JPH03133380A - ヒトトロンボモジュリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、新規なヒトトロンボモジュリン誘導体および
該誘導体をコートしているＤＮＡ化合物を提供するもの
である。また、本発明は、組換えＤＮＡベクターおよび
該ベクターで形質転換した宿主細胞をも提供するもので
ある（この宿主細胞は上記の新規タンパク質を産生させ
るのに有用である）。本発明のトロンボモジュリン誘導
体は独特の性質を有しており、これが本誘導体を抗凝固
薬として特に適切なものにし、そして血栓の治療または
予防に有用なものにする。

【従来の技術】

本発明の理解を助けるため、凝固酵素系の簡単な説明を
以下に挙げる。凝固系（「カスケード」と呼ばれること
もある）は、最終的には酵素トロンビンの生成に導く酵
素前駆体の活性セリンプロテアーゼへの連続的な活性化
を包含する連鎖反応ととらえるのが最も良い。トロンビ
ンは限定されたタンパク質加水分解によって、血漿フィ
ブリノーゲンを不溶性のゲルであるフィブリンに変換す
る。この凝固カスケード中の２つの重要な現象は、凝固
因子ｒＸａによる凝固因子ＸのＸａへの変換、および凝
固因子Ｘａによるプロトロンビンのトロンビンへの変換
である。 これら両反応は細胞表面、特に血小板表面で起こり、両
反応は補助因子を必要とする。主要な補助因子（因子Ｖ
および■）は比較的不活性な前駆体として循環している
が、最初の数個のトロンビン分ヂが生成すると、限定さ
れたタンパク質加水分解によってトロンビンが補助因子
を活性化する。 この活性化された補助因子Ｖａおよび■ａは、約５オー
ダーの強さで、プロトロンビンのトロンビンへの変換お
よび因子Ｘの因子Ｘａへの変換の両方を促進する。 活性化されたプロティンＣは２種類の血漿タンパク質基
質に圧倒的な選択性を有し、これを加水分解し、不可逆
的に破壊する。これらの血漿タンパク質基質は、活性化
された形態の凝固補助因子Ｖおよび■（それぞれ、補助
因子Ｖａおよび■ａ）である。活性化されたプロティン
Ｃは、不活性な前駆体、凝固因子Ｖおよび■を最少に分
解するにすぎない。イヌにおいては、活性化されたプロ
ティンＣが、主要な生理学的フィブリン溶解酵素である
組織プラスミノーゲン活性化因子の循環レベルを急激に
増加させることがわかっている。活性化されたプロティ
ンＣがヒト全血中のフィブリンの溶解を促進することが
インビトロで示されており、最近の実験は、この作用が
組織プラスミノーゲン活性化因子の阻害物質との相互作
用によって媒介されていることを示唆している。従って
、活性化されたプロティンＣは、インビボにおける重要
な抗血栓物質であり、そしておそら（はフィブリン溶解
物質である。 シカし、プロティンＣの活性化には、凝固カスケードに
おける最終的なセリンプロテアーゼであるトロンビン、
および内皮細胞膜結合の糖タンパク質であるトロンボモ
ジュリンが関与している。 トロンボモジュリンは、トロンビンと１：１の強固な化
学量論的なコンプレックスを形成する。トロンビンとコ
ンプレックス化したときのトロンボモジュリンは、トロ
ンビンの機能的な性質を実質的に変化させる。凝固経路
におけるトロンビンは、通常、フィブリノ−゛ゲンを凝
固させ、血小板を活性化し、そして凝固補助因子Ｖおよ
び■をそれらの活性化された形態であるＶａおよび■ａ
に変換する。トロンビンは単独でプロティンＣを活性化
するように働くが、それは極めて遅く、非効率なもので
あるにすぎない。対照的に、トロンボモジュリンとｌ：
１のコンプレックスにあるときのトロンビンは、フィブ
リノーゲンを凝固させず、血小板を活性化せず、また、
凝固因子Ｖおよび〜１をそれらの活性化された形、態に
変換しない。トロンビン：トロンボモジュリンのコンプ
レックスはプロティンＣの活性化を促進し、プロティン
Ｃ活性化の速度定数は、トロンビン単独のものと比較す
るとトロンビン：トロンボモジュリンコンブレソクスの
方が２０．０００倍大きい。 従って、活性化されたプロティンＣは、池の抗凝固薬、
例えばヘパリン、および経口ヒドロキシクマリン型抗凝
固薬、例えばワルファリンなどよりも広い治療学的イン
デックスを有する抗血栓薬である。プロティンＣも活性
化されたプロティンＣも、ある局所部位にトロンビンが
生成するまでは有効ではない。凝固因子ＶをＶａに、そ
して■を■ａに変換するのにトロンビンが必要とされる
ので、活性化されたプロティンＣはトロンビンが存在し
ないと実質的には有効ではない。既述のように、これら
２種類の補助因子の活性化された形態は、活性化された
プロティンＣの好ましい基質である。患者に注入したと
きにプロティンＣ酵素前駆体は、トロンビンが生成して
トロンホモシュリンとコンプレックス化するまでは不活
性のままであろう。トロンボモジュリン；トロンビンの
コンプレ・ノクスが存在しないと、プロティンＣ酵素前
駆体は活性化されたプロティンＣに変換されない。 現在ではヒトプロティンＣの組換え発現か可能であるが
［米国特許Ｎ　ｏ、　４．７５５．６２４（１９８８年
１０月４日発行）を参照］、トロンビン：トロンボモジ
ュリンコンフレノクスによるその活性化のインビボでの
コントロールは、効率的なプロティンＣ活性化の必須成
分であるトロンボモジュリンが有意なｌで入手できなか
ったので、制限されていた。特に、トロンホモシュリン
は最近まで、不活性化されたトロンビンをアガロースに
固定させるアフィニティークロマトグラフィーを包含す
る多工程の精製法によって少量だけが精製されるにすぎ
ながった［エスモン等（Ｅｓｍｏｎ、Ｎ、Ｌ、　ｅｔ　
ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２５７８５９（
１９ｇ２））　；スズキ等（Ｓｕｚｕｋｉ、に、　ｅｔ
　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ、　８１１！２．３４３（１９８６））　；および
マルヤマ等（Ｍａｒｕｙａｍａ、　１．　　ｅｔ　ａｌ
、　、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　７
５．９８７（１９８５））を参照］。トロンボモジュリ
ンはそのトランスメンブランドメインを介して細胞膜に
強固に結合しく後記を参照）、変性原およびデタージエ
ントに対して比較的安定であり、そして外因性の抗血栓
物質として臨床的に有用であるためには十分な溶解性を
欠いているので、精製は一層複雑なものになっている。 さらに、ラン　トロンボモジュリンの大部分の最近ノク
ローニングおよび配列決定［ジャ、ブラン（Ｊａｃｋｍ
ａｎ、　Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、
　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳＡ）、　８３．８８３４（１９８
６））］の前には、トロンボモジュリンの構造は全く不
明であった。ヒト　トロンボモジュリンの全遺伝子配列
が今報告された。また、ヒトゲノムはトロンボモジュリ
ン遺伝子の１個のコピーだけを含有し、それはヒト染色
体２０上に存在している。さらに研究が行われて、この
遺伝子がイントロンを全く含有していないことがわかり
、このことはトロンホモシュリンをコードしているｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡが同一であることを示唆４３５
０（１９８７））　；スズキ等（Ｓｕｚｕｋｉ、ｅｔ　
ａｌ、、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　６．１８
９１（１９８７））　：およびジ’ｒ　ツクマン等（Ｊ
ａｃｋｍａｎ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）。 ８４、６４２５（１９８７乃を参照］。 この情報は、ヒト　トロンボモジュリンの基本的な構造
の決定を可能にした。分析によって、ヒト　トロンボモ
ジュリン（ヒトＴＭ）は、シグナルペプチド部分（１６
，１８または２１残基の長さであると報告されている）
を含む５７５アミノ酸のタンパク質として合成されるこ
とが示された［それぞれ、ジャックマン等（Ｊａｃｋｍ
ａｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ。 ｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ
）、　８４．６４２５（１９８７））　ニジライ等（Ｓ
ｈｉｒａｉ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、、１０３．２８１（１９８ｇ））；およびウェン等Ｑ
ｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、　；上記）］。シグナルペプチド
部分に続いて、ヒトＴＭは、アミノ末端から連続して次
のドメインまたは領域を含有している：１）アミノ末端
ドメイン（〜２２３−２２６アミノ酸残基）；２）６つ
のＥＧＦ（表皮成長因子）様の構造（ＥＧＦ−相同領域
とも呼ばれる；〜２３６−２４０アミノ酸残基）；３）
いくつかの可能性あるＯ−グリコジル化部位が存在して
いるセリン／トレオニン豊富領域（〜３４−３７アミノ
酸残基）　；　４）　トランスメンブラン領域（〜２３
−２４アミノ酸残基）：および５）細胞質ドメイン（〜
３６−３８アミノ酸残基）。当業者なら、ここに挙げた
アミノ酸残基の範囲は、特定のドメインまたは領域が始
まり、そして終わるところの不明確さの結果であること
か理解されよう。これらの範囲は、それぞれのドメイン
または領域の長さについて文献に報告されている様々な
値を示すものである［例えば、スズキ等（Ｓｕｚｕｋｉ
、に、　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ、　６．１８９１（１９８７）　：ウェン等（Ｗｅｎ
、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　；」二記））を参照］。従って
、本明細書で用いる際には、［Ｎ−末端領域またはドメ
イン」、「表皮成長因子相同領域またはドメイン」、「
セリン／トレオニン−豊富領域またはドメイン」、［ト
ランスメンブラン領域またはドメインＪ、および「細胞
質領域またはドメイン」は、それぞれの領域またはドメ
インについて上に挙げたおよそのアミノ酸残基の範囲を
指している。さらに、インビボでのプロセッシングは、
発現している形質転換された宿主細胞に依存して変化す
ることが予想されるので（特に、真核宿主細胞と比べた
ときの原核宿主細胞）、「Ｎ−末端領域またはドメイン
」なる用語はヒト　トロンホモシュリンのシグナルペプ
チドまたはその一部を含んでいることもある。 野生型トロンボモジュリン中のトランスメンブラン領域
のゆえに、この分子は細胞膜中に保持される。その結果
、このタンパク質の精製は望ましくないデタージェント
の使用を必要とする。さらに、天然の供給源から得られ
る精製された物質が少量であることは、臨床的に有用な
付加的な抗凝固薬または抗血栓薬として野生型のトロン
ボモジュリンを使用することを大きく妨げる。

【発明が解決しようとする課題】

本発明は、組換えＤＮＡ法によって製造されうる可溶性
のトロンボモジュリン誘導体を提供することによってこ
れらの困難を克服するものである。 これらの誘導体は、実質的に無制限の量で得ることがで
き、取扱いが容易であり、臨床的に有用な望ましい性質
を備えている。即ち、これらの誘導体は、血栓の治療お
よび予防にこれまで利用することができなかった手段を
臨床医に提供するであろう。本発明によって提供される
タンパク質の性質および利点を以下に詳しく説明する。 上で定義した用語に加えて、本明細書に開示した発明の
ために以下の用語を定義する。 ＡＤ２ＬＰ　：アデノウイルスー２の後期プロモーター 抗生物質：微生物によって産生される物質であって、天
然に、または限定された化学修飾を伴って、別の微生物
または真核細胞の増殖を阻害するか、またはこれらを死
滅させる物質。 抗生物質耐性付与遺伝子；抗生物質に対する耐性を付与
する活性をコードしているＤＮＡセグメント。 Ａｐｔ：アンピシリン耐性の表現型またはアンピシリン
耐性を付与する遺伝子。 ＢＫ：ヒトパポバウイルス　ＢＫウィルス由来（７）Ｂ
Ｋエンハンサ−要素であり、このエンハンサ−はあるプ
ロモーターからの転写のレベルを増大させることができ
る。 ｄｈｆｒ　：　ｄｈｆｒ−細胞における選択マーカーと
して有用なジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子であり、これを
用い、宿主細胞を漸増レベルのメトトレキセートに暴露
することによってＤＮＡセグメントを増幅（ＤＮＡセグ
メントのコピー数の増加）することができる。 ＥＰ：Ｔ−抗原（Ｆ）遺伝子のＳＶ４０初期プロモータ
ー、Ｔ−抗原結合部位、およびＳＶ４０の復製起源を含
有するＤＮＡセグメント。 真核性プロモーター：真核細胞中でプロモーターとして
機能するあらゆるＤＮＡ配列。 宿主細胞：組換えＤＮＡベクターで形質転換することが
できる原核生物および真核生物を含む生物。この用語に
は、哺乳動物細胞、ならびに生存プロトプラスト（例え
ば、ストレプトマイセスのプロトプラスト）が含まれる
が、これらに限定はされない。 Ｈｍ’：ハイグロマイシン耐性の表現型またはハイグロ
マイシン耐性を付与する遺伝子。 ＩＶＳ：イントロンをコードしているＤＮＡであり、介
在配列とも呼ばれる。 ＭＣ５：多重クローニング部位であり、ポリリンカーと
も呼ばれる。 ｏｒｉ　ニブラスミドの複製起源。 ｐＡ：ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮＡ
配列。 プロモーター：　ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。 組換えＤＮＡベクター：あらゆる組換えＤ　Ｎ　Ａクロ
ーニングベクターまたは発現ベクター組換えＤＮＡクロ
ーニングベクター＝１またはそれ以上の別のＤＮＡセグ
メントを付加したか、または付加することができるＤＮ
Ａ分子からなる、自律的に複製するか、または染色体に
組込まれるあらゆる媒体。この用語には、プラスミド、
コスミドおよびファージベクターが含まれるが、これら
に限定はされない。 組換えＤＮＡ発現ベクター：ベクターの一部であるＤＮ
Ａ分子またはベクターに挿入することが可能なりＮＡ分
子を発現させることができる、プロモーターを含有する
あらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター レプリコン二組換えＤＮＡベクターの自律的なｗｌ製を
可能にし、それを制御するＤＮＡ配列。 制限フラグメント：ｌまたはそれ以上の制限酵素の作用
によって生成したあらゆる直線状のＤＮ八へ 感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物の存在下では、それらに対する耐性を付与するＤＮＡ
セグメントがないと増殖することができない宿主細胞。 形質転換、受容宿主細胞（その生存プロトプラストを含
む）へのＤＮＡの導入であり、それによって受容細胞の
遺伝子型が変化する。 形質転換体二形質転換を受けた受容宿主細胞。 酵素前駆体　タンパク質加水分解酵素の酵素的に不活性
な前駆体。 第１図は、ｐｈｄＴＭＤｌの構築の概略を示す工程図で
あり、 第２図は、プラスミドｐＵＣ１８の制限部位および機能
地図の模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＵ　Ｃｌ　８Ｔ　Ｍ　１ｉｎｋ
ｅｒの制限部位および機能地図の模式図であり、第４図
は、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭの制限部位および機能地
図の模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤＩの制限部位お
よび機能地図の模式図であり、第６図は、プラスミド１
）ｈｄの制限部位および機能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｈｄＴＭＤ１の制限部位および
機能地図の模式図である。 当業者なら、添付の図面がほぼ縮尺して描かれているこ
とは理解されよう。地図上の制限部位の間隔は正確では
なく、ベクター上の実際の制限部位が計算した距離と若
干前なっていることもある。 この地図は、あるベクター上の全ての制限部位を完全に
挙げるものではない。これらの図面は、本発明の理解を
助けるために挙げたものである。

【課題を解決するための手段】

本発明は可溶性のヒトトロンボモジュリン誘導体を提供
するものであり、この誘導体は、Ｎ−末端から順に、ヒ
トトロンボモジュリンのａ）Ｎ−末端領域； ｂ）表皮成長因子相同領域；および Ｃ）セリン／トレオニン豊富領域 を含有するアミノ酸配列であり、このアミノ酸配列はヒ
トトロンボモジュリンのトランスメンブランおよび細胞
質ドメインを欠いており、また、該アミノ酸配列をコー
ドしている組換えＤＮΔベクターで形質転換したＡＶ１
２または２９３宿主細胞から得られる。 本発明の好ましい態様においては、可溶性トロンボモジ
ュリン誘導体のアミノ酸配列は、プラスミドｐＵＣ１８
ＴＭＤｌまたはプラスミドｐｈｄＴＭＤＩのトロンボモ
ジュリン誘導体暗号化配列によってコードされているア
ミノ酸配列である。 この好ましい態様では、可溶性トロンボモジュリン誘導
体のアミノ酸配列は以下の配列で示されＣｙｓＡ　ｓｐ
Ｇ　１ｙＬｅｕＡｒｇＧ　１ｙＨｉ　ｓ　ＬｅｕＭｅ　
ｔＴｈ　ｒＶａ　ＩＡ　ｒｇＳｅ　ｒＳｅｒＶａ　ＩＡ
ｌａＡｌａＡ　ｓ　ｐＶａ　Ｉ　Ｉ　ｌ　ｅＳ　ｅ　ｒ
ＬｅｕＬｅ　ｕＬｅ　ｕＡ　ｓ　ｎＧｌｙＡｓ　ｐＧｌ
ｙＧｌｙＶａ　ＩＧｌｙＡｒｇＡｒｇＡ　ｒｇＬｅｕＴ
ｒｐ　Ｉ　１ｅＧ１ｙＬｅｕＧ　１　ｎＬｅｕＰｒｏＰ
　ｒｏＧｌｙｃｙｓ　ＧｌｙＡｓｐＰｒｏＬｙｓＡ　ｒ
ｇＬｅｕＧ　１ｙＰ　ｒｏＬｅｕＡ　ｒｇＧｌｙＰｈｅ
ＧｌｎＴｒｐＶａ　ｌＴｈ　ｒＧｌｙＡｓｐＡｓ　ｎＡ
ｓ　ｎＴｈ　ｒｓｅ　ｒＴｙｒＳｅ　ｒＡｒｇＴｒｐＡ
ｌａＡ　ｒｇＬｅｕＡｓ　ｐＬｅｕＡｓｎＧｌｙＡｌ　
ａ　Ｐ　ｒｏＬｅｕｃｙｇ　ＧｌｙＰ　ｒｏＬｅｕＣｙ
ｓＶａ　ＩＡｌａＶａ　ＩＳｅ　ｒＡ　１ａＡ　１　ａ
　ＧｌｕＡ　１　ａＴｈ　ｒＶａ　ＩＰ　ｒｏｓｅｒＧ
ｌｕＰ　ｒｏ　Ｉ　１ｅＴｒｐＧ１ｕＧ　１　ｕ　Ｇ　
ｌｏＧ　１ｎＣｙｓ　Ｇ　ｌ　ｕＶａ　ＬＬｙｓ　Ａｌ
　ａＡｓ　ｐＧ　ＬｙＰｈｅＬｅｕＣｙｓ　ＧｌｕＰｈ
ｅＨｉ　５ＰｈｅＰ　ｒｏＡｌ　ａ　Ｔｈ　ｒＣｙｓ　
ＡｒｇＰ　ｒｏＬｅｕＡ　１ａＶａ　ＩＧｌｕＰ　ｒｏ
ＧｌｙＡ　１ａＡ１ａＡ　１ａＡｌ　ａＡｌ　ａＶａ　
ＬＳｅ　ｒ　Ｉ　１ｅＴｈ　ｒＴｙ　ｒＧｌｙＴｈ　ｒ
Ｐ　ｒｏＰｈｅＡｌａＡｌ　ａＡ　ｒｇＧｌｙＡｌａＡ
ｓｐＰｈｅＧｌｎＡ　ｌａ　ＬｅｕＰ　ｒｏＶａ　ＬＧ
ｌｙＳｅ　ｒｓｅ　ｒＡｌａＡｌａＶａ　１Ａ１ａ　Ｐ
ｒｏＬｅｕＧ　ｌｙＬｅｕＧｌｎＬｅｕＭｅｔＣｙｓＴ
ｈ　ｒＡｌａ　ＰｒｏＰ　ｒｏＧＬｙＡｌａＶａ　ＩＧ
ｌｎＧｌｙＨｉ　５ＴｒｐＡ　ｌａＡ　ｒｇＧｌｕＡ　
ｌａ　ＰｒｏＧｌｙＡｌａ　ＴｒｐＡｓｐＣｙｓ　Ｓ　
ｅ　ｒＶａ　ＩＧｌｕＡｓｎＧ　１ｙＧ１ｙＣｙｓＧ１
ｕＨｉｓＡｌａＣｙｓＡｓｎＡ　ｌ　ａ　Ｉ　１ｅＰｒ
ｏＧ１ｙＡ　ｌａ　ＰｒｏＡｒｇＣｙｓＧｌｎＣｙｓＰ
ｒｏＡｌａ　ＧｌｙＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｎＡｌａＡ
ｓ　ｐＧｌｙＡｒｇｓｅｒｃｙｓＴｈｒＡｌ　ａＳｅ　
ｒＡｌａＴｈｚＧｌｎｓ　ｅ　ｒＣｙｓＡｓ　ｎＡ　５
ｐＬｅ　ｕＣｙｓ　Ｇ　１ｕ）ｌ　ｉ　ｓ　ＰｈｅＣｙ
ｓ　Ｖａ　１ＰｒｏＡ　ｓ　ｎＰ　ｒｏＡ　５ｐＧ１ｎ
Ｐ　ｒｏＧｌｙｓｅ　ｒＴｙｒＳｅ　ｒｃｙｓＭｅ　ｊ
Ｃｙｓ　ＧｌｕＴｈｒＧｌｙＴｙｒＡｒｇＬｅｕＡｌａ
ＡｌａＡｓｐＧｌｎＨｉｓＡ　ｒｇＣｙｓＧｌ　ｕＡｓ
ｐＶａ　ＩＡｓｐＡｓｐＣｙｓ　Ｉ　ｌ　ｅＬｅｕＧｌ
ｕＰ　ｒｏＳｅ　ｒＰ　ｒｏｃｙｓＰ　ｒｏのｎＡｒｇ
ＣｙｓＶａ　ＩＡｓ　ｎＴｈ　ｒＧｌｎＧ　１ｙＧ１ｙ
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　ＧｌｙＰ　ｒｏＡｓｐＳｅ　ｒＡ　ｌａ　ＬｅｕＡ　
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ｓｐＧ１ｙＧｌｙＡｓ　ｐＳｅ　ｒＧ　１ｙＳｅ　ｒＧ
ｌｙＧｌｕＰｒｏＰｒｏＰｒｏＳｅ　ｒＰｒｏＴｈｒＰ
ｒｏＧｌｙＳｅｒＴｈｒＬｅｕＴｈｒＰｒｏＰｒｏＡｌ
　ａＶａ　ＩＧｌｙＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒ−Ｃｏｏ
ｌ（［配列中、Ａｌａはアラニン１．Ａｒｇはアルギニ
ン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、
Ｃｙｓはシスティン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグ
ルタミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、
１１ｅはインロイメン、ＬｅＵはロイシン、Ｌｙｓはリ
ジン、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン
、Ｐｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオ
ニン、Ｔｒｐはドリフトファン、Ｔｙｒはチロシン、お
よびＶａｌはバＩＪ　７であり ＲはＭｅｔＬｅｕＧｌｙＶａｌＬｅｕＶａｌＬｅｕＧ］
ｙＡｌａＬｅｕＡＩａＬｅｕＡｌａＧＩｙＬｅｕＧｌｙ
−であり Ｒ’はＰｈｅＰｒｏ−てあり・ Ｘは０または１であり； ｙはＯまたはｌである（たたし、ｙかＯであるときはＸ
は０てなければならず、Ｘか１であるときはｙはｌでな
ければならない）１゜ 本発明の特に好ましい態様ては、可溶性トロンボモジュ
リン誘導体のアミノ酸配列は以下の配列でホされる Ｈ２Ｎ−Ａ　ｌａ　Ｐ　ｒｏＡ　ｌａ　Ｇ　１ｕＰ　ｒ
ｏＧｌ　ｎＰｒｏＧｌｙＧｌｙｓｅ　ｒＧｌ　ｎＣｙｓ
Ｖａ　ＩＧｌｕＨｉ　５ＡｓｐＣｙｓＰｈｅＡ　Ｌａ　
ＬｅｕＴｙｒＰ　ｒｏＧｌｙＰ　ｒｏＡ　１ａＴｈ　ｒ
ＰｈｅＬｅｕＡｓｎＡ　１ａＳｅ　ｒＧｌｎＩ　１ｅｃ
ｙｓＡｓ　ｐＧ　１ｙＬｅｕＡ　ｒｇＧｌｙＨｉ　ｓ　
ＬｅｕＭｅ　ＬＴｈｒＶａ　ＩＡ　ｒｇＳｅ　ｒＳｅ　
ｒＶａ　１ＡｌａＡ１ａＡｓｐＶａ　Ｉ　Ｉ　１ｅＳｅ
　ｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡｓｎＧｌｙＡｓｐＧｌｙＧｌ
ｙＶａ　１Ｇ１ｙＡ　ｒｇＡｒｇＡ　ｒｇＬｅｕＴ　ｒ
ｐ　Ｉ　１ｅＧ１ｙＬｅｕＧ１ｎＬｅｕＰｒｏＰ　ｒｏ
Ｇ　１ｙｃｙｓＧ　１ｙＡｓｐＰｒｏＬｙｓＡ　ｒｇＬ
ｅｕＧｌｙＰ　ｒｏ　ＬｅｕＡ　ｒｇＧｌｙＰｈｅＧｌ
ｎＴ　ｒｐＶａ　ＩＴｈ　ｒＧｌｙＡｓｐＡｓ　ｎＡｓ
　ｎＴｈｒｓｅ　ｒＴｙｒＳｅ　ｒＡ　ｔ　ｇＴ　ｒｐ
Ａ　１　ａ　ＡｒｇＬｅｕＡ　ｓ　ｐ　ＬｅｕＡｓ　ｎ
Ｇ　１ｙＡ　１　ａ　Ｐ　ｒｏＬｅｕｃｙｓＧｌｙＰ　
ｔｏＬｅｕｃｙｓＶａ　ＩＡ　１ａＶａ　１ｓｅｒＡ　
１　ａＡｌａ　ＧｌｕＡｌａＴｈｒＶａ　１Ｐｒｏｓｅ
　ｒＧｌｕＰ　ｒｏ　Ｉ　１ｅＴｒｐＧ１ｕＧ　１　ｕ
ＧｌｎＧｌ　ｎＣｙｓ　Ｇｌ　ｕＶａ　１ＬｙｓＡ　ｌ
ａ　Ａｓ　ｐＧｌｙＰｈｅＬｅｕｃｙｓ　ＧｌｕＰｈｅ
ＨｉｓＰｈｅＰ　ｒｏＡ　１　ａ　Ｔｈ　ｒＣｙｓＡ　
ｒｇＰ　ｒｏＬｅｕＡ　ｌａ　Ｖａ　Ｉ　ＧｌｕＰ　ｒ
ｏＧｌｙＡｌ　ａＡ　１ａＡｌａＡ１ａＡ１ａＶａ　ｌ
　Ｓ　ｅ　ｒ　Ｉ　ｌ　ｅＴｈ　ｒＴｙｒＧ　１ｙＴｈ
　ｒＰ　ｒｏ　ＰｈｅＡｌ　ａＡｌａＡ　ｒｇＧｌｙＡ
ｌａ　ＡｓｐＰｈｅＧｌｎＡ　ｌａ　Ｌｅ　ｕＰ　ｒｏ
Ｖａ　１Ｇｌｙｓ　ｅ　ｒｓ　ｅ　ｒＡ　ｌａ　Ａｌａ
　Ｖａ　１Ａ１ａＰ　ｒｏＬｅｕＧ　ＬｙＬｅｕＧｌｎ
ＬｅｕＭｅｔＣｙｓＴｈ　ｒＡｌａ　ＰｒｏＰ　ｒｏＧ
ｌｙＡ　ｌａ　Ｖａ　ＩＧｌｎＧＬｙＨｉｓＴｒｐＡｌ
ａＡｒｇＧｌｕＡｌａＰ　ｒｏＧｌｙＡ　ｌ　ａ　Ｔｒ
ｐＡｓｐＣｙｓ　Ｓ　ｅ　ｒＶａ　ＩＧｌｕＡｓ　＋ｘ
Ｇ１ｙＧ１ｙＣｙｓ　Ｇｌ　ｕｎｉ　ｓＡｌ　ａ　Ｃｙ
ｓＡｓｎＡｌ　ａ　Ｉ　ｌｅＰ　ｒｏＧｌｙＡｌ　ａ　
Ｐ　ｒｏＡ　ｒｇＣｙｓ　ＧｌｎＣｙｓ　ＰｒｏＡｌａ
　ＧｌｙＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｎＡｌａＡｓｐＧｌｙ
ＡｒｇＳｅ　ｒＣｙｓＴｈ　ｒＡｌａ　Ｓｅ　ｒＡｌａ
ＴｈｒＧｌｎｓｅ　ｒＣｙｓＡｓ　ｎＡｓｐＬｅｕＣｙ
　ｓ　ＧｌｕＪ（ｉ　ｓ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｖａ　ＩＰ　
ｒｏＡｓ　ｎＰｒｏＡｓ　ｐＧｌｎＰ　ｒｏＧｌｙｓ　
ｅ　ｒＴｙｒＳ　ｅ　ｒＣｙｓＭｅ　ｔＣｙｓ　Ｇｌ　
ｕＴｈ　ｒＧｌｙＴｙｒＡ　ｒｇＬｅ　ｕＡ　１　ａ　
Ａｌａ　ＡｓｐＧｌｎＪ（ｉ　ｓ　Ａ　ｒ　ｇＣｙｓ　
ＧｌｕＡ　ｓ　ｐＶａ　ＩＡ　ｓｐＡ　５ｐＣｙｓ　Ｉ
　１　ｅＬｅｕＧｌ　ｕＰ　ｒｏＳ　ｅ　ｒＰ　ｒｏＣ
ｙｓ　ＰｒｏＧｌｎＡ　ｒｇＣｙｓＶａ　ＩＡ　ｓ　ｎ
Ｔｈ　ｒＧ　１ｎＧ１ｙＧ　１ｙＰｂ　ｅ　Ｇ　１ｕＣ
ｙｓ　Ｘｉ　ｓ　Ｃｙｓ　ＴｙｒＰ　ｒｏＡｓ　ｎＴｙ
ｒＡｓｐ　ＬｅｕＶａ　ＩＡｓ　ｐＧｌｙＧｌｕｃｙｓ
Ｖａ　１Ｇ１ｕＰ　ｒｏＶａ　ＩＡ　ｓｐＰｒｏｃｙｓ
ＰｈｅＡｒｇＡｌａＡｓ　ｎｃｙｓＧｌｕＴｙｒＧ　１
ｎＣｙｓ　ＧｌｎＰ　ｒｏ　ＬｅｕＡｓ　ｎＧ　１　ｎ
Ｔｈ　ｒＳｅ　ｒＴｙｒＬｅｕＣｙｓ　Ｖａ　Ｉ　Ｃｙ
ｓ　Ａ　ｌａ　Ｇｌ　ｕＧｌｙＰｈｅＡｌａＰｒｏｌｌ
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）ＩｅｔＰｈｅＣｙｓＡｓｎＧ　１ｎＴｈ　ｒＡｌ　ａ
Ｃｙｓ　ＰｒｏＡｌａＡｓｐＣｙｓＡｓｐＰ　ｒｏＡｓ
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Ｐ　【ｏＧｌｕＧｌｙＴｙｒＩ　１ｅＬｅｕＡｓｐＡｓ
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ｅＡｓｐＧ　ＬｕＣｙｓ　ＧｌｕＡｓｎＧｌｙＧ　１ｙ
ＰｈｅＣｙｓ　Ｓｅ　ｒＧｌｙＶａ　ＩＣｙｓＨ４５Ａ
ｓｎＬｅｕＰ　ｒｏＧｌｙＴｈ　ｒＰｈｅＧｌｕｃｙｓ
　Ｉ　１ｅＣｙｓＧｌｙＰ　ｒｏＡｓｐＳｅ　ｒＡ　１
ａＬｅｕＡｌ　ａＡｒｇＨｉｓ　Ｉ　１ｅＧ１ｙＴｈ　
ｒＡｓ　ｐ　ＣｙｓＡｓ　ｐＳｅ　ｒＧ　１ｙＬｙｓＶ
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Ｌｙｓ　ｅ　ｒＧｌｙＧｌｙＰ　ｒｏＰｒｏＰｒｏＳｅ
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ｅ　ｕＴｈ　ｒＰ　ｒｏ　Ｐ　ｒｏＡｌａＶａ　ＩＧｌ
ｙＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒ−ＣＯＯＨ ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、＾
ｓｎはアスパラギン、　Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙ
ｓは／スティン、Ｇｉｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、ｌｌ
ｅはインロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン
、Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐ
ｒｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン
、Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、および
Ｍａｌはバリンである１゜ 本発明の好ましい態様では、提供されるトロンボモジュ
リン誘導体が組換え法によって、好ましくはトロンボモ
ジュリン誘導体をコードしている組換えＤＮＡ発現ベク
ターで真核宿主細胞を形質転換し、次いでこの細胞を本
発明の誘導体の発現に適した条件下で培養することによ
って製造されることは理解されよう。この発現ベクター
は、勿論、ＴＭ誘導体をコードしているＤＮＡ配列が発
現のために適切に配置され、かつ翻訳開始部位との関係
で適切な翻訳リーブイブ・フレーム内に配置されるよう
に構築されるべきである。さらに、開始部位は、挿入し
たＤＮＡ配列から導くことができるか、または他の供給
源から導くことができる。この配列は、天然のものであ
るときには、ベクターに対して異種または同種のいずれ
であってもよく、また、構築に用いたプロモーターに対
して同種または異種であってよい。選択のために、この
発現ベクターは）に択マーカーを含有していてよく、形
質転換は、マーカー遺伝子が存在しないと選択に用いる
毒性物質に対して通常は感受性である宿主細胞中であっ
てよい。 この後者の態様、即ち真核細胞での発現においては、お
そらく生成物のグリコジル化が起こるであろう。従って
、本発明は、ポリペプチドが原核微生物の宿主細胞中で
発現するときに予想されるような非グリコンル化形態の
トロンボモジュリン誘導体だけでなく、グリコジル化形
態の誘導体をも提供するものである。本明細書で用いる
「グリコ／ル化」なる用語は、１またはそれ以上の糖部
分の発現タンパク質への付加を意味する。さらに、当業
者なら理解しているように、真核性の発現は宿主細胞か
ら産物が分泌される結果になることが多い（特に、発現
されるポリペプチドのシグナルペプチト部分が存在して
いるとき）。また、その他の生物学的プロセッシング、
例えばＮ−末端ブロッキングもしくはその後の切断、ま
たはおそら（はＣ−末端切断が真核宿主細胞中で起こり
、これが最終発現タンパク質の同定を困難にするであろ
う。従って、本発明の別の好ましい態様では、プラスミ
ドｐＵＣ　ｌ　ｇＴＭＤ　ｌあるいはプラスミドｐｈｄ
ＴＭＤ１のトロンボモジュリン誘導体暗号化配列を含有
する組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換した宿主細胞
を、発現に適した条件下で培養することによって得られ
るポリペプチドを提供するものである。そのようなヒト
トロンホモジュリノ誘導体をコートシているＤＮＡ配列
は、次の配列で示される６ ＣＴＧＧ ＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＣＡＴＧＣＧＣＴ
ＧＴ ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＴＣＧ−３ ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシアデル
、Ｃはデオキンンチジル、そしてＴはチミジルである１
゜ この態様に好ましい宿主細胞は、真核宿主細胞、特に曲
孔動物細胞である。最も好ましい宿主細胞はヒ）２９３
（２９３細胞）または／リアン・ハムスターＡＶ１２−
６６４細胞（ＡＶ１２）である。 この態様では、後記でさらに詳しく説明するように、特
に誘導体が２９３またはＡｖ　１２細胞中で発現された
ときには、２つの形態のポリペプチドか観察された。こ
れらのポリペプチドを高分子量のトロンボモジュリン誘
導体および低分子量のトロンボモジュリン誘導体と命名
した。高分子量の形態は約９５〜約１１０ｋＤ（還元条
件）および杓７６〜９４ｋＤ（非還元条件）の分子量を
有している。無水Ｔ　Ｆ　Ｍ　Ｓ　（トリフルオロメタ
ンスルホン酸）で化学的に脱グリコ／ル化すると［ソン
ヤー等（Ｓｏｊａｒ、ｅｔ　ａｌ、、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２５９．５２（１９８７
戸を参照］、高分子量の形態は２および３時間後にそれ
ぞれ約６８ｋＤおよび６５ｋ［）（ｊｉ元条件下）のタ
ンパク質を与えた。さらに、この形態はフンドロイチナ
ーゼＡＢＣ切断に感受性であり、未処理の形態のレベル
よりも低いレベルでトロンビンの凝固時間を長くするタ
ンパク質を与える。 コンドロイチナーゼ処理に対して感受性であることは、
本発明の高分子量形態の可溶性トロンボモジュリン誘導
体がグリコサミノグリカン部分を有しているかもしれな
いことを示唆している。さらに、この形態は以下に挙げ
る別の性質を有している：即ち ａ）約１．０〜約５．ＱｍＭの最適Ｃａ”濃度；および ｂ）約２．０〜約３．ＯｎＭのトロンビンのＫｄ０低分
子量の形態は約７３〜約７７ｋＤ（還元条件）および約
５８〜６６ｋＤ（非還元条件）の分子量を有している。 ＴＦＭＳ脱グリコジル化を行うと、この形態のトロンボ
モジュリン誘導体は３時間後に約６３〜約６４ｋＤ（還
元条件）のタンパク質を与えた。また、この誘導体は以
下の性質をも有している。即ち ａ）約０，１〜約０．５ｍＭの最適Ｃａ”濃度；オヨび ｂ）約１０．０〜約２５．ＯｎＭのトロンビンのＫｄ。 さらに、本発明によって提供されるのは、ＤＮＡ配列、
組換えＤＮＡベクター、宿主細胞および本発明の所望の
可溶性トロンボモジュリン誘導体の製造方法である。本
発明のこれら別の態様は後記でさらに詳細に定義する。 本発明のトロンボモジュリン誘導体をコードしているＤ
ＮＡ配列は次の配列で示される１１．０ ＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＧＧ
ＣＴＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣ
Ｃｏ３０ ＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＣ
ＡＡＣＴＧＣ ［配列中、Ｒ゛は５−ＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＧ
ＧＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧ
ＧＣＣＴＧＧＧＧ　−３であり；Ｒ１″は　５°−ＴＴ
ＣＣＣＣ−３″であり；ＸはＯまたはｌであり； ｙはＯまたはｌであり（ただし、ｙがＯであるときはＸ
はＯでなければならず、Ｘが１であるときはｙは１でな
ければならない）： Δはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデ
オキシシチジル、そしてＴはチミジルである］。 （以下、余白） ＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣＡＴＴＣＧ−３’　。 既述のように、本発明の誘導体は組換えＤＮＡ法を用い
て製造するのが好ましい。即ち、本発明は新規なりＮＡ
配列、組換えＤＮＡベクターおよび所望の産物を発現さ
せるための宿主細胞を提供するものである。先に記した
ように、可溶性のトロンボモジュリン誘導体を製造する
ための好ましい方法は、所望のＤＮＡ配列を自存する発
現ベクターを有する真核宿主細胞を培養することによる
。 この目的に好ましい組換え発現ベクターはプラスミドｐ
ｈｄＴＭＤｌであり、その制限部位および機能地図は第
７図に示されている。プラスミドｐｈｄＴＭＤ　＋の全
体の構築は第１図の工程図に概略して示した。この構築
のそれぞれの工程を詳しく説明する。 当業者には周知の出発プラスミドであるプラスミドｐＵ
Ｃ］８は、その包含しているＩａｃ遺伝遺伝子内型多重
クローニング部位リリンカー）を含有している組換えＤ
ＮＡクローニングベクターであり、市販品から入手する
ことかできる（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ、　１ｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ、　ＩＮか
ら）。また、当業者はやはり市販品から入手可能なプラ
スミドｐＵＣ１９を用いることもできる。さらに、これ
らのプラスミドはｐＢ　Ｒ３２２由来の複製起１原およ
び修飾されたアンピシリン耐性遺伝子を含有している。 これらのベクターは、２市にｌ肖化されたＤＮＡ制限フ
ラグメントを別々に、そしてＩａｃフロモーターに関し
て所望の配向でクローニングすることを可能にするので
特に有用である。ｐＵＣ１８の制限部位および機能地図
を第２図に示す。 プラスミドｐｈｄＴＭＤ１の製造のための第１図に挙げ
た特定の工程は、ＴＭ誘導体暗号配列内に存在しないい
くつかの制限部位の存在を必要とする。従って、Ｅｃｏ
ＲＩ　−Ｐｓｔ　ｌリンカ−と命名したリンカ−配列を
調製した。制限部位を表示したその配列を以下に示す 第１図および以下の記述から明らかとなるであろうが、
表示した制限部位のそれぞれはプラスミドｐｈｄＴＭＤ
ｌを構築する際に役立つ。 次に、ｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔｌ
で２重消化し、続いて得られたＤＮＡを上記のＥｃｏＲ
Ｉ−Ｐｓｔｌリンカ−と連結することによって、中間ベ
クターのｐＵ　Ｃ１８Ｔ　Ｍ　１ｉｎｋｅｒを調製した
。得られたベクターｐＵ　Ｃ１８ＴＭｌｉｎｋｅｒの制
限部位および機能地図を第３図に示す。 本発明の可溶性トロンボモジュリン誘導体の暗号配列は
、完全なトロンボモジュリン遺伝子をコードしているゲ
ノムＤＮＡから導いた。この遺伝子はヒトゲノムの染色
体２０上に位置しており、イントロンを含まないことが
報告されている［ウェン等（胃ｅｎ　Ｄ、　ｅｔ　ａｔ
、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２６．４３５０
（１９８７））およびジャックマン等（Ｊａｃｋｍａｎ
、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ。 ｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　（ＵＳ
Ａ）、　８４．６４２５（１９８７））を参照」。 ウシトロンボモジュリンＤＮＡ配列［ジャックマン等（
Ｊａｃｋｍａｎ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ■、邦、　
８８３４（１９８６））を参照］に基づいて設計したオ
リゴヌクレオチドプローブを用いて、完全なヒトトロン
ボモジュリン遺伝子を有するクローンＧＨＴＭ３Ａを、
λファージＣｈａｒｏｎ２１　Ａに担持させたヒト染色
体２０ライブラリーがら単離した。 この染色体ライブラリーは、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３０１
　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｃｃｋｖｉｌｌ
ｅＭＤ　２０８５２　；　Ａ　Ｔ　ＣＣ）から受託番号
ＡＴＣＣ５７７１２（Ｉ　Ｄ：７−ドＬＬ２ＯＮＳ０１
）のもとて入手することができる。 得られたときには、ＧＨＴＭ３ＡはＣｈａｒｏｎ　２Ｉ
Ａベクター中にパッケージングされた〜６．４ｋｂのＨ
ｉｎｄｌｌｌフラグメント上に完全なトロンボモジュリ
ン遺伝子を含有していることがゎがった。 従って、完全な暗号領域は、このクローンをＨｉｎｄｍ
制御６エンドヌクレアーゼで処理シ、〜６．４ｋｂの制
限フラグメントを単離することによって得られる。 次いで、ＧＨＴＭ３Ａがらの〜６．４ｋｂの旧ｎｄＩｌ
＋フラグメントを、Ｈ１ｎｄｌｆｌ消化したｐＵＣＩ９
に連結した。得られたプラスミド（プラスミドｐＧＨＴ
Ｍ３Ａと命名ンを単離し、その先の構築に用いた。 ｐｈｄＴＭＤＩ構築の次の工程は、プラスミドｐＧＨＴ
　Ｍ　３　Ａから〜］　、　９　ｋｂのＰｐｕＭＩ制限
フラグメントを得ることを包含している。また、このフ
ラグメントは、ヒトトロンボモジュリン暗号領域の最初
の数個の塩基対を除く全てを含有している。 この失われた対は、以下に説明するように、ｐｃＨＴ　
Ｍ　３　Ａの〜１．９ｋｂ　ＰｐｕＭｒフラグメントを
ＰｐｕＭＪ消化のｐＵ　ＣＩ　８　Ｔ　Ｍ　ｌ１ｎｋｅ
ｒに連結することによって再構築した。しかし、ヒ）Ｔ
Ｍ配列を単離するためのＰｐｕＭ１部位は、ｄｃｍメチ
ラーゼ認識配列５°〜ＣＣＴＧＧ−３°に重なっている
。この配列の内部シトノンのメチル化はＰｐｕＭＩによ
る切断をブロックするであろう。従って、所望の配列の
クローニングはｄｃｍ−細胞中で行わなければならない
ことは当業者の認めるところであろう。この目的に好ま
しい宿主は、ノーイン・リージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｌＨ５Ｎｏｒ
ｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｐｅｏ
ｒｉａ、　１ｌｌｉｎｏｉｓ　６１６０４　；　Ｎ　Ｒ
ＲＬ　）の永久保存培養物コレクションからブタペスト
条約に則り、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５７２５のも
とて現在入手可能な大腸菌に１２ＧＭ４８である（１９
８３年１１月２３日寄託）。後の目的のため、この菌株
がｄａｍでもあることに注意すべきである。 プラスミドｐＧＨＴＭ３Ａを大腸菌に１２　　ＧＭ４８
形質転換体から単離し、制限酵素ＰｐｕＭＩで処理し、
ヒトＴＭ遺伝子を含有している〜１．９ｋｂの制限フラ
グメントを単離した。上記のように調製したプラスミド
ｐＵ　Ｃ１８Ｔ　Ｍ　１ｉｎｋｅｒも同様に制限酵素Ｐ
ｐｕＭＩで処理した。得られたＤＮＡを単離し、次いで
ｐＧＨＴＭ３Ａの〜１．９ｋｂのＰｐｕＭＩ制限フラグ
メントに連結した。再環化したプラスミドを中離し、ｐ
ＵＣ１８ＴＭと命名した。 このプラスミドは完全なヒトＴＭ暗号配列を含有してい
る。プラスミドｐＵＣ１８ＴＭを、このプラスミドの好
ましい供給源および貯蔵受容体である大腸菌ＫＩ２ＤＨ
５αＦ′Ｊこ導入した。このプラスミドをこの菌Ｐ）ｊ
、（ブタペスト条約に則って寄＋ｉＥサレ、ＮＲＲＬの
永久保存培養物コレクンヨンの一部を為している）から
常法によって単離することができる。この菌株は受託番
号ＮＲＲＬ　　Ｂ１８５２４　（１９８９年７月２０日
寄託）のもとで入手することができる。プラスミドｐＵ
Ｃ１８７Ｍの制限部位および機能地図を第４図に示す。 プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤｌは、本発明の可溶性トロ
ンボモジュリン誘導体をコードしている配列（ＴＭＤＩ
）を含有している。このベクターは、ｐＵＣ１８ＴＭ上
に位置している完全長のＴＭ配列から、この遺伝子の３
″末端から約５００塩基対を削除することによって調製
した。この削除は、１）ＵＣ１８７Ｍを制限酵素Ｂ　ｓ
ｍ　ｒで処理し、続いて再環化することによって行った
。この削除はセリン／トレオニン豊富／トランスメンブ
ランドメイン連結点のところで起こり、このベクターか
ら効率的にトランスメンブランおよび細胞質コード化領
域を切断する。ヒトトロンボモジュリンの公表されてい
る配列に基づくと、この切断によって、以下の構造を有
するポリペプチドが産生されることが予想される（再連
結され、コードされているタンパク質が発現し、そして
付加的なインビボでのプロセソンングが全く無いとき）
： シグナルペブチド／ＮＨ，−末端領域／ＥＧＦ相同領域
／トレオニン／セリン領域／・・・／−ＰｒｏＡｌａＶ
ａｌＧＩｙＬｅｕｖａｌＨｉｓＳｅｒ−ＣＯＯＩＩ　。 本発明の可溶性トロンボモジュリン誘導体をコードして
いる完全なＴＭＤ　１配列は、ｐＵＣ１３ＴＭＤＩの〜
１　、５　ｋｂのＢｃｌｌフラグメント上に含まれてい
る。このフラグメントは後記のことを除き常法によって
単離される。プラスミドｐＵＣ１３７ＭＤｌの制限部位
および機能地図を第５図に示す。 プラスミドｐＧＨＴＭ３ＡのＰｐｕＭＩ制限の場合と同
じように、必要になる次のＢａ１ｌ消化は、認識配列中
の内部デオキシアデニル残基がメチル化されないことが
必要である。従って、プラスミドｐＵＣｌ　８７ＭＤ　
ｌのクローニングは、アデニンメチラーゼ活性を欠く宿
主菌株（ｄａｍ−）中への導入を必要とする。既述のよ
うに、先に用いた菌株大腸菌ＫＩ２　ＧＭ４８（ＮＲＲ
Ｌ　　Ｂ−１５７２５）はこの目的に適している。 次いで、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤ１の〜１５ｋｂＢ
ｃｌｌフラグメントを、真核性の組換えＤＮＡ発現ベク
ターであるプラスミドｐｈｄに挿入した。プラスミドｐ
ｈｄは、それがアデノウィルス−２後期プロモーター（
ＡＤ２ＬＰ）からすぐ上流にＢＫウィルスエンハンサ−
配列（ＢＫ）を含有しているカセットベクターであるの
で好都合な真核性発現ベクターである。さらに、プラス
ミドｐｈｄは、所望のＤＮＡ配列がＢＫエンハンサー−
Ａ　Ｄ　２　ＬＰプロモーター系から発現されるように
、該所望の配列を挿入するために設置された１個のＢａ
１ｌ制限酵素認識配列を含有している。この構築は、挿
入された遺伝子配列の高レベルの転写およびその後の発
現を可能にする。また、プラスミドｐｈａは、ハイグロ
マインン耐性付与配列ならびにジヒドロ葉酸還元酵素（
ｄｈｆｒ）シストロンを含有しており、これらの両方を
それぞれハイグロマイシン、感受性またはｄｈｆｒ陰性
宿主細胞における選択マーカーとして用いることができ
る。プラスミドＩ）ｈｄの構築は、欧州特許出願ＥＰ　
ＡＯ２４５９４９（出願Ｎｏ、８７３０３０８３、７　
；　１９８７年１１月１９日公開）に詳細に記載されて
いる。 フ′ラスミドｐｈｄは、このフ”ラスミドのｔ子ましい
供給源および貯藏受容体である大腸菌に１２　０Ｍ４．
８中に導入されている。ＮＲＲＬに寄託されてその永久
保存培養物コレクションの一部を為しているこの菌株か
ら、常法によってプラスミドを単離することができる。 この菌株は受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８５２５（１９
８９年７月２６日寄託）のもとて人手することができる
。プラスミドｐｈｄの制限部位および機能地図を第６図
に示す。 組換えＤＮＡ発現プラスミドｐｈｄ　Ｔ〜１Ｄｌを１凋
装するため、ｐＵＣＴＭＤＩの〜１．５ｋｂのＢｃｌＩ
フラグメントを単離し、Ｂｃｌｌ消化したプラスミドｐ
ｈｄに連結した。この再環化したＤＮＡは目的の産物の
プラスミドｐｈｄＴＭＤｌである。プラスミドｐｈｄＴ
ＭＤｌの制限部位および機能地図を第７図に示す。 上に記載および使用した特定のベクターか、本発明の可
溶性トロンボモジュリン誘導体をコードしているＤＮＡ
配列をクローンし、そして発現させるための唯一の手段
であるとみなすべきでないことは当業者の認めるところ
であろう。特に、今では当業者なら、あらゆる所望の制
限酵素認識配列（群）を含有するベクターを構築して、
本発明で有用な真核性および原核性の両組換えＤＮＡベ
クターを調製することができる。さらに、当業者は遺伝
コードの縮重性に完全に精通している。従って、当業者
なら本発明で提供されたＤＮＡ配列に修飾を加え、本明
細書中に具体的に挙げたポリペプチドと比較して同一ま
たは改善された生理学的性質を有する相同なタンパク質
を得ることができる。また、当業者ならＤＮＡ配列に修
飾を加えて、本発明で提供されたタンパク質と同一では
あるが高レベルで発現されるタンパク質を発現させるこ
とができる。さらに、当業者は、本発明に含まれる可溶
性ＴＭコード化配列または組換えＤＮＡベクターを調製
する際に有用なりＮＡ配列を合成によって、全部または
部分的に調製する方法にも精通している。さらに加えて
、提供されたＤＮＡ配列を修飾するための組換え法には
、例えば部位指向性の欠失または部位指向性の突然変異
誘発が含まれる。これらの方法は当業者には周知であり
、本明細書での詳細な説明は不要である。従って、本明
細書で用いる「構築された」なる用語は、その範囲内に
、天然供給源から単離されたＤＮＡ。 合成によって調製されたＤＮＡもしくは半合成のＤＮＡ
（天然および合成の供給源からの）、または組換えＤＮ
Ａ法によって修飾されたＤＮＡが含まれる。 同様に、当業者なら、既述した構築を用い、組換えによ
って発現させたポリペプチドを、既知の常法（例えば、
固相合成）によって全部または部分的に合成することも
できることを理解していよう。 従って、本発明は、必然的に上記または実施例記載の最
終的なヒトトロンボモジュリン誘導体の製造方法または
特定のベクター構築に限定されるものとみなすべきでは
ない。本発明のトロンボモジュリン誘導体を製造するた
めのこれら別の方法は本発明に包含されているものとみ
なされる。 本発明の可溶性ヒトトロンボモジュリン誘導体の好まし
い製造方法が、プラスミドｐＵＣ１ｇＴＭＤＩまたはプ
ラスミドｐｈｄＴＭＤｌのトロンボモジュリン誘導体コ
ード化配列を含有している組換えＤＮＡベクターを、宿
主細胞中で発現させることによることは理解されよう。 このトロンボモジュリン誘導体コード化配列を以下に挙
げる：１０・ ＣＴＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣ
ＣＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴ
Ｃ４７０４９０５１゜ ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＧ
ＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣ
ＧＴＧＣＡＡＴＧＣＧＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣ
ＣＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧ
ＣＣＣＴＧＣＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ
ＣＧＣＡＴＣＣＧＣＧＡＣＧＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣ
ＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡＧＴＧＣＡ Ｔ ＧＧＯＣＴＣＧＴＧＧＡＴＴＣＧ−３’　。 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、モしてＴはチミジルである
］。 この後者配列は既述のものである。この配列またはその
一部は、適切に設計された発現ベクター中に挿入すると
、原核および真核の両細胞中で発現させることができる
。例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）、パンラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）発現ベクターが、現在、当分野で周知
である。既述のトロンボモジュリン誘導体コード化配列
を上記および実施例記載のようにして調製することがで
き、次に、適当な原核性発現ベクター中のあるプロモー
ターからの転写および発現に対して適切な配向て挿入し
、適切に形質転換された宿主細胞の選択を可能にする条
件下でクローンし、次いで、挿入した配列の発現に適当
な条件下で発現させ、そして産物を回収することができ
る。 本発明の所望のトロンボモジュリン誘導体の原核宿主細
胞中での、特に大腸菌中での発現は、特定のプロモータ
ーが本発明の操作性に決定的なものではないので、特定
のプロモーターの使用に限定されない。使用することが
できるプロモーターには、例えば、リポタンパク質（ｌ
ｐｐ）プロモータ大腸１ｔｒｐプロモーター　バクテリ
オファージスプロモーター、または大腸菌ラクトース（
ｌａｃ）プロモーターが含まれる。さらに、１またはそ
れ以上のプロモーターを直列して、例えばｔｒｐおよび
ｌａｃプロモーターなどのように用いることができる。 また、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドのプロ
モーター／翻訳活性化配列を調製して、本発明によって
提供されるＴＭＤＩ暗号配列を発現させることができる
。これら全てのプロモーターは、今までにその特徴付け
が為されており、当分野で周知であり、合成によって、
または既知のプラスミドから構築することができる。 さらに、英国特許公開Ｎ　ｏ、　１．５５７．７７４お
よびアーリン等［Ｕｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｔ、　、　Ｇｅ
ｎｅ、　６．９１（１９７９））に開示されているよう
な熱誘導性のランナウェイレプリコンを用いるのが有利
であることもある。３０’Ｃ以下、特に２５°Ｃの温度
では、このレプリコンは、創胞あたり約１０〜１５コピ
ーという比較的低いコピー数を維持している。温度が３
７°Ｃまで上昇すると、コピー数の制御は失われ、この
レプリコンを含有しているプラスミドは細胞あたり約１
０００〜２０００コピーまで増幅する。 後記のように、ランナウェイレプリコンを含有している
ベクター中に、本発明の可溶性トロンホモシーリン誘導
性のような外来遺伝子をクローニングすると、誘導を行
ってコピー数の制御を失わせたときに、タンパク質合成
および細胞内タンパク質性顆粒（細胞封入体）の同時生
成の速度か大きく増加する結果になる。この顆粒はその
タンパク質組成の均質性か高く、顆粒の乾燥重量の８０
％まで（それを越えることも多い）を構成する目的のタ
ンパク質産物を含んでいる。これらの顆粒は細胞溶解液
から容易に単離することができ、低濃度の尿素またはデ
タージェント中での洗浄に安定である。洗浄によって顆
粒に非特異的に結合しているタンパク質が除去される。 しかし、本発明は、可溶性トロンボモジュリン誘導体の
原核細胞中でのクローニングおよび発現に、ランナウェ
イレプリコン含有のプラスミドを使用することに限定さ
れるものではない。ｐＢＲ３２２、ｐＢ　Ｒ３２８、ｐ
ＡｃＹｃ１８４などからの多数のレプリコンが当分群で
知られており、本発明のトロンボモジュリン誘導体コー
ド化ＤＮＡ配列を発現させるように設計した組換えＤＮ
Ａベクターの構築に適している。 また、当業者なら、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ由来のｖｅｇ
プロモーターに精通しているであろう（バララス中での
発現が望ましい）。さらに、バララス中でポリペプチド
を発現させるための方法およびベクターの教示について
は、欧州特許公開ＥＰ　ＡＯ１１６４１１（１９８４年
８月２２日公開）ならびに米国特許Ｎ　ｏ、　４．５５
９゜３００を参照。また、米国特許Ｎ　ｏ、　４．５５
９．３００はストレプトマイセス中で使用するための発
現ベクターを開示している。その他のこのような発現ベ
クターも現在では周知である。例えば、ホリノウチ等［
Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ、　２１０，４６８（１９８７）］および
ピップ等［Ｂｉｂｂ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｒＧｅ
ｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ　４゜Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８３）］を参照。 さらに、特定の選択マーカーの使用は本発明の実施に決
定的なものではない。真核または原核宿主細胞のどちら
か、または両方に用いるための多種多様の選択マーカー
が存在する。 当業者なら、例えば大腸菌、バシラスまたはストレプト
マイセスなどの原核細胞中で発現させたときには、通常
、その産物が細胞内生合成機構によってグリコジル化さ
れ、さらにブロセッノングされることは期待できないこ
とは理解されよう。 従って、そのような細胞においては、本発明のトロンボ
モジュリン誘導体は細胞から分泌されないであろう。そ
の代わりに特に大腸菌においてよく観察されるように、
その産物は先に記したような「細胞封入体」として貯蔵
されていることがある。 このような場合の産物の精製は、宿主細胞膜の破壊、産
物の変性、おそらくはそれに続くタンパク質の再折り畳
み、そして、所望により、適当なプロテアーゼ類を用い
てのシグナル配列のあらゆる望ましい部分の切断を必要
とするであろう。別法によれば、シグナルペプチドのＤ
ＮＡ配列に修飾を加えて、ある酵素によって認識される
特異的な切断部位をコードしているようにし、産物の部
位特異的な切断が可能なようにすることができる。 今ては、このような精製、再折り畳み、および切断工程
の方法は当業者には周知であり、さらに詳しい説明は不
要であろう。 完全長の形態またはその一部として原核宿主細胞から発
現されたときの産物は、有意なトロンボモジュリン様の
活性を有していることがあり、この目的のために、また
は他の有用な誘導体の開発のために用いることもできる
。さらに、これらの産物を、種々の検定に用いることが
できるヒトトロンボモジュリン抗体の製造のための抗原
として用いることもできる。そのような検定の多くは、
試料中のタンパク質の量を測定するために競合的な抗体
結合を用いている。即ち、放射活性（または、その他）
によってラベルした原核細胞産生のトロンボモジュリン
誘導体を、血漿中のトロンボモジュリンを検定する際の
「競合分子」として用いることができる。そのような検
定は、凝固に問題を有する患者の診断に重要である。ま
た、原核細胞から産生された産物は、さらに改良された
トロンボモジュリン誘導体を開発するための構造分析、
折り畳みの特徴付けなどに用いることもできる。 しかし、本発明のトロンボモジュリン誘導体の製造に好
ましい宿主細胞は真核宿主細胞である。 通常、削孔動物およびその他の真核宿主細胞［例えば、
サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ）、
クルイヘロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、
あるいはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）などのある種の酵母１
は、発現された産物のアミノ末端に存在するシグナルペ
プチド部分の認識および適切なプロセッシングのために
必要な細胞機構を備えている。また、ある種の哺乳動物
宿主細胞は、血漿中の野生型トロンボモジュリンで観察
されるような、グリコジル化などの翻訳後修飾を与える
。多種多様のベクターが真核宿主細胞の形質転換のため
に存在し、上記のように、本明細書に挙げた特定のベク
ターはいかなる意味においても本発明の範囲を限定しよ
うとするものではない。 例えば、多種多様のｐＳ　ｖ　２型のベクターがＳＶ４
０ゲノムのセグメントを含有しており、プロモーター（
例えば、ＥＰ）、介在配列（ｒｖｓ）、およびポリアデ
ニル化（ｐＡ　）部位を含むよく分かっている真核性の
転写単位を含有している。５Ｖ４ＱＴ−抗原が存在しな
いと、このｐＳ　ｖ　２型のベクターは、宿主細胞の染
色体ＤＮＡ中に組込まれることによって咄乳動物および
その他の真核宿主細胞を形質転換する。５Ｖ４Ｑプロモ
ーターが挿入された遺伝子を転写させる、例えばプラス
ミドｐＳ　Ｖ　２−ｇｐｔ、　ｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏ、
ｐＳ　Ｖ　２−ｄｈｆｒ、およびｐｓｖ２−β−グロビ
ンなどの、種々のプラスミドｐＳ　ｖ　２型ベクターが
構築されている［Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｖｉｒａｌ　
Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｇｌｕｚｍａｎ　ｅｄ、、Ｃｏ１ｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、　Ｎ、　Ｙ、　、　１９ｇ２を参照コ。これらベク
ターの構築および使用は今では当業者に周知である。そ
のようなベクターは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）またはノーイン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリ−（ＮＲＲＬ）から入手可
能である。 さらに、本発明の誘導体を発現させるのに有用な池のプ
ラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーター以外のプロモー
ターを使用することができる。本発明は、本明細書に例
示したいずれの特定のプロモーターの使用にも限定され
るものではない。他のプロモーター、例えばＳ　Ｖ　４
．　Ｑ後期プロモーターまたは真核性遺伝子由来のプロ
モーター（例えハ、エストロゲン誘導性のニワトリ卵ア
ルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルココル
チコイド誘導性のチロシンアミントランスフェラーゼ遺
伝子、チミジンキナーゼ遺伝子ならびに主初期および後
期アデノウィルス遺伝子などからのプロモーター）を単
離するのは容易であり、本発明のトロンボモジュリン誘
導体を産生させるように設計した絹換えＤ　Ｎ　Ａ”発
現ベクターにおいて使用するために修飾することができ
る。また、真核性プロモーターを直列で用いて所望の最
終産物を発現させることもできる。 さらに、多数のレトロウィルス群が広範囲の真核宿主細
胞に感染することが知られている。レトロウィルスＤＮ
Δ中の長末端反復はプロモーター活性をコードしている
ことが多く、上記のＳ■４０初期プロモーターの代わり
に用いて、本発明によって提供された可溶性トロンホモ
シュリン誘導体コード化配列を転写および翻訳させるこ
とができる。例えば、プラスミドｌ）ＲＳ　Ｖｃａｔ（
Ａ　Ｔ　ＣＣから受託番号ΔＴＣＣ３７１５２のもとて
人手可能）は、ニワトリおよび他の宿主細胞に感染する
ことが知られているウィルスであるラウス肉腫ウィルス
（Ｒ３Ｖ）の長末端反復の部分を含有している。このＲ
３Ｖの長末端反１ｑ配列は、プラスミドｐＲＳ　Ｖｃａ
ｔの〜０．７６ｋｂのＮｄｅｌ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ制限
フラグメントで単離することかできる。このプロモータ
ーを単離し、適当なベクターに挿入して、本発明のトロ
ンボモジュリン誘導体コード化配列を転写および発現さ
せるように正しく設置することかできる。 さらに、上記のＩ）ｈｄによって提供されるものと同様
の、他の真核性または削孔動物発現系が知られている。 例えば、欧州特許出願Ｎ　ｏ、　８７３０３０８３．７
（１，９８７年１１月１９日に公開番号ＥＰ　Ａ　Ｏ２
４５９４９として公開；　１９８６年４月９日出願の米
国量ｊｒｌ　Ｎ　ｏ、　０６／８４９９９９に対応）を
参照。しかし、本発明のトロンボモジュリン誘導体の好
ましい発現ベクターはｐｈｄＴＭＤＩである。 また、酵母細胞中での発現か望ましいときには、酵母発
現系を調製するための方法は今では当分野で周知である
。そのような発現が望ましいときには、次の文献を参照
するとよい：米国特許Ｎｏ、４゜７７５、６２２（１９
８８年１０月４日発行）、欧州特許Ｎｏ、ＣＰＢ００７
３６３５（１９８８年４月２０日交付）；米国特許Ｎｏ
、４゜６１５．９７４（１９８６年１０月７日発行）；
および欧州特許公開ＥＰ　Ａ　０１．８３０７０（１９
８６年６月４日公開）。 既述のように、具体的に提供された真核性発現ベクター
（特に、ｐｈｄＴＭＤｌ）、またはＴＭＤ　１暗号配列
を含んで上記のように構築された他のあらゆる真核性ベ
クターを、種々の真核性（特に、哺乳動物）宿主細胞に
導入し、そして発現させることができる。安定な形質転
換体を同定し、単離するための選択マーカーを含んでい
ないベクターは、米国特許Ｎ　ｏ、　４．３９９．２１
６（１９８３年８月２６日発行）に示されている方法の
ように、−時的な検定または同時形質転換の目的に有用
であろう。通常、大腸菌中でプラスミドＤＮＡを調製す
る方が他の宿主生物中で調製するよりも効率的であるの
で、本発明のベクターは大腸菌中での復製を可能にする
配列を含んでいることもあり、所望により、このベクタ
ーを目的の宿主中に導入する。 いずれにしても、本発明の目的のトロンボモジュリン誘
導体コード化配列の発現は、挿入した遺伝子に結合して
いる特定のプロモーターが機能する宿主細胞中で起こる
。上記のプロモーターおよびｐｈｄＴＭＤｌに用いたア
デノウィルス−２後期プロモーターは、多種多様の宿主
細胞中で機能する。 本発明はいずれの特定の宿主細胞にも限定されるもので
はないが、本発明のトロンボモジュリン誘導体の発現に
好ましい宿主細胞を以下の第１表に挙げる： １１ｅｐＧ−２ヒト肝芽細胞腫 Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ　　蚊の幼虫ＣＶ−１アフ
リカミドリ ザル腎臓　　　　　　ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７０ＬＬＣ
−ＭＫ、原型　　アカゲザル腎臓　　　ＡＴＣＣＩＩ　
ＣＣＬ　７ＬＬＣ−ＭＫ、誘導体　アカゲザル腎臓　　
　ＡＴＣＣＩｆ　ＣＣＬ　７．　Ｉ　　＊＊３Ｔ３　　
　　　　　マウス胚線維芽細胞　ＡＴＣＣｆｌ　ＣＣＬ
　９２ＣＩＩＯ−Ｋｌ　　　　　　チャイニーズノ＼ム
スター卵巣 ＡＴＣＣ＃　ＨＢ　８０６５　　＋ ＡＴＣＣＩｔ　ＣＣＬ　１２５ ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　６１　　　＊＊＊Ａｎｔｈｅｒａ
ｅａ ｅｕｃａｌｙｐｔｉ １ｅＬａ ＲＰＭ１８２２６ Ｈ４１１ＥＣ３ Ｃ１２７１ ｔｌｓ−Ｓｕｌｔａｎ ＢＩＩＫ−２１ ０Ｓ−１ 蛾の卵巣組織 ヒト頚部エビテロ イド ヒト骨髄腫 ラット肝腫瘍 マウス線維芽細胞 ヒト面漿細胞プラ スマ細胞腫 シリアン・ハムス ター腎臓 サル腎臓（ＳＶ４０形 ＡＴＣＣ’ｌ　ＣＣＬ　８０ ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　２ ＡＴＣＣＴ４　ＣＣＬ　１５５　　＊＊＊ＡＴＣＣ＃　
ＣＲＬ　１６００　＊＊＊＊＊ＡＴＣＣ、Ｉ　ＣＲＬ　
１６１６ ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬ　１４８４ ＡＴＣＣｌｌｔ　ＣＣＬ　１０ ＊ ＊＊ このセルラインを使用することは米国特許Ｎｏ、　４．
３９３．１３３に記載されている。 ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ　７より早く増殖する。 ＊＊＊　　ｄｈｆｒ−誘導体ＤＸＢ１１などの、プロリ
ンを必要とするＣｌ０−Ｋ　Ｉの誘導体をこの宿主から
得ることができる。 ＊＊＊＊ＩｇＧλ型の軽鎖を分泌する。 ＊＊＊＊＊　ｇ−アザグアニン耐性のＰＡＺＡ宿主細胞
などの誘導体をこの宿主から得ることができる。 特に好ましい宿主細胞にはヒ）２９３（２９３細胞）細
胞およびシリアン・ハムスターＡＶ１２（ＡＶ１２）細
胞が含まれ、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａ　Ｔ　ＣＣ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　
１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２−１７７６）
から、それぞれ受託番号ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５７３お
よびＣＲＬ　　９５９５のもとで入手することかできる
。ＡＶ１２細胞はブダペスト条約に則って寄託されてお
り（１９８７年１１月２４日）、２９３細胞は今ではだ
れでも入手できるものとしてＡＴＣＣカタログに挙げら
れている。 ＡＶ１２または２９３細胞のどちらかで発現されたとき
には、ｐｈｄＴＭＤＩは２つの形態の本発明の可溶性ト
ロンボモジュリン誘導体を産生させる。これらは高分子
量形および低分子量形と呼ばれる。それぞれの形態の特
宵の物理的および機能的特徴は後記の実施例中に詳しく
記載されている。 さらに、低および高分子量誘導体のＮ−末端の配列決定
により、この分子のシグナルペプチド部分での切断が主
としてアミノ酸１８（プロリン）のカルボキ７末端で起
こり、以下の予想アミノ酸配列の産物を放出することが
わかった（発現後に別のプロセノ／ングが起こらないと
仮定して）：Ｈ２Ｎ−Ａ　Ｌａ　ＰｒｏＡｌａ　Ｇｌｕ
ＰｒｏＧｌｎＰ　ｒｏＧ　ＬｙＧｌｙＳｅ　ｔＧｌ　ｎ
ｃｙｓＶａ　ＩＧ　１ｕＨｉｓＡｓｐｃｙｓＰｈｅＡ１
　ａＬｅｕＴｙｒＰｒｏＧｌｙＰｒｏＡｌａＴｈｒＰｈ
ｅＬｅｕＡｓ　ｎＡ　１　ａＳｅ　ｒＧｌｎｌ　１ｅＣ
ｙｓＡｓｐＧ１ｙＬｅｕＡｒｇＧ１ｙＨｉｓＬｅｕＭｅ
　ｔＴｈ　ｒＶａ　ＩＡｒｇＳｅ　ｒＳ　ｅ　ｒＶａ　
１ＡｌａＡｌ　ａＡｓ　ｐＶａ　ＩＩ　１ｅＳｅｒＬｅ
ｕＬｅｕＬｅｕＡｓｎＧ１ｙＡｓｐＧ１ｙＧｌｙＶａ　
ｌ　ＧｌｙＡｒｇＡｒｇＡｒｇＬｅｕＴｒｐ　Ｉ　１ｅ
Ｇ１ｙＬｅｕＧ１ｎＬｅｕＰ　ｒｏＰ　ｒｏＧｌｙｃｙ
ｓＧｌｙＡｓｐＰ　ｒｏＬｙｓＡｒｇＬｅｕＧ　ｌｙＰ
　ｒｏＬｅ　Ｌ＋Ａ　ｒｇＧｌｙＰｈ　ｅ　ＧｌｎＴ　
ｒｐＶａ　１ＴｈｒＧ　１ｙＡｓ　ｐＡ　ｓ　ｎＡｓ　
ｎＴｈｒＳ　ｅ　ｒＴｙ　ｒＳ　ｅ　ｒＡ　ｒｇＴｒｐ
Ａ　１　ａ　Ａ　ｒｇＬｅｕＡ　ｓ　ｐ　ＬｅｕＡ　ｓ
　ｎＧｌｙＡｌａＰ　ｒ　ｏＬｅ　ｕＣｙｓ　Ｇ　１ｙ
Ｐ　ｒｏＬｅ　ｕＣｙｓＶａ　ＩＡｌａＶａ　ＩＳｅ　
ｒＡｌａＡｌａ　ＧｌｕＡｌａＴｈ　ｒＶａ　１Ｐｒｏ
ｓｅ　ｒＧｌｕＰｒｏ　Ｉ　１ｅＴｒｐＧ１ｕＧ１ｕＧ
　ＬｎＧｌ　ｎｃｙｓＧｌｕＶａ　１ＬｙｓＡＬａ　Ａ
ｓｐＧ　ＬｙＰｈｅＬｅｕＣｙｓ　ＧＬｕＰｈａＨｉ　
ｓ　ＰｈｅＰｒｏＡｌａＴｈ　ｒｃｙｓＡｒｇＰｒｏＬ
ｅｕＡ　１ａＶａ　１Ｇ１ｕＰｒｏＧ１ｙＡｌａＡ１ａ
Ａ１ａＡ　ｌａ　Ａ　ＬａＶａ　ｌ５ｅｒＩ　１ｅＴｈ
ｒＴｙｒＧｌｙＴｈｒＰｒｏＰｈｅＡ１ａＡ１ａＡ　ｒ
ｇＧｌｙＡ　１ａＡｓｐＰｈｅＧ１ｎＡ　１　ａＬｅｕ
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ｌ　ａ　Ｖａ　ＩＡＩ　ａ　Ｐ　ｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅ
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ｌ　ａＰｒｏＡｒｇＣｙｓＧｌｎＣｙｓＰｒｏＡｌａ　
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Ｇｌ　ｕｎｉ　５ＰｈｅＣｙｓＶａ　１ＰｒｏＡｓ　ｎ
Ｐ　ｒｏＡｓｐＧｌｎＰ　ｒｏＧｌｙｓｅ　ｒＴｙ　ｒ
Ｓｅ　ｒＣｙｓＭｅｔＣｙｓ　Ｇｌ　ｕＴｂ　ｒＧｌｙ
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ＨｉｓＡ　ｒｇＣｙｓ　ＧｌｕＡｓｐＶａ　ＬＡｓｐＡ
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ｏｃｙｓＰ　ｒｏＧｌｎＡ　ｒｇＣｙｓＶａ　ＩＡｓ　
ｎＴｈ　ｒＧｌ　ｏＧｌｙＧｌｙＰｈｅＧｌｕＣｙｓＨ
ｉ　ｓ　ＣｙｓＴｙｒＰ　ｒｏＡｓ　ｎＴｙｒＡｓ　ｐ
　Ｌｅ　ｕＶａ　ＬＡｓ　ｐＧ　ＬｙＧ　ｌ　ｕＣｙｓ
Ｖａ　ＩＧ　１ｕＰ　ｒｏＶａ　ＩＡ　ｓｐＰ　ｒｏＣ
ｙｓ　ＰｈｅＡｒｇＡｌａＡｓ　ｎＣｙｓ　ＧｌｕＴｙ
ｒＧｌｎＣｙｓ　Ｇ１ｎＰｒ：ｏＬｅｕＡｓｎＧｌｎＴ
ｈｒＳｅｒＴｙｒＬｅｕＣｙｓＶａ　ＬＣｙｓＡＬ　ａ
ＧｌｕＧｌ　ｙＰｈ＝Ａｌａ　Ｐ　ｒｏＩ　１ｅＰ　ｒ
ｏＨｉ　ｓ　ＧｌｕＰ　ｒｏＨｉ　ｓＡｒｇＣｙｓＧ　
１ｎＭｅ　ｔＰｈｅＣｙ　ｓＡｓ　ｎＧｌｎＴｈｒＡｌ
ａＣｙｓ　ＰｒｏＡｌａＡｓ　ｐＣｙｓＡｓｐＰｒｏＡ
、ｓ　ｎＴｈｒＧｌｎＡｌａｓｅ　ｒＣｙｓ　ＧｌｕＣ
ｙｓ　ＰｒｏＧｌｕＧｌｙＴｙｒＩ　１ｅＬｅｕＡｓｐ
ＡｓｐＧ１ｙＰｈｅ　Ｉ　１ｅＣｙｓＴｈ　ｒＡｓｐ　
Ｉ　ｌ　ｅＡ　ｓ　ｐＧｌｕＣｙｓＧｌｕＡｓ　ｎＧｌ
ｙＧｌｙＰｈｅｃｙｓｓｅ　ｒＧｌｙＶａ　ＩＣｙｓＨ
ｉ　ｓＡｓ　ｎＬｅｕＰ　ｒｏＧ　１ｙＴｈｒＰｈｅＧ
１ｕＣｙｓ　Ｉ　１ｅＣｙｓＧ１ｙＰ　ｒｏＡｓ　ｐＳ
ｅｒＡｌａＬｅｕＡｌａＡｒｇＨｉｓ　Ｉ　ｌｅＧ　１
ｙＴｈ　ｒＡｓｐＣｙｓＡｓ　ｐＳｅ　ｒＧｌｙＬｙｓ
　Ｖａ　１ＡｓｐＧ１ｙＧ１ｙＡｓｐｓｅ　ｒＧｌｙｓ
ｅ　ｒＧｌｙＧ　１ｙＰｒｏＰ　ｒｏＰ　ｒｏＳｅｒＰ
ｒｏＴｈ　ｒＰ　ｒｏＧｌｙｓｅ　ｒＴｈｒＬｅｕＴｈ
ｒＰｒｏＰ　ｒｏＡ　ｌ　ａ　Ｖａ　ＩＧｌｙＬｅｕＶ
ａｌＭｉｓＳｅｒ−ＣｏｏＨ ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
はソステイン、Ｇｉｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミ
ン酸、Ｇｌｙはグリ７ン、Ｈｉｓはヒスチジン、ｌｉｅ
はインロイノン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、
Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒ
ｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、
Ｔｒｐはドリフトファン、Ｔｙｒはチロシン、およびＶ
ａｌはバリンである］。 また、低分子量形態のＮ−末端配列決定により、Ｎ−末
端のシグナルペプチド部分がアミノ酸１６（グ＋）’／
ン）（ＩＪ）ｈルボキシ末端で切断される少ない数の産
物が示された。発現に続いて別のブロセ、シングが起こ
らないと仮定すると、この産物の予想アミノ酸配列は次
のようである： ＰｈｅＰ　ｔｏ　−Ａ　ｌａ　Ｐ　ｒｏＡｌ　ａＧｌｕ
Ｐ　ｒｏＧｌｎＰｒｏＧｌｙＧｌｙｓｅ　ｒＧ　１ｎＣ
ｙｓ　Ｖａ　Ｉ　Ｇｌ　ｕＨｉ　ｓ　ＡｓｐＣｙｓＰｂ
ｅＡｌａＬｅｕＴｙｒＰｒｏＧ　１ｙＰｒｏＡｌａＴｈ
ｒＰｈｅＬｅｕＡｓ　ｎＡ１　ａ　Ｓｅ　ｒＧｌｎＩ　
ｌ　ｅＣｙｓＡ　ｓｐＧｌｙＬｅｕＡｒｇＧｌｙＨｉｓ
　ＬｅｕＭｅｔＴｈ　ｒＶａ　ＩＡｒｇＳｅ　ｒＳｅ　
ｒＶａ　ＩＡＩ　ａＡｌａＡｓ　ｐＶａ　ＩＩ　１ｅｓ
ｅ　ｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＡｓ　ｎＧｌｙＡｓｐＧｌｙ
ＧｌｙＶａ　ｌＧｌｙＡｒｇＡ　ｒｇＡ　ｒｇＬｅｕＴ
ｒｐ　Ｉ　１ｅＧ１ｙＬｅ　ｕＧｌｎＬｅｕＰｒｏＰｒ
ｏＧｌｙｃｙｓ　Ｇ　１ｙＡｓｐＰ　ｒｏＬｙｓＡｒ　
ｇＬｅｕＧｌｙＰｒｏＬｅｕＡｒｇＧｌｙＰｈｅＧｌｎ
ＴｒｐＶａ　ｌＴｈ　ｒＧｌｙＡｓｐＡｓ　ｎＡｓ　ｎ
Ｔｂ　ｒＳ　ｅ　ｒＴｙｒＳｅ　ｒＡ　ｒｇＴ　ｒｐＡ
ｌ　ａ　ＡｒｇＬｅｕＡｓ　ｐＬｅｕＡｓ　ｎＧｌｙＡ
ｌ　ａ　Ｐ　ｒｏＬｅ　ｕＣｙｓ　Ｇｌ　ｙＰ　ｒｏＬ
ｅ　ｕＣｙ　ｓＶａ　ＩＡｌａＶａ　ｌｓｅ　ｒＡＬａ
ＡｌａＧｌｕＡｌａＴｈｒＶａ　ＩＰ　ｒｏＳｅ　ｒＧ
ｌｕＰｒｏＩ　ｌ　ｅＴｒｐＧｌｕＧｌｕＧ　１ｎＧ１
ｎｃｙｓ　Ｇ　１　ｕＶａ　ＩＬｙｓ　ＡｌａＡｓ　ｐ
　Ｇ　１ｙＰｈｅＬｅｕＣｙｓ　Ｇ　ＬｕＰ　ｈｅＨｉ
　ｓ　ＰｈｅＰ　ｒｏＡｌａＴｈｒｃｙｓＡｒｇＰ　ｒ
ｏＬｅｕＡ　１ａＶａ　ＩＧ　１ｕＰｒｏＧｌｙＡｌａ
Ａｌ　ａＡ　１　ａＡ　ｌ　ａ　ＡｌａＶａ　ＩＳｅ　
ｒ　Ｉ　ｌ　ｅＴｈ　ｒＴｙｒＧｌｙＴｈ　ｒＰｒｏＰ
ｈｅＡｌａＡ　１ａＡ　ｒｇＧ　１ｙＡｌ　ａＡｓｐＰ
ｈｅＧｌｎＡｌａＬｅｕＰｒｏＶａ　ｌ　ＧｌｙＳｅ　
ｒＳｅ　ｒＡｌａＡｌ　ａＶａ　ＩＡ　ｌ　ａ　Ｐ　ｒ
ｏＬｅ　ｕＧｌｙＬｅｕＧｌ　ｎＬｅｕＭｅｔ、Ｃｙｓ
ＴｈｒＡｌａＰｒｏＰｒｏＧｌｙＡｌａＶａｌＧｌｎＧ
ｌｙＨｉｓＴｒｐＡｌａＡｔｇＧｌｕＡｌａＰｒｏＧｌ
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ＰｒｏＡｌａＶａ　ｌＧｌｙＬｅｕＶａｌＨｉｓＳｅｒ
−ＣＯＯＨ ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
はシスティン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミ
ン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、ｌｉｅ
はイソロイ７ン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、
Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒ
ｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、
Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、およびＶ
ａｌはバリンである］。 これら形態の全ては本発明に包含されているものとする
。後記の実施例に記載したように、本発明の誘導体は、
これまで臨床医には利用できなかった有用な性質を与え
る。本発明のトロンボモジュリン誘導体は、それらか可
溶性であって真核宿主細胞から分泌されるので、その製
造および精製が容易である。デタージェント不含の緩衝
液中での予想外の溶解性は、野生型トロンボモジュリン
を凌ぐ顕著な利点を与える。特に、高分子の種で顕著で
あるが、最適カルシウム濃度は、野生型トロンボモジコ
リンについて観察される濃度および通常の生理学的条件
下で存在する濃度に近似している。さらに、この産物（
最も顕著には高分子量形態）は、２種類の別の異なった
機序によって凝固カスケードを阻害する。第１に、トロ
ンビンと一緒になった誘導体は、プロティンＣ抗凝固経
路を活性化し、それによって凝固系の主要な補助因子で
ある因子Ｖａおよび■ａの活性を減少させる。第２に、
そして予想外には、本誘導体（特に、高分子量形態）は
、トロンビンの凝固活性を実質的に抑制する。さらに予
想外には、本誘導体（特に、高分子量の誘導体）は、血
小板を活性化するトロンビンの通常の能力を阻害する。 このことは、天然供給源から単離した完全長のヒトトロ
ンボモジュリンが、トロンビン凝固および血小板活性化
の活性に対する阻害作用を、あったとしてもわずかしか
有していないことを文献が示唆しているので予想外であ
る［例えば、マルヤマ等（Ｍａｒｕｙａｍａ、　１．　
ｅｔ２４６（１９８４））を参照］。 本発明の可溶性分泌型トロンボモジュリン誘導体は、血
栓性の疾患の治療および予防に有用である。これらの疾
患には、深静脈血栓症、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心
臓または末梢動脈由来の塞栓、急性心筋梗塞、血栓性の
発作、および播種性の血管内凝固を含む、血管内凝固が
関与している多種多様の後天性の疾患状態が含まれる。 播種性の血管内凝固は、特に、大きな外傷、大手術、熱
発作、敗血症、急性および慢性の肝臓障害、固体腫瘍を
含む悪性腫瘍、白血病およびリンパ腫、多種多様の細菌
、菌類、寄生虫およびウィルス感染、産時合併症、溶血
過程、心臓性ショック、あらゆる原因の循環虚脱、重篤
な進行性発作、ヘビ咬傷、コラーゲン脈管疾患、電撃性
紫斑病、急性膵炎、アレルキー性脈管炎、真性多血症、
血小板血症、および潰瘍性大腸炎を含む移しい疾病状態
の合併症として発生する。 これまでに発見されてはいないが、トロンボモジュリン
発現の先天性の欠損か血栓塞栓の問題をかかえている患
者において示されるかもしれない。 そのような患者の急性の問題は、提供されたトロンホモ
シュリン誘導体による治療を受入れやすいであろう。 実験データおよび臨床データによれば、通常の抗凝固薬
、特にワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ）は侵入性の癌
の治療に有用であり、これら悪性腫瘍の遠く離れた転移
性病巣を防止あるいは減少させるように作用することが
示唆される。本発明のトロンボモジュリン誘導体は、後
記で詳しく説明する理由から、これらの臨床状態におい
て通常の抗凝固薬に代わるものとして有用である。 深静脈面栓症および肺塞栓症は通常の抗凝固薬によって
治療することができるが、さらにもっと魅力ある臨床的
なアプローチは、明らかに危険性の高い患者、例えば手
術を受けている患者、長期にわたって寝たきりの患者お
よびうっ血性心不全の患者において血栓塞栓の合併症の
発生を防止することである。年齢が５０およびそれ以上
である手術患者の５０％以上および全体の患者の２０％
は、手術後の深静脈血栓症に罹患する。手術後の全課静
脈血栓症の約２０％には１またはそれ以上の肺塞栓が伴
われている。現在では、手術前および手術後の両方に低
用量のヘパリン（例えば、８時間毎に５，０００単位）
を投与して深静脈血栓症を防止している。低用量のヘパ
リンは時には手術中および手術後に重篤な出血を引き起
こすことがある。本トロンボモジ−リン誘導体の中で、
低分子量の誘導体は、高分子量形態のトロンボモジ−ノ
ン誘導体よりもトロンビンの不活性化が少なく、そして
血小板活性化の阻害が少ない。特に、この低分子量形態
はヘパリンよりも選択性が高く、出血合併症を引き起こ
すことが少ないようである（トロンビンが生成し、フィ
ブリン血栓が生成したときおよび生成したところでのみ
活性である）。トロンボモジュリン誘導体は、深静脈血
栓症を防止するために予防的に用いたときにヘパリンよ
りも効果が高く、出血合併症を引き起こすことが少ない
であろう。深静脈血栓症を防止するための組換え産生の
トロンボモジュリン誘導体の用量は、０゜５〜Ｉ　００
　ｍ９／日の範囲内である。トロンボモジュリン誘導体
の投与は、手術の６時間前から始め、患者が動けるよう
になるまで続けるのが好ましい。 確立され客観的に証明された深静脈血栓症および／また
は肺塞栓症においては、トロンボモジュリン誘導体く好
ましくは、高分子量形態）の用量は、負荷用量として１
〜３０ｚｙの範囲であり、これに３〜３００　ｍ９／日
の範囲の用量の持続注入が続く。 同様の投与スケジュールが末梢動脈血栓の治療に適用で
きる。トロンボモジュリン誘導体の注入に起因する出血
合併症の可能性は比較的低いので、これらタンパク質は
、急性動脈閉塞の状況下で虚血性の肢を切断から救うの
に必要であることが多い手術法である血栓摘出あるいは
塞栓摘出に関連して、手術中および手術後にヘパリンに
代えることができる。 心臓に由来する動脈塞栓は、心臓弁が関与する心臓疾患
、人工心臓弁を有する患者、急性心筋梗塞、およびある
種の心臓不整脈において多い合併症である。通常の経口
抗凝固薬によるこれら問題の治療は必ずしも完全に有効
とは言えず、経口の抗凝固薬が用いられるときにはいつ
ものように出血合併症の危険が伴う。明らかな深静脈血
栓−肺塞“栓の治療に用いられる用量と同等の用量で、
例えば小型ポンプシステムを用いる持続注入によって、
長期に投与される本発明のトロンボモジュリン誘導体は
、心臓性塞栓の防止に実際的な用途を有している。 同様に、末梢動脈、特に頚動脈中の血栓に由来する塞栓
は、血小板機能を抑制することができる薬物、経口の抗
凝固薬、またはそれらの組合せを含む、現在用いられて
いる処方では満足に治療または予防されない。心臓性の
塞栓の場合と同様、心臓性の塞栓について説明したもの
と同じ方法で長期に投与される本トロンボモジュリン誘
導体は、頚動脈１ｍ栓に由来し、そして塞栓性の発作に
つながる塞栓の予防に主な可能性を有している。 また、本トロンボモジュリン誘導体（最も可能性が高い
のは低分子量形態）は血栓性の発作の治療にも有用であ
る。現在のところ、発作を通常の抗凝固薬で治療するの
は一般的ではない。発作をヘパリンまたは経口の抗凝固
薬で治療するのはときには有益であるが、梗塞した脳の
領域中への出血の危険性が高く、それによって発作に付
随する神経欠損を悪化させる。出血合併症を引き起こす
可能性が低いこと、およびその選択性のゆえに、トロン
ボモジュリン変異体は、発作患者に投与することができ
、閉塞している動脈血栓の局所的な拡大を防止するのに
有益であり、それによって発作からくる神経欠損を減少
させることができる。 投与されるトロンボモジュリン変異体の量は、発作の性
質および重篤度に依存してそれぞれの患者によって変わ
るであろう。 さらに、トロンボモジュリンおよび提供された誘導体の
主な作用機序、即ちプロティンＣの抗凝固経路の活性化
が、循環系の動脈側での抗血栓作用を達成する有効性の
高い手段を構成することか証明されているので、本発明
のトロンボモジュリン誘導体（最も好ましくは、高分子
量の変異体）は急性心筋梗塞の治療にも有用であろう。 動物実験から、および急性心筋梗塞における血（全溶解
薬物による最近の試験において、補助療法としてのヘパ
リンは循環系の動脈側の抗血栓薬物としては比較的有効
ではないようである。本発明のトロンボモジュリン誘導
体は、心筋梗塞の急性期間に血栓溶解薬物とともに投与
することができる。これによって、血栓溶解薬物がそれ
自体またはヘパリンと組合わせて投与されていたときよ
りも短い再潅流時間が得られるであろう。閉塞している
冠状動脈の血栓を溶解した後、さらに数日間、トロンボ
モジュリン誘導体を投与して再び冠状動脈閉塞するのを
防止することができる。急性の心筋梗塞においては、患
者には、血栓溶解治療を始めるときに３〜３０１１ｙの
トロンボモジュリン変異体の負荷用量を投与し、続いて
１〜ｌ　ＯＯｍ９１日の範囲の量でトロンボモジュリン
変異体を持続注入する。 また、本発明のトロンボモジュリン誘導体は播種性の血
管内凝固（ＤＩＣ）の治療にも有用である。 Ｉ　Ｌ−１、ＴＮＦおよびＬＰＳ内毒素などの炎症の仲
介物質は内皮細胞でのトロンボモジュリンの発現を急激
に下方調節し、次いでプロティンＣ抗凝固経路の活性化
の欠如に導くことが実験的に示されている。ヘパリンお
よび経口の抗凝固薬が厳格な臨床試験において播種性の
血管内凝固を有する患者に投与されていたが、これらの
試験の結果は期待に反するものであった。特徴的には、
播種性の血管内凝固を有する患者は、同時に重篤である
ことか多い出血の問題（始めに活性化され、次いで広範
な微小循環のフィブリン血栓の生成の間に不活性化され
る必須凝固因子の「消耗」に起因する）を伴う微小循環
が関与した広範な血栓を有している。播種性の血管内凝
固においては、トロンボモジュリンは通常の抗凝固薬を
大きく凌ぐ利点を有している。その選択性のゆえに、本
発明のトロンボモジュリン誘導体は、ヘパリンおよび経
口の抗凝固薬のようには播種性の血管内凝固に付随する
出血の問題を増大させることがなく、代わりに、さらに
微小血管フィブリン蓄積が生成するのを遅延させるか、
または抑制する。注入されたトロンボモジュリンは循環
内に存在するトロンビンの実質的な量をブロックするで
あろう。高分子Ｆｌはトロンビンのプロ凝固および血小
板活性化活性をブロックし、プロティンＣの活性化プロ
ティンＣへの変換を促進するであろう。必要とされる用
量は、確立された深静脈血栓−肺塞栓に用いられる量と
同等である。ＤＩＣ症候群のもとになっている原因を治
療するための確実な方策を立てることができるまで処置
か続けられる。 通常の抗凝固薬、特にワルファリン（ｗａｒｆａｒｉｎ
）が侵入性の悪性腫瘍の治療に有用であるという証拠か
示されている。腫瘍細胞の多くは、局所的なフィブリン
蓄積につながる凝固系の活性化を誘導する物質を産生ず
る。これらのフィブリンＩｆｉ物は「巣」として機能し
、ここで癌細胞は分裂して転移性の病巣を形成すること
ができる。ある臨床的な研究によると、胛の小細胞癌を
治療するために癌化学療法に加えてワルファリンを与え
られた患者は、化学療法だけを与えられた患者に比べて
、より長く生１し、厳密な転移性の病巣が少なかった。 しかし、この研究で用いられている癌化学療法は、現在
臨床腫瘍学で最良と考えられているものよりも厳しさが
少ない。さらに厳しい形態の癌化学療法は、はとんど常
に、血小板数の急激な減少を生じ、そしてワルファリン
療法と組み合わさった血小板減少は、許容することがで
きない重篤な出血合併症の危険に患者をさらすことにな
る。通常の抗凝固薬よりも選択性が高く、ヘパリンまた
は経口の抗凝固薬よりも高い治療インデックスを有する
トロンボモジュリン変異体は、血小板減少の患者に比較
的安全に投与することができ、従って、トロンボモジコ
リン変異体と組み合わせた効果的かつ強力な化学療法に
よって侵入性感を有する患者を治療することかできる。 トロンボモジュリン変異体による侵入性感の治療は、深
静脈血栓肺塞栓で用いられる投与処方と同様の処方に従
えばよい。 上記に鑑みて、本発明はその別の態様において、血栓の
治療または予防を必要としている患者に、本明細書に記
載したトロンボモジュリン誘導体の治療学的有効量を投
与することを特徴とする該患者の治療方法を提供するも
のである。 本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を製造する
ための既知の方法に従って製剤化することができる。特
に、本発明のトロンボモジュリン誘導体は薬学的に許容
しうる担体、希釈剤または賦形剤と混合される。適当な
担体、希釈剤または賦形剤およびその製剤例（他のヒト
タンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例
えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ第１６版」（Ｏｓｏｌ　ｅ
ｔ　ａｌ、ｉ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１
９８０年）に記載されている。このような組成物は、治
療学的有効量のトロンボモジュリン誘導体を、患者に効
果的に投与するのに適した薬学的に許容しうる組成物を
製造するための適切な量の担体、賦形剤または希釈剤と
ともに含んでいる。このトロンボモジュリン組成物は、
非経口で、または当業者には周知の他の方法によって投
与することができ、効果的な形で血流に放出することを
確実にすることができる。 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。 本発明は、これら実施例の記載を理由としてその範囲を
限定されるものではない。試薬の供給源は単に都合の良
いように挙げたものであって、本発明を限定するもので
はない。 （以下、余白） 実施例Ｉ Ａ、ヒトトロンボモジュリン含有ＤＮＡ配列の単離およ
び同定 トロンボモジュリン遺伝子はヒトゲノムにおいて染色体
２０に位置している［ウエン等（Ｔｅｎ、　Ｄｅｔ　ａ
ｌ、　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ、　２６．４３５０（
１９８７））］。また、この遺伝子はイントロンを含有
していないと報告されている［ジャックマン等（Ｊａｃ
ｋｍａｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ。 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）
、８４．６４２５（１９８７））コ。　この情報に基づ
き、ラムダファージシャロン２１Ａに担持されているヒ
ト染色体２ｏライブラリーを、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ１１５７７１２，Ｉ
Ｄコード　ＬＬ２ＯＮＳＯ１，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。 ＶＤ　２０８５２）から購入した。大腸菌Ｃ６００株細
胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ
　９２０３７がら市販品として入手可能）をＴＹブロス
（１０ｇバクトートリプトン、５ｇバクトーイーストエ
キス、ｌＯｇＮａｃ（／リットル、ｐＨ７，４）中、６
００ｎ＋＋＋テ０．６−０゜８の光学密度まで増殖させ
、細胞（６００μυを５０．０００個のファージで感染
させた。合計６ｏｏ、ｏｏｏ個のファージ（３染色体当
量）を、各々７５ｍ（＜７）ＴＹ７ガー（ＴＹブｏスプ
ラス１５ｇ／リットルのバクトーアガー）を含有してい
る１２個の１５０ｍｍ皿に蒔いた。３７°Ｃで６時間後
、プラークは十分形成していた。ファージをコロニー／
プラーク・スクリーン・フィルター（Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐ
Ｉａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ　ｆｉｌｔｅｒｓ　（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂ。 ５ｔｏｎ、　Ｍ＾））に移し、販売業者の指示に従って
ハイブリダイゼーション用に調製した。 公開されているウシトロンボモジュリンＤＮＡ配列［ジ
ャックマン等（Ｊａｃｋｍａｎ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　
Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８３．８
８３４（１９８６））］に基づいて数種の５０塩基オリ
ゴマーをデザインし、これらのプローブを、当業者周知
の方法を使用してＴ４キナーゼで放射標識した。先ず、
既知のプロトコールを使用してフィルターを３種類のプ
ローブの混合物とハイブリダイズさせ、フィルムを一７
０°Ｃで６時間曝露させることによって、ポジティブな
シグナルを同定した。０．１Ｘ　　５ＳＰＥＳ０１％Ｓ
ＤＳ中、７５°Ｃで１０分間加熱することによって、こ
れらのフィルターから最初のプローブを除去した。Ｎａ
ＮａＣ１２（１７４、ＮａＨ，ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（２７，
６ｇ）およびＥＤＴＡ（７，４ｇ）をＨ２Ｏ（８００Ｒ
１２）に溶解し、その後、Ｎａ０Ｈ（ＩＯＮ溶液〜６　
、５　ｍ（１）でｐＨを７．４に調節し、容量を１リツ
トルに調節することによって、５ＳＰＥ（２０Ｘ）を調
製した。次いで、フィルターを一７０°Ｃで２４時間フ
ィルムに曝露し、最初のプローブ混合物が全て除去され
たことを確認した。次ぎに、別のプローブ混合物を使用
し、これらのフィルターを再びハイブリダイズさせた。 第２のフィルムを第１組に比較し、両組のプローブとハ
イブリダイズしたプラークのみを、第２回目のスクリー
ニングのために選択した。第２回目のスクリーニングに
よって、１個のプラークが、ＤＮＡ配列の５末端とホモ
ローガスなプローブに、そして更に遺伝子の３°−末端
にホモローガスな別のプローブにハイブリダイズするこ
とがわかった。このクローンは、全コード配列を含んで
いた。このクローン、Ｇ　ＨＴ　Ｍ　３　Ａを精製し、
以降の全ての研究のだめの基礎として使用した。 Ｂ、０８７Ｍ３ＡからのＴＭｃＤＮＡ挿入体の単離 プレートリゼイト法［デイビス、ホトスタインおよびロ
ス（Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ、　Ｄ、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　ａ
ｎｄ　Ｊ、Ｒ，Ｒｏｔｈ、　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ
　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　　Ａｄ
ｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　　Ｎ。 Ｙ、、　　１９８０．　ｐａｇｅ　１０６）によって公
開された方法の改良法］を使用し、大量の精製ファージ
ＤＮＡを単離した。１０個の１５０ｍｍ皿それぞれに、
約１０８ブラークー精製フアージで感染させた大腸菌Ｃ
６００を蒔いた。３７°Ｃで７時間後、全面溶菌が達成
された。各プレートにラムダ希釈緩衝液（１０ｍＭ）リ
ス（ｐＨ７，５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＳＯ３）（Ｉｏｌ
ｇ）を注ぎ、４°Ｃで一夜穏やかに振盪した。翌朝、緩
衝液を注意深く移し、残留している細胞を溶解するため
にクロロホルム数滴で処理した。２０、　ＯＯＯｒｐｍ
、　　１８°Ｃで３時間遠心することによって上清から
ファージ粒子を取り、ベレツトをラムダ希釈緩衝液（１
１ｇ）に再懸濁した。 塩化セシウムグラジェントを使用し、ファージ粒子を更
に精製した。即ち、ファージ試料（１ｘＱ’）を、５Ｍ
　ＣｓＣＣ５Ｉ　ＯｍＭ　Ｍｇ５ＯいＯ，１ｍＭＥＤＴ
Ａニナトリウム、１０ｍＭトリス（ｐＨ＝８゜０）（Ｉ
ｉａ）；および３Ｍ　Ｃ５ＣＬ　　１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
，，０，１ｍＭＥＤＴＡニナトリウム、ｌｏ＋ｎＭ）リ
ス（ｐＨ−８，０）（３＋のの段階グラジェントに積層
した。３０．　ＯＯＯｒｐｍ（１８°Ｃ）にて６０分後
、表面に、ファージ粒子に対応する弱いブルーのバンド
を認めることができた。 注射器および針を使用し、表面の溶液（０，５ｉ０を取
った。等容量の脱イオン化ホルムアミドを加え、ファー
ジＤＮＡをタンパク皮膜から放出させた。室温にて３０
分後、溶液を水（０，５ｘＣ）で希釈し、２倍容量の室
温のエタノールでＤＮＡを沈＆サセた。１０．００Ｏｒ
ｐｍで１０分間遠心することによってＤＮＡを集め、こ
のベレットを一２０℃にて６８％エタノール（５１）で
洗浄し、乾燥し、ＴＥ［１０ｍＭトリス（ｐＨ＝８．０
）、１ｍＭＥＤＴＡ］（５００μのに再懸濁した。ファ
ージＤＮＡを合計２００−１０００μｇ回収した。 ヒトゲノムＤＮＡは、シャロン２１Ａベク９−）Ｈｉｎ
ｄ［１部位に挿入されており、この組換クローンをＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化することによって放出させることがで
きた。精製ファージＤＮＡ（５Ｑμｇ）を、５０単位の
ＨｉｎｄＩＩ［を加えたコア緩衝液（緩衝液および酵素
は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａ
ｒｙｌａｎｄ　２０８７７から得た）（２００μＱ容Ｍ
）中、３７°Ｃで９０分間消化した。 次ぎに、この試料をエタノールで沈澱させ、サイズマー
カーとしての、ＨｉｎｄｌＩＩでカントしたラムダＤＮ
Δ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）と−緒に１．０％アガロースゲル電気
泳動することによって分離した。臭化エチジウムを使用
してＤＮＡを可視化し、各バンドのサイズを、ゲルにお
けるその移動度に基づいて算定した。０８７Ｍ３Ａにつ
いての挿入サイズは〜６．４ｋｂと評価された。 Ｃ，ファージＧＨＴＭ３Ａの〜６　、４　ｋｂ　Ｈ１ｎ
ｄＩＩＩフラグメントの単離 実施例ＩＢで単離したファージＧ　ＨＴ　Ｍ　３７〜（
５０８ｇ）を、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（５μｃ）（〜
５０単位）、１０ＸＨｉｎｄＩ［Ｉ反応緩衝液［５００
ｍＭ　ＮａＣ（ｌ。 ５００ｍＭｈリスーＨＣ（！（ｐＨ８，０）、１００ｍ
ＭＭ　ｇＣｃｔ］　（１，Ｏμｉ２）およびＨ，０（８
５μのと混合し、３７°Ｃで約２時間インキュベートす
る。次ぎ１こ、このＨｉｎｄＩ［Ｉ７肖化ファージＧＨ
ＴＭ３Ａ　　ＤＮＡを、〜６．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＩＩ
Ｉフラグメントがその他の消化産物から分離されるまで
０．６％アガロースゲルで電気泳動させる。ＤＮＡバン
ドを、先ス臭化エチジウムの希溶液でゲルを染色し、次
ぎに紫外光でケルを観察することによって、視覚化する
。 〜６．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメントを含有し
ているゲルの領域をゲルから切り取り、プラスチックフ
ィルムに包み、−７０°Ｃで約１０分間凍結させる。次
いで、凍結したゲルスライスを室温で穏やかに圧搾し、
このゲルスラリーを１．５ｙＱ遠心チユーブに注く。等
容量のフェノールを加えて混合物を激しく振盪し、−７
０００で再び凍結させる。混合物を室温で解凍し、１３
．０００Ｘｇで１０分間遠心した後、水相を取る。水相
をフェノールで更に１回、次ぎにＣＨＣＱｓで２回抽出
した。１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた後、
２倍容量のエタノールの添加によってＤＮＡを沈澱させ
、−２０’Ｃで２０分間インキュベートし、遠心する。 この方法によって、〜６．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＩＩＩ制
限フラグメント（約１０μｇ）を得た。精製したフラグ
メントをＴＥ緩衝液（１０μ１２）に再懸濁し、−２０
°Ｃで貯蔵する。 Ｄ、　　ＨｉｎｄｌＩＩｉｆｌ化プラスミドｐＵＣ１９
の単離プラスミドｐＵ　Ｃｌ　９　［Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　　１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ、　ｌＮ４６２５０または“Ｂ　ＲＬ　”（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、　　Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。 ＭＤ　２０７６０）から入手可能］（約１０μｇ）を、
実施例ＩＣの記載と同様にしてＨｉｎｄｌＩＩで消化し
た。ＨｉｎｄｌｌＩ消化ｐＵＣ１９　　ＤＮＡを、実施
例ＩＣの記載と同様にして、消化混合物をフェノール、
次ぎにＣＨＣＱ３で抽出し、エタノール沈澱することに
よって単離した。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ（約１０μ
ｇ）をＴＥ緩衝液（１０μｇ）に再懸濁し、−２０’Ｃ
で貯蔵した。 １号　　フラグメントのライゲートによるプラスミドｐ
Ｇ！−（ＴＭ３Ａの構築 実施例ＩＤで製造した、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化ｐＵＣ１９
プラスミドＤＮＡ（１μのと、実施例ＩＣで単離した〜
６　、４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌｌｌフラグメント（Ｉμ９
）を混合し、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（３００ｍＭ）リス
−Ｉ（ＣＱ、、ｐＨ７，８；１０ｍＭ　ＭｇＣ（１−：
ｌ　００ｍＭノチオスレイトールおよびｌｘｇ／ｘ（！
　ＢＳＡ）（１μの、ｌ　ＯｍＭ　ＡＴ　Ｐ（ｌ　μＱ
）、Ｔ４　　ＤＮＡリガーセ（１μの（〜１０単位）お
よびＨｔＯ（６μＱ）と共に１６°Ｃて一皮インキユベ
ートした。ライゲートされたＤＮＡは、所望のプラスミ
ド、即ちプラスミｌ−’ｐＧ　ＨＴ　Ｍ　３　Ａを構成
した。 Ｆ、ｐＧＨＴＭ３Ａによる大腸菌の形質転換犬陽閑Ｋ　
ｌ　２Ｄ　Ｈ５ａ　Ｆ　’　（Ｂｅｊｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　”ＢＲ
Ｌ”、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　　ＭＤ　２０８
７７から市販品として人手可能）のＴＹ−ブロス中５０
ｉＣ培養物をＯ，Ｄ、５９０ｎｍが〜０．２になるまで
増殖させる。培養物を水上で１０分間冷却し、遠心によ
って細胞を集める。細胞ベレットを冷ＩＱＱｍＭ　Ｃａ
ＣＬ（２５２１２）に再懸濁し、水上で２５分間インキ
ュベートする。細胞を遠心によって再びペレット化し、
ペレットを冷１００ｍＭＣａＣＣ，（２，５１のに再懸
濁し、水上で一夜インキユベートする。 この細胞懸濁液（２００μＱ）を、実施例ＩＥで製造し
た、ライゲートしたＤＮＡと混合し、氷上で２０分間イ
ンキュベートする。混合物を４２°Ｃで２分間、次ぎに
、室ｆ晶で１０分間インキュベートする。この細胞混合
物にＴＹ−ブロス（３ｘｃ）を加え、次ぎに細胞をエア
７エーカーにて３７°Ｃで２時間インキュベートする。 細胞混合物の１部分を、１００μｇ／ｍＱのアンピシリ
ンを含有しているＴＹ−アガー（１５ｇ／（！で寒天を
加えたＴＹ−ブロス）プレートに蒔き、次いで、フレー
トを３７°Ｃでインキュベートする。 大腸菌Ｋ１２ＤＨ５αＦ’／ｐＧＨＴＭ３Ａ形質転換体
を、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認
する。 実施例２　大腸菌に１２　　Ｄ）＋５αＦ″／ｐＧ　８
７Ｍ３Ａの培養およびプラスミドｐＧＨＴＭ３Ａの単離 Ａ、大腸菌ＫＩ２　　Ｄ）＋５αＦ″／ｐＧＨＴＭ３Ａ
の培養 ５０Ｍｇ／ｚ（ｌのアンピシリンを含有しているＴＹ−
ブロス（バクトートリブトンｌｏｇ、バクトイ−ストエ
キス５ｇ５ＮａＣＲＩ　０ｇ５ｐＨ７，５）（１リツト
ル）を、大腸菌ＤＨ５αＦ’／ｐＧＨＴＭ３Ａの培養と
一緒にインキュベートし、５９０ｎｍにおける光学密度
（０，Ｄ、）が〜１吸収単位になるまでエアシェーカー
にて３７℃でインキュベートし、その時点で培養にクロ
ラムフェニコール（１５０，ｗｇ）を加えた。インキュ
ベートを約１６時間続け、クロラムフェニコールの添加
によってタンパクの合成を阻害し、それによって、更な
る細胞分裂を阻害するが、プラスミドの複製は続けさせ
る。 Ｂ、プラスミドｐＧＨＴＭ３Ａの単離 実施例２Ａで調製した培養物を、ソーパルＧＳＡロータ
ー（Ｓｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡ　ｒｏｔａｒ＋　Ｄｕｐｏ
ｎｔ　Ｃｏ、＋　　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ、　　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　　Ｄｉｖｉｓｉｏ
ｎ、　　Ｎｅｗｔｏｗｎ、　ＣＮ　０６４７０）にて、
４℃、６００　ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清
を捨て、細胞ベレットをＴＥＳ緩衝ｉｆｆｌ（１０ｍＭ
トリス−ＨＣ（ｌ、ｐＨ＝７゜５；１０ｍＭ　ＮａＣＱ
：および１ｍＭＥＤＴＡ）（〜５ｏ　３！１２）中で洗
浄し、次いで再びペレット化した。 再び上清を捨てた後、細胞ペレットをドライアイス−エ
タノール浴中で凍結させ、次ぎに解凍した。 解凍した細胞ペレットを２５％シュクロース１５０ｍＭ
ＥＤＴＡ溶液（１０ｘＱ’）ニ再懸濁した。５靭／ＩＣ
のｌｊゾチーム溶液（］１ｉ２）；０．２５Ｍ　　ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ＝８．０（３ｉρ）：およびＩＯｘｇ／ｉｃ
のＲＮＡａｓｅＡ（１００μＩ２）を加えて混合した後
、溶液を水上で１５分間インキュベートした。リゾチー
ム処理した細胞に、溶解溶液［１０％トリトン−Ｘｌ　
００（３ｚ＆）；０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０
、（７ＦＭり；ＩＭ　　）リス−ＨＣ１２，１）Ｈ＝８
．０（１５１のおよび水＜７Ｈのの混合によって調製］
（３ｆｆのを加え、混合し、得られた溶液を水上にて更
に１５分間インキュベートした。溶解した細胞をドライ
アイス−エタノール浴中で凍結させ、次いで解凍した。 ５Ｗ２７０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ　７３６０　Ｎ、Ｌ
ｉｎｃｏｌｎ　Ａｙｅ、、　Ｌｉｎｃｏｌｎｗｏｏｄ、
　　ＩＬ　６０６４６）にて２５．ＯＯＯｒｐｍで４０
分間遠心することによって、溶液から細胞残骸を除去し
た。Ｃ５Ｃｊ（３０，４４ｇ）および５Ｈｇ／戻σの臭
化エチジウム溶液（〜Ｉ　ＲＱ＞を加えた後、溶液量を
４０ｘ（ｌに調節し、Ｖｔ１５０超遠心チユーブ（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ）にデカントした。チューブに栓をした後、
溶液をＶｔ１５０ローター中、４２．００Ｏｒｐｍで〜
１６時間遠心した。紫外光で可視化した、得られたプラ
スミドバンドを単離し、Ｔｉ７５チユーブおよびロータ
ー（１３ｅｃｋｍａｎ）に入れ、５５．００Ｑ　ｒｐｍ
で１６時間遠心した。容量の調節が必要な場合は０．７
６１ｇ／ｚｆ２のＣ５Ｃ（！を含有しているＴＥＳを使
用した。プラスミドバンドを再び単離し、塩飽和させた
インプロパツールで臭化エチジウムを抽出し、ＴＢＳ緩
衝液で１＝３に希釈した。次ぎに、溶液に２倍容量のエ
タノールを加え、−２０°Ｃで一夜インキユベートした
。溶液を５Ｓ３４０−ター（Ｓｏｒｖａｌｌ）にて１０
，０ＯＯｒｐ＠、１５分間遠心することによって、プラ
スミドＤＮＡをペレット化した。 この方法によって得たプラスミドｐＧＨＴＭ３Ａ　　Ｄ
　Ｎ　Ａ　（〜１　ｗｇ）をＴＥ緩衝液（ｌＱｍＭ　　
トリスＨＣ（！、ｐＨ＝８．０および１ｍＭ　ＥＤＴＡ
）（１２Ｑ）に懸濶し、−２０°Ｃで貯蔵した。 実施例３　プラスミドｐＵＣ１８ＴＭの構築Ａ、プラス
ミドｐＧＨＴＭ３Ａの〜Ｉｔ　９　ｋｂ　　Ｐ　ｐｕＭ
ｌ制限フラグメントの単離 ヒトトロンボモジュリンのコード配列を単離するために
使用した両ＰｐｕＭ１部位は、ｄｃｍメチラーゼ認識配
列、５°−ＣＣＴＧＧ−３’と重複している。この認識
配列内部のシトシン残基をメチル化すると、ＤＮＡ切断
が妨害される。このため、大腸菌に１２ＱＭ４８からプ
ラスミドｐｃ　ＨＴＭ３Ａを単離することが必要であっ
た。大腸菌に１２ＱＭ４８、即ちシトシンメチラーゼを
欠乏している株は、１９８３年１１月２３日に原寄託さ
れ、現在ではブダペスト条約の条項の下、Ｎ０ｒＬｈｅ
ｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　（“ＮＲＲＬ″）ｌＰｅｏｒｉａ、　　
１ｌｌｉｎｏｉｓ　６１６０４の永久保存培養物コレク
ンヨンから、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５７，２５の受託番号
で誰でも人手可能である。 実質上実施例ＩＦの方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＣＭ、４
３を形質転換用に調製し、プラスミドｐｃＨＴ　Ｍ　３
　Ａで形質転換した。実質上実施例２Ｂの教示に従い、
大腸菌Ｋ　１２０Ｍ４８／ｐＧＨＴＭ３Ａ形質転換体か
らプラスミドｐＧＨＴＭ３Ａを単離した。 大腸菌Ｋ　１２０Ｍ４８／ｐＧＨＴＭ３Ａ形質転換体か
ら単離したプラスミドｐＧＨＴＭ３Ａ　ＤＮＡ（２０μ
ｇ）を、Ｉ　ＯＸ　ＰｐｕＭ　ｒ反応緩衝液（５００ｍ
Ｍ　ＮａＣ（！：１００ｍＭ　　）リス−ＨＣＬＩ）Ｈ
７，４；ｌ　００ｍＭ　ＭｇＣｌ２−；ｌ　００ｍＭ　
　２−メルカプトエタノール；　１　ｘｇ／　ｘＱのウ
シ血ｌ青アルフ゛ミン）（ＩＯμの、制限酵素ＰｐｕＭ
　Ｉ　（１０ｔｔの（〜１５単位）およびＨ，０（８５
μＱ）に溶解し、得られた反応物を室温で一夜インキユ
ベートした。Ｐ　ｐｕＭ■消化したプラスミドｐＧＨＴ
Ｍ３Ａ　　ＤＮＡを、実質上実施例１の教示に従って１
％アガロースゲルに負荷し、所望の〜１．９ｋｂ　Ｐｐ
ｕＭＩ制限フラグメントを単離し、精製した。得られた
フラグメント（〜２μｇ）をＴＥ緩衝液（１０μＱ）に
溶解し、２０℃で貯蔵した。 Ｂ、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌリンカ−の構築リンカ−の構
築において使用したＤＮＡフラグメントは、シスチック
１４５０Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（Ｓｙｓｔｅｃ　１
４５０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、　５ｙｓ
ｔｅｃ　Ｉｎｃ、、　３８１６　Ｃｈａｎｄｌｅｒ　Ｄ
ｒｉｖｅ、　Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、　ＭＮ）または
ＡＢ３　３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢ３３
８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、　Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。 Ｉｎｃ、、　８５０　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｃｅｎｔｒｅ　
Ｄｒｉｖｅ＋　ＦｏｓｔＬｒ　Ｃ１ｔｙ。 ＣＡ９４４Ｑ４）のいずれかの使用によって合成した。 多数のＤＮＡ合成装置が当業者に知られており、所望の
フラグメントを製造するために使用することができる。 また、フラグメントは、実質上イタクラ等（Ｉｔａｋｕ
ｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ、　
１９８：１０５６）およびフレア等（Ｃｒｅａ　ｅｔ　
ａｌ、’、　１９７Ｂ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、　７５：５７６５）の方法
に従い、常法によって製造することもできる。 リンカ−の各１本鎖（５００ピコモル）を、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（１５単位）（〜０．５μρ）、Ｉ
ＯＸリガーゼ緩衝液（３００ｍＭトリス−ＨＣ（１，ｐ
Ｈ＝７．８；Ｉ　００ｍＭ　ＭｇＣＬ；ｌ　００ｍＭジ
チオスレイトール；およびｌ　＊ｇ／　ｘＱのＢＳＡ）
（２μＱ）、５００μＭ　ＡＴＰ（ＬｏμのオヨびＨ，
０（７，５μｍ２）を含有している反応緩衝液（２０μ
の中でキナーゼ処理した。キナーゼ反応物を３７°Ｃで
３０分間インキュベートし、１００°Ｃで１０分間イン
キュベートすることによって反応を停止させた。完全な
処理を保証するために、反応物を水上で冷却し、０．２
Ｍジチオスレイトール（２μｇ）、５ｍＭ　ＡＴＰ（２
，５μのおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１５単
位）を加えて〆見合し、反応混合物を３７°Ｃで更に３
０分間インキュベートした。 １００℃で更に１０分間インキュベートすることによっ
て反応を停止させ、次いで、氷上で冷却した。 ＤＮＡリンカ−の２本鎖を別個にキナーゼ処理したが、
キナーゼ反応後、混合した。鎖をアニーリングさせるた
め、キナーゼ反応混合物を、水（〜１５０１ｅ）を入れ
た水浴中、１００°Ｃで１．０分間インキュベートした
。このインキュベーション後、水浴の加熱を停止して室
温まで冷却した。この工程に約３時間を要した。次ぎに
、キナーゼ処理したＤＮＡのチューブを入れたままの水
浴を、４°Ｃの冷蔵庫に一夜入れた。この工程によって
１本鎖どうしがアニーリングした。合成されたリンカ−
は、以下の構造： を有した。リンカ−を、必要時まで一２０’Ｃで貯蔵し
た。 Ｃ，ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＴ消化プラスミドｐＵＣ１８の
単離 プラスミドｐＵ　Ｃ１８Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　　１ｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ、　　ＩＮ　４６２５０；またはＢＲＬ、　Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ　２０７６０）（約１０μ
ｇ）を、１０ＸＥｃ。 ＲＴ反応緩衝液（５００ｍＭ　ＮａＣＱ、　　Ｉ　Ｍ　
）リスＨＣｆ２．ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＭｇＣＱｌ、
１　ｍｇ／　ｗＱのウシ血清アルブミン）（ｌＯμの、
制限酵素Ｅｃ。 Ｒ１（５μｍ２Ｘ〜５０単位）、およびＨ２Ｃ（８５μ
０に溶解し、反応物を２時間、３７°Ｃで置いた。次ぎ
に、反応混合物をＮａ０Ａｃ中０．２５Ｍにし、２倍容
量のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴中
で冷却した後、遠心によってＤＮＡをペレツト化した。 ＤＮＡペレットを１ＱＸＰｓｔｒ反応緩衝液（ＩＭ　Ｎ
ａＣＱ、ｌ　００ｍＭ　トリス−ＨＣｆ２、ｐＨ７，５
、］　０００ｍＭＭｇＣ（、，１ｉｇ／　ｚＱ（Ｄ　ウ
シ血清アルフミン）（１０μ１２）、制限酵素Ｐ　ｓｔ
　Ｔ　（５μ１２）（〜５０単位）およびＨ、Ｏ（８５
μＱ）に溶解し、反応物を２時間、３７°Ｃで置いた。 Ｐｓｔ［で消化した後、反応混合物をフェノールで１回
、ＣＨＣρ、で１回抽出し、消化されたＤＮＡを上記と
同様にして沈澱させ、ペレット化した。 ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ消化したプラスミドｐＵＣ１
８を構成するＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（１０μのに
再懸濁し、使用時まで一２０°Ｃで貯蔵した。 Ｄ、フラグメントのライゲートによるプラスミドｐＵＣ
１８ＴＭリンカ−の構築 実施例３Ｂで製造したＥｃｏＲｒ　−Ｐｓｔ　Ｉリンカ
−（１μＱ）および実施例３Ｃで製造したＥｃｏＲｒＰ
ｓｔｌ消化プラスミドｐＵＣ１８（１μジ）を混合し、
次いで、１０×リガーゼ緩衝液（１μの、１０ｍＭ　Ａ
ＴＰ（ｌ　μの、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ（１μａ＞＜
〜１０単位）、およびＨ，○（７μＱ）と−緒に１６°
Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮＡは
、所望のプラスミド、即ちプラスミド１）ＵＣ１８ＴＭ
リンカ−を構成していた。プラスミドの制限部位および
機能地図を添付の図面の第３図に示す。 Ｅ、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭリンカ−の単離実施例３
Ｄで製造した、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭリンカ−を構
成しているライゲートされたＤＮＡを使用し、実質上実
施例ＩＦの記載と同様にして、大腸菌Ｋ］２ＤＩ−１５
αＦ゛細胞を形質転換する。大腸菌に１２　　ＤＨ５α
Ｆ’／ｐＵＣ１８７Ｍリンカ−形質転換体を、そのプラ
スミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認した。１個の
大腸菌　ＫＩ２　　ＤＨ５αＦ’／ｐＵＣＴＭ！Ｊ７カ
ー形質転換体を実施例２Ａの記載に従って培養し、この
培養物から実施例２Ｂの記載と同様にしてプラスミドｐ
ＵＣＩ、８ＴＭリンカ−ＤＮＡを単離した。 Ｆ、ＰｐｕＭＩｔ肖化プラスミドｌ）ＵＣ１８ＴＭリン
カ−の単離 プラスミドｐＵＣ１８７Ｍリンカ−ＤＮＡ（約１０μｇ
）を、実質上実施例３Ａの記載と同様にして’ＰｐｕＭ
Ｊ制限酵素で消化した。実施例３Ｃの記載と同様にして
フェノール抽出およびＣＨＣ（１３抽出した後、Ｐｐｕ
ＭＩ消化ＤＮＡを、エタノール沈澱させた。ＰｐｕＭｌ
消化ｐＵＣ１８ＴＭリンカ−ＤＮＡ（〜ｌＯμｇ）を構
成するＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（１０μＱ）に再懸
濁し、使用時まで一２Ｏ′Ｃで貯蔵した。 Ｇ　フラグメントのライゲートによるプラスミド１）Ｕ
Ｃ１８ＴＭの構築 実施例３Ａで製造した〜１．９　ｋｂ　ＰｐｕＭ　Ｉ制
限フラグメント（Ｉμｇ）を、実施例３Ｆで製造したＰ
ｐｕＭ１１肖化ｐＵＣ１８ＴＭリンカ−ＤＮＡ（１μｇ
）と混合し、実質上実施例３Ｄの記載と同様にしてライ
ゲートした。 ライゲートされたＤＮＡは、所望のプラスミドｐＵＣ１
．８ＴＭを構成した。プラスミドの制限部位および機能
地図を添付の図面の第４図に示す。 プラスミドｐＵＣ１８７Ｍを、プラスミドの好ましい供
給源であり貯蔵容器である大腸菌に１２ＤＨ５αＦ′に
導入した。プラスミドは、ＮＲＲＬに寄託され（１９８
９年７月２０日）、そのパーマネントストックカルチャ
ーコレクションの一部を構成している株から常法により
単離することができる。この株は、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１
８５２４の受託番号で入手可能である。 ト１．プラスミドｐＵＣ１８ＴＭの単離実施例３Ｇで製
造した、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭを構成しているライ
ゲートされたＤＮＡを使用し、実施例１の記載と同様に
して大腸菌に１２　　ＤＨ５αＦ°細胞を形質転換した
。大腸ｆｉＫ１２ＤＨ５αＦ’／ｐＵＣ１８７Ｍ形質転
換体を、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認
した。１個のに１２　　ＤＨ５αＦ’／ｐＵＣｌ　８Ｔ
Ｍ形質転換体を実施例２Ａの記載と同様にして培養し、
実施例２Ｂの記載に従ってこの培養からプラスミドｐＵ
Ｃ１８ＴＭ　ＤＮＡを単離した。 実施例４　プラスミドｐｈｄＴＭＤｌの構築Ａ、Ｂｓｍ
Ｉ消化プラスミドｐＵＣ１．８ＴＭの単離実施例３Ｈの
記載の様にして製造し、単離したプラスミドｐＵＣ　ｌ
　８ＴＭ（１０μｇ）をｌＱＸＢｓｍＩ制限緩衝液（５
００ｍＭ　ＮａＣｌ２．１００ｍＭ１−リス−ＨＣＱ、
ｐＨ７，４、ｌ　ＯＯｍＭ　ＭｇＣＱｔ、１００ｍＭ２
−メルカプトエタノール、１　ｉｇ／　ｚ（ｌのウシ血
清アルブミン）（ｌＯμＩ２）、ＢｓｍＩ（〜５０単位
、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（１０μ
（２）およびＨ，０（８５μのに溶解した。反応混合物
をパラフィン油下、６５°Ｃでインキュベートし、実施
例３Ｃの記載と同様にしてフェノールで１回、ＣＨＣ（
１，で１回抽出し、ＤＮＡを沈澱させた。 ＢｓｍＩ消化したｐＵＣ１８ＴＭ　ＤＮＡを、〜４゜２
ｋｂと〜、４６ｋｂフラグメントが明らかに分離される
まで１％アガロースゲルにて電気泳動させた。 実施例ＩＣに従って〜４．２ｋｂフラグメントを単離し
、精製した。 Ｂｓｍ１消化ｐＵＣ１８ＴＭ　ＤＮＡを構成する精製フ
ラグメント（〜８μｇ）をＴＥ緩衝液（１０μｇ）に再
懸濁し、−２０°Ｃで貯蔵した。 Ｂ、Ｂｓｍ１消化１）ＵＣ１８ＴＭのライゲーションに
よるプラスミドＩ）ＵＣ１８ＴＭＤ１の構築実施例４Ａ
で製造したＢｓｍＩ消化ｐＵＣｉ８ＴＭＤＮＡ（２分の
１μｇ）を、実質上実施例３Ｄの記載と同様にしてライ
ゲートすることによって再環化した。ライゲートされた
ＤＮＡは、所望のプラスミド、即ちプラスミドｐＵＣ１
８ＴＭＤ１を構成した。プラスミドの制限部位および機
能地図を添付の図面の第５図に示す。 Ｃ，プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤＬの単離実施例４Ｂで
製造した、ライゲートされたＤＮＡを構成成分とするプ
ラスミドｐＵＣ１３ＴＭＤ１を使用し、実施例１の記載
と同様にして大腸菌Ｋ］２ＤＨ５αＦ“細胞を形質転換
した。大腸菌ＫＩ２　　ＤＨ５αＦ’／ｐｏ　Ｃ１８Ｔ
ＭＤ　１形質転換体を、プラスミドＤＮＡの制限酵素分
析によって確認した。１＠の大腸菌Ｋ１２　　ＤＨ５α
Ｆ／ｐＵＣＩ　８　ＴＭＤ　１形質転換体を実施例２Ａ
の記載と同様にして培養し、実質上実施例２Ｂの記載と
同様にしてこの培養からプラスミドｐＬＪｃ１８ＴＭＤ
１を単離した。 Ｄ、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤ　１の〜１．５ｋｂＢ
ａｌｌ制限フラグメントの単離 制限酵素ＢｃＱ（でＤ　Ｎ　Ａを完全に消化するために
は、認識配列中のデオキシアデニル残基がメチル化され
ていてはいけない。後にＢｃＱＩて消化しようとするプ
ラスミドＤＮＡを大腸菌中で製造する場合、前記の大腸
菌Ｋ　Ｉ　２０Ｍ４８、即ちＮＲＲＬ　　［３−１５７
２５の様なアデニンメチラーゼを欠乏している株の使用
が必要である。 実質上実施例１の方法に従い、大腸菌Ｋ１２Ｇ　Ｍ　４
８を形質転換用に調製し、次いで、プラスミドｐＵＣ１
８ＴＭＤｌで形質転換した。実質上実施例２Ｂの教示に
従い、大腸菌に１２ＧＭ４３／ｐＵＣＴＴＭＤ　ｌから
プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤＩＤＮＡを単離した。 大腸菌Ｋ　１２０Ｍ４８／ｐＵＣ　１８ＴＭＤ　１形質
転換体から単離したプラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤＩ　Ｄ
ＮＡ（５０μｇ）を、１０ＸＢｃＱ１反応緩衝液（７５
０ｍＭ　ＫＣに６０ｍＭ　　トリス−ＨＣρ、ｐＨ＝７
．４；１００ｍＭ　ＭｇＣ（−；１０ｍＭジチオスレイ
トール；および１　ｘｇ／峠のＢＳＡ）（１０μＱ）、
制限酵素Ｂｃ１２Ｉ（５μの（〜５０単位）、およびＨ
２Ｃ（８５μｇ）に溶解し、得られた反応物を５０’Ｃ
で２時間インキュベートした。Ｂｄｌ消化したプラスミ
ドｐＵＣ１８ＴＭＤ　Ｉ　　ＤＮＡを、実質上実ｍ　例
３Ａの教示に従って１％アガロースゲルに負荷し、所望
の〜１．５ｋｂＢｃ（Ｉ制限フラグメントを単離し、精
製した。得られたフラグメント（〜１０μｇ）をＴＥ緩
衝液（１０μＱ）に溶解し、−２０°Ｃで貯蔵した。 Ｅ、ＢｅＱｒ消化プラスミドｐｈｄの単離実質上実施例
１の方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＧＭ４８を形質転換のた
めに調製し、哺乳動物の発現プラスミドｐｈｄで形質転
換した。プラスミドｐｈｄの制限部位および機能地図を
添付の図面の第６図に示す。大腸菌に１２／ｐｈｄはＮ
ＲＲＩ、に寄託されており（１９８９年７月２６日）、
ＮＲＲＬＢ−１８５２５の受託番号で入手可能である。 実質上実施例１の教示に従い、大腸菌に１００Ｍ４８／
ｐｈｄ形質転換体からプラスミドｐｈｄＤＮＡを単離し
た。 大腸菌Ｋ　ｌ　２　０Ｍ４８／ｐｈｄ形質転換体から単
離したプラスミドｐｈｄ　ＤＮＡ（５０℃１ｇ）を、１
ＱＸＢｃ（Ｔ反応緩衝液（７５０ｍＭ　ＫＣＣ；６００
１Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．４　；　１００ｍＭ　
ＭｇＣＬ；１０ｍＭジチオスレイトール；および１　ｘ
ｇ／　ｘ（ｌのＢＳＡ）（１０μ（り、制限酵素Ｂｃ＋
２１（５μ（り（〜５０単位）、およびＨ，０（８５μ
Ｑ）に溶解し、得られた反応物を５０℃で２時間インキ
ュベートした。 実施例３Ｃの記載の様にして、フェノール抽出、次いで
ＣＨＣｌ２．抽出した後、消化されたＤＮＡをエタノー
ル沈澱させた。Ｂｃｆ２Ｉ消化プラスミドｐｈｄを構成
するペレットをＴＥ緩衝液（１０μｇ）に再懸濁し、−
２０℃で貯蔵した。 Ｆ、Ｂｃｆｆｌフラグメントのライゲートによるプラス
ミドｐｈｄＴＭＤ１の構築 実施例４Ｄで製造した〜１．５ｋｂＢｃＣＩフラグメン
ト（１μｇ）を、実施例４Ｅで製造したＢｃ（２Ｉ消化
プラスミドｐｈａ（０，５μｇ）と混合し、実質上実施
例３Ｄの記載と同様にしてライゲートした。 ライゲートされたＤＮＡは、プラスミドＩ）ｈｄＴＭＤ
Ｉを構成した。プラスミドの制限部位および機能地図を
添付の図面の第７図に示す。 Ｇ、プラスミドｐｈｄＴＭＤｌの単離 実施例４Ｆで製造した、ライゲートされたＤＮＡを構成
成分とするｐｈｄＴＭＤｌを使用し、実施例１の記載と
同様にして大腸菌Ｋ１２ＤＨ５αＦ°細胞を形質転換し
た。大腸菌ＫＩ２　　Ｄ）（５αＦ“／ＰｈｄＴＭＤ１
形質転換体を、プラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て確認した。正しい方向性の１．５ｋｂＢｃＱ１挿入体
を含有している形質転換体は、プラスミドＤＮＡ（１μ
ｇ）を、ｌ００ｍＭＮａＣｆｆ、５０ｍＭトリス−ＨＣ
＆、ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＭｇＣＩ２２中３７°Ｃで
１時間消化した後、以下の制限フラグメントを与えた：
〜４　、６　ｋｂ、〜２．６ｋｂ、〜１．　、６　ｋｂ
および〜１　、４　ｋｂ０フラグメントを、実施例１に
記載の方法で１％アガロース電気泳動し、臭化エチジウ
ム染色することによって同定した。 正しい方向性を有する１個の大腸菌Ｋ１２　　ＤＨ５α
Ｆ’／ｐｈｄＴＭＤ　１形質転換体を、実施例２人の記
載と同様にしてＴＹ−グロスで培養した。 実施例２Ｂの記載と同様にしてこの培養からプラスミド
ＤＮＡを単離した。残留している微量のＣ３ＣＱを除去
するために、単離したプラスミドｌ）ｈｄＴＭＤＩ（〜
１Ｍｇ）を実施例３Ｃに従って、２回、ＴＥ緩衝液（１
０仄のに再懸濁し、エタノール沈澱させた。プラスミド
ｐｈｄＴＭＤＩを構成しているＤＮＡペレットをＴＥ緩
衝液（Ｉ　Ｍ（１’）に再懸濁し、２０°Ｃで貯蔵した
。 実施例５　　ＡＶ１２／Ｉ）ｌ＋ｄＴＭＤｌおよび２９
３　／　１）ｈｄ　Ｔ　Ｍ　Ｄ　ｌ形質転換体の構築以
下の方法は、ＡＶ　１２／ｐｈｄＴＭＤ　ｌおよび２９
３／ｐｈｄＴＭＤ　ｌ形質転換体の構築を説明する。ま
た、この方法は、本明細書にて好ましいセルラインとし
て既述したセルラインに概ね適用可能である。真核生物
宿主細胞のための形質転換法は、当業者に周知である。 例えば、ウィグラー等（Ｗｉｇｌｅｒ、ｅｔ　ａｌ、）
、　　１９７９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５
ｃｉ（ＵＳＡ）　７６、１３７３およびグラハム等（Ｇ
　ｒａｈａｍ、　ｅｔａｔ、　）＋　　１９７３＋　Ｖ
ｔｒｏｌｏｇｙ　５２＋　４５６を参照されたい。 Ａ、細胞の調製 それぞれ、ＡＴＣＣＣＲＬ　　＋５７３およびＣＲＬ　
　９５９５の受託番号でアメリカン・タイツ・カルチャ
ー・コレクションから入手し得るヒト２９３細胞（“２
９３細胞”）およびシリアン（３ｙｒｉａｎ）ハムスタ
ーＡＶ１２−６６４細胞（“ＡＶ１２細胞”）の培養物
を、形質転換前に１日培養し、１０％ｖ／ｖウシ胎児血
清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　１
７２５Ｓｏｕｔｈ　５ｔａｔｅ　Ｈｗｙ　８９−９１．
　Ｌｏｇａｎ　ＵＴ　８４３２１）および５０ｕｇ／ｘ
（ｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　　
Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　　ＮＹ　１４０７２）を
補足したダルベツコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃ。 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、、　３１７５Ｓｔａｎｌｅｙ
　Ｒｏａｄ、　０ｒａｎｄ　！５ｌａｎｄ、　ＮＹ　１
４０７２）からなる増殖培地に、１−２ＸＩＯ’細胞／
ｌｏＯｍＭ組織培養皿の密度で蒔いた。形質転換の４時
間前に、培地を取り替えた。 Ｂ、ＤＮＡの調製 プラスミドｐｈｄＴＭＤ　Ｉ　　ＤＮＡ（１０／１２μ
ｇ）を、２Ｍ　ＣａＣＬ（６２，５１１Ｑ）およびＨ，
０（４３７，５μＱ）に加えた。次いで、ＤＮＡ（Ｑ、
５買Ｑ）を、２　Ｘ　ＨｅＢ　Ｓ　［１０ｇ／　Ｌ　Ｈ
ｅｐｅｓ（ｐＨ−７，５）；　１６ｇ／Ｌ　ＮａＣＲ；
０．７４ｇ／Ｌ　　ＫＣ（２；０．２５ｇ／Ｌ　　Ｎａ
、ＰＯ，；および２ｇ／Ｌ　デキストロース］に滴下し
たところ、沈澱が生成した。この混合物を細胞に加える
前に、室温で３０−４０分間放置した。インキュベート
時間を長くすると、十分形質転換しないきめの粗い沈澱
を生じることがあるが、沈澱を形成させるためにはしば
しば、より長いインキュベート時間が必要かもしれない
。 Ｃ０細胞の形質転換 実施例５Ｂで調製したＤＮＡ溶液（Ｉ　ＲＱ）を、穏や
かな攪拌下、２９３またはＡＶ１２細胞の１００１１１
１１１皿に加え、３７℃で３−４時間インキュベートし
た。細胞が分離しないように注意しながら、実施例５Ａ
に記載の増殖培地で細胞を２回洗浄し、３７℃のインキ
ュベーターに戻した。プラスミドｐｈｄＴ　Ｍ　Ｄ　ｌ
　ハハイグロマイシンＢ耐性について選択可能なマーカ
ーを有しており、形質転換の７２時間後、２００μｇ／
１１１２のハイグロマイシンＢの増殖培地に加えること
によって安定な形質転換体を選択した。２日毎に培地を
取り替えながら、この選択培地中で２−３週間、細胞を
増殖させた。 次いで、各ハイグロマイシン耐性形質転換体を、更に増
殖および分析するために単離した。 実施例６　発現されたトロンボモジュリン誘導体の検定 野生型トロンボモジュリンは、内皮細胞表面において、
トロンビンと１；１の化学量論的高親和性？１合体を形
成する。この複合体は、生理学的カルシウム濃度で、プ
ロティンＣ酵素前駆体を迅速に活性化プロティンＣに変
換することができる。 トロンボモジュリンの非存在下では、プロティンＣのト
ロンビン依存性活性化は、生理学的カルシウム濃度によ
って強く阻害され、トロンボモジュリン　トロンビン複
合体に比較して１０００倍より遅い速度で起こる。 ２９３またはＡＶ１２細胞に導入された本発明のベクタ
ーによって調整培養培地中に産生された、発現された可
溶性ヒトトロンボモジュリン活性の検定には、トロンビ
ン単独と比較した、トロンボモジュリンニトロンビン複
合体の上記特性を利用する。この検定は、以下の様にし
て行う：可溶性トロンボモジュリンの活性についてスク
ｌ−ニングする場合、安定な２９３またはＡＶＩ２／ｐ
ｈｄＴＭＤ　ｌ形質転換体を２４ウ工ル組織培徨クラス
ター中、増殖培地（実施例５Ａに記載した培地）にて増
殖させた。ウェルが〉８０％の面を覆う増殖となった時
、増殖培地を除去し、細胞単層をハンクス平衡塩溶液［
ｔ（ａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔＳｏｌｕｔ
ｉｏｎ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌ
ｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、、　
Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ　１４０７２）］で
２回洗浄し、３：ｌの血清不含の培地（１峠）を加えた
。 血清不含の培地は、ダルベツコの改良イーグル培地３部
およびＦ１２培地１部（両者共、Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ、　　Ｉｎｃ、製）に、１０−’Ｍセレニウム、５Ｘ
ｌＯ−’Ｍエタノールアミンおよび１ｔｔｇ／ｘＱのビ
タミンＫ（全て、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
、、　ｓｔ、　　Ｌｏｕｉｓ、　　ＭＯ６３１７ｇ製）
；２．４ｇ／（！のＮａＨｃｏ、およびｌμｇ／ｘｇの
トランスフェリン（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｒｉｃ
　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　　ＩＬ　６０５６６）；２
　ＸＩＱ”Ｍ　ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ。 Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ８３１７８）；１　ｕｇ／ｌｓＱの
インシュリンおよびｌμｇ／ｘＱのトブラマイシン（Ｅ
ｌｉ　Ｌｉ１ｌｙ　ａｎｄＣｏ、、　　Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ、　　ＩＮ　４６２３５；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ６
３１７８）を加えたものである。 ３７℃で一部インキュベート後、血清不含の調整培地を
取り、１３，０ＯＯ９で遠心して細胞残骸および微粒子
を除去した。 次ぎに、各試料からの調製培地（１０μＱ）を、９６ウ
エルプレート中、検定用緩衝液（０，０２Ｍトリス（ｐ
Ｈ７，４）、０．１ＭＮａＣ（！、３．Ｏｎ＋ＭＣａＣ
Ｌ）に加えた。各試料に、検定用緩衝液中５０μｇ／　
ｘ（ｌのヒトプロティンＣ酵素前駆体（ＧｒｉｎｎｅＩ
ｆ、Ｂ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
、　５．　１１８９（１９８７）の方法に従って入手可
能）溶液（５０μｍ２）、検定用緩衝液中２Ｎ、１．Ｈ
，単位／ＩＩａのウシトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　３０ＯＮ
、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ　Ｓｔ、　５ｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ
、　ＩＮ　４６６０１）溶液（２０μｌりを加えた。次
ぎに、試料を回転プレート上、３７°Ｃで３０分間イン
キュベートした。トロンビンのセリンプロテアーゼ活性
を妨害するために、検定用緩衝液中５０アンチトロンビ
ン単位／！１２のヒルジン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ６３１７
８）溶液（２０μｇ）を加え、試料を３７°Ｃで更に５
分間インキュベートした。検定用緩衝液中４１１ＩＭ発
色性基質Ｓ２３６６　（Ｈｅｌｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ、　Ｂｅａｕｍｏｎｔ、　ＴＸ）溶液（２５
μｍ２）を加え、Ｕ　Ｖ　ｍａｘ自動プレートリーダー
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃａｒｐ、、
　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ９４３９４）を使用し、
４０５＋ｒｍで光学密度を読み取った。基質Ｓ−２３６
６は活性化プロティンＣに対して特異性を示すので、４
０５ｎＩ１１におけるＯ、Ｄ。 の増大は試料中の活性化プロティンＣの量に比例する。 調整培地中でのトロンボモジュリンの活性は、新たに調
製した活性化組換ヒトプロティンＣの標準曲線と、試料
の○、Ｄ、読み取りを比較することによって、μｇ活性
化プロティンＣ／ｚＱ／分の単位で測定することができ
た。また、試料中のトロンボモジュリン濃度のμｇ／　
ｘ（ｌ単位での評価は、精製し、界面活性剤によって可
溶化したウサギトロンボモジュリンの標準曲線と比較す
ることによって決定することができた。 （以下、余白） 実施例７　可溶性ヒトトロンボモジュリン誘導体の精製 Ａ、クローンの増殖および血清不含調整培地の収集 実施例６に記載のトロンボモジュリン検定により、２９
３またはＡ　Ｖ　１２／ｐｈｄＴＭＤ　１形質転換体は
血清不含調整培地（その組成は実施例６Ａに記載されて
いる）に、可溶性トロンボモジュリン活性を分泌するこ
とがわかった。トロンボモジュリンの発現レベルは、−
夜３７°Ｃに保った場合、０．２−２．５μ９／ｙ（ｌ
の範囲にあった。 本発明に係る可溶性ヒトトロンボモジュリン誘導体を〜
０．２μｇ／ｘ（１発現する２９３およびＡＶ＋　２／
ｐｈｄＴＭＤ　ｌ形質転換体を、両者とも、１０個のロ
ーラーボｌ−／喧〜８５０ｃｍ２）中、単層全面生長に
なるまで生長させた。この段階で増殖培地を＋００ｊ１
（１！の３：ｌ血清不含培地／ローラーボトルに代え、
３７°Ｃで２４時間培養した。この最初の調整培地１ｏ
ｏｘＱを捨て、新しい血清不含培地１００１Ｃに代えた
。以降、血清不含調整培地の収集は、２４時間毎に行っ
た。１０個のローラーボトルから集めたこの調整培地（
〜１ρ）を４℃で３０分間、１３，０ＯＯＸ９で遠心し
、デカントし、＝２０°Ｃで保存した。通常、８〜１０
回収集し、血清不含調整培地を８〜１０１２得た後は、
過増殖のため、培養を捨てた。 調整培地を４°Ｃで解かし、４°Ｃで３０分間、１３．
０００Ｘｙで遠心した後、以下に記載する精製工程にか
けた。 Ｂ、　高速Ｑセファロースアニオン交換クロマトグラフ
ィー 本発明の可溶性ヒトトロンボモジュリンのＩＪ’Ｊの初
期段階として、高速Ｑ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　Ｉｎ
ｃ、、　　Ｐ、Ｏ，Ｂ。 Ｘ　１３２７．　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　　Ｎ　Ｊ　
）カラムを使用した。 カラム（１，６Ｘ２０ｃｍ）を、カラムの２０倍容量の
０．１ＭＮａＣｆ２．０．０２Ｍ　　ｌ−リス−ＨＣＱ
（ｐＨ７，４）、０．１ｎＭＥＤＴＡおよび０．０２％
（ｗ／ｖ）　Ｎ　ａＮ　＝を用い、２．０ｎ（１／分の
流速で予め平衡化した。次いで、血清不含調整培地２り
を、流速２　ｘ（１／分、４°Ｃで一夜かけて流入した
。カラムを、カラムの１０倍容量の平衡緩衝液で洗浄し
た。 １ＭＮａｃＱ、０．０２Ｍ　　トリス−ＨＣｄ（ｐＨ７
４）、Ｑ、ｌ、ｗＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）
ＮａＮ３による段階的溶出により、カラムからトロンボ
モジュリン活性を６Ｏ−１００ｘＱの容量中に回収した
。 Ａ　ＩＴｉｇｅｌ　−１０（誘導化架橋アガロースのＮ
ヒドロキシスクシンイミドエステル）親和性ゲルマトリ
ックス（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　　ＣＡ
　９４８０４）　１０Ｒ（ｌを水冷した蒸留水２００ｉ
Ｑで洗浄した。このゲル１０ｊＩＱに、牛トロンビン（
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、　５ｏｕｔｈ　Ｂｅｎｄ、　　ｒ　Ｎ　４６６
０１）を５０１ｔＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，６）中、２
ｘｙ／ｘＱで含む溶’ｒ＆　２５　ｙＱを加えた。４°
Ｃで４時間、おだやかに動かして、トロンビンをゲルマ
トリックスにカップリングさせた。ゲルを沈降させた後
の上澄みをＯＤ、２８０ｒ＋ｍで測定した結果、カップ
リング効率は通常約９５％であった。１Ｍグリシン（ｐ
Ｈ８゜０）１．０スｅを加え、４°Ｃで一夜インキユベ
ートすることにより、親和性マトリックス上のそれ以上
の未反応部位をブロックした。ゲルを５０＋＋ＭＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７，６）で１０回洗浄して、結合せずに残っ
たトロンビンを除去した後、この親和性マトリックスを
５０ｍＭジイソプロピルフルオロフォスフェートで、４
℃で１０時間処理した。マトリックスをこの様に処理す
ると、結合したトロンビンの組換トロンボモジュリンへ
の結合能を損することなく、そのセリンプロテアーゼ活
性が阻止される。　　ジイソプロピルフォスフオロトロ
ンビン親和性カラムを徹底的に洗浄して過剰のジイソプ
ロピルフルオロフォスフェートを除去し、２村／分の流
速、４℃で、０．０２Ｍ　ＮａＣＱ、０．０２Ｍトリス
−ＨＣｌ２（ｐＨ７，４）、１　、　ＯｘＭ　ＣａＣＩ
２ｔ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３により平衡化した
。 実施例７Ｂで調製した高速Ｑ−セファロース溶出液を濃
縮し、０．０２Ｍ　ＮａＣｆｆ、０．０２Ｍ）リス−Ｈ
Ｃ（！（ｐＨ７，４）、０．００　ＬＭ　ＣａＣＱ２．
０．０２％（ｗ／ｖ）　Ｎ　ａ　Ｎ３を用いて限外濾過
により脱塩した。この、緩衝液４０ｙＱ中に約７０次９
のタンパクを含んでいる脱塩した試料を、ジイソプロピ
ルフォスフオロトロンビン親和性カラムに、０５　：ｉ
（！／分の流速で流入した。結合しなかったものは、ル
ープおよび螺動ポンプを使ってカラムに再流入した。こ
の様にして、組換トロンボモジュリンの親和性カラムへ
の結合を最大限にする様、親和性カラムへの試料の連続
的な流入を、４°Ｃで一夜、保持することができた。 次いでカラムを１０倍容量の平衡緩衝液で洗浄し、１Ｍ
Ｎａｃｆ２．０．０２Ｍ　　トリス−ＨＣ（！（ｐＨ７
，４）、０．０００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０２％（Ｗ／
Ｖ）　Ｎ　ａＮ　、による段階的溶出により、結合した
組換トロンボモジュリンを３Ｏ−５Ｃ１＋（！の容量中
に得た。このジイソプロピルフォスフオロトロンビン親
和性カラムにより精製した可溶性トロンボモジュリンを
限外濾過により、容ｆｆ１ｌ−２ｊｌＱにまで濃縮した
（１０−２０巧／′１の。 Ｄ、サイズ排除クロマトグラフィー 実施例７Ｃで調製した、親和性クロマトグラフィーによ
り精製した（以下、アフィニティー精製という）ヒトト
ロンボモジュリン誘導体を、セファロース−６ＨＲ１０
／３０カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　　Ｉｎｃ、、　Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ、　　ＮＪ０８８５５）を用いてサイズ排除クロマ
トグラフィーにかけた。移動相緩衝液（５０ｍＭ　Ｎ　
ａ　ｔ　Ｐ　Ｏ４（ｐＨ７５）、０．１Ｍ　ＮａＣＱ、
Ｏ，，１％（ｗ／ｖ）　Ｎ　ａＮ　ｓ、０．０５％（ｖ
／ｖ）ツウィーン２０）を使って、流速０．１ａｆ２／
分、室温で、カラムを一夜平衡化した。 実施例７Ｃで調製した、濃縮アフィニティー精製トロン
ボモジュリン２００μｄ（３〜６回純化処理）２００μ
Ｑをカラムに入れた。カラムを移動相緩衝液により、０
　、５　ｙＱ１分の流速で溶出した。フラクションを集
め、実施例６Ａに記載の方法でトロンボモジュリン活性
を測定した。 可溶性組換トロンボモジュリン活性の大部分く〉９０％
）は、このカラムから、フラクション２５（１２，５ｉ
（）からフラクション４０（２０ｚＣ）の間に溶出し、
分子サイズに基く２つの主要ピークに分けることができ
た。即ち、２つのグループ（プール）の可溶性組換トロ
ンボモジュリンが調製された。 プールＮｏ、１はフラクション２５−３３に溶出した大
きい分子種（保持時間〜１５１１２）を含んでおり、プ
ールＮＯ１２はフラクション３４−４０に溶出した小さ
い分子種（保持時間〜１７Ｒ（りを含んでいる。 高分子ｍおよび低分子量のトロンボモジュリン誘導体の
両者を、モノーＱＨＲ５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’、　　Ｉｎ
ｃ、＋　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　　Ｎ　Ｊ　　０８８
５５）を使ったアニオン交換クロマトグラフィーにより
、更に精製した。いずれの場合も、カラムは０．０２Ｍ
　ＮａＣ（！Ｓ、０．０２Ｍ　　トリス−ＨＣＣ（ＰＨ
７，８）、０．００１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ
３で平衡化した。 実施例７Ｄで調製した高分子量サイズの可溶性トロンボ
モジュリン誘導体を含有しているプールＮｏ、ｌは、モ
／−Ｑカラムに、１　ｘ（１／分の流速で適用した。９
５％以上のトロンボモジュリン活性がカラムに結合し、
０．０２Ｍトリス−ＨＣ（！（ｐＨ７，８）、０．００
０１Ｍ　ＥＤＴＡ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ＊中の
０９０２から２ＭのＮａＣ（！によるリニアーグラジェ
ント２０Ｒ（ｌにより溶出することができた。組換トロ
ンボモジュリン活性の幅広いピークが１から１．６Ｍの
ＮａＣｌ２約６３２（中に溶出した。この物質は高分子
量の可溶性ヒトトロンボモジュリン誘導体を構成してい
た。その性質は、後に述べる。 実施例７Ｄで調製した低分子量の可溶性ヒトトロンボモ
ジュリン誘導体を含有しているプールＮｏ、２はプール
Ｎｏ、１について記載した同じ方法で、モノーＱカラム
に適用し、溶出した。この場合は、トロンボモジュリン
活性のシャープなピークが０４５から０．６５ＭのＮａ
ＣＱ約２１１２中に溶出された。この物質は、低分子量
の可溶性ヒトトロンボモジュリンを構成していた。その
性質は後に述べる。 実施例７Ｂ−７Ｄおよび上に記載した精製操作により、
Ａ　Ｖ　１２／ｐｈｄ　ＴＭＤ　ｌまたは２９３／ｐｈ
ｄ　ＴＭＤ　１形質転換体から調製した２ｇの血清不含
調製培地から、上記のそれぞれのタイプの組換トロンボ
モジュリンを約１ｙ９単離することができる。得られる
物質は、通常純度９５％以上であった。 実施例８　可溶性組換ヒトトロンボモジュリンの機能的
特性 Ａ、　　ミバエリス定数（Ｋ、）および解離定数（Ｋｄ
）の何車 野生型の界面活性剤で可溶化したヒトトロンボモジュリ
ンは、トロンビンと高い親和性のｌＩ化学量論的コンプ
レックスを形成し、その解離定数（Ｋ４）は約０．４ｎ
Ｍである（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｋ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、、　＋０４：６２８．１９８８）。実施例７の方
法で調製した純化ヒトトロンボモジュリン誘導体の解離
定数は次の様にして測定した。 ２９３およびＡＶ１２形質転換体から精製した、高分子
量および低分子量の組換トロンボモジュリン誘導体を０
．１ＭＮａＣ４，０，０２Ｍ　　トリスＨＣＣ（ｐＨ７
，５）、３ｍＭ　ＣａＣ（１，中（「緩衝液Ａ」という
）、５００　ｒ＋９／　ｔｔｒ（ｌの濃度まで希釈した
。各試料２０μＱを、９６ウエルプレートで、緩衝液Ａ
１００ａおよび緩衝液Ａ中のプロティンＣ（Ｇｒｉｎｅ
比Ｂ、上掲参照）５０μ（１／　ｚＱ溶液５０μＱと混
合した。牛トロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　５ｏｕｔｈ　Ｂａｎ
ｄ、　　Ｔ　Ｎ　４６６０１）　ｌ　ＯｕＱを、緩衝液
Ａによる連続希釈から加え、１００　０．０５ｎＭの！
囲のａ度のトロンビンを得た。反応混合物を３７°Ｃで
１０時間、回転プレート上に置いてインキユベートシた
。インキュベーンヨンの後、４倍モル過剰量のヒルジン
（２０μＣ容ｆｆｉ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ　Ｏ６３１７８
）を各ウェルに加えた。緩衝液Ａ、プロティンＣおよび
トロンビンを含んでいる対照ウェルを同様に処理した。 室温で更に５分間インキュベートした後、緩衝液Ａ中の
色素基質Ｓ　２３６６　（ｌｌｅｌｅｎａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅａｕｒａｏｎｔ、　　Ｔ　Ｘ　
）の４ｍＭ溶１Ｌ２５ｘ＆を加え、２分間インキュベー
トした後、カイネティノクミクロ平板リーダー（ＵＶｍ
ａｘ　！Ａｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒ
ｐ、、　　Ｐａｌ。 ＾１ｔｏ　ＣＡ　９４３９４）により４０５ｎｍにおけ
るＯ、　Ｄ。 を測定した。 トロンホモシュリン含有ウェルの０−Ｄ−４０５ｎ＋ｓ
に於ける読みは、バックグラウンドとしての、トロンビ
ン対照ウェルのＯ，Ｄ、、、、□での読みを引くことに
より補正した。測定した条件下では、この様にして得た
Ｏ　、　Ｄ　、　４０５ｎ＋＊の読みは、トロンボモジ
ュリン：トロンビンコンプレックスにより生成した活性
化プロティンＣの量に比例していた。 従って、活性化したプロティンＣの量は、新たに調製し
た活性化プロティンＣの標準曲線から計算することがで
きた。この方法により、プロティンＣ活性の割合（１分
間に活性化されたプロティンＣμｇ）は、トロンビン濃
度の関数として測定することができた。更にこのデータ
は、ミバエリスメンテンタイプの速度論により、市販の
プログラム（Ｅｎｚｉｆｉｔｔｅｒ、　Ｅｌｉｓｅｖｉ
ｅｒ−Ｂｉｏｓｏｆｔ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。 Ｕ、　Ｋ、）を使って、非直線的回帰分析により合わせ
ることができた。このデータ分析により、トロンボモジ
ュリンのトロンビンに対するＫｍの推定値、および飽和
トロンビン濃度での■、６８を得ることができた。 Ｋｄを求めるために、各濃度に於ける遊離のトロンビン
とトロンボモジュリンに結合したトロンビンの量を測定
した。Ｖ　ａａＸ条件下での、トロンビンと結合したト
ロンボモジュリンの割合を１００％と定義した。トロン
ボモジュリン：トロンビンコンプレックスの濃度とプロ
ティンＣ活性の割合との間に直接関係があると仮定して
、各トロンビン濃度に於ける遊離の、および結合したト
ロンビンの量を測定することができた。記載した条件下
では、用いたトロンボモジュリンの濃度は野生型トロン
ボモジュリンの分子量を７４．０００ダルトンと仮定し
て（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　１４
０：６２８、　１９８８）、０．７５ｎｍであった。従
って、与えられたトロンビン濃度に於いて、 ［トロンビン濃度合＝Ｖ／　Ｖ、、−ｘＸ　０．７５で
あり、そして ［ト貯ビ′］遊離−［ト叶ビア］全量 ［１−ａ７″：７コ結合 である。ここで、■は与えられたトロンビン濃度でのプ
ロティンＣ活性の割合、ＶｆｆｉａえはプロティンＣ活
性化の最大割合である。 この様にして得たデータを、１リガンド結合部位非直線
回帰分析（Ｅｎｚｆｉｔｔｅｒ、上掲）を使って、［ト
ロンビン］ｊ立離に対する［トロンビン］Ｉｏ合の関数
としてプロットし、解離定数（Ｋｄ）を得た。 この方法で得た、２９３およびＡＶ１２形質転換体から
精製した高分子量および低分子量のトロンホモ／ニリン
誘導体のＫｄ値を後記の表２に示す。 トロンボモジュリン：トロンビンコンプレックスによる
プロティンＣ活性化の割合（速度）はプロティンＣの濃
度に依存することがわかった。野生型ヒトトロンボモジ
ュリン、トロンビンコンプレックスのプロティンｑに対
するに１は、約０．７μＭであることが測定されている
（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｋら、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　
１４０：６２８．１９８ｇ）。実施例７の方法に従って
精製した誘導体のそれぞれについて、トロンボモジュリ
ン；トロンビンコンプレックスのプロティンＣにだいす
るに、を次の様にして測定した。 プロティンＣの濃度を７０−０．０７μＭと変え、トロ
ンビン濃度を２．２ｎＭの一定に保った他は、実施例８
Ａに記載した様に、可溶性トロンボモジュリン誘導体を
緩衝液Ａで希釈、混合した。対照ウェルは、緩衝液Ａ、
）ロンビンおよび各種濃度のプロティンＣを入れた。１
０分間３７°Ｃでインキュベートし、４倍モル過剰量の
ヒルジンを添加してトロンビンを阻害した後、プロティ
ンＣ活性化割合を実施例８Ａに記載した様に、色素Ｓ−
２３６６を使って測定した。トロンボモジュリン−含有
ウェルのＯ−Ｄ　、４０５ｎａに於ける読みを、これか
らプロティンＣ対照ウェルの○、Ｄ、４（Ｉｓ。、に於
ける読みを差し引くことにより補正した。実施例８Δに
記載のＥ　ｎｆｉｔｔｅｒプログラムを使用し、非直線
回帰分析により得られたデータを分析した。この方法に
より得た組換トロンボモジュリン：トロンビンコンプレ
ックスのプロティンＣに対するＫ。 を後記の表２に示す。 Ｃ、トロンボモジュリン誘導体の至ＪＣａ”の測定 野生型トロンボモジュリンはＣａ”°に対し飽和反応速
度を示し、ｌ−５ｍＭが至適範囲である（Ｅｓｍｏｎ、
　　Ｎ、　Ｌ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　
２５９：１２２４６．　１９８４）。 検定用緩衝液のＣａ’″濃度をかえることにより、トロ
ンボモジュリン誘導体のｃａ！″依存性を測定した。こ
の実験のために、基本的に実施例８Ａに記載した様に、
トロンボモジュリン誘導体、プロティンＣおよびトロン
ビンを、５ｎ＋Ｍがら０．０２５ｍＭのＣａＣＱ、を含
む緩衝液Ａにより適当な濃度に希釈し、混合した。トロ
ンホモシュリンｊ１体は０．７５ｎＭ、）ｏンビンは２
．２ｎＭ、プロティアＣは１．４μＭで使用した。プロ
ティンＣ、トロンビンおよび各種濃度のＣａＣ１２ｔを
含む対照反応液も調製した。実施例８Ａに記載した様に
、３７°Ｃでの１０分間活性化およびトロンビンのヒル
ジン阻害の後、４０５ｎｍでＯ，Ｄ、を測定した。トロ
ンボモジュリンニトロンピンコンプレックスにょるプロ
ティンＣの活性化はＣａ’″依存性であるが、トロンビ
ン単独によるプロティンＣの自然の活性化がＣ、′＊濃
度の減少に従って増加することは、当業者には知られて
いる。この理由で、トロンボモジュリン非存在下での対
照反応を行って、トロンボモジュリン−非依存性のプロ
ティンＣのトロンビンによる活性化を正確にコントロー
ルしなければならない。この様な反応からのＱ　、　Ｄ
　、　４ｏ５ｎ、に於ける読みを、データ解析の前にト
ロンボモジュリン含有反応から差し引いた。 反応混合物のＣａ”濃度に対するプロティンＣ活性化の
割合としてこの様なデータをプロットした結果、高分子
量と低分子量のヒトトロンボモジュリン誘導体の間に有
意差が観察された。２９３またはＡＶ１２形質転換体か
ら精製した高分子量のヒトトロンボモジュリンについて
は、Ｃａ’°依存性は典型的なミバエリスタイプの飽和
を示し、プロティンＣ活性化の至適値はｌ　　５ｍＭＣ
ａ”°濃度であった。２９３またはＡＶ１２形質転換体
から精製した低分子量のものは、プロティンＣ活性化の
割合はバイモダル（ｂｉｍｏｄａｌ）であった。即ち、
顕著な増加が濃度２００−５００μＭまで観察され、そ
の後、より高いＣａ”濃度では新進的な阻止が観察され
た。 各種の精製した組換トロンボモジュリン誘導体に対する
至適Ｃａ″′濃度を表２に示す。 表２ 血餅形成因子の欠損および循環系中の抗凝固剤の濃度を
評価するために、数多くの標準的な臨床血餅検査法があ
る。組換トロンホモシュリンＸｉ体の抗凝固活性を、２
つの血餅形成試験により調べた。即ち、「活性化された
部分的トランボブラスチン時間」（”ＡＰＴＴ″、Ｋｏ
ｅｐｋｅ、　Ｊ、　Ｅ、、　Ａｍ、　ＪＣｌｉｎ、　Ｐ
ａｔｈｏｌ、　　６３：９９０．　１９７５）および「
トロンビン血餅形成時間」（”ＴＣＴ”、Ｋｏｅｐｋｅ
、　Ｊ、　Ａ、　、　Ａｍ。 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　６８：１９１．１
９７７）である。この”ＡＰＴＴ”試験は、プロティン
Ｃ抗凝固経路の活性化量を測り、活性化されたプロティ
ンＣによるコファクターＶａおよび■ａのタンパク分解
の結果中じる血餅形成活性の低下を測定するものである
。 プロティンＣ抗凝固経路が完全に活性化されていても、
トロンビン血餅形成時間試験（ＴＣＴ）は正常値を示す
。むしろ、ＴＣＴの延長は、本明細書記１戊のトロンホ
モシュリンおよびトロンホモシュリン誘導体によるトロ
ンビンのプロ（前）凝固活性の阻止を反映している。 この試験で用いたヒト血漿は、無外傷性静脈穿刺により
採血し、全血９容量に対し、１容量の０１１Ｍクエン酸
ナトリウムを混合し、２，０００×９で１０分間遠心す
ることにより調製した。上澄の血漿を使用するまで水上
で保存した。ＡＰＴＴおよびＴＣＴの両試験は、自動化
血餅形成タイマーおよび使い捨てプラスチックキュベツ
ト（両者ともＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｌａｂｏｒ、　　Ｌａ
ｒｇｏ、　　Ｆ　Ｌ　　３３５４３）を使って行った。 ＡＰＴＴ試験に使う場合は、血漿、または一定濃度の組
換トロンボモジュリン誘導体（１５μｇ／ｍのを含む血
漿５０μＱを、活性化セファロプラスチン試薬（Ｂａｘ
ｔｅｒ　ｔ（ｅａｌＬｈｃａｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｍｅ
Ｇａｗ　Ｐａｒｋ、　　ｒ　Ｌ　６００８５）と、３７
℃で３分間混合した。次いで、０．０２Ｍ　ＣａＣＱｆ
ｆｉ５０１１（ｌを加え、血餅形成時間を測定した。Ａ
Ｖ１２および２９３細胞から精製した高分子量および低
分子量の両方のトロンボモジュリン誘導体についてのＡ
ＰＴＴ試験の結果を表３に示す。 ＴＣＴ試験用には、血漿または組換トロンボモジュリン
誘導体を含んでいる血漿５０μｇを、ＯＱ５Ｍイｌ’ゾ
ール緩衝液（ｐＨ７，３）１００ｐ（１と混合し、１２
０秒間３７°Ｃでインキュベートした。 血餅形成は、トロンビン（Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ、　
ＤｅｔｒｏｉｔＭｌ）５０Ｍｇを添加して阻止した。ト
ロンビンは蒸留水で新たに希釈し、約２０秒の血餅形成
時間を与えるのに十分な量の濃度にして使用した。種々
の組換ヒトトロンボモジュリン誘導体のＴＣＴ試験の結
果を表４に示す。 表３および表４に示した結果から当業者には理解される
様に、２９３およびＡＶ１２形質転換体から得られた高
分子量および低分子量の組換トロンボモジュリンは、十
分な抗凝固活性を持っていた。プロティンＣの抗凝固経
路の活性化を反映しているＡＰＴＴ試験、およびトロン
ビンのプロ凝固活性の直接的阻害を反映しているＴＣＴ
試験の両者に於いて、高分子量の組換トロンボモジュリ
ンは、低分子量のものより有効な抗凝固因子であること
がわかった。特に顕著なことは血餅形成時間に対する高
分子量トロンボモジュリンの効果であり、これは、天然
物から精製したウサギトロンボモジュリンによる効果を
しのぐものであった。 高分子量トロンボモジュリンは５μｙ／１ｆ２（ＡＰＴ
Ｔ試験）および３μ９／Ｒ（ＲＴ　ＣＴ試験）以上の濃
度では血餅形成時間を無制限に延長させた（即ち、血餅
形成は観察されなかった）。 表４ 表３ ＊ヒト血漿に加えた試料の量 ＊＊血餅形成時間は、３回の実験の平均値上標準偏差で
示しである。 グヒト血景に加えた試料の■ ＊＊ｉｎｌ＊＊血餅形成時間の実験の平均値±（票準偏
差で示しである。 Ｅ　トロンビン依存性の血小板活性化の阻止野生型トロ
ンボモジュリンは、トロンビンによる血小板セロトニン
放出阻止による測定の結果として、トロンビン依存性の
血小板活性化を阻止することがわかっている（Ｅｓｍｏ
ｎ、　Ｎ、　Ｌ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、　　２５８：１２２３８．　１９８３および
Ｍａｒｕｙａｍａ、　　１．　　ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、
　　Ｉｎｖｅｓｔ、、　７５：９８７．、１９８５）。 血小板からのトロンビン−誘導セロトニン放出に及ぼす
各種精製ヒトトロンボモジュリン誘導体の影響を、以下
の様にして測定した。 実施例８Ｄの記載に従い、全血を集め、１０００×９で
３分間遠心して血小板に富む血漿を調製した。この血小
板に富む血漿を、同容量の改良Ｔａｎｇｅｎ緩衝液（０
，Ｉ　４５Ｍ　ＮａＣｆ２．０．Ｏ０５ＭＫＣＣ５０，
０５ｍＭ　ＣａＣＱｔ、０　、１　ｍＭ　ＭｇＣＩ２２
．０．００５５Ｍグルコース、０．０１５Ｍ　ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ７，４）、および１朽／峠の牛血清アルブミン
）と混合し、９００Ｘｙで１０分間遠心して血小板をペ
レット化した。この血小板を血漿のもとの容量の１１５
のＴ　ａｎｇｅｎ緩衝液に再懸濁し、ゆつくり３７°Ｃ
で平衡化した。この血小板懸濁液を０゜１μＣｉ／ｘ（
！の１４Ｃ５−ヒドロキシトリプタミン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ　Ｃｏｒｐ、、　　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇ
ｈｔｓ、　　Ｔ　Ｌ　　６０００５）と共に３７°Ｃで
１時間インキュベートした。 血小板懸濁液をＴ　ａｎｇｅｎ緩衝液で３回洗浄して過
剰の放射ラベルを除去した。 最終的に得られた血小板ペレットを、もとの血漿容量の
Ｔ　ａｎｇｅｎ緩衝液におだやかに再懸濁し、使用する
まで室温で保存した。血球計数器で測定したところ、最
終的な懸濁液は１！ＩＱ当たり５ＸＩ０８血小板を含ん
でいた。 ４Ｃ−セロトニン放出を測定するために、この血小板懸
濁液０．５Ｊ！１２を、絶えず撹拌しながら、５分間、
３７°Ｃに予熱した。次いでトロンビンをｌｎＭの濃度
で加え、インキュベーションを３分間続けた。次いで０
．１１Ｃをとり、水冷した停止緩衝液（０，０５Ｍ燐酸
ナトリウム（ｐＨ７，４）、０．２％（Ｖ／Ｖ）グルタ
ルアルデヒドおよび０，００５Ｍ　ＥＤＴＡ）０．９１
ｄと混合した。８０００　Ｘ９で３０秒間遠心した後、
０．５＋ｆ！分をとり、アクアゾル・シンチレーション
・カクテル〈＾ｑｕａｓｏｌ　５ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉ
ｏｎ　　ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ。 Ｂｏｓｔｉｏｎ、　　ＭＡ　　０２１１８）９ｍｆ！と
混合し、Ｂ　ｅｃｋｍａｎＬＳ３８０ｔシンチレーショ
ン・カウンターヲ使って１４ｃを計測した。血小板懸濁
液０．１ズＱを０．９ｍ（ｌの停止緩衝液と混合し、こ
の混合物のｏ、ｓｚｃ分をシンチレーション・カウンタ
ーにかけることにより、全てのカウント数を測定した。 血小Ｆｉ懸７Ｂ　１ｆｆｌをトロンビンの非存在下、３
７°Ｃで３分間インキュベートすることにより、バック
グラウンド放出カウントを測定した。 ４Ｃ−セロトニン放出量を次の式から求めた。 明らかに有効であることを示している。この面では高分
子量のものが特に有効である。特に、高分子量のものは
、ウサギトロンボモジュリンよりも、トロンビン依存性
の血小板活性化を、−貫して効率よく阻害することがわ
かった。ヒトの胎盤から調製したＴＭは、この点では１
／３０の有効性しかなかったので（ＭａｒｕｙａＩＩｌ
ａら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ。 ７５９８７、１９８５）、上の結果は予想外のものであ
った。 （以下余白） 各種濃度のヒトトロンボモジュリン誘導体とｌ混合した
、ｌｎＭ）ロンビンの存在下での１４ｃｍセロトニン放
出のデータを表５に示す。このデータは、セロトニン放
出によって裏付けられる様に、高分子量および低分子量
のトロンボモジュリン誘導体はいずれも、血小板の活性
化を阻止するのに表５ ＊放出すした１４Ｃ−セロトニンは、１ｎＭトロンビン
の３７°Ｃで３分間の存在下で測定された。 Ｆ、　　トロンビン−誘導による血小板凝集の阻止野生
型の、界面活性剤で可溶化したトロンボモジュリンは、
トロンビン誘導による血小板凝集の阻止によって測定す
ると、トロンビン誘導化血小板活性化を阻止することが
知られている（ＥｓｍｏｎＮ、　　Ｌ、　　ら、Ｊ、　
　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２５８：１２２３ｇ−
１２２４２１９８３）。本発明に係るヒトトロンボモジ
ュリン誘導体の血小板凝集阻止能を、以下の如くして、
血小板に富むヒト血漿を使って評価した。 採血したてのヒト血液９容量を３．８％（ｗ／ｖ）クエ
ン酸ナトリウム１容量と混合し、１００Ｘｙで２５分間
遠心して血小板に富んだヒト血漿を得た。 全面を２０００　Ｘ９で１５分間遠心することにより、
血小板の少ない血漿試料も調製した。凝集試験は、市販
の凝集測定器および測定用キュベツトを使い、業者の指
針に従って行った（Ｈｅｌｅｎａ　Ｍｏｎ１ｔｏｒ　Ｉ
Ｖ、　Ｈｅ１ｅｎａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂ
ｅａｕｍｏｎｔ、　ＴＸ）。 血小板の少ない血漿０．５Ｊ！（！を凝集測定用キュベ
ツトに入れ、計測器の目盛りを、０に合わせることによ
り、各実験に於ける血漿に基因するバックグラウンド吸
収を補正した。次いで、血小板に富む血漿試料０．５３
１ｆ！を計測器に入れ、常に、撹拌しながら３７°Ｃに
した。次いで２ｎＭの濃度でトロンビンを加え、血小板
凝集を、時間経過による吸光度の減少として自動的にモ
ニターした（血小板が凝集すると、光散乱が減り、血小
板の豊富な血漿の吸光度が減少する）。最大の血小板凝
集は、通常、トロンビン添加液３０〜６０秒で観察され
た。低分子量または高分子量のトロンボモジュリン誘導
体（２９３およびＡＶ］２形質転換体由来）をトロンボ
モジュリンニトロンビン−５０：１の比てトロンビンと
予め混合すると、血小板凝集反応の完全な阻止が観察さ
れた。 Ｇ９電気泳動特性による分子量の推定 野生型トロンボモジュリンは、ドデシル硫酸ナトリウム
・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ　Ｓ　−Ｐ　
Ａ　Ｇ　Ｅ　）で変則的な挙動を示す。このタンパクの
分子量は、ンスルフィド結合の還元の前後で、それぞれ
７ｌ−８４ＫＤおよび８８−ＩＩＱＫＤの範囲にまたが
る（Ｅｓｍｏｎ、　Ｎ、　Ｌ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｍｌ、　　２５７：８５９．　１９８１および５
ｕｚｕｋｉ、　　Ｋ　ら、Ｊ、　Ｂｏｃｈａｍ、、　　
１０４：６２ｇ、　　１９８ｇ）。 実梅例７に記・戟した様にして精製した各種ヒトトロン
ホモシュリン誘導体の分子量を、５元および非」■元条
件下の両者で５ＤＩＰＡＧＥにより測定した。′１−気
泳動は、市販の自動化電気泳動システム（ＰｈａｓｔＳ
ｙｓｔｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｕｐｐ
ｓａｌａ。 ５ｖｅｄｅｎ）を使用し、超薄型１０−１５％グラジェ
ントゲルを用い、業者の指針に従って行った。分子量標
準およびタンパクｔＦ４：（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　９４８
０４）を、業者の指針に従い、Ｐ　ｈａｓｔｓｙｓｔｅ
ｍ銀染色法を使って染色した。通常、良好な検出し得る
染色性を得るには、組換トロンボモジュリン誘導体それ
ぞれ０．２〜１．Ｏｕ９か必要であった。 組換トロンボモジュリン誘導体の分子量は、ケルを移動
したタンパクの距離に対し、漂（■タンパクの分子量の
プロットを診照して決定した。この方法で得た値を表６
に示す。 （以下余白） 表６ ／ｆｆ１２のペプスタチンおよび２０μｙ／ｘ（！のロ
イペプチンの存在下、１００ｍＭ　ＮａＣＱ、５０ｍＭ
　　トリス−ＨＣり、３０μＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ８
，’ｏ）中で一夜、３７°Ｃでインキュベートした。 タイツ 実施例９ ２９３細胞から精製した可溶性トロンボモジュリン誘導
体２００　μ（！（７５ｐｇ／　ｚ１２）を、フンドロ
イチナーゼＡＢＣ（５０ミリ単位、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌＣｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ○）の存
在下または非存在下、２．５ｍＭの１、ＩＯ−フェナン
トロリン、１０μ９実施例９Ａのフンドロイチナーセ処
理した誘導体を使って、ヒトフィブリノーゲンのトロン
ビン血餅形成時間に及ぼす影響を調べた。 血餅形成反応液は、１５０ｍＭＮａＣρ、２０ｍＭ　ト
リス−ＨＣＱ、３ｍＭ　ＣａＣ（！２中、ｐＨ７，４，
３７°Ｃでヒトフィブリノーゲンを３ｍ９／ｊ＋夕の割
合で含むものであった。１６ｎＭトロンビンを添加した
後、血餅形成時間を測定した。実施例９Ａのフンドロイ
チナーゼ処理トロンボモジュリン誘導体は、１１００ｎ
の濃度で加えた。この実験の結果を表７に示す。 表７ トロンビン ２２±１ トロンビン＋低分子１誘導体　　　　５３±１トロンビ
ン→−高分子量誘導体　　　２５０±６制限部位および
機能地図の模式図であり、第４図は、プラスミドｐＵＣ
１８ＴＭの制限部位および機能地図の模式図であり、 第５図は、プラスミドｐＵＣ　１８ＴＭＤ　Ｉの制限部
位および機能地図の模式図であり、第６図は、プラスミ
ドｐｈｄの制限部位および機能地図の模式図であり、 第７図は、プラスミドｐｈｄＴＭＤ１の制限部位および
機能地図の模式図である。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理人弁理士青山　葆　はか１名

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐｈｄＴＭＤｌの構築の概略を示す工程図で
あり、 第２図は、プラスミドｐＵＣ１８の制限部位および機能
地図の模式図であり、 第３図は、プラスミドｐＵ　Ｃｌ　８　Ｔ　Ｍ　１ｉｎ
ｋｅｒのＦｆＧ、４ プラスミドｐＵＣ１８ＴＭ （〜４．７ｋｂ） Ｆ　Ｉ　Ｇ、　５ プラスミドｐＵＣ１８Ｔへ・ＩＤ１ （〜４．２ｋｂ） ＦＩＧ、７ プラスミドｐｈｄＴλ１Ｄ１ （〜ｌＯ，４ｋｂ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｎ−末端から順に、ヒトトロンボモジュリンの ａ）Ｎ−末端領域； ｂ）表皮成長因子相同領域；および ｃ）セリン／トレオニン豊富領域； を含有するアミノ酸配列をコードしている組換えＤＮＡ
   ベクターで形質転換したＡＶ１２または２９３宿主細胞
   から得られ、ヒトトロンボモジュリンのトランスメンブ
   ランおよび細胞質ドメインを欠く該アミノ酸配列。 ２、以下の配列で示されるアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
   ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
   はシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミ
   ン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅ
   はイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、
   Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒ
   ｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、
   Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、およびＶ
   ａｌはバリンであり； ＲはＭｅｔＬｅｕＧｌｙＶａｌＬｅｕＶａｌＬｅｕＧ１
   ｙＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａＧｌｙＬｅｕＧｌｙ
   −であり； Ｒ＾１はＰｈｅＰｒｏ−であり； ｘは０または１であり； ｙは０または１である（ただし、ｙが０であるときはｘ
   は０でなければならず、ｘが１であるときはｙは１でな
   ければならない）］。 ３、グリコシル化されている請求項１または請求項２に
   記載のアミノ酸配列。 ４、グリコシル化されていない請求項１または請求項２
   に記載のアミノ酸配列。 ５、以下の配列で示される請求項１または請求項２に記
   載のアミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】 ［配列中、Ａｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａ
   ｓｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓ
   はシステイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミ
   ン酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅ
   はイソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、
   Ｍｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒ
   ｏはプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはトレオニン、
   Ｔｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、およびＶ
   ａｌはバリンである］。 ６、グリコシル化されている請求項５に記載のアミノ酸
   配列。 ７、グリコシル化されていない請求項５に記載のアミノ
   酸配列。 ８、以下に示すＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発現
   ベクターで形質転換した宿主細胞を、発現に適した条件
   下で培養することによって得られるポリペプチド産物： 【アミノ酸配列があります】【アミノ酸配列があります
   】【アミノ酸配列があります】 ［配列中、Ｒ’は　５’−ＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＣ
   ＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣ
   ＣＧＧＣＣＴＧＧＧＧ−３’であり；Ｒ＾１’は５’−
   ＴＴＣＣＣＣ−３’であり；Ｘは０または１であり； ｙは０または１であり（ただし、ｙが０であるときはｘ
   は０でなければならず、ｘが１であるときはｙは１でな
   ければならない）； Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデ
   オキシシチジル、そしてＴはチミジルである］。 ９、原核宿主細胞中で発現された請求項８に記載のポリ
   ペプチド産物。 １０、真核宿主細胞中で発現された請求項８に記載のポ
   リペプチド産物。 １１、２９３またはＡＶ１２細胞中で発現された請求項
   １０に記載のポリペプチド産物。１２、約１１０ｋＤ（
   還元条件）および約７６〜９４ｋＤ（非還元条件）の分
   子量を有する請求項１１に記載のポリペプチド産物。 １３、約７３〜約７７ｋＤ（還元条件）および約５８〜
   ６６ｋＤ（非還元条件）の分子量を有する請求項１１に
   記載のポリペプチド産物。 １４、以下に示す配列を含有する構築されたＤＮＡ化合
   物： 【ＤＮＡ配列があります】 【ＤＮＡ配列があります】 【ＤＮＡ配列があります】 ［配列中、Ｒ’は５’−ＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴ
   ＧＧＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣ
   ＧＧＣＣＴＧＧＧＧ−３’であり；Ｒ＾１’は５’−Ｔ
   ＴＣＣＣＣ−３’であり；ｘは０または１であり； ｙは０または１であり（ただし、ｙが０であるときはｘ
   は０でなければならず、ｘが１であるときはｙは１でな
   ければならない）； Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル、Ｃはデ
   オキシシチジル、そしてＴはチミジルである］。 １５、以下に示す配列を含有する請求項１４に記載のＤ
   ＮＡ化合物： 【ＤＮＡ配列があります】 【ＤＮＡ配列があります】 【ＤＮＡ配列があります】 ［配列中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
   ル、Ｃはデオキシシチジル、そしてＴはチミジルである
   ］。 １６、請求項１４または請求項１５に記載のＤＮＡ配列
   を含有する組換えＤＮＡベクター。 １７、プラスミドｐＵＣ１８ＴＭＤ１またはプラスミド
   ｐｈｄＴＭＤ１。 １８、請求項１４〜１７のいずれかに記載のＤＮＡ配列
   で形質転換された宿主細胞。 １９、原核宿主細胞である請求項１８に記載の宿主細胞
   。 ２０、真核宿主細胞である請求項１８に記載の宿主細胞
   。 ２１、ＡＶ１２または２９３細胞である請求項２０に記
   載の宿主細胞。 ２２、大腸菌／ｐＵＣ１８ＴＭｌｉｎｋｅｒ、大腸菌／
   ｐＵＣ１８ＴＭ、大腸菌／ｐＵＣ１８ＴＭＤ１、および
   大腸菌／ｐｈｄＴＭＤ１からなる群から選ばれる形質転
   換された宿主細胞。 ２３、ＡＶ１２／ｐｈｄＴＭＤ１および２９３／ｐｈｄ
   ＴＭＤ１からなる群から選ばれる形質転換された宿主細
   胞。 ２４、活性成分として請求項１〜１３のいずれかに記載
   のアミノ酸配列を、その薬学的に許容しうる担体、希釈
   剤または賦形剤とともに含有する医薬製剤。 ２５、血栓の治療または予防を必要としている患者に、
   治療学的用量または血栓予防用量の請求項１〜１３のい
   ずれかに記載のアミノ酸配列を投与することからなる該
   患者の血栓の治療または予防方法。