptidique peut se faire, par exemple, en tronquant de façon appropriée

le plus gros peptide d'une manière classique avec une pro-

téase comme une protéase sérine.

On peut, par exemple, isoler des protéases appropriées d'une manière classique, à partir de monocytes purifiés. Ils sont hautement sensibles au PMSF, modérément sensibles à la

leupeptine et insensibles à i'EDTA.

En variante, la séquence leader peut être fixée direc-

tement sur le gène codant pour le peptide recherché.

La préparation par clonage d'un gène renfermant une sé-

quence leader naturelle conduit à des produits peptidiques

ayant le bon repliement pour avoir une entière activité bio-

logique, par exemple pour le ciblage vers l'ta-granulation,

lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules de mammifères.

Les fragments fonctionnels ou dérivés, par exemple les

mutéines, de NSA-1/NAP-2 peuvent être préparés par des pro-

cédés connus dans la technique.

On a également découvert trois variantes de NSA-1/NAP-2 ayant une activité biologique quelque peu réduite, dont la séquence à 70 acides aminés est indiquée sur la figure 4, mais rallongées à l'extrémité N respectivement des 3, 4 et 5

acides aminés correspondants de CTAP-III (voir figure 5).

Ils ont ainsi la séquence de la figure 4 précédée, respecti-

vement, de

Asp-Leu-Tyr-

Ser-Asp-Leu-Tyr- et _ Asp-Ser-Asp-Leu-Tyr- et ont repectivement une longueur de 73, 74 et 75 acides aminés. On peut les produire comme il est décrit ci-dessus pour la préparation du NAP-2, à partir de leucocytes sanguins et/ou de plaquettes sanguines stimulés: par stimulation avec LPS en présence de surnageant de culture monocytaire, on obtient, en plus de NAP-2, un petit pic intermédiaire

contenant les variantes à 73-75 résidus de NAP-2. On com-

plète ce pic supplémentaire à 65, 20 et 15% respectivement

par les formes à 74, à 75 et à 73 résidus.

Le NSA-1/NAP-2 et ses variantes fonctionnelles, ses fragments et ses dérivés possèdent une activité biologique qui les rend indiqués pour être utilisés comme produits pharmaceutiques. ó

Par exemple, ils provoquent une infiltration des neu-

trophiles chez le rat en doses d'environ 1 gg/kg à environ

gg/kg de poids corporel de l'animal.

Le NSA-1/NAP-2 et ses variantes fonctionnelles, frag-

ments et dérivés sont ainsi indiqués pour être utilisés dans

le traitement d'affections qui s'accompagnent ou qui provo-

quent, localement ou systémiquement, une modification du

nombre ou de l'état d'activation des PMN (cellules - neutro-

philes polymorphonucléaires). Ils modifient beaucoup ces pa-

ramètres de PMN et sont donc indiqués pour être utilisés dans le traitement des affections dans lesquelles une hausse du nombre ou de la stimulation de l'état d'activation des PMN se traduit par une amélioration clinique, par exemple dans les infections bactériennes, mycoplasmiques, par les

levures et les champignons, et dans les infections virales.

En outre, ils sont indiqués pour être utilisés dans les ma-

ladies inflammatoires comme le psoriasis, les affections ar-

thritiques et l'asthme, ou dans les affections o la numéra-

tion des neutrophiles est anormalement faible et/ou le taux

des neutrophiles généralisé est faible, et dans la prépara-

tion d'antagonistes, par exemple d'anticorps monoclonaux,

utilisables dans ces indications.

Puisqu'on a montré que, comme le NAP-1, ils étaient

aussi chimiotactiques pour les lymphocytes T, ils sont éga-

lement indiqués pour être utilisés dans certains états immu-

nodéficitaires.

Pour ces indications, la posologie appropriée variera,

bien entendu, par exemple de l'hôte, du mode d'administra-

tion et de la nature et de la gravité de l'affection à trai-

ter. Toutefois, en général, on indique que l'on obtient des

résultats satisfaisants par voie systémique avec des posolo-

gies quotidiennes d'environ 1 mg/kg à environ 100 mg/kg de poids corporel de l'animal. Pour un plus grand sujet, une

posologie quotidienne indiquée est dans l'intervalle d'envi-

ron 0,1 mg à environ 100 mg, de préférence d'environ 0,1 mg à environ 10 mg, avantageusement administrée, par exemple,

en doses divisées (jusqu'à 4 fois par jour).

On peut fabriquer d'une façon classique des composi-

tions pharmaceutiques comprenant le composé en association avec au moins un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable, en le mélangeant avec un véhicule ou un diluant

pharmaceutiquement acceptable. Les formes posologiques uni-

taires contiennent, par exemple, d'enViron 0,025 mg à envi-

ron 50 mg du composé.

Bien qu'il soit fonctionnellement très similaire au NAP-l, le NSA-1/NAP-2 ne peut sans doute être produit que in

vivo lorsque le PBP et/ou le CTAP-III sont libérés des pla-

quettes, tandis que la production du NAF/NAP-1 pardes pha-

gocytes mononucléaires et une grande variété de cellules tissulaires est induite par des cytocines inflammatoires comme le facteur de nécrose tumorale et l'interleukine-1. On peut donc s'attendre à ce que les deux peptides apparaissent

dans des situations physiologiques dissemblables et à diffé-

rents sites. Comme il est dérivé des plaquettes, le NAP-2 est produit principalement en intravasculaire, o se produit l'activation et l'agrégation plaquettaires, par exemple dans les thrombus et dans les lésions athérosclérotiques, tandis que le NAF/NAP-l se forme presqu'invariablement dans les tissus. On ne trouve pas le NSA-l/NAP-2 et ses variantes dans les plaquettes ou dans d'autres constituants des cultures cellulaires mononucléaires, et il semble qu'ils se forment après la libération. Ils présentent les propriétés typiques des agonistes des récepteurs chimiotactiques et provoquent des changements calciques non cytosoliques, une chimiotaxie et une exocytose dans le même intervalle molaire que le NAF/NAP-l, tandis que les PBP, CTAP-II et PF-4 ont peu, voire pas, d'activité en concentrations 100 à 10000 fois plus fortes. On s'attend à ce qu'ils soient aussi efficaces

que le NAF/NAP-l et le C5a dans le recrutement des neutro-

philes et qu'ils aient un rôle dans la thrombose, o ils

pourraient attirer les neutrophiles impliqués dans la reca-

nalisation des vaisseaux obstrués.

EXPLICATION DES FIGURES

Figure la: Chromatographie liquide haute pression prépara-

tive à polarité de phases inversée de NSA-l sur une colonne

C4. Graphe du haut: distribution des protéines, densité op-

tique à 226 nm; graphe du bas: activité de NSA-l, libéra-

tion relative de l'élastase à partir des neutrophiles hu-

mains. Deux pics sont en évidence: un petit correspondant au

NSA-l/NAP-2 et un plus grand correspondant au NAF/NAP-l.

Figure lb: Chromatographie liquide haute pression à pola-

rité de phases inversée de NSA-l/NAP-2 sur une colonne CN-

propyle. Les détails sont les mêmes que pour la figure la.

Figure lc: Chromatographie liquide haute pression à pola-

rité de phases inversée de NSA-1/NAP-2 sur une colonne C4.

Les détails sont les mêmes que pour la figure la.

Figure 2: Séquence amino-terminale de NSA-1/NAP-2. Les 20 premiers résidus sont représentés. Ils correspondent à une partie de la séquence de la 3-thromboglobuline. Figure 3: exocytose provoquée par le NSA-1/NAP- 2 dans les neutrophiles humains traités à la cytochalasine B. Influence

de la concentration.

Figure 4: Séquence en acides aminés de NSA-1/NAP-2.

Figure 5: Séquence d'ADNc et séquence en acides aminés dé-

duite du précurseur de PBP (commence par le nucléotide 103), CTAP-III (commence par le nucléotide 130), g-TG (commence

par le nucléotide 142) et NSA-1/NAP-2 (commence par le nu-

cléotide 175). Les deux liaisons disulfure internes sont

marquées respectivement par des astérisques et par des car-

rés. Le signal de polyadénylation putatif est souligné (nu-

cléotides 581-586). On a tiré un trait au-dessus du site de

reconnaissance par EcoRI.

EXEMPLES

Les exemples suivants illustrent l'invention.

1ERE PARTIE: PRODUCTION DE NSA-1/NAP-2 A PARTIR DE SANG HU-

MAIN, PURIFICATION ET CARACTERISATION

Exemple 1: Production de NSA-1/NAP-2 par des leucocytes et/ou des plaquettes de sang humain stimulés au LPS

On utilise du sang d'un donneur anticoagulé obtenu au-

près du Laboratoire de la Croix Rouge Suisse et stocké perdant

des durées jusqu'à 20 heures à 4-10"C. On isole des cellules mono-

nucléaires (constituées de monocytes et de lymphocytes dans un rapport d'environ 1:5) à partir de couches leucocytaires uniques sur des gradients de Ficoll-Hypaque (A. Boyum, Scand. J. Immunol. 5 (1976) 9-15) et on les lave dans le MEM. On remet en suspension les cellules lavées provenant de 6 couches leucocytaires dans le MEM-PPL (5x106 cellules/ml) et on les cultive pendant 20 heures en présence de 1 lg/ml de LPS dans des bouteilles en verre équipées d'un dispositif

d'agitation. A différents instants, on prélève des échantil-

lons des milieux de culture et on détermine l'activité de

stimulation des neutrophiles comme étant la capacité à pro-

voquer la libération de l'élastase à partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cytochalasine B (B. Dewald et

M. Baggiolini, Biochem. Pharm. 36 (1987) 2505-2510). Cet es-

sai détecte le NSA-l ainsi que le NAF, qui est un facteur

d'activation des neutrophiles décrit antérieuremment (P. Pe-

veri et coll., J. Exp. Med. 167 (1988) 1547-1559). L'acti-

vité de stimulation des neutrophiles augmente avec le temps

et se nivelle au bout de 24 à 48 heures.

Exemple 2: Production de NSA-1/NAP-2 par des leucocytes et/ou des plaquettes de sang humain stimulés au PHA-P

On utilise du sang d'un donneur anticoagulé obtenu au-

près du Laboratoire de la Croix Rouge Suisse et stocké pen-

dant jusqu'à 20 heures à 4-10 C. On isole des cellules mono-

nucléaires (constituées de monocytes et de lymphocytes dans un rapport d'environ 1:5) à partir de couches leucocytaires uniques sur des gradients de Ficoll-Hypaque (Boyum, 1976) et on les lave dans le MEM. On remet en suspension les cellules lavées provenant de 6 couches leucocytaires dans le MEM-PPL (5x106 cellules/ml) et on les cultive pendant 20 heures en présence de 5 gg/ml de PHA-P dans des bouteilles en verre équipées d'un dispositif d'agitation. A différents instants,

on prélève des échantillons des milieux de culture et on dé-

termine l'activité de stimulation des neutrophiles comme étant la capacité à provoquer la libération de l'élastase à

partir de neutrophiles humains prétraités avec de la cyto-

chalasine B. L'activité de stimulation des neutrophiles aug-

* mente avec le temps et se nivelle au bout de 24 à 48 heures.

Exemple 3: Purification de NSA-1/NAP-2 à partir de liquides de culture de leucocytes et/ou de plaquettes de sang humain stimulés au LPS a) Chromatographie sur phosphocellulose

On charge directement des portions de 700 ml de li-

Z640142

quides de cultures acellulaires de leucocytes humains stimu-

lés comme le décrit l'exemple 1 sur une colonne de 15 ml de phosphocellulose (Whatman Pl1) équilibrée avec du tampon A (20mM de tampon phosphate de potassium, pH 7,2, contenant 20mM de NaCl, lmM d'EDTA et 5% de glycérol). La colonne est lavée avec le même tampon, puis éluée (24 ml/heure) avec 120 ml d'un gradient linéaire de concentration de NaCl (0,02 à

1,5M) dans le tampon A. On analyse les fractions pour déter-

miner leur activité de stimulation des neutrophiles.

b) Chromatographie à polarité de phases inversée

on réunit les-fractions actives obtenues dans la sépa-

ration chromatographique sur phosphocellulose et on leur fait subir une purification supplémentaire par 4 passages répétés sur une colonne préparative C4 à polarité de phases inversée à gros pores (10 x 250 mm, 7 Wm, Macherey-Nagel,

Dueren, RFA). La colonne est éluée à 2 ml/min avec un gra-

dient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroa-

cétique à 0,1%, avec un accroissement de 0,66% par minute.

On réunit-les fractions actives ayant un temps de ré-

tention de 20226 minutes, on les concentre sur une centrifu-

geuse Speed Vac et on les charge sur une colonne analytique CN-propyle à polarité de phases inversée (4,6 x 250 mm, 5 wn, gros pores, Baker Research Products, Phillipsburg, N.J., USA). La colonne est éluée à 0,5 ml/min avec un gradient de 0 à 80% d'acétonitrile dans de l'acide trifluoroacétique à 0,1%, avec un accroissement de 0,66% par minute. On réunit les fractions actives ayant un temps de rétention de 20-25 minutes, on les concentre et on les repasse sur une colonne analytique C4 à polarité de phases inversée (4,6 x 250 mm, 5

gm, gros pores, Baker Research Products), dans les condi-

tions décrites pour la colonne CN-propyle. Les fractions ac-

tives ayant un temps de rétention de 42,5 minutes sont sé-

chées dans une centrifugeuse Speed Vac, remises en suspen-

sion dans de l'eau stérile et ensuite utilisées pour l'ana-

lyse séquentielle en phase gazeuse et pour les dosages bio-

logiques. La figure 1 représente la séparation du NSA-1/NAP-

2 d'avec le NAF/NAP-1 et les fractions utilisées pour l'ana-

lyse de la séquence en acides aminés.

Exemple 4: Electrophorèse sur gel du NSA-1/NAP-2 purifié On analyse le NSA-1/NAP-2 purifié sur un gel de SDS-po-

lyacrylamide à 20% d'urée selon B. Kadenbach et coll., Ana-

lyt. Biochem. 129 (1983) 517-521). On obtient une seule

bande, de masse moléculaire apparente 6500, par visualisa-

tion au moyen d'une coloration à l'argent. Le NAP-2 migre

légèrement plus vite que le NAF/NAP-1.

Exemple 5: Analyse de la séquence en acides aminés du NSA-

1/NAP-2

On effectue l'analyse de la séquence en acides aminés par décomposition automatisée à l'isothiocyanate de phényle en utilisant un séquenceur en phase gazeuse modèle 477A de

Applied Biosystems. On applique les échantillons de NSA-

1/NAP-2 (500 pmoles) directement ou après modification chi-

mique. On effectue la réduction et l'alkylation de la ma-

nière suivante: on dilue 1 nmole de NSA-1/NAP-2 dans 150 1l de 6M de chlorhydrate de guanidinium, 2mM d'EDTA, 0,2M de Tris-HCl, pH 8,3, puis on ajoute 225 nl de tributylphosphine

dans 15 il d'acétonitrile et on incube la solution à la tem-

pérature ambiante. Au bout de 60 minutes, on ajoute 160 nl de 4vinylpyridine dans 10 gl d'acétonitrile. Au bout de 30 minutes, on ajoute une quantité égale de tributylphosphine et de vinylpyridine et on poursuit la réaction pendant 40 minutes supplémentaires, sous azote. On acidifie la solution avec de l'acide trifluoroacétique jusqu'à pH 2,0 et on la dessale par CLHP à polarité de phases inversée dans de

l'acide trifluoroacétique à 0,1% avec un gradient d'acéto-

nitrile. On détermine la terminaison carboxy avec 0,5 nmole de NAP-2 et 0, 4 lg de carboxypeptidase P ou de carboxypeptidase

Y (pour séquençage, Boehringer).

La figure 2 illustre l'analyse des 20 premiers acides

aminés amino-terminaux.

Exemple 6: Effet d'activation des neutrophiles de NSA-

1/NAP-2

Des neutrophiles sont isolés du sang humain, mis en suspension dans PBC/BSA, puis utilisés pour évaluer la capa- cité du NSA-1/NAP-2 à provoquer la libération d'élastase au moyen d'une méthode de dosage sur plaque de microtitrage de

Dewald et Baggiolini (1987). Le NSA-1/NAP-2 amorce la libé-

ration sélective de l'élastase d'une manière dépendant de laconcentration. L'influence de la concentration est analogue à celle que l'on observe avec le NAF/NAP-1 et l'activité est environ la moitié de cette du NAF et environ le tiers de

celle du fMLP.

La figure 3 représente l'activité du NSA-1/NAP-2 en

fonction de la concentration.

IIEME PARTIE: CLONAGE D'ADNc CODANT POUR LE CTAP-III PROVE-

NANT D'UNE BIBLIOTHEQUE D'EXPRESSION DE âgtll DERIVEE DE

PLAQUETTES HUMAINES

Exemple 7:

a) Isolement et lavage des plaquettes

On isole des plaquettes à partir de sang traité au ci-

trate, par centrifugation à 160 x g pendant 10 minutes, pour obtenir un plasma riche en plaquettes (PRP), et par une étape de centrifugation supplémentaire à 1100 x g pendant 10 minutes, pour obtenir un culot plaquettaire. Les plaquettes sont ensuite lavées deux fois avec 30 mmoles/l de glucose, mmoles/l de NaCl, 129 mmoles/l de'citrate de sodium, 10 mmoleF/l. d'EDTA, pH 6,5, et une fois avec 10 mmoles/l de

Tris-HCl, 154 mmoles/l de NaCl, 10 mmoles/l d'EDTA, pH 7,4.

b) Mégacarvocytes humains On les isole à partir du sang périphérique d'un patient atteint de leucémie mégacaryoblastique par centrifugation par densité de gradient de Ficoll-métrizoate. Le phénotype mégacaryoblastique de ces cellules leucémiques est basé sur leur réactivité avec des anticorps monoclonaux (AMo) sur le 2g40142 GPIIb plaquettaire, le complexe GPIIb/GPIIIa et le facteur de Willebrand (vWF). Une sonde d'ADNc pour GPIb plaquettaire donne aussi un signal positif avec un ARN messager (ARNm) de 2,4 kb (même taille que dans les plaquettes) dans une analyse par Northern blot avec un ARNm provenant de ces - cellules. c) Préparation des anticorps

On solubilise des plaquettes lavées dans du Triton X-

114 à 1% en présence de N-éthylmaléimide (NEM) et de fluo-

rure de phénylméthanesulfonyle (PMSF, dissous dans le métha-

nol) en une concentration finale de 2 mmoles/l pour chaque,

et on réalise un partage des phases comme le décrit Biochim.

Biophys. Acta 778 (1984 463. On utilise la phase aqueuse pour la chromatographie d'exclusion sur Ultrogel AcA-34 (LKB) dans du dodécylsulfate de sodium (DDS) à 0,1%, 0,1

mole/l de NH4HCO3, pH 7,4. On utilise pour immuniser des la-

pins une fraction contenant des protéines dans l'intervalle de 8- à 9- Kd, que l'on estime par électrophorèse sur gel de

dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE).

d) Immunoblot On obtient des produits de dégranulation à partir du

surnageant des plaquettes lavées stimulées avec de la throm-

bine (2 U/4 x 109/ml, 5 minutes, 37 C) et traitées avec 2 mmoles/l de PMSF et 2 mmoles/1 de NEM. On les solubilise dans 1% de SDS, on les réduit avec du dithiothréitol (DTT) à 0,1% et on les sépare à l'aide de SDS-PAGE à 20%, puis par transfert électrophorétique sur de la nitrocellulose (BA 85,

Schleicher & Shuell, Feldbach, Suisse) avec un papier élec-

troabsorbant semi-sec, sous 150 mA pendant 90 minutes. Après

l'incubation avec un antisérum polyclonal de lapin anti-

CTAP-III, on utilise un second anticorps de chèvre anti-

anticorps de lapin couplé à la phosphatase alcaline (Bio-Rad

Laboratories, Glattbrugg, Suisse) pour colorer avec les sub-

strat au nitrobleu de tétrazolium et au phosphate de 5-bro-

mo-4-chloro-3-indolyle.

2(40142

e) Construction de la bibliothèque d'expression d'ADNc On prépare un ARN total de plaquettes à partir de 180 litres de sang, en utilisant le procédé au chlorhydrate de guanidine. On isole un ARNm polyA par ch3omatographie d'affinité sur oligo(dT) cellulose (Pharmacia, Uppsala, Suède). Le premier brin est synthétisé au moyen d'amorces oligo(dT) (Parmacia P-L Biochemicals) et de transcriptase inverse (Bethesda Research Laboratories, Gibco, Bâle, Suisse). Le second brin est préparé avec de l'ARNase H (New

England Biolabs, Schwalbach bei Frankfort, RFA) et d'ADN-

polymérase I de Escherichia coli (Boehringer Mannheim, Rot-

kreuz, Suisse). Après la production d'extrémités inactivées

avec l'ADN T4-polymérase et l'enzyme de Klenow, la méthyla-

tion par EcoRI et la ligature aux linkers EcoRI, on prépare l'ADNc résultant dans une préparation d'extrait de ?gtll (Gigapack Gold, Statagene, San Diego, CA) et on l'amplifie

dans E.coli y1088.

f) Criblage de la bibliothèque et caractérisation des clones positifs On crible la bibliothèque d'expression d'ADNc ?gtll

plaquettaire par la méthode standard avec l'antisérum de la-

pin polyclonal. On élimine les anticorps spécifiques à

E.coli BNN97 par immunoadsorption sur lysat.lié à la nitro-

cellulose. Les phages recombinants positifs sont détectés

par le même second anticorps et les mêmes substrats chromo-

gènes que pour l'immunoblot. Après purification, l'ADN-' est digéré avec EcoRI (Boehringer Mannheim) et les inserts sont

isolés par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,8% et élec-

troélution dans un Bio-Trap (Schleicher & Schuell). L'ADN est précipité avec de l'éthanol et ligaturé à 5 ng de Bluescript M13 linéarisé par EcoRI (Sratagène) au moyen de T4 ligase (Bio-Lab) et transfecté dans E. coli JM 101. Les

colonies blanches sont soumises à un essai de plasmides re-

combinants positifs par le procédé d'extraction alcaline et on prépare des matrices d'ADNc monocaténaires par infection avec un phage assitant M13K07. On détermine la séquence d'ADN des deux brins par la méthode de terminaison de la chaîne didésoxy en utilisant un kit de Séquénase (United States Biochemical Corporation) et un ATPd marqué au 53S en a (New England Nuclear, DuPont). g) Analyse par Northern Blot A l'issue d'une électrophorèse dans un gel d'agarose à 1%, on sépare 1'ARNm sur un papier Hybond N (Amersham) et on le soumet à une hybridation avec une sonde d'ADNc sulfonylée à 68 C pendant 18 heures dans 4 x SSPE, 0,1% Na4P207, 0,2%

SDS, 0,5 mg/ml d'héparine contenant 100.g/ml d'ADN de sper-

macéti de saumon. Après avoir lavé deux fois pendant cinq minutes dans 1 x SSPE, 1% SDS, 0,1% Na4P2O7 à la température ambiante et deux fois pendant 30 minutes dans 0,2 x SSPE,

0,1% SDS, 0,1% Na4P207 à 68 C, on détecte l'ARNm correspon-

dant par immunocoloration avec un anticorps monoclonal de murin (AMo, Sigma, Deisenhofen, RFA) contre un ADN sulfonylé et un second anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à de la phosphatase alcaline. Les substrats sont les mêmes

que ci-dessus.

h) Résultats Les anticorps monoclonaux produits par immunisation de lapins avec une fraction de filtration sur gel contenant des protéines hydrosolubles plaquettaires dans l'intervalle de 8 à 9 kd présentent une haute avidité et une haute spécificité

sur les immunoblots et sont utilisés pour cribler une bi-

bliothèque d'expression d'ADNc gtll dérivé de plaquettes.

On purifie sur plaques deux clones positifs, provenant des

000 phages recombinants initialement criblés, et on sou-

met les deux fragments internes EcoRI à un sous-clonage dans du M13 Bluescript . Les séquences en nucléotides des deux brins sont déterminées par la méthode de terminaison des chaînes didésoxy. On obtient un clone d'ADNc entier (ACl) de 690 paires de bases (figure 5) contenant une région 5' non codante de 66 paires de bases, un cadre de lecture ouvert 2f40142 codant pour une protéine de 128 résidus d'acides aminés (13 894 da) et une région 3' non codante contenant le codon de terminaison (TAA), le signal de polyadénylation putatif et la queue polyA. Un second clone (?C2), qui commence sur la position relative 9, présente une séquence en nucléotides identique. La séquence consensus servant à amorcer la traduction en ARNm eucaryote (5' CCACCAUGA 3') commence au nucléotide 5. Une hybridation par Northern Blot d'ARNm provenant

d'une lignée cellulaire de leucémie mégacaryocytaire, de mé-

gacaryocytes et de plaquettes, mais pas d'un témoin hépato-

cyte, donne un signal positif à environ 0,8 kb avec l'ARNm

du précurseur CTAP-III, ce qui suggère que l'ADNc correspon-

dant est entier. On n'obtient aucun signal avec l'ARNm de HEL, peut-être du fait de la sensibilité plus faible de la méthode de marquage radioactif pour la sonde d'ADNc et/ou de la faible teneur en ARNm spécifique au CTAP-III de la lignée

cellulaire HELT utilisée.

La séquence en acides aminés que l'on déduit (figure 5) est identique à la séquence bien définie pour -le CTAP-III plaquettaire humain. L'extrémité amino du CTAP-III est en

position d'acide aminé 44 de la séquence traduite, et le dé-

but de son produit 5-thromboglobuline, mitogéniquement inac-

tif, de décomposition par la plasmine ou la trypsine se trouve 4 résidus en aval en position 48. On a montré qu'un

précurseur de ces protéines, le PBP, partage les dix pre-

miers résidus de CTAP-III, mais que son extrémité amino se trouve neuf résidus en amont en position 35. Tout ce que l'on sait sur la structure de ces protéines est exactement en accord avec la séquence en acides aminés dérivée du clone d'ADNc codant, ce qui est une preuve solide que les trois

protéines ont un précurseur unique.

Ainsi, la séquence leader de 34 acides aminés de CTAP-

III représentée sur la figure 5 est exceptionnellement

2 é4 0 1 4 2

longue, diffère des peptides signaux classiques et est pro-

bablement responsable du ciblage des protéines vers les a-

granulations des mégacaryocytes en voie de maturation.

Claims

R E V E N D I C A T I ONS

1. Peptide-2 d'activation des neutrophiles (NAP-2) ou va-

riante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci caractérisé en ce qu'il active les neutroqhiles humains Dour

libérer des enzymes de granulations. -

2. Facteur appelé activité 1 de stimulation des neutrophiles, qui active les neutrophiles et est dérivé des leucocytes

et/ou des plaquettes du sang.

3. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce

qu'il a une masse moléculaire d'environ 6500-7500.

à. Facteur selon la revendication3, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire apparente d'environ 6500 par électrophorèse sur gel de SDS polyacrylamide à 20% d'urée et

un point isoélectrique apparent d'environ 8,3.

5. Facteur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il a une masse moléculaire calculée de 7628 et un point

isoélectrique calculé de 8,7.

6. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce

qu'il comporte la séquence en acides aminés N-terminale sui-

vante:

Ala-Glu-Leu-Arg-Cys-Met-Cys-Ile-Lys-Thr-

Thr-Ser-Gly-Ile-Fis-Pro-Lys-Asn-Ile-Gln-,

ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.

7. Facteur selon la revendication 6, caractérisé en ce que sa séquence en acides aminés N-terminale est suivie de la

séquence en acides aminés C-terminale subséquente correspon-

- dante de. la P-TG, variante fonctionnelle, fragment ou dérivé

de celui-ci.

8. Facteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence de 70 acides aminés suivante: 1i 5 10 Ala-Glu-Leu-Arg-Cys-MetCys-Ile-Lys-Thr_ il 15 20

Thr-Ser-Gly-Ie-1is-Pro-Lys-A.sn-Ile-Gln-

2&40142

21 25 30

Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Gly-Lys-Gly-Thr-His-

31 35 - 40

Cys-Asn-Gln-Val-Glu-Val-Ile-Ala-Thr-Leu-

41 45 -50

Lys-Asp-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-

51 55 60

Asp-Ala-Pro-Arg-Ile-Lys-Lys-Ile-Val-Gln-

61 65 70

Lys-Lys-Leu-Ala-Gly-Asp-Glu-Ser-Ala-Asp

ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.

9. Variante du facteur selon la revendication 8, caracté-

risée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés

définie dans la revendication 8 précédée de Asp-Leu-Tyr-.

io0. Variante du facteur selon la revendication 8, caracté-

risée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés

définie dans la revendication 8 précédée de Ser-Asp-Leu-

Tyr-.

Ili. Variante du facteur selon la revendication a, caracté-

risée en ce qu'elle comporte la séquence de 70 acides aminés

définie dans la revendication 8 précédée de Asp-Ser-Asp-Leu-

Tyr-. 12. Procédé de préparation de NSA-1/NAP-2, caractérisé en ce qu'il comprend la purification à partir de liquides de culture de leucocytes sanguins stimulés, par chromatographie sur phosphocellulose et chromatographie à polarité de phases inversée. 13. Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend a) une chromatographie sur phosphocellulose, b) une chromatographie liquide haute pression à polarité de phases inversée sur une colonne C4, et c) une chromatographie liquide haute pression à polarité

de phases inversée sur une colonne CN-propyle.

1 4 Procédé de préparation de NSA-1/NAP-2 ou d'une variante fonctionnelle, d'un fragment ou d'un dérivé de celui-ci, ou d'un parent structurel biologiquement actif de celui-ci

comme P-TG, CTAP-III ou PBP, caractérisé en ce qu'il com-

prend le clonage d'un gène correspondant_renfermant une sé-

quence leader naturelle, l'expression du gène dans un hôte

convenable et la récupération appropriée du produit pepti-

dique, éventuellement au moyen d'une protéase appropriée.

15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que la séquence leader code pour:

1 5 10

MET-Ser-Leu-Arg-Leu-Asp-Thr-Thr-Pro-Ser-

11 15 20

Cys-Asn-Ser-Ala-Arg-Pro-Leu-His-Ala-Leu-

21 25 30

Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Leu-Leu-

Thr-Ala-Leu-Ala-

ou une variante fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de

celui-ci.

16. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend le facteur selon la revendication 1 ou une variante fonctionnelle, un fragment ou un dérivé de celui-ci, ainsi

qu'un véhicule ou un diluant pharmaceutiquement acceptable.

17. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonction-

* nelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce

qu'il est utilisable comme spécialité pharmaceutique.

38. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonction-

nelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est utilisable dans le traitement des affections qui sont accompagnées ou causées, localement ou systémiquement, par une modification du nombre ou de l'état d'activation des

PMN (cellules-neutrophiles polymorphonucléaires).

19. Facteur selon la revendication 1 ou variante fonction-

nelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce

qu'il est utilisable dans le traitement des infections bac-

tériennes, mycoplasmiques, par levures et champignons, et virales, ou dans le traitement des maladies inflammatoires ou des affections de numération neutrophilique anormalement faible et/ou de taux neutrophilique faible généralisé, et

dans la préparation d'antagonistes utilisables dans ces in-

dications.

20. Peptide leader ayant la séquence en acides aminés sui-

vante:

1 5 10

MET-Ser-Leu-Arg-Leu-Asp-Thr-Thr-Pro-Ser-

il 15 20

Cys-Asn-Ser-Ala-Arg-Pro-Leu-His-Ala-Leu-

21 25 30

Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Leu-Leu-

Thr-Ala-Leu-Ala-

ou variante fonctionnelle, fragment ou dérivé de celui-ci.

2]. Facteur selon la revendication 1, ou variante fonction-

nIlle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 12 ou 14.

22-Facteur selon la revendication 1 ou variante fonction-

nelle, fragment ou dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir de P-TG, de CTAP-III ou de PBP ou à partir d'un gène codant pour la P-TG, le CTAP-III ou le PBP.