JP3051160B2

JP3051160B2 - 好中球活性化ペプチド‐２

Info

Publication number: JP3051160B2
Application number: JP2500533A
Authority: JP
Inventors: バギオリニ、マルコ; クレメトソン、ケンネス・ヨハン; ワルツ、アルフレッド
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト; テオドール・コヘル・インスティテュート
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1989-11-17
Publication date: 2000-06-12
Anticipated expiration: 2015-06-12
Also published as: JPH03503767A; GR890100810A; KR910700260A; GB2231872A; CA2004685A1; AU634508B2; BE1003636A4; CH681625A5; NL8921262A; FR2640142A1; WO1990006321A1; SE9002589L; DK188690D0; GB2231872B; GB9011468D0; GR1000455B; AU4655689A; FR2640142B1; IL92557A0; DK188690A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、免疫調節物質に関るものである。

より具体的には、好中白血球、とりわけヒト好中白血
球を活性化する免疫刺激因子に関るものである。これ
は、今度、好中球刺激活性１（NSA−１）または、同義
的に好中球刺激ペプチド（NAP−２）と称する。

1.背景好中白血球（好中球）は、最も一般的な白血球であ
り、ヒト血液中の白血球の約2/3をしめる。これらは、
宿主有機体を微生物感染から譲るのが、主な機能であ
る。好中球は可動性であり、感染により引きおこされる
走化性刺激に応答し、感染した組織中に移動し、微生物
を殺すことができる。微生物を殺すのは、好中球が微生
物をのみこみ、酵素ラジカルおよび殺微生物性酵素を放
出する能力に依存する。このような産生物の放出は、好
中球の活性に依存する。

数種のタンパクが、このような活性を有していること
は周知である。たとえば好中球活性化因子（NAF）（P.
ペベリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ
ディシン167巻1547頁（1988年））であり、好中球活性
化ペプチド１（NAP−１）とも称せられる。

2.本発明の要旨好中球刺激活性は、刺激を受けた培養白血球により産
み出され、培養液から得ることができるということが、
現在明らかになっている。好中球刺激活性は、本明細書
ではNSA−１または同義的に好中球活性化ペプチド−２
（NAP−２）と称する。

NSA−1/NAP−２は、構造的にはβ−スロンボグロブリ
ン（β−TG）、結合組織活性化ペプチドIII（CTAP−II
I）および血小板基礎タンパク（PBP）に極めて類似して
いることも、明らかになっている。

本発明の目的は、さらに特性化することができる程度
に十分に精製された、NSA−1/NAP−２、またはこの生物
学的活性を有するその機能的変種、フラグメントもしく
は誘導体、たとえば突然変異タンパク、たとえば組み換
えDNA技法による製造、並びにその薬剤としての使用を
提供することである。

本発明は、さらに、たとえばヒト血液白血球および／
または血小板からNSA−1/NAP−２を調製する方法を提供
するものである。

本発明は、さらに、好中白血球の活性化およびそれに
伴う、感染に対する抵抗性の増強における、NSA−1/NAP
−２の使用を提供するものである。

本発明は、さらに、天然の先導配列、たとえばヒト血
小板に内因性の天然の先導配列を含有する対応する遺伝
子のクローニングし、それを適当な宿主内で発現させる
こと、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用し
て、ペプチド産生物を適当に回収することから成る組み
換えDNA技法により、NSA−1/NAP−２または、それの機
能的変種、フラグメントもしくは誘導体もしくはそれの
生物学的活性を有する構造相関物、たとえばβ−TG、CT
AP−IIIもしくはPBPの調製方法を提供するものである。

3.略語 BSA:ウシ血清アルブミン CTAP−III:結合組織活性化ペプチドIII DDS:ドデシル硫酸ナトリウム DTT:ジチオスレイトール fMLP:N−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−フェニルアラニン LPS:エシエリキア・コリ055:D5のリポ多糖類 MEM:イーグル最小必須培地（ゼロメド・ゲゼルシヤフト
・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク、ミューニッ
ヒ、西ドイツ）に25μg/mlネオマイシンを加え、25mM炭
酸水素ナトリウムおよび20mM HEPESでpH7.4に緩衝した
もの MEM−PPL:1％低温殺菌血しょうタンパク液（５％PPL−S
RK、スイス赤十字研究所、ベルン、スイス）並びに100I
U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン（ギブコ・ア
クリチエンゲゼルシヤフト、バーゼル、スイス）を含有
したもの MOAbs:モノクローナル抗体 mRNA:メッセンジャーRNA NAF:好中球活性化因子（＝NAP−１） NAP−1:好中球活性化ペプチド１（＝NAF） NAP−2:好中球活性化ペプチド２（＝NSA−１） NEM:N−エチルマレイミド NSA−1:好中球刺激活性１（＝NAP−２） PBP:血小板塩基性タンパク PBS:Ca⁺⁺およびMg⁺⁺不含リン酸塩緩衝生理食塩水 PBS−BSA:0.9mM塩化カルシウム、0.49mM塩化マグネシウ
ムおよび2.5mg/ml BSAを加えたPBS PRP:血小板に富む血しょう PHA−P:植物性赤血球凝集素（ディフコ・ラボラトリー
ズ、デトロイト、ミシシッピー州、米国） PMN:多形核細胞−好中球 PMSF:フェニルメタン−スルホニル−フルオライド SDS−PAGE:ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動 SSPE:180mM塩化ナトリウム、10mMリン酸二水水素ナトリ
ウム、1mM EDTA、pH7.4 β−TG:β−スロンボグロブリン 4.詳細な説明 NSA−1/NAP−２は、好中球活性化特性、とりわけ顆粒
酵素放出を誘起するという生物学的特徴がある。分子の
見地から、NSA−1/NAP−２は、分子量約7500、算出等電
点約8.7という特徴を有する。

これは、刺激された血液白血球および／または血小板
の培養液からのリン酸セルロースクロマトグラフィーお
よび逆相クロマトグラフィーによる精製から成る方法に
より、たとえばヒト血液白血球および／または血小板か
ら産生する。

ヒト以外の種のNSA−1/NAP−２は、対応する血液白血
球および／または血小板から、類似の方法で産生するこ
とができる。

刺激は、既知の任意の試薬、たとえばLPSおよびPHA−
Ｐで行ってよい。

リン酸セルロースクロマトグラフィーは、たとえばリ
ン酸カリウム／塩化ナトリウム/EDTA/グリセロール緩衝
液、おおよそ中性のpH、たとえばpH7.2で平衡にしたリ
ン酸セルロースカラムを用い、続いてたとえば同じ緩衝
液中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配で溶出して行う。

逆相クロマトグラフィーは、リン酸セルロースクロマ
トグラフィーの後に行うのが好ましく、最初に、予備逆
相C4カラムを用い、たとえば、0.1％トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルを０〜80％勾配にした溶出液で溶出
し、その後CN−プロピルカラムを用い、たとえば0.1％
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル０〜80％勾配にし
た溶出液で溶出し、次いで、活性フラクションを、CN−
プロピルクロマトグラフィーで用いたのと同様な条件下
で、分析用逆相C4カラムに再び流すのが好ましい。

精製の経過は、第1a、1bおよび1cに示す。

精製したものは、引き続いて好中球刺激活性を、たと
えばサイトカラシンＢ（B.デワルドおよびM.バギオリ
ニ、バイオケミカル・ファーマコロジー36巻2505〜2510
頁（1987年））で前処理したヒト好中球からのエラスタ
ーゼ放出誘起能力として測定する。

NSA−1/NAP−２は、20％尿素−SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によれば、約6500の見かけの分子量を有
していることが明らかになった。見かけの等電点は約8.
3である。

アミノ酸配列分析によれば、最初の20N−末端アミノ
酸は、血小板基礎タンパク（PBP）およびそれの構造誘
導体CTAP−III（C.W.カストールら、PNAS80巻765〜769
頁（1983年））およびβ−スロンボグロブリン（G.S.ベ
ッグら、バイオケミストリー17巻1739〜1744頁（1987
年））の共通した部分の配列と正確に一致することが示
された（第２図）。NSA−1/NAP−２のアミノ末端は、CT
AP−IIIのアミノ酸16およびβ−TGのアミノ酸12に対応
する。カルボキシペプチダーゼＹで分解すると、Ｃ末端
アミノ酸配列も同一（−Glu−Ser−Ala−Asp）であるこ
とが示された。NSA−1/NAP−２はβ−TGの配列と完全に
並び、算出分子量は7628、算出等電点は8.7で70のアミ
ノ酸から構成される。70のアミノ酸の全配列は、第４図
に示す。NSA−1/NAP−２とNAF/NAP−１の全体の相同性
は46％である。NSA−1/NAP−２配列は、見かけ上、Ｎ−
グリコシル化のための部位を全く含まない。プロテイン
キナーゼＣによるホスホリル化のための潜在的な部位
（Thr）が39位に、アミド化が可能な部位（Asp）が42位
にある。

従って、NSA−1/NAP−２は、β−TGのフラグメントで
あると考えられる。

NSA−1/NAP−２の配列は、NAF/NAP−１の配列と、２
つの最初のシステイン残基に基づいて（NSA−1/NAP−２
のCys5およびCys7、並びにNAF/NAP−１のCys7およびCys
9）並べることができる。このように並べた場合、NSA−
1/NAP−２およびNAF/NAP−１の最初の20アミノ酸の約1/
2が同一である。従って、２つの因子は、機能的だけで
なく、ある程度構造的にも相関している。

NSA−1/NAP−２のアミノ酸配列の入手可能性は、上述
の天然資源からの単離に加え、別の方法による製造可能
性をひらくことになる。すなわち、ペプチドは70アミノ
酸しか含まないので、たとえばメリーフィールドの固相
法を用いて、および２個のジスルフィド結合の存在に必
要な注意を払って、従来のやり方で全合成が可能であ
る。

別の産生方法には、所望によりコドンの最適化をした
後で、たとえば対応する合成遺伝子をクローニングおよ
び発現化する、組み換えDNA技法がある。遺伝子をコー
ド化したCTAP−IIIの化学合成および酵母中での発現に
ついては、既に報告されており（G.T.ムーレンバッハ
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
261巻719頁（1986年））、NSA−1/NAP−２のような関連
したペプチドの産生にも適用できる。しかし、生成した
CTAP−IIIの一部しか生物学的活性を有さない。折りた
たみの誤り、およびジスルフィド結合が正しく形成され
ていないことが、主な問題であったと思われる。この種
の化合物の、このような先導配列は既知ではないので、
先導配列のDNAコードは、合成遺伝子中に組み込まれて
いなかった。

さらに、組み換えDNA技術による産生方法には、たと
えば適当な発現ライブラリーから選択した相補的DNAの
クローニングおよび発現化、並びにNSA−1/NAP−２また
はNSA−1/NAP−２を包含するより大きなペプチド、たと
えばβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPのコード化、および
発現産生物から常法によるNSA−1/NAP−２の回収によ
り、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に固有の天然
先導配列を含有する遺伝子をクローニングおよび発現化
する方法がある。このような先導配列は、第５図の配列
中では最初の34のアミノ酸、またはそれの機能的フラグ
メントもしくは誘導体である。実施例７では、ヒト血小
板由来λgt11発現ライブラリーから、CTAP−IIIの相補
的DNAのコードのクローニングについて記載している。
より大きな親ペプチドから望ましいペプチド産生物の回
収は、たとえば、常法により、セリンプロテアーゼなど
のプロテアーゼで、より大きなペプチドを適当に短くき
ることにより行うことができる。

適当なプロテアーゼは、たとえば常法により精製単球
から単離できる。これは、PMSFに対する感受性が高く、
レウペチンには穏やかな感受性を示し、EDTAには感受性
がない。

変法としては、先導配列を、望ましいペプチドの遺伝
子コードに直接つけることができる。

天然の先導配列を含有する遺伝子のクローニングを行
う調製の結果、十分な生物学的活性を示すため、たとえ
ば哺乳動物の細胞中で発現化した場合、α顆粒を標的に
するために適当な折りたたみを有するペプチド産生物が
できる。

NSA−1/NAP−２の機能的なフラグメントまたは誘導
体、たとえばムテインは、当業界で既知の方法に従って
調製できる。

いく分生物学的活性を減じたNSA−1/NAP−２の３種の
変種をも見出されており、第４図で示された70のアミノ
酸配列を有しているが、対応するCTAP−IIIのアミノ酸
配列をそれぞれ３、４および５個、Ｎ末端で延長されて
いる。すなわち、これらは各々、で始まる、第４図で示した配列を有しており、長さは各
々、73、74および75アミノ酸になる。

これらは、刺激された血液白血球および／または血小
板からNAP−２の調製について上に記載されたように産
生することができる。すなわち、単球培養上清の存在
下、LPSで刺激すると、NAP−２に加え、NAP−２の73−7
5残基変種を含有する小さな中間ピークが得られる。こ
の付加的なピークは、74、75および73残基体により、各
々65、20および15％まで作られる。

NSA−1/NAP−２並びにそれの機能的変種、フラグメン
トおよび誘導体は、薬学的な使用を示唆する生物学的活
性を有する。

たとえば、これらは、ラットにおいて動物の体重あた
り約１μg/kg〜約100μg/kgの投与量で、好中球の浸入
を誘起する。

従って、NSA−1/NAP−２並びにそれの機能的変種、フ
ラグメントおよび誘導体は、PMN（多形核細胞−好中
球）の数の変化または活性化状態により、局所的または
全身的に伴うかまたは引き起こされる症状の処置の使用
に適用される。これらは、このPMNパラメーターを広範
に変化させ、それ故に、たとえば細菌、マイコプラズ
マ、酵母および真菌、並びにウイルスの感染において、
PMNの数の増加や、活性状態の増強が臨床改善をもたら
すような症状の処置のための使用に適用される。さら
に、炎症性疾患たとえば乾癬、関節炎の症状およびぜん
息、または好中球のカウントが異常に低い、および／ま
たは常時好中球レベルが低い状態、並びにこれらの適用
時に使用される拮抗物質、たとえばモノクローナル抗体
の調製時の使用のために適用される。

これらは、NAP−１と同様、Ｔリンパ球に対して走化
性をもつことが示されているので、ある種の免疫不全状
態における使用のためにも適用される。

これらの適用のために適した投与量は、もちろん、た
とえば宿主、投与方法並びに処置すべき状態の性質およ
び重篤度に依存して変化させる。しかし、一般的に、１
日投与量が動物の体重あたり約1mg/kg〜約100mg/kgで全
身的に満足のいく結果が得られる。対象がより大きい場
合、１日投与量は、約0.1mg〜約100mgの範囲内であり、
約0.1mg〜約10mgが好ましく、たとえば１日４回までに
分割して投与すると都合よい。

化合物を少なくとも１種の薬学的に許容できる担体ま
たは希釈物と組み合わせた薬学的組成物は、常法で、薬
学的に許容できる担体または希釈物と混合して製造する
ことができる。単位投与形態にはたとえば化合物は約0.
025mg〜約50mgが含まれる。

NSA−1/NAP−２は、機能的にはNAP−１に大部分が類
似しているにもかかわらず、PBPおよび／またはCTAP−I
IIを血小板から遊離した時に、おそらくイン・ビボでし
か発生できないが、一方、単核食細胞および組織細胞の
さまざまな変種によるNAF/NAP−１の産生は、腫瘍壊死
因子およびインターロイキン１のような炎症性サイトキ
ネースにより誘起される。従って、２種のペプチドは、
異なる生物学的状態で、および異なる部位で発生するに
ちがいない。NAP−２は、血小板に由来するので、主に
血管内で産生され、その血管内では、たとえば血栓およ
びアテローム性動脈硬化性障害時に、血小板の活性化お
よび凝集が起こるが、一方、NAF/NAP−１は組織中でほ
ぼ定まって生成する。

NSA−1/NAP−２およびそれの変種は、血小板または単
核細胞培養の他の成分からは見出されず、遊離に引き続
いて産生されるようだ。これらは典型的な走化性受容体
作用物質の特性を呈し、NAF/NAP−１と同じモル濃度範
囲で、細胞質ゾル中の遊離カルシウムの変化、走化性お
よびエクソサイト−シスを引き起こす。一方、PBP、CTA
P−IIIおよびPF−４は、100〜10000倍の高濃度で、活性
があるとしてもごくわずかである。これらは、好中球の
補給において、NAF/NAP−１およびC5aと同じように有効
で、血栓症において、ふさがれた血管を再び通す働きを
する好中球を集める役割を果たすであろうと期待され
る。

5.図の説明第1a図:C4カラムを用いた、NSA−１の予備逆相高圧液体
クロマトグラフィー。上のグラフ：光学密度226nmにお
けるタンパクの分布；下のグラフ:NSA−１の活性、ヒト
好中球からの相対的なエラスターゼの放出。２本のピー
クが明示：小さいピークは、NSA−1/NAP−２に相当し、
大きいピークはNAF/NAP−１に相当する。

第1b図:CN−プロピルカラムを用いた、NSA−1/NAP−２
の逆相高圧液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同
様。

第1c図:C4カラムを用いた、NSA−1/NAP−２の逆相高圧
液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同様。

第２図:NSA−1/NAP−２のアミノ末端配列。最初の20残
基を示す。これらはβ−スロンボグロブリンの配列の一
部に相当する。

第３図：サイトカラシンＢ処理ヒト好中球における、NS
A−1/NAP−２誘起エクソサイト−シス。濃度依存的。

第４図:NSA−1/NAP−２のアミノ酸配列第５図:PBP（ヌクレオチド103で開始）、CTAP−III（ヌ
クレオチド130で開始）、β−TG（ヌクレオチド142で開
始）、NSA−1/NAP−２（ヌクレオチド175で開始）の前
駆体の相補的DNA配列および解読されたアミノ酸配列。
２個の内部のジスルフィド結合は、各々アステリスクお
よび四角の印で示す。ポリアデニル化信号が推定される
ところ（ヌクレオチド581−586）は下線で示す。EcoR I
認識部位は上線で示す。

6.実施例以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであ
る。

第１部：ヒト血液からのNSA−1/NAP−２の産生、精製お
よび特性化実施例1:LPS刺激したヒト血液白血球および／または血
小板による、NSA−1/NAP−２の産生スイス赤十字研究所から得られた供給血液は、抗凝固
処理し、４〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。
単核細胞（単球とリンパ球の構成比は約1:5）は、単一
の軟膜から、フィコール−ハイパーク勾配上に単離し
（A.ボユム、スカンド・ジェイ・イムノール、５巻９〜
15頁（1976年））、MEMで洗浄した、６個の軟膜から採
った洗浄細胞を、MEM−PPLに再懸濁し（５×10⁶セル/m
l）、撹拌装置をつけたガラスビン中で、１μg/ml LPS
の存在下、20時間培養した。経時的に培養液を採取し、
好中球刺激活性を、サイトカラシンＢで前処理したヒト
好中球からのエラスターゼ放出の誘起能力として測定し
た（B.デワルドおよびM.バギオリニ、バイオケミカル・
ファーマコロジー36巻2505〜2510頁（1987年））。この
試験より、NSA−１およびNAFは、前述のとおり、好中球
活性化因子であることが判明した（P.ペベリら、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン167巻154
7〜1559頁（1988年））。好中球刺激活性は経時的に増
強し、24〜48時間後に一定値に達した。

実施例2:PHA−Ｐ刺激したヒト血液白血球および／また
は血小板によるNSA−1/NAP−２の産生スイス赤十字研究所から得た供給血液は、抗凝固処理
し、４〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。単核
細胞（単球およびリンパ球の構成比は約1:5）は単一の
バッフィー・コートから、フィコール−ハイパーク勾配
上に単離し（ボユム、1976年）、MEMで洗浄した。６個
の軟膜から採り洗浄した細胞を、MEM−PPLに再懸濁（５
×10⁶セル/ml）し、撹拌装置をつけたガラスビン中で、
５μ/ml PHA−Ｐ存在下20時間培養した。経時的に培
養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカラシンＢで
前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能力
として測定した。好中球刺激活性は経時的に増強され、
24〜48時間で一定値に達した。

実施例3:刺激したヒト血液白血球および／またはLPS刺
激した血小板の培養液からのNSA−1/NAP−２の精製ａ）リン酸セルロースクロマトグラフィー実施例１記載のとおり刺激したヒト白血球の細胞で不
含培養液700mlを、緩衝液Ａ（20mM塩化ナトリウム、1mM
EDTAおよび５％グリセロールを含有する20mMリン酸カ
リウム緩衝液、pH7.2）で平衡にした15mlリン酸セルロ
ースカラム（ファットマンP11）に直接入れた。カラム
は同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液Ａ中直線的な塩化ナトリ
ウム濃度勾配（0.02〜1.5M）120mlで流出（24ml/時間）
した。各フラクションは好中球刺激活性を測定した。

ｂ）逆相クロマトグラフィーリン酸セルロースクロマトグラフィーによる分離によ
り得られた、活性フラクションは、貯蔵し、広孔予備逆
相C4カラム（10×250mm、７μｇ、マシェレイ−ナゲ
ル、デュエレン、西ドイツ）に繰り返し流して、さらに
精製した。カラムは0.1％トリフルオロ酢酸中、０〜80
％アセトニトリル勾配を0.66％／分で増加させたものを
用い、2ml/分で溶出した。

保持時間20〜26分の活性フラクションは、貯蔵し、ス
ピード・バック遠心で濃縮し、分析用逆相CN−プロピル
カラム（4.6×250mm、５μｍ、広孔、ベーカー・リサー
チ・プロダクツ、フィリップスバーグ、ニュージュージ
ー州、米国）に入れる。カラムは0.1％トリフルオロ酢
酸中０〜80％アセトニトリル勾配を0.66％／分で増加さ
せたものを用い、0.5ml/分で流出した。保持時間22〜25
分の活性フラクションは、貯蔵し、濃縮し、分析用逆相
C4−カラム（4.6×250mm、５μｍ、広孔、ベーカー・リ
サーチ・プロダクツ）に、CN−プロピルカラムの場合に
記載した条件下で流した。保持時間42.5分の活性フラク
ションは、スピード・バック遠心中で乾燥し、無菌水に
再懸濁した後、気相配列分析および生物学的試験に供し
た。第１図は、NAF/NAP−１からのNSA−1/NAP−２の分
離、およびアミノ酸配列分析に用いたフラクションを示
す。

実施例4:精製NSA−1/NAP−２のゲル電気泳動精製したNSA−1/NAP−２は、20％尿素−SDSポリアク
リルアミドゲルを用いて、B.カデンバッハら、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー129巻517〜521頁（1983
年）に準じて分析した。銀染色による発色により、見掛
けの分子量が6500の単一のバンドが得られた。NAP−２
はNAF/NAP−１よりわずかに速く移動した。

実施例5:NSA−1/NAP−２のアミノ酸配列分析アミノ酸配列分析は、アプライド・バイオシステムズ
気相シークエンサーモデル477Aを用いた自動フェニルイ
ソチオシアン化勾配で行った。NSA−1/NAP−２の試料
（500ピコモル）は、直接または化学修飾した後、適用
した。還元およびアルキル化は以下のとおり実施した:N
SA−1/NAP−２１ナノモルを6M塩酸グアニジニウム、2
mM EDTA、0.2Mトリス−塩酸、pH8.3の溶液150μに溶
解し、アセトニトリル15μ中、トリブチルホスフィン
225nlを加え、室温でインキュベートした。60分後、ア
セトニトリル10μ中、４−ビニルピリジン160nlを加
えた。30分後、同量のトリブチルホスフィンおよびビニ
ルピリジンを加え、さらに40分、窒素存在下で反応を持
続させた。溶液はトリフルオロ酢酸で、pH2.0まで酸性
にし、アセトニトリル勾配のある0.1％トリフルオロ酢
酸中、逆相HPLCで脱塩した。

カルボキシ末端は、NAP−２ 0.5ナノモルおよびカル
ボキシペプチダーゼＰまたはカルボキシペプチダーゼＹ
（配列決定用、ベーリンガー）0.4μｇを用いて決定し
た。

第２図は、最初の20アミノ末端アミノ酸を示す。

実施例6:NSA−1/NAP−２の好中球活性化効果好中球はヒト血液から単離し、PBS/BSA中に懸濁し、
次いで、デワルドおよびバギオリニのマイクロタイター
・プレート・アッセイ法（1987年）を用いて、NSA−1/N
AP−２のエラスターゼ放出誘起能力の評価に用いた。NS
A−1/NAP−２は濃度依存的に選択的なエラスターゼ放出
を誘起した。濃度依存性は、NAF/NAP−１で観察された
ものに類似しており、強度はNAFの場合の約1/2、fMLPの
場合の約1/3であった。

第３図は、NSA−1/NAP−２の、濃度依存的な活性を示
す。

第II部：ヒト血小板由来λgt11発現ライブラリからのCT
AP−IIIの相補的DNAコードのクローニング実施例7: ａ）血小板の単離および洗浄血小板は、クエン酸処理血液を160gで10分間遠心して
単離し、血小板に富む血しょう（プレートレット・リッ
チ・プラズマ:PRP）を得、さらに1100gで10分間遠心に
かけて血小板塊を得た。血小板は30ミリモル／グルコ
ース、120ミリモル／塩化ナトリウム、129ミリモル／
クエン酸ナトリウム、10ミリモル／ EDTA、pH6.5の
溶液で２回洗浄し、10ミリモル／トリス／塩酸、154
ミリモル／塩化ナトリウム、10ミリモル／ EDTA、p
H7.4の溶液で１回洗浄した。

ｂ）ヒト巨核球これらは、巨核芽球性白血病の患者の末梢血から、フ
ィコール−メトリゾエート密度勾配遠心により単離し
た。これら白血病性細胞の巨核芽球の表現型は、血小板
GP II b、GP II b/GP IIIの複合体および（vWF）フォン
・ウィレブランド・ファクターに対する、モノクローナ
ル抗体（MoAbs）との反応性に基づいている。これらの
細胞からのメッセンジャーRNA（mRNA）とのノーザン・
ブロッティングにおいて、血小板GP I bの相補的DNAプ
ローブを用いても、2.4kbのmRNA（血小板の場合と同じ
大きさ）との陽性の信号が得られた。

ｃ）抗体の調製洗浄した血小板は、Ｎ−エチルマレイミド（NEM）お
よびフェニルメタン−スルホニルフルオライド（PMSF、
メタノールに溶解）を各々最終濃度２ミリモル／で存
在する１％トリトンＸ−114に溶解し、バイオケム・バ
イオフィズ、アクタ778巻463頁（1984年）に記載のとお
り、相分離を行った。水相は、0.1％ドデシル硫酸ナト
リウム（DDS）、0.1モル／炭酸水素アンモニウム、pH
7.4の溶液を用いたAcA−34ウルトロゲル（LKB）排除ク
ロマトグラフィーに供した。８−９−Ｋαの範囲でタン
パクを含有するフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で
評価されるように、ウサギの免疫化に用いた。

ｄ）イムノブロッティング脱顆粒産生物は、スロンビン刺激（2U/4×10⁹/ml、５
分、37℃）した洗浄血小板の上清から得られ、２ミリモ
ル／ PMSFおよび２ミリモル／ NEMで処理した。こ
れらを１％SDSに溶解し、0.1％ジチオスレイトール（DT
T）で還元し、20％SDS−PAGEにより分離し、半乾燥エレ
クトロブロッターを用いて150mAで90分間、ニトロセル
ロース（BA85、シュライヒャー＆シュエル、フェルドバ
ッハ、スイス）に電気泳動的に移した。抗CTAP−IIIウ
サギポリクロナール抗血清とインキュベートした後、ア
ルカリ性フォスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ２次
抗体（バイオ−ラド・ラボラトリーズ、グラットブル
ク、スイス）を、基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム
および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォス
フェートでの染色に用いた。

ｅ）相補的DNA発現ライブラリーの構成 180の血液から採った血小板の全RNAは、グアニジン
塩酸法を用いて調製した。ポリAmRNAは、オリゴ（dT）
セルロース（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）
親和クロマトグラフィーにより単離した。１本目の鎖
は、オリゴ（dT）プライマー（ファルマシアＰ−Ｌバイ
オケミカルズ）および逆転写酵素（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、ギブコ、バーゼル、スイス）を用い
て合成した。２本目の鎖は、RNアーゼＨ（ニュー・イン
グランド・バイオラブズ、シュバルバッハ・バイ・フラ
ンクフルト、西ドイツ）およびエシエリキア・コリDNA
ポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム、ロットク
ロイツ、スイス）で調製した。T4DNAポリメラーゼおよ
びクレナウ酵素でブラント末端を作り、EcoR Iメチル化
し、EcoR Iリンカーに連結した後、効果的にできる相補
的DNAは、λgt11パッケージング抽出物（ギガパック・
ゴールド、ストラッタジーン、サン・ディエゴ、カリフ
ォルニア州）中にパッケージし、エシエリキア・コリy1
088中、増幅した。

ｆ）ライブラリー・スクリーニングおよび陽性クロー
ンの特性化血小板λgt11相補的DNA発現ライブラリーは、ポリク
ローナル・ウサギ抗血清を用いる一般法で、ふるい分け
した。エシエリキア・コリ特異的抗体は、ニトロセルロ
ース結合した、エシエリキア・コリBNN97のリゼイトに
免疫吸着させて除去した。陽性組み換えファージは、イ
ムノブロッティングの場合と同じ２次抗体および色素原
基質で検出した。精製した後、λ−DNAをEcoR I（ベー
リンガー・マンハイム）で分解し、挿入物は、0.8％ア
ガロース・ゲル電気泳動およびバイオ・トラップ（シュ
ライヒャー＆シュエル）中に電気溶出して単離した。DN
Aはエタノールで沈澱させ、T4リガーゼ（バイオ−ラ
ブ）を用いて5ngEcoR I直線化M13ブルースクリプト（ス
トラッタジーン）に結合し、エシエリキア・コリJM101
に導入した。白色コロニーは、アルカリ性抽出法によ
り、陽性組み換えプラスミドの試験を行い、１本鎖相補
的DNA鋳型は、M13K07ヘルパーファージで感染させて調
製した。両方の鎖のDNA配列は、シークエナーゼキット
（ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレ
ーション）および³⁵Sα−標識化dATP（ニュー・イング
ランド・ニュークレアー、デュ・ポント）を用いたジデ
オキシ鎖末端法により決定した。

ｇ）ノーザン・ブロット分析１％アガロースゲル電気泳動を行った後、mRNAは、ハ
イボンドＮ（アメルシャム）上にブロットし、次いでス
ルホニル化した相補的DNAプローブと、68℃で18時間、1
00μg/mlサケ精子DNAを含有する４×SSPE、0.1％二リン
酸ナトリウム、0.2％SDS、0.5mg/mlヘパリン中でハイブ
リダイズした。１×SSPE、１％SDS、0.1％二リン酸ナト
リウム中室温で５分間の洗浄を２回行い、0.2×SSPE、
0.1％SDS、0.1％二リン酸ナトリウム中68℃で30分間の
洗浄を２回行った後、対応するmRNAは、スルホニル化DN
Aに対するネズミのモノクローナル抗体（MoAB;シグマ、
ディーセンホーフェン、西ドイツ）およびアルカリ性ホ
スファターゼに結合したヤギ抗マウスIgG2次抗体で免疫
染色し、検出した。基質は上記と同一であった。

ｈ）結果８〜9Kdの範囲の血小板水溶性タンパクを含有するゲ
ル濾過フラクションでウサギを免疫して産生したポリク
ローナル抗体は、イムノブロット上で、高度な結合活性
および特異性を示し、血小板由来λgt11相補的DNA発現
ライブラリーのふるい分けに用いた。100000の最初にふ
るい分けされた組み換えファージからの２個の陽性のク
ローンが、精製されたプラークであり、２個の介在EcoR
Iフラグメントは、M13ブルースクリプト（商標）中で
サブクローン化した。両方の鎖のヌクレオチド配列は、
ジデオキシ鎖末端法により決定した。690塩基対の全長
の相補的DNAクローン（λCI）が得られ（第５図）、こ
れは66塩基対の５′非コード化部分、128アミノ酸残基
（13894da）のタンパクをコード化する転写解読枠およ
び終止コドン（TAA）を含有する３′非コード化部分、
推定上のポリアデニル化信号、並びにポリＡテールを含
有していた。相対位置−９で開始した２次クローン（λ
C2）は同一のヌクレオチド配列を示した。

真核生物のmRNA（５′CCACCAUGA3′）における翻訳開
始のコンセンセス配列は、ヌクレオチド−５で始まる。

巨核球性白血病セルライン、巨核球、および血小板か
ら採ったmRNAであって、肝細胞コントロールからのmRNA
ではないものの、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼ
ーションにより、CTAP−III前駆体のmRNAの約0.8kbの陽
性信号が得られた。このことは、対応する相補的DNAが
全長であることを示している。HELmRNAでは信号は得ら
れなかったが、これは恐らく、相補的DNAプローブのた
めの非放射性標識化法の感受性が低く、および／または
用いたHELセルラインのCTAP−III特異的mRNA含量が低い
ためであろう。

推測されるアミノ酸配列（第５図）は、ヒト血小板CT
AP−IIIの十分に確立された配列と同一である。CTAP−I
IIのアミノ末端は、翻訳された配列の44位のアミノ酸で
あり、ミトゲン的に不活性なプラスミンまたはトリプシ
ン分解産物β−スロンボグロブリンの開始部は、下流方
向48位の４残基である。これらのタンパクの前駆体であ
るPBPは、CTAP−IIIの最初の10残基を共有しているが、
アミノ末端は上流方向35位の９残基であることが示され
ている。これらの３種のタンパクに関する全ての既知の
構造的な情報は、コード化した相補的DNAクローンに由
来するアミノ酸配列に、正確に合致する。このことは、
３種のタンパク全ての前駆体が単一のものであるとい
う、強力な証拠になっている。

従って、第５図に示されたCTAP−IIIの34アミノ酸先
導配列は、例外的に長く、古典的なシグナルペプチドと
異なり、恐らくタンパクを、成熟巨核球のα顆粒に対す
る標的にする原因となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者クレメトソン、ケンネス・ヨハンスイス国ツェハー‐3065 ボルリゲン、フルラッケル 29番 (72)発明者ワルツ、アルフレッドスイス国ツェハー‐3098 ケニツ、フェルドラインストラッセ７番 (56)参考文献特表昭60−502086（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ. 17，Ｎｏ．９，ｐ．1739−1744（1978) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．80，ｐ．764−769 （1983) ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖｏｌ. 25，Ｎｏ．８，ｐ．1988−1996（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/435 - 14/70 C12P 21/00 - 21/02 C12N 15/12 - 15/28 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】70アミノ酸配列：を有する好中球活性化ペプチド−２（NAP−２）。
【請求項２】β−TG、CTAP−IIIもしくはPBPから、また
はβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPをコード化した遺伝子
から得られる、請求項１記載の好中球活性化ペプチド。
【請求項３】請求項１記載のアミノ酸配列と、更にその
Ｎ末端にAsp−Leu−Tyr−、Ser−Asp−Leu−Tyr−また
はAsp−Ser−Asp−Leu−Tyr−なるアミノ酸配列が連結
して構成されたアミノ酸配列を有する、好中球活性化ペ
プチド。
【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の好中球活
性化ペプチドと、医薬的に許容される担体または希釈液
とを含有する、免疫刺激用医薬組成物。