JP3051160B2 - 好中球活性化ペプチド‐2 - Google Patents
好中球活性化ペプチド‐2Info
- Publication number
- JP3051160B2 JP3051160B2 JP2500533A JP50053390A JP3051160B2 JP 3051160 B2 JP3051160 B2 JP 3051160B2 JP 2500533 A JP2500533 A JP 2500533A JP 50053390 A JP50053390 A JP 50053390A JP 3051160 B2 JP3051160 B2 JP 3051160B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nap
- nsa
- amino acid
- iii
- neutrophil
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5421—IL-8
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫調節物質に関るものである。
より具体的には、好中白血球、とりわけヒト好中白血
球を活性化する免疫刺激因子に関るものである。これ
は、今度、好中球刺激活性1(NSA−1)または、同義
的に好中球刺激ペプチド(NAP−2)と称する。
球を活性化する免疫刺激因子に関るものである。これ
は、今度、好中球刺激活性1(NSA−1)または、同義
的に好中球刺激ペプチド(NAP−2)と称する。
1.背景 好中白血球(好中球)は、最も一般的な白血球であ
り、ヒト血液中の白血球の約2/3をしめる。これらは、
宿主有機体を微生物感染から譲るのが、主な機能であ
る。好中球は可動性であり、感染により引きおこされる
走化性刺激に応答し、感染した組織中に移動し、微生物
を殺すことができる。微生物を殺すのは、好中球が微生
物をのみこみ、酵素ラジカルおよび殺微生物性酵素を放
出する能力に依存する。このような産生物の放出は、好
中球の活性に依存する。
り、ヒト血液中の白血球の約2/3をしめる。これらは、
宿主有機体を微生物感染から譲るのが、主な機能であ
る。好中球は可動性であり、感染により引きおこされる
走化性刺激に応答し、感染した組織中に移動し、微生物
を殺すことができる。微生物を殺すのは、好中球が微生
物をのみこみ、酵素ラジカルおよび殺微生物性酵素を放
出する能力に依存する。このような産生物の放出は、好
中球の活性に依存する。
数種のタンパクが、このような活性を有していること
は周知である。たとえば好中球活性化因子(NAF)(P.
ペベリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ
ディシン167巻1547頁(1988年))であり、好中球活性
化ペプチド1(NAP−1)とも称せられる。
は周知である。たとえば好中球活性化因子(NAF)(P.
ペベリら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メ
ディシン167巻1547頁(1988年))であり、好中球活性
化ペプチド1(NAP−1)とも称せられる。
2.本発明の要旨 好中球刺激活性は、刺激を受けた培養白血球により産
み出され、培養液から得ることができるということが、
現在明らかになっている。好中球刺激活性は、本明細書
ではNSA−1または同義的に好中球活性化ペプチド−2
(NAP−2)と称する。
み出され、培養液から得ることができるということが、
現在明らかになっている。好中球刺激活性は、本明細書
ではNSA−1または同義的に好中球活性化ペプチド−2
(NAP−2)と称する。
NSA−1/NAP−2は、構造的にはβ−スロンボグロブリ
ン(β−TG)、結合組織活性化ペプチドIII(CTAP−II
I)および血小板基礎タンパク(PBP)に極めて類似して
いることも、明らかになっている。
ン(β−TG)、結合組織活性化ペプチドIII(CTAP−II
I)および血小板基礎タンパク(PBP)に極めて類似して
いることも、明らかになっている。
本発明の目的は、さらに特性化することができる程度
に十分に精製された、NSA−1/NAP−2、またはこの生物
学的活性を有するその機能的変種、フラグメントもしく
は誘導体、たとえば突然変異タンパク、たとえば組み換
えDNA技法による製造、並びにその薬剤としての使用を
提供することである。
に十分に精製された、NSA−1/NAP−2、またはこの生物
学的活性を有するその機能的変種、フラグメントもしく
は誘導体、たとえば突然変異タンパク、たとえば組み換
えDNA技法による製造、並びにその薬剤としての使用を
提供することである。
本発明は、さらに、たとえばヒト血液白血球および/
または血小板からNSA−1/NAP−2を調製する方法を提供
するものである。
または血小板からNSA−1/NAP−2を調製する方法を提供
するものである。
本発明は、さらに、好中白血球の活性化およびそれに
伴う、感染に対する抵抗性の増強における、NSA−1/NAP
−2の使用を提供するものである。
伴う、感染に対する抵抗性の増強における、NSA−1/NAP
−2の使用を提供するものである。
本発明は、さらに、天然の先導配列、たとえばヒト血
小板に内因性の天然の先導配列を含有する対応する遺伝
子のクローニングし、それを適当な宿主内で発現させる
こと、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用し
て、ペプチド産生物を適当に回収することから成る組み
換えDNA技法により、NSA−1/NAP−2または、それの機
能的変種、フラグメントもしくは誘導体もしくはそれの
生物学的活性を有する構造相関物、たとえばβ−TG、CT
AP−IIIもしくはPBPの調製方法を提供するものである。
小板に内因性の天然の先導配列を含有する対応する遺伝
子のクローニングし、それを適当な宿主内で発現させる
こと、および指示ある場合適当なプロテアーゼを使用し
て、ペプチド産生物を適当に回収することから成る組み
換えDNA技法により、NSA−1/NAP−2または、それの機
能的変種、フラグメントもしくは誘導体もしくはそれの
生物学的活性を有する構造相関物、たとえばβ−TG、CT
AP−IIIもしくはPBPの調製方法を提供するものである。
3.略語 BSA:ウシ血清アルブミン CTAP−III:結合組織活性化ペプチドIII DDS:ドデシル硫酸ナトリウム DTT:ジチオスレイトール fMLP:N−ホルミル−L−メチオニル−L−ロイシル−L
−フェニルアラニン LPS:エシエリキア・コリ055:D5のリポ多糖類 MEM:イーグル最小必須培地(ゼロメド・ゲゼルシヤフト
・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク、ミューニッ
ヒ、西ドイツ)に25μg/mlネオマイシンを加え、25mM炭
酸水素ナトリウムおよび20mM HEPESでpH7.4に緩衝した
もの MEM−PPL:1%低温殺菌血しょうタンパク液(5%PPL−S
RK、スイス赤十字研究所、ベルン、スイス)並びに100I
U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン(ギブコ・ア
クリチエンゲゼルシヤフト、バーゼル、スイス)を含有
したもの MOAbs:モノクローナル抗体 mRNA:メッセンジャーRNA NAF:好中球活性化因子(=NAP−1) NAP−1:好中球活性化ペプチド1(=NAF) NAP−2:好中球活性化ペプチド2(=NSA−1) NEM:N−エチルマレイミド NSA−1:好中球刺激活性1(=NAP−2) PBP:血小板塩基性タンパク PBS:Ca++およびMg++不含リン酸塩緩衝生理食塩水 PBS−BSA:0.9mM塩化カルシウム、0.49mM塩化マグネシウ
ムおよび2.5mg/ml BSAを加えたPBS PRP:血小板に富む血しょう PHA−P:植物性赤血球凝集素(ディフコ・ラボラトリー
ズ、デトロイト、ミシシッピー州、米国) PMN:多形核細胞−好中球 PMSF:フェニルメタン−スルホニル−フルオライド SDS−PAGE:ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動 SSPE:180mM塩化ナトリウム、10mMリン酸二水水素ナトリ
ウム、1mM EDTA、pH7.4 β−TG:β−スロンボグロブリン 4.詳細な説明 NSA−1/NAP−2は、好中球活性化特性、とりわけ顆粒
酵素放出を誘起するという生物学的特徴がある。分子の
見地から、NSA−1/NAP−2は、分子量約7500、算出等電
点約8.7という特徴を有する。
−フェニルアラニン LPS:エシエリキア・コリ055:D5のリポ多糖類 MEM:イーグル最小必須培地(ゼロメド・ゲゼルシヤフト
・ミット・ベシュレンクテル・ハフツンク、ミューニッ
ヒ、西ドイツ)に25μg/mlネオマイシンを加え、25mM炭
酸水素ナトリウムおよび20mM HEPESでpH7.4に緩衝した
もの MEM−PPL:1%低温殺菌血しょうタンパク液(5%PPL−S
RK、スイス赤十字研究所、ベルン、スイス)並びに100I
U/mlペニシリンおよびストレプトマイシン(ギブコ・ア
クリチエンゲゼルシヤフト、バーゼル、スイス)を含有
したもの MOAbs:モノクローナル抗体 mRNA:メッセンジャーRNA NAF:好中球活性化因子(=NAP−1) NAP−1:好中球活性化ペプチド1(=NAF) NAP−2:好中球活性化ペプチド2(=NSA−1) NEM:N−エチルマレイミド NSA−1:好中球刺激活性1(=NAP−2) PBP:血小板塩基性タンパク PBS:Ca++およびMg++不含リン酸塩緩衝生理食塩水 PBS−BSA:0.9mM塩化カルシウム、0.49mM塩化マグネシウ
ムおよび2.5mg/ml BSAを加えたPBS PRP:血小板に富む血しょう PHA−P:植物性赤血球凝集素(ディフコ・ラボラトリー
ズ、デトロイト、ミシシッピー州、米国) PMN:多形核細胞−好中球 PMSF:フェニルメタン−スルホニル−フルオライド SDS−PAGE:ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動 SSPE:180mM塩化ナトリウム、10mMリン酸二水水素ナトリ
ウム、1mM EDTA、pH7.4 β−TG:β−スロンボグロブリン 4.詳細な説明 NSA−1/NAP−2は、好中球活性化特性、とりわけ顆粒
酵素放出を誘起するという生物学的特徴がある。分子の
見地から、NSA−1/NAP−2は、分子量約7500、算出等電
点約8.7という特徴を有する。
これは、刺激された血液白血球および/または血小板
の培養液からのリン酸セルロースクロマトグラフィーお
よび逆相クロマトグラフィーによる精製から成る方法に
より、たとえばヒト血液白血球および/または血小板か
ら産生する。
の培養液からのリン酸セルロースクロマトグラフィーお
よび逆相クロマトグラフィーによる精製から成る方法に
より、たとえばヒト血液白血球および/または血小板か
ら産生する。
ヒト以外の種のNSA−1/NAP−2は、対応する血液白血
球および/または血小板から、類似の方法で産生するこ
とができる。
球および/または血小板から、類似の方法で産生するこ
とができる。
刺激は、既知の任意の試薬、たとえばLPSおよびPHA−
Pで行ってよい。
Pで行ってよい。
リン酸セルロースクロマトグラフィーは、たとえばリ
ン酸カリウム/塩化ナトリウム/EDTA/グリセロール緩衝
液、おおよそ中性のpH、たとえばpH7.2で平衡にしたリ
ン酸セルロースカラムを用い、続いてたとえば同じ緩衝
液中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配で溶出して行う。
ン酸カリウム/塩化ナトリウム/EDTA/グリセロール緩衝
液、おおよそ中性のpH、たとえばpH7.2で平衡にしたリ
ン酸セルロースカラムを用い、続いてたとえば同じ緩衝
液中直線的な塩化ナトリウム濃度勾配で溶出して行う。
逆相クロマトグラフィーは、リン酸セルロースクロマ
トグラフィーの後に行うのが好ましく、最初に、予備逆
相C4カラムを用い、たとえば、0.1%トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルを0〜80%勾配にした溶出液で溶出
し、その後CN−プロピルカラムを用い、たとえば0.1%
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル0〜80%勾配にし
た溶出液で溶出し、次いで、活性フラクションを、CN−
プロピルクロマトグラフィーで用いたのと同様な条件下
で、分析用逆相C4カラムに再び流すのが好ましい。
トグラフィーの後に行うのが好ましく、最初に、予備逆
相C4カラムを用い、たとえば、0.1%トリフルオロ酢酸
中、アセトニトリルを0〜80%勾配にした溶出液で溶出
し、その後CN−プロピルカラムを用い、たとえば0.1%
トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル0〜80%勾配にし
た溶出液で溶出し、次いで、活性フラクションを、CN−
プロピルクロマトグラフィーで用いたのと同様な条件下
で、分析用逆相C4カラムに再び流すのが好ましい。
精製の経過は、第1a、1bおよび1cに示す。
精製したものは、引き続いて好中球刺激活性を、たと
えばサイトカラシンB(B.デワルドおよびM.バギオリ
ニ、バイオケミカル・ファーマコロジー36巻2505〜2510
頁(1987年))で前処理したヒト好中球からのエラスタ
ーゼ放出誘起能力として測定する。
えばサイトカラシンB(B.デワルドおよびM.バギオリ
ニ、バイオケミカル・ファーマコロジー36巻2505〜2510
頁(1987年))で前処理したヒト好中球からのエラスタ
ーゼ放出誘起能力として測定する。
NSA−1/NAP−2は、20%尿素−SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によれば、約6500の見かけの分子量を有
していることが明らかになった。見かけの等電点は約8.
3である。
ドゲル電気泳動によれば、約6500の見かけの分子量を有
していることが明らかになった。見かけの等電点は約8.
3である。
アミノ酸配列分析によれば、最初の20N−末端アミノ
酸は、血小板基礎タンパク(PBP)およびそれの構造誘
導体CTAP−III(C.W.カストールら、PNAS80巻765〜769
頁(1983年))およびβ−スロンボグロブリン(G.S.ベ
ッグら、バイオケミストリー17巻1739〜1744頁(1987
年))の共通した部分の配列と正確に一致することが示
された(第2図)。NSA−1/NAP−2のアミノ末端は、CT
AP−IIIのアミノ酸16およびβ−TGのアミノ酸12に対応
する。カルボキシペプチダーゼYで分解すると、C末端
アミノ酸配列も同一(−Glu−Ser−Ala−Asp)であるこ
とが示された。NSA−1/NAP−2はβ−TGの配列と完全に
並び、算出分子量は7628、算出等電点は8.7で70のアミ
ノ酸から構成される。70のアミノ酸の全配列は、第4図
に示す。NSA−1/NAP−2とNAF/NAP−1の全体の相同性
は46%である。NSA−1/NAP−2配列は、見かけ上、N−
グリコシル化のための部位を全く含まない。プロテイン
キナーゼCによるホスホリル化のための潜在的な部位
(Thr)が39位に、アミド化が可能な部位(Asp)が42位
にある。
酸は、血小板基礎タンパク(PBP)およびそれの構造誘
導体CTAP−III(C.W.カストールら、PNAS80巻765〜769
頁(1983年))およびβ−スロンボグロブリン(G.S.ベ
ッグら、バイオケミストリー17巻1739〜1744頁(1987
年))の共通した部分の配列と正確に一致することが示
された(第2図)。NSA−1/NAP−2のアミノ末端は、CT
AP−IIIのアミノ酸16およびβ−TGのアミノ酸12に対応
する。カルボキシペプチダーゼYで分解すると、C末端
アミノ酸配列も同一(−Glu−Ser−Ala−Asp)であるこ
とが示された。NSA−1/NAP−2はβ−TGの配列と完全に
並び、算出分子量は7628、算出等電点は8.7で70のアミ
ノ酸から構成される。70のアミノ酸の全配列は、第4図
に示す。NSA−1/NAP−2とNAF/NAP−1の全体の相同性
は46%である。NSA−1/NAP−2配列は、見かけ上、N−
グリコシル化のための部位を全く含まない。プロテイン
キナーゼCによるホスホリル化のための潜在的な部位
(Thr)が39位に、アミド化が可能な部位(Asp)が42位
にある。
従って、NSA−1/NAP−2は、β−TGのフラグメントで
あると考えられる。
あると考えられる。
NSA−1/NAP−2の配列は、NAF/NAP−1の配列と、2
つの最初のシステイン残基に基づいて(NSA−1/NAP−2
のCys5およびCys7、並びにNAF/NAP−1のCys7およびCys
9)並べることができる。このように並べた場合、NSA−
1/NAP−2およびNAF/NAP−1の最初の20アミノ酸の約1/
2が同一である。従って、2つの因子は、機能的だけで
なく、ある程度構造的にも相関している。
つの最初のシステイン残基に基づいて(NSA−1/NAP−2
のCys5およびCys7、並びにNAF/NAP−1のCys7およびCys
9)並べることができる。このように並べた場合、NSA−
1/NAP−2およびNAF/NAP−1の最初の20アミノ酸の約1/
2が同一である。従って、2つの因子は、機能的だけで
なく、ある程度構造的にも相関している。
NSA−1/NAP−2のアミノ酸配列の入手可能性は、上述
の天然資源からの単離に加え、別の方法による製造可能
性をひらくことになる。すなわち、ペプチドは70アミノ
酸しか含まないので、たとえばメリーフィールドの固相
法を用いて、および2個のジスルフィド結合の存在に必
要な注意を払って、従来のやり方で全合成が可能であ
る。
の天然資源からの単離に加え、別の方法による製造可能
性をひらくことになる。すなわち、ペプチドは70アミノ
酸しか含まないので、たとえばメリーフィールドの固相
法を用いて、および2個のジスルフィド結合の存在に必
要な注意を払って、従来のやり方で全合成が可能であ
る。
別の産生方法には、所望によりコドンの最適化をした
後で、たとえば対応する合成遺伝子をクローニングおよ
び発現化する、組み換えDNA技法がある。遺伝子をコー
ド化したCTAP−IIIの化学合成および酵母中での発現に
ついては、既に報告されており(G.T.ムーレンバッハ
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
261巻719頁(1986年))、NSA−1/NAP−2のような関連
したペプチドの産生にも適用できる。しかし、生成した
CTAP−IIIの一部しか生物学的活性を有さない。折りた
たみの誤り、およびジスルフィド結合が正しく形成され
ていないことが、主な問題であったと思われる。この種
の化合物の、このような先導配列は既知ではないので、
先導配列のDNAコードは、合成遺伝子中に組み込まれて
いなかった。
後で、たとえば対応する合成遺伝子をクローニングおよ
び発現化する、組み換えDNA技法がある。遺伝子をコー
ド化したCTAP−IIIの化学合成および酵母中での発現に
ついては、既に報告されており(G.T.ムーレンバッハ
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
261巻719頁(1986年))、NSA−1/NAP−2のような関連
したペプチドの産生にも適用できる。しかし、生成した
CTAP−IIIの一部しか生物学的活性を有さない。折りた
たみの誤り、およびジスルフィド結合が正しく形成され
ていないことが、主な問題であったと思われる。この種
の化合物の、このような先導配列は既知ではないので、
先導配列のDNAコードは、合成遺伝子中に組み込まれて
いなかった。
さらに、組み換えDNA技術による産生方法には、たと
えば適当な発現ライブラリーから選択した相補的DNAの
クローニングおよび発現化、並びにNSA−1/NAP−2また
はNSA−1/NAP−2を包含するより大きなペプチド、たと
えばβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPのコード化、および
発現産生物から常法によるNSA−1/NAP−2の回収によ
り、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に固有の天然
先導配列を含有する遺伝子をクローニングおよび発現化
する方法がある。このような先導配列は、第5図の配列
中では最初の34のアミノ酸、またはそれの機能的フラグ
メントもしくは誘導体である。実施例7では、ヒト血小
板由来λgt11発現ライブラリーから、CTAP−IIIの相補
的DNAのコードのクローニングについて記載している。
より大きな親ペプチドから望ましいペプチド産生物の回
収は、たとえば、常法により、セリンプロテアーゼなど
のプロテアーゼで、より大きなペプチドを適当に短くき
ることにより行うことができる。
えば適当な発現ライブラリーから選択した相補的DNAの
クローニングおよび発現化、並びにNSA−1/NAP−2また
はNSA−1/NAP−2を包含するより大きなペプチド、たと
えばβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPのコード化、および
発現産生物から常法によるNSA−1/NAP−2の回収によ
り、天然の先導配列、たとえばヒト血小板に固有の天然
先導配列を含有する遺伝子をクローニングおよび発現化
する方法がある。このような先導配列は、第5図の配列
中では最初の34のアミノ酸、またはそれの機能的フラグ
メントもしくは誘導体である。実施例7では、ヒト血小
板由来λgt11発現ライブラリーから、CTAP−IIIの相補
的DNAのコードのクローニングについて記載している。
より大きな親ペプチドから望ましいペプチド産生物の回
収は、たとえば、常法により、セリンプロテアーゼなど
のプロテアーゼで、より大きなペプチドを適当に短くき
ることにより行うことができる。
適当なプロテアーゼは、たとえば常法により精製単球
から単離できる。これは、PMSFに対する感受性が高く、
レウペチンには穏やかな感受性を示し、EDTAには感受性
がない。
から単離できる。これは、PMSFに対する感受性が高く、
レウペチンには穏やかな感受性を示し、EDTAには感受性
がない。
変法としては、先導配列を、望ましいペプチドの遺伝
子コードに直接つけることができる。
子コードに直接つけることができる。
天然の先導配列を含有する遺伝子のクローニングを行
う調製の結果、十分な生物学的活性を示すため、たとえ
ば哺乳動物の細胞中で発現化した場合、α顆粒を標的に
するために適当な折りたたみを有するペプチド産生物が
できる。
う調製の結果、十分な生物学的活性を示すため、たとえ
ば哺乳動物の細胞中で発現化した場合、α顆粒を標的に
するために適当な折りたたみを有するペプチド産生物が
できる。
NSA−1/NAP−2の機能的なフラグメントまたは誘導
体、たとえばムテインは、当業界で既知の方法に従って
調製できる。
体、たとえばムテインは、当業界で既知の方法に従って
調製できる。
いく分生物学的活性を減じたNSA−1/NAP−2の3種の
変種をも見出されており、第4図で示された70のアミノ
酸配列を有しているが、対応するCTAP−IIIのアミノ酸
配列をそれぞれ3、4および5個、N末端で延長されて
いる。すなわち、これらは各々、 で始まる、第4図で示した配列を有しており、長さは各
々、73、74および75アミノ酸になる。
変種をも見出されており、第4図で示された70のアミノ
酸配列を有しているが、対応するCTAP−IIIのアミノ酸
配列をそれぞれ3、4および5個、N末端で延長されて
いる。すなわち、これらは各々、 で始まる、第4図で示した配列を有しており、長さは各
々、73、74および75アミノ酸になる。
これらは、刺激された血液白血球および/または血小
板からNAP−2の調製について上に記載されたように産
生することができる。すなわち、単球培養上清の存在
下、LPSで刺激すると、NAP−2に加え、NAP−2の73−7
5残基変種を含有する小さな中間ピークが得られる。こ
の付加的なピークは、74、75および73残基体により、各
々65、20および15%まで作られる。
板からNAP−2の調製について上に記載されたように産
生することができる。すなわち、単球培養上清の存在
下、LPSで刺激すると、NAP−2に加え、NAP−2の73−7
5残基変種を含有する小さな中間ピークが得られる。こ
の付加的なピークは、74、75および73残基体により、各
々65、20および15%まで作られる。
NSA−1/NAP−2並びにそれの機能的変種、フラグメン
トおよび誘導体は、薬学的な使用を示唆する生物学的活
性を有する。
トおよび誘導体は、薬学的な使用を示唆する生物学的活
性を有する。
たとえば、これらは、ラットにおいて動物の体重あた
り約1μg/kg〜約100μg/kgの投与量で、好中球の浸入
を誘起する。
り約1μg/kg〜約100μg/kgの投与量で、好中球の浸入
を誘起する。
従って、NSA−1/NAP−2並びにそれの機能的変種、フ
ラグメントおよび誘導体は、PMN(多形核細胞−好中
球)の数の変化または活性化状態により、局所的または
全身的に伴うかまたは引き起こされる症状の処置の使用
に適用される。これらは、このPMNパラメーターを広範
に変化させ、それ故に、たとえば細菌、マイコプラズ
マ、酵母および真菌、並びにウイルスの感染において、
PMNの数の増加や、活性状態の増強が臨床改善をもたら
すような症状の処置のための使用に適用される。さら
に、炎症性疾患たとえば乾癬、関節炎の症状およびぜん
息、または好中球のカウントが異常に低い、および/ま
たは常時好中球レベルが低い状態、並びにこれらの適用
時に使用される拮抗物質、たとえばモノクローナル抗体
の調製時の使用のために適用される。
ラグメントおよび誘導体は、PMN(多形核細胞−好中
球)の数の変化または活性化状態により、局所的または
全身的に伴うかまたは引き起こされる症状の処置の使用
に適用される。これらは、このPMNパラメーターを広範
に変化させ、それ故に、たとえば細菌、マイコプラズ
マ、酵母および真菌、並びにウイルスの感染において、
PMNの数の増加や、活性状態の増強が臨床改善をもたら
すような症状の処置のための使用に適用される。さら
に、炎症性疾患たとえば乾癬、関節炎の症状およびぜん
息、または好中球のカウントが異常に低い、および/ま
たは常時好中球レベルが低い状態、並びにこれらの適用
時に使用される拮抗物質、たとえばモノクローナル抗体
の調製時の使用のために適用される。
これらは、NAP−1と同様、Tリンパ球に対して走化
性をもつことが示されているので、ある種の免疫不全状
態における使用のためにも適用される。
性をもつことが示されているので、ある種の免疫不全状
態における使用のためにも適用される。
これらの適用のために適した投与量は、もちろん、た
とえば宿主、投与方法並びに処置すべき状態の性質およ
び重篤度に依存して変化させる。しかし、一般的に、1
日投与量が動物の体重あたり約1mg/kg〜約100mg/kgで全
身的に満足のいく結果が得られる。対象がより大きい場
合、1日投与量は、約0.1mg〜約100mgの範囲内であり、
約0.1mg〜約10mgが好ましく、たとえば1日4回までに
分割して投与すると都合よい。
とえば宿主、投与方法並びに処置すべき状態の性質およ
び重篤度に依存して変化させる。しかし、一般的に、1
日投与量が動物の体重あたり約1mg/kg〜約100mg/kgで全
身的に満足のいく結果が得られる。対象がより大きい場
合、1日投与量は、約0.1mg〜約100mgの範囲内であり、
約0.1mg〜約10mgが好ましく、たとえば1日4回までに
分割して投与すると都合よい。
化合物を少なくとも1種の薬学的に許容できる担体ま
たは希釈物と組み合わせた薬学的組成物は、常法で、薬
学的に許容できる担体または希釈物と混合して製造する
ことができる。単位投与形態にはたとえば化合物は約0.
025mg〜約50mgが含まれる。
たは希釈物と組み合わせた薬学的組成物は、常法で、薬
学的に許容できる担体または希釈物と混合して製造する
ことができる。単位投与形態にはたとえば化合物は約0.
025mg〜約50mgが含まれる。
NSA−1/NAP−2は、機能的にはNAP−1に大部分が類
似しているにもかかわらず、PBPおよび/またはCTAP−I
IIを血小板から遊離した時に、おそらくイン・ビボでし
か発生できないが、一方、単核食細胞および組織細胞の
さまざまな変種によるNAF/NAP−1の産生は、腫瘍壊死
因子およびインターロイキン1のような炎症性サイトキ
ネースにより誘起される。従って、2種のペプチドは、
異なる生物学的状態で、および異なる部位で発生するに
ちがいない。NAP−2は、血小板に由来するので、主に
血管内で産生され、その血管内では、たとえば血栓およ
びアテローム性動脈硬化性障害時に、血小板の活性化お
よび凝集が起こるが、一方、NAF/NAP−1は組織中でほ
ぼ定まって生成する。
似しているにもかかわらず、PBPおよび/またはCTAP−I
IIを血小板から遊離した時に、おそらくイン・ビボでし
か発生できないが、一方、単核食細胞および組織細胞の
さまざまな変種によるNAF/NAP−1の産生は、腫瘍壊死
因子およびインターロイキン1のような炎症性サイトキ
ネースにより誘起される。従って、2種のペプチドは、
異なる生物学的状態で、および異なる部位で発生するに
ちがいない。NAP−2は、血小板に由来するので、主に
血管内で産生され、その血管内では、たとえば血栓およ
びアテローム性動脈硬化性障害時に、血小板の活性化お
よび凝集が起こるが、一方、NAF/NAP−1は組織中でほ
ぼ定まって生成する。
NSA−1/NAP−2およびそれの変種は、血小板または単
核細胞培養の他の成分からは見出されず、遊離に引き続
いて産生されるようだ。これらは典型的な走化性受容体
作用物質の特性を呈し、NAF/NAP−1と同じモル濃度範
囲で、細胞質ゾル中の遊離カルシウムの変化、走化性お
よびエクソサイト−シスを引き起こす。一方、PBP、CTA
P−IIIおよびPF−4は、100〜10000倍の高濃度で、活性
があるとしてもごくわずかである。これらは、好中球の
補給において、NAF/NAP−1およびC5aと同じように有効
で、血栓症において、ふさがれた血管を再び通す働きを
する好中球を集める役割を果たすであろうと期待され
る。
核細胞培養の他の成分からは見出されず、遊離に引き続
いて産生されるようだ。これらは典型的な走化性受容体
作用物質の特性を呈し、NAF/NAP−1と同じモル濃度範
囲で、細胞質ゾル中の遊離カルシウムの変化、走化性お
よびエクソサイト−シスを引き起こす。一方、PBP、CTA
P−IIIおよびPF−4は、100〜10000倍の高濃度で、活性
があるとしてもごくわずかである。これらは、好中球の
補給において、NAF/NAP−1およびC5aと同じように有効
で、血栓症において、ふさがれた血管を再び通す働きを
する好中球を集める役割を果たすであろうと期待され
る。
5.図の説明 第1a図:C4カラムを用いた、NSA−1の予備逆相高圧液体
クロマトグラフィー。上のグラフ:光学密度226nmにお
けるタンパクの分布;下のグラフ:NSA−1の活性、ヒト
好中球からの相対的なエラスターゼの放出。2本のピー
クが明示:小さいピークは、NSA−1/NAP−2に相当し、
大きいピークはNAF/NAP−1に相当する。
クロマトグラフィー。上のグラフ:光学密度226nmにお
けるタンパクの分布;下のグラフ:NSA−1の活性、ヒト
好中球からの相対的なエラスターゼの放出。2本のピー
クが明示:小さいピークは、NSA−1/NAP−2に相当し、
大きいピークはNAF/NAP−1に相当する。
第1b図:CN−プロピルカラムを用いた、NSA−1/NAP−2
の逆相高圧液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同
様。
の逆相高圧液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同
様。
第1c図:C4カラムを用いた、NSA−1/NAP−2の逆相高圧
液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同様。
液体クロマトグラフィー。詳細は第1a図と同様。
第2図:NSA−1/NAP−2のアミノ末端配列。最初の20残
基を示す。これらはβ−スロンボグロブリンの配列の一
部に相当する。
基を示す。これらはβ−スロンボグロブリンの配列の一
部に相当する。
第3図:サイトカラシンB処理ヒト好中球における、NS
A−1/NAP−2誘起エクソサイト−シス。濃度依存的。
A−1/NAP−2誘起エクソサイト−シス。濃度依存的。
第4図:NSA−1/NAP−2のアミノ酸配列 第5図:PBP(ヌクレオチド103で開始)、CTAP−III(ヌ
クレオチド130で開始)、β−TG(ヌクレオチド142で開
始)、NSA−1/NAP−2(ヌクレオチド175で開始)の前
駆体の相補的DNA配列および解読されたアミノ酸配列。
2個の内部のジスルフィド結合は、各々アステリスクお
よび四角の印で示す。ポリアデニル化信号が推定される
ところ(ヌクレオチド581−586)は下線で示す。EcoR I
認識部位は上線で示す。
クレオチド130で開始)、β−TG(ヌクレオチド142で開
始)、NSA−1/NAP−2(ヌクレオチド175で開始)の前
駆体の相補的DNA配列および解読されたアミノ酸配列。
2個の内部のジスルフィド結合は、各々アステリスクお
よび四角の印で示す。ポリアデニル化信号が推定される
ところ(ヌクレオチド581−586)は下線で示す。EcoR I
認識部位は上線で示す。
6.実施例 以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであ
る。
る。
第1部:ヒト血液からのNSA−1/NAP−2の産生、精製お
よび特性化 実施例1:LPS刺激したヒト血液白血球および/または血
小板による、NSA−1/NAP−2の産生 スイス赤十字研究所から得られた供給血液は、抗凝固
処理し、4〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。
単核細胞(単球とリンパ球の構成比は約1:5)は、単一
の軟膜から、フィコール−ハイパーク勾配上に単離し
(A.ボユム、スカンド・ジェイ・イムノール、5巻9〜
15頁(1976年))、MEMで洗浄した、6個の軟膜から採
った洗浄細胞を、MEM−PPLに再懸濁し(5×106セル/m
l)、撹拌装置をつけたガラスビン中で、1μg/ml LPS
の存在下、20時間培養した。経時的に培養液を採取し、
好中球刺激活性を、サイトカラシンBで前処理したヒト
好中球からのエラスターゼ放出の誘起能力として測定し
た(B.デワルドおよびM.バギオリニ、バイオケミカル・
ファーマコロジー36巻2505〜2510頁(1987年))。この
試験より、NSA−1およびNAFは、前述のとおり、好中球
活性化因子であることが判明した(P.ペベリら、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン167巻154
7〜1559頁(1988年))。好中球刺激活性は経時的に増
強し、24〜48時間後に一定値に達した。
よび特性化 実施例1:LPS刺激したヒト血液白血球および/または血
小板による、NSA−1/NAP−2の産生 スイス赤十字研究所から得られた供給血液は、抗凝固
処理し、4〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。
単核細胞(単球とリンパ球の構成比は約1:5)は、単一
の軟膜から、フィコール−ハイパーク勾配上に単離し
(A.ボユム、スカンド・ジェイ・イムノール、5巻9〜
15頁(1976年))、MEMで洗浄した、6個の軟膜から採
った洗浄細胞を、MEM−PPLに再懸濁し(5×106セル/m
l)、撹拌装置をつけたガラスビン中で、1μg/ml LPS
の存在下、20時間培養した。経時的に培養液を採取し、
好中球刺激活性を、サイトカラシンBで前処理したヒト
好中球からのエラスターゼ放出の誘起能力として測定し
た(B.デワルドおよびM.バギオリニ、バイオケミカル・
ファーマコロジー36巻2505〜2510頁(1987年))。この
試験より、NSA−1およびNAFは、前述のとおり、好中球
活性化因子であることが判明した(P.ペベリら、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン167巻154
7〜1559頁(1988年))。好中球刺激活性は経時的に増
強し、24〜48時間後に一定値に達した。
実施例2:PHA−P刺激したヒト血液白血球および/また
は血小板によるNSA−1/NAP−2の産生 スイス赤十字研究所から得た供給血液は、抗凝固処理
し、4〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。単核
細胞(単球およびリンパ球の構成比は約1:5)は単一の
バッフィー・コートから、フィコール−ハイパーク勾配
上に単離し(ボユム、1976年)、MEMで洗浄した。6個
の軟膜から採り洗浄した細胞を、MEM−PPLに再懸濁(5
×106セル/ml)し、撹拌装置をつけたガラスビン中で、
5μ/ml PHA−P存在下20時間培養した。経時的に培
養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカラシンBで
前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能力
として測定した。好中球刺激活性は経時的に増強され、
24〜48時間で一定値に達した。
は血小板によるNSA−1/NAP−2の産生 スイス赤十字研究所から得た供給血液は、抗凝固処理
し、4〜10℃で20時間以内の保存のものを用いた。単核
細胞(単球およびリンパ球の構成比は約1:5)は単一の
バッフィー・コートから、フィコール−ハイパーク勾配
上に単離し(ボユム、1976年)、MEMで洗浄した。6個
の軟膜から採り洗浄した細胞を、MEM−PPLに再懸濁(5
×106セル/ml)し、撹拌装置をつけたガラスビン中で、
5μ/ml PHA−P存在下20時間培養した。経時的に培
養液を採取し、好中球刺激活性を、サイトカラシンBで
前処理したヒト好中球からのエラスターゼ放出誘起能力
として測定した。好中球刺激活性は経時的に増強され、
24〜48時間で一定値に達した。
実施例3:刺激したヒト血液白血球および/またはLPS刺
激した血小板の培養液からのNSA−1/NAP−2の精製 a) リン酸セルロースクロマトグラフィー 実施例1記載のとおり刺激したヒト白血球の細胞で不
含培養液700mlを、緩衝液A(20mM塩化ナトリウム、1mM
EDTAおよび5%グリセロールを含有する20mMリン酸カ
リウム緩衝液、pH7.2)で平衡にした15mlリン酸セルロ
ースカラム(ファットマンP11)に直接入れた。カラム
は同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液A中直線的な塩化ナトリ
ウム濃度勾配(0.02〜1.5M)120mlで流出(24ml/時間)
した。各フラクションは好中球刺激活性を測定した。
激した血小板の培養液からのNSA−1/NAP−2の精製 a) リン酸セルロースクロマトグラフィー 実施例1記載のとおり刺激したヒト白血球の細胞で不
含培養液700mlを、緩衝液A(20mM塩化ナトリウム、1mM
EDTAおよび5%グリセロールを含有する20mMリン酸カ
リウム緩衝液、pH7.2)で平衡にした15mlリン酸セルロ
ースカラム(ファットマンP11)に直接入れた。カラム
は同じ緩衝液で洗浄し、緩衝液A中直線的な塩化ナトリ
ウム濃度勾配(0.02〜1.5M)120mlで流出(24ml/時間)
した。各フラクションは好中球刺激活性を測定した。
b) 逆相クロマトグラフィー リン酸セルロースクロマトグラフィーによる分離によ
り得られた、活性フラクションは、貯蔵し、広孔予備逆
相C4カラム(10×250mm、7μg、マシェレイ−ナゲ
ル、デュエレン、西ドイツ)に繰り返し流して、さらに
精製した。カラムは0.1%トリフルオロ酢酸中、0〜80
%アセトニトリル勾配を0.66%/分で増加させたものを
用い、2ml/分で溶出した。
り得られた、活性フラクションは、貯蔵し、広孔予備逆
相C4カラム(10×250mm、7μg、マシェレイ−ナゲ
ル、デュエレン、西ドイツ)に繰り返し流して、さらに
精製した。カラムは0.1%トリフルオロ酢酸中、0〜80
%アセトニトリル勾配を0.66%/分で増加させたものを
用い、2ml/分で溶出した。
保持時間20〜26分の活性フラクションは、貯蔵し、ス
ピード・バック遠心で濃縮し、分析用逆相CN−プロピル
カラム(4.6×250mm、5μm、広孔、ベーカー・リサー
チ・プロダクツ、フィリップスバーグ、ニュージュージ
ー州、米国)に入れる。カラムは0.1%トリフルオロ酢
酸中0〜80%アセトニトリル勾配を0.66%/分で増加さ
せたものを用い、0.5ml/分で流出した。保持時間22〜25
分の活性フラクションは、貯蔵し、濃縮し、分析用逆相
C4−カラム(4.6×250mm、5μm、広孔、ベーカー・リ
サーチ・プロダクツ)に、CN−プロピルカラムの場合に
記載した条件下で流した。保持時間42.5分の活性フラク
ションは、スピード・バック遠心中で乾燥し、無菌水に
再懸濁した後、気相配列分析および生物学的試験に供し
た。第1図は、NAF/NAP−1からのNSA−1/NAP−2の分
離、およびアミノ酸配列分析に用いたフラクションを示
す。
ピード・バック遠心で濃縮し、分析用逆相CN−プロピル
カラム(4.6×250mm、5μm、広孔、ベーカー・リサー
チ・プロダクツ、フィリップスバーグ、ニュージュージ
ー州、米国)に入れる。カラムは0.1%トリフルオロ酢
酸中0〜80%アセトニトリル勾配を0.66%/分で増加さ
せたものを用い、0.5ml/分で流出した。保持時間22〜25
分の活性フラクションは、貯蔵し、濃縮し、分析用逆相
C4−カラム(4.6×250mm、5μm、広孔、ベーカー・リ
サーチ・プロダクツ)に、CN−プロピルカラムの場合に
記載した条件下で流した。保持時間42.5分の活性フラク
ションは、スピード・バック遠心中で乾燥し、無菌水に
再懸濁した後、気相配列分析および生物学的試験に供し
た。第1図は、NAF/NAP−1からのNSA−1/NAP−2の分
離、およびアミノ酸配列分析に用いたフラクションを示
す。
実施例4:精製NSA−1/NAP−2のゲル電気泳動 精製したNSA−1/NAP−2は、20%尿素−SDSポリアク
リルアミドゲルを用いて、B.カデンバッハら、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー129巻517〜521頁(1983
年)に準じて分析した。銀染色による発色により、見掛
けの分子量が6500の単一のバンドが得られた。NAP−2
はNAF/NAP−1よりわずかに速く移動した。
リルアミドゲルを用いて、B.カデンバッハら、アナリテ
ィカル・バイオケミストリー129巻517〜521頁(1983
年)に準じて分析した。銀染色による発色により、見掛
けの分子量が6500の単一のバンドが得られた。NAP−2
はNAF/NAP−1よりわずかに速く移動した。
実施例5:NSA−1/NAP−2のアミノ酸配列分析 アミノ酸配列分析は、アプライド・バイオシステムズ
気相シークエンサーモデル477Aを用いた自動フェニルイ
ソチオシアン化勾配で行った。NSA−1/NAP−2の試料
(500ピコモル)は、直接または化学修飾した後、適用
した。還元およびアルキル化は以下のとおり実施した:N
SA−1/NAP−2 1ナノモルを6M塩酸グアニジニウム、2
mM EDTA、0.2Mトリス−塩酸、pH8.3の溶液150μに溶
解し、アセトニトリル15μ中、トリブチルホスフィン
225nlを加え、室温でインキュベートした。60分後、ア
セトニトリル10μ中、4−ビニルピリジン160nlを加
えた。30分後、同量のトリブチルホスフィンおよびビニ
ルピリジンを加え、さらに40分、窒素存在下で反応を持
続させた。溶液はトリフルオロ酢酸で、pH2.0まで酸性
にし、アセトニトリル勾配のある0.1%トリフルオロ酢
酸中、逆相HPLCで脱塩した。
気相シークエンサーモデル477Aを用いた自動フェニルイ
ソチオシアン化勾配で行った。NSA−1/NAP−2の試料
(500ピコモル)は、直接または化学修飾した後、適用
した。還元およびアルキル化は以下のとおり実施した:N
SA−1/NAP−2 1ナノモルを6M塩酸グアニジニウム、2
mM EDTA、0.2Mトリス−塩酸、pH8.3の溶液150μに溶
解し、アセトニトリル15μ中、トリブチルホスフィン
225nlを加え、室温でインキュベートした。60分後、ア
セトニトリル10μ中、4−ビニルピリジン160nlを加
えた。30分後、同量のトリブチルホスフィンおよびビニ
ルピリジンを加え、さらに40分、窒素存在下で反応を持
続させた。溶液はトリフルオロ酢酸で、pH2.0まで酸性
にし、アセトニトリル勾配のある0.1%トリフルオロ酢
酸中、逆相HPLCで脱塩した。
カルボキシ末端は、NAP−2 0.5ナノモルおよびカル
ボキシペプチダーゼPまたはカルボキシペプチダーゼY
(配列決定用、ベーリンガー)0.4μgを用いて決定し
た。
ボキシペプチダーゼPまたはカルボキシペプチダーゼY
(配列決定用、ベーリンガー)0.4μgを用いて決定し
た。
第2図は、最初の20アミノ末端アミノ酸を示す。
実施例6:NSA−1/NAP−2の好中球活性化効果 好中球はヒト血液から単離し、PBS/BSA中に懸濁し、
次いで、デワルドおよびバギオリニのマイクロタイター
・プレート・アッセイ法(1987年)を用いて、NSA−1/N
AP−2のエラスターゼ放出誘起能力の評価に用いた。NS
A−1/NAP−2は濃度依存的に選択的なエラスターゼ放出
を誘起した。濃度依存性は、NAF/NAP−1で観察された
ものに類似しており、強度はNAFの場合の約1/2、fMLPの
場合の約1/3であった。
次いで、デワルドおよびバギオリニのマイクロタイター
・プレート・アッセイ法(1987年)を用いて、NSA−1/N
AP−2のエラスターゼ放出誘起能力の評価に用いた。NS
A−1/NAP−2は濃度依存的に選択的なエラスターゼ放出
を誘起した。濃度依存性は、NAF/NAP−1で観察された
ものに類似しており、強度はNAFの場合の約1/2、fMLPの
場合の約1/3であった。
第3図は、NSA−1/NAP−2の、濃度依存的な活性を示
す。
す。
第II部:ヒト血小板由来λgt11発現ライブラリからのCT
AP−IIIの相補的DNAコードのクローニング 実施例7: a) 血小板の単離および洗浄 血小板は、クエン酸処理血液を160gで10分間遠心して
単離し、血小板に富む血しょう(プレートレット・リッ
チ・プラズマ:PRP)を得、さらに1100gで10分間遠心に
かけて血小板塊を得た。血小板は30ミリモル/グルコ
ース、120ミリモル/塩化ナトリウム、129ミリモル/
クエン酸ナトリウム、10ミリモル/ EDTA、pH6.5の
溶液で2回洗浄し、10ミリモル/トリス/塩酸、154
ミリモル/塩化ナトリウム、10ミリモル/ EDTA、p
H7.4の溶液で1回洗浄した。
AP−IIIの相補的DNAコードのクローニング 実施例7: a) 血小板の単離および洗浄 血小板は、クエン酸処理血液を160gで10分間遠心して
単離し、血小板に富む血しょう(プレートレット・リッ
チ・プラズマ:PRP)を得、さらに1100gで10分間遠心に
かけて血小板塊を得た。血小板は30ミリモル/グルコ
ース、120ミリモル/塩化ナトリウム、129ミリモル/
クエン酸ナトリウム、10ミリモル/ EDTA、pH6.5の
溶液で2回洗浄し、10ミリモル/トリス/塩酸、154
ミリモル/塩化ナトリウム、10ミリモル/ EDTA、p
H7.4の溶液で1回洗浄した。
b) ヒト巨核球 これらは、巨核芽球性白血病の患者の末梢血から、フ
ィコール−メトリゾエート密度勾配遠心により単離し
た。これら白血病性細胞の巨核芽球の表現型は、血小板
GP II b、GP II b/GP IIIの複合体および(vWF)フォン
・ウィレブランド・ファクターに対する、モノクローナ
ル抗体(MoAbs)との反応性に基づいている。これらの
細胞からのメッセンジャーRNA(mRNA)とのノーザン・
ブロッティングにおいて、血小板GP I bの相補的DNAプ
ローブを用いても、2.4kbのmRNA(血小板の場合と同じ
大きさ)との陽性の信号が得られた。
ィコール−メトリゾエート密度勾配遠心により単離し
た。これら白血病性細胞の巨核芽球の表現型は、血小板
GP II b、GP II b/GP IIIの複合体および(vWF)フォン
・ウィレブランド・ファクターに対する、モノクローナ
ル抗体(MoAbs)との反応性に基づいている。これらの
細胞からのメッセンジャーRNA(mRNA)とのノーザン・
ブロッティングにおいて、血小板GP I bの相補的DNAプ
ローブを用いても、2.4kbのmRNA(血小板の場合と同じ
大きさ)との陽性の信号が得られた。
c) 抗体の調製 洗浄した血小板は、N−エチルマレイミド(NEM)お
よびフェニルメタン−スルホニルフルオライド(PMSF、
メタノールに溶解)を各々最終濃度2ミリモル/で存
在する1%トリトンX−114に溶解し、バイオケム・バ
イオフィズ、アクタ778巻463頁(1984年)に記載のとお
り、相分離を行った。水相は、0.1%ドデシル硫酸ナト
リウム(DDS)、0.1モル/炭酸水素アンモニウム、pH
7.4の溶液を用いたAcA−34ウルトロゲル(LKB)排除ク
ロマトグラフィーに供した。8−9−Kαの範囲でタン
パクを含有するフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で
評価されるように、ウサギの免疫化に用いた。
よびフェニルメタン−スルホニルフルオライド(PMSF、
メタノールに溶解)を各々最終濃度2ミリモル/で存
在する1%トリトンX−114に溶解し、バイオケム・バ
イオフィズ、アクタ778巻463頁(1984年)に記載のとお
り、相分離を行った。水相は、0.1%ドデシル硫酸ナト
リウム(DDS)、0.1モル/炭酸水素アンモニウム、pH
7.4の溶液を用いたAcA−34ウルトロゲル(LKB)排除ク
ロマトグラフィーに供した。8−9−Kαの範囲でタン
パクを含有するフラクションは、ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で
評価されるように、ウサギの免疫化に用いた。
d) イムノブロッティング 脱顆粒産生物は、スロンビン刺激(2U/4×109/ml、5
分、37℃)した洗浄血小板の上清から得られ、2ミリモ
ル/ PMSFおよび2ミリモル/ NEMで処理した。こ
れらを1%SDSに溶解し、0.1%ジチオスレイトール(DT
T)で還元し、20%SDS−PAGEにより分離し、半乾燥エレ
クトロブロッターを用いて150mAで90分間、ニトロセル
ロース(BA85、シュライヒャー&シュエル、フェルドバ
ッハ、スイス)に電気泳動的に移した。抗CTAP−IIIウ
サギポリクロナール抗血清とインキュベートした後、ア
ルカリ性フォスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ2次
抗体(バイオ−ラド・ラボラトリーズ、グラットブル
ク、スイス)を、基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム
および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォス
フェートでの染色に用いた。
分、37℃)した洗浄血小板の上清から得られ、2ミリモ
ル/ PMSFおよび2ミリモル/ NEMで処理した。こ
れらを1%SDSに溶解し、0.1%ジチオスレイトール(DT
T)で還元し、20%SDS−PAGEにより分離し、半乾燥エレ
クトロブロッターを用いて150mAで90分間、ニトロセル
ロース(BA85、シュライヒャー&シュエル、フェルドバ
ッハ、スイス)に電気泳動的に移した。抗CTAP−IIIウ
サギポリクロナール抗血清とインキュベートした後、ア
ルカリ性フォスファターゼに結合したヤギ抗ウサギ2次
抗体(バイオ−ラド・ラボラトリーズ、グラットブル
ク、スイス)を、基質ニトロ・ブルー・テトラゾリウム
および5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォス
フェートでの染色に用いた。
e) 相補的DNA発現ライブラリーの構成 180の血液から採った血小板の全RNAは、グアニジン
塩酸法を用いて調製した。ポリAmRNAは、オリゴ(dT)
セルロース(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)
親和クロマトグラフィーにより単離した。1本目の鎖
は、オリゴ(dT)プライマー(ファルマシアP−Lバイ
オケミカルズ)および逆転写酵素(ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、ギブコ、バーゼル、スイス)を用い
て合成した。2本目の鎖は、RNアーゼH(ニュー・イン
グランド・バイオラブズ、シュバルバッハ・バイ・フラ
ンクフルト、西ドイツ)およびエシエリキア・コリDNA
ポリメラーゼI(ベーリンガー・マンハイム、ロットク
ロイツ、スイス)で調製した。T4DNAポリメラーゼおよ
びクレナウ酵素でブラント末端を作り、EcoR Iメチル化
し、EcoR Iリンカーに連結した後、効果的にできる相補
的DNAは、λgt11パッケージング抽出物(ギガパック・
ゴールド、ストラッタジーン、サン・ディエゴ、カリフ
ォルニア州)中にパッケージし、エシエリキア・コリy1
088中、増幅した。
塩酸法を用いて調製した。ポリAmRNAは、オリゴ(dT)
セルロース(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)
親和クロマトグラフィーにより単離した。1本目の鎖
は、オリゴ(dT)プライマー(ファルマシアP−Lバイ
オケミカルズ)および逆転写酵素(ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ、ギブコ、バーゼル、スイス)を用い
て合成した。2本目の鎖は、RNアーゼH(ニュー・イン
グランド・バイオラブズ、シュバルバッハ・バイ・フラ
ンクフルト、西ドイツ)およびエシエリキア・コリDNA
ポリメラーゼI(ベーリンガー・マンハイム、ロットク
ロイツ、スイス)で調製した。T4DNAポリメラーゼおよ
びクレナウ酵素でブラント末端を作り、EcoR Iメチル化
し、EcoR Iリンカーに連結した後、効果的にできる相補
的DNAは、λgt11パッケージング抽出物(ギガパック・
ゴールド、ストラッタジーン、サン・ディエゴ、カリフ
ォルニア州)中にパッケージし、エシエリキア・コリy1
088中、増幅した。
f) ライブラリー・スクリーニングおよび陽性クロー
ンの特性化 血小板λgt11相補的DNA発現ライブラリーは、ポリク
ローナル・ウサギ抗血清を用いる一般法で、ふるい分け
した。エシエリキア・コリ特異的抗体は、ニトロセルロ
ース結合した、エシエリキア・コリBNN97のリゼイトに
免疫吸着させて除去した。陽性組み換えファージは、イ
ムノブロッティングの場合と同じ2次抗体および色素原
基質で検出した。精製した後、λ−DNAをEcoR I(ベー
リンガー・マンハイム)で分解し、挿入物は、0.8%ア
ガロース・ゲル電気泳動およびバイオ・トラップ(シュ
ライヒャー&シュエル)中に電気溶出して単離した。DN
Aはエタノールで沈澱させ、T4リガーゼ(バイオ−ラ
ブ)を用いて5ngEcoR I直線化M13ブルースクリプト(ス
トラッタジーン)に結合し、エシエリキア・コリJM101
に導入した。白色コロニーは、アルカリ性抽出法によ
り、陽性組み換えプラスミドの試験を行い、1本鎖相補
的DNA鋳型は、M13K07ヘルパーファージで感染させて調
製した。両方の鎖のDNA配列は、シークエナーゼキット
(ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレ
ーション)および35Sα−標識化dATP(ニュー・イング
ランド・ニュークレアー、デュ・ポント)を用いたジデ
オキシ鎖末端法により決定した。
ンの特性化 血小板λgt11相補的DNA発現ライブラリーは、ポリク
ローナル・ウサギ抗血清を用いる一般法で、ふるい分け
した。エシエリキア・コリ特異的抗体は、ニトロセルロ
ース結合した、エシエリキア・コリBNN97のリゼイトに
免疫吸着させて除去した。陽性組み換えファージは、イ
ムノブロッティングの場合と同じ2次抗体および色素原
基質で検出した。精製した後、λ−DNAをEcoR I(ベー
リンガー・マンハイム)で分解し、挿入物は、0.8%ア
ガロース・ゲル電気泳動およびバイオ・トラップ(シュ
ライヒャー&シュエル)中に電気溶出して単離した。DN
Aはエタノールで沈澱させ、T4リガーゼ(バイオ−ラ
ブ)を用いて5ngEcoR I直線化M13ブルースクリプト(ス
トラッタジーン)に結合し、エシエリキア・コリJM101
に導入した。白色コロニーは、アルカリ性抽出法によ
り、陽性組み換えプラスミドの試験を行い、1本鎖相補
的DNA鋳型は、M13K07ヘルパーファージで感染させて調
製した。両方の鎖のDNA配列は、シークエナーゼキット
(ユナイテッド・ステーツ・バイオケミカル・コーポレ
ーション)および35Sα−標識化dATP(ニュー・イング
ランド・ニュークレアー、デュ・ポント)を用いたジデ
オキシ鎖末端法により決定した。
g) ノーザン・ブロット分析 1%アガロースゲル電気泳動を行った後、mRNAは、ハ
イボンドN(アメルシャム)上にブロットし、次いでス
ルホニル化した相補的DNAプローブと、68℃で18時間、1
00μg/mlサケ精子DNAを含有する4×SSPE、0.1%二リン
酸ナトリウム、0.2%SDS、0.5mg/mlヘパリン中でハイブ
リダイズした。1×SSPE、1%SDS、0.1%二リン酸ナト
リウム中室温で5分間の洗浄を2回行い、0.2×SSPE、
0.1%SDS、0.1%二リン酸ナトリウム中68℃で30分間の
洗浄を2回行った後、対応するmRNAは、スルホニル化DN
Aに対するネズミのモノクローナル抗体(MoAB;シグマ、
ディーセンホーフェン、西ドイツ)およびアルカリ性ホ
スファターゼに結合したヤギ抗マウスIgG2次抗体で免疫
染色し、検出した。基質は上記と同一であった。
イボンドN(アメルシャム)上にブロットし、次いでス
ルホニル化した相補的DNAプローブと、68℃で18時間、1
00μg/mlサケ精子DNAを含有する4×SSPE、0.1%二リン
酸ナトリウム、0.2%SDS、0.5mg/mlヘパリン中でハイブ
リダイズした。1×SSPE、1%SDS、0.1%二リン酸ナト
リウム中室温で5分間の洗浄を2回行い、0.2×SSPE、
0.1%SDS、0.1%二リン酸ナトリウム中68℃で30分間の
洗浄を2回行った後、対応するmRNAは、スルホニル化DN
Aに対するネズミのモノクローナル抗体(MoAB;シグマ、
ディーセンホーフェン、西ドイツ)およびアルカリ性ホ
スファターゼに結合したヤギ抗マウスIgG2次抗体で免疫
染色し、検出した。基質は上記と同一であった。
h) 結果 8〜9Kdの範囲の血小板水溶性タンパクを含有するゲ
ル濾過フラクションでウサギを免疫して産生したポリク
ローナル抗体は、イムノブロット上で、高度な結合活性
および特異性を示し、血小板由来λgt11相補的DNA発現
ライブラリーのふるい分けに用いた。100000の最初にふ
るい分けされた組み換えファージからの2個の陽性のク
ローンが、精製されたプラークであり、2個の介在EcoR
Iフラグメントは、M13ブルースクリプト(商標)中で
サブクローン化した。両方の鎖のヌクレオチド配列は、
ジデオキシ鎖末端法により決定した。690塩基対の全長
の相補的DNAクローン(λCI)が得られ(第5図)、こ
れは66塩基対の5′非コード化部分、128アミノ酸残基
(13894da)のタンパクをコード化する転写解読枠およ
び終止コドン(TAA)を含有する3′非コード化部分、
推定上のポリアデニル化信号、並びにポリAテールを含
有していた。相対位置−9で開始した2次クローン(λ
C2)は同一のヌクレオチド配列を示した。
ル濾過フラクションでウサギを免疫して産生したポリク
ローナル抗体は、イムノブロット上で、高度な結合活性
および特異性を示し、血小板由来λgt11相補的DNA発現
ライブラリーのふるい分けに用いた。100000の最初にふ
るい分けされた組み換えファージからの2個の陽性のク
ローンが、精製されたプラークであり、2個の介在EcoR
Iフラグメントは、M13ブルースクリプト(商標)中で
サブクローン化した。両方の鎖のヌクレオチド配列は、
ジデオキシ鎖末端法により決定した。690塩基対の全長
の相補的DNAクローン(λCI)が得られ(第5図)、こ
れは66塩基対の5′非コード化部分、128アミノ酸残基
(13894da)のタンパクをコード化する転写解読枠およ
び終止コドン(TAA)を含有する3′非コード化部分、
推定上のポリアデニル化信号、並びにポリAテールを含
有していた。相対位置−9で開始した2次クローン(λ
C2)は同一のヌクレオチド配列を示した。
真核生物のmRNA(5′CCACCAUGA3′)における翻訳開
始のコンセンセス配列は、ヌクレオチド−5で始まる。
始のコンセンセス配列は、ヌクレオチド−5で始まる。
巨核球性白血病セルライン、巨核球、および血小板か
ら採ったmRNAであって、肝細胞コントロールからのmRNA
ではないものの、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼ
ーションにより、CTAP−III前駆体のmRNAの約0.8kbの陽
性信号が得られた。このことは、対応する相補的DNAが
全長であることを示している。HELmRNAでは信号は得ら
れなかったが、これは恐らく、相補的DNAプローブのた
めの非放射性標識化法の感受性が低く、および/または
用いたHELセルラインのCTAP−III特異的mRNA含量が低い
ためであろう。
ら採ったmRNAであって、肝細胞コントロールからのmRNA
ではないものの、ノーザン・ブロット・ハイブリダイゼ
ーションにより、CTAP−III前駆体のmRNAの約0.8kbの陽
性信号が得られた。このことは、対応する相補的DNAが
全長であることを示している。HELmRNAでは信号は得ら
れなかったが、これは恐らく、相補的DNAプローブのた
めの非放射性標識化法の感受性が低く、および/または
用いたHELセルラインのCTAP−III特異的mRNA含量が低い
ためであろう。
推測されるアミノ酸配列(第5図)は、ヒト血小板CT
AP−IIIの十分に確立された配列と同一である。CTAP−I
IIのアミノ末端は、翻訳された配列の44位のアミノ酸で
あり、ミトゲン的に不活性なプラスミンまたはトリプシ
ン分解産物β−スロンボグロブリンの開始部は、下流方
向48位の4残基である。これらのタンパクの前駆体であ
るPBPは、CTAP−IIIの最初の10残基を共有しているが、
アミノ末端は上流方向35位の9残基であることが示され
ている。これらの3種のタンパクに関する全ての既知の
構造的な情報は、コード化した相補的DNAクローンに由
来するアミノ酸配列に、正確に合致する。このことは、
3種のタンパク全ての前駆体が単一のものであるとい
う、強力な証拠になっている。
AP−IIIの十分に確立された配列と同一である。CTAP−I
IIのアミノ末端は、翻訳された配列の44位のアミノ酸で
あり、ミトゲン的に不活性なプラスミンまたはトリプシ
ン分解産物β−スロンボグロブリンの開始部は、下流方
向48位の4残基である。これらのタンパクの前駆体であ
るPBPは、CTAP−IIIの最初の10残基を共有しているが、
アミノ末端は上流方向35位の9残基であることが示され
ている。これらの3種のタンパクに関する全ての既知の
構造的な情報は、コード化した相補的DNAクローンに由
来するアミノ酸配列に、正確に合致する。このことは、
3種のタンパク全ての前駆体が単一のものであるとい
う、強力な証拠になっている。
従って、第5図に示されたCTAP−IIIの34アミノ酸先
導配列は、例外的に長く、古典的なシグナルペプチドと
異なり、恐らくタンパクを、成熟巨核球のα顆粒に対す
る標的にする原因となる。
導配列は、例外的に長く、古典的なシグナルペプチドと
異なり、恐らくタンパクを、成熟巨核球のα顆粒に対す
る標的にする原因となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12P 21/02 C12R 1:91) (72)発明者 クレメトソン、ケンネス・ヨハン スイス国ツェハー‐3065 ボルリゲン、 フルラッケル 29番 (72)発明者 ワルツ、アルフレッド スイス国ツェハー‐3098 ケニツ、フェ ルドラインストラッセ 7番 (56)参考文献 特表 昭60−502086(JP,A) BIOCHEMISTRY,Vol. 17,No.9,p.1739−1744(1978) Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,Vol.80,p.764−769 (1983) BIOCHEMISTRY,Vol. 25,No.8,p.1988−1996(1986) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07K 14/435 - 14/70 C12P 21/00 - 21/02 C12N 15/12 - 15/28 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ/G eneSeq SwissProt/PIR/GeneS eq WPI(DIALOG)
Claims (4)
- 【請求項1】70アミノ酸配列: を有する好中球活性化ペプチド−2(NAP−2)。
- 【請求項2】β−TG、CTAP−IIIもしくはPBPから、また
はβ−TG、CTAP−IIIもしくはPBPをコード化した遺伝子
から得られる、請求項1記載の好中球活性化ペプチド。 - 【請求項3】請求項1記載のアミノ酸配列と、更にその
N末端にAsp−Leu−Tyr−、Ser−Asp−Leu−Tyr−また
はAsp−Ser−Asp−Leu−Tyr−なるアミノ酸配列が連結
して構成されたアミノ酸配列を有する、好中球活性化ペ
プチド。 - 【請求項4】請求項1〜3のいずれかに記載の好中球活
性化ペプチドと、医薬的に許容される担体または希釈液
とを含有する、免疫刺激用医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB888828728A GB8828728D0 (en) | 1988-12-08 | 1988-12-08 | Neutrophil-stimulating activity i |
GB8828728.9 | 1989-04-27 | ||
GB898909681A GB8909681D0 (en) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | Neutrophil-stimulating activity 1 |
GB8909681.2 | 1989-04-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03503767A JPH03503767A (ja) | 1991-08-22 |
JP3051160B2 true JP3051160B2 (ja) | 2000-06-12 |
Family
ID=26294713
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2500533A Expired - Lifetime JP3051160B2 (ja) | 1988-12-08 | 1989-11-17 | 好中球活性化ペプチド‐2 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5759533A (ja) |
JP (1) | JP3051160B2 (ja) |
KR (1) | KR910700260A (ja) |
AU (1) | AU634508B2 (ja) |
BE (1) | BE1003636A4 (ja) |
CA (1) | CA2004685A1 (ja) |
CH (1) | CH681625A5 (ja) |
DK (1) | DK188690A (ja) |
ES (1) | ES2047458A6 (ja) |
FI (1) | FI903931A0 (ja) |
FR (1) | FR2640142B1 (ja) |
GB (1) | GB2231872B (ja) |
GR (1) | GR1000455B (ja) |
IL (1) | IL92557A0 (ja) |
NL (1) | NL8921262A (ja) |
NZ (1) | NZ231652A (ja) |
PT (1) | PT92509A (ja) |
SE (1) | SE9002589D0 (ja) |
WO (1) | WO1990006321A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101993316B1 (ko) * | 2017-04-11 | 2019-06-26 | 나민자 | 강아지 배변기 |
KR102453406B1 (ko) | 2020-08-24 | 2022-10-11 | 연세흠 | 반려동물 배변수거기 |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH681625A5 (ja) * | 1988-12-08 | 1993-04-30 | Sandoz Ag | |
US6673893B1 (en) * | 1990-02-01 | 2004-01-06 | University Of South Florida | Leukocyte derived growth factor 2 |
WO1991011515A2 (en) * | 1990-02-01 | 1991-08-08 | University Of South Florida | Leukocyte-derived growth factor |
AU2348492A (en) * | 1991-07-19 | 1993-02-23 | East Carolina University | Method of treating asthma |
WO1993009794A1 (en) * | 1991-11-15 | 1993-05-27 | University Of Pennsylvania | Suppression of megakaryocytopoiesis by neutrophil activating peptide-2 |
AU6085694A (en) * | 1993-01-07 | 1994-08-15 | University Of South Florida | Leukocyte derived growth factors |
US5578569A (en) * | 1993-03-12 | 1996-11-26 | Tam; Cherk S. | Method of increasing bone growth |
US5786327A (en) | 1993-03-12 | 1998-07-28 | Gensci Regeneration Sciences Inc. | Bone stimulating factor, methods of isolating same, and methods of increasing bone growth comprising administering same |
US6458349B1 (en) | 1995-06-02 | 2002-10-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine β-4 polypeptides |
US6391589B1 (en) | 1994-08-23 | 2002-05-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Human chemokine beta-10 mutant polypeptides |
US6174995B1 (en) | 1994-08-23 | 2001-01-16 | Haodong Li | Human chemokines, CKβ4 and CKβ10/MCP-4 |
US5912232A (en) * | 1994-09-23 | 1999-06-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Anti-inflammatory polypeptide antagonists of human I1-8 |
US6352973B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-03-05 | Osteopharm Inc. | Bone stimulating factor |
US5880094A (en) * | 1995-06-07 | 1999-03-09 | Osteopharm Limited | Polypeptides that stimulate bone growth |
US6117839A (en) * | 1995-06-07 | 2000-09-12 | Gensci Regeneration Sciences, Inc. | Bone stimulating factor |
US6693081B2 (en) * | 1995-09-26 | 2004-02-17 | Osteopharm Inc. | Bone stimulating factor |
US6290948B1 (en) | 1996-05-14 | 2001-09-18 | Smithkline Beecham Corporation | Method of treating sepsis and ARDS using chamohine beta-10 |
EP1015486A2 (en) | 1997-09-25 | 2000-07-05 | Academisch Ziekenhuis bij de Universiteit van Amsterdam | Isolated and recombinant antimicrobial peptides thrombocidin-1 (tc-1) and thrombocidin-2 (tc-2) or variants thereof |
GB9807721D0 (en) | 1998-04-08 | 1998-06-10 | Chiron Spa | Antigen |
EP2110436B1 (en) * | 2000-03-07 | 2013-01-30 | Japan Tobacco Inc. | Polypeptides having neutrophil stimulating activity |
US6815421B1 (en) | 2001-03-22 | 2004-11-09 | Osteopharm Inc. | Polypeptides for use in ameliorating effects of aging in mammals |
US7375192B2 (en) | 2002-05-01 | 2008-05-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies that specifically bind to chemokine beta-4 |
US7177246B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-02-13 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Optical disk drive focusing apparatus using sum signal |
NZ611269A (en) | 2010-11-19 | 2015-03-27 | Eisai R&D Man Co Ltd | Neutralizing anti-ccl20 antibodies |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4897348A (en) * | 1983-08-25 | 1990-01-30 | Sri International | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-III and analogs thereof |
DE3737703A1 (de) * | 1987-11-06 | 1989-05-18 | Ferring Arzneimittel Gmbh | Neutrophilen aktivierendes polypeptid, verfahren zu dessen herstellung sowie dessen verwendung als arzneimittel und diagnostikum |
US5026639A (en) * | 1988-01-14 | 1991-06-25 | Nippon Mining Company, Limited | Method to improve mRNA translation and use thereof for production of platelet factor-4 |
CH681625A5 (ja) * | 1988-12-08 | 1993-04-30 | Sandoz Ag |
-
1989
- 1989-11-17 CH CH2577/90A patent/CH681625A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-17 WO PCT/EP1989/001389 patent/WO1990006321A1/en not_active Application Discontinuation
- 1989-11-17 AU AU46556/89A patent/AU634508B2/en not_active Ceased
- 1989-11-17 KR KR1019900701733A patent/KR910700260A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-11-17 ES ES9050004A patent/ES2047458A6/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-17 JP JP2500533A patent/JP3051160B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-17 NL NL8921262A patent/NL8921262A/nl not_active Application Discontinuation
- 1989-12-06 PT PT92509A patent/PT92509A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-12-06 NZ NZ231652A patent/NZ231652A/en unknown
- 1989-12-06 GR GR890100810A patent/GR1000455B/el unknown
- 1989-12-06 IL IL92557A patent/IL92557A0/xx unknown
- 1989-12-06 CA CA002004685A patent/CA2004685A1/en not_active Abandoned
- 1989-12-07 FR FR8916207A patent/FR2640142B1/fr not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-08 BE BE8901313A patent/BE1003636A4/fr not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-05-11 GB GB9011468A patent/GB2231872B/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-07 DK DK188690A patent/DK188690A/da not_active Application Discontinuation
- 1990-08-07 SE SE9002589A patent/SE9002589D0/xx not_active Application Discontinuation
- 1990-08-08 FI FI903931A patent/FI903931A0/fi not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-06 US US08/471,817 patent/US5759533A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BIOCHEMISTRY,Vol.17,No.9,p.1739−1744(1978) |
BIOCHEMISTRY,Vol.25,No.8,p.1988−1996(1986) |
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.80,p.764−769(1983) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101993316B1 (ko) * | 2017-04-11 | 2019-06-26 | 나민자 | 강아지 배변기 |
KR102453406B1 (ko) | 2020-08-24 | 2022-10-11 | 연세흠 | 반려동물 배변수거기 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH03503767A (ja) | 1991-08-22 |
GR890100810A (en) | 1991-03-15 |
KR910700260A (ko) | 1991-03-14 |
GB2231872A (en) | 1990-11-28 |
CA2004685A1 (en) | 1990-06-08 |
AU634508B2 (en) | 1993-02-25 |
BE1003636A4 (fr) | 1992-05-12 |
CH681625A5 (ja) | 1993-04-30 |
NL8921262A (nl) | 1990-11-01 |
FR2640142A1 (fr) | 1990-06-15 |
WO1990006321A1 (en) | 1990-06-14 |
SE9002589L (sv) | 1990-08-07 |
DK188690D0 (da) | 1990-08-07 |
GB2231872B (en) | 1992-07-22 |
GB9011468D0 (en) | 1990-08-29 |
GR1000455B (el) | 1992-07-30 |
AU4655689A (en) | 1990-06-26 |
FR2640142B1 (fr) | 1994-09-23 |
IL92557A0 (en) | 1990-08-31 |
DK188690A (da) | 1990-08-07 |
SE9002589D0 (sv) | 1990-08-07 |
FI903931A0 (fi) | 1990-08-08 |
PT92509A (pt) | 1990-06-29 |
NZ231652A (en) | 1993-02-25 |
US5759533A (en) | 1998-06-02 |
ES2047458A6 (es) | 1994-02-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3051160B2 (ja) | 好中球活性化ペプチド‐2 | |
Bozic et al. | Expression and biologic characterization of the murine chemokine KC. | |
US5641867A (en) | Antibody which specifically binds to endothelial-monocyte activating polypeptide II | |
US7319091B2 (en) | Human derived monocyte attracting purified protein product useful in a method of treating infection and neoplasms in a human body, and the cloning of full length cDNA thereof | |
US5401651A (en) | DNA encoding ENA-78, a neutrophil activating factor | |
JPH04281790A (ja) | Dnaおよびその用途 | |
JPH11505417A (ja) | ヒトケモカインベータ−8、ケモカインベータ−1、およびマクロファージ炎症性タンパク質−4 | |
Wenger et al. | Cloning of cDNA coding for connective tissue activating peptide III from a human platelet-derived lambda gt11 expression library | |
US20030124677A1 (en) | Amino-terminally truncated MCP-2 as chemokine antagonists | |
EP0760849A1 (en) | Recombinant bpi-based and lbp-based proteins, nucleic acid molecules encoding same, methods of producing same, and uses thereof | |
WO1991008231A1 (en) | [Ala IL-8]77 AS A LEUKOCYTE ADHESION INHIBITOR | |
US6869924B1 (en) | Human derived monocyte attracting purified protein product useful in a method of treating infection and neoplasms in a human body, and the cloning of full length cDNA thereof | |
KR100837898B1 (ko) | 다발성 경화증의 치료에서 사용되는 케모킨 변이체 | |
KR0150000B1 (ko) | 사람 macif 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 발현 벡터, 형질전환 세포 및 사람 macif 활성을 갖는 단백질 | |
EP0550506B1 (en) | Novel chemotactic factor | |
AU711573B2 (en) | Short forms of chemokine beta-8 | |
JP2660681B2 (ja) | 組換え生成物 | |
JPH07132095A (ja) | Dnaおよびそのコードする蛋白質 | |
IT8922620A1 (it) | Peptide-2 che attiva i neutrofili | |
US20020007047A1 (en) | Short forms of chemokine beta-8 | |
AU652575B2 (en) | Novel chemotactic factor | |
JP4001246B2 (ja) | 新規ヒトcc型ケモカインlarc | |
CA2233367A1 (en) | Short forms of chemokine .beta.-8 |