Die Erfindung betrifft eine immunomodulatorische Substanz. Insbesondere betrifft die Erfindung einen immunostimulierenden Faktor, der neutrophile Leukozyten, insbesondere humane neutrophile Leukozyten, aktiviert. Nachstehend wird dieser Faktor als Neutrophile-stimulierende Aktivität 1 (NSA-1) oder synonym als Neutrophile-aktivierendes Peptid 2 (NAP-2) bezeichnet.
Die neutrophilen Leukozyten (Neutrophile) sind die häufigsten Leukozyten und machen etwa 2/3 der weissen Blutkörperchen im menschlichen Blut aus. Eine ihrer Hauptfunktionen besteht im Schutz des Wirtsorganismus gegen mikrobielle Infektionen. Die Neutrophilen sind mobil, reagieren auf bei Infektionen erzeugte chemotaktische Reize und können sich zur Abtötung von Mikroorganismen in das infizierte Gewebe begeben. Die Abtötung hängt von der Fähigkeit der Neutrophilen zur Einhüllung der Mikroorganismen und zur Freisetzung von Sauerstoffradikalen und miokrobiziden Enzymen ab. Die Freisetzung von derartigen Produkten hängt von der Aktivierung der Neutrophilen ab. Es sind einige Proteine mit einer derartigen Aktivität bekannt; z.B. der Neutrophile-aktivierende Faktor (NAF) (P. Peveri et al., J.
Exp.Med., Bd. 167 (1988), S. 1547), der auch als Neutrophile-aktivierendes Peptid 1 (NAP-1) bezeichnet wird.
Es wurde nunmehr festgestellt, dass eine Neutrophile-stimulierende Aktivität durch stimulierte Leukozyten in Kulturen gebildet und aus der Kulturflüssigkeit erhalten werden kann. Die Neutrophile-stimulierende Aktivität wird hier als NSA-1 oder synonym als Neutrophile-aktivierendes Peptid 2 (NAP-2) bezeichnet.
Es wurde ferner festgestellt, dass NSA-1/NAP-2 strukturell sehr ähnlich ist mit beta -Thromboglobulin ( beta -TG), Bindegewebe-Aktivierungs-Peptid III (CTAP-III) und Platelet Basic Protein (PBP).
Aufgabe der Erfindung ist es, NSA-1/NAP-2 oder funktionelle Varianten oder Fragmente davon, die noch biologische Aktivität besitzen, z.B. ein Mutein, in einem Reinheitsgrad bereitzustellen, der zur weiteren Charakterisierung und Herstellung des Produkts, beispielsweise durch rekombinante DNA-Techniken, und zur pharmazeutischen Verwendung ausreicht.
Ferner wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Herstellung von NSA-1/NAP-2 aus humanen Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen bereitgestellt.
Ferner wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Herstellung von NSA-1/NAP-2 oder funktionellen Varianten oder Fragmenten davon durch rekombinante DNA-Techniken bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Klonierung eines entsprechenden Gens oder eines Gens, das für ein Peptid, das NSA-1/NAP-2 umfasst, wie beta -TG, CTAP-III oder PBP, kodiert, mit einer natürlichen Leitsequenz (Leader-Sequenz), z.B. einer natürlichen, für humane Blutplättchen endogenen Leitsequenz, die Expression des Genprodukts in einem geeigneten Wirt und die entsprechende Gewinnung des Peptidprodukts, gegebenenfalls unter Verwendung einer geeigneten Protease.
BSA: Rinderserumalbumin
CTAP-III: Bindegewebe-Aktiverungs-Peptid III
SDS: Natriumdodexylsulfat
DTT: Dithiothreit
fLMP: N-Formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanin
LPS: Lipopolysaccharid aus E. coli 055:D5
MEM: Eagle-Minimal-Essential-Medium (Seromed GmbH, München, BRD), ergänzt mit 25 mu g/ml Neomycin, gepuffert auf pH-Wert 7,4 mit 25 millimolar NaHCO3 und 20 millimolar HEPES
MEM-PEL: enthält zusätzlich: 1% pasteurisierte Plasmaproteinlösung (5% PPL-SRK, Laboratorium des Schweizer Roten Kreuzes, Bern, Schweiz) sowie 100 IU/ml Penicillin und Streptomycin (Gibco AG, Basel, Schweiz)
MoAbs: monoklonale Antikörper
mRNA: Messenger-RNA
NAF: Neutrophile-aktivierender Faktor (= NAP-1)
NAP-1: Neutrophile-aktivierendes Peptid 1 (= NAF)
NAP-2: Neutrophile aktivierendes Peptid 2 (= NSA-1)
NEM: N- epsilon thylmaleimid
NSA-1: Neutrophile-stimulierende Aktivität 1 (= NAP-2)
PBP: Platelet Basic Protein
PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca<+><+> und Mg<+><+>
PBS-BSA: PBS ergänzt mit 0,9 millimolar CaCl2, 0,49 millimolar MgCl2 und 2,5 mg/ml BSA
PRP: an Blutplättchen reiches Plasma
PHA-P: Phytohämagglutinin (Difco Laboratories, Detroit, MI, V.St.A.)
PMN: polymorphonuklare Zellen - Neutrophile
PMSF: Phenylmethansulfonylfluorid
SDS-PAGE: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
SSPE: 180 millimolar NaCl, 10 millimolar NaH2PO4, 1 millimolar EDTA, pH-Wert 7,4
beta -TG: beta -Thromboglobulin
NSA-1/NAP-2 ist biologisch durch seine Neutrophile-aktivierenden Eigenschaften gekennzeichnet, insbesondere durch die Induktion der Freisetzung von Granula-Enzym. Auf molekularer Ebene ist NSA-1/NAP-2 durch ein Molekulargewicht von etwa 7500 und einen berechneten isoelektrischen Punkt von etwa 8,7 charakterisiert.
Es wird beispielsweise aus humanen Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen durch ein Verfahren gebildet, das die Reinigung aus Kulturflüssigkeiten von stimulierten Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen durch Phosphocellulose-Chromatographie und Phasenumkehr-Chromatographie umfasst.
NSA-1/NAP-2 aus nicht-humanen Spezies kann auf ähnliche Weise aus den entsprechenden Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen gebildet werden.
Die Stimulation kann mit beliebigen bekannten Mitteln durchgeführt werden, z.B. mit LPS und PHA-P.
Die Phosphocellulose-Chromatographie kann an einer Phosphocellulose-Säule, die mit Kaliumphosphat/NaCl/EDTA/Glycerin-Puffer bei einem etwa neutralen ph-Wert, z.B. pH-Wert 7,2, äquilibriert ist, und durch anschliessende Elution beispielsweise mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten im gleichen Puffer durchgeführt werden.
Die Phasenumkehr-Chromatographie schliesst sich vorzugsweise an die Phosphocellulose-Chromatographie an und wird vorzugsweise folgendermassen durchgeführt: Zunächst an einer präparativen Phasenumkehr-C4-Säule, die beispielsweise mit einem 0 bis 80%-Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert wird; anschliessend an einer CN-Propyl-Säule, die beispielsweise mit einem Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert wird; und anschliessend erneutes Aufsetzen der aktiven Fraktionen auf eine analytische Phasenumkehr-C4-Säule unter ähnlichen Bedingungen wie bei der CN-Propyl-Chromatographie.
Der Verlauf der Reinigung ist aus den Fig. 1a, 1b und 1c ersichtlich.
Der Reinigungsverlauf wird durch Analyse der Neutrophile-stimulierenden Aktivität verfolgt, beispielsweise durch Bestimmung der Fähigkeit zur Induktion der Freisetzung von Elastase aus humanen Neutrophilen, die mit Cytochalasin B vorbehandelt sind (B. Dewaldt und M. Baggiolini, Biochem. Pharmacol., Bd. 36 (1987), S. 2505-2510).
Für NAS-1/NAP-2 ergibt sich bei der Elektrophorese an 20% Harnstoff-SDS-Polyacrylamidgel ein Molekulargewicht von etwa 6500. Der isoelektrische Punkt wird zu etwa 8,3 bestimmt.
Die Aminosäure-Sequenzanalyse (Fig. 2) zeigt, dass die ersten 20 N-terminalen Aminosäuren genau einem gemeinsamen Bereich der Sequenz von Platelet Basic Protein (PBP) und dessen strukturellen Derivaten CTAP-III (C.W. Castor et al., PNAS, Bd. 80 (1983), S. 765-769), und beta -Thromboglobolin (G.S. Begg et al, Biochemistry, Bd. 17 (1978), S. 1739-1744) entspricht. Das Aminoende von NSA-1/NAP-2 entsprechen der Aminosäure 16 von CTAP-III und der Aminosäure 12 von beta -TG. Die Verdauung mit Carboxypeptidase Y zeigt, dass die C-terminalen Aminosäurensequenzen identisch sind (-Glu-Ser-Ala-Asp). NAS- 1/NAP-2 ist vollständig auf die Sequenz von beta -TG ausgerichtet und besteht aus 70 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 7628 und einem berechneten isoelektrischen Punkt von 8,7. Die vollständige 70-Aminosäuresequenz ist in Fig. 4 dargestellt.
Die Gesamthomologie zwischen NSA-1/NAP-2 und NAF/NAP-1 beträgt 46%. Die NSA-1/NAP-2-Sequenz enthält keine offensichtlichen Stellen für die N-Glycosylierung. Es gibt eine potentielle Stelle für die Phosphorylierung durch Protein-kinase C (Thr) in Stellung 39 und eine mögliche Amidierungsstelle (Asp) in Position 42.
Somit kann NSA-1/NAP-2 als Fragment von beta -TG angesehen werden.
Die Sequenz von NSA-1/NAP-2 kann mit der von NAF/NAP-1 auf der Basis der ersten beiden Cysteinreste (Cys 5 und Cys 7 für NSA-1/NAP-2 und Cys 7 und Cys 9 für NAF/NAP-1) ausgerichtet werden. Bei Ausrichtung auf diese Weise sind etwa die Hälfte der ersten 20 Aminosäuren von NSA-1/NAP-2 und NAF/NAP-1 identisch. Die beiden Faktoren sind somit nicht nur funktionell, sondern im bestimmten Umfang auch strukturell miteinander verwandt.
Die Kenntnis der Aminosäuresequenz von NSA-1/NAP-2 eröffnet neben der vorstehend beschriebenen Isolierung aus einer natürlichen Quelle weitere Verfahren zur Herstellung dieses Produkts. Da das Peptid nur 70 Aminosäuren umfasst, ist eine Totalsynthese auf herkömmliche Weise möglich, z.B. unter Anwendung der Merrifield-Festphasenmethode, wobei auf die Anwesenheit der beiden Disulfidbindungen entsprechend Rücksicht genommen wird.
Zu den weiteren Herstellungsverfahren gehören rekombinante DNA-Techniken, z.B. die Klonierung und Expression eines entsprechenden synthetischen Gens, gegebenenfalls nach Codon -Optimierung. Die chemische Synthese und Expression in Hefe eines für CTAP-III kodierenden Gens wurde beschrieben (G.T. Mullenbach et al., J. Biol. Chem., Bd. 261, (1986), S. 719) und ist somit auf die Anwendung von verwandten Peptiden, wie NSA-1/NAP-2, anwendbar. Jedoch besass nur ein Teil des gebildeten CTAP-III biologische Aktivität. Es ist wahrscheinlich, dass Faltungsfehler und die Bildung von falschen Disulfid-Bindungen die Hauptprobleme darstellten. Dem synthetischen Gen war keine DNA-Kodierung für eine Leitsequenz einverleibt, da für diese Klasse von Verbindungen keine Leitsequenz bekannt war.
Ein weiteres Herstellungsverfahren durch rekombinante DNA-Techniken umfasst die Klonierung und Expression eines Gens mit einer natürlichen Leitsequenz, z.B. einer für humane Blutplättchen endogenen Leitsequenz, z.B. durch Klonieren und Exprimieren einer cDNA, die aus einer entsprechenden Expressionsbibliothek ausgewählt ist und für NSA-1/NAP-2 oder ein grösseres Peptid, das NSA-1/NAP-2 umfasst, z.B. beta -TG, CTAP-III oder PBP kodiert, und die Gewinnung von NSA-1/NAP-2 auf herkömmliche Weise aus dem Expressionsprodukt. Bei einer derartigen Leitsequenz handelt es sich beispielsweise um die ersten 34 Aminosäuren in der Sequenz von Fig. 5 oder ein funktionelles Fragment oder ein Derivat davon. Beispiel 7 beschreibt die Klonierung von cDNA, die für CTAP-III aus einer humanen, von Blutplättchen abgeleiteten lambda gt11-Expressionsbibliothek kodiert.
Die Gewinnung des gewünschten Peptidprodukts aus einem grösseren Ausgangspeptid kann beispielsweise durch entsprechendes Verkürzen des grösseren Peptids auf herkömmliche Weise mit einer Protease, z.B. einer Serin-protease durchgeführt werden.
Geeignete Proteasen lassen sich beispielsweise auf herkömmliche Weise aus gereinigten Monozyten isolieren. Sie sind gegenüber PMSF stark empfindlich, mässig empfindlich gegen Leupeptin und unempfindlich gegen EDTA.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Leitsequenz direkt an dem für das gewünschte Peptid kodierenden Gen anzubringen.
Eine Herstellung über die Klonierung eines Gens mit der natürlichen Leitsequenz führt zu Peptidprodukten mit der richtigen Faltung zur Gewährleistung der vollständigen biologischen Aktivität, z.B. für die Ausrichtung auf alpha -Granula bei Expression in Säugetierzellen.
Funktionelle Fragmente von NSA-1/NAP-2 lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen. Drei Varianten von NSA-1/NAP-2 mit einer etwas verminderten biologischen Aktivität wurden ebenfalls aufgefunden. Sie weisen die in Fig. 4 gezeigte 70-Aminosäuresequenz auf, sind jedoch am N-Ende durch 3, 4 bzw. 5 entsprechende Aminosäuren von CTAP-III (vgl. Fig. 5) verlängert. Sie haben die Sequenz von Fig. 4, wobei folgende Sequenzen vorhergehen:
EMI8.1
Sie lassen sich auf die vorstehend für die Herstellung von NAP-2 aus stimulierten Blut-Leukozyten und/odor Blutplättchen beschriebene Weise herstellen. Nach Stimulierung mit LPS in Gegenwart von Monozytenkultur-Überstand wird neben NAP-2 ein kleinerer Zwischen-Peak mit einem Gehalt an den Varianten mit 73 bis 75 Resten NAP-2 erhalten. Dieser zusätzliche Peak setzt sich aus 65, 20 bzw. 15% der Produkte mit 74, 75 bzw. 73 Resten zusammen.
NSA-1/NAP-2 und funktionelle Varianten und Fragmente davon weisen biologische Aktivität auf, die sie zur Verwendung als Pharmazeutika eignet.
So indizieren sie Neutrophilen-Infiltrierung in Ratten bei Dosen von etwa 1 mu g/kg bis etwa 100 mu g/kg Tiergewicht.
NSA-1/NAP-2 und funktionelle Varianten und Fragmente davon sind somit zum Einsatz bei der Behandlung von Zuständen indiziert, die lokal oder systemisch von einer Modifikation der Anzahl oder des Aktivierungszustandes von PMN (polymorphonukleare Zellen-Neutrophile) begleitet oder durch diese verursacht sind. Sie modifizieren weitgehend diese PMN-Parameter und sind somit zum Einsatz bei der Behandlung von Zuständen iniiziert, bei denen die Erhöhung der Anzahl oder die Verstärkung des Aktivierungszustandes von PMN zu einer klinischen Besserung führt, z.B. bei Bakterien-, Mykoplasma-, Hefe-, Pilz- und Virusinfektionen.
Ferner ist ihre Anwendung indiziert bei entzündlichen Erkrankungen, wie Psoriasis, arthritischen Zuständen und Asthma oder bei Zuständen von abnormal niedriger Neutrophilenzahl und/oder einem allgemeinen niederen Neutrophilenspiegel, und bei der Herstellung von Antagonisten, z.B. monoklonalen Antikörpern, die bei derartigen Indikationen eingesetzt werden.
Da gezeigt werden konnte, dass sie, wie auch NAP-1, auf T-Lymphozyten chemotaktisch wirken, sind sie auch zum Einsatz bei gewissen immunodefizienten Zuständen geeignet.
Für obige Indikationen variiert die geeignete Dosierung selbstverständlich z.B. abhängig vom Wirt, von der Verabreichungsart und von der Art und Ernsthaftigkeit des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch befriedigende Ergebnisse erzielt bei einer täglichen Dosierung im Bereich von etwa 1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg, systemisch verabreicht. Die Gesamtdosis pro Tag beim grösseren Wirt beträgt von etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg, vorzugsweise von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg, z.B in bis zu 4 Teildosen pro Tag verabreicht.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend die Verbindung zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel können auf bekannte Weise hergestellt werden durch Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Verdünnungsmittel. Teildosen enthalten z.B. von etwa 0,025 mg bis etwa 50 mg Wirkstoff.
Obgleich eine weitgehende funktionelle Ähnlichkeit mit NAP-1 besteht, kann NSA-1/NAP-2 in vivo wahrscheinlich nur gebildet werden, wenn PBP und CTAP-III aus Blutplättchen freigesetzt werden, während die Bildung von NAF/NAP-1 durch mononukleare Phagozyten und eine grosse Vielzahl von Gewebezellen induziert wird durch inflammatorische Cytokine, wie Tumor-Nekrosefaktor und Interleukin-1. Es ist daher zu erwarten, dass die beiden Peptide in unterschiedlichen physiologischen Situationen und an unterschiedlichen Stellen auftreten. Da NAP-2 sich von Blutplättchen ableitet, wird es hauptsächlich intravaskulär erzeugt, wo die Blutplättchen-Aktivierung und -Aggregation erfolgt, z.B. in Thromben und atherosklerotischen Läsionen, während NAF/NAP-1 fast ausnahmslos in Geweben entsteht.
NSA-1/NAP-2 und dessen Varianten treten nicht in Blutplättchen oder anderen Komponenten der mononuklearen Zellkulturen auf und werden offensichtlich im Anschluss an die Freisetzung gebildet. Sie weisen die typischen Eigenschaften von chemotaktischen Rezeptor-Antagonisten auf und induzieren zytosolische freie Calciumveränderungen, Chemotaxis und Exozytose im gleichen molaren Bereich wie NAF/NAP-1, während PBP, CTAP-III und PF-4 bei 100- bis 100 000fach höheren Konzentrationen eine geringe oder gar keine Aktivität besitzen.
Von den erfindungsgemässen Produkten ist anzunehmen, dass sie bei der Erholung von Neutrophilen ebenso wirksam wie NAF/NAP-1 und C5a sind und dass sie eine Rolle bei Thrombosen spielen, wo sie Neutrophile, die an der Rekanalisierung von verstopften Gefässen beteiligt sind, anziehen können.
Fig. 1a: Präparative Phasenumkehr-Hochdruck-Flüssigchromatographie von NSA-1 an einer C4-Säule. Oberes Diagramm: Proteinverteilung, OD bei 226 nm; Unteres Diagramm: NSA-1-Aktivität, relative Freisetzung von Elastase aus humanen Neutrophilen.
Zwei Peaks sind ersichtlich: Ein kleiner Peak, entsprechend NSA-1/NAP-2, und ein grösserer Peak, entsprechend NAF/NAP-1.
Fig. 1b: Phasenumkehr-Hochdruck-Flüssigchromatographie von NSA-1/NAP-2 an einer CN-Propyl-Säule.
Bezüglich der Einzelheiten wird auf Fig. 1a verwiesen.
Fig. 1c: Phasenumkehr-Hochdruck-Flüssigchromatographie von NSA-1/NAP-2 an einer C4-Säule. Bezüglich der Einzelheiten wird auf Fig. 1a verwiesen.
Fig. 2: Aminoterminale Sequenz von NSA-1/NAP-2. Die ersten 20 Reste sind dargestellt. Sie entsprechen einem Teil der Sequenz von beta -Thromboglobolin.
Fig. 3: NSA-1/NAP-2-induzierte Exozytose in mit Cytochalasin B behandelten humanen Neutrophilen. Konzentrationsabhängigkeit.
Fig. 4: Aminosäuresequenz von NSA-1/NAP-2.
Fig. 5: cDNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der Vorstufe von PBP (Beginn mit Nucleotid 103), CTAP-III (Beginn mit Nucleotid 130), beta -TG (Beginn mit Nucleotid 142) und NSA-1/NAP-2 (Beginn mit Nucleotid 175). Die beiden internen Disulfidbindungen sind mit Sternen bzw. Quadraten gekennzeichnet.
Das vermutliche Polyadenylierungssignal ist unterstrichen (Nucleotide 581-586). Die EcoRI-Erkennungsstelle ist mit einem darüberliegenden Strich versehen.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläutert.
Teil 1: Herstellung von NSA-1/NAP-2 aus humanem Blut. Reinigung und Charakterisierung
Beispiel 1:
Bildung von NSA-1/NAP-2 durch LPS stimulierte humane Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen
Einer Antikoagulationsbehandlung unterworfenes Spenderblut, das vom Laboratorium des Schweizer Roten Kreuzes erhalten und bis zu 20 Stunden bei 4-10 DEG C gelagert worden war, wurde verwendet. Mononukleare Zellen (bestehend aus Monozyten und Lymphozyten in einem Verhältnis von etwa 1:5) wurden aus Einzel-Leukozytenfilmen an Ficoll-Hypaque-Gradienten (A. Boyum, Scand. J. Immunol., Bd. 5, (1976), S. 9-15) isoliert und in MEM gewaschen. Die gewaschenen Zellen aus 6 Leukozytenfilmen wurden in MEM-PPL (5x10<6> Zellen/ml) resuspendiert und 20 Stunden in Gegenwart von 1 mu g/ml LPS in Glasgefässen, die mit einer Rührvorrichtung ausgerüstet waren, gezüchtet.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquotproben aus den Kulturmedien entnommen und die Neutrophile-stimulierende Aktivität wurde anhand der Fähigkeit zur Induktion der Freisetzung von Elastase aus humanen Neutrophilen, die mit Cytochalasin B vorbehandelt waren, bestimmt (B. Dewald und M. Baggiolini, Biochem. Pharm., Bd. 36 (1987), S. 2505-2510). Dieser Test weist sowohl NSA-1 als auch NAF, einem bekannten Neutrophile-aktivierenden Faktor (Peveri et al., J. Exp. Med., Bd. 167 (1988), S. 1547-1559) nach. Die Neutrophilen-stimulierende Aktivität stieg mit der Zeit an und war nach 24 bis 48 Stunden gleichbleibend.
Beispiel 2
Bildung von NSA-1/NAP-2 durch mit PHA-P stimulierte humane Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen
Einer Antikoagulationsbehandlung unterworfenes Spenderblut, das vom Laboratorium des Schweizer Roten Kreuzes erhalten und bis zu 20 Stunden bei 4-10 DEG C gelagert worden war, wurde verwendet. Mononukleare Zellen (bestehend aus Monozyten und Lymphozyten in einem Verhältnis von etwa 1:5) wurden aus Einzel-Leukozytenfilmen an Ficoll-Hypaque-Gradienten [A. Boyum, (1976)] isoliert und in MEM gewaschen. Die gewaschenen Zellen aus 6 Leukozytenfilmen wurden in MEM-PPL (5x10<6> Zellen/ml) resuspendiert und 20 Stunden in Gegenwart von 5 mu l/ml PHA-P in Glasgefässen, die mit einer Rührvorrichtung ausgerüstet waren, gezüchtet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquotproben aus den Kulturmedien entnommen und die Neutrophile-stimulierende Aktivität wurde anhand der Fähigkeit zur Induktion der Freisetzung von Elastase aus humanen Neutrophilen, die mit Cytochalasin B vorbehandelt waren bestimmt.
Die Neutrophile-stimulierende Aktivität stieg mit der Zeit an und war nach 24 bis 48 Stunden gleichbleibend.
Beispiel 3
Reinigung von NSA-1/NAP-2 aus Kulturflüssigkeiten von mit LPS stimulierten humanen Blut-Leukozyten und/oder Blutplättchen
a) Phosphocellulose-Chromatographie
Portionen von jeweils 700 ml zellfreien Kulturflüssigkeiten von gemäss Beispiel 1 stimulierten humanen Leukozyten wurden direkt auf eine 15-ml-Phospocellulose-Säule (Whatman P11), die mit Puffer A (20 millimolar Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2, mit einem Gehalt an 20 millimolar NaCl, 1 millimolar EDTA und 5% Glyzerin) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Diese Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und anschliessend mit 120 ml (24 ml/h) eines linearen NaCl-Konzentrationsgradienten (0,02-1,5 m) in Puffer A eluiert. Die Fraktionen wurden auf ihre Neutrophile-stimulierende Aktivität analysiert.
b) Phasenumkehr-Chromatographie
Bei der Phosphocellulose-Chromatographie-Trennung erhaltene aktive Fraktionen wurden vereinigt und durch 4 wiederholte Läufe über eine weitporige, präparative Phasenumkehr-C4-Säule (10x250 mm, 7 mu m, Macherey-Nagel, Düren, BRD) weiter gereinigt. Die Säule wurde mit 2 ml/min eines Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure mit einer Steigerung von 0,66% pro min eluiert.
Die aktiven Fraktionen mit einer Retentionszeit von 20 bis 26 min wurden vereinigt, in einer Speed-Vac-Zentrifuge eingeengt und auf eine analytische Phasenumkehr-CN-Propyl-Säule (4,6 x 250 mm, 5 mu m, weitporig, Baker Research Products, Phillipsburg, N.J., V.St.A.) aufgesetzt. Die Säule wurde mit 0,5 ml/min eines Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure mit einer Steigerung von 0,66% pro min eluiert. Aktive Fraktionen mit einer Retentionszeit von 22 bis 25 min wurden vereinigt, eingeengt und einem erneuten Lauf über eine analytische Phasenumkehr-C4-Säule (4,6 x 250 mm, 5 mu m weitporig, Baker Research Product) unter den vorstehend für die CN-Propyl-Säule beschriebenen Bedingungen unterworfen.
Aktive Fraktionen mit einer Retentionszeit von 42,5 min wurden in einer Speed Vac-Zentrifuge getrocknet, in sterilem Wasser resuspendiert und anschliessend für die Gasphasen-Sequenzanalyse und für biologische Tests verwendet. Fig. 1 zeigt die Abtrennung von NSA-1/NAP-2 aus NAF/NAP-1 und die für die Aminosäure-Sequenzanalyse verwendeten Fraktionen.
Beispiel 4
Gelelektrophorese von gereinigtem NSA-1/NAP-2
Gereinigtes NSA-1/NAP-2 wurde an 20% Harnstoff-SDS-Polyacrylamidgel gemäss B. Kadenbach et al., Analyt. Biochem., Bd. 129 (1983), S. 517-521 analysiert. Eine einzelne Bande mit einem gemessenen Molekulargewicht von 6500 wurde nach Sichtbarmachen mit Silberfärbung erhalten. NAP-2 wanderte geringfügig schneller als NAF/NAP-1.
Beispiel 5
Aminosäure-Sequenzanalyse von NSA-1/NAP-2
Die Aminosäure-Sequenzanalyse wurde mit einem automatisierten Phenylisothiocyanat-Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems-Gasphasen-Sequenziergeräts Modell 477 A durchgeführt. Proben von NSA-1/NAP-2 (500 pMol) wurden direkt oder nach chemischer Modifikation aufgesetzt. Die Reduktion und Alkylierung wurde folgendermassen durchgeführt: 1 nMol NSA-1/NAP-2 wurde in 150 mu l 6 m Guanidinium-hydrochlorid, 2 millimolar EDTA, 0,2 m Tris-HCl, pH-Wert 8,3 verdünnt und anschliessend wurden 225 nl Tributylphosphin in 15 mu l Acetonitril zugesetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 60 Minuten wurden 160 nl 4-Vinylpyridin in 10 mu l Acetonitril zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde eine gleiche Menge an Tributylphosphin und Vinylpyridin zugesetzt, und die Umsetzung wurde weitere 40 Minuten unter Stickstoff fortgesetzt.
Die Lösung wurde mit Trifluoressigsäure auf den pH-Wert 2,0 angesäuert und durch Phasenumkehr-HPLC in 0,1% Trifluoressigsäure mit einem Acetonitrilgradienten entsalzt,
Das Carboxyende wurde mit 0,5 nMol NAP-2 und 0,4 mu g Carboxypeptidase P oder Carboxypeptidase Y (Sequenzierungsqualität, Boehringer) bestimmt.
Fig. 2 zeigt die Analyse der ersten 20 aminoendständigen Aminosäuren.
Beispiel 6
Neutrophile-aktivierende Wirkung von NSA-1/NAP-2
Die Neutrophilen wurden aus humanem Blut isoliert, in PBS/BSA suspendiert und anschliessend zur Ermittlung der Kapazität von NSA-1/NAP-2 in Bezug auf die Induktion der Elastase-Freisetzung unter Anwendung des Mikrotitorplatten-Bestimmungsverfahrens von Dewald und Baggiolini (1987) verwendet. NSA-1/NAP-2 induzierte die selektive Freisetzung von Elastase in konzentrationsabhängiger Weise. Die Konzentrationsabhängigkeit war ähnlich der bei NAF/NAP-1 beobachteten Abhängigkeit, und die Stärke betrug etwa die Hälfte von der von NAF und etwa ein Drittel von der von fMLP.
Fig. 3 zeigt die konzentrationsabhängige Aktivität von NSA-1/NAP-2.
Teil II:
Klonierung von cDNA, die für CTAP-III aus einer humanen, von Blutplättchen abgeleiteten lambda gt11 Expressionsbibliothek kodiert.
Beispiel 7
a) Isolieren und Waschen von Blutplättchen
Blutplättchen wurden aus citratbehandeltem Blut durch 10minütige Zentrifugation bei 160 g unter Bildung eines an Blutplättchen reichen Plasmas (PRP) und durch eine weitere 10minütige Zentrifugationstufe bei 1100 g unter Bildung eines Blutplättchens-Pellets isoliert. Die Blutplättchen wurden sodann zweimal mit 30 mMol/Liter Glukose, 120 mMol/Liter NaCl, 129 mMol/Liter Natriumcitrat, 10 mMol/Liter EDTA, pH-Wert 6,5 und einmal mit 10 mMol/Liter Tris/HCl, 154 mMol/Liter NaCl, 10 mMol/Liter EDTA, pH-Wert 7,4 gewaschen.
b) Humane Megakaryozyten
Die Megakaryozyten wurden aus dem pheripheren Blut eines Patienten mit megakaryoplastischer Leukämie durch Ficoll-Metriuzoat-Gradienten-Dichtezentrifugation isoliert. Der megakaryoplastische Phänotyp dieser leukämischen Zellen beruht auf ihrer Reaktivität mit monoklonalen Antikörpern (MoAbs) zu Blutplättchen-GPIIb, dem GPIIb/GPIIIa-Komplex und vWF (von Willebrand-Faktor). Eine cDNA-Sonde für Blutplättchen-GPIb ergab auch ein positives Signal mit einer Messenger-RNA (mRNA) von 2,4 kb (gleiche Grösse wie in Blutplättchen) beim Northern-Blotting mit mRNA aus diesen Zellen.
c) Präparation von Antikörpern
Gewaschene Blutplättchen wurden in 1% Triton X-114 in Gegenwart von N-Ethylmaleimid (NEM) und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, gelöst in Methanol) in einer Endkonzentration von jeweils 2 mMol/Liter gelöst. Eine Phasenverteilung wurde gemäss den Angaben in Biochim. Biophys. Acta, Bd. 778 (1984), S. 463 durchgeführt. Die wässrige Phase wurde für die AcA-34-Ultrogel (LKB)-Ausschlusschromatographie in 0,1% Natriumdodecylsulfat (DDS), 0,1 Mol/Liter NH4HCO3, pH-Wert 7,4, verwendet. Eine Fraktion mit einem Gehalt an Proteinen im 8- und 9-KD-Bereich, bestimmt durch Natriumdodecyl-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde zur Immunisierung von Kaninchen verwendet.
d) Immunoblotting
Degranulationsprodukte wurden aus dem Überstand von Blutplättchen erhalten, die mit Thrombin (2 U/4 x 10<9>/ml 5 Minuten, 37 DEG C) und mit 2 mMol/Liter PMSF und 2 mMol/Liter NEM behandelt worden waren. Sie wurden in 1% SDS gelöst, mit 0,1% Dithiothreit (DTT) reduziert und mit 20% SDS-PAGE abgetrennt, wonach sich eine elektrophoretische Übertragung auf Nitrocellulose (BA 85, Schleicher & Schuell, Feldbach, Schweiz) mit einem Halbtrocken-Elektroblotter bei 150 mA und einer Behandlungszeit von 90 Minuten anschloss. Nach Inkubation mit einem anti-CTAP-III-Kaninchen-polyklonalem-Antiserum wurde ein Ziegen-Antikaninchen-zweiter-Antikörper, gekuppelt an alkalische Phosphatase (Bio-Rad-Laboratories, Glattbrugg, Schweiz) zum Färben mit den Substraten Nitroblautetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat verwendet.
e) Konstruktion der cDNA-Expressionsbibliothek
Die gesamte RNA aus Blutplättchen von 180 Liter Blut wurde unter Anwendung des Guanidin-hydrochlorid-Verfahrens gewonnen. Poly-A-mRNA wurde durch oligo(dT)-Cellulose (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Affinitätschromatographie isoliert. Der erste Strang wurde unter Verwendung von oligo(dT)-Primern (Pharmacia P-L Biochemicals) und reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Gibco, Basel, Schweiz) synthetisiert. Der zweite Strang wurde mit RNase H (New England Biolabs, Schwalbach bei Frankfurt, BRD) und Escherichia coli-DNA-Polymerase I (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Schweiz) erhalten.
Nach Bildung von stumpfen Enden mit T4-DNA-Polymerase und Klenow-Enzym, EcoRI-Methylierung und Ligation an EcoRI-Linker wurde die erhaltene cDNA in lambda gt11-Packungsextrakt (Gigapack Gold, Stratagene, San Diego, CA) gepackt und in E. coli y1088 amplifiziert.
f) Bibliothekenscreening und Charakterisierung der positiven Klone
Die Blutplättchen- lambda gt11-cDNA-Expressionsbibliothek wurde einem Screening nach einem Standardverfahren mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum unterworfen. E-coli-spezifische Antikörper wurden durch Immunoadsorption an Nitrocellulose-gebundenem Lysat von E. coli BNN97 entfernt. Positive, rekombinante Phagen wurden mit dem gleichen zweiten Antikörper und chromogenen Substraten, wie sie für das Immunoblotting verwendet wurden, nachgewiesen. Nach Reinigung wurde die lambda -DNA mit EcoRI (Boehringer Mannheim) verdaut und die Inserte durch 0,8%-Agarosegel-Elektrophorese und Elektroelution in einem Bio-Trap (Schleicher & Schuell) isoliert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und mit 5 ng EcoRI-linearisiertem M13 Bluescript (Stratagene) unter Verwendung von T4-Ligase (Bio-Lab) verknüpft und in E. coli JM1Ol transfiziert.
Weisse Kolonien wurden auf positive, rekombinante Plasmide gemäss dem alkalischen Extraktionsverfahren getestet und einzelsträngige cDNA-Schablonen wurden durch Infektion mit M13K07-Helferphagen hergestellt. Die DNA-Sequenz beider Stränge wurde durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren unter Verwendung von Sequenase Kit (United States Biochemical Corporation) und <3><5>S- alpha -markiertem dATP (New England Nuclear, DuPont) bestimmt.
g) Northern-Blotanalyse
Im Anschluss an die Elektrophorese in einem 1%-Agarosegel wurde die mRNa auf Hybond N (Amersham) geblottet und sodann mit einer sulfonylierten cDNA-Sonde 18 Stunden bei 68 DEG C in 4 x SSPE, 0,1% Na4P2O7, 0,2% SDS, 0,5 mg/ml Heparin mit einem Gehalt an 100 mu g/ml Lachssperma-DNA hybridisiert. Nach zweimaligem Waschen von jeweils 5 Minuten in 1 x SSPE, 1% SDS, 0,1% Na4P2O7 bei Raumtemperatur und zweimaligem 4,30-minütigem Waschen in 0,2 x SSPE, 0,1% SDS, 0,1% Na4P2O7 bei 48 DEG C wurde die entsprechende mRNA durch Immunofärben mit einem Mäuse-monoklonalen-Antikörper (MoAB; Sigma, Deisenhofen, BRD) gegen sulfonylierte DNA und einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-Antimaus-IgG-zweiten Antikörper nachgewiesen. Es wurden die vorstehend angegebenen Substrate verwendet.
h) Ergebnisse
Durch Immunisierung von Kaninchen mit einer Gelfiltrations-Fraktion mit einem Gehalt an wasserlöslichen Blutplättchen-Proteinen im 8 bis 9 kd-Bereich gebildete polyklonale Antikörper ergaben eine hohe Reaktionsfähigkeit und Spezifität auf Immunoblots und wurden zum Screening einer von Blutplättchen abgeleiteten lambda gt11-cDNA-Expressionsbibliothek verwendet. 2 positive Klone aus 100 000 ursprünglich dem Screening unterworfenen, rekombinanten Phagen wurden einer Plaquereinigung unterworfen, und die beiden internen EcoRI-Fragmente wurden der Subklonierung in M13-Bluescript< TM > unterworfen. Die Nucletodidsequenzen beider Stränge wurden mit den Didesoxy-Kettenterminationsverfahren bestimmt.
Ein cDNA-Klon ( lambda C1) voller Länge mit 690 Basenpaaren wurde erhalten (Fig. 5), der einen 5 min -nicht-kodierenden Bereich von 66 Basenpaaren, einen offenen Leserahmen, der für ein Protein von 128 Aminosäureresten (13 894 da) kodiert und einen 3 min -nicht-kodierenden Bereich mit einem Gehalt an dem Terminationscodon (TAA), das mutmassliche Polyadenylierungssignal und den poly A-Schwanz enthält. Ein zweiter Klon ( lambda c2), beginnend mit der relativen Position -9 zeigte eine identische Nucleotidsequenz.
Die Übereinstimmungssequenz für die Initiation der Translation in eukaryontischer mRNA (5 min CCACCAUGA 3 min ) beginnt beim Nucleotid -5.
Northern-Blot-Hybridisierung von mRNA aus einer megakaryozytischen Leukämie-Zellinie, Megakaryozyten und Blutplättchen, jedoch nicht aus einer Hepatozytenkontrolle ergab ein positives Signal bei etwa 0,8 kb mit der mRNA der CTAPIII-Vorstufe, was darauf schliessen lässt, das die entsprechende cDNA die volle Länge aufweist. Kein Signal wurde mit HEL-mRNA erhalten, was möglicherweise auf die geringere Empfindlichkeit des nicht-radioaktiven Markierungsverfahrens auf die cDNa-Sonde und/oder auf den geringen CTAP-III-spezifischen mRNA-Gehalt der verwendeten HEL-Zellinie zurückzuführen ist.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz (Fig. 5) ist identisch mit der gesicherten Sequenz von humanem Blutplättchen CTAP-III. Das Aminoende von CTAP-III befindet sich in der Aminosäureposition 44 der translatierten Sequenz und der Beginn des mitogen-inaktiven Plasmin- oder Trypsin-Abbauprodukts beta -Thromboglobulin befindet sich 4 Reste weiter unten in Position 48. Von einer Vorstufe dieser Proteine, PBP, wurde gezeigt, dass sie die ersten 10 Reste von CTAP-III gemeinsam hat, dass dessen Aminoende sich aber 9 Reste in Stomaufwärtsrichtung in Position 35 befindet. Sämtliche bekannten Strukturinformationen über diese 3 Proteine stimmen genau mit der Aminosäuresequenz überein, die von dem kodierenden cDNA-Klon abgeleitet ist, was einen starken Hinweis auf eine einzige Vorstufe für alle drei Proteine darstellt.
Somit ist die in Fig. 5 gezeigte 34-Aminosäure-Leitsequenz von CTAP-III ungewöhnlich lang, unterscheidet sich von klassischen Signalpeptiden und ist vermutlich für die Zielrichtung des Proteins auf alpha -Granulae von reifenden Megakaryozyten verantwortlich.