JP2660681B2 - 組換え生成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、組換えDNA 技術による
新規ヒトたん白質ミンアクチビンに関するものである。 【０００２】 【従来の技術】ミンアクチビン(PAI-2) はウロキナ−ゼ
型プラスミノ−ゲン賦活剤の天然不活性化剤である。こ
の種のプラスミノ−ゲン賦活剤は多くの主要なヒトの
癌、特に肺癌、結腸癌、乳癌および前立腺癌の中に異常
に高レベルで見出される。プラスミノ−ゲン賦活剤は、
細胞転座、移動および侵入を供なうたん白分解系を仲介
すると考えられるセリンプロテア−ゼである。従ってこ
れらは組織破壊および再構築に関与するものであると考
えられ、そして腫瘍の生長および転移に関連を有するも
のであった。又これらは炎症反応にあずかる役割を有す
るものである。プラスミノ−ゲン賦活剤は一般に２つの
型に分けられることが知られている。その１つは(1)ウ
ロキナ−ゼ型であり、第２は(2)組織型である。組織型
プラスミノ−ゲン賦活剤は血液および血管壁中に、およ
び血栓症に対するフィブリン溶解防御系を賦活機能を有
する組織中に主として見られる。ウロキナ−ゼ型プラス
ミノ−ゲン賦活剤は通常の血栓溶解工程において作用効
果を奏する様には思えないが、侵襲や組織破壊、特に腫
瘍転移や炎症反応に関連した病原性異変に関与するもの
であった。 【０００３】プラスミノ−ゲン賦活剤に特異的ないくつ
かの禁止剤が知られており、その１つは胎盤から単離さ
れたもの(Holmberg,L 、の「Biochim.Biophys.」Acta 5
44,128-137(1978)) であり、もう１つは培養血管内皮細
胞中に産生されるPAI-1(VanMourik, J.A.,Lawrence,D.
A.およびLoskutoff,D.J.の「J.Biol.Chem.」259,14914-
14921(1984))である。ミンアクチビンは血液単球および
U937細胞により産生されるものであることが知られてお
り、そして免疫的に胎盤禁止剤に関連していると考えら
れている。 【０００４】これら種々の禁止剤の間の関係については
現在のところ知られていない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】ほとんど大部分の生物
学的に活性なたん白質がそうである様に、ミンアクチビ
ンは生体内では非常に少量しか産生されず、そしてそれ
自体通常の生物化学的方法では精製したりまた特性決定
するのが困難である。従ってその性質や臨床応用におけ
る生物学的効能等を更に評価するために大量の精製ミン
アクチビンが必要とされるので、組換えDNA 技術を使用
して、すなわち、ミンアクチビン遺伝子を代替宿主例え
ば細菌や動物細胞中でクロ−ニングすることにより、該
たん白質を製造することが望まれている。ミンアクチビ
ンをクロ−ニングするためには、精製ミンアクチビン由
来の抗体、アミノ酸配列、ペプチド断片および合成オリ
ゴヌクレオチドの生成のために精製した天然ミンアクチ
ビンの少量を均一となるまで精製することが望ましい。
試薬はクロ−ニング工程において使用されるものであ
る。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は下記アミノ酸配
列からなる単一な精製されたミンアクチビンに関するも
のである。 Met Glu Asp Leu Cys Val Ala Asn Thr Leu Phe Ala Leu Asn Leu Phe Lys His Leu Ala Lys Ala Ser Pro Thr Gln Asn Leu Phe Leu Ser Pro Trp Ser Ile Ser Ser Thr Met Ala Met Val Tyr Met Gly Ser Arg Gly Ser Thr Glu Asp Gln Met Ala Lys Val Leu Gln Phe Asn Glu Val Gly Ala Asn Ala Val Thr Pro Met Thr Pro Glu Asn Phe Thr Ser Cys Gly Phe Met Gln Gln Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Pro Asp Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Ala Asp Lys Ile His Ser Ser Phe Arg Ser Leu Ser Ser Ala Ile Asn Ala Ser Thr Gly Asn Tyr Leu Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Phe Gly Glu Lys Ser Ala Ser Phe Arg Glu Glu Tyr Ilu Arg Leu Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Ser Glu Pro Gln Ala Val Asp Phe Leu Glu Cys Ala Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ilu Asn Ser Trp Val Lys Thr Gln Thr Lys Gly Lys Ile Pro Asn Leu Leu Pro Glu Gly Ser Val Asp Gly Asp Thr Arg Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Thr Pro Phe Glu Lys Lys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Arg Val Asn Ser Ala Gln Arg Thr Pro Val Gln Met Met Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Asn Ile Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys Ala Gln Ile Leu Glu Leu Pro Tyr Ala Gly Asp Val Ser Met Phe Leu Leu Leu Pro Asp Glu Ile Ala Asp Val Ser Thr Gly Leu Gln Leu Leu Glu Ser Glu Ile Thr Tyr Asp Lys Leu Asn Lys Trp Thr Ser Lys Asp Lys Met Ala Glu Asp Glu Val Glu Val Tyr Ile Pro Gln Phe Lys Leu Glu Glu His Tyr Glu Leu Arg Ser Ile Leu Arg Ser Met Gly Met Glu Asp Ala Phe Asn Lys Gly Arg Ala Asn Phe Ser Gly Met Ser Glu Arg Asn Asp Leu Phe Leu Ser Glu Val Phe His Gln Ala Met Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Val Met Thr Gly Arg Thr Gly His Gly Gly Pro Gln Phe Val Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Leo Ile Met His Lys Ile Thr Asn Cys Ile Leu Phe Phe Gly Arg Phe Ser Ser Pro 【０００７】 【０００８】本発明による好ましいペプチドとしては次
の配列を有するペプチドが挙げられる。 又本発明は、ミンアクチビン、特に組換えDNA 由来ミン
アクチビン、ミンアクチビンの断片又はミンアクチビン
又はミンアクチビンの断片に対する抗体と、その薬理的
に許容し得る非毒性担体又は希釈剤とから成る、治療
用、診断用又は予防用組成物を提供するものである。略語の説明 HPLC：高速クロマトグラフィ− Mr ：相対分子質量 MW ：分子量 PMA ：４−ホルボ−ル−12−ミリステ−ト−13−アセテ
−ト SDS-PAGE：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動 TFA ：トリフルオロ酢酸 HPA ：ヒトプラスミノ−ゲン賦活剤 bp ：塩基対（ベ−スペア） kb ：キロ塩基対（キロベ−スペア） PU ：Ploug発明を実施するための最良の形態 強化ミンアクチビン合成用のU937細胞系の誘発 ミンアクチビンは誘導ヒト単球、ある種のマクロファ−
ジおよび単球血統の形質転換細胞により生成されること
が知られている。（国際特許出願第W086/01212号参
照。）形質転換細胞系U937(ATCC CRL1593)はデキサメタ
ゾンの存在下に構成的にミンアクチビンを生成すること
が見出された。無血清条件下においてこれらの細胞によ
り分泌されるミンアクチビンのレベルはこれらの細胞の
分泌する全たん白質量のわずかに0.06% にすぎないもの
であることが知られていた。又、このレベルは４−ホル
ボ−ル−12−ミリステ−ト13−アセテ−ト(PMA) の添加
により約0.4%程度増加し得ることが知られていた。PMA
のミンアクチビン分泌に対する経時効果は２相推移系を
とるものであり、最初の６時間は低く、次いで60時間ま
ではミンアクチビン活性は直線的に増加した（図１）。
又、PMA 濃度を10ng／mlから30ng／mlへ増加しても何ら
の相異も観察されなかった。更に又、17時間後でさえも
放射標識したPMA は培養上ずみ液中にほんの少量（10％
未満）しか検出されなかったので、ホルボ−ルエステル
は細胞をしっかりと結合していたと断定された。 【０００９】下記の実施例は本発明の好ましい態様を開
示するものである。しかしこれらは本発明の範囲を限定
するものとして解釈されるべきではない。又特記しない
限り部および％は重量部および重量％である。実施例１ 細胞培養 ヒトマクロファ−ジ細胞系U937を、T175培養フラスコ中
で又は10ｌのブラウム(Braun) 醗酵器中で、10％ウシ胎
児血清および１μM デキサメタゾン含有RPMI1640中で培
養した。細胞は１〜３×10⁶ 個／mlの密度に保持した。
この生長相中に細胞によってミンアクチビンが分泌され
るけれども、細胞を無血清培地に移してミンアクチビン
精製用に上ずみ液を取った。細胞をペレット化し、１度
洗浄し、１μM デキサメタゾン含有のRPMI 1640中に再
けん濁し、そして３日間培養した。無血清条件下にこれ
ら細胞により分泌されたミンアクチビンのレベルは、PM
Aの添加により約0.4%程度増加した。 【００１０】次いで細胞を採取し上ずみ液を以下に記載
する精製工程に使用した。実施例２ 均質ミンアクチビンの精製 (a) 無血清ミンアクチビン上ずみ液の濃縮 典型的なものとして、４〜５ｌの培養上ずみ液を、30,0
00MW分離カ−トリッジを備えたアミコンDC₂ 中空繊維透
析／濃縮装置を使用して10倍に濃縮した。次いでこの濃
縮物を少なくとも等量の50mMグリシン(pH7.8) に対して
透析して全痕跡量の色素を除去した。 (b) ミンアクチビン濃縮物の遠心分離 透析した濃縮物をJA10−ロ−タ−中で8000rpm で30分間
４℃で遠心分離して、残留細胞細砕物と透析中に沈でん
したと思われるたん白質とをペレット化した。次いでこ
の透明にした上ずみ液をアリクオットに作成しそして次
の精製工程に使用するまで−20℃で凍結しておく。 (c) 段階的pH溶離法を使用してのフェニル−セファロ−
スクロマトグラフィ− PMA を添加しないで培養した細胞から得られた培養上ず
み液を10倍に濃縮したものから、下記の様なフェニル−
セファロ−スを使用しての段階的pH溶離法により更にミ
ンアクチビンを精製した。 【００１１】上ずみ液（200 ml、12000 単位、特異活性
102 単位／mg）のイオン強度を、固体NaClの添加により
2Mに調節し、又そのpHをくえん酸により5.5 に調整し
た。この溶液を、50mMくえん酸ナトリウム（pH5.5)、2M
NaCl および1mM EDTAで平衡化したフェニル−セファロ
−スカラム(4.4cm×5.0 cm) 中に装入し、そして280nm
(A280) における基線吸光度が基線にもどるまで同じ緩
衝液で溶出した。次いでカラムを0.5M NaCl と1mM EDTA
を含有する50mMくえん酸ナトリウム（pH5.5)で溶出して
そして再度吸光度が基線にもどるまでA280を観察した。
次にミンアクチビンを50mMグリシン（pH9.0)でカラムか
ら溶出した。図１５はこの溶離プロフィルを示すもので
ある。 【００１２】この方法によるミンアクチビンの回収量は
9553単位であって、これはカラムに装入した単位の80％
に相当する。最高特異活性を有する物質を集め（6700単
位、特異活性1343単位／mg）、そしてアミコンYM10膜上
で濃縮して３mlとした。 (d) セファクリルS-200 ゲル透過クロマトグラフィ− こうして集めて濃縮したミンアクチビンを、0.1Mほう酸
ナトリウム（pH9.0)で平衡化したセファクリルS-200 の
2.2 cm×78cmカラム中に装入した。5.0 mlの画分を流速
0.46ml／分で集めた。図８はミンアクチビンが主たん白
質ピ−クの尾端部に溶出したことを示している。ミンア
クチビン活性を有する画分を集め（4480単位、特異活性
1355単位／mg）、そしてYM10膜を使用して３mlにまで濃
縮した。公知のMr標準体でのこのカラムの検量によれ
ば、ミンアクチビンが45〜48KDのMrを有していることが
明らかとなった。 (e) 等電点電気泳動 濃縮ミンアクチビン溶液を、pH値範囲4.5〜6.0のアムフ
ォリン含有ウルトロデックスの予備平床ゲルに装填し、
LKB マルチホ−ル等電点電気泳動装置上で23時間10℃で
電気集光した。この操作の終了後に、ゲルの長さ方向を
横断する30ゾ−ンをかき出して、そして1mM EDTA（pH9.
0)を含有する1Mグリシン10mlを使用してそれぞれからた
ん白質を溶離した。各画分のアリクオットをミンアクチ
ビン活性について分析し、15％SDS-ポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動してたん白質を確認した。図１６はミ
ンアクチビン活性を有する画分から著量のたん白質が分
離された事を示している。これらの状況から、ミンアク
チビンはpH５〜pH5.2 の間で等電点電気泳動し、そして
このゲルの領域内においては該ゲルに装填したミンアク
チビン全活性の15％が回収された。 【００１３】事実、ミンアクチビン活性を有する等電点
電気泳動ゲルの領域内において、２つのたん白質バンド
だけが可視となって表れている（図１６）。これらのバ
ンドの内どちらがミンアクチビンであるか決定するため
に、等量のアクリルアミドゲル上のたん白質をニトロセ
ルロ−ス上に移しそしてヤギにおける胎盤禁止剤に対し
て作った抗体でプロ−ビングした。同じ様な生物学的性
質を持っているので、２つの両たん白質は免疫的に関連
がある様に考えられた。図１７に示す様に、Mr＝45〜48
kDのたん白質バンドは抗胎盤禁止剤抗体と特異的に交叉
反応し、従ってこのたん白質がミンアクチビンであるこ
とを示している。更に又、この観察はゲル透過クロマト
グラフィ−上の在来ミンアクチビンを決定した45〜48kD
のMrと一致している。 (f) 高速液体クロマトグラフィ− ミンアクチビン活性を有している上記等電点電気泳動に
よる画分をアミコンYM10限外ろ過膜上で10倍に濃縮し、
そして更にウォ−タ−ズ社の高速クロマトグラフィ−を
使用してヴィダックC-4 逆相カラム上で分画した。たん
白質を、図１８に示した様に、0.1% TFA中のアセトニト
リルの溶離傾斜を使用して逆相カラムから溶出した。各
吸光度ピ−クをSDS-PAGEにより調べ、そして第５ピ−ク
が純粋ミンアクチビンを含有していることがわかった
（図１９）。実施例2A (a) ゲルろ過 細胞を含有しない上ずみ液を、WO86/01212の精製実施例
２に記載の工程(a) および(b) に従って処理し、次い
で、WO86/ 01212 の精製実施例１に記載の段階的pH溶離
法を使用してのフェニル−セファロ−スを通して処理し
た。ミンアクチビン活性を有する画分を集め、85％飽和
硫酸アンモニウムでの沈降により濃縮し、そして0.1Mほ
う酸ナトリウム（pH9.0)で平衡化したセファクリルS-20
0 の2.2 cm×80cmカラム中に装入した。3.5 mlの画分を
0.46ml／分の流速で集めた。図８は、ミンアクチビンが
主たん白質ピ−クの尾端部に溶出し、そして2206単位／
mgのピ−ク特異活性を有していた事を示している。尚こ
の活性は特異活性の31倍の全増加量に相当する。この様
な状況から、ミンアクチビンはスト−クス半径について
分子としてオバルブミンと同様な挙動を示すものであ
り、45〜49×10³ ダルトンの分子量を有するものである
と考えられる。 (b) フェニル−ボロネ−トアガロ−スクロマトグラフィ
− 細胞を含有しない上ずみ液を、WO86/01212の精製実施例
２に記載の工程(a) および(b) に従って処理した。この
上ずみ液の１mlをMgCl₂ 中10mMとし、そして次いで水酸
化ナトリウムでpHを8.5 に調節した。この溶液を、10mM
MgCl₂を含有する50mMグリシン（pH8.5)で平衡化したフ
ェニル−ボロネ−トアガロ−ス−30(PBA30) のカラム
(0.8cm×2.5 cm) 中に４℃で装入した。次いでこのカラ
ムを上記の緩衝液９mlで洗浄しそして次いで下記の溶液
で順次洗浄した。 【００１４】(a) 10mM EDTA 含有の50mMグリシン（pH8.
5)の10ml。 (b) 100mM ソルビト−ル含有の50mMグリシン（pH8.5)の
10ml。 (c) 100mM トリス-HCl（pH8.5)の10ml。 (d) 50mM酢酸ナトリウム（pH5.0)の10ml。 ５mlの画分を集め、そしてミンアクチビン活性およびた
ん白質決定の前に、４℃で１晩、pH7.8 で50mMグリシン
に対して透析した。図９に示した結果から、別の条件下
でカラムから２つの明確な活性ピ−クが溶出しているこ
とがわかる。第１のピ−クはEDTAで溶出したものであ
り、14倍の特異活性の増加を以って、カラムに装填した
全活性の35％を含有するものである。第２のピ−クは、
特異活性の4.4 倍の増加を以って、当初の活性の32％を
表わしている。 (c) 着色集光 細胞を含有しない上ずみ液を、WO86/01212の精製実施例
２に記載の工程(a) および(b) に従って処理した。この
上ずみ液の４mlを25mMイミゾダ−ル-HCl緩衝液（pH7.4)
に対して透析し、次いで該緩衝液で平衡化したPBE94 着
色集光カラム（１cm×27cm）に装入した。次いでpH4.0
のポリ緩衝液200 mlの使用により直線pH傾斜を確立し、
そして４mlの画分を集めて1Mトリス−HCl （pH7.5)の４
mlのアリクオットとした。各10個の画分を集め、濃縮し
そしてセントリコン(centricon)30 上で洗浄してミンア
クチビン活性とたん白質濃度を分析した。図１０は大部
分の活性がpH５の近くで溶出したことを示している。活
性の全回収率は82％であり、特異活性の２倍の増加があ
った。 (d) 等電点電気泳動 細胞を含有しない上ずみ液を、WO86/01212の精製実施例
２に記載の工程(a) および(b) に従って処理し、次いで
WO86/01212の精製実施例１に記載の段階的pH溶離法を使
用してのフェニル−セファロ−スを通して処理した。ミ
ンアクチビン活性を有する画分を集め、85％飽和硫酸ア
ンモニウムでの沈降により濃縮し、そして50mMグリシン
（pH9.0)に対して１晩透析した。この溶液を、pH値範囲
4.5 〜6.0 のアムフォリン含有ウルトロデックスの予備
平床ゲルに装填し、LKB マルチホ−ル等電点電気泳動装
置上で23時間10℃で電気集光した。この操作の終了後
に、ゲルの長さ方向を横断する30ゾ−ンをかき出して、
そして1mM EDTA （pH9.0)を含有する1Mグリシン10mlを
使用してそれぞれからたん白質を溶離した。各画分のア
リクオットをミンアクチビン活性について分析し、15％
SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動してたん白質
を確認した。図１１はミンアクチビン活性を有する画分
から著量のたん白質が分離された事を示している。これ
らの状況から、ミンアクチビンはpH５〜pH5.2 の間で等
電点電気泳動し、そしてこのゲルの領域内においては該
ゲルに装填したミンアクチビン全活性の39％が回収され
た。 (e) 免疫アフィニティ−クロマトグラフィ− 細胞を含有しない上ずみ液を精製実施例１の様にして処
理した。このミンアクチビン製剤（2300単位、2.25mg、
特異活性 1020Ｕ／mg）の4.6 mlのアリクオットをりん
酸ナトリウム中 0.05M 、NaCl中0.5 、トリトンX-100
中0.01% 、アジ化ナトリウム中0.1%、EDTA中 1mMとし、
そしてpHを7.5 に調節した。この溶液を上記緩衝液で15
mlに希釈し、そして抗胎盤禁止剤抗体10mgを化学的に結
合したセファロ−ス4Bの15mlに加えた。このスラリ−を
４℃で１晩振とうし、次いで2.5cm×3.1 cmのカラム中
に注ぎ入れた。未結合たん白質がカラムから排出され、
そしてこのカラムを、280mm における吸光度が基準線に
戻るまで緩衝液で洗浄した。次いでカラムを、10mMトリ
ス-HCl（pH8.0)を含有する3M KSCN で溶出した。溶出プ
ロフィ−ルを図１２に示した。KSCNにより溶出した画分
をセントリコン(Centricon) 上で8.5 倍に濃縮し、40mM
グリシン（pH7.8)で洗浄し、そしてSDS-PAGEによりミン
アクチビン活性を分析した。大部分のミンアクチビン活
性は抗体カラムと結合していなかった。しかしながら、
少量のミンアクチビン活性（8.5 単位）は特異的に結合
しており、3M KSCN により溶出する。この事は、これら
の条件下で抗体カラムはミンアクチビンを超過担持して
いるという事を意味するものである。更に又、ミンアク
チビンはかなりの時間の間にKSCNの存在下にその活性の
90％以上を失活するが、これはミンアクチビン活性の回
収率が低いことはKSCN中における分子の失活が原因であ
るを示すものである。SDS-PAGEの結果はほとんど大部分
のたん白質溶出物がカラムから阻害されることなく溶出
したことを示している。しかしながらKSCN溶離剤は、ゲ
ルろ過におけるミンアクチビンの分子サイズと同様（実
施例2A(a) 参照) の約45,000の分子量の多くのたん白質
バンドを含有している（図１２) 。このミンアクチビン
製剤のウエスタン分析によれば、単一の免疫交差反応種
がSDS-PAGEに続いて観察されたたん白質バンドと同一の
移動をすることが明らかとなった( 図１３) 。 【００１５】ある条件下ではミンアクチビンは約60,000
〜70,000の分子サイズを有することが観察されている
（PCT191-85 に詳しく記載されている）。この矛盾は、
ミンアクチビンのグリコシル化度による可動性の変化に
起因するものであると考えられる。実施例３ ミンアクチビンからのペプチド断片の単離と配列決定 上記実施例２の様にして、PMA 誘発U937細胞からミンア
クチビンを精製した。次いでこのミンアクチビン(3〜5
μg)を、5M尿素を含有する20mMトリス-HCl（pH8.5)中の
エンドプロティナ−ゼLysC(0.1μg)の最終体積50μｌ
で、８時間22℃で消化した。得られたペプチドを、0.1%
TFA中のアセトニトリルの溶離傾斜を使用してシンクロ
パックRP-P(C-8) カラム上の逆相高速液体クロマトグラ
フィ−により分離した（図２０）。星印を付したペプチ
ドをアプライドバイオシステム（Applied Biosystem)47
0A気相シ−クエンサ−によりシ−クエンシング（配列決
定）し、そしてその配列は下記の通りである。 【００１６】ペプチド 13：AQILELPY-GDV-MFLLLP-E... ペプチド 11：GRANFSGMSE-NDLF... ペプチド 10：MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y... ペプチド 6：LNIGYIEDLK ペプチド 9：IPNLLPEG-V実施例４ ミンアクチビンの分子クロ−ニング (a) mRNAの単離 図１より、PMA 誘発U937細胞の最適転写時間は15〜25時
間の間であると考えるのが妥当である。従って、U937細
胞の細胞密度1.2 ×10⁶ 個／mlの４ｌ無血清培養液をPM
A の存在下に19時間培養し、細胞を採取し、そして次に
使用するまでの間液体窒素中ですばやく凍結させた。PM
A での刺激を与えていないU937細胞を３日間無血清培養
したものも同様にmRNA単離のために保持した。国際特許
出願第WO89/01212号の記載の様にして作りそして対外で
（試験管内的に）３日間培養したヒト血液単球も又mRNA
源として使用した。 【００１７】上記の原料のそれぞれから、グアニジン−
HCl 法の変法により全RNA を抽出した。細胞ペレット
を、4Mグアニジンイソチオシアネ−ト、50mMトリス-HCl
（pH7.5)、10mM EDTA 、0.5%サルコシル(Sarkosyl)、お
よび0.1M２−メルカプトエタノ−ルを含有する緩衝液の
20倍体積（１ｇ重量につき）中で、撹拌器中で４℃で３
分間ゆっくりとした速度で均質化（ホモジナイズ）し
た。次いでけん濁液を10分間遠心分離して細砕物を除去
した。酢酸を25mMまでと、冷エタノ−ルを0.75体積倍加
えることによって上ずみ液から核酸を沈でんさせ、そし
て−20℃で１晩培養した。再びけん濁液を30分間−10℃
で遠心分離し、そしてペレットを7.5Mグアニジン-HCl、
20mM酢酸ナトリウム（pH5.0)および1mM ジチオスレイト
−ルを含有する緩衝液中にもとの体積の20％となる様に
溶解した。遠心分離して未溶解物質を除去した後に、0.
55体積倍の冷エタノ−ルを加えて−20℃で１〜３時間す
るとRNA が沈でんした。このRNA を遠心分離により回収
し、グアニジン−HCl 緩衝液中に再溶解しそして沈でん
させた。この最後の工程は３回くり返し行なった。最終
沈でんの後に、ペレットを20mM EDTA （pH7.0)中に溶解
し、そして等体積のクロロホルム：ブタノ−ル（４：
１）で抽出した。次いでRNA を、酢酸ナトリウム（pH5.
0 、0.3Mまで）と２体積倍の冷エタノ−ルを加えて−20
℃に１晩保つことにより、水相から沈でんさせた。この
RNA を遠心分離により回収し、20mM HEPES（pH7.4)およ
び0.5%ドデシル硫酸ナトリウム中の100 mg／mlのプロテ
ィナ−ゼＫで50℃で４時間処理して残留たん白質がある
場合にはこれを除去した。次いで0.2M酢酸ナトリウム
（pH5.0)および２体積倍のエタノ−ルの存在下に−20℃
でRNA を沈でんにより回収した。遠心分離による回収の
後で、3M酢酸ナトリウム（pH6.0)の存在下に４℃で１晩
RNA を沈でんさせることにより残留DNA がある場合には
これを除去した。RNA を遠心分離により回収し、そして
0.25N 塩化ナトリウムおよび２体積倍のエタノ−ルの存
在下に沈でんさせた。このRNA を再度遠心分離により回
収した。次いで吸着およびオリゴ(dT)−セルロ−スから
の溶出を２サイクル行なってポリA⁺mRNAを単離した。 【００１８】このポリA⁺mRNAを、しょ糖密度こう配遠心
分離により10〜20倍のミンアクチビンmRNAに濃縮した。
このサンプルを15〜34％(w/w) しょ糖こう配上に層状に
おき、そしてベックマンSW41ロ−タ−中で33,000rpm 、
４℃で16時間遠心分離した。図２はサイズ分画したmRNA
調製品の変性条件下におけるゲル分析を示すものであ
る。図３に示す様に、ミンアクチビンmRNAは、試験管内
翻訳および免疫沈降法（後記する）により決定された18
S リボゾ−ムRNA 標準体の回りに集中した画分（画分16
および17）中に検出された。 (b) ミンアクチビン翻訳生成物の同定 ミンアクチビンmRNAは、細胞を含有しない網状赤血球溶
解産物系中での試験管内翻訳およびそれに続く、その天
然物質ウロキナ−ゼを利用したミンアクチビン翻訳生成
物の免疫沈降により同定した。 【００１９】アマ−シャム社(Amersham)から市販のウサ
ギ網状赤血球溶解産物を、最初にメ−カ−の指示通り
に、ウシ肝臓tRNA(Boehri-nger Mannheim)を100 ng／ml
の濃度で加えて使用した。³⁵S-メチオニン(Amersham)を
2mCi／mlの濃度で加えて、オ−トラジオグラフィ−によ
り翻訳生成物を検出できるようにした。上記の様にして
作成したポリ A⁺ mRNAを50mg／mlの濃度で90分間30℃で
翻訳した。25μｌの翻訳生成物を各免疫沈降に使用し
た。培養しそして全スタフィロコッカスオ−レウス(Sta
phylococcus aureus) 細胞(Pansorbin,Calbiochem)の洗
浄けん濁液を除去して非特異結合を最少にした後で、こ
のサンプルを50mPV のウロキナ−ゼ(Calbiochem)で室温
で90分間培養した。この工程によりミレアクチビン翻訳
生成物とウロキナ−ゼとの間の錯体が生成する。この錯
体を、１〜２μｌの抗ウロキナ−ゼ抗血清（ミドリ十字
社）又は胎盤禁止剤に対する抗体を加えることにより溶
液から取り出し、30分間室温で、次いで１晩４℃で培養
し、そして次に25μｌの洗浄パンソルビン(Pansorbin)
を加えることにより沈でんさせた。遠心分離後、ミンア
クチビン−ウロキナ−ゼ−抗体−パルソルビンペレット
を洗浄し、２％SDS および２−メルカプトメタノ−ルの
存在下に沸騰させることにより粉砕し、そしてこの生成
物をゲル電気泳動、次いでオ−トラジオグラフィ−によ
り分析した。 【００２０】ウロキナ−ゼに対する抗体での³⁵S-標識翻
訳生成物の免疫沈降により69,000および79,000のMrs を
有するウロキナ−ゼ特異性翻訳生成物が得られた。これ
らのたん白質バンドは、次の様なことからミンアクチビ
ンとウロキナ−ゼとの特異的錯体を表わしている。 (1) ウロキナ−ゼ又はmRNAの不在下では表われない。 【００２１】(2) 抗体の不在下では沈でんしない。 (3) ウロキナ−ゼ結合について未標識の精製ミンアク
チビンおよび胎盤禁止剤(Calbiochem)製剤と競合する
（図４）。免疫沈降生成物は、DNA 誘発U937細胞から得
られたmRNAから合成した全たん白質の0.05% を表わすも
のであることが見出された。非誘発U937細胞から得たmR
NAからは免疫沈降生成物は全く検出されなかった。これ
はこの場合はミンアクチビンmRNAのレベルが低いことが
原因となっていると考えられる。 【００２２】胎盤禁止剤に対する抗体を使用してのウロ
キナ−ゼ−ミンアクチビン翻訳生成物の免疫沈降によっ
ても同様の結果が得られた。いくつかの抗胎盤禁止剤抗
体製剤は、69,000および79,000MWにおいてはっきりとウ
ロキナ−ゼ−ミンアクチビン翻訳生成物錯体を沈でんさ
せた（図５）。図６に示す様に、ウロキナ−ゼの存在下
および不在下に得られた免疫沈降生成物を比較すること
により、ミンアクチビン翻訳生成物の直接同定が可能で
ある。これは43,000のMrにおいて明白なバンドとして表
われる。この分子量は在来たん白質の場合に観察される
ものよりいく分少ない様に思えるが、これはグリコシル
化に起因するものであると考えられる。ウロキナ−ゼの
存在下では、このバンドは消失しており、69,000Mrの所
に特有のウロキナ−ゼ−ミンアクチビン翻訳生成物が検
出される。先に観察された79,000〜80,000Mrにおける別
のたん白質バンドは、サンプルが部分的に還元条件下で
分析されたので、錯体の非還元型を表わすものであると
考えられる。 【００２３】更に又、ミンアクチビン翻訳生成物との錯
体形成は、ウロキナ−ゼの低分子量形(HPA33) の存在に
依存するものであることがわかった。HPA52 とHPA33 の
純粋製剤を入手し(Calbiochem)、これは全く１つの種で
あり、すなわち１方は他方にブィブリン被覆をしたもの
であることが明らかとなった（図７）。尚、プラスミノ
−ゲン／プラスミンをHPA33 に加えるとこの製剤中に残
留する痕跡量のHPA52は低分量形に変わった。69,000MW
におけるはっきりとしたウロキナ−ゼ−ミンアクチビン
翻訳生成物錯体は、使用したウロキナ−ゼ製剤がHPA33
を含有していた場合にのみ表われた。この結果の説明は
明らかではない。可能なたん白分解を禁止するために溶
解産物混合物にトラシロ−ルを加えてもこの結果には何
ら影響はなかった。 【００２４】要するに、U937細胞からのmRNAの試験管内
翻訳によりMrが約43,000の生物学的に活性なミンアクチ
ビン翻訳生成物が生成することが明らかであり、このこ
とはウロキナ−ゼとの錯体を形成し、これが69,000の特
有のMrを有することから容易に同定することができる。 (c) 相補DNA ライブラリ−の構築 色々な公知方法により、全ポリ A⁺ mRNA又はしょ糖密度
こう配分画mRNAからcDNAライブラリ−を構築した。１例
として、第１鎖相補DNA を一般的な方法によりプライマ
−開始逆転写酵素を使用してmRNAから合成した。次いで
第２鎖を、例えば、 (1)DNA ポリメラ−ゼ又は逆転
写酵素を使用しての通常のヘヤ−ピンル−ププライマ−
によるDNAの合成、又は(2)RNア−ゼH-DNA ポリメラ−ゼ
Ｉのメジエ−タ−作用による第２鎖合成、又は (3)
５′−末端をプライマ−として開始する方法により合成
した。S1ヌクレア−ゼでの処理（必要の場合に）の後
に、DNA をメチル化し、そして通常の例えばDNA ポリメ
ラ−ゼ、クレノ−断片又はT4ポリメラ−ゼの導入による
方法を使用して平滑端を生成させた。次いでcDNAを、こ
れを適当な切断部位を含有する合成リンカ−分節で創製
した相補ホモポリマ−末端又は付着端を介し適当なプラ
スミド（例えば、pBR322、pUC 又はpUR 系）又はバクテ
リオファ−ジ（例えばλgt11）と通常の方法により結合
させ、そして次いで適当な宿主に形質転換させることに
よりクロ−ニングすることが出来る。実施例５ cDNAライブラリ−を構築する好ましい方法は次の通りで
ある。 50mMトリス-HCl、75mM KCl、10mM DTT、3mM Mg
Cl、各1mM のdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP、10μg/mlオ
リゴ(dT)₁₂〜₁₈および100 μg/ml BSAの存在下に、モロ
ニ−ネズミ白血病ウィルス逆転写酵素(BRL、200U／μg
mRNA) を使用して全ポリ A⁺ mRNAの６μｇからcDNAを合
成した。反応物の200 μｌを40分間37℃で培養した。DN
A ポリメラ−ゼＩのクレノ−断片を使用してのヘヤ−ピ
ンル−ププライマ−による合成により第２鎖を合成し
た。反応は70℃に加熱して10分間行なってDNA/RNA ２重
体を分離し、２倍に希釈し、そして10μCiのdATP(1800C
i/mmol) の存在下にクレノ−を325U／mlに加えた。反応
は15℃で１時間培養する様に続けた。フェノ−ル：クロ
ロホルム（１：１）抽出とエタノ−ル沈でんの後で、DN
A を溶解し、そして0.2M NaCl 、50mM酢酸ナトリウム
（pH4.5)、1mM ZnSO₄ および0.5%グリセロ−ルの存在下
に80単位のS1ヌクレア−ゼ(P/L Biochemicals)での処理
によってヘヤ−ピンル−プを除去し、そして上記した様
にして沈でんさせた。次いで100mM トリス-HCl（pH8.
0)、10mM EDTA および80μM S-アデノシルメチオニンの
存在下に、20単位のEcoR1 メチラ−ゼ(Biolabs) を使用
して２本鎖cDNAをメチル化した。33mMトリス−酢酸（pH
8.0)、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5m
M ジチオスレイト−ル、0.1 mg／ml BSAおよび各0.5mM
のdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPの存在下に2.5VのT4 DNA
ポリメラ−ゼを１時間に37℃で加え、次いでT4ポリヌク
レオチドキナ−ゼ(20V) および0.1mM ATP を加えること
によりDNA を修復した。フェノ−ル：クロロホルム
（１：１）抽出およびエタノ−ル沈でんの後に、T4 DNA
リガ−ゼ(IBI:1.2V/μg,DNA)を使用してEcoR1 リンカ−
を再溶解したDNA (2μg リンカ−/1μg DNA)に加えた。
反応を濃縮cDNA溶液(167μg/ml) 上で26℃で４時間行っ
た。EcoR1 で処理した後に、バイオゲルA150M 上でのク
ロマトグラフィ−によりcDNAから遊離のリンカ−を分離
した。平均長が1,000b.p. より大きいcDNAを含有する画
分を集め、cDNAを濃縮し、そして２体積倍のエタノ−ル
を加えて沈でんさせた。 cDNAの収量は2.5 μg であっ
た。 【００２５】cDNAライブラリ−をλgt11およびgt10の両
方の中で作成した。cDNA(100ng) を、EcoR1 切断したフ
ォスファタ−ゼ処理した λgt11(1μg)220 μg/mlのDN
A 濃度で、４℃で16時間ライゲ−トした。このDNA をVe
ctor Cloning Systems社製の既製の包装製剤で包装し
た。E.コリY1088 株に吸着させてファ−ジを増幅させ、
そしてY1090 中でスクリ−ニングした。λgt11ライブラ
リ−はcDNA１μg 当たり約８×10⁶ の組換え体（全ファ
−ジの94％）を含有していた。cDNA分子を含有する組換
え体の割合は、このライブラリ−をα〔³²P 〕−dATPの
存在下に合成したcDNAでスクリ−ニングすることにより
決定した。約90％の白色プラ−クがこのプロ−ブとハイ
ブリダイズした。λgt10中で作成したライブラリ−用
に、cDNA(200ng) をEcoR1 切断したフォスファタ−ゼが
処理したλgt10(1μg)と、240 μg/mlのDNA 濃度で、
25℃で４時間ライゲ−ションした。このDNA を、E.コリ
C600hfl 株を使用して上記の様にして包装した。 λgt
10ライブラリ−はcDNA 1μg 当り約7.5 ×10⁶ 個の組換
え体を含有していた。cDNA分子を含有する組換え体の割
合は、このライブラリを放射線標識したcDNAでスクリ−
ニングすることにより決定した。90％より多くのプラ−
クがこのプロ−ブとハイブリダイズした。実施例６ ミンアクチビン遺伝子を含有するクロ−ンの同定 ミンアクチビンをコ−ドする遺伝子を含有するクロ−ン
は従来技術を使用して下記の実施例中に記載のプロ−ブ
を使用して同定することが出来る。実施例6a ハイブリッド選択翻訳 ミンアクチビンmRNAに相補的な配列を含有するcDNAクロ
−ンはハイブリダイゼ−ション選択により同定すること
が出来る。クロ−ン化DNA を変成し、ニトロセルロ−ス
の様な固体マトリックスに固定し、そして全mRNAの製剤
とハイブリダイズする。RNA/DNA ２重体を加熱してmRNA
を放出し、次いでこれを上記した様な試験管内ウサギ網
状赤血球溶解産物の無細胞系に翻訳する。この翻訳生成
物を次いで実施例4bに記載の様にして同定する。実施例6b ミンアクチビン遺伝子配列に相補的なDNA プロ−ブ 実施例３に記載のミンアクチビンのペプチド用に得られ
るアミノ酸配列を使用して、次いでそのアミノ酸配列を
コ−ドすると考えられるオリゴヌクレオチド配列を予測
することが出来、そして従来技術を使用してオリゴヌク
レオチドプロ−ブを合成することが出来る。 【００２６】この配列デ−タを使用して、Applied Bios
ystems 380A DNA 合成装置によりたくさんのオリゴヌク
レオチドプロ−ブを合成した。これらオリゴヌクレオチ
ドの配列は次の通りである。特異的オリゴヌクレオチドプロ−ブを放射線標識し、次
いで常法を使用して細菌コロニ−又はバクテリオファ−
ジプラ−クのその場でのハイブリダイゼ−ションにより
cDNAライブラリ−をスクリ−ニングすることにこれを使
用し、それによりミンアクチビン遺伝子の全部又は１部
を含有するクロ−ンを同定することが出来る。実施例6c 免疫学的スクリ−ニング 在来ミンアクチビンたん白質と交差反応する抗体を使用
して常法によりクロ−ンをスクリ−ニングすることが出
来る。 【００２７】ミンアクチビンに対する抗体は常法により
作成する。例えば、ウサギをそれぞれ、例えばフロイン
トの完全アジュバント又はモンタナイドの様な適当なア
ジュバントの存在下に、10〜100 μg の精製ミンアクチ
ビンで免疫付与する。約４週間後に同量のブ−スタ−付
与をした後に、ウサギの血清を採り、これをミンアクチ
ビンに対する抗体用に分析すれば良い。実施例6d 生物学的活性についてのスクリ−ニング ミンアクチビン遺伝子含有クロ−ンは、放射線標識した
ウロキナ−ゼ又はウロキナ−ゼのいずれかおよびウロキ
ナ−ゼに対する抗体を使用してミンアクチビン活性を試
験又はスクリ−ニングすることが出来る。これは免疫学
的スクリ−ニングの常法技術を使用して行うことが出来
る。ウロキナ−ゼおよびウロキナ−ゼに対する抗体は市
販のものを入手すれば良い。放射線標識したウロキナ−
ゼは以下に述べた様にして作成出来る。 【００２８】市販のウロキナ−ゼ(Calbiochem)を、文献
記載の方法(Holmberg,L.,Bladh,B.およびAstedt,B, の
「Biochim,Bioph-ys. 」,Acta 445, 215〜222(1976),お
よびGoldfarb,R.H. およびQuigley,J.P.の「Biochemist
ry」,19,5463〜5471(1980))により、ｐ−アミノベンズ
アミジンセファロ−ス上のクロマトグラフィ−によりア
フィニティ−精製した。75プロ−(Ploug) 単位の精製ウ
ロキナ−ゼを、Bolton Hunter 法により、Ｎ−スクシン
イミジル３−（４−ヒドロキシ，５−〔I¹²⁵〕ヨ−ドフ
ェニル）プロピオン酸エステルとの結合によりよう素化
した。このI¹²⁵−標識したウロキナ−ゼを、0.1Mりん酸
ナトリウム（pH7.0)、0.4M塩化ナトリウム、0.1%トリト
ンX100および1%担体ウシ血清アルブミンで平衡化したセ
ファデックスG-25M 上のクロマトグラフィ−により遊離
標識剤から分離した。 【００２９】非還元条件下においてSDS-ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によりこのI¹²⁵−標識ウロキナ−ゼ製
剤を分析すると、ウロキナ−ゼの特有の高分子形(Mr55,
000)および低分子形(Mr33,000) の存在が明らかとなっ
た（図１４）。還元条件下では高分子量形はその特有の
33,000および22,000Mrサブユニットに解離する。ウロキ
ナ−ゼ製剤をよう素化することにより、Coleman および
Green の分析法(Ann,N.Y.Acad.Sci.,370,617(1981)) に
より測定したところ、10〜15％プラスミノ−ゲン賦活剤
活性の損失があったが、しかしこれは酵素のミンアクチ
ビン禁止効果には何ら影響がなかった。ミンアクチビン
を種々の濃度に希釈したものをニトロセルロ−ス紙上に
点状塗布し、放射線標識したウロキナ−ゼと一緒に１晩
培養し、洗浄し、乾燥し、そしてオ−トラジオグラフィ
−に付すことから成る点ブロット分析の結果、10mMの感
度で、すなわち約0.1ng のミンアクチビンが固相に結合
している状態で放射線標識ウロキナ−ゼがミンアクチビ
ンを検出することが出来ることが明らかとなった。 【００３０】実施例７ ミンアクチビン遺伝子の同定 ミンアクチビン遺伝子を同定する好ましい方法は次の通
りである。合成後に、実施例6bに記載のオリゴヌクレオ
チドプロ−ブ７〜10をポアクリルアミドゲル電気泳動に
より精製し、ポリヌクレオチドキナ−ゼ(IBI 1V/pmol D
NA) およびγ− ³²P-ATP で標識し、そして常法によるイ
オン交換クロマトグラフィ−により精製した。 【００３１】実施例５に記載のλgt10ライブラリ−を、
常法によりその場でのハイブリダイゼ−ションによりス
クリ−ニングした。ハイブリダイゼ−ションの条件は背
景体との特異結合が最少となる様に調節し、そして下記
の様になるように決定した。ロ−ブ７および８：６×SS
C 、５×Denhardt′s 、0.5% SDS、および0.2 mg／ml切
断ウシ胸腺DNA 中で42℃で１時間予備ハイブリダイゼ−
ションした後に、６×SSC 、５×Denhardt′s 、0.1% S
DSおよび20μg/ml tRNA 中で50℃で３時間処理。プロ−
ブ９および10：10×Denhardt′s 、５×SSC 、および
0.05% ピロりん酸ナトリウム中で37℃で16時間処理。 【００３２】10⁸cpm／μg より大きな特異活性を有する
³²P-標識オリゴヌクレオチドプロ−ブを約0.5pmol/ml使
用した。陽性クロ−ンの選択性を高めるために、フィル
タ−を0.1% SDS含有の0.5 ×又は２×SSC 中で上昇温度
で洗浄した。陽性シグナルのプラ−クを採り上げ、再ス
クリ−ニングし、そしてファ−ジDNA を常法により精製
した。（例えばManiatis等の「Molecular Cloning 」(1
982)参照。） 互いに交差ハイブリダイズは、配列を含有する、それぞ
れ2100および1060の塩基対のEcoRI-リンカ−結合cDNAイ
ンサ−トを持つ、2 つの組換えバクテリオファ−ジクロ
−ンMINID およびMIN611が得られた。 【００３３】これらインサ−トをそれぞれプラスミドpB
TA440 およびpBT 441 を創製するプラスミドpUC18 にサ
ブクロ−ニングし、そして図２１に示す様な制限酵素分
析による制限酵素切断地図を作成した。クロ−ンMIN1D
のサザ−ンブロット分析により、図２１に示した様に32
0 塩基対XbaI-NcoI 制限断片内にオリゴヌクレオチドプ
ロ−ブ７および８の結合領域があるのを確認した。これ
らのクロ−ンがミンアクチビンをコ−ドする遺伝子を含
有していたことは、ハイブリッド選択翻訳およびDNA 配
列分析により確認された。ハイブリッド選択翻訳 Maniatis等の方法( 「Molecular Cloning 」(1982)) に
より、３mm×３mmのフィルタ−１枚につき20μg の濃度
で精製pBTA440 をニトロセルロ−スフィルタ−上に固定
した。洗浄後、各フィルタ−を50μg の全mRNAで培養
し、そして50℃で３時間ハイブリダイズした。充分に洗
浄後、沸とうにより特異的にハイブリダイズしたmRNAを
溶出し、そして次いで市販のウサギ網状赤血球溶解産物
製剤(Amersham)を使用して試験管内で翻訳した。 【００３４】図２２に示す様に、ハイブリダイズしたmR
NAは、ゲル電気泳動によりMr43,000の翻訳生成物を特異
的にコ−ドすることが明らかとなった。尚ミンアクチビ
ン翻訳生成物の特性は実施例4bに記載した。更に又、ウ
ロキナ−ゼの存在下では、このバンドは消失し、そして
特有のウロキナ−ゼ−ミンアクチビン複合体が69,000Mr
に検出された。DNA 配列分析 pBTA440 の制限断片を一本鎖ファ−ジベクタ−M13mp9、
M13mp 18およびM13mp19 にサブクロ−ニングし、そして
挿入された 2,100bp のDNA 配列をSangerの連鎖終息法
により決定した。そのDNA 配列を調べたところ、2,100b
p インサ−トはミンアクチ ビン遺伝子の全コ−ド配列
を含有していることがわかった。プライマ−拡張 ミンアクチビンのＮ末端領域をコ−ドするDNA 配列の残
りを得るために、プライマ−拡張により第２のcDNAライ
ブラリ−を構築した。このライブラリ−は、先のヌクレ
オチド配列391 〜420 に相補的なオリゴヌクレオチド5
′TTC CAG TAA ATA ATT CCC TGT GGA TGC ATT3′でポ
リ A⁺ mRNAの 5μg をプライミングすることにより作成
した。引き続きEcoRＩ−リンカ−含有cDNAインサ−トを
常法によりλgt10中にクロ−ニングした。 【００３５】得られた7.2 ×10⁴ 個のクロ−ンの内の約
5.3 ×10³ 個のクロ−ンを第２のオリゴヌクレオチド ５′GCC TGC AAA ATC GCA TCA GGA TAA GTA CC３′ （これはヌクレオチド310 〜325 に対して相補的) でス
クリ−ニングした。得られた100 個の陽性クロ−ンの内
の15個を精製し、そして最大のcDNAインサ−ト(430bp)
を有するクロ−ン（クロ−ン13）をプライスミドpBTA44
2 を創製するプラスミドpUC18 にサブクロ−ニングし
た。pBTA442 のDNA 配列は上記の様にして決定した（同
様に図２１参照）。 【００３６】pBTA440 およびpBTA443 中に含有されるミ
ンアクチビン遺伝子のコ−ド配列（これはpBTA442 に対
して反対側に配向したpUC18 中の430bp ５′−ミンアク
チビン配列を含有するプラスミドである）を、図２３に
示す様にある種のDNA 制限断片と結合させて隣接させて
pBTA438 を創製した。pBTA438 を含有するE.コリK-12株
JM109 は1987年11月11日でAmerican Type Culture Coll
ection (12301 Parklawn Drive,Rockoille,Maryland 20
852,米国）に寄記し、寄記番号ATCC 53585を受けた。ミ
ンアクチビン遺伝子の全cDNA配列およびこれから演繹し
たミンアクチビンたん白のアミノ酸配列を図２４および
図２５に示した。全翻訳生成物は415 個のアミノ酸（Mr
46,543)から成っている。この遺伝子は、図２４および
図２５に示した様に在来ミンアクチビンのアミノ酸配列
分析から得られた５個のペプチドをコ−ドしている。 【００３７】このDNA 配列の分析の結果、ミンアクチビ
ンはウロキナ−ゼ型プラスミノ−ゲン賦活剤に特異的で
あるにもかかわらず、セリンプロテア−ゼ禁止剤上科の
一員（セルピンとして知られている）であることが明ら
かとなった。実施例８ 生物学的に活性なミンアクチビンの発現 例えばpBTA438 中に存在する全長cDNAを、細菌や真核動
物細胞（例えばベクタ−でトランスフェクトされたか又
は形質転換された哺乳動物細胞）の様な種々の宿主中で
たん白質の合成を司どることのできる種々のベクタ−中
に同化統合することにより、生物学的に活性な分子の高
レベルでの発現が可能である。ここでベクタ−として
は、ミンアクチビンをコ−ドするヌクレオチド配列の発
現を制御し得るヌクレオチド配列を含有するものが好ま
しい。この第２のヌクレオチド配列は、１例として、プ
ロモ−タ−配列、ポリアデニル化配列、又はたん白質を
別のたん白質に融合したハイブリッド分子として発現さ
せる様な作用を有するヌクレオチド配列を含有していて
も良い。実施例９ ミンアクチビンの細菌による発現 この工程のまず最初は、E.コリ中で複製可能な、そして
ミンアクチビンの発現をコ−ドするDNA 配列を含有する
発現ベクタ−又はクロ−ニング媒体を作成することであ
る。 【００３８】ミンアクチビンはその在来型として、ある
いは別のたん白質と融合したハイブリッド分子として発
現可能である。これらの構築方法は図２６、図２８、図
２９に示した。１種のプラスミド構築には、在来の又は
在来に近い（Ｎ−末端アミノ酸変成した）ミンアクチビ
ンを発現する。λ P_L 発現ベクタ−pLK57 およびpLK58
(Botterman 等の「Gene」,37;229 〜239,(1985)) を使
用した。 【００３９】図１５に示す様に、プラスミドpBTA438 を
EcoRＩおよびDraＩで消化し、そして1610bPのEcoRＩ-Dr
aＩ制限断片をアガロ−スゲルから単離した。この断片
をT4リガ−ゼで、EcoRＩおよび EcoRV で消化したベク
タ−pLK57 にライゲ−ションした。この誘導体プラスミ
ドpBTA444 は在来ミンアクチビンの発現を制御するλP_L
プロモ−タ−を含有している。 【００４０】発現ベクタ−pBTA444 を使用して、ラムダ
の熱可変cIリプレッサ−を含有するE.コリK-12株N4830
(Joyce 等の「PNAS 80 」, 1830〜1834,(1983))を形質
転換した。こうしてpBTA444 で形質転換した細胞を、10
0 μg/mlのアンピシリンを添加したMEB 培地(Mott 等の
「PNAS 82 」,88 〜92,(1985))中で28℃で１晩生育させ
た。細胞をMEB 培地中で希釈し、そして予熱(65 ℃) し
たMEB 培地と等量加えて温度を42℃に平衡とした時にOD
₆₀₀ が1.0 となるまで28℃で生育させた。42℃で４時間
更に生育させた後に、細胞を採取し、そして洗浄細胞
（−70℃にて凍結後に解凍した後に) を20％しょ糖、30
mMトリス-HCl（pH8.1)および mg／mlリゾチ−ム溶液
の200 μ中に再けん濁させ更に3M EDTA（pH7.3)の３ml
を加えることにより、膜および可溶たん白画分を作成し
た。細胞抽出物は簡単な音波処理により清澄にし、そし
て膜および不溶たん白分は遠心分離(27,000xg,60分間)
によりペレット化した。上ずみ液にトリクロル酢酸(10%
w/v)を加えることにより可溶たん白分を沈でんさせ、こ
のペレットを水中に溶解した。ペレット化した膜も同様
に水中に溶解した。未誘発(28 ℃) のおよび誘発処理(4
2 ℃) した細胞の両方のこれら画分のサンプルをSDS-ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動およびヒト胎盤禁止剤に
対する抗血清を使用してのウエスタン転移によるミンア
クチビンの免疫的検出により分析した。図２７に示す様
に、ヒト胎盤禁止剤に対する抗体およびアルカリホスフ
ァタ−ゼ(Sigma) と結合したウサギ抗ヤギIgG を使用し
てのウエスタン転移により可視化されたミンアクチビン
たん白バンド( Mr 40〜50K)が、誘発処理した（42℃）
可溶画分および膜画分の両方に存在している。在来ミン
アクチビンを作成する別法を図２６に示した。プラスミ
ドpBTA442 を xhoIIで消化し、そして243bp xhoII制限
断片をアガロ−スゲルから精製した。この断片をT4リガ
−ゼで、Bgl IIで消化したベクタ−pLK58 にライゲ−シ
ョンした。この誘導体プラスミドpBTA445 をPvu IIおよ
びSma Ｉで消化し、そして2800bp断片を精製し、そして
T4リガ−ゼでpBTA438 からの精製1320bp PvuII-DraＩ制
限断片にライゲ−ションした。この誘導体プラスミドpB
TA446 をBgl IIで線状開裂し、そして細菌リボゾ−ム結
合部位と在来ミンアクチビン遺伝子の開始ヌクレオチド
を含有する合成２本鎖26量体オリゴヌクレオチドとライ
ゲ−ションしてプラスミドpBTA447 を創製した。pBTA44
7 を前記の様にして適当な宿主、例えばN4830 中へ形質
転換し、誘発処理しそして分析すると、図２７に示す様
に再度ミンアクチビンが生成されている。それぞれpBTA
444 およびpBTA447 を含有する細胞の両方の場合に、ミ
ンアクチビンは誘発処理した（42℃）可溶性画分および
膜画分の両方に存在していた。 【００４１】E.コリN4830 により産生されたミンアクチ
ビンの生物学的活性を評価するために、可溶生画分およ
び膜画分を、実施例４の記載の様にして、高分子量形お
よび低分子量形のウロキナ−ゼを使用して90分間培養し
た。次いでサンプルをアセントで沈で んさせ、水中に
再けん濁し、そして還元SDS-ポリアクリルアミドゲル上
で処理した。ミンアクチビンおよびミンアクチビン−ウ
ロキナ−ゼ複合体を前記した様なウエスタン転移により
可視化した。図２７に示す様に、標準分析条件下におい
て、ウロキナ−ゼとのpBTA447 複合体を含有する誘発E.
コリN4830 からの可溶画分中にミンアクチビンが存在し
ている。この事はこれらの細菌細胞から生成したミンア
クチビンが生物学的活性を保有していることを意味する
ものである。 【００４２】一方のたん白質コ−ド配列の全部又は１部
とミンアクチビンコ−ド配列の全部又は１部との融合た
ん白質を製造する方法の２つの例を次に記載する。図２
９に示す様に、プラスミドpBTA440 をSspIおよびDraIで
消化し、そして1110bp断片をアガロ−スゲルから単離し
た。この断片を、EcoRV で消化したベクタ−pBTA449に
ライゲ−ションしてpBTA450 を創製した。次いで pBTA
450 をAvaIで消化し、そして精製した2800bp断片を、Av
aIで消化したプラスミドpLK57 にライゲ−ションしてプ
ラスミドpBTA586 を創製した。これはλP_L プロモ−タ
−の制御下にミンアクチビンコ−ド配列の部分と成るも
のであり、そしてtraT遺伝子の最初の80個のアミノ酸コ
−ド配列と融合する。その80個のアミノ酸の内の最初の
20個はE.コリの外膜中に表われる融合体となるシグナル
配列を構成している。このシグナル配列はtraTたん白質
の通常の存在位置である外膜への輸送中に開裂する。 【００４３】上記した様にプラスミドpBTA586 を適当な
宿主、例えばN4830 中に形質転換しそして温度シフトに
より誘発処理をすると、TraT−ミンアクチビン融合たん
白質が、図３０に示した様に外膜に表われる。融合体製
造法の第２の例は図２８に示した。プラスミドpBTA440
中において、ミンアクチビンコ−ド配列は、プラスミド
pUC18 上に存在するβ−ガラクトシダ−ゼ遺伝子の部
分と枠内融合する。 【００４４】プラスミドpBTA440 を適当な宿主、例えば
JM101 、叉はlacI^q 遺伝子を含有するE.コリ株中に形質
転換し、そしてイソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（最終濃度１mM）の添加により誘発処理する
と、前記した様にしてミンアクチビン産生が検出できる
（図３０）。実施例10 真核細胞中における組換えミンアクチビンの発現 ミンアクチビンの全コ−ド領域を含有するpBTA438 の断
片を、哺乳動物細胞中において真核遺伝子の安定的な同
化、発現が可能な一連のベクタ−中に挿入した。これら
は、(1)ミンアクチビンcDNA配列がSV40初期プロモ−タ
−の制御下にあるpKC3(pKO- neo 由来、Van Doren,Hana
han,D,およびGluzman,Y,の「J.Virol.」50,606〜614(19
84));(2)ミンアクチビン遺伝子がレトロウイルスのLTR
プロモ−タ−の下流にあり、そして原核生物にカナマイ
シン耐性を付与し、真核生物にG418耐性を付与するネオ
遺伝子に基づいて選択が行なわれる、モロニ−ネズミ白
血病ウイルス由来レトロウイルスシャトル系のpZipNeoS
V(X)1(Cepko,C,L., Roberts,B,E,およびMulligan,R.C.
の「Cell」,37,1053〜1062(1984));および(3)マウス乳
腫瘍ウイルス(MMTV)５′-LTR中に含有されるデキサメタ
ゾン誘発性プロモ−タ−の利用によりミンアクチビンの
規則的発現が達成可能なpMSG(Pharmacia社から市販され
入手可能) である。 【００４５】これら３つのベクタ−の構築を図３１に示
し、尚その詳細は下記の通りである。ミンアクチビン遺
伝子のコ−ド領域を1610bpEcoRI-DraI断片としてpBTA43
8 から単離し、そして下記の様にして下記のベクタ−中
に挿入した。1610bp EcoRI-DraI断片と、EcoRI とSmaI
で消化したpKC3中にライゲ−ションし、そして次いでE.
コリC600γ中に形質転換した。こうして生成したプラス
ミドをpBTA587 と命名した。 【００４６】第２の構築工程において、この1610 bp Ec
oRI-DraI断片を DNA ポリメラ−ゼI のクレノ−断片を
使用して平滑末端化し、pMSGのSmaI部位中にライゲ−シ
ョンし、そして適当なE.コリ K-12宿主中に形質転換し
た。pMSG中のミンアクチビン遺伝子を含有するコロニ−
を、先に実施例７に記載した³²P-標識オリゴヌクレオチ
ド（29量体）（オリゴヌクレオチド310 〜335 に相補性
を有する）を使用してのコロニ−ハイブリダイゼ−ショ
ンにより検出した。こうして出来たプラスミドをpBTA58
8 と命名した。 【００４７】第３の構築工程において、上記の平滑末端
化したEcoRI/DraI断片を、HincIIで消化したpUC7中にラ
イゲ−ションして、pBTA589 と命名したプラスミドを構
築した。pUC7中のHincII部位はBam HI部位の側面にある
ので、これはBam HI消化の後にミンアクチビン遺伝子を
単離させ、そしてpZIPNeo SV(X)1のBan HI部 位中にラ
イゲ−ションさせる作用を奏した。適当なE.コリK-12宿
主中への形質転換の次に、ミンアクチビンを含有するコ
ロニ−を前記した様なコロニ−ハイブリダイゼ−ション
法により検出した。この結果生成したプラスミドをpBTA
590 と命名した。真核細胞のトランスフェクション 全部のプラスミドをりん酸カルシウム法により真核細胞
中にトランスフェクションした。約１〜２×10⁵ 個の細
胞を、T25 フラスコ中で、10％(v/v) ウシ胎児血清、3.
6mM グルタミン、200mM 45IV／mlペニシリンおよび45mg
／mlストレプトマイシンを補填したダルベコ変性イ−グ
ル培地（完全培地）の５ml中に植種した。約１〜５μｇ
のCsCl傾斜精製DNA をりん酸カルシウムで沈でんさせ、
そして細胞に加えた。４時間後に、細胞をグリセリンシ
ョックで処理し、次いで３日間完全培地中で培養した。
次いで培養上ずみ液を過渡発現測定用に取り出した。次
に細胞をトリプシン化して1/3 づつに分けて、適当な選
択抗生物質（下記参照）を含有する完全培地の入ったT7
5 フラスコ中に入れた。この細胞は毎６〜７日間毎に同
じ培地で洗浄し、トランスフェクトした生成物を14〜28
日目に取り出し、そして合流生長となるまで個々に培養
した。 【００４８】各pBTA587 、pBTA588 およびpBTA590 のト
ランスフェクションの条件は下記の通りであった。pBTA587 ：pKC3は適当なマ−カ−を含有していないの
で、 pBTA587 はpZIPNeo SV(X)1と、pBTA587:pZIPNeo
SV(X)1のモル比 7.5:1 の割合で共トランスフェクトし
た。トランスフェクト体を0.4 mg／mlのG418を含有する
完全培地で選択した。トランスフェクションはCOS 細胞
中で行なった。 【００４９】pBTA588 ：pMSGはSV40初期プロモ−タ−か
ら発現したE.コリキサンチン−グアニンホスホリボシル
トランスフェラ−ゼ(gpt) 遺伝子を含有しているので、
ピポキサンチン、アミノプテリンおよびミコフェノ−ル
酸を含有するHAT 培地中で、安定にトランスフェクトし
た細胞を選択した。トランスフェクションはMIH3T3細胞
を使用して行なった。 【００５０】pBTA590 ：トランスフェクト体は0.4 mg／
mlのG418を含有する完全培地を使用して選択した。トラ
ンスフェクションは MIH3T3細胞中で行なった。真核細胞中の組換えミンアクチビンの発現の分析 トランスフェクションの後に、細胞を³⁵S-メチオニンの
存在下に培養しそして、主として実施例4bに記載の方法
に従って胎盤禁止剤に対する抗体を使用してその放射線
標識したミンアクチビン組換体を特異的に免疫沈降させ
ることによって、ミンアクチビン組換体の過渡発現を検
出する。例えば、pBTA587 のCOS 細胞中へのトランスフ
ェクション後48時間してから、上ずみ液を除き、そして
細胞を、³⁵S-メチオニン(Amersham)を添加して、但し通
常のメチオニンを含有しないEMEM(Flow)の１mlの存在下
に培養した。これを50μg のヤギ抗胎盤禁止剤抗体と20
0μｌの洗浄パンソルビンで免疫沈降させた後、複合体
をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元条件）に
より分析し、そして図３２に示す様にオ−トラジオグラ
フィ−により可視化した。組換えミンアクチビンはMr 4
5,000 〜48,000のバンドとして検出されるが、ベクタ−
(pKC3)だけを含有する相当するコントロ−ルトランスフ
ェクション体においてこれは検出されない。免疫沈降の
前に上ずみ液にウロキナ−ゼ(15 プロ−単位、Calbioch
em) を加えると、このバンドは消失し、これは生物活性
ミンアクチビンに特有のものである。ミンアクチビン
ウロキナ−ゼ複合体を表わすバンドがMr 69,000 に観察
されるが、これは同位置の非特異的たん白バンドにより
幾分不明瞭となっている。又、ある種の組換えミンアク
チビンはウロキナ−ゼ製剤の添加後にたん白分解により
分解したと考えられる。尚これはMr 35,000 〜37,000バ
ンドの検出により明らかにされていることである。 【００５１】生成した組換えミンアクチビンが生物学的
に活性であるということは、細胞を４時間血清不在下に
培養し、そして実質的に実施例11に記載の様にして比色
分析することによりウロキナ−ゼ活性の阻害程度を定量
することにより決定された。この際阻害程度レベルを検
出し、これは背景上の約１単位／mlのミンアクチビン活
性に相当するものであった。 【００５２】ミンアクチビン遺伝子を含有するトランス
フェクト体も又、実施例６の記載の様にして、又はBake
r の方法に従って作成した放射線標識ウロキナ−ゼを使
用してミンアクチビン活性を分析することが出来る。組
換えミンアクチビンとウロキナ−ゼとの間に複合体を生
成する様に、培養上ずみ液を放射線標識ウロキナ−ゼと
共に培養する。次いでこの複合体を、ウロキナ−ゼに対
して作成したウサギ抗体（ミドリ十字社）の添加により
溶液から分離し、そして洗浄パンソルビン又は免疫ピ−
ズに共有結合した抗ウサギ抗体(Biorad)の添加により沈
でんさせる。遠心分離後、ミンアクチビン−ウロキナ−
ゼ−抗体ペレットを洗浄し、２％SDS での沸とうにより
細砕し、そして生成物をゲル電気泳動、次いでオ−トラ
ジオグラフィ−により分析した。トランスフェクトした
細胞により生成した生物活性組換えミンアクチビンの存
在は、ウロキナ−ゼの分子量のMr 55,000 （又は33,00
0)からミンアクチビン−ウロキナ−ゼ複合体の生成に特
有な、より高いMr（69,000〜92,000) へのシフトにより
立証されている。 【００５３】実施例11 生物活性たん白質の精製および回収 E.コリ中で高レベルでミンアクチビンを発現する条件を
確立したら、次に、ミンアクチビン遺伝子をコ−ドする
プラスミドを有する細胞を遅くとも対数期に採取する。
パックした細胞の１体積を、２体積のリ−シス緩衝液
（1mM EDTAおよび1mM ふっ化フェニルメチルスルホニル
を含有した0.1Mりん酸ナトリウム（pH7.0)) 中にけん濁
させ、そして15,000psi でフレンチプレスの中を３回通
過させることにより細胞溶解させる。このけん濁液を2
3,000xgで20分間遠心分離し、そしてペレットを５％ト
リトンX-100 を含有するリ−シス緩衝液の２体積倍中に
再けん濁させる。このけん濁液を再度23,000xgで20分間
遠心分離し、そしてペレットを8M尿素および0.1MDTT を
含有する0.1Mトリス-HCl（pH8.0)の３体積倍中にけん濁
させる。溶液を窒素でフラッシングし、そして密封管中
で37℃で２時間培養する。培養後に、溶液のpHを、該溶
液の各１mlにつき50μｌの氷酢酸を加えて約pH3.5 に低
下させる。このけん濁液を上記した様な遠心分離によっ
て清澄にし、そして上ずみ液を0.1M酢酸で平衡化したセ
ファデックスG-75カラム(3.2cm×90cm) 中に装中する。
ミンアクチビンを含有する画分はSDS-PAGEにより所在確
認する。ミンアクチビンを含有する画分を集めそして8M
尿素および0.1mM DTT を含有する10mMトリス-HCl（pH8.
0)に対して、室温で16時間透析する。次いで透析溶液と
前記の緩衝液で平衡化したDEAE−セファデックスカラム
(2.2cm×25cm) 中に装入し、そしてカラムを洗浄して未
結合物質を溶出する。次いで、同緩衝液中の０〜0.5Mの
塩化ナトリウムの線状傾斜を使用してカラムからミンア
クチビンを溶出する。ミンアクチビンを含有する画分は
SDS-PAGEにより同定し、そして広範囲にわたって蒸留水
に対して透析する。この工程中に沈でんしたたん白質を
凍結乾燥により回収する。この凍結乾燥したたん白質を
0.1%トリフルオロ酢酸中に再溶解し、そしてウォ−タ−
ズ社の高速クロマトグラフィ−にとり付けたヴィダック
C-4 逆相カラム中に装入する。 0.1%トリフルオロ酢酸
中の０〜80％おアセトニトリルの線状傾斜を使用して、
このカラムから純粋なミンアクチビンを溶出する。ミン
アクチビンに相当するA₂₂₀ピ−クをSDS-PAGEにより同定
し、その画分を集めて凍結乾燥する。 【００５４】凍結乾燥し精製したミンアクチビンを8M尿
素を含有する0.1Mトリス-HCl（pH8.0)中に、10mg／mlの
濃度で溶解させ、そして１mM還元グルタチオンおよび0.
1mM酸化グルタチオンを含有する0.1Mトリス-HCl（pH8.
0)中で10μg/mlに希釈する。再反応を室温で24時間行な
い、次いで溶液を濃縮し、そしてYM10膜を使用してアミ
コン撹拌細胞上で0.1Mりん酸ナトリウム（pH7.0)に対し
て透析ろ過する。活性ミンアクチビンを含有する得られ
た溶液を、前記した分析法( 実施例１）を使用して分析
する。 【００５５】哺乳動物細胞から高レベルで分泌した生物
活性ミンアクチビンの回収には、実施例２に記載したU9
37細胞からの在来ミンアクチビンの精製と同様の方法を
利用すれば良い。この方法ではまず最初に、30,000ダル
トン分離カ−トリッジを備えたアミコンDC-2中空繊維濃
縮装置を使用して細胞を含有しない上ずみ液を10倍に濃
縮する。次いでこの濃縮物を、少なくとも等体積の50mM
グリシン（pH7.8)に対して透析して全痕跡量の色素を除
去する。この透析濃縮物を8,000rpmで30分間、４℃でJA
10ロ−タ−中で遠心分離して、残留細胞細砕物と透析中
に沈でんすることのあるたん白質とをペレット化する。
次いで清澄となった上ずみ液をアリクホットに分けこれ
を次の精製工程で使用するまで−20℃に凍結しておく。 【００５６】下記の様にしてフェニル−セファロ−スを
使用したpH段階溶離により、10倍濃縮培養上ずみ液から
ミンアクチビンを更に精製する。上ずみ液のイオン強度
を固体NaClの添加により2Mに調節し、そしてpH値をくえ
ん酸で5.5 に調節する。この溶液を、50mMくえん酸ナト
リウム（pH5.5)、2M NaCl および1M EDTA で平衡化した
フェニル−セファロ−スカラム(4.4cm×5.0 cm)に装入
し、そして280nm(A280) における基線吸光度が基線にも
どるまで同じ緩衝液で溶出する。次にミンアクチビンを
50mMグリシン（pH9.0)でカラムから溶出する。最高特異
活性ミンアクチビンを含有する画分を集め、アミコンYM
10膜上で濃縮する。 【００５７】こうして集めて濃縮したミンアクチビンを
次いで0.1Mほう酸ナトリウム（pH9.0)で平衡化したセフ
ァクリルS-200 の2.2 cm×78cmカラム中に装入する。5.
0 mlの画分を流速0.46ml／分で集める。ミンアクチビン
活性を有する画分を集め、そしてYM10膜を使用して３ml
にまで濃縮する。公知のMr標準体でのこのカラムの検量
によれば、ミンアクチビンが45〜48KDのMrを有している
ことが明らかである。 【００５８】濃縮ミンアクチビン溶液を、pH値範囲4.5
〜6.0 のアムフォリン含有ウルトロデックスの予備平床
ゲルに装填し、LKB マルチホ−ル等電点電気泳動装置上
で23時間10℃で電気集光する。この操作の終了後に、ゲ
ルの長さ方向を横断する30ゾ−ンをかき出して、そして
１mM EDTA （pH9.0)を含有する1Mグリシン10mlを使用し
てそれぞれからたん白質を溶離する。各画分のアリクオ
ットをミンアクチビン活性について分析し、15％SDS-ポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動してたん白質を確認
する。これらの状況から、ミンアクチビンはpH５〜pH5.
2 の間で集光して著しく精製される。この物質を再度ア
ミコンYM10膜上で濃縮し、そして1mM EDTAおよび50％グ
リセリン含有の50mMグリシン（pH 9.0)中に−20℃で保
存する。 産業上の利用可能性 ウロキナ−ゼ型プラスミノ−ゲン賦活剤の特異的失活剤
として、ミンアクチビンは色々なヒトの癌や炎症状態の
診断や可能な処置のための臨床用薬剤としての有効な産
業上の利用可能性の範囲を有するものである。 【００５９】腫瘍ウイルスによる生体外の細胞形質転換
の研究(Ossowski 等の「J.Exp.med.」,137,112,1973)お
よび化学発癌物質による当該研究（Sisskin 等の「Int.
J.Cancer」,26,331,1980) によれば、プラスミノ−ゲン
賦活剤分泌は形質転換に関連した量も首尾一貫した初期
の生化学現象であるとされている。更に又、生体内で転
移する細胞系の能力は、プラスミノ−ゲンを発現するそ
れらの能力と関連していることが見出された(Wang 等の
「Cancer Research 」,40,288,1980) 。又、最も一般
的なヒトの癌、例えば肺癌、乳癌、前立腺癌および結腸
癌のいくつかの腫瘍細胞は高レベルのウロキナ−ゼ形プ
ラスミノ−ゲン賦活剤を産生することは良く知られたと
ころである(Duffy,M.T. およびO ′Grady,P.の「Eur.J.
Clin.Oncol. 」,20(5),577〜582, (1984)。 【００６０】本発明者らによる、結腸粘膜における悪性
腫瘍や悪性腫瘍となる徴候状態、例えば腺腫様ポリ−
プ、結腸ポリ−プおよびクロ−ン病や潰瘍性大結腸炎の
様な結腸の炎症状態に関するこれまでの研究(Stephens,
R.S.等。「Blood 」,66,333〜337,1985) によれば、ヒ
ト結腸癌は、隣接する平常組織に比べて著しく大量のウ
ロキナ−ゼ形プラスミノ−ゲン賦活剤を生成することが
わかった。そして又、ミンアクチビンはこの腫瘍関連プ
ラスミノ−ゲン賦活剤と結合しこれを阻害する作用のあ
ることが見出された(Stephens 等の「Blood 」,66,333
〜337,1985) 。この様に、これら従来の研究は、ミンア
クチビンが生体内的にも又組織学的検体用にも腫瘍の同
定と確認のための反応剤として産業上利用可能であるこ
とを裏付けようというものである。生体内で腫瘍を造影
するには、ミンアクチビンを適当な放射性同位体、例え
ばテクネチウム-99m(Richardson,V.J.の「Brit,J. Ca
ncer」,40,35,1979)又はよう素-131(Begent,R.H.の「J.
Lan-cet.」,1982 年10月２日）で標識すれば良い。ミン
アクチビン製剤を投与した後に、腫瘍の位置と境界を公
知の放射性同位体法、例えばガンマ線カメラ造影法によ
り測定することが出来る。このようにミンアクチビン
は、特に外科的要因に起因する様な小さな転移癌の同定
が出来る様な高感度な方法可能とするものである。組織
化学用検体の分析において、ミンアクチビン又はその抗
体はI¹³¹の様な同位体で標識するか、又は適当な酵素又
は他の化学反応剤と接合することが出来る。組織学用検
体、例えばバイオプシ−片を接触させると、ミンアクチ
ビンは腫瘍型プラスミノ−ゲン賦活剤とその分泌部位に
おいて結合し、これにより腫瘍境界および潜在的な腫瘍
の転移状態を同定し得るものと考えられる。その診断用
途に加えて、ミンアクチビンは又腫瘍の直接処置の用途
としても利用可能である。腫瘍が周囲組織を侵襲するプ
ロセスに関与する酵素の特異的禁止剤として (Dano,K.
等の「Adu,in CancerRes.」,44,139,1985) 、腫瘍生長
および転移を規制し、そして特にそれらを禁止すること
が出来る。更に又、ミンアクチビンはレクチン又はトキ
シンを直接に生長している腫瘍に送り届ける、薬剤デリ
バリ−系としても使用することが出来る。このデリバリ
−系は、特異的なそして特に効果的な抗腫瘍能を有する
ものとして多大な利益をもたらすものであるということ
が理解出来よう。 【００６１】ウロキナ−ゼ型プラスミノ−ゲン賦活剤の
関与する他の生物学的プロセスとしては、例えばリウマ
チ性関節炎の様な慢性炎症状態の様な、侵襲および組織
破壊に関連した生理学的現象がある。ミンアクチビンは
組織破壊に対する自然宿主応答の１部であるので、特に
処方通りの治療を行っている間の病気の状態を観察（モ
ニタリング）するためのマ−カ−として有用であると考
えられる。標識抗体やミンアクチビン由来のDNA プロ−
ブは、病気の状態と関連して血しょう中の又は組織バイ
オプシ−のマクロファ−ジ中の又は滑液中のミンアクチ
ビンレベルをモニタリングする診断剤として産業上の利
用可能性を有している。同様に、ミンアクチビン自身も
又病気の状態を回復するために生体内に投与した時に治
療効果を有するものであることが確認されている。

【図面の簡単な説明】 【図１】ミンアクチビン活性をプロットした図であっ
て、ミンアクチビン分泌におけるPMA の作用を示すもの
である。 【図２】サイズ分画したミンアクチビンmRNA調製品のゲ
ル分析である。 【図３】18S rRNA標準体の周囲に集中した画分中のミン
アクチビンmRNAを示すサイズ分画されたmRNAの生体外翻
訳の後に免疫沈降した生成物のオ−トラジオグラフィ−
を表わす。 【図４】抗ウロキナ−ゼ抗体を使用してのウロキナ−ゼ
との複合体形成の特異性を示す免疫沈降翻訳生成物のオ
−トラジオグラフィ−を表わす。 【図５】抗胎盤禁止剤抗体を使用してのウロキナ−ゼと
の複合体形成の特異性を示す免疫沈降翻訳生成物のオ−
トラジオグラフィ−を表わす。（オ−トラジオグラム
は、抗胎盤禁止剤抗体を使用した場合の結果と、抗ウロ
キナ−ゼ抗体を使用した場合の結果とが同じであること
を示している。 【図６】還元条件下でのウロキナ−ゼの存在又は不在下
における免疫沈降生成物の比較によってミンアクチビン
翻訳生成物を固定するオ−トラジオグラフィ−を表わ
す。 【図７】フイブリン被覆技術を使用してのウロキナ−ゼ
種の識別を示すゲルを表わす。 【図８】全たん白溶出物に関して、富化ミンアクチビン
活性体の溶出を示すセファクリルS-200 クロマトグラム
である。 【図９】溶離条件を変化させた場合のフェニル−ボロネ
−トアガロ−スからのミンアクチビン活性の別々の溶出
状態を示すものである。 【図１０】溶離pHの関数としての着色集光カラムから溶
出した全たん白質に関するミンアクチビン活性体の溶出
を示すクロマトグラムである。 【図１１】たん白質含有量対ミンアクチビン活性を示
す、等電点電気泳動ゲルから単離したたん白画分のゲル
上のミンアクチビン活性のス−パ−インポジションを表
わすものである。 【図１２】ミンアクチビン活性溶出を示す、免疫アフィ
ニティカラムの溶出プロフィ−ルである。 【図１３】免疫アフィニティカラムから溶出したミンア
クチビンのSDS-PAGEゲルおよびこのゲルのウエスタンブ
ロットを表わす。 【図１４】高分子量形および低分子量形および還元条件
下の高分子量形の解離を表わすSDS-PAGE上のI¹²⁵−標識
ウロキナ−ゼのオ−トラジオグラフである。 【図１５】フェニル−セファロ−スカラムの段階pH溶離
からのミンアクチビン活性およびたん白質の溶出プロフ
ィルを示すものであり、ここでＡは50mMくえん酸ナトリ
ウム、1mM EDTAおよび0.5M塩化ナトリウムでの溶離を、
そしてＢは50mMグリシン(pH9.0) での溶離を表わす。 【図１６】たん白質含量対ミンアクチビン活性を示す、
等電点電気泳動ゲルから単離したたん白画分のSDS-PAGE
ゲル上のミンアクチビン活性のス−パ−インポジション
を表わすものである。 【図１７】たん白質のニトロセルロ−ス上へのウエスタ
ン転移後の第15図の等電点電気泳動実験からの画分およ
び抗胎盤禁止剤抗体でのたん白質の免疫学的検出を示す
ものである。 【図１８】ヴィダックC-4 逆相高速液体クロマトグラフ
ィ−操作からの高度に精製したミンアクチビン製剤の溶
出プロフィルを示すものである。 【図１９】図１８のHPLC操作のピ−ク５から得た均質ミ
ンアクチビンのSDS-PAGEを示すものである。 【図２０】シンクロパックRP-P(C-8) カラム高速クロマ
トグラフィ−操作から溶出したミンアクチビンのペプチ
ドの溶出プロフィルである。 【図２１】ミンアクチビン遺伝子の分節を含有するクロ
−ンのエンドヌクレア−ゼ制限地図およびDNA 配列決定
法を示すものである。 【図２２】ミンアクチビンmRNAのハイブリッド選択翻訳
を示す。 【図２３】連続したミンアクチビン遺伝子を含有するプ
ラスミドpBTA438 の構築を示すものである。 【図２４】図２５とあわせてなるミンアクチビン遺伝子
の全cDNAおよびミンアクチビンたん白の演繹したアミノ
酸配列の一部を示す。ここにアミノ酸配列分析から得ら
れた３個のペプチドに下線を付した。 【図２５】図２４の続きでミンアクチビン遺伝子の全cD
NAおよびミンアクチビンたん白の演繹したアミノ酸配列
の残部を示す。ここにアミノ酸配列分析から得られた２
個のペプチドに下線を付した。 【図２６】ミンアクチビン発現ベクタ−pBTA444およびp
BTA447 の構築を示すものである。 【図２７】pBTA447 から発現したミンアクチビンのSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ウエスタン分析およ
びS³⁵ パルス標識たん白質分析を示すものである。 【図２８】ハイブリッドたん白発現ベクタ−pBTA440 の
構築を示すものである。 【図２９】ハイブリッドたん白発現ベクタ−pBTA586 の
構築を示すものである。 【図３０】pBTA440 およびpBTA586 から発現したハイブ
リッドミンアクチビンたん白質のSDS ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、ウエスタン分析およびS³⁵ パルス標識
たん白質分析を示すものである。 【図３１】ミンアクチビン遺伝子を含有する哺乳動物の
クロ−ニングベクタ−pBTA587 、pBTA588 およびpBTA59
0 の構築を示すものである。 【図３２】ウロキナ−ゼの存在下又は不在下での免疫沈
降後の哺乳動物細胞中のミンアクチビンの発現を示すオ
−トラジオグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/53 33/58 Ａ 33/577 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/58 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アンタリス，トニー・マリー オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2047、ドラムモイン、ヘンリ ー・ストリート 48 (72)発明者 バーネス，ミッシェル・トーマス オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2031、レイン・クーヴ、ムー ニー・ストリート 20 (72)発明者 クラーク，ミッシェル・アリソン オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2065、グリーンウイッチ、キ ング・ウイリアム・ストリート 15 (72)発明者 デヴィン，ピーター・レオナード オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2111、グラーズヴィル、オス ガソープ・ロード 54 (72)発明者 ゴス，ネイル・ハワード オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2076、ワールーンガ、キャン ベル・ドライブ 118 (72)発明者 レアーバック，フィリップ・ラルフ オーストラリア国 ニユー・サウス・ウ エールズ 2076、ワールーンガ、フィオ ナ・アヴェニュー ５

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．下記アミノ酸配列からなる単一な精製されたミンア
   クチビン。 Met Glu Asp Leu Cys Val Ala Asn Thr Leu Phe Ala Leu Asn Leu Phe Lys His Leu Ala Lys Ala Ser Pro Thr Gln Asn Leu Phe Leu Ser Pro Trp Ser Ile Ser Ser Thr Met Ala Met Val Tyr Met Gly Ser Arg Gly Ser Thr Glu Asp Gln Met Ala Lys Val Leu Gln Phe Asn Glu Val Gly Ala Asn Ala Val Thr Pro Met Thr Pro Glu Asn Phe Thr Ser Cys Gly Phe Met Gln Gln Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Pro Asp Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Ala Asp Lys Ile His Ser Ser Phe Arg Ser Leu Ser Ser Ala Ile Asn Ala Ser Thr Gly Asn Tyr Leu Leu Glu Ser Val Asn Lys Leu Phe Gly Glu Lys Ser Ala Ser Phe Arg Glu Glu Tyr Ilu Arg Leu Cys Gln Lys Tyr Tyr Ser Ser Glu Pro Gln Ala Val Asp Phe Leu Glu Cys Ala Glu Glu Ala Arg Lys Lys Ilu Asn Ser Trp Val Lys Thr Gln Thr Lys Gly Lys Ile Pro Asn Leu Leu Pro Glu Gly Ser Val Asp Gly Asp Thr Arg Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Thr Pro Phe Glu Lys Lys Leu Asn Gly Leu Tyr Pro Phe Arg Val Asn Ser Ala Gln Arg Thr Pro Val Gln Met Met Tyr Leu Arg Glu Lys Leu Asn Ile Gly Tyr Ile Glu Asp Leu Lys Ala Gln Ile Leu Glu Leu Pro Tyr Ala Gly Asp Val Ser Met Phe Leu Leu Leu Pro Asp Glu Ile Ala Asp Val Ser Thr Gly Leu Gln Leu Leu Glu Ser Glu Ile Thr Tyr Asp Lys Leu Asn Lys Trp Thr Ser Lys Asp Lys Met Ala Glu Asp Glu Val Glu Val Tyr Ile Pro Gln Phe Lys Leu Glu Glu His Tyr Glu Leu Arg Ser Ile Leu Arg Ser Met Gly Met Glu Asp Ala Phe Asn Lys Gly Arg Ala Asn Phe Ser Gly Met Ser Glu Arg Asn Asp Leu Phe Leu Ser Glu Val Phe His Gln Ala Met Val Asp Val Asn Glu Glu Gly Thr Glu Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Val Met Thr Gly Arg Thr Gly His Gly Gly Pro Gln Phe Val Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Leo Ile Met His Lys Ile Thr Asn Cys Ile Leu Phe Phe Gly Arg Phe Ser Ser Pro