DE3751646T2

DE3751646T2 - Rekombinantes Produkt

Info

Publication number: DE3751646T2
Application number: DE3751646T
Authority: DE
Inventors: Toni Marie Antails; Thomas Michael Barnes; Michelle Alison Clark; Peter Leonard Devine; Neil Howard Goss; Philip Ralph Lehrbach
Original assignee: Australian National University; Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Australian National University; Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1986-03-13
Filing date: 1987-03-13
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2007-03-14
Also published as: JPH08112094A; NZ219608A; KR960001820B1; NO178504B; EP0238275B1; EP0238275A3; CN1100957A; DE3751646D1; IL81879A; NO178504C; DK172400B1; US5426044A; JP2589996B2; CN87102725A; ATE132192T1; NO874704L; KR880701073A; WO1987005628A1; DK595187A; NO874704D0

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen menschlichen Proteins, Minactivin, mit Gentechnologie, die Charakterisierung der DNA-Seguenz des Gens und die Expression und Reinigung großer Mengen von biologisch aktivem Minactivin aus einem rekombinanten Wirt. Sie betrifft auch die Reinigung von biologisch aktivem nativem Minactivin, ebenso wie von Peptiden, die von Minactivin abgeleitet sind und deren Aminosäuresequenzen.

Stand der Technik

Minactivin (PAI-2) ist ein natürlich vorkommender Inaktivator von urokinaseartigen Plasminogen-Aktivatoren. Diese Art von Plasminogen-Aktivator findet sich in abnorm hohen Anteilen bei vielen menschlichen Carcinomen, insbesondere der Lunge, des Darms, der Brust und der Prostata. Plasminogen-Aktivatoren sind Serinproteasen, von denen angenommen wird, daß sie die proteolytische Kaskade, die an der zellulären Translokation, Wanderung und Invasion beteiligt ist, vermitteln. Sie scheinen daher mit der Gewebezerstörung und dem Wiederaufbau von Gewebe verbunden zu sein und sind am Tumorwachstum und der Metastasenbildung beteiligt. Sie spielen auch eine Rolle bei entzündlichen Reaktionen.
Es wurde allgemein gefunden, daß es zwei Arten von Plasminogen-Aktivatoren gibt: 1. urokinaseartige und 2. den Gewebetyp. Der Plasminogen-Aktivator des Gewebetyps wird hauptsächlich im Blut und Blutgefäßwänden gefunden und ist dort verantwortlich für die Aktivierung des fibrinolytischen Abwehrsystems gegen Thrombosen. Urokinaseartige Plasminogen-Aktivatoren scheinen keine Rolle bei normalen thrombolytischen Prozessen zu spielen, sind aber an solchen pathologischen Ereignissen beteiligt, die mit der Invasion und Gewebezerstörung verbunden sind, insbesondere mit Tumor-Metastasen-Bildung und entzündlichen Reaktionen.
Verschiedene Inhibitoren, die spezifisch für Plasminogen-Aktivatoren sind, wurden beschrieben, die einen einschließen, der aus Plazenta isoliert wurde (Holmberg, L. Biochim. Biophys. Acta 544, 128-137 (1978)) und einen anderen (PAI-1), der in kultivierten Gefäßendothelzellen erzeugt wird (J.A. Van Mourik, D.A. Lawrence, D.J. Loskutoff, J. Biol. Chem. 259, 14914-14921 (1984)). Es wurde gefunden, daß Minactivin von Blutmonozyten und U937-Zellen erzeugt wird und immunologisch mit dem Plazenta-Inhibitor verwandt zu sein scheint. Die Beziehung zwischen den verschiedenen Inhibitoren ist bisher unbekannt.
Wie im Fall der meisten anderen wirksamen biologisch aktiven Proteine wird Minactivin in vivo in sehr geringen Mengen erzeugt und ist daher schwierig zu reinigen und zu charakterisieren mit üblichen biochemischen Ansätzen. Da große Mengen von gereinigtem Minactivin für die weitere Auswertung seiner Eigenschaften und biologischen Wirksamkeit in klinischen Anwendungen notwendig sind, ist es daher wünschenswert, das Protein unter Verwendung der Gentechnologie herzustellen; d.h. durch Klonieren des Minactivin-Gens in einem Wechsel- Wirt, z.B. Bakterien- oder Tierzellen. Um Minactivin zu klonieren ist es wünschenswert, die kleinen Mengen von natürlich vorkommendem Minactivin, die so gereinigt werden können, bis zur Homogenität zu reinigen, um Antikörper, Aminosäure-Sequenzen, Peptidfragmente und synthetische oligonucleotide, die von dem gereinigten Minactivin abgeleitet sind, herzustellen. Diese Reagenzien werden für Klonierungs-Strategien verwendet.

Abkürzungen

HPLC - Hochdruckflüssig-Chromatographie
Mr - relative Molekülmasse
MW - Molekulargewicht
PMA - 4-Phorbol-12-myristat-13-acetat
SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacralamidgel- Elektrophorese
TFA - Trifluoressigsäure
HPA - menschlicher Plasminogen-Aktivator
bp - Basenpaare
kb - Kilobasenpaare
PU - Ploug-Einheit

Beschreibung der Erfindung

In einer ersten Ausführungsform liefert die Erfindung eine DNA-Sequenz, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, eine DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA-sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einzelne oder mehrfache Basen-Substitutionen, - Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz verwandt ist oder eine hybridisierende Sequenz oder eine DNA-Sequenz, die bei der Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische Rolle spielt oder eine ähnliche biologische Aktivität wie Minactivin hat, umfaßt.
Eine erfindungsgemäße bevorzugte DNA-Sequenz und Fragmente und Derivate davon, kodieren ein Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Minactivin aufweist.
Solche DNA-Sequenzen können z.B. aus Säugetierzellen herge stellt werden, indem die gesamte DNA daraus extrahiert wird und die Sequenzen mit Standardtechniken zur Herstellung von rekombinanten Molekülen isoliert werden.
Im Schutzbereich der Erfindung liegt auch ein Verfahren zur Selektion einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid kodiert, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Minactivin aufweist, aus einer Gruppe von DNA-Sequenzen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man bestimmt, welche der DNA-Sequenzen mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, von der bekannt ist, daß sie ein Polypeptid mit dieser Aktivität kodiert.
Die ausgewählte Sequenz kann z.B. aus natürlichen Quellen, von synthetischen DNA-Sequenzen, von DNA-Sequenzen aus rekombinanten DNA-Molekülen und DNA-Sequenzen, die eine Kombination davon sind, stammen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung einer cDNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen von Minactivin dient, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man Zellen dazu stimuliert, Minactivin zu erzeugen; RNA aus diesen stimulierten Zellen erhält; mRNA daraus isoliert und die cDNA von der mRNA produziert. Bevorzugt sind die Zellen U937-Zellen.
Das bevorzugtere Verfahren der molekularen Klonierung von cDNA für Minactivin und die Expression des Proteins in einem rekombinanten Wirt schließen die folgenden Methoden ein:
1. Induktion einer Zellinie zur stimulierten Minactivin-Produktion und Expression.
2. Isolierung von mRNA aus der geeigneten Zellinie.
3. in vitro-Translation der mRNA und Immunfällung bzw. immunologische Ausfällung des Minactivin-Translationsproduktes durch Komplexbildung mit Urokinase.
4. Fraktionierung der mRNA aus (2) und Identifizierung der Fraktion, die eine Minactivin-Translations-Aktivität enthält.
5. Konstruktion von cDNA-Bibliotheken aus der mRNA von (2) und (4).
6. Klonieren der cDNA-Bibliotheken von (5) in geeigneten Wirten, z.B. E. coli oder dem Bakteriophagen lambda.
7. Identifizierung von Klonen, die das Minactivin-Gen enthalten durch
a) Hybrid-Freisetzungs-Translation unter Anwendung von (3);
b) Hybridisierung mit einer chemisch synthetisierten DNA- Sequenz-Sonde, insbesondere einer Sonde, die eine synthetische Oligonucleotid-Sonde der Erfindung umfaßt;
c) differenzielle Hybridisierung unter Verwendung von markierter cDNA, die aus induzierter und nicht induzierter mRNA synthetisiert wurde;
d) immunologisches Screening von cDNA-Expressions-Bibliotheken unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Minactivin oder andere immunologisch verwandte Moleküle gerichtet sind;
e) Screenen von cDNA-Expressions-Bibliotheken auf biologische Aktivität unter Verwendung von markierter Urokinase oder Urokinase und Antikörpern gegen Urokinase.
8. Verlängerung des klonierten Gens durch Erzeugung von cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von Oligonucleotid- Primern, die aus Teil-Minactivin-Gensequenzen erhalten wurden, insbesondere Oligonucleotid-Sequenzen, die für den Bereich der Erfindung offenbart wurden.
9. Bestimmung der Nucleotidsequenz des Minactivin-Gens.
10. Expression des Minactivin-Gens in E. coli und Renaturierung, um ein biologisch aktives Produkt zu erhalten.
11. Expression eines biologisch aktiven rekombinanten Minactivins durch Klonieren in Wechsel-Wirten, z.B. eukaryotischen Zellen.
12. Reinigung von rekombinantem Minactivin und klinisches Testen der biologischen Eigenschaften.
In einer zweiten Ausführungsform liefert die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine erste DNA-Sequenz enthält, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen von dem gesamten Minactivin, einem Teil, Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, eine DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA- Sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder einer hybridisierenden Sequenz verwandt ist oder eine DNA-Sequenz, die bei der Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle der Erfindung schließen eine Expressions-Kontrollsequenz ein, die operativ mit einer ersten DNA-Sequenz verbunden ist, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Denvaten oder Kombinationen von Minactivin dient, eine DNA- Sequenz, die mit der ersten DNA-Sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder der hybrisierenden Sequenz verwandt ist oder eine DNA-Sequenz, die bei der Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Ein bevorzugtes rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung ist ein Plasmid, das als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen von Minactivin dient.
Ein bevorzugtes Plasmid der Erfindung hat eine erste DNA-Sequenz, die ein Mittel zur Kontrolle der Expression der DNA- Sequenz der Erfindung, die mit der DNA-Sequenz der Erfindung verbunden ist, kodiert.
Die Erfindung liefert auch ein fusioniertes Gen, das einen beweglichen Promotor, eine Translations-Startstelle und ein Gen, das menschliches Minactivin kodiert, umfaßt.
Im Schutzbereich der Erfindung liegt auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man in einen Klonierungsvektor eine erste DNA-Sequenz einführt, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, einer DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA-Sequenz hybridisiert, einer DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basensubstitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder der hybridisierenden Sequenz verwandt ist oder eine DNA- Sequenz, die bei der Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Bevorzugt schließt das Verfahren auch die Stufe ein, daß man eine Expressions-Kontrollsequenz in den Klonierungsvektor einführt.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids, das als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Plasmid mit einer DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für diese Aminosäuresequenzen dient und bevorzugt einer Expressions- Kontrollsequenz vereinigt. Die DNA-Sequenz ist bevorzugt eine cDNA-Sequenz.
In einer dritten Ausführungsform liefert die Erfindung einen Wirt, der mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das eine erste DNA-Sequenz enthält, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, eine DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA- Sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder einer hybridisierenden Sequenz verwandt ist, oder eine DNA-Sequenz, die bei Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Geeignete Wirte schließen Bakterien, Hefen, andere Pilze, Mäuse oder andere tierische Wirte, pflanzliche Wirte, Insektenwirte und andere eukaryotische Wirte, z.B. Säugetier-Zellgewebe, einschließlich menschlichem Zellgewebe ein. Geeignete Bakterien schließen E. coli, Pseudomonasarten und Bacillusarten ein.
Besonders bevorzugt ist ein Mikroorganismus mit der genetischen Information für die Biosynthese von Minactivin.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Transformation eines Wirts ein, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man in einen Wirt ein rekombinantes DNA-Molekül einführt, das eine erste DNA-Sequenz enthält, die eine erste DNA-Sequenz umfaßt, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient, eine DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA- Sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder einer hybridisierenden Sequenz verwandt ist, oder eine DNA-sequenz, die bei Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus mit der genetischen Information für die Biosynthese des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin, wobei das Verfahren umfaßt, daß man einen Mikroorganismus mit einem Plasmid oder anderen Vektor transformiert, der als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin dient.
In einer vierten Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die von gereinigtem Minactivin abgeleitet sind, wobei das Verfahren umfaßt, daß man Minactivin bis zur Homogenität reinigt, dann Aminosäuresequenzen erhält, die einzigartig für Minactivin sind.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt:
a) das Züchten einer Zellinie, die Minaktvin exprimieren kann;
b) Ernten des Überstands;
c) Einengen des Überstands;
d) Dialyse des Überstands, dann Zentrifugation des Kulturüberstands, um restliche Zellbruchstücke und Protein, das während der Dialyse ausgefallen sein kann, zu entfernen;
e) chromatographische und elektrophoretische Fraktionierung des Kulturüberstandes;
f) Einengen der Fraktion, die Minactivin-Aktivität enthält;
g) Analyse der Fraktion, die Minactivin-Aktivität enthält, um die Reinheit zu zeigen;
h) Gewinnung von Aminosäuresequenzen, die einzigartig für Minactivin sind.
In einer bevorzugten Form umfaßt das Verfahren:
a) das Züchten einer Minactivin produzierenden Kultur oder Zellinie;
b) Ernten des Kulturüberstands und Einengen des Kulturüberstands;
c) Dialyse des Kulturüberstands, dann Zentrifugation des Kulturüberstands, um restliche Zellbruchstücke und Protein, das während der Dialyse ausgefallen sein kann, zu entfernen;
d) Fraktionieren des Kulturüberstands mit Ionenaustausch- Chromatographie;
e) Poolen und Einengen der Eluate mit der höchsten Minactivin-spezifischen Aktivität;
f) Fraktionieren der gepoolten, eingeengten Eluate durch Gelfiltrations-Chromatographie;
g) Einengen des Eluats und dann isoelektrische Fokussierung des Eluats;
h) Sondieren der Fraktionen, die von dem isoelektrisch fokussierenden Gel erhalten wurden, mit Antikörpern, die mit Minactivin reagieren, um die Minactivin-Bande zu lokalisieren;
i) Einengen der Fraktion, die Minactivin-Aktivität enthält;
j) weitere Fraktionierung der Fraktion, die Minactivin-Aktivität enthält, durch Verteilungschromatographie und dann Analysieren der gereinigten Fraktion, die Minactivin-Aktivität enthält mit Gelelektrophorese;
k) Verdau des gereinigten Minactivins und Auftrennung der entstehenden Peptide durch Verteilungs-Chromatographie.
In einer bevorzugteren Form wird die menschliche Makrophagen- Zellinie U937 gezüchtet. Bevorzugte Kulturbedingungen schließen das Züchten ohne Serum und/oder in Gegenwart einer ausreichenden Menge einer Substanz oder von Substanzen, die die Urokinase-Produktion hemmen oder die konstitutive Produktion von Minactivin stimulieren, ein. Eine geeignete Substanz für diesen Zweck ist Dexamethason, das bevorzugt in einer Konzentration von 1 µM verwendet wird. Die Kultur kann auch in Gegenwart von PMA gezüchtet werden. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich für PMA in der Kultur ist 1 bis 300 ng/ml, bevorzugter 10 bis 30 ng/ml.
Ein bevorzugtes Volumen für geernteten Kulturüberstand ist 4 bis 5 l. Die Anfangskonzentrationsstufe ist bevorzugt eine Stufe, bei der auf ein Zehntel eingeengt wird. Eine geeignete Vorrichtung für dieses Einengen ist eine Hohlfaser-Dialyse/- Konzentrationseinheit Amicon DC2, die mit einer Patrone mit einem Ausschluß bei 30.000 MW ausgestattet ist.
Die Dialyse von Stufe c) wird bevorzugt mit einem Dialysat, wie 50 mM Glycin, pH 7,8, durchgeführt. Bevorzugter sollte das 50 mM Glycin, pH 7,8, Dialysat in einem Volumen, das mindestens gleich groß ist, wie das Volumen der Probe, die gegen das Dialysat dialysiert wird, verwendet werden.
Die Ionenaustausch-Chromatographie von Stufe d) wird bevorzugt an einer Phenylsepharosesäule durchgeführt, wobei die Elution bevorzugt eine stufenweise pH-Elution ist. Bevorzugter sollte für die stufenweise pH-Elution die Ionenstärke des Überstandes auf 2 M eingestellt werden, insbesondere kann dies durch Zugabe von festem NaCl erfolgen, dann sollte der pH auf 5,5 eingestellt werden, bevorzugt mit Zitronensäure. Ein bevorzugtes Äquilibrierungsmittel für die Phenylsepharosesäule ist eine Lösung von 50 mM Na-Citrat, pH 5,5, 2 M NaCl und 1 mM EDTA. Die Säule kann anfangs mit dem Äquilibrierungspuffer, dann mit 50 mM Na-Citrat, pH 5,5, das 0,5 M NaCl und 1 mM EDTA enthält, und schließlich mit 50 mM Glycin, pH 9,0, eluiert werden.
Das Einengen der Probe von Stufe g) wird bevorzugt mit einer Amicon YM10 Membran durchgeführt, mit einem Endvolumen des Konzentrats von 3 ml. Die isoelektrische Fokussierung wird bevorzugt auf einem präparativen Flachbettgel aus Ultrodex, das Ampholine im pH-Bereich von 4,5 bis 6,0 enthält, durchgeführt. Bevorzugter wird das Gel bei 10ºC 23 Stunden lang auf einer LKB-Multiphor isoelektrisch fokussierenden Vorrichtung elektrofokussiert. Ein bevorzugtes Elutionsmittel für Proteine von dem elektrofokussierenden Gel ist 1 M Glycin, das 1 mM EDTA, pH 9,0, enthält, bevorzugter in einem Volumen von 10 ml. Geeignete Antikörper der Stufe h) schließen Ziege- Anti-Plazentainhibitor-Antikörper ein.
Das Einengen in Stufe i) kann mit einer Amicon YM10 Membran durchgeführt werden.
Die Verteilungs-Chromatographie von Stufe j) ist bevorzugt HPLC, wird bevorzugter an einer Vydac C-4 Reverse-Phase-Säule unter Verwendung eines Hochdruckflüssig-Chromatographen von Waters durchgeführt. Der Elutionsgradient ist bevorzugt Acetonitril in 0,1 % TFA. Die Gelelektrophorese von Stufe j) ist bevorzugt SDS-PAGE.
Der Verdau des gereinigten Minactivins von Stufe k) erfolgt bevorzugt mit Endoproteinase LysC. Geeignete Verdaubedingungen schließen 3 bis 5 µg Minactivin mit 0,1 µg Endoproteinase LysC in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, 5 M Harnstoff in einem Volumen von 50 µl, 8 Stunden lang bei 22ºC ein. Eine geeignete Form der Verteilungs-Chromatographie ist die Reverse-Phase- HPLC, insbesondere unter Anwendung einer Synchropak RP-P(C-8)-Säule mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,1 % TFA.
In einer fünften Ausführungsform liefert die Erfindung Minactivin in im wesentlichen reiner Form. Bevorzugt ist das Minactivin bis zur Homogenität gereinigt.
In einer sechsten Ausführungsform liefert die Erfindung gereinigtes Minactivin, das mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde.
In einer siebenten Ausführungsform liefert die Erfindung Peptide, die von gereinigtem Minactivin abgeleitet sind und Peptide, die eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie diese Peptide aufweisen.
Bevorzugte Peptide der Erfindung schließen Peptide mit den folgenden Sequenzen ein:
AQILELPY-GDV-MFLLLP-E...
GRANFSGMSE-NDLF...
MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y...
LNIGYIEDLK
IPNLLPEG-V
Die Erfindung liefert auch Peptide der Erfindung, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.
In einer achten Ausführungsform liefert die Erfindung ein mikrobiologisch hergestelltes Peptid, das insgesamt oder teilweise die Aminosäuresequenz des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen des Minactivins enthält.
Ein Peptid und Fragmente oder Derivate davon, die eine immunologische oder biologische Aktivität von Minactivin aufweisen, liegen auch im Schutzbereich der Erfindung.
Das bevorzugte Peptid oder Fragmente oder Derivate davon werden von einer DNA-Sequenz kodiert, die mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen von Minactivin dient und die biologische oder immunologische Aktivität von Minactivin aufweist, wobei die Aktivität durch Antiseren gegen Minactivin zerstört wird.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung des gesamten nicht glykosylierten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen davon, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man die genetische Information für die Biosynthese von Minactivin unter Verwendung von mRNA von Zellen monocytischer Abstammung erhält; das entstehende Gen in einen Mikroorganismus einführt; den Mikroorganismus selektiert und züchtet, um Minactivin herzustellen und das Minactivin sammelt.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Minactivin aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: daß man einen Wirt züchtet, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wurde, das eine erste DNA-Sequenz enthält, die eine erste DNA-Sequenz, die als kodierende Sequenz für Aminosäuresequenzen des gesamten Minactivins, eines Teils, von Analogen, Homologen, Derivaten oder Kombinationen von Minactivin, eine DNA-Sequenz, die mit der ersten DNA-sequenz hybridisiert, eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Basen-Substitutionen, -Deletionen, -Insertionen und -Inversionen einschließt, mit der ersten DNA-Sequenz oder einer hybridisierenden Sequenz verwandt ist, oder eine DNA-Sequenz, die bei Expression ein gesamtes Polypeptid, einen Teil, Analoge, Homologe, Derivate oder Kombinationen eines Polypeptids kodiert, das Minactivin ist oder eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie Minactivin aufweist, umfaßt.
Die Erfindung liefert auch ein Reagenz, um die Grenzen von Tumoren in histologischen Proben oder in vivo zu lokalisieren und zu definieren, wobei das Reagenz in geeigneter Weise markiertes Minactivin, insbesondere von rekombinanter DNA stammendes Minactivin oder Fragmente von Minactivin umfaßt und das entsprechende Verfahren zur Lokalisierung und Definierung der Grenzen von Tumoren in histologischen Proben oder in vivo umfaßt, daß man in geeigneter Weise markiertes Minactivin oder Fragmente davon anwendet oder verabreicht und anschließend bildlich darstellt, um die Stelle, wo die Markierung konzentriert ist, zu bestimmen.
Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren, um die Tumorinvasion zu hemmen und zur Behandlung von Tumoren, das umfaßt, daß man einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge Minactivin, in geeigneter Weise markiertes Minactivin, Fragmente von Minactivin oder markierte Fragmente von Minactivin verabreicht; und ein Verfahren zur Behandlung von chronischen Entzündungen, wie z.B. von Polyarthritis, das umfaßt, daß man einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, eine therapeutisch wirksame Menge von Minactivin oder Fragmenten von Minactivin verabreicht und ein Verfahren zur Überwachung einer chronischen Entzündung, das den Nachweis von Minactivin in Proben von Körperflüssigkeiten und Geweben umfaßt unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Minactivin oder Fragmente von Minactivin hergestellt wurden.
Auch in der Erfindung enthalten sind Antikörper-Präparate, die gegen Minactivin, einschließlich rekombinantes Minactivin, gereinigtes natürliches Minactivin und Fragmente davon, hergestellt wurden. Die Erfindung liefert auch eine therapeutische, diagnostische oder prophylaktische Zusammensetzung, die Minactivin, insbesondere von rekombinanter DNA stammendes Minactivin, Fragmente von Minactivin oder Antikörper gegen Minactivin oder Fragmente von Minactivin und einen pharmazeutisch annehmbaren nicht toxischen Träger oder ein Verdünnungsmittel dafür umfaßt.
Die Erfindung liefert weiterhin synthetische Oligonucleotidsonden, wobei die Sequenz dieser Sonden eine erste Nucleotidsequenz, die bei der Expression die Aminosäuresequenz eines Peptids der Erfindung kodiert, eine Nucleotidsequenz, die ausreichend mit der ersten Nucleotidsequenz verwandt ist, um mit der ersten Nucleotidsequenz zu hybridisieren oder eine DNA-Sequenz, die durch Mutation, was einfache oder mehrfache Baseninsertionen, -Inversionen, -Deletionen oder -Substitutionen einschließt, mit der ersten Nucleotidsequenz verwandt ist, umfaßt.
Im Schutzbereich der Erfindung liegt auch ein Verfahren zur Herstellung der synthetischen Oligonucleotidsonden, wobei das Verfahren umfaßt, daß man die Aminosäuresequenz der von dem gereinigten Minactivin stammenden Peptidfragmente bestimmt und entsprechende Oligonudeotide synthetisiert. In einer bevorzugten Form wird diese Synthese an einem DNA-Syntheseautomaten von Applied Biosystems 380A durchgeführt.
Die Erfindung liefert ein Präparat, das die synthetischen Oligonucleotidsonden der Erfindung umfaßt.
Bevorzugt sind diese Präparate diagnostische Reagenzien.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Nachweis von menschlichen Carcinomen und entzündlichen Zuständen und einer Anfälligkeit dafür, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Präparat, das die synthetische Oligonucleotidsonde umfaßt, in einem Test verwendet, der zum Nachweis von DNA, die Minactivin kodiert, vorgesehen ist. Das Fehlen der Fähigkeit, Minactivin in Geweben herzustellen, kann mit der Anfälligkeit für Carcinome und entzündliche Zustände zusammenhängen. Ein nachgewiesener Mangel kann behandelt werden durch Verabreichung von gereinigtem Minactivin an den Patienten und kann auch als Marker für Gewebe dienen, die durch Carcinome und Entzündung beeinträchtigt sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein Diagramm der Minactivin-Aktivität, das die Wirkung von PMA auf die Minactivin-Sekretion darstellt.
Figur 2 ist eine Gelanalyse eines der Größe nach aufgetrennten Minactivin-mRNA-Präparats.
Figur 3 ist ein Autoradiogramm der immunologisch ausgefällten Produkte nach einer in vitro Translation von der Größe nach aufgetrenntem mRNA, das Minactivin-mRNA in den Fraktionen zeigt, die um den 18S rRNA-Standard angeordnet sind.
Figur 4 ist ein Autoradiogramm von immunologisch ausgefällten Translationsprodukten, das die Spezifität der Komplexbildung mit Urokinase unter Verwendung von Anti-Urokinase-Antikörpern zeigt.
Figur 5 ist ein Autoradiogramm von immunologisch ausgefällten Transiationsprodukten, das die Spezifität der Komplexbildung mit Urokinase unter Verwendung von Anti-Plazentainhibitor-Antikörpern zeigt (Autoradiogramm, das die Identität der Ergebnisse unter Verwendung von Anti-Plazentainhibitor-Antikörpern mit den Ergebnissen unter Verwendung von Anti-Urokinase-Antikörpern zeigt).
Figur 6 ist ein Autoradiogramm, das die Identifizierung des Minactivin-Translations-Produktes durch Vergleich mit den immunologischen Fällungsprodukten in Gegenwart und Abwesenheit von Urokinase unter reduzierenden Bedingungen zeigt.
Figur 7 ist die Darstellung eines Gels, das die Differenzierung der Urokinasearten unter Verwendung der Fibrin-Überschichtungstechnik zeigt.
Figur 8 ist ein Sephacryl S-200 Chromatogramm, das die Elution von angereicherter Minactivin-Aktivität bezogen auf die Gesamtproteinelution zeigt.
Figur 9 ist ein Diagramm, das die differentielle Elution der Minactivin-Aktivität von Phenylboronatagarose unter verschiedenen Elutionsbedingungen zeigt.
Figur 10 ist ein Chromatogramm, das die Elution der Minactivin-Aktivität in Bezug auf das gesamte aus einer chromatographisch fokussierenden Säule eluierte Protein als Funktion des pH's der Elution zeigt.
Figur 11 ist eine Überlagerung, die die Minaktivität über einem Gel der Proteinfraktionen, die von einem isoelektrisch fokussierenden Gel isoliert wurden, zeigt, um den Proteingehalt gegen die Minactivin- Aktivität zu zeigen.
Figur 12a ist ein Elutionsprofil von einer Immunoaffinitätssäule, das die Elution der Minactivin-Aktivität zeigt.
Figur 12b ist die Darstellung eines SDS-PAGE-Gels von Minactivin, das von der Immunoaffinitätssäule eluiert wurde und eines Westernblots dieses Gels.
Figur 13 ist ein Autoradiogramm von mit ¹²&sup5;I markierter Urokinase auf SDS-PAGE, das die Formen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht und die Dissoziation der Form mit hohem Molekulargewicht unter reduzierenden Bedingungen zeigt.
Figur 14 zeigt das Elutionsprofil der Minactivin-Aktivität und des Proteins der stufenweisen pH-Elution von der Phenylsepharose-Säule.
A: Elution mit 50 mM Natriumcitrat, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,5 M Natriumchlorid.
B: Elution mit 50 mM Glycin, pH 9,0.
Figur 15 ist eine Überlagerung der Minactivin-Aktivität über ein SDS-PAGE-Gel der Proteinfraktionen, die aus einem isoelektrisch fokussierenden Gel isoliert wurden, um den Proteingehalt gegen die Minactivin-Aktivität zu zeigen.
Figur 16 ist eine Darstellung der Fraktionen des isoelektrischen Fokussierungstests, der in Figur 15 gezeigt ist, nach Westerntransfer des Proteins auf Nitrocellulose und nach dem immunologischen Nachweis der Proteine mit Anti-Placentainhibitor-Antikörpern.
Figur 17 zeigt ein Elutionsprofil des höchst gereinigten Minactivin-Präparates von einem Hochdruckflüssig- Chromatographie-Durchlauf auf einer Vydac C-4 Reverse-Phase-Säule.
Figur 18 ist eine Darstellung eines SDS-PAGE, das das homogene Minactivin, das aus Peak 5 des in Figur 17 gezeigten HPLC-Durchlaufs gewonnen wurde, zeigt.
Figur 19 zeigt das Elutionsprofil der Minactivin-Peptide, die bei einem Hochdruck-Flüssig-Chromatographie- Durchlauf von einer Synchropak RP-P (C-8) Säule eluiert wurden.
Figur 20 zeigt die Endonuclease-Restriktionskarte und die DNA-Sequenzierungsstrategie der Klone, die Segmente des Minactivin-Gens enthalten.
Figur 21 zeigt die Hybrid-Freisetzungs-Translation von Minactivin-mRNA.
Figur 22 zeigt die Konstruktion des Plasmids pBTA438, das das zusammenhängende Minactivin-Gen enthält.
Figur 23 zeigt die vollständige cDNA des Minactivin-Gens und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Minactivin-Proteins. Die fünf Peptide, die aus der Aminosäuresequenzanalyse erhalten wurden, sind unterstrichen.
Figur 24 zeigt die Konstruktion der Minactivin-Expressionsvektoren pBTA444 und pBTA447.
Figur 25 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die Westernanalyse und die ³&sup5;S-pulsmarkierte Proteinanalyse von Minactivin, exprimiert von pBTA444 und pBTA447.
Figur 26 zeigt die Konstruktion der Hybridprotein-Expressionsvektoren a) pBTA440 und b) pBTA586.
Figur 27 zeigt die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die Westernanalyse und die ³&sup5;S pulsmarkierte Proteinanalyse von Hybrid-Minactivin-Proteinen, die von pBTA440 und pBTA586 exprimiert werden.
Figur 28 zeigt die Konstruktion der Säugetier-Klonierungsvektoren pBTA587, pBTA588 und pBTA590, die das Minactivin-Gen enthalten.
Figur 29 ist ein Autoradiogramm, das die Expression von Minactivin in Säugetierzellen nach einer immunologischen Ausfällung in Gegenwart und Abwesenheit von Urokinase zeigt.

Beste Durchführungsform der Erfindung

Induktion der U937-Zellinie für eine verbesserte Minactivin- Synthese
Es wurde gefunden, daß Minactivin von induzierten menschlichen Monozyten, bestimmten Makrophagen und transformierten Zellen monozytischer Abstammung erzeugt wird (siehe Internationale Patentanmeldung WO86/01212). Es wurde gefunden, daß die transformierte Zellinie U937 (ATCC CRL 1593) Minactivin konstitutiv in Gegenwart von Dexamethason produziert. Der Anteil an Minactivin, der von diesen Zellen unter serumfreien Bedingungen ausgeschieden wurde, war nur etwa 0,06 % des gesamten von diesen Zellen ausgeschiedenen Proteins. Es wurde gefunden, daß dieser Anteil um ungefähr eine Größenordnung auf 0,4 % verbessert werden konnte durch Zugabe von 4-Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA). Die Wirkung von PMA auf die Minactivin-Sekretion mit der Zeit folgt einem biphasischen Verlauf mit einer Anfangs-Lag-Phase von 6 Stunden, gefolgt von einem linearen Anstieg der Minactivin-Aktivität bis zu 60 Stunden (Figur 1). Es wurden keine Unterschiede beobachtet bei einer Erhöhung der PMA-Konzentration von 10 ng/ml auf 30 ng/ml. Weiterhin wurde bestimmt, daß die Phorbolester eng mit den Zellen verbunden waren, da radioaktiv markiertes PMA sogar nach 17 Stunden nur in geringen Mengen (weniger als 10%) in den Kulturüberständen nachgewiesen werden konnte.
Die folgenden Beispiele erläutern bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Sie sollten nicht so ausgelegt werden, daß sie den Schutzbereich der Erfindung beschränken. Wenn nicht anders angegeben, beziehen sich alle Teile und Prozentangaben auf Gewicht.

Beispiel 1

Zellkultur

Die menschliche Makrophagen-Zellinie U937 wurde in RPMI 1640, das 10 % foetales Kälberserum und 1 µm Dexamethason enthielt, entweder in T175 Kulturkolben oder in einem 10 l Braun-Fermenter gezüchtet. Die Zellen wurden auf einer Dichte von 1 bis 3 x 10&sup6; Zellen/ml gehalten. Obwohl Minactivin von den Zellen während der Wachstumsphase ausgeschieden wurde, wurden die Zellen in serumfreies Medium überführt, um Überstände für die Minactivin-Reinigung zu erhalten. Die Zellen wurden pelletisiert, einmal gewaschen, in RPMI 1640, das 1 µm Dexamethason enthielt, resuspendiert und 3 Tage lang gezüchtet. Der Gehalt an von diesen Zellen unter serumfreien Bedingungen ausgeschiedenen Minactivin konnte um ungefähr eine Größenordnung auf 0,4 % durch Zugabe von PMA verbessert werden.
Die Zellen wurden dann. geerntet und der Überstand im folgenden Reinigungsschema verwendet.

Beispiel 2

Reinigung von homogenem Minactivin

a) Konzentration der serumfreien Minactivin-Überstände
Typischerweise wurden 4 bis 5 l Kulturüberstand auf ein Zehntel eingeengt auf einer Hohlfaser-Dialyse/Konzentrationseinheit Amicon DC2, die mit einer Patrone mit einem Molekulargewichtsausschluß von 30.000 ausgestattet war. Das Konzentrat wurde dann gegen ein mindestens gleiches Volumen von 50 mM Glycin, pH 7,8, dialysiert, um alle Spuren von Farbstoff zu entfernen.
b) Zentrifugation des Minactivin-Konzentrats
Das dialysierte Konzentrat wurde auf einem JA10-Rotor mit 8.000 Upm 30 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert, um restliche Zelibruchstücke und Protein, das während der Dialyse ausgefällt worden sein konnte, zu pelletisieren. Der geklärte Überstand wurde dann in Aliquots aufgeteilt und bei -20ºC eingefroren, bis er für die nachfolgende Reinigung notwendig war.
c) Phenyl-Sepharose-Chromatographie unter Verwendung einer stufenweisen pH-Elution
Minactivin wurde weiter aus dem 10fach eingeengten Kulturüberstand, der aus Zellen, die in Abwesenheit von PMA gezüchtet worden waren, durch stufenweise pH-Elution unter Verwendung von Phenylsepharose erhalten worden war, wie folgt gereinigt.
Die Ionenstärke des Überstandes (200 ml; 12.000 Einheiten; spezifische Aktivität 102 Einheiten/mg) wurde durch Zugabe von festem NaCl auf 2 M eingestellt und der pH wurde mit Zitronensäure auf 5,5 eingestellt. Diese Lösung wurde auf eine Phenyl-Sepharose-Säule (4,4 cm x 5,0 cm), die mit 50 mM Na-Citrat, pH 5,5, 2 M NaCl und 1 mM EDTA äquilibriert worden war, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorption der Grundlinie bei 280 nm (A280) auf die Grundlinie zurückkehrte. Die Säule wurde dann mit 50 mM Natriumcitrat, pH 5,5, das 0,5 M NaCl und 1 mM EDTA enthielt, eluiert und wiederum wurde die A280 überwacht, bis die Absorption auf die Grundlinie zurückkehrte. Das Minactivin wurde dann von der Säule mit 50 mM Glycin, pH 9,0, eluiert. Figur 14 zeigt das Elutionsprofil.
Mit diesem Verfahren wurden 9553 Einheiten Minactivin gewonnen, was 80 % der auf die Säule aufgetragenen Einheiten darstellt. Das Material mit der höchsten spezifischen Aktivität wurde gesammelt (6700 Einheiten; spezifische Aktivität 1343 Einheiten/mg) und auf einer Amicon YM10 Membran auf 3 ml eingeengt.
d) Sephacryl S-200 Gel-Permeations-Chromatographie
Das gepoolte, eingeengte Minactivin wurde auf eine 2,2 cm x 78 cm Säule von Sephacryl S-200, die mit 0,1 M Natriumborat, pH 9,0 aquilibriert war, aufgetragen. Fraktionen mit jeweils 5,0 ml wurden mit einer Durchflußrate von 0,46 ml/min gesammelt. Figur 8 zeigt, daß Minactivin an der Schwanzkante des Hauptproteinpeaks eluierte. Die Fraktionen, die Minactivinaktivität enthielten, wurden gepoolt (4480 Einheiten; spezifische Aktivität 1355 Einheiten/mg) und auf 3 ml unter Verwendung einer YM10 Membran eingeengt. Die Kalibrierung dieser Säule mit bekannten Mr- Standards zeigte, daß Minactivin ein Mr von 45 bis 48 kD hatte.
e) Isoelektrische Fokussierung
Die konzentrierte Minactivin-Lösung wurde auf ein präparatives Flachbettgel aus Ultrodex, das Ampholine im pH-Bereich von 4,5 bis 6,0 enthielt, aufgetragen und 23 Stunden lang bei 10ºC auf einer LKB-Multiphor isoelektrischen Fokussierungseinrichtung elektrofokussiert. Nach Ende des Durchlaufs wurden 30 Zonen über die Länge des Gels herausgekratzt und das Protein aus jeder mit 10 ml 1 M Glycin, das 1 mM EDTA, pH 9,0, enthielt, eluiert. Aliquots jeder Fraktion wurden auf Minactivin-Aktivität getestet und auf 15 % SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt, um das Protein zu lokalisieren. Figur 15 zeigt, daß eine wesentliche Menge an Protein aus den Fraktionen, die die Minactivin-Aktivität enthielten, entfernt worden war. Unter diesen Bedingungen fokussiert Minactivin zwischen pH 5 und pH 5,2 und innerhalb dieses Bereichs auf dem Gel wurden 15 % der Gesamtaktivität, die auf das Gel aufgetragen worden war, gewonnen.
Tatsächlich sind in dem Bereich des isoelektrisch fokussierenden Gels, das die Minaktivität enthält, nur zwei Proteinbanden sichtbar (Figur 15). Um zu bestimmen, welche dieser Banden Minactivin ist, wurde das Protein auf einem aquivalenten Polyacrylamidgel auf Nitrocellulose überführt und mit Antikörpern sondiert, die in Ziegen gegen den Plazenta-Inhibitor erzeugt worden waren. Aufgrund ähnlicher biologischer Eigenschaften wurde es als wahrscheinlich angesehen, daß die zwei Proteine immunologisch verwandt sein könnten. Wie in Figur 16 gezeigt, gibt die Proteinbande mit Mr = 45 bis 48 kD eine spezifische Kreuzreaktion mit den Antiplazenta-Inhibitor-Antikörpern, was darauf hindeutet, daß diese Proteinbande Minactivin ist. Weiterhin stimmt diese Beobachtung überein mit dem Mr von 45 bis 48 kD, das für das native Minactivin mit Gelpermeations-Chromatographie bestimmt wurde.
f) Hochdruckflüssig-Chromatographie
Die Fraktionen von der isoelektrischen Fokussierung oben, die Minactivinaktivität enthielten, wurden auf einer Amicon YM10 Ultrafiltrationsmembran auf ein Zehntel eingeengt und weiter auf einer Vydac C-4 Reverse-Phase-Säule unter Verwendung eines Hochdruckflüssig-Chromatographen von Waters fraktioniert. Die Proteine wurden von der Reverse-Phase-Säule eluiert unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1 % TFA, wie in Figur 17 gezeigt. Jeder der Absorptionspeaks wurde mit SDS-PAGE untersucht und es wurde gefunden, daß Peak 5 reines Minactivin enthielt (Figur 18).

Beispiel 2A

a) Gelfiltration
Zellfreie Überstände wurden mit den Stufen (a) und (b), wie in dem Reinigungsbeispiel 2 von WO86/01212 beschrieben, bearbeitet und dann über Phenylsepharose geschickt unter Verwendung einer stufenweisen pH-Elution, wie in dem Reinigungsbeispiel 1 von WO86/01212 beschrieben. Die Fraktionen, die Minactivinaktivität enthielten, wurden gepoolt, durch Ausfällung mit 85 % gesättigtem Ammoniumsulfat eingeengt und auf eine 2,2 cm x 80 cm Säule von Sephacryl S-200 aufgetragen, die mit 0,1 M Natriumborat, pH 9,0 aquilibriert war. Fraktionen mit jeweils 3,5 ml wurden mit einer Durchflußrate von 0,46 ml/min gesammelt. Figur 8 zeigt, daß Minactivin mit der Schwanzkante des Hauptproteinpeaks eluierte und eine peakspezifische Aktivität von 2206 Einheiten/mg hatte, was einen Gesamtanstieg der spezifischen Aktivität um das 31fache anzeigt. Unter diesen Bedingungen verhält sich das Minactivin wie ein Molekül mit einem Stokes-Radius ähnlich dem von Ovalbumin, was auf eine Molekülgröße von 45 bis 49 x 10³ Dalton deutet.
b) Phenylboronat-Agarose-Chromatographie
Zellfreie Überstände wurden mit den Stufen (a) und (b), wie in Reinigungsbeispiel 2 von WO86/01212 beschrieben, bearbeitet. 1 ml Überstand wurde auf 10 mM in MgCl&sub2; gebracht und der pH dann auf pH 8,5 eingestellt mit Natriumhydroxid. Diese Lösung wurde auf eine Säule mit Phenylboronat-Agarose -30 (PBA 30) (0,8 cm x 2,5 cm), die mit 50 mM Glycin, pH 8,5, das 10 mM MgCl&sub2; enthielt, bei 4ºC äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 9 ml des obigen Puffers und dann aufeinanderfolgend wie folgt gewaschen:
a) 10 ml 50 mM Glycin, pH 8,5, das 10 mM EDTA enthielt
b) 10 ml 50 mM Glycin, pH 8,5, das 100 mM Sorbit enthielt
c) 10 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5
d) 10 ml 50 mM Natriumacetat, pH 5,0.
Fraktionen mit jeweils 5 ml wurden gesammelt und gegen 50 mM Glycin, pH 7,8, über Nacht bei 4ºC dialysiert, bevor die Minactivin-Aktivität und das Protein bestimmt wurden. Die Ergebnisse, die in Figur 9 gezeigt sind, zeigen, daß zwei verschiedene Aktivitätspeaks von der Säule unter verschiedenen Bedingungen eluieren. Der erste Peak, der mit EDTA eluiert, enthält 35 % der gesamten auf die Säule geladenen Aktivität mit einem Anstieg der spezifischen Aktivität um das 14fache. Der zweite Peak stellt 32 % der Anfangsaktivität dar mit einem Anstieg der spezifischen Aktivität um das 4,4fache.
c) Chromatographische Fokussierung
Zellfreie Überstände wurden mit den Stufen (a) und (b), wie in dem Reinigungsbeispiel 2 von WO86/01212 beschrieben, bearbeitet. 4 ml dieses Überstands wurden gegen 25 mM Imidazol-HCl-Puffer, pH 7,4 dialysiert und dann auf eine PBE 94 chromatographisch fokussierende Säule (1 cm x 27 cm), die mit dem obigen Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen. Ein linearer pH-Gradient wurde dann erzeugt, indem 200 ml Polypuffer, pH 4,0, aufgetragen wurden und Fraktionen mit jeweils 4 ml wurden in 4 ml Aliquots von 1 M Tris-HCl, pH 7,5 gesammelt. Jeweils 10 Fraktionen wurden gepoolt, eingeengt und auf einem Centrikon 30 gewaschen und auf Minactivin-Aktivität und Proteinkonzentration getestet. Figur 10 zeigt, daß der Hauptanteil der Aktivität in der Nähe von pH 5 eluierte. Die Gesamtgewinnung der Aktivität war 82 % und es gab einen 2fachen Anstieg der spezifischen Aktivität.
d) Isoelektrische Fokussierung
Zellfreie Überstände wurden mit den Stufen (a) und (b), wie in dem Reinigungsbeispiel 2 von WO86/01212 beschrieben, bearbeitet und dann über Phenylsepharose geschickt unter Verwendung einer stufenweisen pH-Elution, wie in Reinigungsbeispiel 1 von WO86/01212 beschrieben. Die Fraktionen, die Minactivin-Aktivität enthielten, wurden gepoolt, durch Ausfällen mit 85 % gesättigtem Ammoniumsulfat eingeengt und über Nacht gegen 50 mM Glycin, pH 9,0, dialysiert. Diese Lösung wurde auf ein präparatives Flachbettgel aus Ultrodex, das Ampholine in dem pH-Bereich von 4,5 bis 6,0 enthielt, aufgetragen und 23 Stunden lang bei 10ºC auf einer isoelektrischen LKB-Multiphor Fokussierungsvorrichtung elektrofokussiert. Nach Abschluß des Durchlaufes wurden 30 Zonen über die Länge des Gels herausgekratzt und das Protein von jeder mit 10 ml 1 M Glycin, das 1 mM EDTA, pH 9,0, enthielt, eluiert. Aliquots jeder Fraktion wurden auf Minactivin-Aktivität getestet und auf 15 % SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt, um das Protein zu lokalisieren. Figur 11 zeigt, daß eine wesentliche Menge des Proteins aus den Fraktionen, die Minactivin-Aktivität enthielten, entfernt worden war. Unter diesen Bedingungen fokussiert das Minactivin zwischen pH 5 und pH 5,2 und innerhalb dieses Bereichs des Gels wurden 39 % der gesamten Aktivität, die auf das Gel aufgetragen worden war, gewonnen.
e) Immunoaffinitäts-Chrornatographie
Zelifreie Überstände wurden, wie in Reinigungsbeispiel 1, bearbeitet. Ein Aliquot mit 4,6 ml dieses Minactivin-Präparats (2300 Einheiten, 2,25 mg, spezifische Aktivität 1020 U/mg) wurde auf 0,05 M Natriumphosphat, 0,5 NaCl, 0,01 % Triton X-100, 0,1 % Natriumazid, 1 mM EDTA gebracht und der pH auf 7,5 eingestellt. Diese Lösung wurde mit dem obigen Puffer auf 15 ml verdünnt und zu 15 ml Sepharose 4B zugegeben, an die 10 ml Anti-Plazentainhibitor-Antikörper chemisch gekuppelt waren. Die Aufschlämmung wurde über Nacht bei 4ºC geschüttelt und dann in eine 2,5 cm x 3,1 cm Säule gegossen. Nicht gebundenes Protein wurde von der Säule abgezogen und die Säule mit Puffer gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm auf die Grundlinie zurückkehrte. Die Säule wurde dann mit 3 M KSCN, das 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 enthielt, eluiert. Das Elutionsprofil ist in Figur 12 gezeigt. Die Fraktionen, die mit dem KSCN eluierten, wurden auf einem Centricon 10 um das 8,5fache eingeengt, mit 40 mM Glycin, pH 7,8, gewaschen und auf Minactivin-Aktivität und mit SDS-PAGE analysiert. Der Hauptanteil der Minactivin-Aktivität band nicht an die Antikörper-Säule. Jedoch wurde eine geringe Menge an Minactivin-Aktivität (8,5 Einheiten) spezifisch gebunden und mit 3 M KSCN eluiert. Dies deutet darauf hin, daß unter diesen Bedingungen die Antikörpersäule mit Minactivin überladen war. Weiterhin verliert Minactivin mehr als 90 % seiner Aktivität in Gegenwart von KSCN über einen vergleichbaren Zeitraum, was darauf hindeutet, daß die geringe Gewinnung an Minactivin-Aktivität auf der Inaktivierung der Moleküle durch KSCN beruhen könnte. Die Ergebnisse der SDS-PAGE zeigen, daß der Hauptanteil des Proteins umgehend von der Säule eluiert. Das KSCN-Eluat enthält jedoch eine Hauptproteinbande mit einem Molekulargewicht von ca. 45.000, ähnlich der Molekülgröße des Minactivins bei der Gelfiltration (siehe Beispiel 2A(a)) (Figur 12a). Die Westernanalyse dieses Minactivin-Präparates zeigte eine einzige immunologisch kreuzreagierende Art, die identisch mit der Proteinbande wanderte, die nach der SDS-PAGE beobachtet wurde (Figur 12b).
Unter bestimmten Bedingungen wurde beobachtet, daß Minactivin eine Molekülgröße von ungefähr 60 bis 70.000 hat (siehe im Detail PCT191-85). Diese Diskrepanz kann auf einer unterschiedlichen Mobilität aufgrund des Glykosylierungsgrades von Minactivin beruhen.

Beispiel 3

Isolierung und Sequenz von Peptidfragmenten von Minactivin

Minactivin wurde aus mit PMA induzierten U937-Zellen, wie in Beispiel 2 oben beschrieben, gereinigt. Das Minactivin (3 bis 5 µg) wurde dann mit Endoproteinase Lys C (0,1 µg) in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, das 5 M Harnstoff enthielt, in einem endgültigen Volumen von 50 µl 8 Stunden lang bei 22ºC verdaut. Die entstehenden Peptide wurden mit Reverse-Phase-Hochdruckflussig-Chromatographie auf einer Synchropak RP-P (C-8)-Säule aufgetrennt unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril in 0,1 % TFA (Figur 19). Die Peptide, die mit Sternen gekennzeichnet sind, wurden auf einem Applied Biosystems 470A Gasphasen-Sequenziergerät sequenziert und die Sequenzen waren wie folgt:
Peptid 13: AQILELPY-GDV-MFLLLP-E...
Peptid 11: GRANFSGMSE-NDLF...
Peptid 10: MAE-EVEVYIPQFKLEE-Y...
Peptid 6: LNIGYIEDLK
Peptid 9: IPNLLPEG-V

Beispiel 4

Molekulare Klonierung von Minactivin

a) Isolierung von mRNA
Aus Figur 1 könnte die optimale Zeit für die Transkription von mit PMA induzierten U937-Zellen mit 15 bis 25 Stunden abgeschätzt werden. Daher wurden 4 l einer serumfreien Kultur von U937-Zellen mit einer Zelldichte von 1,2 x 10&sup6; Zellen/ml 19 Stunden lang in Gegenwart von PMA inkubiert, die Zellen geerntet und schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren bis zur weiteren Verwendung. Nicht mit PMA stimulierte U937-Zellen aus dreitägigen serumfreien Kulturen wurden auch für die mRNA-Isolierung aufbewahrt. Menschliche Blutmonozyten, die wie in der Internationalen Patentanmeldung WO86/01212 beschrieben, hergestellt wurden und 3 Tage in vitro gezüchtet wurden, wurden auch als Quelle für mRNA verwendet.
Die gesamte RNA aus jeder der obigen Quellen wurde mit einer Modifikation des Guanidin-HCl-Verfahrens extrahiert. Das Zellpellet wurde in 20 Volumina (pro Gramm Gewicht) Puffer, der 4 M Guanidin-Isothiocyanat, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5 % Sarkosyl, 0,1 M 2-Merkaptoethanol enthielt, in einem Mischer mit einer niedrigen Geschwindigkeit 3 Minuten lang bei 4ºC homogenisiert. Die Suspension wurde dann 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu entfernen. Die Nukleinsäuren wurden aus dem Überstand ausgefällt durch Zugabe von Essigsäure auf 25 mM und 0,75 Volumina kaltem Ethanol und über Nacht bei -20ºC inkubiert. Die Suspension wurde wiederum 30 Minuten lang bei -10ºC zentrifugiert und das Pellet in Puffer, der 7,5 M Guanidin-HCl, 20 mM Natriumacetat, pH 5,0, 1 mM Dithiothreitol enthielt, mit 20 % des ursprünglichen Volumens gelöst. Nach der Zentrifugation zur Entfernung von jeglichem nicht gelöstem Material wurde die RNA wieder mit 0,55 Volumina kaltem Ethanol bei -20ºC 1 bis 3 Stunden lang ausgefällt. Die RNA wurde durch Zentrifugation gewonnen, wieder in dem Guanidin-HCl-Puffer gelöst und wieder ausgefällt. Die letzte Stufe wurde dreimal wiederholt. Nach der letzten Ausfällung wurde das Pellet in 20 mM EDTA, pH 7,0 gelöst und mit einem gleichen Volumen Chloroform:Butanol (4:1) extrahiert. Die RNA wurde dann aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von Natriumacetat, pH 5,0 bis 0,3 M und 2 Volumina kaltem Ethanol bei -20ºC über Nacht ausgefällt. Die RNA wurde durch Zentrifugation gewonnen und mit 100 mg/ml Proteinase K in 20 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 % Natriumdodecylsulfat 4 Stunden lang bei 50ºC versetzt, um alles restliche Protein zu entfernen. Die RNA wurde dann durch Ausfällung in Gegenwart von 0,2 M Natriumacetat, pH 5,0 und 2 Volumina Ethanol bei -20 ºC gewonnen. Nach der Gewinnung durch zentrifugation wurde jegliche restliche DNA durch Ausfällen der RNA in Gegenwart von 3 M Natriumacetat, pH 6,0, über Nacht bei 4ºC entfernt. Die RNA wurde durch Zentrifugation gewonnen und in Gegenwart von 0,25 n Natriumchlorid und 2 Volumina Ethanol ausgefällt. Die RNA wurde wiederum durch Zentrifugation gewonnen. Poly-A&spplus;-mRNA wurde dann durch zwei Adsorptionszyklen und Elution von Oligo-(dT)-Cellulose isoliert.
Die Poly-A&spplus;-mRNA wurde 10 bis 20fach bezüglich der Minactivin-mRNA durch Zentrifugation mit einem Saccharose- Dichtegradienten angereichert. Die Probe wurde mit 15 bis 34 % (G/G) des Saccharosegradienten überschichtet und in einem Beckman SW41-Rotor mit 33.000 Upm 16 Stunden lang bei 4ºC zentrifugiert. Figur 2 zeigt eine Gelanalyse unter denaturierenden Bedingungen des der Größe nach fraktionierten mRNA-Präparats. Minactivin-mRNA wurde in diesen Fraktionen (Fraktionen 16 und 17), die rund um den 18S-ribosomal-RNA-Standard angeordnet waren, nachgewiesen, wie mit in vitro-Translation und immunologischer Ausfällung (Methode unten beschrieben) in Figur 3 gezeigt ist.
b) Identifizierung des Minactivin-Translationsproduktes
Minactivin-mRNA wurde durch in vitro-Translation in einem zellfreien Retikulozytenlysatsystem und anschließende immunologische Ausfällung des Minactivin-Translations-Produktes unter Verwendung des natürlichen Substrats, Urokinase, identifiziert.
Im Handel erhältliches Kaninchen-Retikulozytenlysat von Amersham wurde zuerst gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet unter Zugabe von Kalbsleber-tRNA (Boehringer Mannheim) in einer Konzentration von 100 ng/ml. ³&sup5;S-Methionin (Amersham) wurde in einer Konzentration von 2 mCi/ml zugegeben, um den Nachweis der Translationsprodukte durch Autoradiographie zuzulassen. Poly-A&spplus;-mRNA, die wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde in einer Konzentration von 50 mg/ml 90 Minuten lang bei 30ºC translatiert. 25 µl der Translationsmischung wurden pro immunologischer Ausfällung verwendet. Nach der Inkubation und Entfernung einer gewaschenen Suspension vollständiger Staphylococcus aureus Zellen (Pansorbin, Calbiochem), um die nicht spezifische Bindung zu minimieren, wurde die Probe mit 50 mPU Urokinase (Calbiochem) 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Stufe läßt die Komplexbildung zwischen dem Minactivin-Translationsprodukt und der Urokinase zu. Der Komplex wurde aus der Lösung entfernt durch Zugabe von 1 bis 2 µl Anti-Urokinase-Antiserum (Green Cross Corp.) oder von Antikörpern gegen Plazenta- Inhibitor und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang und über Nacht bei 4ºC inkubiert und dann durch Zugabe von 25 µl gewaschenem Pansorbin ausgefällt. Nach Zentrifugation wurde das Minactivin-Urokinase-Antikörper-Pansorbin-Pellet gewaschen, durch Sieden in Gegenwart von 2 % SDS und 2- Mercaptoethanol zerstört und die Produkte mit Gelelektrophorese und anschließend durch eine Autoradiographie analysiert.
Die immunologische Ausfällung der ³&sup5;S-markierten Translationsprodukte mit Antikörpern gegen Urokinase lieferte urokinasespezifische Transiationsprodukte mit Mr's von 69.000 bis 79.000. Diese Proteinbanden stellen spezifische Komplexe von Minactivin mit Urokinase dar, da sie:
1. in Abwesenheit von Urokinase oder mRNA nicht vorhanden sind;
2. nicht in Abwesenheit von Antikörpern ausfallen und
3. mit nicht markiertem gereinigtem Minactivin und Plazentainhibitor-(Calbiochem)-Präparaten um die Urokinase-Bindung konkurrieren (Figur 4).
Es wurde gefunden, daß das immunologisch ausgefällte Produkt 0,05 % des gesamten aus mRNA synthetisierten Proteins, das von mit PMA induzierten U937-Zellen erhalten worden war, darstellte. Keine immunologisch ausgefällten Produkte konnten nachgewiesen werden aus mRNA, die aus nicht induzierten U937-Zellen erhalten wurde, wahrscheinlich aufgrund des verminderten Gehalts an Minactivin-RNA in diesem Präparat.
Die immunologische Ausfällung der Urokinase-Minactivin- Translationsprodukte unter Verwendung von Antikörpern gegen Plazentainhibitor lieferte identische Ergebnisse. Mehrere Anti-Plazentainhibitor-Antikörper-Präparate fällten die verschiedenen Urokinase-Minactivin-Translationsprodukt-Komplexe mit 69.000 und 79.000 MW aus (Figur 5).
Ein Vergleich der immunologisch ausgefällten Produkte, die in Gegenwart und Abwesenheit von Urokinase erhalten wurden, läßt eine direkte Identifizierung des Minactivin- Translationsproduktes zu, wie in Figur 6 gezeigt. Es ist als distinkte Bande mit Mr 43.000 vorhanden. Dieses Molekulargewicht scheint etwas geringer zu sein, als das, das für das native Protein beobachtet wurde, wahrscheinlich aufgrund der Glykosylierung. In Gegenwart von Urokinase verschwindet diese Bande und das charakteristische Urokinase-Minactivin-Translationsprodukt wird bei 69.000 Mr nachgewiesen. Die zusätzliche Proteinbande bei 79 bis 80.000 Mr, die vorher beobachtet worden war, scheint eine nicht reduzierte Form des Komplexes darzustellen, da die Proben unter teilweise reduzierenden Bedingungen analysiert wurden.
Weiterhin wurde gefunden, daß die Komplexbildung mit dem Minactivin-Translationsprodukt von der Gegenwart der Form der Urokinase mit geringem Molekulargewicht (HPA 33) abhängig war. Reine Präparate von HPA 52 und HPA 33 wurden erhalten (Calbiochem) und es wurde sichergestellt, daß es hauptsächlich die eine Art oder die andere war durch Fibrinüberschichtung (Figur 7). Außerdem wurde Plasminogen/Plasmin zu HPA 33 zugegeben, um alle restlichen Spuren von HPA 52 in dem Präparat in die Form mit niedrigem Molekulargewicht umzuwandeln. Der unterscheidbare Urokinase- Minactivin-Translationsprodukt-Komplex mit 69.000 MW erschien nur, wenn die verwendeten Urokinase-Präparate HPA 33 enthielten. Die Erklärung für dieses Ergebnis ist unbekannt. Die Zugabe von Trasylol zu der Lysatmischung, um eine mögliche Proteolyse zu hemmen, hatte keine Wirkung auf dieses Ergebnis.
Zusammenfassend liefert die in vitro Translation von mRNA aus U937-Zellen eindeutig ein biologisch aktives Minactivin-Translationsprodukt mit Mr von ungefähr 43.000, das leicht durch Bildung eines Komplexes mit Urokinase identifiziert werden kann, was ein charakteristisches Mr von 69.000 ergibt.
c) Konstruktion komplementärer DNA-Bibliotheken
Es wurden cDNA-Bibliotheken konstruiert aus der gesamten Poly-A&spplus;-mRNA oder der mit Saccharose-Dichtegradienten fraktionierten mRNA unter Verwendung einer Vielzahl eingeführter Methoden. Zum Beispiel wurde allgemein die komplementäre DNA des ersten Strangs aus der mRNA synthetisiert unter Verwendung eines Primers, initiiert durch Reverse Transkriptase. Der zweite Strang wurde dann z.B. durch (1) übliche durch Haarnadeistrukturen geprimte DNA-Synthese unter Verwendung von DNA-Polymerase oder Reverser Transkriptase; (2) RNAse-H-DNA-Polymerase I vermittelte Zweitstrang-Synthese oder (3) dem Verfahren mit Primer am 5' Ende synthetisiert. Nach Behandlung mit S1-Nuclease (falls erforderlich) wird die DNA methyliert und glatte Enden werden erzeugt unter Verwendung der Standardmethoden des Einfüllens, z.B. mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase oder mit T4-Polymerase. Anschließend können die cDNA's kloniert werden, indem sie in ein geeignetes Plasmid (z.B. pBR322, pUC oder pUR-Systeme) oder in Bakteriophagen- (z.B. lambda gt 11)-Vektoren eingefügt werden über komplementäre Homopolymerschwänze oder kohäsive Enden, die mit synthetischen Linkersegmenten erzeugt werden, die die geeigneten Restriktionsstellen enthalten, unter Verwendung von Standardverfahren und dann in einen geeigneten Wirt transformiert werden.

Beispiel 5

Ein bevorzugtes Verfahren zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken ist wie folgt: cDNA wurde aus 6 µg der gesamten Poly-A&spplus;-mRNA synthetisiert unter Verwendung der Reversen Transkriptase aus Moloney Mäuseleukämievirus (BRL, 200 U/µg mRNA) in Gegenwart von 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 3 mM MgCl, jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 µg/ml Oligo(dT)12-18 und 100 µg/ml BSA. Ein Reaktionsvolumen von 200 µl wurde 40 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Der zweite Strang wurde synthetisiert durch eine durch Haarnadelstrukturen geprimte Synthese unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I. Der Ansatz wurde 10 Minuten lang auf 70ºC erhitzt, um DNA/RNA-Doppelstränge abzutrennen, auf das Zweifache des Volumens verdünnt und Klenow mit 325 U/ml in Gegenwart von 10 µCi dATP (1800 Ci/mmol) zugegeben. Der Ansatz wurde eine Stunde bei 15ºC inkubieren gelassen. Nach einer Phenol:Chloroform (1:1)-Extraktion und einer Ethanolausfällung wurde die DNA gelöst und die Haarnadelstrukturen entfernt durch Behandlung mit 80 Einheiten S1-Nuclease (P/L Biochemicals) in Gegenwart von 0,2 M NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1 mM ZnSO&sub4; und 0,5 % Glycerin und wie vorher beschrieben ausgefällt.
Die doppelsträngige cDNA wurde dann methyliert unter Verwendung von 20 Einheiten EcoR1-Methylase (Biolabs) in Gegenwart von 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA und 80 µm S-Adenosylmethionin. Die DNA wurde wieder gepaart durch Zugabe von 2,5 U T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 33 mM Trisacetat, pH 8,0, 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM Dithiothreitol, 0,1 mg/ml BSA und jeweils 0,5 mM dATP, sCTP, dGTP und dTTP eine Stunde bei 37ºC, anschließend wurde T4- Polynucleotidkinase (20 u) und 0,1 mM ATP zugegeben. Nach der Phenol:Chloroform (1:1)-Extraktion und einer Ethanolausfällung wurden EcoR1-Linker zu der wieder aufgelösten DNA zugegeben (2 µg Linker pro 1 µg cDNA) unter Verwendung von T4- DNA-Ligase (IBI; 1,2 U/µg, DNA). Die Reaktion wurde in einer konzentrierten cDNA-Lösung (167 µg/ml) 4 Stunden lang bei 26ºC durchgeführt. Nach Behandlung mit EcoRI wurden die freien Linker von der cDNA durch Chromatographie auf Biogel A150M abgetrennt. Die Fraktionen, die cDNA mit einer durchschnittlichen Länge von mehr als 1000 bp enthielten, wurden gepoolt und die cDNA eingeengt und ausgefällt durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol. Die Ausbeute an cDNA war 2,5 µg.
cDNA-Bibliotheken wurden sowohl in lambda gt 11 als auch gt 10 hergestellt. cDNA (100 ng) wurde mit mit EcoR1 gespaltenem mit Phosphatase behandeltem lambda gt 11 (1 µg) bei einer DNA-Konzentration von 220 µg/ml 16 Stunden lang bei 4ºC ligiert. Die DNA wurde unter Verwendung vorbereite ter Verpackungspräparate von Vector Cloning Systems verpackt. Die Phagen wurden amplifiziert durch Adsorption an den E. coli Stamm Y1088 und in Y1090 gescreent. Die lambda gt 11 Bibliothek enthielt ungefähr 8 x 10&sup6; Rekombinanten pro µg cDNA (94 % aller Phagen). Der Anteil der Rekombinanten, die cDNA- Moleküle enthielten, wurde bestimmt, indem die Bibliothek mit cDNA, die in Gegenwart von α[³²P]-dATP synthetisiert worden war, gescreent wurde. Ungefähr 90 % der weißen Plaques hybridisierten mit dieser Sonde.
Für die in lambda gt 10 hergestellte Bibliothek wurde cDNA (200 ng) mit mit EcoR1 gespaltenem, mit Phosphatase behandeltem lambda gt 10 (1 µg), bei einer DNA-Konzentration von 240 µg/ml 4 Stunden lang bei 25ºC ligiert. Die DNA wurde verpackt, wie oben, unter Verwendung des E. coli Stamms C600 hfl.
Die lambda gt 10 Bibliothek enthielt ungefähr 7,5 x 10&sup6; Rekombinanten pro µg cDNA. Der Anteil der Rekombinanten, der cDNA-Moleküle enthielt, wurde bestimmt, indem die Bibliothek mit radioaktiv markierter cDNA gescreent wurde. Mehr als 90 % der Plaques hybridisierten mit dieser Sonde.

Beispiel 6

Identifizierung der Klone, die das Minactivin-Gen enthalten

Der Klon/die Klone, die das Minactivin kodierende Gen enthalten, können mit den in den folgenden Beispielen beschriebenen Sonden unter Verwendung eingeführter Techniken identifiziert werden.

Beispiel 6a

Hybrid-Freisetzungs-Translation

cDNA-Klone, die Sequenzen enthalten, die komplementär zu der Minactivin-mRNA sind, können durch Hybridisierungs-Selektion identifiziert werden. Die klonierte DNA wird denaturiert, auf einer festen Matrix, z.B. Nitrocellulose, immobilisiert und mit Präparaten der gesamten mRNA hybridisiert. Der RNA/DNA- Doppelstrang wird erhitzt, um die mRNA freizusetzen, die dann in vitro in einem zelifreien Kaninchen-Retikulozyten-Lysatsystem, wie oben beschrieben, translatiert wird. Das Translationsprodukt kann dann, wie in Beispiel 4b beschrieben, identifiziert werden.

Beispiel 6b

DNA-Sonden, die komplementär zu der Minactivin-Gensequenz sind

Unter Verwendung der für die Minactivin-Peptide erhaltenen Aminosäuresequenz, wie in Beispiel 3 beschrieben, können Oligonucleotidsequenzen, die die Aminosäuresequenz kodieren, vorhergesagt werden und Oligonucleotidsonden können unter Verwendung üblicher eingeführter Techniken synthetisiert werden. Unter Verwendung dieser Sequenzdaten wurden eine Anzahl von Oligonucleotidsonden synthetisiert unter Verwendung eines Applied Biosystems 380A DNA-Syntheseautomaten. Die Sequenzen dieser Oligonudeotide waren wie folgt:
7. ATA TGT TTC CTC GAG CTT GAA CTG AGG GAT GTA CAC CTC GAC TTC GCT CTC TGC CAT
Die spezifische Oligonucleotidsonde kann radioaktiv markiert werden und dann verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu screenen durch in situ-Hybridisierung von Bakterienkolonien oder Bakteriophagen-Plaques unter Verwendung von Standardtechniken, um Klone zu identifizieren, die das gesamte Minactivin-Gen oder einen Teil davon enthalten.

Beispiel 6c

Immunologisches Screening

Die Klone können gescreent werden unter Verwendung von Standardverfahren mit Antikörpern, die mit dem nativen Minactivin-Protein kreuzreagieren.
Antikörper gegen Minactivin werden mit Standardmethoden hergestellt, z.B. wird jedes Kaninchen mit 10 bis 100 µg gereinigtem Minactivin in Gegenwart eines geeigneten Adjuvans, z.B. Freund's komplettem Adjuvans oder Montanid immunisiert. Nach einer Verstärkung mit einer äquivalenten Menge ungefähr 4 Wochen später kann Kaninchenserum erhalten werden, das auf Antikörper gegen Minactivin getestet werden kann.

Beispiel 6d

Screenen auf biologische Aktivität

Klone, die das Minactivin-Gen enthalten, können auf Minactivin-Aktivität getestet oder gescreent werden, entweder mit radioaktiv markierter Urokinase oder mit Urokinase und Antikörpern gegen Urokinase. Dies wird erreicht unter Verwendung von Standardtechniken des immunologischen Screenens. Urokinase und Antikörper gegen Urokinase können im Handel erhalten werden. Radioaktiv markierte Urokinase kann wie unten beschrieben hergestellt werden.
Im Handel erhältliche Urokinase (Calbiochem) wurde durch Affinität gereinigt mit einer Chromatographie auf p-Aminobenzamidin-Sepharose nach veröffentlichten Schemata [L. Holmberg, B. Bladh, B. Astedt, Biochim. Biophys. Acta 445, 215- 222 (1976) und R.H. Goldfarb, J.P. Quigley, Biochemistry 19, 5463-5471 (1980)]. 75 Ploug-Einheiten der gereinigten Urokinase wurden durch Konjugation mit N-Succinimidyl-3-(4- hydroxy, 5-[¹²&sup5;I]iodphenyl)propionat mit dem Verfahren von Bolton Hunter iodiert. Die ¹²&sup5;I-markierte Urokinase wurde von der freien Markierung abgetrennt durch Chromatographie auf Sephadex G-25M, die mit 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, 0,4 M Natriumchlorid, 0,1 % Triton X-100 und 1 % Rinderserumalbumin als Träger äquilibriert worden war.
Die Analyse des mit ¹²&sup5;I-markierten Urokinase-Präparats mit SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen zeigte die Gegenwart der charakteristischen Formen der Urokinase mit hohem (Mr 55.000) und niedrigem (Mr 33.000) Molekulargewicht (Figur 13). Unter reduzierenden Bedingungen wird die Form mit hohem Molekulargewicht in die charakteristischen Untereinheiten mit 33.000 und 22.000 Mr dissoziiert. Die Iodierung des Urokinase-Präparats führte zu einem Verlust von 10 bis 15 % der Plasminogen-Aktivator-Aktivität, was mit dem Test von Coleman und Green [Ann. N. Y. Acad. Sci. 370, 617 (1981)] gemessen wurde, hatte aber keine Wirkung auf die Minactivin-Hemmung des Enzyms. Punkttests, bei denen verschiedene Verdünnungen von Minactivin auf Nitrocellulosepapier getupft wurden, über Nacht mit radioaktiv markierter Urokinase inkubiert wurden, gewaschen, getrocknet und autoradiographiert wurden, zeigten, daß die radioaktiv markierte Urokinase Minactivin, das an die feste Phase gebunden war, mit einer Empfindlichkeit von 10 mU oder ungefähr 0,1 ng Minactivin nachweisen konnte.

Beispiel 7

Identifizierung des Minactivin-Gens

Das bevorzugte Verfahren zur Identifizierung des Minactivin- Gens ist wie folgt. Nach der Synthese wurden die Oligonucleotidsonden 7 bis 10, die in Beispiel 6b beschrieben wurden, mit Polyacrylarnidgel-Elektrophorese gereinigt und mit Polynucleotidkinase (IBI, 1 U/pmol DNA) und gamma-³²P-ATP markiert und durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Standardverfahren gereinigt.
Die lambda gt 10 Bibliothek, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde durch in situ Hybridisierung mit Standard-Testverfahren gescreent. Die Hyxbridisierungs-Bedingungen wurden so eingestellt, daß eine spezifische Bindung mit minimalem Hintergrund möglich war und wurden wie folgt bestimmt:
Sonden 7 und 8: 3 Stunden bei 50ºC in 6 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,1 % SDS, 20 µg/ml tRNA anschließende Vorhybridisierung eine Stunde bei 42ºC in 6 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,5 % SDS, 0,2 mg/ml zerkleinerte Kälberthymus-DNA.
Sonden 9 und 10: 16 Stunden bei 37ºC in 10 x Denhardt's, 5 x SSC, 0,05 % Natriumpyrophosphat.
³²P-markierte Oligonucleotid-Sonden mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 10&sup8; cpm/µg wurden mit ungefähr 0,5 pmol/ml verwendet. Die Filter wurden mit 0,5 X oder 2 x SSC, das 0,1 % SDS enthielt, mit steigender Temperatur gewaschen, um die Stringenz zur Selektion der positiven Klone zu erhöhen.
Plaques mit positiven Signalen wurden herausgepickt, wieder gescreent und die Phagen-DNA gereinigt unter Verwendung von Standardverfahren (siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning 1982).
Zwei rekombinante Bakteriophagen-Klone MIN1D und MIN611, die Sequenzen enthielten, die miteinander kreuzhybridisierten, wurden erhalten, mit mit EcoR1-Linkern versehenen cDNA- Inserts mit 2100 bzw. 1060 Basenpaaren. Diese Inserts wurden in Plasmid pUC18 subkloniert, um die Plasmide pBTA440 bzw. pBTA441 zu erzeugen, und durch Restriktionsenzymanalyse eine Karte erstellt, wie in Figur 20 gezeigt. Durch Southern-Blot- Analyse des Klons MIN1D wurde die bindende Region der Oligonucleotidsonden 7 und 8 aufgefunden innerhalb eines XbaI- NcoI-Restriktionsfragmentes mit 320 Basenpaaren, wie in Figur 20 gezeigt.
Daß diese Klone Gene enthielten, die Minactivin kodieren, wurde sichergestellt durch Hybrid-Freisetzungs-Translation und DNA-Sequenzanalyse.

Hybrid-Freisetzungs-Translation

Gereinigter pBTA440 wurde auf Nitrocellulosefilter mit einer Konzentration von 20 µg pro 3 mm x 3 mm Filter mit dem von Maniatis et al. beschriebenen Verfahren immobilisiert (Molecular Cloning 1982). Nach dem Waschen wurde jeder Filter mit 50 µg der gesamten mRNA inkubiert und 3 Stunden bei 50ºC hybridisiert. Nach sorgfältigem Waschen wurde die spezifisch hybridisierte mRNA durch Sieden eluiert und dann in vitro translatiert unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kaninchen-Retikulocytenlysat-Präparats (Amersham).
Wie in Figur 21 dargestellt wurde gezeigt, daß die hybridisierte mRNA spezifisch ein Translationsprodukt mit Mr 43.000 gemäß Gelelektrophorese, kodiert, was charakteristisch ist für das in Beispiel 4b beschriebene Minactivin-Translationsprodukt. Weiterhin verschwand in Gegenwart von Urokinase diese Bande und der charakteristische Urokinase-Minactivin- Komplex wurde bei 69.000 Mr nachgewiesen.

DNA-Sequenzanalyse

Restriktionsfragmente von pBTA440 wurden in den einzelsträngigen Phagenvektoren M13mp9, M13mp18 und M13mp19 subkloniert und die DNA-Sequenz der eingesetzten 2100 bp wurde bestimmt unter Verwendung des Kettenabbruch-Verfahrens von Sanger. Die Untersuchung der DNA-Sequenz zeigte, daß das 2100 bp Insert nicht die gesamte kodierende Sequenz des Minactivin-Gens enthielt.

Primer-Extension

Um den Rest der DNA-Sequenz, die die N-terminale Region von Minactivin kodiert, zu erhalten, wurde eine zweite cDNA- Bibliothek konstruiert unter Verwendung einer Primer-Extension. Die Bibliothek wurde hergestellt, indem 5 µg Poly-A&spplus;- mRNA mit dem Oligonucleotid 5' TTC CAG TAA ATA ATT CCC TGT GGA TGC ATT 3', die komplementär zu den vorher sequenzierten Nucleotiden 391 bis 420 ist, geprimt wurde. Mit EcoR1-Linkern versehene cDNA-Inserts wurden anschließend in lambda gt 10 unter Verwendung von Standardtechniken kloniert.
Ungefähr 5,3 x 10³ der erhaltenen bis 7,2 x 10&sup4; Klone wurden mit einem zweiten Oligonucleotid 5' GCC TGC AAA ATC GCA TCA GGA TAA CTA CC 3' (komplementär zu den Nudeotiden 310 bis 335) gescreent. Von den 100 positiven erhaltenen Klonen wurden 15 gereinigt und der Klon (Klon 13) mit dem größten cDNA- Insert (430 bp) wurde in Plasmid pUC18 subkioniert, um Plasmid pBTA442 zu erzeugen. Die DNA-Sequenz von pBTA442 wurde bestimmt, wie oben beschrieben (siehe auch Figur 20).
Die kodierende Sequenz des Minactivin-Gens, die in pBTA440 und pBTA443, einem Plasmid, das die 430 bp 5'Minactivin- Sequenz in pUC18 in entgegengesetzter Orientierung zu pBTA442 enthält, enthalten ist, wurde durchgehend gemacht durch Rekombination bestimmter DNA-Restriktionsfragmente, um pBTA438 zu erzeugen, wie in Figur 22 gezeigt. E. coli K12, Stamm JM109, der pBTA438 enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Vereinigte Staaten von Amerika am 11. Februar 1987 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53585 hinterlegt.
Die vollständige cDNA-Sequenz des Minactivin-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Minactivin-Proteins sind in Figur 23 angegeben. Das vollständige Translationsprodukt besteht aus 415 Aminosäuren (Mr 46 543). Das Gen kodiert die fünf Peptide, die aus der Aminosäuresequenz-Analyse des nativen Minactivins, wie in Figur 23 dargestellt, erhalten wurden.
Die DNA-Sequenz-Analyse deutet darauf hin, daß Minactivin ein Mitglied der Überfamilie der Serinproteasen-Inhibitoren (bekannt als Serpine) ist, obwohl es für urokinaseartige Plasminogen-Aktivatoren spezifisch ist.

Beispiel 8

Expression von biologisch aktivem Minactivin

Eine Überexpression des biologisch aktiven Moleküls wird z.B. erhalten durch Integration einer cDNA mit voller L.nge, die in pBTA438 vorhanden ist, in verschiedene Vektoren, die die Synthese des Proteins in einer Vielzahl von Wirten, z.B. Bakterien oder eukaryotischen Zellen (z.B. Säugetierzellen, die mit dem Vektor transfiziert oder transformiert sind) steuern können. Der Vektor enthält bevorzugt eine Nucleotidsequenz, die die Expression der Minactivin kodierenden Nucleotidsequenz steuern kann. Diese zweite Nucleotidsequenz kann z.B. eine Promotorsequenz, Polyadenylierungssequenzen oder Nucleotidsequenzen, die zulassen, daß das Protein als Hybridmolekül, das an ein anderes Protein fusioniert ist, exprimieren, einschließen.

Beispiel 9

Bakterielle Expression von Minactivin

Der allgemeine Ansatz ist die Herstellung eines Expressionsvektors oder Klonierungsvektors, der in E. coli replizierbar ist, der eine DNA-Sequenz enthält, die die Expression des Minactivins kodiert.
Minactivin kann in der nativen Form oder als Hybridmolekül, fusioniert an ein anderes Protein, exprimiert werden. Diese Konstruktionen sind in den Figuren 24 und 26 gezeigt.
Bei einer Reihe von Plasmid-Konstrukten wurden die lambda PL- Expressionsvektoren pLK57 und pLK58 verwendet (Botterman et al. Gene 37; 229-239, 1985) um natives oder fast natives (N- terminale Aminosäure modifiziert) Minactivin zu exprimieren.
Wie in Figur 24 gezeigt, wurde das Plasmid pBTA438 mit EcoRI und DraI verdaut und ein EcoRI-DraI-Restriktionsfragment mit 1610 bp wurde auf einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde mit T4-Ligase mit Vektor pLK57 ligiert, der mit EcoRI und EcoRV verdaut worden war. Das abgeleitete Plasmid pBTA444 enthält den lambda PL-Promotor, der die Expression des nativen Minactivins kontrolliert.
Der Expressionsvektor pBTA444 wurde verwendet, um E. coli K-12 Stamm N4830 (Joyce et al., PNAS 80, 1830-1834, 1983) zu transformieren, der den thermolabilen CI-Repressor von lambda enthält. Zellen, die mit pBTA444 transformiert waren, wurden über Nacht in MEB-Medium (Mott et al., PNAS 82, 88-92, 1985) mit 100 µg/ml Ampicillin bei 28ºC gezüchtet. Die Zellen wurden in MEB-Medium verdünnt, bei 28ºC auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 1,0 gezüchtet, als vorgewärmtes (65º) MEB-Medium in gleichem Volumen zugegeben wurde, um die Temperatur auf 42º einzustellen. Nach 4 Stunden Wachstum bei 42ºC wurden die Zellen geerntet und Membran- und lösliche Proteinfraktionen hergestellt, indem die gewaschenen Zellen (nach Einfrieren bei -70ºC und Auftauen) in 200 µ 20 % Saccharose, 30 mM Tris-HCl, pH 8,1 und mg/ml Lysozym-Lösung resuspendiert wurden und anschließend 3 ml 3 M EDTA, pH 7,3 zugegeben wurde. Der Zellextrakt wurde geklärt durch kurze Beschallung und Membranproteine und lösliche Proteine wurden durch Zentrifugation (27.000 x g, 60 Minuten) pelletisiert. Die löslichen Proteine wurden durch Zugabe von 10 % Trichloressigsäure (GIV) zu dem Überstand ausgefällt und das Pellet in Wasser gelöst. Die pelletisierten Membranen wurden auch im Wasser gelöst. Proben dieser Fraktionen sowohl für die nicht induzierten (28ºC) als auch die induzierten (42ºC) Zellen wurden mit SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert und der immunologische Nachweis von Minactivin erfolgte mit Westerntransfer unter Verwendung eines Antiserums gegen menschlichen Plazentainhibitor. Wie in Figur 25 gezeigt, ist eine Minactivin-Proteinbande (Mr 40 - 50 K), die durch Westerntransfer sichtbar gemacht wurde unter Verwendung von Antikörpern gegen menschlichen Plazentainhibitor und von Kaninchen-Antiziege-IgG, das mit alkalischer Phosphatase (Sigma) gekuppelt war, sowohl in den induzierten (42ºC) löslichen als auch den Membran-Fraktionen vorhanden.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von nativem Minactivin ist auch in Figur 24 gezeigt. Das Plasmid pBTA442 wurde mit XhoII verdaut und ein XhoII-Restriktionsfragment mit 243 bp wurde auf einem Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wurde mit T4-Ligase mit Vektor pLK58, der mit BglII verdaut war, ligiert. Das abgeleitete Plasmid pBTA445 wurde mit PvuII und SmaI verdaut und ein Fragment mit 2800 bp gereinigt und mit T4-Ligase mit einem gereinigten PvuII-DraI-Restriktionsfragment aus pBTA438 ligiert. Das abgeleitete Plasmid pBTA446 wurde mit BqlII linearisiert und mit einem synthetischen doppelsträngigen 26-mer Oligonucleotid, das eine bakterielle Ribosomen-Bindungsstelle und die Anfangsnucleotide des nativen Minactivin-Gens enthielt, ligiert, was Plasmid pBTA447 erzeugte. Als pBTA447 in einen geeigneten Wirt transformiert wurde, z.B. N4830, induziert und wie oben analysiert wurde, wurde wiederum Minactivin erzeugt, wie in Figur 25 gezeigt. In beiden Fällen war bei pBTA444 und pBTA447 enthaltenden Zellen Minactivin sowohl in den induzierten (42ºC) löslichen als auch den Membranfraktionen vorhanden.
Um die biologische Aktivität von in E. coli N4830 erzeugtem Minactivin zu testen, wurden die löslichen und Membranfraktionen 90 Minuten lang mit Urokinase mit hohem und niedrigem Molekulargewicht, wie in Beispiel 4 beschrieben, inkubiert. Proben wurden dann mit Aceton ausgefällt, in Wasser wieder suspendiert und auf einem reduzierenden SDS-Polyacrylamidgel laufen gelassen. Minactivin und Minactivin-Urokinase-Komplexe wurden durch Westerntransfer, wie oben beschrieben, sichtbar gemacht. Wie in Figur 25 gezeigt, bildet Minactivin in der löslichen Fraktion aus induziertern E. coli N4830, der pBTA447 enthält, Komplexe mit Urokinase unter Standard-Testbedingungen. Dies zeigt, daß von diesen bakteriellen Zellen erzeugtes Minactivin die biologische Aktivität behält.
Zwei Beispiele für ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, d.h. einer Fusion der das gesamte Protein oder einen Teil des Proteins kodierenden Sequenz mit der gesamten Minactivin kodierenden Sequenz oder eines Teils davon folgen. Wie in Figur 26 gezeigt, wurde das Plasmid pBTA440 mit SspI und DraI verdaut und ein Fragment mit 1110 bp wurde auf einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem Vektor pBTA449, der mit EcoRV verdaut worden war, ligiert, was pBTA450 erzeugte. pBTA450 wurde dann mit AvaI verdaut und ein gereinigtes Fragment mit 2800 bp wurde mit dem Plasmid pLK57 ligiert, das mit AvaI verdaut worden war, um Plasmid pBTASB6 zu erzeugen. Dieses bringt einen Teil der Minactivin kodierenden Sequenz unter die Kontrolle des lambda-PL-Promotors und verband ihn mit der die ersten 80 Aminosäuren des traT-Gens kodierenden Sequenz, wobei die ersten 20 eine Signalsequenz bilden, die zur Fusion führt, die in der äußeren Membran von E. coli erscheint. Die Signalsequenz wird während des Transports zu der äußeren Membran abgespalten, was der normale Ort des traT-Proteins ist.
Wenn das Plasmid pBTA586 in einen geeigneten Wirt transformiert wird, z.B. N4830, und durch eine Temperaturverschiebung, wie oben, induziert wird, erscheint das TraT-Minactivin-Fusionsprotein in der äußeren Membran, wie in Figur 27 gezeigt.
Ein zweites Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung einer Fusion ist in Figur 26 gezeigt. Im Plasrnid pBTA440 wird die Minactivin kodierende Sequenz im Leserahmen mit einem Teil des ß-Galactosidasegens, das auf Plasmid pUC18 vorhanden ist, fusioniert.
Wenn das Plasmid pBTA440 in einen geeigneten Wirt transformiert wird, z.B. JM101 oder irgendeinen E. coli Stamm, der das lacIq-Gen enthält, und durch Zugabe von Isopropyl-thio-β- D-galactopyranosid (Endkonzentration 1 mM) induziert wird, kann die Minactivin-Produktion, wie oben beschrieben, nachgewiesen werden (Figur 27).

Beispiel 10

Expression von rekombinantem Minactivin in eukaryotischen Zellen

Ein Fragment von pBTA438, das die gesamte kodierende Region von Minactivin enthielt, wurde in eine Reihe von Vektoren insertiert, die zu einer stabilen Integration und Expression von eukaryotischen Genen in Säugetierzellen fähig waren. Diese schlossen 1) pKC3 (abgeleitet von pKO-neo, Van Doren, D. Hanahan, Y. Gluzman, J. Virol. 50, 606-614 (1984)), worin die Minactivin-cDNA-Sequenz unter der Kontrolle des frühen Promotors von SV40 ist; 2) pZipNeoSV(X)1 (C.L. Cepko, B.E. Roberts, R.C. Mulligan, Cell 37, 1053-1062 (1984)), ein von dem Molony Mäuseleukämievirus abgeleitetes retrovirales Shuttle-System, in dem das Minactivin-Gen stromabwärts von dem retroviralen LTR-Promotor angeordnet ist und die Selektion auf dem Neo-Gen basiert, das die Kanamycin-Resistenz in Prokaryoten und die G418-Resistenz in Eukaryoten beiträgt und 3) pMSG (im Handel erhältlich von Pharmacia), worin die regulierte Expression von Minactivin erreicht wird, indem ein durch Dexamethason induzierbarer Promotor verwendet wird, der in dem Maus-Brusttumorvirus (MMTV) 5'LTR enthalten ist, ein.
Die Konstruktion dieser drei Vektoren ist in Figur 28 gezeigt und die Details sind im folgenden angegeben. Die kodierende Region des Minactivin-Gens wurde aus pBTA438 isoliert als EcoRI-DraI-Fragment mit 1610 bp und in die folgenden Vektoren, wie unten beschrieben, insertiert.
Das EcoRI-DraI-Fragment mit 1610 bp wurde in pKC3 ligiert, der mit EcoRI und SmaI verdaut worden war und dann in E. coli C600γ transformiert. Das entstehende Plasmid wurde mit pBTA587 bezeichnet.
Bei der zweiten Konstruktion wurden bei dem EcoRI-DraI-Fragment mit 1610 bp glatte Enden erzeugt unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I, das Fragment in die SmaI-Stelle von pMSG ligiert und in einen geeigneten E. coli K-12 als Wirt transformiert. Die Kolonien, die das Minactivin-Gen in pMSG enthielten, wurden durch Koloniehybridisierung unter Verwendung von mit ³²P-markiertem Oligonucleotid (29-mer) nachgewiesen, wie vorher in Beispiel 7 beschrieben (komplementär zu den Nudeotiden 310 bis 335). Das entstehende Plasmid wurde mit pBTA588 bezeichnet.
Bei der dritten Konstruktion wurde das EcoRI/DraI-Fragment mit glatten Enden, das oben beschrieben wurde, in pUC7 ligiert, der mit HincII verdaut worden war, was die mit pBTA589 bezeichnete Konstruktion ergab. Da die HincII-Stelle in pUC7 von BamHI-Stellen flankiert ist, läßt dies zu, daß das Minactivin-Gen nach einem BamHI-Verdau isoliert wird und in die BamHI-Stelle von pZIPNeo SV(X)1 ligiert wird. Nach der Transformation in einen geeigneten E. coli K-12-Wirt werden Kolonien, die das Minactivin-Gen enthalten, durch Kolonie- Hybridisierung, wie oben beschrieben, nachgewiesen. Das entstehende Plasmid wurde mit pBTA590 bezeichnet.

Transfektion von eukaryotischen Zellen

Alle Plasmide wurden in eukaryotische Zellen mit dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert. Ungefähr 1 bis 2 x 10&sup5; Zellen wurden in einen T25-Kolben mit 5 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium, das mit 10 % (V/V) foetalem Kälberserum, 3,6 mM Glutamin, 200 mM, 45 IU/ml Penicillin und 45 mM/ml Streptomycin (vollständiges Medium) ergänzt war, geimpft. Ungefähr 1 bis 5 µg mit CsCl-Gradient gereinigte DNA wurde mit Calciumphosphat ausgefällt und zu den Zellen zugegeben. Nach 4 Stunden wurden die Zellen mit einem Glycerinschock behandelt und in dem vollständigen Medium 3 Tage lang gezüchtet. Der Kulturüberstand wurde dann zur Messung der vorübergehenden Expression entfernt. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und in Drittel aufgespalten in T75-Kolben mit komplettem Medium, das das geeignete antibiotische Auswahlmedium enthielt (siehe unten). Die Zellen wurden alle 6 bis 7 Tage mit dem gleichen Medium gewaschen und die Transfektanten am 14. bis 28. Tag aufgepickt und einzeln gezüchtet, bis ein zusammenfließendes Wachstum erreicht war.
Die Bedingungen der Transfektion für pBTA587, pBTA588 und pBTA590 waren wie folgt:
pBTA587: Da pKC3 keinen selektierbaren Marker enthält, wurde pBTA587 mit pZIPNeo SV(X)I in einem molaren Verhältnis von 7,5:1 cotransfiziert, pBTA587: pZIPNeo SV(x)I. Die Transfektanten wurden mit komplettem Medium, das 0,4 mg/ml G418 enthielt, selektiert. Die Transfektionen wurden in COS-Zellen durchgeführt.
pBTA588: Da pMSG das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-(gpt)-Gen von E. coli enthält, das von den frühen Promotoren von SV40 exprimiert wird, wurden stabil transfizierte Zellen in HAT-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Mycophenolsäure enthielt, selektiert. Die Transfektionen wurden ausgeführt unter Verwendung von NIH3T3-Zellen.
pBTA590: Die Transfektanten wurden selektiert unter Verwendung des vollständigen Mediums, das 0,4 mg/ml G418 enthielt. Die Transfektionen wurden in NIH3T3-Zellen durchgeführt.

Analyse der Expression von rekombinantern Minactivin in eukaryotischen Zellen

Nach der Transfektion wird die vorübergehende Expression des rekombinanten Minactivins nachgewiesen, indem die Zellen in Gegenwart von ³&sup5;S-Methionin gezüchtet werden und das rekombinante radioaktiv markierte Minactivin unter Verwendung von Antikörpern gegen den Plazenta-Inhibitor, im wesentlichen mit dem in Beispiel 4b beschriebenen Verfahren, spezifisch immunologisch gefällt wird. Zum Beispiel wurden 48 Stunden nach der Transfektion von pBTA587 in COS-Zellen der Überstand entfernt und die Zellen wurden in Gegenwart von 1 ml Methioninfreiem EMEM (Flow), das mit ³&sup5;S-Methionin (Amersham) ergänzt war, gezüchtet. Nach der immunologischen Ausfällung mit 50 mg Ziegen-Anti-Plazentainhibitor-Antikörpern und 200 ml gewaschenem Pansorbin wurden die Komplexe mit SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (reduzierende Bedingungen) analysiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht, wie in Figur 29 gezeigt. Rekombinantes Minactivin wird als Bande mit einem Molekulargewicht von 45 bis 48.000 nachgewiesen, die nicht bei der entsprechenden Kontroll-Transfektion beobachtet wird, die den Vektor (pKC3) allein enthält. Wenn Urokinase (15 Plough-Einheiten, Calbiochem) zu dem Überstand vor der immunologischen Ausfällung zugegeben wird, verschwindet diese Bande, die charakteristisch ist für biologisch aktives Minactivin. Eine Bande wird bei M 69.000 beobachtet, was auf den Minactivin-Urokinase-Komplex hinweist, die aber etwas durch eine unspezifische Proteinbande an gleicher Position verdeckt wird. Etwas rekombinantes Minactivin scheint auch proteolytisch gespalten zu sein nach der Zugabe des Urokinase-Präparates, was durch die bei Mr 35 bis 37.000 nachgewiesene Bande sichtbar gemacht wird.
Daß das hergestellte rekombinante Minactivin biologisch aktiv war, wurde bestimmt, indem die Zellen in Abwesenheit von Serum 4 Stunden lang gezüchtet wurden und die Hemmung der Urokinase-Aktivität durch den im wesentlichen in Beispiel 1 beschriebenen colorimetrischen Test quantitativ nachgewiesen wurde. Ein Grad der Hemmung wurde nachgewiesen, der ungefähr einer Einheit pro ml Minactivin-Aktivität über den Hintergrund hinaus entsprach.

Beispiel 11

Reinigung und Gewinnung von biologisch aktivem Protein

Nach der Einstellung der Bedingungen für die Expression von Minactivin in E. coli in hohem Anteil werden die Zellen, die das Plasmid, das das Minactivin-Gen kodiert, beinhalten, in der späten log-Phase geerntet. Ein Volumen gepackte Zellen werden in zwei Volumina Lysepuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, enthaltend 1 mM EDTA und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) suspendiert und durch drei Passagen durch eine French Press mit 15.000 psi lysiert. Die Suspension wird mit 23.000 x g 20 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet in zwei Volurnina Lysepuffer, der 5 % Triton X-100 enthält, resuspendiert. Die Suspension wird wiederum mit 23.000 x g 20 Minuten lang zentrifugiert und das Pellet in 3 Volumina 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, der 8 M Harnstoff und 0,1 M DTT enthält, suspendiert. Die Lösung wird mit Stickstoff gespült und in einem abgeschlossenen Röhrchen bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wird der pH der Lösung auf ungefähr pH 3,5 abgesenkt durch Zugabe von 50 ml Eisessig pro ml Lösung. Die Suspension wird geklärt, indem sie wie oben zentrifugiert wird und der Überstand wird auf eine Sephadex G-75 Säule (3,2 cm x 90 cm), die mit 0,1 M Essigsäure äquilibriert ist, aufgetragen. Die Fraktionen, die das Minactivin enthalten, werden durch SDS-PAGE lokalisiert. Die Fraktionen, die das Minactivin enthalten, werden gepoolt und gegen 10 mM Tris-C1, pH 8,0, das 8 M Harnstoff und 0,1 mM DTT enthält, bei Raumtemperatur 16 Stunden lang dialysiert. Die analysierte Lösung wird dann auf eine DEAE-Sephadex-Säule (2,2 cm x 25 cm), die mit dem obigen Puffer äquilibriert ist, aufgetragen und die Säule wird gewaschen, um nicht gebundenes Material zu eluieren. Das Minactivin wird dann von der Säule eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von Natriumchlorid von 0 bis 0,5 M im gleichen Puffer. Die Fraktionen, die das Minactivin enthalten, werden mit SDS-PAGE identifiziert und intensiv gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das Protein, das während dieses Verfahrens ausfällt, wird durch Lyophilisierung gewonnen. Das lyophilisierte Protein wird in 0,1 % Trifluoressigsäure wieder aufgelöst und auf eine Vydac C-4 Reverse Phase Säule aufgetragen, die mit einem Waters Hochdruck-Flüssig-Chromatographen verbunden ist. Das reine Minactivin wird von der Säule eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril von 0 bis 80 % in 0,1 % Trifluoressigsäure. Der A&sub2;&sub2;&sub0;-Peak, der dern Minactivin entspricht, wird mit SDS-PAGE identifiziert, die Fraktionen gepoolt und lyophilisiert.
Das lyophilisierte gereinigte Minactivin wird in 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, das 8 M Harnstoff in einer Konzentration von 10 mg/ml enthält, gelöst und auf 10 mg/ml in 0,1 M Tris-Cl, pH 8,0, das 1 mM reduziertes Glutathion und 0,1 Mm oxidiertes Glutathion enthält, gelöst. Die Renaturierungsreaktion wird bei Raumtemperatur 24 Stunden lang fortschreiten gelassen und dann wird die Lösung eingeengt und gegen 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, auf einer gerührten Amicon-Zelle unter Verwendung einer YM10-Membran diafiltriert. Die entstehende Lösung, die aktives Minactivin enthält, wird getestet unter Verwendung des oben beschriebenen Tests (Beispiel 1).
Für die Gewinnung des in hohem Anteil von Säugetierzellen ausgeschiedenen biologisch aktiven Minactivins wird das gleiche Verfahren angewendet, wie in Beispiel 2 für die Reinigung des nativen Minactivins aus U937-Zellen beschrieben. Dies betrifft anfangs eine 10fache Aufkonzentration des zellfreien Überstands unter Verwendung einer Amicon DC-2 Hohlfaser-Konzentrationsvorrichtung, die mit einer Patrone mit einem Ausschluß bei 30.000 Dalton ausgestattet ist. Das Konzentrat wird dann gegen mindestens ein gleiches Volumen 50 mM Glycin, pH 7 bis 8, dialysiert, um alle Farbstoffspuren zu entfernen. Das dialysierte Konzentrat wird in einem JA10- Rotor mit 8.000 Upm 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, um restliche Zellbruchstücke und Protein, das während der Dialyse ausgefallen sein kann, zu pelletisieren. Der geklärte Überstand wird dann in Aliquots aufgeteilt und bei -20ºC eingefroren, bis er für die nachfolgende Reinigung gebraucht wird.
Minactivin wird weiter aus dem 10fach konzentrierten Kulturüberstand durch stufenweise pH-Elution unter Verwendung von Phenylsepharose wie folgt gereinigt.
Die Ionenstärke des Überstandes wird auf 2 M durch Zugabe von festem NaCl eingestellt und der pH wird mit Zitronensäure auf 5,5 eingestellt. Diese Lösung wird auf eine Phenylsepharosesäule (4,4 cm x 5,0 cm), die mit 50 mM Na-Citrat, pH 5,5, 2 M NaCl und 1 mM EDTA äquilibriert ist, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer eluiert, bis die Absorption bei 280 nm (A280) auf die Grundlinie zurückgekehrt ist. Das Minactivin wird dann von der Säule mit 50 mM Glycin, pH 9,0, eluiert. Die Fraktionen, die die höchste spezifische Aktivität an Minactivin enthalten, werden gepoolt und auf einer Amicon YM10-Membran eingeengt.
Das gepoolte, eingeengte Minactivin wird dann auf eine 2,2 cm x 78 cm Säule von Sephacryl S-200, die mit 0,1 M Natriumborat, pH 9,0 äquilibriert ist, aufgetragen. Fraktionen mit jeweils 5,0 ml werden mit einer Durchflußrate von 0,46 ml/min gesammelt. Die Fraktionen, die die Minactivin-Aktivität enthielten, wurden gepoolt und auf 3 ml eingeengt unter Verwendung einer YM10-Membran. Die Kalibrierung dieser Säule mit bekannten Mr-Standards zeigt, daß Minactivin ein Mr von 45 bis 48 kD hat.
Die konzentrierte Minactivin-Lösung wird auf ein präparatives Flachbettgel aus Ultrodex, das Ampholine im pH-Bereich von 4,5 bis 6,0 enthält, aufgetragen und 23 Stunden lang bei 10ºC auf einer LKB-Multiphor isoelektrisch fokussierenden Einrichtung elektrofokussiert. Nach Abschluß des Durchlaufes werden 30 Zonen über die Länge des Gels ausgekratzt und das Protein aus jeder Zone mit 10 ml 1 M Glycin, das 1 mM EDYA, pH 9,0, enthält, eluiert. Aliquots jeder Fraktion werden auf Minactivin-Aktivität getestet und auf 15 % SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt, um das Protein zu lokalisieren. Unter diesen Bedingungen fokussiert Minactivin zwischen pH 5 und pH 5,2 und ist hoch gereinigt. Dieses Material wird wiederum auf einer Amicon YM10-Membran eingeengt und bei - 20ºC in 50 mM Glycin, pH 9,0, das 1 mM EDTA und 50 % Glycerin enthält, aufbewahrt.

Industrielle Anwendung

Als spezifischer Inaktivator von Urokinase-artigen Plasminogen-Aktivatoren hat Minactivin eine Reihe von potentiellen industriellen Anwendungen als klinisches Reagenz für die Diagnose und mögliche Behandlung verschiedener menschlicher Carcinome und entzündlicher Zustände.
Untersuchungen der Zelltransformation in vitro durch Tumorviren (Ossowski et al., J. Exp. Med. 137, 112, 1973) und durch chemische Carcinogene (Sisskin et al., Int. J. Cancer, 26, 331, 1980), zeigen beide, daß die Ausscheidung von Plasminogen-Aktivator das beste frühe biochemische Ereignis ist, das mit der Transformation in Beziehung steht. Weiterhin wurde gefunden, daß die Fähigkeit von Zellinien, in vivo Metastasen zu bilden, mit ihrer Fähigkeit, Plasminogen-Aktivator zu exprimieren, korreliert (Wang et al., Cancer Research 40, 288, 1980). Es ist auch wohlbekannt, daß Tumorzellen von verschiedenen der am meisten vorherrschenden menschlichen Krebsarten, d.h. Carcinome der Lunge, der Brust, der Prostata und des Darms, hohe Gehalte an Urokinase-artigem Plasminogen-Aktivator erzeugen (M.J. Duffy, P. O'Grady, Eur. J. Clin. Oncol. 20(5)577-582, 1984).
Frühere Untersuchungen (R.S. Stephens et al., Blood 66, 333- 337, 1985) über die Bösartigkeit in der Darmschleimhaut und die Bedingungen, die eine Bösartigkeit vorherbestimmen, d.h. adenomatöse Polypen, Polyposis coli (Polypenbildung im Darm) und entzündliche Zustände des Darms, wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, haben gezeigt, daß menschlicher Darmkrebs eine wesentlich größere Menge an urokinaseartigem Plasminogen-Aktivator erzeugt, als in benachbartem nicht betroffenem Gewebe auftritt. Es wurde gefunden, daß Minactivin diesen mit Tumoren assoziierten Plasminogen-Aktivator binden und hemmen kann (Stephens et al., Blood 66, 333-337, 1985). Daraus folgt, daß Minactivin industrielle Anwendung hat als Reagenz zur Identifizierung und Definition von Tumoren, sowohl in vivo als auch in histologischen Proben. Zur Sichtbarmachung von Tumoren in vivo kann Minactivin mit einem geeigneten Isotop, z.B. Technetium-99m (V.J. Richardson, Brit. J. Cancer 40, 35, 1979) oder Iod-131 (R.H.J. Begent, Lancet, 2. Okt. 1982) markiert werden. Nach Verabreichung des Minactivin-Präparates können der Ort und die Grenzen des Tumors mit bekannten radioisotopischen Methoden bestimmt werden, z.B. die Sichtbarmachung mit einer Gamma-Kamera. Somit bietet Minactivin ein empfindliches Verfahren, um die Identifizierung kleiner metastatischer Krebsarten zu ermöglichen, insbesondere solcher, die nach einem chirurgischen Eingriff auftreten. Bei der Analyse von histochemischen Proben können Minactivin oder seine Antikörper mit einem Isotop, wie I¹³¹ markiert oder mit einem geeigneten Enzym oder einem anderen chemischen Reagenz konjugiert werden. Bei Kontakt mit einer histologischen Probe, z.B. einen Biopsieschnitt, bindet Minactivin an den tumorartigen Plasminogen-Aktivator an der Stelle seiner Ausscheidung, wodurch die Tumorgrenzen identifiziert werden und möglicherweise der metastatische Zustand des Tumors. Zusätzlich zu den diagnostischen Anwendungen ist Minactivin auch indiziert zur Verwendung zur direkten Behandlung von Tumoren. Als spezifischer Inhibitor des Enzyms, das an dem Verfahren beteiligt ist, mit dem Tumoren in umgebende Gewebe eindringen (K. Dano et al., Adv. in Cancer Res. 44, 139, 1985) können Regulierung und insbesondere Hemmung des Tumorwachstums und der Metastasenbildung erreicht werden. Außerdem kann Minactivin als Arzneimittel-Abgabesystem verwendet werden, um Lectine oder Toxine direkt zu den wachsenden Tumoren zu bringen. Es wird davon ausgegangen, daß dieses System viele Vorteile bieten könnte, wegen seiner spezifischen und extrem wirksamen tumoriziden Fähigkeiten.
Andere biologische Verfahren, an denen urokinaseartige Plasminogen-Aktivatoren beteiligt sind, betreffen solche physiologischen Ereignisse, die mit der Invasion und der Gewebezerstörung verbunden sind, z.B. chronisch entzündliche Zustände, einschließlich Polyarthritis. Da Minactivin Teil der natürlichen Reaktion des Wirts auf den Gewebeabbau ist, wird es sich als geeigneter Marker zur Überwachung des Zustandes der Erkrankung erweisen, insbesondere während eines vorgeschriebenen Behandlungsverlaufes. Markierte Antikörper oder DNA- Sonden, die von Minactivin stammen, haben industrielle Anwendung als diagnostische Reagenzien zur Überwachung von Minactivingehalten in Blutplasma, in Makrophagen von Gewebebiopsien und in Synovialflüssigkeit für die Korrelation mit Krankheitszuständen. Auf gleiche Weise ist Minactivin selbst auch indiziert wegen seiner therapeutischen Wirkung, wenn es in vivo verabreicht wird, um solche Zustände zu verbessern.

Claims

1. Eine folgendes enthaltende DNS-Sequenz:

(a) eine erste DNS-Sequenz zur Codierung von Minactivin mit der in Abb. 23 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. einem Teil, Analog oder Homolog dieser Sequenz;

(b) eine zur ersten, in (a) beschriebenen DNS-Sequenz komplementäre DNS-Sequenz (aus jeglichen Quellen, einschließlich natärlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen); oder

(c) eine durch ein- oder mehrfache Basensubsütution, -entfernung, -einlagerung oder -vertauschung entstandene Mutante der ersten DNS-Sequenz;

wobei der Teil, die Mutante, das Analog oder das Homolog über mit Minactivin identische immunologische oder biologische Aktivität verfügt.

2. Eine Minactivin codierende DNS-Sequenz entsprechend Punkt 1.

3 Die DNS-Sequenz:

oder ein Fragment dieser Sequenz.

4. Ein rekombinantes, eine der unter einem der Punkte 1 bis 3 beschriebenen DNS- Sequenzen sowie Vektor-DNS enthaltendes DNS-Molekül.

5. Ein rekombinantes DNS-Molekül entsptechend Punkt 4, wobei die Vektor-DNS aus einem der folgenden Plasmide besteht: pMSG-, pKC-, pLi-, pBR322-, pUC- oder pUR-Systeme; pZIP Neo SV(X); pLK57 oder pLK58.

6. Ein rekombinantes DNS-Molekül entsprechend Punkt 4 oder 5, wobei eine Expressions-Steuersequenz operativ an die DNS-Sequenz angeschlossen ist.

7. Ein rekombinates DNS-Molekül entsprechend Punkt 6, wobei die Expressions- Steuersequenz aus dem β-galaktosidase-Gen von E. coli, dem trp-Operon, dem linken Promoter der Bakteriophage λ, dem langen Terminal-Repeat des Moloney- Leukämievirus, dem Mammatumorvirus der Maus oder dem SV40-Frühpromoter besteht.

8. Ein fusioniertes Gen mit einem portablen Promoter, einer Translations-Startstelle und einer Minactivin codierenden DNS-Sequenz entsprechend Punkt 1.

9. Ein durch mindestens ein rekombinantes DNS-Molekül entsprechend einem der Purkte 4 bis 7 transformierter Host.

10. Ein transformanter Host entsprechend Punkt 9, und zwar ein Bakterium, z.B. E. coll, eine Pseudomonas- oder eine Bacillusart, eine Hefe, ein Pilz, ein Maus- oder anderer tierischer Host, ein pflanzlicher Host, eine eukaryote Gewebelle, z.B. eine Insektenzelle oder eine Human- oder sonstige Säugetierzelle.

11. Zur Homogenität gereinigtes Minactivin mit der in Abb. 23 dargestellten Aminosäurensequenz.

12. Ein die in Abb. 23 dargestellte Aminosäurensequenz enthaltendes Polypeptid bzw. ein Analog, eine Mutante, ein Fragment oder ein Homolog dieses Polypeptids mit Minactivin identischer immunologischer oder biologischer Aktivität.

13. Ein Polypeptid entsprechend Punkt 12, das zugleich ein rekombinantes Polypeptid ist.

14. Ein zur Homogenität gereinigtes Peptid entspechend Punkt 13.

15. Ein in einer Säugetierzelle ausgedrücktes Peptid entsprechend einem der Punkte 13 oder 14.

16. Ein aus einem transformierten oder transfizierten Mikroorganismus hergestelltes Polypeptid mit der in Abb. 23 dargestellten Aminosäurensoquenz oder einem Analog, einer Mutante, einem Fragment oder einem Homolog dieses Polypeptids mit Minactivin identischer immunologischer oder biologischer Aktivität.

17. Ein für den Nachweis und die Definition von Tumorabgrenzungen in histologischen Proben oder in vivo geeignetes Reagens mit aus markierter, rekombinanter DNS abgeleitetem Minactivin mit der in Abb. 23 dargestellten Aminosäurensequenz oder einem Fragment, Analog, Homolog oder einer Mutante hiervon mit Minactivin identischer immunologischer oder biologischer Aktivität.

18. Eine therapiefähige, diagnosefähige oder prophylaktische Verbindung mit einem Polypeptid entsprechend einem der Punkte 12 bis 16 oder einem Antikörper hierzu sowie einem pharmazeutisch akzeptablen, nichttoxischen Träger oder Verdünner.

19. Eine synthetische Oligonucleidsonde mit einer ersten Nucleotidsequenz, die nach Translation und Expression die Aminosäurensequenz eines Polypeptids entsprechend einem der Punkte 12 bis 16 codiert.

20. Eine Formel mit einer synthetischen Oligonucleotidsonde entsprechend Punkt 19 sowie einem akzeptablen Träger oder Verdünner.

21. Ein gegen rekombinantes Minactivin, gereinigtes Minactivin oder eines der in Punkten 12 bis 16 beschriebenen Polypeptide hergestellter Antikörper.

22. Ein Verfahren zur Herstellung einer cDNS-Sequenz mit einer DNS-Sequenz entsprechend Punkt 1, das folgendes beinhaltet:

(a) Gewinnung von RNS aus eukaryoten Zellen,

(b) Isolation von mRNS aus dieser RNS;

(c) Synthese doppelsträndiger, zu den mRNS-Sequenzen komplementärer DNS- Sequenzen;

(d) Insertion der DNS-Sequenzen in einen sich autonom replizierenden Klonvektor zur Bildung eines rekombinanten Klonvektors;

(e) Transförmation der Hostzelle durch den rekombinanten Klonvektor;

(f) Selektion der transformierten Hostzellen, in die die DNS-Sequenz Codes für Minactivin selbst bzw. ein Minactivin-Analog, -Fragment, -Homolog oder eine Minactivin-Mutante mit Minactivin identischer immunologischer oder biologischer Aktivität eingelagert hat und

(g) Identifizierung der eingelagerten DNS-Sequenzen im Klonvektor der transformierten Hostzellen.

23. Ein Verfahren zur Herstellung einer cDNS-Sequenz mit einer DNS-Sequenz entsprechend Punkt 1 sowie Expression dieses Moleküls in einem rekombinanten Host, wobei das Verfahren folgendes beinhaltet:

(a) Isolation von mRNS aus einer geeigneten Zell-Linie;

(b) Aufbau von cDNS-Bibliotbeken aus mRNS;

(c) Klonierung der cDNS-Bibliotheken unter (b) in einen geeigneten Host und

(d) Identifizierung der diese cDNS enthaltenden Klone.

24. Ein Verfahren entsprechend Punkt 23, bei dem E. coli oder Bakieriophage λ als Host dienen.

25. Ein Verfahren entsprechend Punkt 23 oder 24, bei dem die Klone auf folgende Weise identifiziert werden:

(a) hybridselektive Translation;

(b) Hybridisierung zu einer chemisch synthetisierten DNS-Sequenzsonde;

(c) differentieue Hybridisierung unter Verwendung markierter, aus induzierter und nichtinduzierier mRNS hergestellter cDNS;

(d) immunologisches Screening von cDNS-Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern gegen Minactivin oder sonstige, immunologisch verwandte Moleküle und/oder

(e) Screening von cDNS-Expressionsbibliotheken nach biologischer Aktivität unter Venwendung von Urokinase und/oder markierter Urokinase und Urokinase-Antikörpern.

26. Ein Verfahten entsprechend Punkt 25, wobei die DNS-Sonde den Anforderungen von Punkt 19 entspricht.

27. Ein Verfahren entsprechend einem der Punkte 23 bis 25, bei dem zusätzlich das geklonte Gen durch die Schaffung von cDNS-Bibliotheken unter Verwendung von aus partiellen Minactivin-Gensequenzen hergestellten Oligonucleotid-Primern extendiert wird.

28. Ein Verfahren zur Herstellung von cDNS mit einer DNS-Sequenz entsprechend Punkt 1 sowie Expression dieses Moleküls in einem rekombinanten Host, wobei das Verfahren folgendes beinhaltet;

(a) Induktion einer Zell-Linie zur stimulierten Minactivin-Produktion und -Expression;

(b) Isolierung von mRNS aus der entsprechenden Zell-Linie;

(c) in vitro-Translation der mRNS und Immunpräzipitation des Minactivin- Translationsprodukts durch Komplexbildung mit Urokinase;

(d) Fraktionierung der mRNS aus (b) und Identifizierung der Minactivin- Translationsaktivität enthaltenden Fraktion;

(e) Aufbau von cDNS-Bibliotheken aus der mRNS aus (b) und (c);

(f) Klonierung der cDNS-Bibliotheken aus (e) zu geeigneten Hosts;

(g) Identifizierung der das Minactivin-Gen enthaltenden Klone durch:

(1) hybridselektive Translation unter Verwendung von (c);

(2) Hybridisierung zu einer chemisch synthetisierten DNS-Sequenzsonde;

(3) differentielle Hybridisierung unter Verwendung markierter, aus induzierter und nichtinduzierter mRNS hergestellter cDNS;

(4) immunologisches Screening der cDNS-Expressionsbibliotheken unter Verwendung von Antikörpern gegen Minactivin oder sonstige, immunologisch verwandte Moleküle und/oder

(5) Screening der cDNS-Expressionsbibliotheken nach biologischer Aktivität unter Verwendung markierter Urokinase oder Urokinase und Urokinase- Antikörpern;

(h) Ausbau der klonierten cDNS durch Schaffung von cDNS-Bibliotheken unter Verwendung von aus partiellen Minactivin-Gensequenzen hergestellten Oligonucleotidprimern;

(i) Bestimmung der Nucleotidsequenz des Minactivin-Gens:

(j) Expression des Minactivin-Gens in E. coli;

(k) Expression biologisch aktiven, rekombinanten Minactivins durch Klonierung zu alternativen Hosts und/oder

(1) Reinigung rekombinanten Minactivins und klinische Beurteilung dessen biologischer Eigenschaften.

29. Ein Verfahren entsprechend Punkt 28, bei dem E. coli oder Bakteriophage λ als Host dienen.

30. Ein Verfahren entsprechend Punkt 28 oder 29, wobei die DNS-Sonde den in Punkt 20 gestellten Anforderungen entspricht.

31. Ein Verfahren entsprechend einem der Punkte 28 bis 30, wobei eine eukaryote Zelle als alternativer Host dient.

32. Ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNS-Moleküls entspechend Punkt 4 oder 5, wobei das Verfahren die Kombination von Vektor-DNS mit einer DNS- Sequenz entsprechend einem der Punkte 1 bis 3 beinhaltet.

33. Ein Verfahren entsprechend Punkt 32, bei dem zusätzlich eine Expressions- Steuersequenz in die Vektor-DNS eingelagert wird.

34. Ein Verfahren zur Host-Transformation, das die Einlagerung eines rekombinanten DNS-Moleküls entsprechend den Anforderungen eines der Punkte 4 bis 7 in den Host beinhaltet.

35. Ein Verfahren zur Herstellung eines den Anforderungen von Punkt 12 genügenden, nicht glycosylierten Polypeptids, wobei das Verfahren folgendes beinhaltet:

(a) Extraktion der genetischen Information zur Minactivin-Biosynthese unter Verwendung von mRNS aus Zellen monozytärer Herkunft;

(b) Einlagerung des entstehenden Gens in einen Mikroorganismus;

(c) Selektion und Kultur des Mikroorganismus zur Herstellung nicht glycosylierten Polypeptids und

(d) Gewinnung des nicht glycosylierten Polypeptids.

36. Ein Verfahren zur Herstellung eines den Anforderungen von Punkt 12 entsprechenden Polypeptids, das folgendes beinhaltet:

(a) Kultur eines Hosts, der mittels eines rekombinanten DNS-Moleküls transformiert wurde, das eine als Codiersequenz für die Aminosäuresequenz des Human-Minactivins fungierende DNS-Sequeuz beinhaltet und

(b) Gewinnung des Polypeptids.

37. Ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen Oligonucleotidsonde entsprechend den Anforderungen von Punkt 19, das folgendes beinhaltet:

(a) Bestimmung der Aminosäurensequenz von aus gereinigtem Minactivin abgeleiteten Peptidfragmenten und Synthese entsprechender Oligonudeotide.

38. Ein zum Nachweis und zur Definition von Tumorabgrenzungen in histologischen Proben geeignetes Verfahren unter Verwendung von sinnvoll markierten, rekombinanten oder homogenen Polypeptiden entsprechend Punkt 12 mit nachfolgender Abbildung zur Ortsbestimmung der Markerkonzentration.

39. Ein Verfahren zur Kontrolle chronischer Entzündung, das den Nachweis von Minactivin in einer Probe menschlicher Körperflüssigkeit und menschlichen Gewebes unter Verwendung eines Antikörpers ensprechend Punkt 21 beinhaltet.

40. Ein Verfahren zum Nachweis menschlicher Karzinome und entzündlicher Krankheiten oder einer Anfälligkeit hierfür, das den Einsatz einer Verbindudg entsprechend Punkt 19 in einem in vitro-Assay zum Nachweis der DNS-Codierung für Minactivin beinhaltet.