HUT56876A - Process for producing human thrombomodulin derivatives - Google Patents

Description

BUDAPESTI NEMZETKÖZI ÜGYVÉSI

ÉS SZABADALMI IRODA

1061 BUDAPEST, DALSZÍNHÁZ U. 10.

TELEFON: 153-3733

I/32V/3O

52.140/SZE

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

ELJÁRÁS HUMÁN TROMBOMODULIN SZÁRMAZÉKOK ELŐÁLLÍTÁSÁRA

ÉLI LILLY AND COMPANY, INDIANAPOLIS, Indiana,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltalálók: BANG Nils Ulrik,

GRINNEL Brian William,

HOSKINS 3o Ann

MOORE Róbert Cári Jr.

PARKINSON dohn Francis, INDIANAPOLIS, Indiana

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A bejelentés napja: 49*3°. o 8.03-Elsőbbsége: 1989.08.11. (07/393,617)

1990.02.05. (07/474,870) AMERIKAI EGYESÜLT

ÁLLAMOK

A találmány új humán trombomodulin származékokkal foglalkozik, foglalkozik továbbá az ezeket a származékokat kódoló DNS vegyületekkel. rekombináns DNS vektorokat,

A találmány ismerteti a és az ezekkel a vektorokkal transzformált gazdasejteket, amelyek alkalmasak ezeknek az új fehérjéknek a termelésére. Ezek a trombomodulin származékok olyan egyedi tulajdonságokkal bírnak, amelyek különösen alkalmassá teszik ezeket alvadásgátló szernek és így alkalmasak trombózisos események kezelésére vagy megelőzésére.

Abból a célból, hogy a találmányt jobban megértsük, az alábbiakban megadjuk az alvasztó enzimrendszer rövid leírását. Az alvasztó enzimrendszer, amelyet néha kaszkádnak neveznek, jól tanulmányozott rendszer, ez olyan láncreakció, amely zimogének egymás utáni aktiválását foglalja magában aktív szerin proteázokká, amelyek azután végsősoron a trombin enzim termeléséhez vezetnek. A trombin, korlátozott proteolízis segítségével, a plazma fibrinogént átalakítja az oldatatlan fibrin géllé. Az alvasztási kaszkád két kulcslépése az alvasztó X faktor átalakulása Xavá a IXa alvasztó faktor révén, és a protrombin átalakulása trombinná a Xa alvasztó faktor révén.

Mindkét reakció a sejtfelületen végbe, pontosabban a vérlemezke (piatelet) felületen, és mindkét reakció kofaktorokat igényel. A fő kofaktorok, az V és VIII faktorok, viszonylag inaktív prekurzorként cirkulálnak, de amikor az élső néhány trombin molekula kialakul, a trombin korlátozott proteolízis révén aktiválja a kofaktorokat. Az

aktíváit kofaktorok (Va és Villa) meggyorsítják - mintegy öt nagyságrenddel ··- mind a protrombin átalakulását trombinná, mind a X faktor átalakulását Xa faktorrá.

Ί>

Az aktivált szubsztrátumot

C fehérje különösen két plazma-fehérje részesít előnyben, amelyeket ez a C fehérje hidrolizál és irreverzibilisen elroncsol.

Ezek a plazma fehérje szubsztrátumok az V és VIII alvasztó kofaktorok aktivált formái (Va illetve Villa kofaktorok). Az aktíváit C fehérje csak minimális mértékben bontja az inaktív prekurzorokat, vagyis az V és VIII faktort. Kutyákban az aktivált C fehérjéről kimutatták, hogy erőteljesen növeli a fő fiziológiai fibrinolitikus enzim, a szöveti plazminogén aktivátor cirkuláló szintjét. Az aktivált C fehérjéről kimutatták in vitro, hogy fokozza a fibrin lízisét a teljes emberi vérben, és a jelenlegi kísérletek azt sugallják, hogy ezt a hatást a szöveti plazminogén aktivátor egy inhibitorával való kölcsönhatás közvetíti. Az aktivált C fehérje tehát fontos in vivő antitrombotikus és valószínűleg fibrinolitikus szer.

A C fehérje aktiválásában azonban érdekelt a trombin, az alvadási kaszkád végső szerin proteáza, valamint egy endoteliális sejtmembránnal társult glikoprotein , trombomodulin.

A trombomodulin szilárd 1:1 sztöchiometrikus komplexet képez trombinnal. A trombomodulin, amikor trombinnal komplexbe lép, lényegesen módosítja a trombin funkcionális tulajdonságait. A trombin, az alvadási útban, normálisan alvasztja a fibrinogént, aktiválja . a vérlemezkéket és az V és VIII alvadási kofaktorokat aktivált formáikká, Va-vá és VlIIa-vá alakítja. A trombin önmagában úgy működik, hogy aktiválja a C fehérjét, de csak nagyon lassan és kevéssé hatékonyan. Ezzel ellentétben a trombin, amikor 1:1 arányú komplexben van trombomodulinnal, nem alvasztja a fibrinogént, nem aktiválja a vérlemezkéket, és nem alakítja át az V és VIII alvasztó faktorokat aktivált formáikká. A trombin: trombomodulin komplex elősegíti a C fehérje aktiválását egy C fehérje aktiválási sebességi állandóval, amely 20000-szer is nagyobb lehet a trombin: trombomodulin komplexnél, mint a sebességi állandó a trombinnál egymagában.

Az aktivált C fehérje ennél fogva antitrombotikus szer szélesebb terápiás indexszel, mint más al vadás_^gát lók, pl. a heparin vagy az orális hidroxi-kumarin típusú alvadásgátlók, mint a warfarin. Sem a C fehérje, sem az aktivált C fehérje nem hatékony addig, amíg bizonyos lokális helyeken trombin nem alakul ki. Az aktivált C fehérje végülis nem hatásos trombin nélkül, mivel a trombin szükséges ahhoz, hogy az V alvadási faktor átalakuljon Va-vá és a VIII alvadási faktor átalakuljon VlIIa-vá. Amint megjegyeztük, ezen két kofaktor aktivált formái az fehérje számára. A infúzióval beadjuk, nem keletkezik és előnyös szubsztrátumok az aktivált C C fehérje zimogén, amikor a betegbe mindaddig inaktív marad, amíg trombin nem lép komplexbe trombomodulinnal. A trombomodulin: trombin komplex nélkül a C fehérje zimogén nem alakul át aktivált C fehérjévé.

Bár a humán C fehérje rekombináns kifejezése már lehetséges (lásd a 4,755,624 lajstromszámú amerikai egyesült államok• · · · beli szabadalmi leírást, amely 1988. október 4-én került nyilvánosságra), aktiválásának szabályozása in vivő a trombin: trombomodulin komplex révén általában korlátozott, mivel a trombomodulin, amely esszenciális komponens a C fehérje aktiválásához, nem áll rendelkezésre jelentős mennyiségben. Ezen kívül a trombomodulin a jelen időkig csak igen kis mennyiségekben volt tisztítható egy többlépcsős tisztítási folyamattal, amely affinitás-kromatográfiát is foglal magában; ebben a lépésben az inaktivált trombin agarózon van immobilizálva. Lásd pl. Esmon N.L. és munkatársai: J.Biol.Chem. 257, 859 (1982); Suzuki K. és munkatársai: Biochim.Biophys Acta 882, 343 (1986); és Maruyama és munkatársai: J. Clin. Invest. 75 , 987 (1985). A tisztítást tovább komplikálja, hogy a trombomodulin erősen kötődik a sejtmembránhoz transzmembrán tartománya révén (lásd később), továbbá viszonylag stabil a denaturáló szerekkel és detergensekkel szemben, és hiányzik belőle a megfelelő oldhatóság, hogy exogén antitrombotikus szerként klinikailag használható legyen.

Ezen kívül a szarvasmarha trombomodulin egy nagy részének nemrégiben közölt klónozása és szekvencia-elemzése előtt EJackman R.: Proc . Na ti.Acad.Sei. (USA) 83_, 8834 (1986)3 a trombomodulin szerkezete teljesen ismeretlen volt. A humán trombomodulin teljes génszekvenciáját most írjuk le. A humán genom a trombomodulin génnek csak egyetlen kópiáját tartalmazza, amely a 20. humán kromoszómán lokalizálődik. A további tanulmányok feltárják, hogy ez a gén nem tartalmaz intronokat, azt sugallva, hogy a cDNS és a trombomodulint kódoló genomikus DNS azonosak Elásd Wen D. és munkatársai:

• 44

4 « 4

Biochemistry 26 , 4350 (1987); Suzuki és munkatársai: The

EMBO Journal 6_, 1891 (1987); Jackman R. és munkatársai:

Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 8£, 6425 (1987)].

Ez az információ lehetővé teszi a alapszerkezetének meghatározását. Az hogy a humán trombomobulin (humán humán trombomodulin elemzés azt mutatja, TM) 575 aminosavas fehérjeként szintetizálódik, amelybe beleértendő egy szignál-peptid rész is, amelyről azt írják, hogy 18- vagy 21 gyök hosszúságú EJackman R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 84 , 6425 (1987); Shirai T. és munkatársai: J. Biochem. 103, 281 (1988); és Wen és munkatársai, fentebb idézett munka], A szignál peptid részt követően a humán TM az amino-terminálistól indulva sorrendben a következő tartományokat vagy területeket tartalmazza: 1., amino-terminális tartomány (~223-226 aminosavgyök); 2., hat EGF (epidermái is növekedési faktor)-szerű szerkezet (amelyet EGF-homológia terület' -nek is nevezünk), ez /v 236-240 aminosavas gyök; 3., szerinben/treoninban dús terület, amelyben számos lehetséges 0-glikozilező hely van jelen (^34-3 7 aminosavas gyök); 4., transzmembrán terület (^-23-24 aminosavgyök); és

5., citoplazmás tartomány (^36-38 aminosavgyök). Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a meghatározott aminosav száma annak a bizonytalanságnak az eredménye lehet, amely egy adott tartomány kezdeténél vagy végénél léphet fel. Ezen bizonytalan aminosavak számáról találhatók beszámolók az irodalomban, ettől függhet a tartomány vagy terület hosszúsága. Lásd pl. Suzuki K. és munkatársai. The EMBO Journal £, 1891 (1987); Wen D. és munkatársai: fentebb • · idézett munka. Ahogyan itt használjuk, az N-terminális terület vagy tartomány, homológia terület vagy epidermális növekedési faktor tartomány, szerin/treonin-dús terület vagy tartomány, transzmembrán terület vagy tartomány és citoplazmás terület vagy tartomány kifejezések tehát aminosav-gyokok hozzávetőleges tartományára utalnak vagy tartománynál.

minden fentebb megnevezett területnél

Ezen kívül mivel az in vivő feldolgozásról várható, hogy változó a transzformált gazdasejt kifejezésétől függően (különösen változó lehet, ha a prokarióta gazdasejteket összehasonlítjuk az eukarióta gazdasejtekkel), az N-terminális terület vagy tartomány adott esetben magában foglalhatja a humán trombomodulin szignál peptidet vagy annak egy részét.

A transzmembrán terület miatt a vad típusú trombomodulinban a molekula visszamarad a sejtmembránokon belül. Ennek következményeképpen a fehérje tisztítása detergensek nem kívánatos alkalmazását igényli. Ezen kívül a természetes forrásoknál rendelkezésre álló tisztított anyagok kis mennyisége erősen gátolja a vad típusú trombomodulin alkalmazását klinikailag alkalmas járulékos alvadásgátlóként vagy antitrombotikus szerként.

A jelen találmány megoldja ezeket a nehézségeket olyan módon, hogy oldható trombomodulin származékokat szolgáltat, amelyek képesek termelődni rekombináns DNS technikák segítségével. Ezeket a származékokat gyakorlatilag korlátlan mennyiségben megkaphatjuk, könnyen kezelhetők és kívánatos, klinikailag hasznos jellemzőkkel bírnak. így ezek a • 4 • ·♦ · · · « • * · · Λ 4· • · * ·♦> t ·· • ···»· t « « «· ·· · ·· ·· · · származékok klinikai gyógyszerek alapjai lehetnek eddig nem hozzáférhető forrásokból trombózis kezeléséhez és megelőzéséhez. A jelen találmány szerinti fehérjék előnyeit és jellemzőit a későbbiekben részletesen leírjuk és példákkal támasztjuk alá.

A fentebb definiált kifejezéseken kívül a jelen találmány céljaira, a leírásban és igénypontokban, az alábbi kifejezéseket határozzuk meg.

AD2LP-adenovírus-2 késői promotor.

Antibiotikum - valamely mikroorganizmus által termelt anyag, amely vagy természetes formájában, vagy meghatározott kémiai módosítás után gátolja egy másik mikroorganizmus vagy eukarióta sejt növekedését, vagy elpusztítja azt.

Antibiotikum rezisztenciát átadó gén-ONS szegmens, amely egy antibiotikumra való ellenállást átadó aktivitást kódol.

Ap^r-- az ampicillin-rezisztens fenotípus vagy egy gén, amely ampicillin-rezisztenciát ad át.

BK-- a BK fokozó (enhancer) elem az emberi papovavírusból, a BK vírusból, ahol az említett fokozó képes az átírás szintjét növelni egy adott promotorból.

dhfr-- a dihidrofolát reduktáz gén, amely szelektálható markerként szolgál dhfr^- sejtekben, és amelyet alkalmazhatunk egy DNS szegmens sokszorozására (vagyis kópiaszámának növelésére) olyan módon, hogy a gazdasejtet metotrexát növekvő szintjeinek vetjük alá.

»··

ΕΡ-- DNS szegmens, amely tartalmazza a T-antigén (F) gén SV40 korai promotorját, a T-antigén kötőhelyeket és az SV40 replikációs origót.

Eukarióta promotor-- bármely DNS szekvencia, amely eukarióta sejtekben promotorként képes működni.

Gazdasejt-- organizmus, ideértve a prokariótákat és eukariótákat egyaránt, amelyet transzformálhatunk egy rekombináns DNS vektorral. A kifejezés magában foglalja (de nemcsak ezekre korlátozódik) az emlős sejteket, valamint pl. Streptomyces életképes protoplasztjait.

Hm^r-- a higromicin rezisztens fenotípus vagy egy gén, amely higromicin rezisztenciát ad át.

IVS-- egy intront, avagy más néven megszakító szekvenciát kódoló DNS.

MCS-- többszörös klónozó hely, amelyet poli1inkernek is neveznek.

őri-- plazmid replikációs origó.

pA-- poliadenilező szignált kódoló DNS szekvencia.

Promotor-- DNS szekvencia, amely irányítja a DNS átírását RNS-sé.

···· · ·« ·· »··« • « · · · β « • · · ··· · ν · • ···· · · « e · ·· * ·· ·♦ «·

Rekombináns DNS vektor-- bármely rekombináns DNS klónozó vagy kifejező vektor.

Rekombináns DNS klónozó vektor-- bármely autonóm módon replikálódó vagy kromoszómáiisan integrálódó anyag, amely tartalmaz egy olyan DNS molekulát, amelyhez egy vagy több további DNS szegmenst lehet hozzáadni, vagy amelyhez egy vagy több további DNS szegmens van hozzáadva. A kifejezés magában foglalja (de nemcsak ezekre korlátozódik) a plazmid, kozmid és fág vektorokat.

Rekombináns DNS kifejező vektor-- bármilyen rekombináns DNS klónozó vektor, amely tartalmaz egy promotort, és képes olyan DNS molekula kifejezésére, amely része a vektornak vagy abba beiktatható.

Replikon-- DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy rekombináns DNS vektor autonóm replikádéját.

Restrikciós fragmentum-- bármely lineáris DNS, amely egy vagy több restrikciós enzim hatása révén alakul ki.

Érzékeny gazdasejt-- gazdasejt, amely nem nő egy adott antibiotikum vagy más toxikus anyag jelenlétében egy olyan DNS szegmens nélkül, amely rezisztenciát ad át ezek ellen.

Transzformálás-- DNS bevezetése egy befogadó gazdasejtbe, beleértve ezek életképes protoplasztjait is, olyan módon, hogy a befogadó sejt genotípusa megváltozik.

» 4 < · · · · · • · · » · β · • · · e»· · t · ····· · · «· a ·· * ·· ·« «· ··««

Transzformáns-- befogadó gazdasejt, amely transzformáción ment keresztül.

Zimogén-- egy proteolitikus enzim enzim atikusan inaktív prekurzorja .

Az alábbiakban röviden bemutatjuk az ábrákat.

Az 1. ábra a phdTMDl megalkotását körvonalazó folyamatábrát mutatja be.

A 2. ábra a pUC18 plazmid restrikciós és működési térképe.

A 3. ábra a pUC18TMlinker plazmid restrikciós és működési térképe.

A 4. ábra a pUC18TM plazmid restrikciós és működési térképe. Az 5. ábra a pUC18TMDl plazmid restrikciós és működési térképe.

A 6. ábra a phd plazmid restrikciós és működési térképe.

A 7. ábra a phdTMDl plazmid restrikciós és működési térképe.

Azok, akik a szakterülen jártasak, tudják, hogy a bemutatott ábrák csak hozzávetőlegesen méretarányosak. A restrikciós helyek térközei a térképen nem pontosak és a vektoron levő tényleges restrikciós helyek valamelyest eltérhetnek a számított távolságoktól. A térképek nem adják meg az adott vektoron az összes restrikciós helyek teljes listáját. Ezek a rajzok csak arra szolgálnak, hogy a leírás olvasóját segítsék a találmány jobb megértésében.

A jelen találmány oldható humán tormbomodulin származékokat ♦ ··· ·· 4 4·· • ·4 • * · · · ·t • · · · 4 4 · »« • ···« * a β 4· ·< · ·4 44· · ismertet; ezek olyan aminosavszekvenciák, amelyek az Nterminálistól számítva magukban foglalják a humán trombomodulin

a) N-terminális területét;

b) epidermális növekedési faktorral homológ területét; és

c) szerin/treoninban dús területét, ahol az említett aminosavszekvenciákból hiányzik a humán trombomodulin transzmembrán és citoplazmás tartománya, és ahol az említett aminosavszekvenciák egy, az említett aminosavszekvenciákat kódoló rekombináns DNS vektorral transzformált AV12 vagy 293 gazdasejtekből származhatnak.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az oldható trombomodulin származék aminosavszekvenciája az az aminosavszekvencia, amelyet a trombomodulin származékot kódoló pUC18TMDl vagy phdTMDl plazmid kódol.

Ebben az előnyös kiviteli módban az oldható trombomodulin származék aminosavszekvenciája az alábbi:

• · ···· • · « « · « · • · · ··· » · · • · ···· · · · · « · ·· · ·· ·* ··

-13 H^N-(R)_x(R¹)y-AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAsp

CysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlle

CysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAla

AspValIleSerLeuLeuLeuAsnC-iyAspGlyGlyValGlyArgArgArg

LeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu

GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyr

SerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeu

CysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrp

GluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHis

PheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAla

Al'aValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPhe

GlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGln

LeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu

AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAla

CysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAla

LeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsn

AspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyr

SerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCys

GluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCys

ValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeu

ValAspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCys

GluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAla

GluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCys

AsnGlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCys

GluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIle

AspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuPro

GlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuAlaArgHisIle

GlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspGlyGlyAspSerGlySerGly

GiuProProProSerProThrProGlySerThrLeuThrProProAlaVal

GlyLeuValHisSer-COOH ··♦· · ·· ·· ···· • · · · · · · • · · «·· · * « • · ···· · · «4 φ ·· · ·· ·· ·· ahol ALA jelentése alanin,

ARG jelentése arginin, ASN jelentése aszparagin, ASP jelentése aszparaginsav, CYS jelentése cisztein,

GLN jelentése glutamin, GLU jelentése glutaminsav, GLY jelentése glicin, HIS jelentése hisztidin, ILE jelentése izoleucin, LEU jelentése leucin, LYS jelentése lizin, MET jelentése metionin, PHE jelentése fenilalanin, PRO jelentése prolin, SER jelentése szerin, THR jelentése treonin, TRP jelentése triptofán, TYR jelentése tirozin, és VAL jelentése valin;

R jelentése MetLeuGlyValLeuValLeuGlyAlaLeuAlaLeuAlaGlyLeu Gly-_;

R1 jelentése PhePro-;

x jelentése 0 vagy 1;

y jelentése 0 vagy 1, azzal a feltétellel, hogy ha y jelentése 0, akkor x-nek is 0-nak kell lennie és ha x jelentése 1, akkor y-nak is 1-nek kell lennie.

A jelen találmány egy különösen előnyös kiviteli módjában az oldható trombomodulin származék aminosavszekvenciája az alábbi:

·« · « · « « 9 9 9 ·· • · 9 ··· · ·· • 9 9999 9 9 9 99

9 9 ·9 ····

-15H2N-AlaProAlaGluProGln.ProGlyGlySerGLnCysValGluHisAspCys

PheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCys

AspGlyLeuArgGlyHisLeuMetTnrValArgSerSerValAlaAlaAsp

ValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeu

TrpIleGlyLeuGlnleuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGly

ProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSer

ArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCys

ValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGlu

GluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPhe

ProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAla

ValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGln

AÍaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeu

MetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHísTrpAlaArgGluAla

ProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCys

AsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeu

GlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAsp

LeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSer

CysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGlu

AspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysVal

AsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal

AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGlu

TyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGlu

GlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsn

GlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGlu

CysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAsp

GluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGly

ThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuAlaArgHisIleGly

ThrAspCysAspSerGlyLysValAspGlyGlyAspSerGlySerGlyGly

ProProProSerProThrProGlySerThrLeuThrProProAlaValGly

LeuValHisSer-COOH • « · * · ahol ALA jelentése alanin,

ARG jelentése arginin, ASN jelentése aszparagin, ASP jelentése aszparaginsav, CYS jelentése cisztein,

GLN jelentése glutamin, GLU jelentése glutaminsav, GLY jelentése glicin, HIS jelentése hisztidin,

ILE jelentése izoleucin, LEU jelentése leijein, LYS jelentése lizin, MET jelentése metionin, PHE jelentése fenilalanin, PRO jelentése prolin,' SER jelentése szerin, THR jelentése treonin, TRP jelentése triptofán, TYR jelentése tirozin, és VAL jelentése valin.

Megjegyezzük, hogy a jelen találmány előnyös kiviteli módjában a szóbanforgó trombomodulin származékokat a rekombináns technológia eszközeivel termeljük, előnyösen valamely eukarióta gazdasejt transzformálásával a trombomodulin származékot kódoló rekombináns DNS kifejező vektorral, majd a sejt tenyésztésével olyan körülmények között, amely a találmány szerinti származékok kifejezésére alkalmas. A kifejező vektor természetesen úgy alkotható meg, hogy a TM származékot kódoló DNS szekvencia a kifejeződéshez megfelelően helyezkedjék el és megfelelő transzlációs leolvasó keretben legyen a transzlációs rajthelyhez viszonyítva. Ezen kívül a rajthely származhat a beiktatott DNS szekvenciából, vagy származhat más forrásokból. Ez a szekvencia lehet a vektorra nézve heterológ vagy homológ, ha ez természetben előforduló vektor, vagy lehet homológ vagy heterológ a konstrukcióban alkalmazott promotorra nézve. A szelekció céljából a kifejező vektor tartalmazhat egy szelektálható markért, és a transzformálás egy normális körülmények közt a szelektáláshoz használt toxikus anyagra érzékeny gazdasejtben történhet, amely sejt az eredményes • · · · · · transzformálás után rezisztenssé válik.

Ebben a kiviteli módban, vagyis az eukarióta sejtekben történő kifejeződésben, azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a termék glikozilezése valószínűleg bekövetkezik. így a találmány a trombomodulin származékokat nem csupán nem-glikozilezett formában szolgáltatja, ami várható lenne, ha a polipeptidet valamely prokarióta mikrobiológiai gazdasejtben fejeznénk ki, hanem glikozilezett formában is. Ahogyan itt alkalmazzuk, a glikozilezés kifejezés egy vagy több cukorrész hozzátételét jelenti a kifejezett fehérjéhez. Ezen kívül, amit a szakterületen jártasak jól tudnak, az eukarióta kifejeződés gyakran eredményezi a termék kiválasztódását a gazdasejtből, különösen akkor, amikor a kifejezett polipeptid szignál-peptid része jelen van. Ezen kívül más biológiai feldolgozások, pl. az N-terminális hasítás vagy esetleges C-terminális hasítás, amelyek nehézzé teszik a végső kifejezett fehérje következhet be eukarióta megfelelően a jelen találmány azonosítását, blokkolása gazdaszervezetekben. Ennek egy további előnyös kiviteli módjában szolgáltatunk egy polipeptidet, amelyet úgy állítunk elő, hogy a kifejeződéshez alkalmas körülmények között egy gazdasejtet tenyésztünk, ahol az említett gazdasejt a trombomodulin származékot kódoló pUC18TMDl plazmidot vagy phdTMOl plazmidot tartalmazó rekombináns DNS kifejező vektorral van transzformálva. Egy ilyen DNS szekvencia, amely egy humán trombomodulin származékot kódol, az alábbi:

• · · « _13_

3050

5'-ATGCTTGGGGTCCTGGTCCTTGGCGCGCTGGCCCTGGCCGGCCTGGGGTTC

7090

CCCGCACCCGCAGAGCCGCAGCCGGGTGGCAGCCAGTGCGTCGAGCACGAC

110 130150

TGCTTCGCGCTCTACCCGGGCCCCGCGACCTTCCTCAATGCCAGTCAGATC

170190

TGCGACGGACTGCGGGGCCACCTAATGACAGTGCGCTCCTCGGTGGCTGCC

210 230250

GATGTCATTTCCTTGCTACTGAACGGCGACGGCGGCGTTGGCCGCCGGCGC

270290

CTCTGGATCGGCCTGCAGCTGCCACCCGGCTGCGGCGACCCCAAGCGCCTC

310 330350

GGGCCCCTGCGCGGCTTCCAGTGGGTTACGGGAGACAACAACACCAGCTAT

370 3904

AGCAGGTGGGCACGGCTCGACCTCAATGGGGCTCCCCTCTGCGGCCCGTTG

430450

TGCGTCGCTGTCTCCGCTGCTGAGGCCACTGTGCCCAGCGAGCCGATCTGG ···· ·

-19 _

470 490510

GAGGAGCAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGATGGCTTCCTCTGCGAGTTCCAC

530550

TTCCCAGCCACCTGCAGGCCACTGGCTGTGGAGCCCGGCGCCGCGGCTGCC

570 590610

GCCGTCTCGATCACCTACGGCACCCCGTTCGCGGCCCGCGGAGCGGACTTC

630650

CAGGCGCTGCCGGTGGGCAGCTCCGCCGCGGTGGCTCCCCTCGGCTTACAG

670 690710

CTAATGTGCACCGCGCCGCCCGGAGCGGTCCAGGGGCACTGGGCCAGGGAG

730750

GCGCCGGGCGCTTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCG

770 790810

TGCAATGCGATCCCTGGGGCTCCCCGCTGCCAGTGCCCAGCCGGCGCCGCC

830850

CTGCAGGCAGACGGGCGCTCCTGCACCGCATCCGCGACGCAGTCCTGCAAC

870 890910

GACCTCTGCGAGCACTTCTGCGTTCCCAACCCCGACCAGCCGGGCTCCTAC

930 95097

TCGTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCGGCCGACCAACACCGGTGC

9901010

GAGGACGTGGATGACTGCATACTGGAGCCCAGTCCGTGTCCGCAGCGCTGT • · ·· ···· • ·· ·» • · · · · • · ·«· *· ···· · ·· • ·· ··

	_20„
1030	1050	1070

GTCAACACACAGGGTGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCTAACTACGACCTG

10901110

GTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCGTGCTTCAGAGCCAACTGC

1130 11501170

GAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAAACTAGCTACCTCTGCGTCTGCGCC

11901210

GAGGGCTTCGCGCCCATTCCCCACGAGCCGCACAGGTGCCAGATGTTTTGC

1230 12501270

AACCAGACTGCCTGTCCAGCCGACTGCGACCCCAACACCCAGGCTAGCTGT 12901310

GAGTGCCCTGAAGGCTACATCCTGGACGACGGTTTCATCTGCACGGACATC

1330 13501370

GACGAGTGCGAAAACGGCGGCTTCTGCTCCGGGGTGTGCCACAACCTCCCC

1390 141014

GGTACCTTCGAGTGCATCTGCGGGCCCGACTCGGCCCTTGCCCGCCACATT

1450 ‘ 1470

GGCACCGACTGTGACTCCGGCAAGGTGGACGGTGGCGACAGCGGCTCTGGC

1490 15101530

GAGCCCCCGCCCAGCCCGACGCCCGGCTCCACCTTGACTCCTCCGGCCGTG

GGGCTCGTGCATTCG-3' • ·8· · *8 ·· a··· • · a · · a a • · · ··< a · · • a i»a« · a · a « ·· · »· aa aa ahol A jelentése dezoxiadenil, G jelentése dezoxiguani 1, C jelentése dezoxicitidil és T jelentése timidil gyök.

Ennél a kiviteli módnál az előnyös gazdasejt valamely eukarióta gazdasejt, előnyösen emlős sejt. A legelőnyösebb gazdasejt vagy a humán 293. sejt (293. sejt) vagy a szíriai hörcsög AV12-664 sejt (AV12). Ebben a kiviteli módban, amint ezt a későbbiekben részletesen leírjuk, a polipeptid két formáját figyelhetjük meg, különösen akkor, amikor a származékokat a 293. vagy AV12 sejtekben fejezzük ki.

Ezeket trombomodulin polipeptideket származéknak illetve nagy kis molekulatömegO trombomodulin származéknak nevezzük.

származék molekulatömege mintegy 95 között (redukáló körülmények) illetve

A nagy kD és molekulatömegű molekula, tömegű mintegy 110 kD kD és 94 kD között (nem redukáló körülmények) van. A kémiai deglikozilezés után vízmentes TFMS-sel Elásd Sojar és munkatársai: Arch.Biochem.Biophys. 259, 52 (1987)3 a nagy molekulatömegű formából egy mintegy 68 kD-s és 65 kD-s (redukáló körülmények közt) fehérje alakul ki két illetve három óra után.

Ezen kívül ez a forma fogékony a kondroitináz ABC hasításra; ez a hasítás olyan fehérjét alakít ki, amely megnyújtja ugyan a trombin alvasztási idejét, de csak olyan szinten, amely kisebb, mint a nem kezelt forma hasonló reakciója. A fogékonyság a kondroitináz kezelésre azt sugallja, hogy a jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származék egy glükózamin-glükán résszel bír. Ezen kívül ez a forma továbbá az alábbi jellemzőkkel rendelkezik:

•••· · ·· ·ν ···· • · · · · · · • · · ··· · · · • · ···· · · · · · ·· · ·· ·· ··

a) mintegy 1,0 és mintegy 5,0 mmól/1 közti optimális Ca⁺⁺ koncentráció; és

b) a Kj érték trombinra mintegy 2,0 és mintegy 3,0 nanomol/1 között van.

A kis · molekulatömegű forma molekulatömege mintegy 73 kD és 77 kD között (redukáló körülmények) és 55 kD és 66 kD között (nem-redukáló körülmények) van. A TFMS-sel végzett deglikozilezés után a trombomodulin származéknak ez a formája 3 óra után olyan molekulatömege mintegy 63 kD (redukáló körülmények). Ennek fehérjét termel, amelynek és mintegy 64 kD között van a származéknak a következő jellemzői vannak:

a) mintegy 0,1 és mintegy 0,5 mmól/1 közti optimális Ca⁺⁺ koncentráció; és

b) a Kjj érték trombinra mintegy 10,0 és mintegy 25,0 nmól/1 között van.

A jelen találmány foglalkozik továbbá DNS szekvenciákkal, rekombináns DNS vektorokkal és gazdasejtekkel, valamint eljárásokkal a jelen találmány szerinti kívánt oldható trombomodulin származékok előállítására. A jelen találmány ezen további szempontjait a későbbiekben részletesebben meghatározzuk.

A jelen találmány szerinti trombomodulin származékokat kódoló DNS szekvencia az alábbi:

-237090

5'-(R') (R ) -GCACCCGCAGAGCCGCAGCCGGGTGGCAGCCAGTGCGTCGAGCACGAC x y

110 130150

TGCTTCGCGCTCTACCCGGGCCCCGCGACCTTCCTCAATGCCAGTCAGATC

170190

TGCGACGGACTGCGGGGCCACCTAATGACAGTGCGCTCCTCGGTGGCTGCC

210 230250

GATGTCATTTCCTTGCTACTGAACGGCGACGGCGGCGTTGGCCGCCGGCGC

270290

CTCTGGATCGGCCTGCAGCTGCCACCCGGCTGCGGCGACCCCAAGCGCCTC

310 330350

GGGCCCCTGCGCGGCTTCCAGTGGGTTACGGGAGACAACAACACCAGCTAT

370 3904

AGCAGGTGGGCACGGCTCGACCTCAATGGGGCTCCCCTCTGCGGCCCGTTG

430450

TGCGTCGCTGTCTCCGCTGCTGAGGCCACTGTGCCCAGCGAGCCGATCTGG

470 490510

GAGGAGCAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGATGGCTTCCTCTGCGAGTTCCAC

470 490510

GAGGAGCAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGATGGCTTCCTCTGCGAGTTCCAC

530550

TTCCCAGCCACCTGCAGGCCACTGGCTGTGGAGCCCGGCGCCGCGGCTGCC

- 24570 590610

GCCGTCTCGATCACCTACGGCACCCCGTTCGCGGCCCGCGGAGCGGACTTC

630650

CAGGCGCTGCCGGTGGGCAGCTCCGCCGCGGTGGCTCCCCTCGGCTTACAG

670 690710

CTAATGTGCACCGCGCCGCCCGGAGCGGTCCAGGGGCACTGGGCCAGGGAG

730750

GCGCCGGGCGCTTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCG

770 790810

TGCAATGCGATCCCTGGGGCTCCCCGCTGCCAGTGCCCAGCCGGCGCCGCC

830850

CTGCAGGCAGACGGGCGCTCCTGCACCGCATCCGCGACGCAGTCCTGCAAC

870 890910

GACCTCTGCGAGCACTTCTGCGTTCCCAACCCCGACCAGCCGGGCTCCTAC

930 95097

TCGTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCGGCCGACCAACACCGGTGC

9901010

GAGGACGTGGATGACTGCATACTGGAGCCCAGTCCGTGTCCGCAGCGCTGT

1030 10501070

GTCAACACACAGGGTGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCTAACTACGACCTG

10901110

GTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCGTGCTTCAGAGCCAACTGC

-251130 11501170

GAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAAACTAGCTACCTCTGCGTCTGCGCC

11901210

GAGGGCTTCGCGCCCATTCCCCACGAGCCGCACAGGTGCCAGATGTTTTGC 1230 12501270

AACCAGACTGCCTGTCCAGCCGACTGCGACCCCAACACCCAGGCTAGCTGT

12901310

GAGTGCCCTGAAGGCTACATCCTGGACGACGGTTTCATCTGCACGGACATC

1330 13501370

GACGAGTGCGAAAACGGCGGCTTCTGCTCCGGGGTGTGCCACAACCTCCCC

1390 141014

GGTACCTTCGAGTGCATCTGCGGGCCCGACTCGGCCCTTGCCCGCCACATT

14501470

GGCACCGACTGTGACTCCGGCAAGGTGGACGGTGGCGACAGCGGCTCTGGC

1490 15101530

GAGCCCCCGCCCAGCCCGACGCCCGGCTCCACCTTGACTCCTCCGGCCGTG

GGGCTCGTGCATTCG-3' ahol a képletben

R' jelentése 5'-ATGCTTGGGGTCCTGGTCCTTGGCGCG

CTGGCCCTGGCCGGCCTGGGG-3 ' ;

R¹'jelentése 5'-TTCCCC-3 ' ;

x jelentése 0 vagy 1;

y jelentése 0 vagy 1, azzal a feltétellel, hogy ha y jelentése 0, akkor x-nek is 0-nak kell lennie, és ha x jelentése 1₍akkor y-nak is 1nek kell lennie;

A jelentése dezoxiadenil;

G jelentése dezoxiguanil;

C jelentése dezoxicitidil; és

T jelentése timidil.

Amint megjegyeztük, a jelen találmány szerinti származékokat előnyösen rekombináns DNS technikákat alkalmazva állítjuk elő. így a találmány új DNS szekvenciákat, rekombináns DNS vektorokat és gazdasejteket nyújt a kívánt termékek kifejeződéséhez. Amint korábban megjegyeztük, az oldható trombomodulin származékok előállításának előnyös eljárása egy eukarióta gazdasejt, amely a kívánt DNS szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral rendelkezik, tenyésztése. Az előnyös rekombináns kifejező vektor erre a célra a phdTMDl plazmid, amelynek restrikciós hely- és működési térképét a

7. ábra mutatja be. A phdTMDl plazmid általános megalkotását az 1. ábra folyamatábrája körvonalazza. Az egyes lépéseket ebben a konstrukcióban a későbbiekben részletesen tárgyaljuk.

A kiinduló plazmid, a pUClB plazmid, jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak; ez kereskedelmi forgalomban kapható (pl. Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana) rekombináns DNS klónozó vektor, amely sokszoros klónozó helyet (polilinker) tartalmaz magában foglalt lac génjén belül. Egy másik eljárás szerint - ez is jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak - alkalmazhatjuk a pUC19 plazmidot is, amely szintén kereskedelmi forgalomban van. Ezen kívül ezek a plazmidok tartalmaznak egy módosított ampicillin-rezisztencia gént és replikációs origót a pBR322ből. Ezek a vektorok különösen hasznosak, mivel ezek lehetővé teszik a kettősen emésztett DNS restrikciós fragmentumok klónozását külön-külön és a lac promotorra nézve a kívánt orientációban. A pUC18 restrikciós hely- és műveleti térképét a 2. ábrában adjuk meg.

Az 1. ábrában körvonalazott speciális plazmid előállítására számos olyan jelenlétét igényli, amely nincs jelen vázlat a phdTMDl restrikciós hely a TM származékot kódoló szekvencián belül. Ennek megfelelően elkészítünk egy kapcsoló (linker) szekvenciát, amelyet EcoRI-PstI kapcsolónak nevezünk. Ez a szekvencia (a jelzett restrikciós helyekkel együtt) az alábbi:

·»

Bell	BsmI	PstI
EcoRI	PpuMI	Bell

5¹-AATTCTGATCATGCTTGGGGTCCTTGCATTCGTAATTAATTAATGATCACTGCA-3 '

3'-GACTAGTACGAACCCCAGGAACGTAAGCATTAATTAATTAGTAGTG-5'

A jelölt restrikciós helyek mindegyike alkalmas a phdTMDl plazmid megalkotásában, amely világosabbá válik az 1. ábrára való utalással és a későbbi tárgyalás alapján.

Ezután elkészítjük a pUC18TMlinker köztes vektort a pUC18 kettős emésztésével EcoRI és PstI enzimekkel, ezt az így létrejövő DNS ligálása követi a fentebb leírt EcoRI-PstI kapcsolóval. Az így létrejövő vektornak, a pUC18TMlinker-nek a restrikciós hely- és működési térképét a 3. ábrában adjuk meg.

A jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származékok kódoló szekvenciája a teljes trombomodulin gént kódoló genomikus DNS-ből származik. Ez a gén a humán genom 20. kromoszómáján van lokalizálva, és azt közölték róla, hogy intronoktól mentes Elásd Wen D. és munkatársai: Biochemistry 26, 4350 (1987); Jackman R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 6425 (1987)3. A szarvasmarha trombomodulin DNS szekvencián EJackman R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83, 8834 (1986)3 alapuló és ennek alapján tervezett oligonukleotid vizsgáló mintákat alkalmazva egy kiónt, a GHTM3A-t, amely a teljes humán trombomodulin gént hordozza, izolálunk a humán 20.

kromoszóma könyvtárból, amelyet a Charon 21A lambda fág hordoz. Ez a kromoszómái is könyvtár rendelkezésre áll az

American Type Culture Collectionnál (ATCC; 12301 Parklawn

Drive, CID kod:

Rockville, Maryland 20852) ATCC 55712 letéti számon LL20NS01).

A GHTM3A-ról azt találjuk, hogy tartalmazza a teljes trombomodulin gént egy, a Charon 21A vektorba csomagolt ^6,4 kb-s HindlII fragmentumon. így a teljes kódoló területet úgy kapjuk meg, hogy a kiónt HindlII restrikciós endonukleázzal kezeljük és a 6,4 kb-s restrikciós fragmentumot izoláljuk.

A GHTM3A-ból származó 6,4 kdb-s HindlII fragmentumot azután a HindlII-mal emésztett pUC19-hez ligáljuk. Az így létrejövő plazmidot, amelyet pGHTM3A-nak nevezünk, izoláljuk és további konstrukciókhoz használjuk fel.

A phdTMDl konstrukciójában a következő lépés a ^1,9 kb-s PpuMI restrikciós fragmentum kinyerése a pGHTM3A plazmidból. Ez a fragmentum tartalmazza a csaknem teljes humán trombomodulin kódoló területet az első néhány bázispár kivételével. A hiányzó párokat úgy állíthatjuk helyre, hogy a pGHGTM3A ^1,9. kb-s PpuMI fragmentumát ligáljuk a PpuMI gyel emésztett pUC18TMlinker-hez, amint ezt a későbbiekben leírjuk. A PpuMI helyek a humán TM szekvencia izolálásához azonban átfedik az 5'-CCTGG-3' dcm metiláz felismerő szekvenciát.

Ezen szekvencia belső citozinjának metilezettsége Azok, akik a blokkolhatja a PpuMI-gyel végzett hasítást, szakterületen jártasak, ennél fogva tudják, hogy a kívánt szekvenciák klónozását dcm sejtekben kell • ·

elvégezni. Erre a célra előnyös gazdaszervezet az E.coli K12 GM48, amely 1983.· november 23-án volt deponálva, és most már rendelkezésre áll a Budapesti Szerződés szabályai szerint a Northern Régiónál Research Laboratory-nál (NRRL, 1815 North Oniversity Street, Peoria, Illinois 61604) az NRRL B15725 letéti számon. A későbbi célokra tekintettel azok, akik a szakterületen jártasak, megjegyezhetik, hogy ez a törzs dam~ is.

A pGHTM3A plazmidot az E.coli K12 GM48 transzformánsokból izoláljuk, PpuMI restrikciós enzimmel kezeljük, és a ^1,9 kb-s restrikciós fragmentumot, amely a humán TM gént tartalmazza, izoláljuk. Hasonlóképpen kezeljük a pUC18TMlinker plazmidot PpuMI restrikciós enzimmel. Az így létrejövő DNS-t izoláljuk, majd a pGHTM3A <^1,9 kb-s PpuMI restrikciós fragmentumához ligáljuk. Az újra koraiakévá zárt plazmidot, amelyet pUC18TM-nek nevezünk, izoláljuk és ez tartalmazza a teljes humán TM kódoló szekvenciát. A pUC18TM plazmidot E.coli K12 DH5<ZF'-be transzformáljuk, ez lesz a plazmid előnyös forrása és gyűjtőhelye. A plazmidot hagyományos eljárásokkal izolálhatjuk ebből a törzsből, amelyet a Budapesti Szerződés feltételei szerint deponáltunk, ez részét képezi az NRRL törzsgyűjteményének. Ez a törzs az NRRL B-18524 letéti számon áll rendelkezésre, és 1989. július 20-án lett deponálva. A pUC18TM plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 4. ábra mutatja be.

A pUC18TMDl tartalmazza a jelen találmány oldható trombomodulin származékjait kódoló szekvenciát (TMD1). Ezt a vektort úgy állítjuk elő, hogy a teljes hosszúságú TM szekvenciából, a pUC18TM-en helyezkedik el, mintegy 500 bázispárt kiiktatunk a gén 3' végéből. A kiiktatást úgy hajtjuk végre, hogy a pUC18TM-et BsmI restrikciós enzimmel kezeljük, majd újra köralakúvá tesszük. Ez a kiiktatás a szerin/treoninban dús és transzmembrán tartományok találkozásánál történik, hatékonyan kihasítva a transzmembrán és citoplazmás kódoló területeket a vektorból. A humán trombomodulin publikált szerkezetére támaszkodva ettől a hasítástól, az újra ligálás után, elvárható, hogy a kódolt fehérje kifejezésekor és bármiféle további in vivő feldolgozás hiányában az alábbi szerkezet kialakítását tegye lehetővé:

Szignál peptid/NE^-terminális terület/EGF homológia terület/treonin/szerin terület/.../-ProAlaValGlyLeuValHisSer-COOH

A teljes TMD1 szekvencia, amely a jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származékokat kódolja, megtalálható a pUC18TMDl'v-l, 5 kb-s Bell fragmentumában. Ezt a fragmentumot, hacsak a későbbiekben másképp nem jelezzük, hagyományos eljárásokkal izoláljuk. A pUC18TMDl plazmid restrikciós hely- és működési térképét az 5. ábra mutatja be.

Akárcsak a pGHTM3A plazmid PpuMI-gyel végzett hasításánál, az ezt követő Bell emésztés, amennyiben szükséges, igényli, hogy a belső dezoxiadenil gyök a felismerő szekvenciában ne legyen metilezve. Ennek megfelelően a pUC18TMDl plazmid klónozása szükségessé teszi, hogy ez olyan gazdatörzsbe legyen transzformálva, amely adenin metiláz aktivitásban ·♦··♦ ·♦ ·· ··«· » · · 4 · » • · · »··· 4 · • · ···· 4 4··· hiányos (dam^-). Amint korábban már megjegyeztük, az E.coli K12 GM48 (NRRL B-15725) alkalmas erre a célra.

A pUC18TMDl plazmid 1,5 kb-s Bell fragmentumát azután beiktatjuk a phd plazmidba, amely egy eukarióta rekombináns DNS kifejező vektor. A phd plazmid kellemes eukarióta kifejező vektor, mivel olyan kazetta vektor, amely tartalmazza a BK vírus fokozó (enhancer) szekvenciát (BK) közvetlenül az adenovírus-2 késői promotortól (AD2LP) fölfelé. Ezen kívül a phd plazmid tartalmaz egy egyedi Bell restrikciós enzim felismerő helyet egy kívánt DNS szekvencia beiktatáshoz viszonyítva úgy elhelyezve, hogy ez a BK fokozó

AD2LP promotor rendszerből kifejeződjék. Ez a konstrukció lehetővé teszi a beiktatott génszekvencia magas szintű átírását és azt követő kifejezését. A phd plazmid tartalmaz higromicin-rezisztencia átadó szekvenciát is, valamint dihidrofolát reduktáz (dhfr) cisztront, amelyek mindegyikét alkalmazhatjuk szelektálható markerként higromicin-érzékeny illetve dhfr negatív gazdasejtekben. A phd plazmid megalkotását részletesen ismerteti az EP A 0 245 949 számú európai szabadalmi közzétételi irat (bejelentési szám 80303083.7), amely 1987. november 19-én került nyilvánosságra.

A phd plazmidot azután E.coli K12 GM48-ba transzformáljuk, ez előnyös forrása és gyűjtőhelye ennek a plazmidnak. A plazmidot hagyományos eljárásokkal izolálhatjuk ebből a törzsből, amelyet már deponáltunk, és így részét képezi az NRRL törzsgyűjteményének. A törzs az NRRL B-18525 letéti számon lett deponálva 1989. július 26-án, és erre a számra hivatkozva szerezhető be. A phd restrikciós hely és működési térképét a 6. ábra mutatja be.

Abból a célból, hogy megalkossuk a phdTMDl rekombináns DNS kifejező plazmidot, izoláljuk a pUCTMDl 1,5 kb-s Bell fragmentumát, és a BclI-gyel emésztett phd plazmidba ligáljuk. Az újból köralakúvá tett DNS a kívánt termék, vagyis a phdTMDl plazmid. A phdTMDl plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 7. ábra mutatja be.

Akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy nemcsak a fentebb leírt és alkalmazott speciális vektorok képezik az egyetlen járható utat a jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származékokat kódoló DNS szekvenciák klónozásához és kifejezéséhez, jártasak, képesek bármilyen

Azok, akik a szakterületen kívánt restrikciós enzim felismerő szekvenciát tartalmazó vektorok megalkotására, hogy akár eukarióta, akár prokarióta rekombináns DNS vektorokat állítsanak elő, amelyek a jelen találmányban használhatók. Ezen kívül azok, akik a szakterületen jártasak, teljes mértékig tisztában vannak a genetikai kód degenerációjával. Következésképpen a képzett szakember képes módosítani a találmányban megadott DNS szekvenciákat, hogy olyan homológ fehérjéket kapjanak, amelyek az itt felsorolt speciális polipeptidek fiziológiai jellemzőihez hasonlítva azonos vagy javított fiziológiai jellemzőkkel bírnak. Azok, akik a szakterületen jártasak, úgy is tudják módosítani a DNS szekvenciát, hogy azonos fehérjét fejezzen ki, mint az eddig szolgáltatott fehérje, de magasabb szinten fejezze ki. Ezen kívül azok, akik a szakterületen jártasak, tisztában vannak ·· 1» • · *· • · · * · ♦ ··· ·· · ··· azokkal az eszközökkel és eljárásokkal, amelyekkel részben vagy egészben . szintetikusan DNS szekvenciákat lehet előállítani, amelyek alkalmazhatók rekombináns DNS vektorok vagy a jelen találmány körébe tartozó oldható TM-et kódoló szekvenciák előállítására. Ezen kívül a rekombináns eszközök közt a kapott DNS szekvenciák módosítására találjuk pl. a helyre irányított kiiktatást vagy a helyre irányuló mutagenezist. Ezek a technikák jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, és ezért nem szükséges itt további körülírás. Következésképpen ahogyan itt használjuk, a megalkotott vagy konstruált kifejezés magában foglalja mindazokat a DNS-eket, amelyeket természetes forrásból izolálunk, szintetikusan vagy félszintetikusan (természetes vagy szintetikus forrásokból) állítunk elő, vagy rekombináns DNS eljárásokkal módosítunk.

Hasonlóképpen azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a rekombináns módon kifejezett polipeptideket lehet szintetizálni is az ismert konstrukciókat alkalmazva, vagy részben, vagy egészben hagyományos, ismert technikákkal, pl. szilárdfázisű szintézissel. így a jelen találmányt nem ügy alkottuk meg, hogy feltétlenül korlátozzuk magunkat adott vektorkonstrukciókra vagy eljárásokra a végső humán trombomodulin származékok, amelyeket fentebb definiáltunk vagy a példákban leírtunk, előállításánál. Minden alternatív eljárást a jelen trombomodulin származékok előállítására a jelen találmányba foglaltnak tekintünk.

A jelen találmány oldható humán trombomodulin származékainak előállítására az az előnyös eljárás, hogy egy gazdasejtben ····· ♦ · ·· ···· • · · · · · · • · * ··· · · · * · ···· · · ·« * ·· · ·· ·· ·« egy rekombináns DNS vektort fejezünk ki, amely a pUC18TMDl plazmid vagy a phdTMDl plazmid trombomodulin-származékot kódoló szekvenciáját fejezi ki. A trombomodulin származékot kódoló szekvencia az alábbi:

·· .

• · • ·· · ·*·· · • · • · · « · ··· ···«

-3610 - 3050

5'-ATGCTTGGGGTCCTGGTCCTTGGCGCGCTGGCCCTGGCCGGCCTGGGGTTC

7090

CCCGCACCCGCAGAGCCGCAGCCGGGTGGCAGCCAGTGCGTCGAGCACGAC

110 130150

TGCTTCGCGCTCTACCCGGGCCCCGCGACCTTCCTCAATGCCAGTCAGATC

170190

TGCGACGGACTGCGGGGCCACCTAATGACAGTGCGCTCCTCGGTGGCTGCC

210 230250

GATGTCATTTCCTTGCTACTGAACGGCGACGGCGGCGTTGGCCGCCGGCGC

270290

CTCTGGATCGGCCTGCAGCTGCCACCCGGCTGCGGCGACCCCAAGCGCCTC

310 330350

GGGCCCCTGCGCGGCTTCCAGTGGGTTACGGGAGACAACAACACCAGCTAT

370 3904

AGCAGGTGGGCACGGCTCGACCTCAATGGGGCTCCCCTCTGCGGCCCGTTG

430450

TGCGTCGCTGTCTCCGCTGCTGAGGCCACTGTGCCCAGCGAGCCGATCTGG

470 490510

GAGGAGCAGCAGTGCGAAGTGAAGGCCGATGGCTTCCTCTGCGAGTTCCAC

530550

TTCCCAGCCACCTGCAGGCCACTGGCTGTGGAGCCCGGCGCCGCGGCTGCC ···♦ * ·· ·· ·«·· • ♦ · · · · · • · · ·«« · · · * ··»·· ·· ·· · ·* . ♦ ·· ·· ··

-37570 ' 590 .610

GCCGTCTCGATCACCTACGGCACCCCGTTCGCGGCCCGCGGAGCGGACTTC

630650

CAGGCGCTGCCGGTGGGCAGCTCCGCCGCGGTGGCTCCCCTCGGCTTACAG

670 690710

CTAATGTGCACCGCGCCGCCCGGAGCGGTCCAGGGGCACTGGGCCAGGGAG

730750

GCGCCGGGCGCTTGGGACTGCAGCGTGGAGAACGGCGGCTGCGAGCACGCG

770 790810

TGCAATGCGATCCCTGGGGCTCCCCGCTGCCAGTGCCCAGCCGGCGCCGCC

830850

CTGCAGGCAGACGGGCGCTCCTGCACCGCATCCGCGACGCAGTCCTGCAAC

870 890910

GACCTCTGCGAGCACTTCTGCGTTCCCAACCCCGACCAGCCGGGCTCCTAC

930 95097

TCGTGCATGTGCGAGACCGGCTACCGGCTGGCGGCCGACCAACACCGGTGC

9901010

GAGGACGTGGATGACTGCATACTGGAGCCCAGTCCGTGTCCGCAGCGCTGT

1030 10501070

GTCAACACACAGGGTGGCTTCGAGTGCCACTGCTACCCTAACTACGACCTG

1090 1110

GTGGACGGCGAGTGTGTGGAGCCCGTGGACCCGTGCTTCAGAGCCAACTGC ···· · ·· ·· ··«· • · ♦ · · 4 · • · * »r« · 4 « • 44·*· ·· ·· « ·« · «· ·♦ ·»

1130 11501170

GAGTACCAGTGCCAGCCCCTGAACCAAACTAGCTACCTCTGCGTCTGCGCC

11901210

GAGGGCTTCGCGCCCATTCCCCACGAGCCGCACAGGTGCCAGATGTTTTGC

1230 12501270

AACCAGACTGCCTGTCCAGCCGACTGCGACCCCAACACCCAGGCTAGCTGT 12901310

GAGTGCCCTGAAGGCTACATCCTGGACGACGGTTTCATCTGCACGGACATC

1330 13501370

GACGAGTGCGAAAACGGCGGCTTCTGCTCCGGGGTGTGCCACAACCTCCCC

1390 141014

GGTACCTTCGAGTGCATCTGCGGGCCCGACTCGGCCCTTGCCCGCCACATT

14501470

GGCACCGACTGTGACTCCGGCAAGGTGGACGGTGGCGACAGCGGCTCTGGC

1490 15101530

GAGCCCCCGCCCAGCCCGACGCCCGGCTCCACCTTGACTCCTCCGGCCGTG

GGGCTCGTGCATTCG-3¹, ·« *·♦· ·*·< · *4 ♦ · · · · ♦ • · · ··· · 9 4 * ··««· ««* «« 4 ·· · ·· ·* ·· ahol A jelentése dezoxiadenil, G jelentése dezoxiguanil, C jelentése dezoxicitidil és T jelentése timidil.

Ez utóbbi szekvenciát korábban már leírták. Ezt a szekvenciát, vagy prokarióta, mind tervezett kifejező egy részét, ki lehet fejezni mind eukarióta sejtekben, ha megfelelően vektorokba iktatjuk be ezeket. így pl.

E.coli, Bacillus és Streptomyoes kifejező vektorok már jól ismertek a szakterületen. A nevezett trombomodulin származékot kódoló szekvenciát úgy állíthatjuk elő, amint fentebb leírtuk és a példákban leírjuk, majd ezt beiktathatjuk az átíráshoz és egy adott promotor segítségével létrejövő kifejezéshez megfelelő orientációban a megfelelő prokarióta kifejező vektorba, klónozhatjuk olyan körülmények között, amely lehetővé teszi a megfelelően transzformált gazdasejtek szelekcióját, majd kifejezhetjük olyan körülmények között, amely a beiktatott szekvencia kifejezéséhez alkalmas, ezt azután a termék kinyerése követi.

A kívánt trombomodulin származékok kifejezése prokarióta gazdasejtekben, elsősorban E.coliban nem korlátozódik egy adott promotor alkalmazására, mivel egy speciális promotor nem döntő a jelen találmány működőképessége szempontjából. Az alkalmas promotorok között találjuk pl. a lipoprotein (lpp) promotort, az E.coli trp promotort, a bakteriofág lambda promotorokat, vagy az E.coli laktóz (lac) promotort. Ezen kívül egy vagy több promotort alkalmazhatunk együtt, tandem felállításban is, pl. a trp és lac promotorokat. Ezen kívül állíthatunk elő hibrid «··· · ·* ·· ,«k* • * < · · »> · • · · ··♦ « r * • ·«··· » · ·· · <· « ·· » * «·* promotor/transzláció-aktiváló szekvenciákat, mint pl. a tac promotor, hogy .a jelen találmány szerinti TMO1 kódoló szekvencia kifejeződését elősegítsük. Mindezeket a promotorokat már korábban jellemezték, jól ismertek a szakterületen, és megalkothatok mind szintetikusan, mind ismert plazmidokból.

Ezen kívül előnyös lehet egy hővel indukálható szökevény (runaway) replikon alkalmazása, pl. olyané, amelyet az 1,557,774 számú, egyesült királyság-beli szabadalmi közzétételi irat és az alábbi közlemény ismertet: Uhlin és munkatársai: Gene £, 91 (1979). 30 °C hőmérséklet alatt, elsősorban 25 °C hőmérsékleten, a replikon viszonylag kis kópiaszámot (10-15 kópia sejtenként) tart fenn. Amikor a hőmérsékletet 37 °C-ra emeljük, a kópiaszám-kontroll eltűnik és a replikont tartalmazó plazmidok mintegy 1000-2000 kópia/sejt száma sokszorozódnak.

Amint a későbbiekben megjegyezzük, egy idegen gén, pl. a jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származékok génjének klónozása egy runaway replikont tartalmazó vektorba azt eredményezi, hogy az indukció és a kópiaszámkontroll elvesztése alkalmával a fehérjeszintézis és intracelluláris, fehérje-jellegű szemcsék (zárványtestek) ezzel együtt járó képződése jelentősen megnövekedett mértékű lesz. A szemcsék fehérje-összetételük szempontjából nagy mértékben homogének, és nagy mértékben tartalmazzák a kívánt fehérjét, amely elérheti vagy akár meg is haladhatja a szemcse száraz tömegének 80%-át. Ezek a szemcsék könnyen izolálhatok a sejt-1izátumokból és stabilak kis ···· · *· ·· ···· • · · · a · · • a a ··· a · · • « *··« · · » · é •a a » ♦ «· o· koncentrációjú karbamid vagy detergens oldatokkal végzett mosás esetében. Ezek a mosások eltávolítják azokat a fehérjéket, amelyek nem fajlagosan kötődnek a szemcsékhez.

A jelen találmány azonban nem korlátozódik egy runaway replikont tartalmazó plazmidra az oldható trombomodulin származékok prokarióta sejtekben való klónozásánál és kifejezésénél. Nagyon sokféle replikon, pl. a pBR322, pBR328, pACYC184-ből származó replikonok és hasonlók ismeretesek a szakterületen és alkalmasak olyan rekombináns DNS vektorok megalkotásához, amelyeket azért tervezünk, hogy a jelen találmány szerinti trombomodulin származékokat kódoló DNS szekvenciák kifejeződését elősegítsük.

Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerik a B. subtilisből származó vég promotort, amely a Bacillus-ban való kifejezéshez lehet kívánatos. Ezen kívül utalunk az EP A 0 116 411 számú európai szabadalmi közzétételi iratra (közzétéve 1984. augusztus 22-én), valamint a 4,559,300 lajstromszámú leírásra, bejelentésbe, polipeptidek szükséges lajstromszámú leírás ezen amerikai referenciaként amelyek egyesült államokbeli szabadalmi épülnek kitanítást Bacillusban, eljárásokról.

és

A be a jelen tartalmaznak az ehhez 4,559,300 szabadalmi amelyek és kifejezéséről vektorokról és amerikai egyesült államok-beli kívül ismertet olyan kifejező vektorokat is, amelyek Streptomyces-ben való kifejezéshez alkalmas. Erre a célra más kifejező vektorok is ismertek a szakirodalomban. Lásd pl. Horinouchi és munkatársai: Mól.Gén.Génét. 210 , 468 (1987); és Bibb M. és munkatársai: Experimental Manipulation ···· · • · • · · • · ···· ·* · of Gene Expression, 4. fejezet: Developments in Streptomyces Cloning , Academic Press (1983).

Ezen kívül egy adott szelektálható marker alkalmazása nem kritikus a jelen találmány műveletei szempontjából. Szelektálható markerek széles választéka működik, amelyek alkalmasak mind eukarióta, mind prokarióta gazdasejtekhez.

Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy amikor valamely prokarióta sejtben, pl. E.coliban, Bacillusban vagy Streptomycesben fejezünk ki, a terméktől normálisan nem várható, hogy glükozilezett legyen, vagy bármilyen formában feldolgozott legyen az intracelluláris bioszintetikus rendszer révén. Az ilyen sejtekben következésképpen a jelen találmány szerinti trombomodulin származékok bizonyára nem választódnak ki a sejtekből. E helyett, amint elsősorban az E.colinál láthatjuk, a termék zárványtest-ként raktározódik el, amint korábban leírtuk. A termék tisztítása ebben az esetben a gazdasejt membránjának szétzúzását, a termék denaturálását - amelyet legtöbb esetben a fehérje visszahajtogatás-a követ -, és szükség esetén megfelelő proteázok alkalmazásával a szignál szekvencia valamely kívánt részének lehasítását igényli. Egy másik eljárás szerint a szignál peptid DNS szekvenciáját úgy módosíthatjuk, hogy egy fajlagos hasítási helyet kódoljon, amelyet egy adott enzim úgy ismer fel, hogy a termék helyspecifikus hasítása legyen lehetséges. Az eszközök az ilyen tisztítási, visszahajtogatási és hasítási lépésekhez jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, ezért ezekkel nem foglalkozunk tovább részletesebben.

···· · ·· ·· ···· • · · · « · ♦ • · · «·· · · · * » ···· · » · · · ·· · ·· ·· ··

A termék, amikor prokarióta gazdasejtben fejezzük ki, akár teljes hosszúságú formájában, akár ennek egy részeként, jelentős trombomodulin-szerű aktivitással bírhat és felhasználható erre a célra vagy más hasznos származékok kifejlesztéséhez. Ezen kívül ezeket a termékeket antigénekként is alkalmazhatjuk humán trombomodulin antitestek előállítására, amelyeket sokféle vizsgálathoz alkalmazhatunk. Sok ilyen vizsgálat versengő antitest-kötést alkalmaz egy fehérje szintjének mérésére valamely mintában, így a prokarióta sejt által termelt trombomodulin származékok radioaktívan (vagy más módon) jelzett származékait alkalmazhatjuk versengő molekula-ként a vérplazmában lévő fontos lehet a diagnózisában. A alkalmazhatjuk jellemzők, stb.

trombomodulin mérésére. Az ilyen mérés véralvadási gondokkal küzködő betegek prokarióta sejtben termelt termékeket szerkezetelemzéshez, összetekeredési vizsgálatához, és további, javított trombomodulin származékok kifejlesztéséhez.

A jelen találmány trombomodulin származékainak termelésére az előnyös gazdasejtek azonban az eukarióta gazdasejtek.

Általában (elsősorban gazdasejtek kifejezett az emlős vagy más eukarióta, pl. élesztő

Saccharomyces, Kluyveromyces vagy Pichia) rendelkeznek a szükséges sejtmechanizmussal a termék aminoííerminálisán jelen levő szignál peptid rész felismeréséhez és megfelelő feldolgozásához.

Bizonyos emlős sejtek képesek elvégezni bizonyos transzláció utáni módosításokat, pl. glikozilezést, stb. is, amint ez megfigyelhető a plazmában levő vad típusú trombomodulinban.

···· ν ·« ·· «··· • · · · V · · • · · <·· · · · • · ·«·» · <· · · · • l · ·· ·· ··

Vektorok széles választéka létezik eukarióta gazdasejtek transzformálásához, és amint fentebb jeleztük, a találmány oltalmi köre semmiképpen sem korlátozódik az egyes megnevezett speciális vektorokra.

így pl. sokféle pSV2 típusú vektor tartalmazza az SV40 genom szegmenseit, amelyek egy meghatározott eukarióta transzkripciós egységet alkotnak, beleértve egy promotort (pl. EP), beavatkozó szekvenciákat (IVS) és poliadenilező helyeket (pA). SV40 T-antigén távollétében a p5V2-típusú vektorok az emlős- és más eukarióta gazdasejteket úgy transzformálják, hogy integrálódnak a gazdasejt kromoszomális DNS-ébe. Sokféle pSV2-típusú plazmidot alkottak meg Llásd: Eukaryotic Viral Vectors (szerkesztő: Gluzman; kiadó: Cold Spring Harbor Laboratories, New York) (1982)3, pl. a pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr és pSV2-pglobin plazmidokat, amelyekben az SV4O promotor segíti elő egy beiktatott gén átírását. Ezeknek a vektoroknak megalkotása és alkalmazása jól ismert azok számára, akik a szakterületen jártasak. Ilyen vektorok beszerezhetők az American Type Culture Collection-tól (ATCC, Rockville, Maryland) vagy a Northern Régiónál Research Laboratory-tól (NRRL; Peoria, Illinois).

A jelen találmány származékainak kifejezéséhez alkalmas további plazmidok alkalmazhatnak SV40 korai promotortól eltérő más promotorokat is. A jelen találmány ezért nem korlátozódik csak az itt példaként megadott promotorok alkalmazására. Más promotorok, pl. az SV40 késői promotor, vagy eukarióta génekből, mint ösztrogén-indukálható csirke • · · · • » · ovalbumin génből interferon génekből _z glükokortikoidindukálható tirozin aminotranszferáz génből, timidin kinéz génből és promotorok rekombináns a fő korai és késői adenovírus génből való és módosíthatók olyan amelyek a előállításához könnyen izolálhatok

DNS kifejező vektorokban történő alkalmazáshoz találmány vannak szerinti trombomodulin származékok alkalmazhatunk egymás tervezve. Eukarióta promotorokat melletti (tandem) elrendezésben is, hogy elősegítsük a kívánt végtermék kifejeződését.

kívül nagyszámú retrovírus is gazdasejtet fertőz.

ismétlődése gyakran fentebb leírt a jelen találmány származékot és transzlációját.

ismeretes, amely sokféle retrovirális DNS hosszú kódol promotor aktivitást és SV4O korai promotor helyett, által nyújtott oldható kódoló szekvenciák így pl. a pRSVcat az ATCC 37152 számon szerezhető szarkóma vírus (RSV) hosszú részeit (erről a vírusról fertőz) . Az RSV szekvenciák a pRSVcat plazmid restrikciós fragmentumán izolálhatjuk és megfelelő hogy a jelen találmány kódoló szekvencia elősegítéséhez megfelelően

Ezen eukarióta terminális alkalmazható a hogy elősegítse trombomodulin transzkripcióját plazmid (amely az ATCC-től be) tartalmazza a Rous terminális ismétlődésének ismeretes, hosszú egy λ/ 0,7 6 izolálhatok. vektorba szerinti átírásának helyezkedjék hogy csirke- és más gazdasejteket terminális ismétlődő kb-s Ndel-HindlII

Ezt a promotort iktathatjuk olyan módon, trombomodulin származékot és kifejeződésének

Ezen kívül más eukarióta vagy emlős kifejező rendszerek is • · ♦ ismeretesek, amelyek hasonlók azokhoz, amelyeket a fentebb leírt phd nyújt. Utalunk az alábbi irodalmi helyekre ezzel kapcsolatban: 87303083.7 számú publikált európai szabadalmi bejelentés, amely 1987. november 19-én lett publikálva EP A 0 245 949 számon; ez megfelel a 06/849999 számú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi bejelentésnek (a bejelentés napja: 1986. április 9); ez az irodalmi hely referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. A jelen trombomodulinokhoz az előnyös kifejező vektor azonban a phdTMDl.

Amennyiben viszont a kifejeződés élesztőben lenne kívánatos, az élesztő kifejező rendszerek előállításának eljárásai a szakterületen jól ismertek. Ha ilyen kifejeződés szükséges, utalunk az alábbi irodalmi helyekre: 4,775,622 lajstromszámú amerikai egyesült (közrebocsátva 1988. lajtromszámú európai államok-beli szabadalmi leírás október 4-én); EP B 0 073 635 szabadalmi leírás (megadva 1988.

április 20-án); 4,615,974 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás (közrebocsátva 1986. október

7-én); és EP A 0 183 070 számú európai szabadalmi közzétételi irat (közzétéve 1986. június 4-én).

Amint megjegyeztük, a konkréten alkalmazott eukarióta kifejező vektorok, elsősorban a phdTMDl, vagy más, fentiek szerint megalkotott eukarióta vektorok, amelyek magukban foglalják a TMD1 kódoló szekvenciát, sokféle eukarióta, különösen emlős, gazdasejtbe transzformálhatok és ezekben kifejezhetők. Azok a vektorok, amelyek nem tartalmaznak olyan szelektálható markereket, amelyek segítségével stabil transzformánsokat lehet izolálni és azonosítani, alkalmasak lehetnek átmeneti vizsgálatokhoz vagy együtt transzformálás céljaira; ilyen munkamenetet körvonalaz a 4,399,216 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás, amely referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. A jelen találmány szerinti vektorok magukban foglalnak olyan szekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a replikádét E.coliban, mivel általában hatékonyabban lehet előállítani plazmid DNS-t E.coliban, mint más gazda organizmusokban, és ezeket, ha kívánatos, transzformálni lehet a kívánt gazdaszervezetbe.

Bármely esetben a jelen találmány szerinti kívánt trombomodulin származékot kódoló szekvenciák kifejeződése olyan gazdasejtekben történik, amelyekben az adott promotor a beiktatott gén-funkciókkal társul. A fentebb említett promotorok és főleg a phdTMDl-ben alkalmazott adenovírus-2 késői promotor gazdasejtek széles választékában működik. Bár a találmány nem korlátozódik a megadott gazdasejtekre, megadjuk a jelen találmány trombomodulin származékainak kifejeződéséhez az előnyös gazdasejteket az 1. táblázatban:

	1.	TÁBLÁZAT
Előnyös	eukarióta	gazdasejtek a phdTMDl	plazmidhoz
Gazdase.jt	Eredet	Forrás	Megjegyzés

HepG-2	Humán máj hepatoblasztóma	*ATCC HB 8065	Ennek a sejtvonalnak az alkalmazását a 4,393,133 lajtsromszámú USA szabadalmi leírás írja le
Aedes
aegypti	Moszkító lárva	ATCC CCL 125
CV-1	Afrikai zöld majom
	vese	ATCC CCL 70
llc-mk2
eredet i	Rhesus majom vese	ATCC CCL 7
llc-mk2
származék	Rhesus majom vese	ATCC CCL 7.1	Gyorsabban nő,
			mint az ATCC
			CCL 7
3T3	Egér embrió fibro-
	blaszt	ATCC CCL 92
CHO-kL	Kínai hörcsög pe-
	tefészek	ATCC CCL 61	A CHO-K1 pro-

lint igénylő származékát, pl. a DXB11 dhfr^- szárma- 49

1. TÁBLÁZAT (folytatása)

Előnyös eukarióta gazdasejtek a phdTMDl plazmidhoz

Gazdasejt Eredet Forrás Megjegyzés zékát lehet kialakítani ebből a gazdaszervezetből

Antheraea
eucalypti	Moly peteszövet	ATCC	CCL	80
He La	Emberi méhnyak epiteloid	ATCC	CC.L	2
RPM/8226	Humán mielóma	ATCC	CCL	155	IgG lambda típusú könnyű lánc kiválasztó
H4IIEC3	Patkány hepatóma	ATCC	CRL	1646	Ebből a gazdaszervezetből származékokat lehet kialakítani, pl. a 8azaguanin-rezisztens FA2A gazdasejteket
C127I	Egér fibroblaszt	ATCC	CRL	1616
HS-Sultan	Humán plazmasejt plazmocitóma	ATCC	CRL	1484
BHK-21	Szíriái hörcsög-

vese

ATCC CCL 10 ···· · ·· ·· ···· • · · · · · · « · · ·«· * 4· • ····· ·· · · · ·· · 4 · 44··

1. TÁBLÁZAT (folytatása)

Előnyös eukariőta gazdasejtek a phdTMDl plazmidhoz

Gazdasejt Eredet Forrás Megjegyzés

C0S-1 Majomvese (SV40nel transzformált ATCC CRL 1650

ATCC=American Type Culture Collection, 12301 Parklawn

Drive, Rockville, Maryland 20852-1776 • · » ·· · • ·· • · 9 9·· · « · C ··· · · · ····· ·· ·* * ·* · ·· ·· ·· ···· «

A különösen előnyös gazdasejtek közt találjuk a humán 293 sejteket (293-,sejtek) és a szíriai hörcsög AV12 sejteket (AV12), amelyek beszerezhetők az American Type Culture Collection-tól (Rockville, Maryland) ATCC CRL 1573 illetve CRL 9595 letéti számon. Az AV12 sejteket a Budapesti Szerződés feltételei szerint 1987. november 24-én deponálták, míg a 293 sejtek már korábban is szerepeltek az ATCC katalógusban, mint a köz számára rendelkezésre álló sejtek.

Amikor AV12-ben vagy 293 sejtekben fejezzük ki, a phdTMDl a jelen találmány szerinti oldható trombomodulin származékok két formáját termeli. Ezeket nagy molekulatömegű illetve kis molekulatömegű formáknak nevezzük. Az egyes formák adott fizikai és működési jellemzőit részletesen leírják a későbbi példák. Ezen kívül a kis- és nagy molekulatömegű származékok N-terminális szekvenciaelemzése jelzi, hogy a molekula szignálpeptid részének hasítása zömmel a 18. aminosav (prolin) karboxi-terminálisnál történik, a termék megjósolt aminosav-szekvenciájaként az alábbi szekvenciát alakítva ki, feltéve, hogy a kifejeződést követően további feldolgozás nem történik.

·· ♦··· «··· · ·· • · · · • · · ·· · • · ··· · · ·· «·

-52I^N-AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCys

PheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCys

AspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAsp

ValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeu

TrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGly

ProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyrSer

ArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCys

ValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGlu

GluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPhe

ProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAla

ValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGln

AlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeu

MetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAla

ProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCys

AsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeu

GlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAsp

LeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSer

CysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHísArgCysGlu

AspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysVal

AsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal

AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGlu

TyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGlu

GlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsn

GlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGlu

CysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAsp

GluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGly

ThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuAlaArgHisIleGly

ThrAspCysAspSerGlyLysValAspGlyGlyAspSerGlySerGlyGly

ProProProSerProThrProGlySerThrLeuThrProProAlaValGly

LeuValHisSer-COOH ♦ ♦ • · ··· ··♦· · ·· ·<τ«· • · · • · ···· ·· · • · · • · · · ·· · · ahol ALA jelentése alanin, ARG jelentése arginin, ASN jelentése aszparagin, ASP jelentése aszparaginsav, CYS jelentése cisztein, GLN jelentése glutamin, GLU jelentése glutaminsav, GLY jelentése glicin, HIS jelentése hisztidin, ILE jelentése izoleucin, LEU jelentése leucin, LYS jelentése lizin, MET jelentése metionin, PHE jelentése fenil-alanin, PRO jelentése prolin, SER jelentése szerin, THR jelentése treonin, TRA jelentése triptofán, TYR jelentése tirozin, és VAL jelentése valin.

A kis molekulatömegű forma N-terminális szekvenciaelemzése jelzi egy termék kisebb populációját is, amelyben az Nterminális szignál-peptid része a 16. aminosav (glicin) karboxi-terminálisnál hasad. Ennek a terméknek a jósolt aminosav-szekvenciája, feltéve, hogy a kifejeződést követően további feldolgozás nem történik, az alábbi:

·· ·*·«

-54PhePro-AlaProAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAspCys

PheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlleCys

AspGlyLeuArgGlyHisLeuMetThrValArgSerSerValAlaAlaAsp

ValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArgLeu

TrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeuGly

ProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGLyAspAsnAsnThrSerTyrSer . ArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeuCys

ValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrpGlu

GluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPheLeuCysGluPheHisPhe

ProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAlaAla

ValSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAlaArgGlyAlaAspPheGln

AlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGlnLeu

MetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGluAla

ProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAlaCys

AsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAlaLeu

GlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsnAsp

LeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyrSer

CysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCysGlu

AspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCysVal

AsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeuVal

AspGlyGluCysValGluProValAspProCysPheArgAlaAsnCysGlu

TyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAlaGlu

GlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCysAsn

GlnThrAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCysGlu

CysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIleAsp

GluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuProGly·

ThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuAlaArgHisIleGly

ThrAspCysAspSerGlyLysValAspGlyGlyAspSerGlySerGlyGly

ProProProSerProThrProGlySerThrLeuThrProProAlaValGly

LeuValHisSer-COOH ·'

- ♦ · • r» 4 ahol ALA jelentése alanin, ARG jelentése arginin, ASN jelentése aszparagin, ASP jelentése aszparaginsav, CYS jelentése cisztein, GLN jelentése glutamin, GLU jelentése glutaminsav, GLY jelentése glicin, HIS jelentése hisztidin, ILE jelentése izoleucin, LEU jelentése leucin, LYS jelentése lizin, MET jelentése metionin, PHE jelentése fenil-alanin, PRO jelentése prolin, SER jelentése szerin, THR jelentése treonin, TRA jelentése triptofán, TYR jelentése tirozin, és VAL jelentése valin.

Mindezek a formák benne foglaltatnak a jelen találmányban Amint ezt a példákban a későbbiekben bemutatjuk, a jelen származékok olyan hasznos tulajdonságokat mutatnak, amelyek eddig a gyakorló klinikai orvosoknak nem álltak rendelkezésre. A jelen találmány szerinti trombomodulin származékok könnyen elkészíthetők és tisztíthatok, mivel ezek oldhatók és kiválasztódnak az eukarióta gazdasejtekből. A detergens-mentes pufferokban nem várt oldékonyság határozott előnyt biztosít a vad típusú trombomodulinokkal szemben. Ezen kívül a termékek olyan jelentős fiziológiai aktivitást mutatnak, amely előre nem volt jósolható. Különösen a nagy molekulatömegű fajtánál az optimális kalcium-koncentráció mintegy azonos azzal, amely normális fiziológiai körülmények között jelen van és a vad típusú trombomodulinnál is megfigyelhető. Ezen kívül a termékek, a legszigorúbban a nagy molekulatömegű forma, két határozottan különböző mechanizmus révén gátolják az alvasztási kaszkádot. Először: a származékok a trombinnal együttműködve aktiválják a C fehérje alvadásellenes utat, ezáltal csökkentik a jelentősebb kofaktorok, az Va és VIII.a ·«· |>· faktorok aktivitását az alvadási rendszerben. Másodszor (és nem várt módon): a származékok, elsősorban a nagy molekulatömegű származék, lényegében meggátolja a trombin alvasztási aktivitását. Ezen kívül (nem várt módon) a származékok, elsősorban a nagy molekulatömegű származék, gátolja a trombinnak azt a normális képességét, hogy aktiválja a vérlemezkéket. Ez azért váratlan, mivel az irodalom azt sugallja, hogy a természetes forrásokból izolált, teljes hosszúságú humán trombomodulinnak csekély a hatása a trombin alvasztási és vérlemezke - aktiválási aktivitására, vagy egyáltalán nincs ilyen hatása Clásd pl.: Maruyama I. és munkatársai: 3. Clin. Invest. 75, 987 (1985); Saleem H.H: és munkatársai: 3. Bioi. Chem. 259, 12246 (1984)3.

A jelen találmány szerinti oldható, kiválasztható trombomodulin származékoknak jelentős értéke lehet a trombotikus rendellenességek megelőzésében és kezelésében. Ezek között a rendellenességek között találjuk a szerzett betegségi állapotok sokaságát, ideértve az intravaszkuláris alvadást, ezen belül a mélyvénás trombózist, tüdőembóliát, perifériás artériákból artériás trombózist, a szív- és perifériás eredő embóliákat, akut miokardiális infarktust, trombotikus sokkokat, és elosztott alvadást.

Az elosztott (disszeminált) intravaszkuláris intravaszkuláris alvadás számos betegségi állapot komplikációjaként fordul elő, ideértve többek között a nagyobb baleseteket, nagyobb sebészeti beavatkozásokat, hősokkot, vérmérgezést, akut és krónikus májbetegségeket, rosszindulatú elváltozásokat, ezen belül a szilárd tumorokat, fehérvérűséget és limfómákat, ···· Λ • ·

4 · • 4 ♦··· «· · sokféle bakteriális, gombás, parazitás és vírusos fertőzést, szülési komplikációkat, hemolitikus folyamatokat, szíveredetű sokkokat, bármilyen eredetű keringési kollapszusokat, súlyos, előrehaladott hűdéseket, kígyómarást, vaszkuláris kollagén-rendellenességeket, heveny vörhe.nyt (purpura fulminans), akut hasnyálmirigy-gyulladást, allergiás vaszkulitiszt vörösvérsejt tűltengést, (polycythemia vera) trombocitémiát és fekélyes vastagbélhurutot.

A trombomodulin kifejeződésében való veleszületett rendellenességeket ki lehet mutatni a tromboembóliás gondokkal küszködő betegekben. Az ilyen betegekben az akut epizódok megfoghatók a kapott trombomodulin származékokkal végzett kezeléssel.

A kísérleti és klinikai adatok azt sugallják, hogy a hagyományos alvadásgátlók, elsősorban a warfarin, alkalmasak a támadó rákok kezelésében és úgy működnek, hogy megakadályozzák vagy csökkentik ezen rosszindulatú betegségek távoli áttételes zavarait. A jelen trombomodulin származékok hatásos alternatívát képviselnek a hagyományos alvadásgátlókhoz viszonyítva ezekben a klinikai szituációkban az alább részletezett okokból.

A mélyvénás trombózist és a tüdőembóliát lehet kezelni a hagyományos alvadásgátlókkal, de sokkal hatásosabb klinikai megközelítés a tromboembóliás komplikációk előfordulásának megakadályozása az azonosított nagy kockázatú betegekben, pl. olyan betegekben, akik krónikusan ágyban feküdni ·· kényszerülnek, és olyan betegekben, akiknek született szívrendellenességük van. Az 50 év feletti sebészeti betegek több, mint 50%-a és az összes sebészeti betegek 20%-a általában mélyvénás trombózisban szenved a sebészeti beavatkozást követően. Az összes műtét utáni mélyvénás trombózis esetek mintegy 20%-ához komplikációként még egy vagy több tüdőembólia is társul. Jelenleg heparin kis dózisát (pl. 8 óránként 5000 egység) adják mind a műtét előtt, mind a műtét után, hogy megakadályozzák a mélyvénás trombózist. A heparin kis adagja alkalmanként súlyos vérzést okoz a műtét közben és után. A trombomodulin származékok között a kis molekulatömegű származék kisebb trombininaktiválást és kisebb vérlemezke-aktiválás gátlást okoz, mint a nagy molekulatömegű formájú trombomodulin származék. A kis molekulatömegű forma pedig szelektívebb, mint a heparin és kevésbé valószínű, hogy vérzési komplikációkat okoz, mivel csak akkor és ott aktív, ahol és amikor trombin keletkezik és fibrinrögök képződnek.

A trombomodulin származékok hatékonyabbak lehetnek és kevésbé valószínű, hogy vérzési komplikációkat okoznak, mint a heparin, amikor megelőzésként alkalmazzuk mélyvénás trombózis megakadályozására. A rekombináns úton előállított trombomodulin származékok adagja a mélyvénás trombózis megakadályozására 0, 5 és 100 mg/nap tartományban van. A trombomodulin származék beadása előnyösen 6 órával a sebészeti beavatkozás előtt kezdődik és egészen addig tart, amíg a beteg mozgásképessé válik. Egy megállapított, objektívan dokumentált mélyvénás trombózis és/vagy tüdőembólia esetében a trombomodulin származék (előnyösen a ··<· * • · • · · • · ···· e· · nagy molekulatömegű forma) adagja 1-30 mg közti tartományban van beterhelő dózisként, ezt azután folyamatos infúzió követi 3-300 mg/nap tartományba eső mennyiséggel. Hasonló adagolási munkamenet alkalmazható perifériás artériás rögök kezeléséhez is. A trombomodulin származék infúzióból eredő vérzési komplikációk kisebb valószínűsége miatt ezek a fehérjék helyettesíthetik a heparint műtét közben és után a trombektómiákkal és embolektómiákkal kapcsolatban; ezek olyan sebészeti műtétek, amelyek gyakran szükségesek azért, hogy az iszkémiás végtagokat megmentsék az amputálástól akut artériás eldugulás esetében.

A szívből eredő artériás embóliák gyakori komplikációk olyan szívbetegségek esetében, amelyek a szívbillenytűkkel kapcsolatosak, továbbá olyan betegekben, akiknek mesterséges szívbillenytűik vannak, akut miokardiális infarktusban szenvednek, vagy szív arritmia bizonyos típusaiban szenvednek. Ezeknek a problémáknak a kezelése hagyományos orális alvadásgátlókkal nem mindig teljesen hatásos, és mint minden esetben, amikor orális alvadásgátlókat alkalmaznak, jelentős a vérzési komplikációk kockázata. A jelen trombomodulin származékok, amelyeket hosszú időn át adunk be olyan dózisokban, amelyek a megállapított mélyvénás trombózis-tüdőembólia dózisaihoz hasonlók, folyamatos infúzióval pl. hordozható szivattyúrendszert alkalmazva, jelentős hasznosítást nyerhetnek a szív-eredetű embóliák megelőzésében.

Hasonlóképpen a perifériás artériák, leginkább a nyaki verőér artériák vérrögeiből eredő embóliák nem kezelhetők • · • · • · « · • · • » » · • · · · · vagy nem akadályozhatok meg kielégítően a jelenleg alkalmazott kezelési rendszerekkel, amelyek közt találjuk a vérlemezke-funkciókat elfojtó gyógyszereket, orális alvadásgátlókat, vagy ezek kombinációit. Akárcsak a szíveredetű embóliák esetében, a trombomodulin származékok jelentős képességgel bírnak a nyaki ütőér vérrögeiből eredő és embóliás hűdést eredményező embóliák megakadályozásában, ugyanolyan módon hosszú időn át adva ezeket, ahogyan a szíveredetű embóliáknál körvonalaztuk.

A trombomodulin származékok (legvalószínűbben a kis molekulatömegű forma) hasznosak a trombotikus hűdések kezelésében is. Ma a hűdéseket általában nem kezelik a hagyományos alvadásgátlókkal. A hűdések kezelése heparinnal vagy orális alvadásgátlókkal, bár alkalmanként előnyös lehet, az infarktusban érintett agyi terület bevérzésének kockázatát hordozza, ezáltal súlyosbítva a hűdéssel társuló neurológiai veszélyeket. A vérzési komplikációk okozásában való alacsony potenciáljuk és szelektivitásuk miatt a trombomodulin variánsokat beadhatjuk a hűdésben szenvedőknek és ezek előnyösek abban, hogy megakadályozzák a kivált artériás vérrögök helyi továbbterjedését, ezáltal csökkentik a hűdésből eredő neurológiai veszélyeket. A beadott trombomodulin variánsok mennyisége betegről-betegre változik, a hűdés természetétől és súlyosságától függően.

Ezen kívül a jelen trombomodulin származékok (legelőnyösebben a nagy molekulatömegű származék) alkalmas lehet akut miokardiális infarktus kezelésében, mivel bizonyíték van arra, hogy a nevezett trombomodulin és β ·

származékai hatásának fő mechanizmusa, vagyis a C fehérje alvadásgátló út- aktiválása, nagyon hatékony eszközt jelent trombózisellenes hatások eléréséhez a vérkeringés arteriális oldalán. A jelen próbálkozásokból trombolitikus szerekkel akut miokardiális infarktusban, valamint az állatkísérletekből úgy tűnik, hogy a heparin, mint kiegészítő terápia eszköze, viszonylag hatástalan trombózis ellenes szerként a vérkeringés arteriális oldalán. A jelen trombomodulin származékokat beadhatjuk trombolitikus szerekkel együtt a miokardiális infarktus akut fázisai során. Ez a reperfűzió rövidebb idejét eredményezi ahhoz az időhöz viszonyítva, mintha a trombolitikus szert önmagában vagy heparinnal kombinálva adnánk be. Miután az alvadt koronáriás vérrög feloldódott, a trombomodulin származékokat adhatjuk további napokon át, hogy megakadályozzuk a koronáriás űjraalvadást. Akut miokardiális infarktusban a betegnek 3-30 mg trombomodulin variáns beterhelő dózist adunk abban az időpontban, amikor a trombolitikus kezelést elkezdjük, majd a trombomodulin variánsok folyamatos infúziója következik 1-100 mg/nap tartományban levő mennyiségben.

A jelen trombomodulin származékok alkalmasak szétterjedő intravaszkuláris alvadás (Disseminated Intravascular Coagulation, DIC) kezelésére is. Kísérleti bizonyíték van arra, hogy a gyulladás-közvetítők, mint az IL-1, TNF, és LPS endotoxin erőteljesen alulszabályozzák a trombomodulin kifejeződését az endoteliális sejtekben _z ez viszont a C fehérje alvadásgátló út fogyatékos aktiválásához vezet. Heparint és orális alvadásgátlókat is adtak szétterjedő intravaszkuláris alvadásban szenvedő betegeknek kiterjedt klinikai kísérletekben, de ezeknek a kísérleteknek az eredményei csalódást okoztak. A szétterjedő intravaszkuláris alvadásban szenvedő betegekben jellemzően sokféle elterjedt vérrögök találhatók, beleértve a mikrocirkulációs részeket is, és ezzel gyakran együtt járnak súlyos vérzési problémák, amelyek az esszenciális alvadási faktorok fogyasztás-ából adódnak, amelyek először aktiválódnak, majd inaktiválódnak a sokfelé elterjedt mikrocirkulációs fibrinrögök képződése során. A szétterjedő intravaszkuláris alvadásban a trombomodulinnak határozott előnyei vannak a hagyományos alvadásgátlókkal szemben. Szelektivitásuk miatt a jelen találmány szerinti trombomodulin származékok nem súlyosbítják a szétterjedő intravaszkuláris alvadással társult vérzési problémákat, mint a heparin és az orális alvadásgátlók, e helyett visszaszorítják vagy gátolják további mikrovaszkuláris fibrin lerakódások képződését. Az infúzióban beadott trombomodulin variánsok blokkolják a trombin pro-koaguláns és vérlemezke aktiváló aktivitását és felgyorsítják a C fehérje átalakulását aktíváit C fehérjére. Az igényelt dózis hasonló ahhoz, mint amelyet a kialakult mélyvénás trombózis-tüdőembólia kezelésben alkalmazunk. A kezelés addig folytatódik, amíg meghatározott intézkedéseket nem teszünk a DIC szindróma alapvető okainak kezelésére.

Bizonyítékok vannak arra nézve, hogy a hagyományos alvadásgátló gyógyszerek, különösen a warfarin, alkalmasak támadó rosszindulatú tumorok kezelésében. Sok tumorsejt termel olyan anyagokat, amelyek előidézik az alvadási rendszer aktiválását, ez pedig helyi fibrin lerakódást • · ·

eredményez. Ezek a fibrin lerakódások fészek-ként működnek, amelyekben a ráksejtek osztódhatnak, áttételes károsodásokat alakítva ki. Az egyik klinikai tanulmányban kimutatták, hogy azok a betegek, akik a tüdő kissejtes karcinómájának kezelésére alkalmazott rák kemoterápia mellett warfarint is kapnak, tovább élnek és sokkal kevésbé kiterjedtek az áttételes károsodások, mint azoknál a betegeknél, akik csak kemoterápiában részesültek. Az ebben a tanulmányban alkalmazott rák kemoterápia azonban kevésbé intenzív, mint amelyet ma a klinikai onkológiában optimálisnak tekintenek. A rák kemoterápia intenzív formái csaknem mindig kialakítanak egy éles letörést a beteg vérlemezke-számában, terápiával együtt kockázatnak teszi és a trombocitopenia a warfarin a beteget elfogadhatatlanul nagy ki a súlyos vérzési komplikációk szempontjából. A trombomodulin variánsok, mivel sokkal szelektívebbek, mint a hagyományos alvadásgátlók és nagyobb terápiás index-szel bírnak, viszonylag biztonságosan adhatók be a trombocitopéniás betegeknek; így lehetővé válik a támadó rákokban szenvedő betegek kezlése hatékony, intenzív kemoterápiával trombomodulin variánsokkal együtt. A támadó rákok kezelését trombomodulin variánsokkal egy adagolási menetrend követi, amely ahhoz hasonló, mint amelyet a mélyvénás trombózis-tüdőembólia betegségben alkalmazunk.

A jelen tárgyalás szempontjai szerint a találmány egy másik megközelítést is tartalmaz, eljárást trombotikus események kezelésére vagy megelőzésére olyan betegekben, akiknek erre szükségük van; az eljárás abból áll, hogy az említett betegnek gyógyászatilag hatékony mennyiségben valamely itt • · · · ismertetett trombomodulin származékot adunk.

A jelen találmány szerinti vegyületeket ismert módszerekkel szerelhetjük ki, hogy gyógyászatilag hasznos kompozíciókat állítsunk elő. Egy jelen találmány szerinti trombomodulin származékot keverékben egyesíthetünk valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval, hígítóval vagy kötőanyaggal. Megfelelő hordozók, hígítók vagy kötőanyagok és ezek kiszerelései, beleértve más emberi fehérjéket is, pl. humán szérum alkumint, le vannak írva pl. az alábbi irodalmi helyen: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás; kiadó: Mack Publishing Co., szerkesztők: Osol és munkatársai (1980); ez referenciaként épül be a jelen bejelentésbe. Az ilyen kompozíciók a trombomodulin származék gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazzák, megfelelő mennyiségű hordozóval, hordozókat elfogadható töltőanyaggal vagy hígítóval. Az ilyen azért alkalmazzuk, hogy gyógyászatilag kompozíciókat alakítsunk ki, amelyek a betegnek beadva hatékonyak. A trombomodulin származékokat beadhatjuk parenterálisan vagy más úton, amelyek jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, a lényeg az, hogy biztosítva legyen ezek bejuttatása a véráramba hatékony formában.

Az alábbi nem korlátozó jellegű példákat azért adjuk meg, hogy jobban illusztráljuk és írjuk le a találmányt. A találmány példái nem azért lettek leírva, hogy korlátozzák a találmány oltalmi körét. A reagensek forrásait csak kényelmi szempontokból adjuk meg, ezek a források sem korlátozó jellegűek az oltalmi kör szempontjából.

* * •·· ···« · « • ····· «· ·· ·· » «· ♦· ··

1. példa

A. Humán trombomodulin gént tartalmazó DNS szekvenciák izolálása és azonosítása

A trombomodulin gén a 20. kromoszómán van lokalizálva a humán genomban EWen D. és munkatársai; Biochemistry 26, 4350 (1987)J. Erről a génről leírták, hogy nem tartalmaz intronokat EJackman R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84 , 6425 (1987)J. Erre az információra alapozva egy Charon 21A lambda tágban hordozott humán 20. kromoszóma könyvtárat szerzünk be az American Type Culture Collection-tól (ATCC 57712; ID kód: LL20NS01; Rockville, Maryland 20852). E.coli C600 törzset Camely kereskedelmi forgalomban van, és a Stratagene cégtől (La Jolla, Kalifornia 92037) szerezhető be] növesztünk 0,60,8 optikai sűrűség értékre 600 nm-nél mérve, TY tápközegben E10 g Bacto tripton, 5 g Bacto élesztőkivonat, 10 g NaCl/liter (pH 7,4)2; 600 ^1 sejtet fertőzünk 50000 tággal. Összesen 600000 fágot (három kromoszóma ekvivalens) szélesztünk tizenkét 150 mm-es lemezre, amelyek mindegyike 75 ml TY agart tartalmaz (TY tápközeg + 15 g/1 Bacto agar). Hat óra múlva 37 °C hőmérsékleten jól formált tarfoltok alakulnak ki. A fágokat Colony/Plaque Screen szűrőkre (New England Nuclear, Boston, Massachussets) visszük át és előkészítjük hibridizáláshoz a szállító cég ajánlásai szerint.

Több különböző 50 bázisos oligomert tervezünk, amelyek a • * « · ♦ • · • · · · · · * · · publikált szarvasmarha trombomodulin DNS szekvencián alapulnak EJackman

R. és munkatársai: Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA) 83, 8834 mintákat radioaktív segítségével, olyan (1986)3, és ezeket a vizsgáló jelzéssel látjuk el T4 kináz technikákat alkalmazva, amelyek ismeretes azok számára, akik a szakterületen jártasak. A szűrőket először három vizsgáló minta keverékével hibridizáljuk ismert munkameneteket alkalmazva, és a pozitív jeleket úgy azonosítjuk, hogy a filmet 6 órán át -70 °C hőmérsékleten exponáljuk. Az eredeti vizsgáló mintákat ezekből a szűrőkből olyan módon távolítjuk el, hogy melegítjük a szűrőket O,lxSSPE-t és 0,1¾ SDS-t tartalmazó oldatban 10 percen át 75 °C hőmérsékleten. Az SSPE-ΐ (20x) ügy állítjuk elő, hogy 174 g NaCl-t, 27,6 g NaH₂P0₄.H₂0-t és 7,4 g EDTA-t feloldunk 800 ml H₂0-ban, majd a pH-t 7,4-re állítjuk be NaOH-val ( 6,5 ml 10 n oldat), és a térfogatot 1 literre állítjuk be. A szűrőket ezután filmen exponáljuk 24 órán át -70 °C hőmérsékleten, hogy megbizonyosodjunk arról: az összes eredeti vizsgáló minta keveréket eltávolítottuk. Ezeket a szűrőket azután újból hibridizáljuk egy másik, eltérő vizsgáló minta keverékkel. A második filmeket összehasonlítjuk az első készlettel, és csak azokat a tarfoltokat választjuk ki egy második átvizsgálási körre, amelyek mindkét vizsgáló minta készlettel hibridizáltak. Az átvizsgálás második köre során egy tarfoltról találjuk azt, hogy hibridizál egy olyan vizsgáló mintához, amely homológ a DNS szekvencia 5' végéhez, és hibridizál egy másik vizsgáló mintához, amely homológ a gén 3' végéhez. Ez a klón tartalmazza a teljes kódoló szekvenciát. Ezt a kiónt, a

GHTM3A-t tisztítjuk és alapként használjuk fel a további tanulmányokhoz.

B. A TM cDNS beiktatás izolálása GHTM3A-ból

Nagy mennyiségű tisztított fág DNS-t izolálunk, a lemezlizáló technikát alkalmazva Eez a Davis R.W, Botstein D. és Roth 0. R. által publikált eljárás módosított változata: A Manual fór Genetic Engineering, Advenced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, New York, New York (1980), 106. oldalJ. Tíz 150 mm-es lemezt, amelyen E.coli 0600 van növesztve, fertőzünk egyenként mintegy 10^, tarfoltról tisztított fággal. Az összefüggő lízist két óra múlva érjük el 37 °C hőmérsékleten. Mindegyik lemezt elárasztjuk 10 ml lambda hígító pufferral C10 mmól/1 trisz (pH 7,5), 10 mmól/1 MgSO^j és gyengéden rázatjuk 4 °C hőmérsékleten 1 éjszakán át. A puffért gondosan eltávolítjuk a következő reggelen és néhány csepp kloroformmal kezeljük, hogy lizáljuk a még megmaradt sejteket. A felülúszóból a fág részecskéket eltávolítjuk 20000 fordulat/perccel, 3 órán át, 18 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással, és az üledéket újra szuszpendáljuk 1 ml lambda hígító pufferral.

A fág részecskéket tovább tisztítjuk cézium-klorid gradienst alkalmazva. Az 1 ml fág-mintát lépcsőzetes gradiensre rétegezzük, amely az alábbi: 5 mól/1 CsCl, 10 mmól/1 MgSO^ 0,1 mmól/1 dinátrium-EDTA, 10 mmól/1 trisz (pH-8,0); és 3 mól/1 CsCl, 10 mmól/1 MgSO^, 0,1 mmól/1 dinátrium-EDTA, 10 mmól/liter Trisz (pH=8,0). 60 perc • · után 30000 fordulat/percnél (18 °C hőmérsékleten) egy halvány kék- csík, amely a fág-részecskéknek felel meg, látható a határfelületen.

Injekciós tűt alkalmazva a határfelületről 0,5 ml oldatot veszünk ki. A fág DNS-t kiemeljük a fehérje- burkolatból azonos térfogatú ionmentesített formamid hozzáadásával. 30 perc múlva szobahőmérsékleten az oldatot 0,5 ml vízzel hígítjuk, és két térfogat szobahőmérsékletű etanol hozzáadásával a DNS-t kicsapjuk. A DNS-t 10 percen át 10000 fordulat/perccel végzett centrifugálással összegyűjtjük; az üledéket 5 ml 68%-os etanollal -20 °C hőmérsékleten öblítjük, szárítjuk és újra szuszpendáljuk 500^4.1 TE-ben C10 mmól/1 Trisz (pH = 8,0), 1 mmól/1 EDTA3. Összesen 200-1000 ^g fág DNS-t nyerünk ki.

A humán genomikus DNS előzőleg a Charon 21A vektor HindlII helyére van beiktatva, így úgy lehet kinyerni, hogy a rekombináns kiónt HindlII-mal emésztjük. 50 JA g tisztított fág DNS-t emésztünk 200^1 mag (core) puffer térfogatban 50 egység HindlII-mal La puffer és az enzim a

Bethesda Research Laboratories 20877) termékej 90 percen át mintákat etanollal kicsapjuk, (Gaithersburg , Maryland °C hőmérsékleten. A majd elektroforézissel elkülönítjük 1%-os agaróz gélen, méret-markerként

HindlII-mal hasított lambda

DNS-sel (Bethesda Research

Laboratories) együtt.

A DNS-t etidium-bromidot alkalmazva tesszük láthatóvá és az egyes csíkok méretét a gélen történő vándorlásuk alapján számítjuk ki. A beiktatás méretét a GHTM3A-nálrJ 6,4 kb-nak becsüljük.

·« ··* · • ·· · · ·· • · · · · · · • · · ···· · · • ·«··· · · ·· · ·· · ·· ·· · ·

C. A GHTM3A fág zv 6,4 kb-s HindlII fragmentumának izolálása * őO^g, az 1 B. példában izolált GHTM3A fág DNS-t összekverünk 5/<l (/v50 egység) HindlII restrikciós enzimmel, 10/Λ.1 lOx HindlII rekció pufferrel C500 mmól/1 NaDl, 500 mmól/1 Trisz.HOl (pH 8,0), 100 mmól/1 MgC^J és 85/11 H20-val , és 37 °0 hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át. A HindlII-mal emésztett GHTM3A DNS-t azután elektroforézisnek vetjük alá 0,6%-os agaróz gélen, amíg a/v-6,4 kb-s HindlII fragmentum elkülönül a többi emésztési terméktől. A DNS csíkokat úgy tesszük láthatóvá, hogy először a gélt megfestjük híg etidiumbromid oldattal, majd a gélt ultraibolya fénnyel megvilágítjuk.

A gélnek nx6,4 kb-s HindlII területét kihasítjuk a gélből, zsugorcsomagoljuk, és -70 °C fragmentumot tartalmazó egy darab műanyag filmbe hőmérsékleten mintegy 10 percen át fagyasztjuk. A fagyasztott gélszeleteket azután gyengéden összepréseljük szobahőmérsékleten és a gélzagyot egy 1,5 ml-es centrifugacsőbe öntjük. Azonos térfogatú fenolt adunk hozzá és a keveréket élénken kevertetjük lefagyasztjuk

Vortex berendezésben, -70 °C hőmérsékleten.

majd ismét

A keveréket szobahőmérsékleten felengedtetjük és a vizes fázist

13000 xg-nél 10 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. A vizes fázist még egyszer extraháljuk fenollal, majd kétszer CHCl^-mal. 1/10 térfogat 3 mól/literes nátrium-acetát hozzáadása után a DNS-t 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk, -20 °C • · · · » • · « · · • · ···· • · · • · · · • · · • « · · · • · · *· ··

-	* 70
hőmérsékleten 20	percen	át	inkubáljuk, majd
centrifugáljuk.
Ezzel az eljárással	mintegy	10/19	zv- 6,4 kb-s HindlII
restrikciós fragmentumot	kapunk	A tisztított

fragmentumot újra szuszpendáljuk 10/(1 TE pufferban és 20 °C hőmérsékleten tároljuk.

D. A HindlII-mal emésztett pUC19 plazmid izolálása

Mintegy 10/tg pUC19 plazmidot Lamely a BoehringerMannheim-nél (Indianapolis, Indiana 46250) vagy a BRL-nél (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland 20760) szerezhető be] emésztünk HindlII-mal, amint az 1 C. példában leírtuk. A HindlII-mal emésztett pUC19 DNS-t az emésztett keverék fenollal, majd kloroformmal végzett extrahálásával, majd etanolos kicsapással extraháljuk, amint ezt az 1 C. példában leírtuk. A mintegy lO^g, HindlII-mal emésztett DNS-t újra szuszpendáljuk 10/11 TE pufferban, majd -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

E. A fragmentumok ligálása a pGHTM3A plazmid megalkotásához ycl, HindlII-mal emésztett pUC19 plazmid DNS-t, amelyet az 1 D. példa szerint állítottunk elő, és l/tl, <^-6,4 kbs HindlII fragmentumot, amelyet az 1 C. példa szerint izoláltunk, összekeverünk, majd inkubáljuk 1 m.1 lOx ligáz V pufferral E300 mmól/1 Trisz.HCl (pH 7,8); 10 mmól/1

MgClo; 100 mmól/1 ditiotreitol, és 1 mg/ml BSA • · ♦ · · ·♦ • ♦· · ·· • · · · · · · ··· ···· · · * ··«·· · · · · · ·· · ·· «· ·· (szarvasmarha szérum albumin)!, lyíl 10 mmól/1 ATP-vel, 1/tl T4 DNS ligázzal ( 10 egység) és 6^1 E^O-val, 16 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt plazmidot, a pGHTM3A plazmidot.

F. E.coli transzformálása pGHTM3A-val

E.coli K12 DH5dF' Eamely kereskedelmi forgalomban van, és a Bethesda Research Laboratories (BRL, Gaithersburg, Maryland 20877) termékei 50 ml-es tenyészetét növesztjük TY tápközegben /v0,2 0.0. 590 értékig. A tenyészetet jégen hűtjük 10 percen át, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket újra szuszpendáljuk 25 ml jéghideg 100 mmól/literes CaC^-ben, és jégen inkubáljuk 25 percen át. A sejteket újra üledékbe visszük centrifugálással, és az üledéket újra szuszpendáljuk 2,5 ml jéghideg 100 mmól/l-es CaC^-ben, és egy éjszakán át jégen inkubáljuk.

Ebből a sejtszuszpenzióból 200/tl-t összekeverünk az 1 E. példában elkészített, ligáit DNS-sel, és jégen inkubáljuk 20 percig. A keveréket azután 42 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 percen át, majd 10 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten. 3 ml TY tápközeget adunk a sejtkeverékhez, majd a sejteket levegőn rázó készüléken rázatjuk 37 °C hőmérsékleten 2 órán át.

A sejtkeverék alikvotjait TY-agar lemezekre (TY táp--közeg 15 g/1 agarral) szélesztjük, amelyek tartalmaznak még lOOj/ig/ml ampicillint is, és a lemezeket 37 °C • « · · hőmérsékleten inkubáljuk. Az E.coli K12 DH5oCF'/pGHTM3A transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével igazoljuk.

«···· · · ·· • » · · · · · • · · ··· · · · • ····· · β · · · ·· * ·· ·· ··

2. példa

E.coli K12 DH5/F'/pGHTM3A tenyésztése és a pGHTM3A plazmid izolálása

A. Az E.coli K12 DH5<áF '/pGHTM3A tenyésztése liter TY-tápközeget E10 g Bacto tripton, 5 g Bacto élesztőkivonat, 10 g NaCl (pH 7,5)3, amely 50 ^g/ml ampicillint is tartalmaz, beoltunk E.coli DH5oLF'/pGHTM3A tenyészettel és levegőn rázó készüléken inkubáljuk 37 °C

hőmérsékleten,	amíg az optikai sűrűség (0.0.) 590 nm-nél
eléri a 1	abszorbancia egységet; ekkor 150 mg
klóramfenikolt	adunk a tenyészethez. Az inkubálást

mintegy 16 órán át folytatjuk; a klóramfenikol hozzáadása gátolja a fehérjeszintézist és így gátolja a további sejtosztódást, de lehetővé teszi, hogy a plazmid replikáció tovább folytatódjék.

B. A pGHTM3A plazmid izolálása

A 2 A. példában előállított tenyészetet Sorvall GSA rotorban (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical

Division, Newtown, CN 06470) fordulat/percnél 5 percig 4 °C létrejött felülúszót eldobjuk, centrifugáljuk 600 hőmérsékleten. Az így és a sejtüledéket «· «··· ·*·· • · • · · • · *«· · • · · • · • · * · · ··· · « · • · · · · • · · · · r *

mossuk 50 ml TES pufferban C10 mmól/1 Trisz.HCl (pH = 7,5) ; 10. mmól/1 NaCl; és 1 mmól/1 EDTA3, majd újra üledékbe visszük. Miután újból eldobtuk a felülúszót, a sejtüledéket szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztjuk, majd felengedtetjük. A felengedtetett sejtüledéket újra szuszpendáljuk 10 ml 25¾ szacharóz/50 mmól/1 EDTA oldatban. Miután hozzáadtunk 1 ml 5 mg/ml lizozim oldatot, 3 ml 0,25 mól/1 EDTA-t (pH 8,0), és 100 ργΐ 10 mg/ml RN-áz A-t, és ezeket összekevertük, az oldatot jégen inkubáljuk 15 percig. 3 ml lizáló oldatot Eamely úgy készül, hogy összekeverünk 3 ml 10%-os Triton-X 100at, 75 ml 0,25 mól/1 EOTA-t (pH 8,0), 15 ml Trisz.HCl-t (pH 8,0), és 7 ml vizet! adunk a lizozimmal kezelt sejtekhez, összekeverjük, és az így létrejövő oldatot jégen inkubáljuk további 15 percen át. A lizált sejteket szárazjég-etanol fürdőben lefagyasztjuk, majd felengedtetjük.

A sejttörmeléket az oldatból 25000 fordulat/percnél 40 percen át SW27 rotorban (Beckman 7360 N. Lincoln Avenue, Lincolnwood, Illinois 60646) végzett centrifugálással távolítjuk el. Miután hozzáadtunk 30,44 g CsCl-t és 1 ml 5 mg/ml-es etidium-bromid oldatot, az oldat térfogatát 40 ml-re állítjuk be, ultracentrifuga csőbe és dekantáljuk egy Vti50 (Beckman). Miután a csövet leforrasztottuk, fordulat/percnél az oldatot Vti50 rotorban 42000 órán át centrifugáljuk. Az így létrejövő plazmid csíkot, amelyet ultraibolya fénnyel teszünk láthatóvá, izoláljuk, majd Ti75 csőbe és rotorba (Beckman) helyezzük, és centrifugáljuk 55000 fordulat/percnél 16 órán át. Bármilyen szükséges ·4*« · ·· ·9 ···· • » · Μ ♦ · ♦ ·«· «Α·· I · * ····« · · ·· · «·· · ·· ta ·· térfogat-kiegészítést olyan TES alkalmazásával végzünk, amely 0,761-.g/ml CsCl-t is tartalmaz. A plazmid csíkot ismét izoláljuk, az etidium-bromidot sóval telített izopropanollal extraháljuk, és TES pufferral 1:3 arányban hígítjuk. Két térfogat etanolt adunk ezután az oldathoz, ezt követi az inkubálás egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten. A plazmid DNS-t az oldat centrifugálásával üledékbe visszük, SS34 rotorban (Sorvall) 15 percen át 10000 fordulat/percnél.

Az ezzel az eljárással kapott λ/I mg pGHTM3A plazmid

DNS-t 1 trisz.HC1 ml TE pufferban szuszpendáljuk (pH=8,0) és 1 mmól/1 EDTA)3,

C10 mmól/1 és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

3. PÉLDA

A pUC18TM plazmid megalkotása

A. A pGHTM3A plazmid /vl,9 kb-s PpuMI restrikciós fragmentumának izolálása

A humán trombomodulin kódoló szekvenciájának izolálásához alkalmazott PpuMI helyek mindketten átfedik a dcm metiláz felismerő szekvenciát (5 '-CCTGG-3') . Ezen felismerő szekvencia belső citozin gyökének metílezése a DNS hasítás blokkolását eredményezi. Ez okból a pGHTM3A plazmidot az E.coli K12 GM48 törzsből szükséges izolálni. Az E.coli K12 GM48 törzset, amely citozin metilázban hiányos törzs, eredetileg 1983. november 23-án helyezték letétbe, és most is rendelkezésre áll a Budapesti *4 · 4 · · « · « *»ί

I» · 4 « «· • ♦ ··« 4 ·· *«·· ··4· V • 4444 szerződés feltételei szerint a Northern Régiónál Research

Laboratory .. (NRRL, Peoria, Illinois 61604) állandó törzsgyűjteményéből NRRL B-15725 számon.

Az E.coli K12 GM48 törzs előállítását a transzformáláshoz, valamint a pGHTM3A plazmiddal végzett transzformálást lényegében az 1F. példa eljárásával végezzük. A pGHTM3A plazmidot az E.coli K12 GM48/pGHTM3A transzformánsokból lényegében a 2 B. példa kitanításával összehangban izoláljuk.

20/tg pGHTM3A DNS-t, amelyet az E.coli K12 GM48/pGHTM3A transzformánsokból izolálunk, feloldjuk 10/tl lOxPpuMI reakciópufferban C500 mmól/1 NaCl; 100 mmól/1 Trisz.HCl (pH 7,4); 100 mmól/1 MgC^; 100 mmól/1 2-merkapto-etanol; 1 mg/ml szarvasmarha szérum albuminl, 10 /ti ( 15 egység) PpuMI restrikciós pufferban és 85/^1 vízben, és az így létrejövő reakciókeveréket szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk. A PpuMI-vel emésztett pGHTM3A plazmid DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük és a kívánt λ/1,9 kb-s PpuMI restrikciós fragmentumot izoláljuk és tisztítjuk, lényegében az 1. példa kitanítása szerint. A kapott 2 /lg fragmentumot feloldjuk 10/<1 TE pufferban és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

B. Az EcoRI-PstI kapcsoló megalkotása

A kapcsoló megalkotásában alkalmazott DNS fragmentumokat vagy a Systec 1450A QNA Synthesizer berendezést (Systec Inc., 3816 Chandler Drive, Minneapolis, Minnesota) , vagy ···· « Μ «····« » · · « « · · • · · « ·· · * · • ·«·»« · 4 ·*· ·· » ·« ··9 9

- 76 * ABS 380Α DNA Synthesizer berendezést (Applied Biosystems, Inc., B50 Lincoln Centre Drive, Foster City, Kalifornia 94404) alkalmazva szintetizáljuk. Sokféle DNS szintetizáló berendezés ismeretes a szakterületen és alkalmazható a kívánt fragmentumok előállítására. Ezen kívül a fragmentumokat hagyományosan is előállíthatjuk Itakura és munkatársai CScience 198, 1056 (1977)3, valamint Crea és munkatársai CProc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75, 5765 (1978)3 eljárásaival összhangban.

500-500 pikomólt kezelünk kinázzal a kapcsoló egyes egyedi szálaiból 20^/vtl reakciópufferban, amely tartalmaz 15 egység (^0,5 1) T4 polinukleotid kinázt, 2/(l lOxligáz puffért E300 mmól/1 Trisz.HCl (pH=7,8); 100 mmól/1 MgC^; 100 mmól/1 ditiotreitol; és 1 mg/ml BSA3, 10^1 500 mól/l-es ATP-t és 7,5^/K.l vizet. A kinázos reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk, és a reakciót 100 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett inkubálással állítjuk le. Abból a célból, hogy biztosítsuk a kinázos kezelés teljességét, a reakciókeveréket jégen hűtjük, 2 /ti 0,2 mól/l-es ditiotreitolt, 2,5j41 5 mmól/literes ATP-t és 15 egység T4 polinukleotid kinázt adunk hozzá, és a reakciókeveréket további 30 percen át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A reakciót további 10 perces, 100 °C hőmérsékletű inkubálással állítjuk le, majd jégen lehűtjük a reakciókeveréket.

Bár a kinázos kezelést külön-külön végezzük, a DNS kapcsoló két egyedi szálát összekeverjük a kinázos ♦ ··· ♦

« • · »4 ···· · »· ·· • ♦ · · · · e · · ··· · 9 • « ···» · · · • · t 9« *· reakció után. Abból a célból, hogy a szálakat összeforrasszuk, a kinázos reakciókeveréket 100 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percig 150 ml vizet tartalmazó vízfürdőben. Ez után az inkubálás után a vízfürdőt kikapcsoljuk ‘ és hagyjuk szobahőmérsékletre lehűlni; ez a művelet mintegy 3 órán át tart. A vízfürdőt, amely még tartalmazza a kinázzal kezelt DNS csövét, ezután 4 °C hőmérsékletű hűtőbe helyezzük egy éjszakára. Ez a munkamenet összeforrasztja az egyedi szálakat. A szintetikus kapcsoló szerkezete az alábbi:

Bell BsmI PstI

EcoRI PpuMI Bell

5'-AATTCTGATCATGCTTGGGGTCCTTGCATTCGTAATTAATTAATGATCACTGCA-3'

3'-GACTAGTACGAACCCCAGGAACGTAAGCATTAATTAATTACTAGTG-5'

A kapcsolót felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

C. Az EcoRI-gyel és Pstl-gyel emésztett pUC18 plazmid izolálása

Mintegy lO^ng pUC18 plazmid DNS-t (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana 46250; vagy BRL, Gaithersburg, Maryland 20760) feloldunk 10/(1 IOxEcoRI reakciópufferban E500 mmól/1 NaCl, 1 mól/1 Trisz.HC1 (pH=7,5)_r 50 mmól/1 MgC12, 1 mg/ml szarvasmarha szérum albuminj, 5/(1 (/-50 egység) EcoRI restrikciós enzimben és 85/(1 F^O-ban, és a reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. A reakciókeveréket 0,25 mól/1iteressé tesszük NaOAc-ra, ·««« · ·

4 · • · 444· ·· · ·4 ···· • e · e •44 4 ·· · 4 4· «4 44»4 majd két térfogat etanol hozzáadása és szárazjég-etanolos fürdőben való hűtés után a DNS-t centrifugálással üledékbe visszük.

A DNS üledéket feloldjuk 10/11 lOxPstl reakcipufferban Cl mól/1 NaCl, 100 mmól/1 Trisz.HC1 (pH 7,5), 100 mmól/1 MgC12, 1 mg/ml szarvasmarha szérum albuminj, 5^1 ( 50 egység) PstI restrikciós enzimben és 8 5^1 H20-ban, és a reakciókeveréket 2 órán át 37 °C hőmérsékleten tartjuk.

A Pstl-gyel végzett emésztés után a reakciókeveréket egyszer fenollal és egyszer CHClj-mal extraháljuk és az emésztett DNS-t kicsapjuk és üledékbe visszük, amint korábban leírtuk. A DNS üledéket, amely az EcoRI-gyel és Pstl-gyel emésztett pUC18 plazmidot alkotja, újra szuszpendáljuk 10 ^1 TE pufferban, és felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

D. A fragmentumok ligálása a pUC18TMlinker plazmid megalkotásához ljH.1, a 3 B. példa szerint előállított EcoRI-PstI kapcsolót és 1/(1, 3 C. példa szerint előállított, EcoRIgyel és Pstl-gyel emésztett pUC18 plazmidot összekeverünk, majd l/tl lOxligáz pufferral, 1^1 10 mmól/1 ATP-val, 1/(1 T4 DNS ligázzal ( 10 egység) és 7^1 H20-val inkubáljuk 16 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. A ligáit DNS alkotja a kívánt plazmidot, a pUC18TMlinker plazmidot. A plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 3. ábra mutatja be.

··«· « ·· ·· *··· • · · · · ·9

9 9 999 9 99 • · 9999 9 9 9 99 · ·· ····

Ε. A pUC18TMLlinker plazmid izolálása

A pUC18TMlinker plazmidot alkotó, 3 D. példa szerint előállított ligáit DNS-t E.coli K12 DH5jtF' sejtek transzformálására alkalmazzuk lényegében olyan módon, amint ezt az 1 F. példában leírtuk. Az E.coli K12 DH5v(F'/pUC18TMlinker transzf ormánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes analízisével igazoljuk. Egy egyedi

E.coli K12 DH5o(.F '/pUCTMlinker transzformánst tenyésztünk olyan módon, ahogyan ezt a 2 A. példában leírtuk és a pUC18TMlinker plazmid DNS-t ebből a tenyészetből a 2B. példában leírtak szerint izoláljuk.

F.APpuMI-vel emésztett pUCIBTMlinker plazmid izolálása

Mintegy 10/4 g pUC18TMlinker plazmid DNS-t emésztünk PpuMI restrikciós enzimmel lényegében olyan módon, ahogyan a 3 A. példában leírtuk. A fenolos extrakció és kloroformos extrakció után a PpuMI-vel emésztett DNS-t etanollal kicsapjuk, amint ez a 3 C. példában le van írva. A DNS üledéket, amely mintegy lO^g, PpuMI-vel emésztett pUC18TMlinker DNS-nek felel meg, újra szuszpendáljuk 10(/(1 TE pufferban, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk, amíg felhasználásra kerül.

• ♦ · · • · * · ··· · · · » · · • ····· · · ♦ · * • · * ·· ·· ♦ ♦

G. A fragmentumok ligálása a pUC18TM plazmid megalkotásához lyug, a 3 A. példa szerint előállított, «zl,9 kb-s PpuMI restrikciós fragmentumot összeke/erünk 1 g, a 3 F. példa szerint előállított, PpuMI-vel emésztett pUC18TMlinker DNS-sel, majd lényegében a 3 D. példában leírtak szerint ligáljuk ezeket.

A ligáit DNS alkotja a kívánt pUC18TM plazmidot. A plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 4. ábrán mutatjuk be. A pUC18TM plazmid E.coli K12 DH5<Z.F'-be transzformálva tárolható, ez a törzs a plazmid előnyös forrása. A plazmidot a törzsből hagyományos módon lehet izolálni; ez a törzs 1989. július 20-án lett deponálva és részét képezi az NRRL állandó törzsgyűjteményének. A törzs NRRL B-18524 számon szerezhető be.

H. A pUC18TM plazmid izolálása

A ligáit DNS-t, amely a pUC18TM plazmidot tartalmazza és amelyet a 3 G. példa szerint állítunk elő, E.coli K12 DH5<<F' sejtekbe transzformáljuk olyan módon, ahogyan az

1. példában leírtuk. Az E.coli K12 0H5c<F¹/pUC18TM transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. Egy egyedi K12 0H5oíF'/pUC18TM transzformánst tenyésztünk olyan módon, amint a 2 A. példában leírtuk, és ebből a tenyészetből a pUC18TM plazmid DNS-t a 2 B. példában leírtak szerint izoláljuk.

4. PÉLDA

A phdTMDl plazmid megalkotása ···· · · ·· ·· • ·· · · · 4 · a···· · · · · ·· · ·· «· · *

A. A BsmI-gyel emésztett pUC18TM plazmid izolálása

10/tg pUC18TM plazmidot, amelyet a 3 H. példában leírtak szerint állítunk elő és lOxBsml reakciópufferban Trisz.HC1 (pH 7,4), 100 merkapto-etanol, 1 mg/ml

10/11 BsmI-ben (^50 egység, H20-ban. A reakciókeveréket alatt inkubáljuk, egyszer kloroformmal extraháljuk és a leírtak szerint kicsapjuk.

izolálunk, Γ500 mmól/1 feloldunk 1O./<1 NaCl, 100 mmól/1 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 2szarvasmarha szérum albuminj, New England Biolabs) és 85/1 65 °C hőmérsékleten parrafinolaj fenollal DNS-t a és egyszer

C. példában

A BsmI-gyel emésztett pUC18TM vetjük alá 1%-os agaróz gélen kb-s fragmentumok világosan fragmentumot az 1 tisztítjuk.

DNS-t elektrofoTézisnek amíg a ^4,2 kb-s 03^0,46

A M,2 kb-s izoláljuk és elkülönülnek.

C. példa szerint

A8 /tg tisztított emésztett pUC18TM DNS-t 10^1 TE pufferban és -20 fragmentumot, amely újra a BsmI-gyel alkotja, újra szuszpendáljuk °C hőmérsékleten tároljuk.

B. A BsmI-gyel emésztett megalkotására pUClöTM ligálása a pUCIBTMDl

0,5^g, 4 A. példa szerint készített, BsmI-gyel emésztett • · pUC18TM DNS-t újból köralakúvá teszünk ligálással lényegében olyan módon, ahogyan ezt a 3 D. példában leírtuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt plazmidot, a pUC18TMDl plazmidot. A plazmid restrikciós hely- és működési térképét az 5. ábrában mutatjuk be.

C. A pUClöTMDl plazmid izolálása

A pUC18TMDl plazmidot alkotó ligáit DNS-t, amelyet a 4 B. példa szerint állítottunk elő, E.coli K12 DHSolF ’ sejtek transzformálására használjuk fel, amint ezt az 1. példában leírjuk. Az E.coli K12 DH5o(F'/pUC18TMDl transzformánsokat plazmid DNS-ük restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. Egy egyedi E.coli K12 DH5<áF '/pUC18TMDl transzformánst tenyésztünk, amint a 2 A.

példában leírtuk, és a pUC18TMDl plazmidot	ebből a példában
tenyészetből leírtuk.	izoláljuk,	amint ezt	a 2 B.
D. A pUC18TMDl	plazmid /v	1,5 kb-s	Bell restrikciós
fragmentumának	izolálása
Abból a célból, hogy a	DNS-t teljes	mértékben	emésszük

BclI-gyel, a felismerő szekvenciában a dezoxi-adenil gyöknek nem szabad metilezettnek lenni. Amikor plazmid DNS-t készítünk E.coliban a BclI-gyel végzett emésztéshez, olyan törzset szükséges használni, amely adenin-metilázban hiányos; ilyen pl. az E.coli K12 GM48 törzs (NRRL B-15725), amelyet korábban már leírtunk.

• · ·

Az E.coli K12 GM48-at transzformáláshoz előkészítjük, majd pUC18TMDl plazmiddal transzformáljuk, lényegében az 1. példa munkamenete szerint. A pUC18TMDl plazmid DNS-t az E.coli K12 GM48/pUC18TMDl transzformánsokkal lényegében a 2 B. példa kitanítása szerint izoláljuk.

50y<g, az E.coli K12 GM48/pUC18TMDl transzformánsokból izolált pUC18TMDl plazmid DNS-t feloldunk 10 /ti IOxBcII reakciópufferban (750 mmól/1 KC1; 60 mmól/1 Trisz.HCl (pH=7,4); 100 mmól/1 MgC^; 10 mmól/1 ditiotreitol; és 1 mg/ml BSAj, 5/ι 1 (^50 egység) Bell restrikciós enzimben, és 85/tl H20-ban, és az így létrejött reakciókeveréket 50 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. A BclI-gyel emésztett pUC18TMDl plazmid DNS-t 1%-os agaróz gélre terheljük, és a kívánt Az 1,5 kb-s Bell restrikciós fragmentumot izoláljuk és tisztítjuk, lényegében a 3 A. példa kitanítása szerint. A kapott 10 g fragmentumot feloldjuk 10/tl TE pufferban és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

E. A BclI-gyel emésztett phd plazmid izolálása

E.coli K12 GM48 törzset előkészítünk a transzformáláshoz, majd phd emlős kifejező plazmiddal transzformáljuk, lényegében az 1. példa munkamenete szerint. A phd plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 6. ábrában mutatjuk be. Az E.coli K12 GM48/phd törzset az NRRL-nél deponáltuk (1989. július 26.) és ez az NRRL B-18525 letéti számon áll rendelkezésre. A phd plazmid DNS-t E.coli K12 GM48/phd transzformánsokból izoláljuk, • « · · · * • «· · · · · · ····· · · · ·

Μ · · » · *

- 84 * lényegében az 1. példa kitanítása szerint.

50jutg phd plazmid DNS-t, amelyet.az E.coli K12 GM48/phd transzformánsokból izoláltunk, feloldunk 10^1 IOxBcII reakciópufferban C750 mmól/1 KC1; 60 mmól/1 Trisz.HCl (pH=7,4); 100 mmól/1 MgC12 10 mmól/1 ditiotreitol; és 1 mg/ml BSAj, 5/ti ( 50 egység) Bell restrikciós enzimben, és 85/tl H20-ban, és az így létrejött reakciókeverékét 50 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Fenollal végzett extrahálás, majd kloroformmal végzett extrahálás után az emésztett

DNS-t etanollal kicsapjuk, amint ezt a 3 C.

példában leírjuk. Az üledéket, amely a BclI-gyel emésztett phd plazmidot tartalmazza, újra szuszpendáljuk 10/41 TE pufferban, és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

F. Bell fragmentumok ligálása megalkotásához a phdTMDl plazmid l/tg, 4 D. példa szerint előállított, 1,5 kb-s Bell fragmentumot összekeverünk 0,5/( g, 4 E. példa szerint előállított, BclI-gyel emésztett phd plazmiddal, és ligáljuk lényegében olyan módon, amint ezt a 3 D. példában leírtuk. A ligáit DNS alkotja a phdTMDl plazmidot. A plazmid restrikciós hely- és működési térképét a 7. ábra mutatja be.

G. A phdTMDl plazmid izolálása

A 4 F. példa szerint előállított, a phdTMDl-et alkotó ligáit DNS-t E.coli K12 DH5«CF' sejtek transzformálására ·♦ « ··*·* * • ·« ♦ · · ύ ·' · • ····· · · . · ν ·· · 4 4 . . 4« *

használjuk fel, amint ezt az 1. példában leírjuk. Az E.coli K12 DH5<AF ¹ /phdTMDl transzformánsokat plazmid DNSük restrikciós enzimes elemzésével igazoljuk. Azok a transzformánsok, amelyek az 1,5 kb-s Bell beiktatás korrekt orientációját tartalmazzák, l/tg plazmid DNS BglII-vel végzett emésztése után az alábbi restrikciós fragmentumokat termelik: ru4,6 kb; az 2,6 kb; 1,6 kb; és a/1,4 kb. Az emésztés 37 °C hőmérsékleten 1 órán át történik az alábbi oldatban: 100 mmól/1 NaCl, 50 mmól/1 Trisz.HCl (pH 8,0), 10 mmól/1 MgC^. A fragmentumokat IV os agaróz gélen végzett elektroforézissel és etidiumbromidos festéssel azonosítjuk az 1. példában leírt módon.

Egy egyedi, a korrekt E.coli K12 DH5«X-F'/phdTMDl transzformánst TY tápközegben tenyésztünk, amint ezt a 2

A. példában leírtuk. A tenyészetből plazmid DNS-t izolálunk, amint ezt a 2 B. példában leírtuk. Abból a célból, hogy a CsCl nyomnyi maradványait eltávolítsuk, ^vl mg izolált phdTMDl plazmidot újra szuszpendálunk 10 ml TE pufferral, és etanollal kétszer kicsapjuk a 3 C. példa szerint. A DNS üledéket, amely a phdTMDl plazmidot alkotja, újra szuszpendáljuk 1 ml TE pufferban és -20 °C hőmérsékleten tároljuk.

5. PÉLDA

Az AV12/phdTMDl és 293/phdTMDl transzformánsok megalkotása

Az alábbi munkamenet leírja az AV12/phdTMDl és 293/phdTMDl transzformánsok munkamenet amelyeket között a alkalmazható kívül a olyan sejtvonalakra, előnyös sejtvonalak megadott megalkotását. Ezen.

általában alkalmazható korábban felsoroltunk az jelen leírásban. Az eukarióta gazdasejtekhez transzformációs eljárások jól ismertek a szakterületen. Lásd pl: Wigler és

Acad. Sci. (USA) 76., 1373; és

Virology 52, 456 (1973).

munkatársai: Proc. Natl. Graham és munkatársai:

A. A sejtek előállítása

Humán 293 sejtek (293 sejtek) és szíriai hörcsög AV12664 sejtek (AV12 sejtek) tenyészeteit, amelyek az American Type Culture Collection-tól szerezhetünk be ATCC CRL 1573 illetve CRL 9595 deponálási számon, átoltjuk egy nappal a transzformálás előtt és 1,2.10^ sejt/100 mm szövettenyésztő lemez sűrűséggel szélesztjük olyan növesztő tápközegen, amely Dulbecco által módosított Eagle-féle tápközeget (DMEM; Gibco Laboratories Life Technologies, Inc., 3175 Stanley Road, Grand Island, New York 14072) tartalmaz, ahol ez a tápközeg 10¾ (térfogat/térfogat) borjúembrió szérumot (FCS; Hyclone Laboratories, 1725 South State Hwy 89-91, Logan, Utah 84321) és 50jng/ml gentamicint (Gibco Laboratories Life Technologies, Grand Island, New York 14072) is tartalmaz. A tápközeget 4 órával a transzformálás előtt helyettesítjük.

B. A DNS előállítása

10-20/(g phdTMDl plazmid DNS-t adunk 62,5./11 2 mól/1 CaC12-höz és.437,5/(1 H₂0-hoz. 0,5 ml DNS-t adunk azután cseppenként 0,5 ml 2xHeBS-hez E10 g/1 HEPES (pH=7,5); 16 g/1 NaCl; 0,74 g/1 KC1; 0,25 g/1 Na₂P0₄; és 2 g/1 glükóz], ilyen módon csapadékot képezve. A keveréket szobahőmérsékleten 30-40 percig állni hagyjuk, majd hozzáadjuk a sejtekhez. Egy hosszabb inkubálási idő durvább csapadékot eredményezhet, amely nem transzformálódik jól, de néha hosszabb inkubálási idő szükséges, hogy csapadék képződjék.

C. A sejtek transzformálása

Az 5 B példa szerint előállított 1 ml DNS oldatot 293 vagy AV12 sejteket tartalmazó 100 mm-es lemezekhez adjuk gyengéd kevertetés közben, és 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-4 órán át. Gondosan ügyelve arra, hogy a sejtek ne váljanak le, a sejteket kétszer mossuk az 5 A. példában leírt növesztő tápközeggel, majd a lemezeket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük vissza. Mivel a phdTMDl plazmid szelektálható markert tartalmaz higromicin B rezisztenciára, a stabil transzformánsokat úgy választjuk ki, hogy a transzformálás után 72 órával 200/tg/ml higromicin B-t adunk a növesztő tápközeghez. A sejteket 2-3 hétig hagyjuk szaporodni olyan módon, hogy a tápközeget 2 naponként cseréljük. Ezután egyedi higromicin rezisztens transzformánsokat izolálunk a további szaporításhoz és elemzéshez.

···· · ♦ ·· · • · « · · · * ··· ···« » · • ····· ·· · · · ·· · ·· ·· ··

6. PÉLDA

A. A kifejezett trombomodulin származékok vizsgálata

A vad típusú trombomodulin 1:1 sztöchiometrikus arányú, nagy affinitású komplexet képez trombinnal az endoteliális sejtfelületen. Ez a komplex képes gyorsan átalakítani a C fehérje zimogént aktivált C fehérjévé fiziológiás kalcium-koncentráció mellett. Trombomodulin távollétében a C fehérje trombin-függő aktiválását a fiziológiás kalcium koncentráció erősen gátolja, ez ezerszeresnél is nagyobb arányban lassítja a reakciósebességet a trombomodulin: trombin komplexhez viszonyítva.

A találmány szerinti, 293 vagy AV12 sejtekhez transzformált vektorok termelt, kifejezett aktivitására vonatkozó által kondicionált tápközegben oldható humán trombomodulin mérések a trombomodulin: trombin komplex fentebb említett tulajdonságait mutatják a trombinhoz viszonyítva. Ezt a vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük.

Amikor az oldható trombomodulin aktivitásra vizsgálunk, stabil 293 vagy AV12/phdTMDl transzformánsokat szaporítunk 24 üreges szövettenyésztő edényben növesztő tápközegben (amelyet az 5 A. példában írtunk le). Amikor az üregek több, mint 80%-ban összefolynak, a növesztő tápközeget eltávolítjuk, a sejt egy_-réteget (monolayer) kétszer mossuk Hank féle kiegyensúlyozott sóoldattal ···· · ·« ·· ···· • · · · · · · • · · ··· 4 · · • »··«· ·· ·· · (Hanks Balanced Salt Solution; Gibco Laboratories Life

Technologies, Inc., Grand Island, New York 14072), és 1 ml 3:1 arányú szérummentes tápközeget adunk hozzá. Ez a szérummentes tápközeg 3 rész Dulbecco által módosított

Eagles tápközeget (DMEM) és 1 rész F12 tápközeget tartalmaz (mindkettő Gibco Laboratories Life Technologies, Inc.), kiegészítve 10“θ mól/1 szelénnel, 5.105 mól/1 etanol-aminnal, 1 g/ml K vitaminnal (mindhárom a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri 63178, terméke), 2,4 g/1 NaHCO^-mal, l^g/ml transzferrinnel (Miles Scientific, Naperville, Illinois 60566), 2.10^-2 mól/1 HEPES-sel (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri 63178), 1 /c.g/ml inzulinnal és l^g/ml tobramicinnel (Éli Lilly and Co., Indianapolis, Indiana

46285; Sigma

Egy éjszakán

Chemical Co., St. Louis, Missouri 63178). át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a kondicionált szérummentes tápközeget eltávolítjuk és 13000xg-nél centrifugáljuk, hogy eltávolítsuk a sejttörmeléket és részecskéket.

Az egyes mintákból 10-10^1 kondicionált tápközeget adunk 100/tl vizsgáló pufferhez E0,02 mól/1 Trisz (pH=7,4), 0,1 mól /1 NaCl, 3,0 mmól/1 CaC^H 96 üreges lemezeken. Az egyes mintákhoz 50^1 50,/lg/ml-es humán C fehérje zimogén oldatot adunk Cez Grinnell B. és munkatársai eljárása szerint készíthető: Biotechnology 5_, 1189 (1987)] vizsgáló pufferban, majd 20/\l szarvasmarha trombint adunk hozzá, amelynek koncentrációja 2 NIH egység/ml. A szarvasmarha trombin az Enzyme Research Laboratories (300 N. Michigan St., South Bend, Indiana 46601) terméke. A ··· « • «·« ··· · β ·· · • · · · ·«· « * · • ·· · ·· ·· ·· mintákat ezután forgó lemezen inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 30 percig. Abból a célból, hogy a trombin szerin-proteáz aktivitását blokkoljuk, 20/<l hirudint (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri 63178) adunk hozzá vizsgáló pufferben (a hirudin koncentrációja 50 antitrombin egység/ml), és a mintákat további 5 percen át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. 4 mmól/l-es S-2366 kromogén szubsztrátum (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) vizsgáló pufferrel készített oldatát (25/fl) adjuk hozzá és leolvasást végzünk optikai sűrűségre 405 nm-nél, UVmax automatikus lemez-leolvasót alkalmazva (Molecular Devices Corp., Palo Alto, Kalifornia 94394).

Mivel az S-2366 szubsztrátum fajlagosságot mutat az aktíváit C fehérjére, az O.D. 405 mm-nél a mintában levő aktíváit C trombomodulin aktíváit C fehérje mennyiségével arányosan nő. A aktivitást a kondicionált tápközegben /Kg fehérje/ml/perc egységekben mérhetjük, összehasonlítva olyan minták O.D. leolvasási értékeivel, amelyek frissen készített aktivált rekombináns humán C fehérje standard görbéjéhez készültek. Egy másik eljárás szerint a trombomodulin koncentráció a mintákban /4 g/ml egységekben határozható meg olyan standard görbével összehasonlítva, amely tisztított, detergenssel szolubilizált nyúl trombomodulinból készült.

···· ·

7. PÉLDA

Humán trombomodulin oldható származékainak tisztítása

A. Kondicionált szérummentes tápközeg klón-szaporítása és összegyűjtése

A 6. példában leírt trombomodulin vizsgálatot alkalmazva 293 vagy AV12/phdTM01 transzformánsokról úgy találjuk,

hogy oldható kondicionált

trombomodulin aktivitást választ ki a szérummentes tápközegbe, amelynek

komponenseit a 6 A. példában írtuk le. A trombomodulin kifejeződésének szintjét 0,2-2,5^g/ml tartományban találjuk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten végzett kondicionálás után.

Mind a 293, mind az AV12/phdTMDl transzformánsokat, amelyek rv 2,0 ^g/ml, jelen találmány szerinti oldható humán trombomodulin származékot fejeznek ki, addig szaporítjuk, amíg összefolyó egy-rétegeket kapunk 10 gördülő palackban ( 850 cm ). Ebben a stádiumban a növesztő tápközeget gördülő palackonként 100 ml 3:1 arányú szérummentes tápközeggel helyettesítjük és a tenyészeteket visszahelyezzük 37 °C hőmérsékletre 24 órára. Ezt a kezdeti 100 ml kondicionált tápközeget azután eldobjuk és 100 ml friss, szérum-mentes tápközeggel helyettesítjük. Ezután minden 24 órában összegyűjtjük a szérummentes kondicionált tápközeget. A 10 gördülő palackból összegyűjtött kondicionált tápközeget C-χζΙ liter) 13000xg-nél 30 percig centrifugáljuk 4 °C hőmérsékleten, dekantáljuk és -20 °C «···· ·· ·« · ··· • · · · » · * « · · ·«· · · · • ···«,« · * ·· · • · · ·· ·· · · ·

- 92 ‘ hőmérsékleten tároljuk. Általában 8-10 gyűjteményt, amely összesen 8-10 liter szérummentes kondicionált tápközeget nyújt, készítünk, mielőtt a tenyészeteket eldobnánk túlnövekedés miatt. A kondicionált tápközeget hagyjuk lehűlni 4 °C hőmérsékletre, majd centrifugáljuk 13000xgnél 30 percig 4 °C hőmérsékleten, majd az alább leírt tisztítási munkamenetnek vetjük alá.

B. Gyors áramlású (fast-flow) Q Sepharose anioncserélő kromatográfia

Fast-Flow Q-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology Inc. P.O. Box 1327, Piscataway, New Jersey) oszlopot alkalmazunk kiindulási lépésként a jelen találmány szerinti oldható humán trombomodulinok tisztításában. Az oszlopot (1,6x20 cm) elő-egyensúlyozzuk 20 térfogat olyan oldattal, amely 0,1 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH 7,4), 0,1 mmól/1 EDTA-t és 0,02% (tömeg/térfogat) NaNj-at tartalmaz, 2,0 ml/perc sebességgel. Ezután 2 liter szérummentes kondicionált tápközeget viszünk fel 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át 2 ml/perc sebességgel. Az oszlopot azután 10 oszloptérfogat kiegyensúlyozó pufferral mossuk. A trombomodulin aktivitást az oszlopról 60-100 ml térfogatban nyerjük ki lépésenként! elucióval olyan oldat segítségével, amely 1 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 trisz.HCl-tfpH 7,4), 0,1 mmól/1 EDTA-t és 0,02% (tömeg/térfogat) NaN^-at tartalmaz.

*··« · φπ 44 ·»·· φ φ · fr f φ » • a r ··« · « 4

4 4C.44 4 4 4 4 · »4 4 »4 44 Φ ·

C. Az oldható rekombináns trombomodulin affinitáskromatográfiája ml Affigel-10 affinitás gél mátrixot (származékba vitt, kereszt-kötött agaróz N-hidroxi-szukcinimid észtere; BioRad, Richmond, Kalifornia 94804) mosunk 200 ml jéghideg desztillált F^O-val. Ebből a gélből 10 ml-hez 25 ml szarvasmarha trombin oldatot adunk, ennek koncentrációja 2 mg/ml 50 mmól/liter HEPES-ben (pH 7,6) (a szarvasmarha trombin az Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana 46601, terméke ). A trombint hagyjuk kapcsolódni a gél-mátrixszal gyengéd keverés közben 4 °C hőmérsékleten 4 órán át. A kapcsolási hatékonyság, amit az felülúszó O.D.-jével mérünk 280 nm-nél a gél kiülepedése után, tipikusan mintegy 95¾. Az affinitásmátrixon levő további nem reagált helyeket blokkoljuk olyan módon, hogy 1,0 ml 1 mólos glicint (pH 8,0) adunk hozzá és inkubáljuk egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A gél tízszeres kimosása után 50 ml HEPES-ben (pH 7,6) abból a célból, hogy eltávolítsuk a maradék nem kötött trombint, az affinitás mátrixot 50 mmól/1 diizopropilfluor-foszfáttal kezeljük 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A mátrix kezelése ilyen módon gátolja a kötött trombin szerin proteáz aktivitását anélkül, hogy elpusztítanánk a rekombináns trombomodulin kötési képességét.

A diizopropil-foszforotrombin affinitás oszlopot azután erőteljesen mossuk, hogy eltávolítsuk a fölösleges diizopropil-fluor-foszfátot, és kiegyensúlyozzuk ♦ · ·· < «· · * ···· « · « » · · · • · ·» ··· * t · • · ···· * · · · ♦ ·· * ·· ·β ·· *

0,02 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH 7,4), 1,0 mmól/1 CaCl^-t és 0,02¾ (tömeg/térf ogat) NaNj-at tartalmazó oldattal, 4 °C hőmérsékleten, 2 ml/perc áramlási sebességnél.

A 7 B. példa szerint készített Fást Flow Q-Sepharose eluátumot koncentráljuk és ultraszűréssel sómentesítjük, olyan oldatot alkalmazva, amely 0,02 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 trisz.HCl-t (pH 7,4), 0,001 mól/1 CaC12~t és 0,02¾ (tömeg/térfogat) NaN^-at tartalmaz. Ezt a sómentesített mintát, amely mintegy 70 mg fehérjét tartalmaz 40 ml pufferban, diizopropil-foszforotrombin affinitás oszlopra visszük fel 0,5 kötött anyagot visszacsatlakozó segítségével. Ezen tarthatjuk fenn az °C hőmérsékleten, áramlási felvisszük az és perisztaltikus sebességnél. A nem oszlopra szivattyú áramlását ml/perc újból hurok a módon a minta folyamatos affinitás oszlopra egy éjszakán át 4 így elérhetjük a rekombináns trombomodulin maximális kötését az affinitás oszlophoz.

Az oszlopot mossuk és lépésenként!

ezután 10 térfogat kiegyensúlyozó pufferral a kötött rekombináns trombomodulint eluálásnak vetjük alá olyan oldattal, amely mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH 7,4), 0,0001 mól/1 EDTA-t és 0,02¾ (tömeg/térfogat) NaN-j-at tartalmaz, így 30-50 ml eluátumot kapunk. Ezt a diizopropilfoszforotrombin affinitással tisztított oldható trombomodulint azután 1-2 ml-re koncentráljuk (10-20 mg/ml) ultraszűréssel.

• ·· ·· • 4 · · · · 9

-44 ··· ♦ · · • ···«· ·· 4 · ♦ •β 4 ·· ·· ·» *

D. Méretkizárásos kromatográfia

A 7 C. példában előállított, affinitással tisztított humán trombomodulin származékokat méretkizárásos kromatográfiának vetjük alá, Superose-6 HR 10/30 oszlopot alkalmazva (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.

Piscataway, New Jersey 08855). Az oszlopot egy éjszakán át egyensúlyozzuk mozgó fázisú pufferral C50 mmól/1 Na2P0^ (pH=7,5), 0,1 mól/1 NaCl, 0,1¾ (tömeg/térfogat)

NaNj, 0,05¾ (térfogat/térfogat) Tween-203 0,1 ml/perc áramlási sebességnél. A 7 C. példa szerint előállított, affinitással tisztított koncentrált trombomodulint 200 /tl-es alikvotokbon az oszlopra visszük (3-6 tisztító futtatás). Az oszlopot mozgó fázisú pufferral eluáljuk 0,5 ml/perc áramlási sebességnél. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk és ezeket megvizsgáljuk trombomodulin aktivitásra, amint ezt a 6 A. ábrában leírjuk.

Az oldható rekombináns trombomodulin aktivitás többsége 090¾) a 25. frakciótól (12,5 ml) a 40. frakcióig (20 ml) eluálódik erről az oszlopról, és szétválasztható két nagyobb fő csúcsba molekulatömegük alapján. Következésképpen az oldható rekombináns trombomodulin két gyűjteményét készítjük el. Az 1. gyűjtemény a nagyobb molekulatömegű fajtát tartalmazza(retenciós idő ^15 ml), és ez * a 25.-33. frakciókból eluálódik, a 2. gyűjtemény viszont a kisebb molekulatömegű fajtát tartalmazza (retenciós idő ^17 ml), és ez a 34.-40. frakciókban eluálódik.

»··· · ·· ·· ···· • · · · · · · « * · ♦·· · i · • · *··· · · · · · «4« · ·· ·· «4

E. Az oldható trombomodulin származékok anioncserélő kromatográfiája

A trombomodulin származékok mind nagy molekulatömegű, mind kis molekulatömegű formáit tovább tisztítjuk anioncserélő kromatográfiával Mono-Q HR 5/5 oszlopon (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey 08855). Az oszlopot mindkét esetben 0,02 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH 7,8), 0,001 mól/1 EDTA-t és 0,02¾ NaNj-at tartalmazó oldattal egyensúlyozzuk ki.

Az oldható trombomodulin származék nagy molekulatömegű formáját tartalmazó, 7 D. példa szerint előállított 1. gyűjteményt Mono-Q oszlopra visszük fel 1 ml/perc áramlási sebességnél. A trombomodulin aktivitásnak több, mint 95Va az oszlophoz kötődik és eluálható egy 20 ml-es lineáris gradienssel 0,02-2 mól/1 NaCl között, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH 7,8), 0,0001 mól/1 EDTA-t és 0,02¾ (tömeg/térfogat) NaNj-at tartalmazó oldatban.

A rekombináns trombomodulin aktivitás éles csíkja eluálódik 6 ml térfogatban az 1 és 1,6 mól/1 NaCl között. Ez az anyag alkotja a humán trombomodulin származék nagy molekulatömegű formáját, amelynek tulajdonságait később írjuk le.

A 7 D. példa szerint előállított 2. gyűjteményt, amely az oldható humán trombomodulin származékok kis molekulatömegű formáját tartalmazza, Mono-Q oszlopra ··«· · *· 99 ···· • · · « · 9 «

9 9 ··· 9 · · • · »··· · V · · · ·♦ · ·« «« visszük fel és eluáljuk erről olyan módon, amint ezt az 1· gyűjteménynél leírtuk. Ebben az esetben a trombomodulin aktivitás éles csíkja 2 ml térfogatban eluálódik a 0,45 és 0,65 mól/1 NaCl koncentáció között. Ez az anyag alkotja a humán trombomodulin származék kis molekulatömegű formáját, amelynek tulajdonságait később írjuk le.

A fentebb és munkameneteket a 7 B.-7 D. példákban leírt tisztítási alkalmazva mintegy 1-1 mg-ot tudunk izolálni a rekombináns trombomodulin mindkét formájából 2 liter szérummentes kondicionált tápközegből kiindulva, amely akár AV12/phdTMDl, akár 293/phdTMDl transzformánsokból készült. A kapott anyag tisztasága általában 95%-nál nagyobb.

8. PÉLDA

Az oldható rekombináns humán trombomodulin működési jellemzői

A. A Michaelis állandó (K_m) és a disszociációs állandó (Kj) meghatározása

A vad típusú, detergenssel szolubilizált humán trombomodulin nagy affinitású, 1:1 sztöchiometrikus komplexet képez trombinnal, mintegy 0,4 nmól/1 disszociációs konstanssal CSuzuki K. és munkatársai: 0. Biochem. 104, 628 (1988)]. A tisztított humán trombomodulin származékok, amelyeket a 7. példában leírtak szerint állítottunk elő, disszociációs állandóját ···· · ·· ···· • · · · · · 9 • · · ··· *» · · * · «··· 9 9 9 · 9 ·· · 99 ·* 99 az alábbiak szerint határozzuk meg.

A kis és nagy molekulatömegű rekombináns trombomodulin származékokat, akár 293, akár AV12 transzformánsokból vannak tisztítva, 500 ng/ml koncentrációra hígítjuk 0,1 mól/1 NaCl-t, 0,02 mól/1 Trisz.HCl-t (pH=7,5) és 3 mmól/1 CaC12~t tartalmazó pufferban (A puffer). Ezután az egyes mintákból 20-20 /(.1-t összekeverünk 96-üreges lemezeken 100/tl A pufferral és 50/(l/ml C fehérje oldat 50^1-ével (lásd Grinell B. fentebb idézett munkáját). 10 /ti szarvasmarha trombint (Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana 46601) adunk azután az A pufferban kialakított sorozathígításokból, hogy 100 és 0,05 nmól/1 trombin koncentrációtartományt fogjunk át.

A reakciókeverékeket azután 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 10 percig forgó lemezen. Az inkubálás után hirudin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri 63178) négyszeres mólfeleslegét (20 /11 térfogatban) adjuk az egyes üregekhez. Az A puffért, C fehérjét és trombint tartalmazó kontroll üregeket ugyanolyan módon kezeljük. Szobahőmérsékleten további 5 percen át végzett inkubálás után S2366 kromogén szubsztrátum (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) 4 mmól/ literes, A pufferben képzett oldatából 25 ml-t adunk -hozzá, és 405 nm-nél meghatározzuk az 0D értéket 2 perces inkubálási periódus után, kinetikus mikrolemez leolvasót (UVmax, Molecular Devices Corp., Polo Alto, Kalifornia 94394) alkalmazva.

A trombomoidulint tartalmazó üregekben az 0^405 nm • · • · · • · ·444 ·» · ·· *· ··«· V · · ·· ·*· · 44

4 4 44 ·· 44·· leolvasásokat a háttér-értékkel korrigáljuk, kivonva a trombin kontroll üregekben kapott OD4Q5 _nm leolvasásokat. Az alkalmazott körülmények között az így kapott OD4Q5 _nfn leolvasások arányosak a trombomodulin: trombin komplex által kialakított aktivált C fehérje mennyiségével. Az aktivált C fehérje mennyisége ennek megfelelően frissen készített számítható sebességét aktivált C fehérje standard görbéjéből ki. Ennek segítségével a C fehérje aktiválás (A,g aktivált C fehérje percenként) úgy határozhatjuk meg, mint a trombin-koncentráció függvényét. Az adatokat azután nem lineáris regressziós analízissel állíthatjuk össze, kereskedelmi forgalomban levő programot alkalmazva (Enzfitter, Elsevier-Biosoft, Cambridge, Egyesült Királyság) a Michaelis-Menten típusú kinetika szerint. Ez az adatelemzés a trombomodulin K_m értékének becslését adja trombinra és a V_max értéket telített trombin koncentrációnál adja meg.

A K(j érték meghatározásához a szabad trombin és a trombomodulinhoz kötött trombin mennyiségét az egyes koncentrációknál meghatározzuk. A definíció szerint V_max körülmények között a trombinnal komplexbe vitt trombomodulin aránya 100%. Lineáris kapcsolatot tételezve fel a trombomodulin: trombin komplex koncentrációja és a C fehérje aktiválás sebessége között, a szabad és kötött trombin mennyiségét az egyes trombin koncentrációknál meghatározhatjuk. A leírt körülmények között az alkalmazott trombomodulin koncentrációja 0,75 nm Ea vad típusú trombomodulinra 74000 dalton molekulatömeget feltételezve; lásd Suzuki és munkatársai: 3. Biochem. 140, 628 (1988)3. így egy adott trombin koncentrációnál:

• · · • · · · · · •·· ·»·· · · • ·>··· · · · * ·· · · · ·· ··

CTrombin3_kQ^Q^^ “V7V_max x 0,75 és

CTrombin3_szabad=CTrombin3_telj_es - CTrombin3_kötött ahol V jelentése a C fehérje aktiválás sebessége egy adott trombin koncentrációnál és Vmax jelentése a C fehérje aktiválás maximális sebessége.

Az ezen az úton kapott adatokat függvényben ábrázoljuk, a CTrombin3_kQ^-_d^t függvényeként a CTrombin3_szabac|-dal szemben, egy-ligandumos kötőhely nem-lineáris regressziós analízist (Enzfitter, fentebb idézett munka) alkalmazva, így kapjuk meg a disszociációs állandót (K^).

A 293 és AV12 transzformánsokból tisztított nagy- és kis molekulatömegű trombomodulin származékok ilyen módszerrel meghatározott K_d értékeit a 2. táblázatban foglaljuk össze.

B. A trombomodulin: trombin komplex K_m értékének meghatározása C fehérjére

A C fehérje trombomodulin: trombin komplexszel való aktiválásának sebességéről kimutatták, hogy függ a C fehérje koncentrációjától. A vad típusú humán trombomodulin: trombin komplex K_m értékét C fehérje mintegy 0,7 mól/l-nek határozták meg CSuzuki K. és • « · · • ·

- 101 * -

munkatársai:	J.	Biochem	140,	628	(1988)3. A
trombomodulin:		trombin	komplex		Km értékének
meghatározását	C	fehérjére	az egyes.	, 7.	példa eljárása
szerint tisztított származékoknál	az	alábbi módon

végezzük.

Oldható trombomodulin származékokat hígítunk és összekeverjük A pufferral, amint ezt a 8 A. példában leírjuk, azzal a kivétellel, hogy a C fehérje koncentrációját 70 és 0,07 mól/1 között változtatjuk_y míg a trombin koncentrációját állandóan tartjuk 2,2 nmól/liternél. A kontroll üregek A puffért, trombint és változó C fehérje koncentrációkat tartalmaznak. 10 perces, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás és a trombin gátlása után négyszeres mólfelesleg hirudin hozzáadásával, a C fehérje aktiválás sebességét S-2366 kromogén alkalmazásával meghatározzuk, amint ezt a 8 A. ábrában leírtuk. A trombomodulint tartalmazó üregekben az ^0D405 _nm leolvasásokat korrigáljuk olyan módon, hogy kivonjuk belőlük a C fehérje kontroll üregekben levő 0°405 _nm leolvasásokat. A kapott adatokhoz nem lineáris regressziós analízist alkalmazunk, a 8 A. példában leírt Enzfitter programm segítségével. A rekombináns trombomodulin: trombin komplex ezzel az eljárással kapott K_m értékeit C fehérjére a 2. táblázatban foglaljuk össze.

D. A Ca^·*· optimum meghatározása a trombomodulin származékokhoz

A vad típusú trombomodulin Ca^⁴· szempontjából telíthető • *

*

- 102 kinetikát mutat 1-5 mmól/1 optimummal EEsmon N.L. és munkatársai:. 0. Bioi. Chem. 259, 12246 (1984)3. A trombomodulin származékok Ca^^4- függőségét olyan módon határozzuk meg, hogy a vizsgálati pufferek Ca^⁴koncentrációját változtatjuk. Ezeknél a kísérleteknél a trombomodulin származékokat, C fehérjét és trombint olyan

A pufferben hígítjuk megfelelő koncentrációra, amely 5 mmól/1 és 0,025 mmól/1 közti tartományban tartalmaz

CaC12-t, és ezeket az keverjük össze, amint ezt trombomodulin származékokat nmól/1 és a C fehérjét alkalmazzuk. 10 perces, aktiválás és a trombin alkotórészeket hirudinos lényegében úgy a 8 A. példában leírtuk. A 0,75 nmól/1, a trombint 2,2 1,4 mól/1 koncentrációnál °C hőmérsékleten végzett gátlása után 405 nm-nél

0D leolvasásokat végzünk, amint ezt a 8 A. példában leírtuk. Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy a C komplexszel aktiválása fehérje aktiválása trombomodulin: trombin Ca2⁺-függő, míg a C fehérje spontán csak trombinnal növekszik csökkenő Ca^^4- koncentrációval. Ez okból kontroll reakciókat kell végeznünk trombomodulin távollétében, hogy pontos kontrollt biztosítsunk a trombinnal végzett, trombomodulintól független C fehérje aktiváláshoz. Az ilyen reakciókból kapott OD4Q5 _nm leolvasásokat kivonjuk a trombomodulin-tartalmú reakcióknál kapott adatokból az adatok elemzése előtt.

Amikor az ilyen adatokat függvényben ábrázoljuk, mint a C fehérje aktiválás sebességét a reakciókeverék Ca^⁴ koncentrációjával szemben, jelentős különbségeket • ·

figyelhetünk meg a nagy és kis molekulatömegű humán trombomodulin származékok között. Az akár 293, akár AV12 transzformánsokból tisztított humán molekulatömegű formáinál a Ca²⁺ Michaelis típusú telítést mutat trombomodulin nagy függőség tipikus 1-5 mmól/1 Ca²⁺ koncentrációnál levő optimális értékekkel C fehérje aktiválásra. Ez az érték megközelítőleg a normál fiziológiás Ca²⁺ koncentrációknak felel meg. Az akár 293, akár AV12 transzformánsokból - tisztított kis molekulatömegű formáknál a C fehérje aktiválás sebessége két alakú. Különösen drámái növekedés figyelhető meg 200500 mól/1 koncentrációig, amelyet progresszív gátlás követ nagyobb Ca²⁺ koncentrációknál.

Az optimális Ca²⁺ koncentrációkat a különböző tisztított rekombináns trombomodulin származékoknál a 2. táblázatban mutatjuk be.

t

- 104* HUMÁN REKOMBINÁNS TROMBOMODULIN SZÁRMAZÉKOK KINETIKAI TULAJDONSÁGAI + + ro ό CD -H

CJ CD 'CD •H p <-1 -H 'ro c Ε ω •H CJ +» c □. o O

CD P

CD í

		ι—1	ι—1
		ι—4	<—1
		Ό	Ό
r~H	I—1	ε	Ε
ι—1	r—1	X
Ό	Ό	ο	Ο
ε	ε	ο	Ο
ε	ε	m I	m I
m	ιη	1 α	1 ο
I	|	ο	ο
ι—4	r—4	04	04

00	ΟΙ	χο	m
ο	γ—1	Ο	ο
Ο	Ο	Ο	ο
+ 1	+ 1	+ 1	+1
<±	ΟΙ	χο	00
Γ-	Ο	Γ*	Γ**
•	•	•	•
ο	ι—1	ο	ο

σχ	σχ
ι—4	»—I	«—1	<±
•	•	•	«
Ο	ο	γ—|	γ—4
+ I	+ 1	+ 1	+ 1
σχ	χο	χο	m
σχ	XŰ	•	•
•	•	ιη	XŰ
04	04	ι—1	ι—4

	OJ
rx	r—1	m
σχ	>	σχ
οι	<c	04

CD	CD
	CD	ω	CD	CD
	E	E	ro	ro
03	:o	:o	E	E
+->	4-»	:o	:o
	ro	ro	4->	4->
'CÜ	ι—1	r—'1	ro	ro
E	D	D	1—1	r—1
t ,	JZ	JC	D	D
1—1	(D	ro	LC	Js:
O	r-H	r—1	ro	CD
«Μ	O	o	<—1	<—1
	E	E	o	o
X			E	£
	>>	>>
h—	CD	CD	CD	CD
	ro	ro	•rH	•H
c	z:	z:

D. A humán plazma alvadási idők elnyújtása

Többféle standardizált klinikai alvadásvizsgálat áll rendelkezésre az alvadási faktor hiányosságoknak és a keringő alvadásgátlók szintjének értékelésére. A rekombináns trombomodulin származékokat alvadásgátló aktivitásra két alvadási vizsgálattal vizsgáljuk: az aktíváit részleges tromboplasztin idővel CAPTT, lásd Koepke Ü.E.: Am. 0. Clin. Pathol. 63, 990 (1975)3, és a trombin alvadási idővel CTCT, lásd Koepke J. A. Am. J. Clin. Pathol. 68, 191 (1977)3. Az APTT vizsgálat mennyiségileg vizsgálja aktiválását, és azt a méri, amely az Va és a C fehérje alvadásgátlási út csökkentett alvadási aktivitást Villa kofaktorok proteolitikus bomlásának következményeként lép fel; ezt az aktivált C fehérje idézi elő. A trombin alvadási idő (TCT) normális még a C fehérje alvadásgátlási út teljes aktiválásával is. A TCT elnyújtása inkább a trombin elő-alvadási aktivitásának gátlását tükrözi, amelyet a trombomodulin és az itt leírt trombomodulin származékok idéznek elő. Az ezekhez a tanulmányokhoz alkalmazott humán plazmát atraumatikus véna-punkturával gyűjtjük össze, és úgy készítjük elő, hogy 9 rész teljes vért összekeverünk 1 térfogat 0,11 mól/literes nátrium-citráttal, ezt centrifugálás követi

2000 xg-nél percen át. A felülúszó plazmát felhasználásig jégen tároljuk.

Elvégezzük mind az APTT, mind a TCT vizsgálatokat automatizált alvadásidő-mérőt és eldobható műanyag küvettakat alkalmazva (mindkettő az American Labor,

Largo, Florida 33543, terméke). Az APTT vizsgálatban való ····· ·· ·· ·♦·· • · · · · » · • · · ··· · I · • ····· ·· · · · ·· e · ♦ · ·* felhasználáshoz 50 jjl plazmát vagy adott koncentrációjú (1-5 /tg/ml) rekombináns trombomodulin származékot tartalmazó plazmát összekeverünk 50^1, aktinnal aktíváit cefaloplasztin reagenssel (Baxter Healthcare Corp., McGaw Park, Illinois 60085) 3 percig 37 °C hőmérsékleten.

1 0,02 mól/literes CaC12~t adunk hozzá ezután, és meghatározzuk az alvadási időt. Az APTT vizsgálat eredményeit mind az AV12, mind a 293 sejtekből tisztított, nagy- és kis molekulatömegű trombomodulin származékoknál a 3.

táblázatban foglaljuk. össze.

A TCT vizsgálatnál 50 /ti plazmát vagy rekombináns trombomodulin származékot tartalmazó plazmát összekeverünk 100 /11, 0,05 mól/literes imidazol pufferral (pH 7,3) és 37 °C hőmérsékleten 120 másodpercig inkubálunk. Az alvadást 50 Λ1 trombin (Parke-Davis, Detroit, Michigan) hozzáadásával indítjuk be. A trombint frissen hígítjuk desztillált vízben, és olyan koncentrációban alkalmazzuk, amely mintegy 20 másodperces alvadási idők kialakítására alkalmas. A TCT vizsgálatok eredményeit különböző humán trombomodulin származékoknál a 4. táblázatban foglaljuk össze.

Azok, akik a szakterületen jártasak, a 3. és 4.

táblázatokban mind a 293, bemutatott eredményekből láthatják, hogy mind az AV12 transzformánsokból származó rekombináns trombomodulin mind nagy, mind kis molekulatömegű formái jelentős alvadásgátló aktivitással bírnak. Mind az APTT vizsgálatban, amely a C fehérje alvadásgátló útjának aktiválását tükrözi, mind a TCT • · ·· · ♦ · · • « « · · · · ··· ··· · · · ····· · · · · · •· · · · · ν «·

- 107 * vizsgálatban, amely a trombin pro-alvadási aktivitásának közvetlen gátlását tükrözi, a rekombináns trombomodulin nagy molekulatömegű formájáról úgy találjuk, hogy hatékonyabb alvadásgátló, mint a kis molekulatömegű forma. Különösen meglepő a nagy molekulatömegű forma hatása a trombin alvadási időre, amely valójában meghaladja azt, amely természetes forrásokból tisztított nyúl trombomodulinnal elérhető. A nagy molekulatömegű rekombináns trombomodulin koncentrációi 5_l/cg/ml fölött (APTT vizsgálat) illetve 3 /fg/ml fölött (TCT vizsgálat) a végtelenségig elnyújtják az alvadási időt (vagyis egyáltalán nem figyelhető meg rög képződése).

• ·· ·

- 108 -

3k	Xű CM + 1 σχ	r-i CN + 1 σχ	σχ CD + 1 co	co o
	r-H E cd o
+ 1 XO	i—1 o
	•	fa	o		FA	JD
ω		σχ	r*^			-P
¢-1						ω

tisztított humán trombomodulin származékok hatása a humán plazma aktivált részleges tromboplasztin idejére (APTT)**

ω	K	XO	o	r^	CM	VH
'CO	r-H			•	•		2C
E	E	rH	rH	CD	CD
	CT	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1
»O	q.						•P
XI		rH		CD	LA		tn
•rH	CD		•	•	•		«ω
	•		σχ	xo	P-		P
•rd	CM	XO	ιΑ	fa	FA		«ω
(Π							P
*co							r-H
Ό							CD
CO
>;	<	r-	co	<r	xo		n
r-H	<—1		•	•	•		P
c	E	1------1	o	CD	CD		co
							xj
	cn	+ 1	+ 1	+ 1	+ 1		c
							co
		Γ-		σχ	XO		-P
	o	•	•	•	•		tn
	•	fa	LA	LA	LA
	rH	LA	<±	FA	FA		co
							+ 1
		CM	LA	CD	<fr		-P
		•	•	•	•		o
3K	r—1	CD	r-H	O		CD
	rH						co
	£	+ f	+ 1	+ f	+ 1		í—í
							4-»
	cn	<±	FA	CD	FA		«co
			•	•	•
		γα	CM	FA	CM		N
	o	ía	fa	FA	FA		ra
							-P
						ω	c
						cn	•rH
	rH					«ω	E
	CO					cn
	c					Ή	·>
	o					>.	ω
	>					C	JD
	-P					c
	•Π					ω	x.
	ω					E	D
	cn						rí
						CD	-P
	<o	CM		CM		P	ra
	r-H	rH	FA	r-1	FA	c	•P
	ω	>	OX	>	σχ	•rH	D
	s	<c	CM	<r	CM	E	E
	P
	ω					•P	>Λ
	1—					-P	CD
						o	'D
						XJ
						co	P
							ω
						N
		CD	CD			O	o
		ω	ω	CD	CD	x:	XJ
		E	E	ω	CD	«co	•rH
		:o	:o	E	E	E
		-P	-P	:o	:O	NI	•rH
		CO	co	•P	-P	ro	cn
	co	r-H	rH	co	CO	r-H	«ra
	•r-J	Z3	□	rH	r-H	Q.	X3
	«CO	X	_x	3			ra
	E	ω	ω	X	.X	C	>
	P	r-H	r—1	CD	ω	«co	T—1
	o	o	o	rH	r-H	E	ra
	«Η	E	E	o	o	ZD
				E	E	JZ	N
		>x	>ϊ				<r
	>—	CD	CD	cn	ω	<c
		CO	CO	•H	•r-I
	<r	z	Z		ÍZ		*

- .109 tisztított humán trombomodulin származékok hatása a humán plazma trombin alvadási

*	σχ	<	CM	«5Τ
	i—4	•	•	•	•
	E	CM	r—|	f—l	i-4
	a	4 1	+ 1	+ 1	4 1
	<	r-	rx		O
	o	•	•	•	•
		\ű	CO	<4	σχ	i-4
CJ	rA	00	ΙΛ	CM	CM	IO
P						_a
ω						4-3
CL						ω
TD	9K	co	CM		CM	r—4
o	í—1	•	•	•	•	H
tn	E	f-4	f-4	O	o	'CD
'CO	\					cn
E	CB	4 1	4 1	+ 1	+ 1	Ή
		CM	CM		CM
»O	O	•	•	•	•	Γ-Λ
TO	•	O	<4	Γ-Λ
rd	CM		rx	CM	CM	-P
						tn
•r4						Ό
tn
'05	3K		XŰ		<±	Ό
Ό	i—1	•	•	•	•	4-5
ro	E	o	o	o	Q	i-4
>	—.					a)
r—1	CT	+ 1	+ 1	+ 1	4 1
<C						Ό
		MD		co	Γ-Λ	P
	O	•	•	•	•	ro
	•	ΙΛ		o	f-4	u
	i—4	CM	CM	CM	CM	c
						ro
		CO	Ox	σχ	xo	4->
		•	•	•	•	cn
	3K	o	o	o	O
	ι—1					4 1
	E	+ 1	4 1	+ 1	4 1
						•P
	CD	Γ-	OX	σχ	O	O
	q.		•	•	•	O)
		OX	OX	σχ	o	ro
	o	r—1	r—1	r-4	CM	f-4
						4-»
						'CÖ
						N
						ro

CD4-»

CDC 'CD·<—I

r-4	ω	E
ro					*r—1
c					>.	**
o					c.	aj
>					c.	JD
4->					aj
•n					E
CD						CT
cn					CO	•o
					-P	-P
o					c	CD
i-4					•H	-P
ω	CM		CM		ε	3
E	í—1		i—1			E
P	>	σ\	>	σχ	4->
CD	<r	CM	<c	CM	•P	>>
π-					O	CD
						'3
					CO	+3
					N	ω
					□
	CD	CD			η	<o
	ω	aj	CD	CD	'CD	TJ
	E	E	aj	aj	E	•r-1
	:o	:o	E	E	N
	4->	-P	:o	:o	CO	•i-4
	co	co	4->	+->	í—1	cn
ω	í—I	1—1	co	co	CL	Ό5
•Γη	CT	CT	1—I	r—1		XJ
*ro	-X	jc:	CT	CT	C	ro
E=	aj	aj		.X.	'CO	>
Q	r—1	í—1	aj	ω	E	r-4
O	O	o	<—1	<—1	CT	ro
q-j	E	E	o	o	x:
			E	E		N
ZE		>>			<	<r
1—	CD	CD	cn	cn
	CD	CO	Ή	♦r-		3K
c	Z	z	l«í		JK

• ·· * ·· ·· • V ♦ · • ·« · · • · · ·· ·· • · ···· ·· ·

E. A trombin-függő vérlemezke-aktíválás gátlása

A vad típusú trombomodulinról kimutatták, hogy gátolja a trombin-függő vérlemezke-aktiválást,. amint ezt a trombinnal indukált vérlemezke szerotonin kibocsátás gátlásával mérték CEsmon N.L. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 258, 12238 (1983); Maruyama L. és munkatársai: J. Clin. Invest. 75, 987 (1985)3. A különböző tisztított humán trombomodulin származékok befolyását a vérlemezkékből való trombin-indukált szerotonin kibocsátásra az alábbiak szerint határozzuk meg.

Teljes vért gyűjtünk a 8 0. példában leírtak szerint, és vérlemezkékben dús plazmát állítunk elő 1000 xg-nél 3 percen át végzett centrifugálással. A vérlemezkékben dús plazmát összekeverjük azonos térfogat módosított Tangenféle pufferral E0,145 mól/1 NaCl, 0,05 mól/1 KC1, 0,05 mmól/1 CaC12, 0,1 mmól/1 MgC12, 0>0055 mól/1 glükóz, 0,015 mól/1 HEPES (pH 7,4) és 1 mg/ml szarvasmarha szérum albumin3, és a vérlemezkéket 900 xg-nél 10 percen át végzett centrifugálással üledékbe visszük. A vérlemezkéket gyengéden újra szuszpendáljuk Tangen-féle pufferral a plazma eredeti térfogatának 1/5-ére és lassan kiegyensúlyozzuk 37 °C hőmérsékleten. A vérlemezkeszuszpenziót 0,1 ^MCi/ml ^-^C-5-hidroxi-triptaminnal (Amersham inkubáljuk radioaktív

Corp., Arlington Heights, Illinois 60005) 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. A fölösleges jelzést mosással távolítjuk el, a vérlemezke szuszpenziót háromszor mosva Tangen-féle pufferral.

• ·· · 4 ·« ·· ··· · • · » · · · « « * · ··* · · · • ····· 4 · ·· · ·♦ · ·· ·· ··

A végül kapott vérlemezke-üledéket gyengéden újra szuszpendáljuk az eredeti plazmatérfogatra Tangen-féle pufferral, és felhasználásig szobahőmérsékleten tartjuk.

A végső szuszpenzió 5.10® vérlemezkét tartalmaz milliliterenként, amint ezt hemocitométerrel mérjük.

A 14g__szerotonin kibocsátás mérésére 0,5 ml vérlemezke szuszpenziót előmelegítünk 37 °C hőmérsékleten 5 percig állandó kevertetés mellett. Ezután trombint adunk hozzá 1 nmól/1 koncentrációban és az inkubálást folytatjuk további 3 percig. Ezután 0,1 ml-es alikvotokat veszünk és összekeverjük ezeket 0,9 ml jéghideg stop pufferral L0,05 mól/1 nátrium-foszfát (pH=7,4), 0,2% (térfogat/térfogat) glutáraldehid és 0,005 mól/1 EDTA3. 30 percen át 8000 xg-nél végzett centrifugálás után 0,5 ml-es alikvotot veszünk ki és összekeverjük 9 ml Aquasol szcintillációs koktéllel (New England Nuclear, Boston, Massachussets 02118), és a l^C-t megszámoljuk Beckman LS3801 Scintillation Counter számlálóberendezést alkalmazva. A teljes számot úgy határozzuk meg, hogy 0,1 ml vérlemezke-szuszpenziót összekeverünk 0,9 ml stop pufferral, alkalmazzuk és ezen keverék 0,9 ml-es alikvotját a szcintillációs számláláshoz. A háttér kibocsátott számait úgy határozzuk meg, hogy a vérlemezke-szuszpenziót 3 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk trombin távollétében.

A '•^C-szerotonin-kibocsátást az alábbi képletet alkalmazva határozzuk meg:

···· · ί· ·· • · · · · · · • ♦ · ··· · · · • · ►·«· · · · · · ·· « ·· ·· ·· % kibocsátás = (^bocsátott .szám-háttér) (teljes szám-háttér) x 100

A ¹⁴-szerotonin kibocsátásból kapott adatokat, 1 nmól/1 trombin jelenlétében, összekeverve humán trombomodulin származékok különböző koncentrációival, az 5. táblázatban foglaljuk össze. Az adatok világosan jelzik, hogy a trombomodulin származékoknak mind nagy, mind kis molekulatömegű formái hatékonyak a vérlemezkék aktiválásának megakadályozására, amint ez a szerotonin kibocsátásból molekulatömegű tekintetben.

tükröződik. Ezek közül forma különösen hatékony A nagy molekulatömegű a nagy ebben a formáról következetesen azt találjuk, hogy hatékonyabban gátolja a trombin-függő vérlemezke-aktiválást, mint a nyűi trombomodulin. Ez az eredmény váratlan, mivel a humán méhlepényből készített TM harmincszor kevésbé hatékony ebben a tekintetben Clásd Maruyama és munkatársai: 3. Clin. Invest. 75., 987 (1985)3.

< Μ

CD ω «« Η 'CÜ cn υ ο X) •Η

C Ή

C Ο +> ο ρ

QJ Ν ω ι CD ρ »ο rH Χ2 ΧΟ Dd •JÉ «φ

-X Ό Ν c cd •η ε ι ω

C Ω •ιΗ Ρ χ> -ω ε > ο

Ρ c •Ρ '{0 ε

C0 3 χ: ra tn

Ό ρ π C •X □

'(D

Ν

CQ ε

Ρ ‘Φ

Ν <η □ ο ο ε ο XJ ε ο Ρ +»

C 'C0 ε □ χ:

<

ω ΌΟ •Ρ	Ό	ΓΗ Ό
Ό)	•ιΗ	Ε
ω	ω	C
ο	'TO
ο	ρ
Χ3	•Ρ	Ο
•ró	C	οι
	QJ
C	ω C
•r—1	ο
C
ο -Ρ	(Ζ
ο	•rd
Ρ	Ω
ω	Ζ)
Ν	τζ>	ι—1
ω	ο
ι	Ε	r-l
ω	ο	Ό
t	XD	Ε
Η	ε	C
ο\β	ο
	ρ	Ο
Μ	Ω	ι-Η

»□	ΟΙ	ΟΙ	cn
rd	rH	ΚΧ	rH	rx	'CÜ
ω	>	σχ	>	σχ	-H
Ε	<	CM	<	CXJ	xo
ρ					cn
ω					o
Ω					o
					_O
					•rH
					Zü	c
					c	CD
					•rl	-P
	CD	CD			C	CD
	OJ	ω	CD	CD	o	rd
	Ε	Ε	CD	CD	P	zz
	:ο	:ο	ε	ε	o	'CD
	-Ρ	-Ρ	:θ	:o	p	cn
	ro	ro	Ρ	-P	CD	p
ro	I”1	ω	ro	ro	N	'CD
•η	3	2	rH	rd	cn	E
Ό	Λί		ZJ	ZJ		»o
Ε	CD	α>	_kí	dz	CD	xz
(-1	f—1	Ω	CD	CD	st
Ο	ο	Ο	rH	rd	ι—1	CD
«Η	Ε	ε	o	O		o
			ε	ε	o\®
Σ	>>	>>				Ω
Ω	CD	CD	ω	cn	<z	rx
	ro	ro	rd	•rH
<Τ	ζ			X>í	*

• •V* · ·♦ ·<· 999· < « 4 V 4 · « · · ·*4 · 4 ♦ « · »·♦» · 4 44 <

·· « ·· 44 ··

114

F. A trombin-indukált vérlemezke-aggregálódás gátlása

A vad típusú, detergenssel szolubilizált trombomodulinról kimutatták, hogy gátolja a trombin-indukált vérlemezkeaktiválást, amint ezt a trombin-indukált vérlemezkeaggregáció gátlásával mérik EEsmon N.L. és munkatársai: 0. Bioi. Chem. 258, 12238-12242 (1983)1. A jelen találmány szerinti humán trombomodulin származékoknak azt a képességét, hogy gátolják a vérlemezke-aggregációt, az alábbi módon értékeljük vérlemezkében dús humán plazmában.

térfogat frissen vett emberi vért összekeverünk 1 térfogat 3,8%-os (tömeg/térfogat) nátrium-citráttal és 100 xg-nél centrifugáljuk 25 percen át, hogy vérlemezkékben dús humán plazmát kapjunk. Készítünk vérlemezkékben szegény plazma-mintát is olyan módon, hogy teljes vért centrifugálunk 2000 xg-nél 15 percen át. Az aggregálódási kereskedelmi aggregometer útmutatásai Laboratories, tanulmányokat úgy végezzük, hogy forgalomban levő aggregometert és küvettákat használunk a gyártó cég szerint (Helena Monitor IV, Helena

Beaumont, Texas). Az egyes kísérleteknél háttér-abszorbancia korrekciót alkalmazunk a plazma miatt, ezt úgy végezzük el, hogy 0,5 ml vérlemezkékben szegény plazma 0,5 ml-es mintáját aggregometer küvettába helyezzük, és ezzel állítjuk 0-ra a készüléket. Ezután 0,5 ml vérlemezkékben dús plazmát helyezünk a készülékbe és 37 °C hőmérsékletre állítjuk be folytonos keverés mellett. Ezután trombint adunk hozzá 2 nmól/1 ···· ·«·· koncentrációban és a vérlemezke aggregálódást automatikusan követjük, mint az abszorbancia csökkenését az idő függvényében (amikor ugyanis a vérlemezkék aggregálódnak, kevesebb fény szóródik szét, és a vérlemezkékben dús plazma abszorbanciája csökken). Tipikus maximális vérlemezke aggregációt figyelünk meg a trombin hozzáadásától számított 30. és 60. másodperc között. Amikor akár a kis molekulatömegű, akár a nagy molekulatömegű trombomodulin származékokat (mind a .293, mind az AV12 transzformánsokból) előre összekeverjük trombinnal 50:1 trombomodulin: trombin arányban, a vérlemezke aggregálódási válasz teljes gátlása figyelhető meg. Rekombináns trombomodulin hozzáadása az aggregometer küvettához a trombin hozzáadása után azt eredményezi, hogy az aggregációs válasz gátlása csökken, és közel maximális aggregálódás lép fel, ha a trombin hozzáadása után több, mint 20 másodperccel adjuk a trombomodulint.

G. A molekulatömeg becslése elektroforetikus tulajdonságokkal

A vad típusú trombomodulin a nátrium-dodeci1-szulfátpoliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) rendellenes viselkedést mutat. A fehérje molekulatömege 74-84 kD közti molekulatartományban van a diszulfid kötés redukciója előtt és 88-110 kD közti tartományban van a diszulfid kötés redukciója után CEsmon N.L. és munkatársai: 0. Bioi. Chem. 257, 859 (1981); Suzuki K. és munkatársai: ű. Biochem. 104, 628 (1988)J.

···« · ·· ·« ·*·· • · · · · · · • · · ··· · · * • · ···· · « « · · ·· · «· »4 ··

- 116 A 7. példában leírtak szerint tisztított különböző humán trombomodulin származékok molekulatömegét SDS-PAGE-val határozzuk meg, mind körülmények között. Az 15%-os gradiens-géllel redukáló, mind nem-redukáló elektroforézist ultravékony 10hajtjuk végre, kereskedelmi forgalomban kapható automatikus elektroforetikus rendszert alkalmazva (Phast System, Pharmacia LKB, Uppsala, Svédország) a gyártók útmutatása szerint.

Molekulatömeg-standardokat és a fehérje standardokat (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornia 94804) festünk meg a Phast system ezüstfestési eljárást alkalmazva a gyártó cél útmutatása szerint. Tipikusan 0,2-1,0/kg szükséges az egyes rekombináns trombomodulin származékokból, hogy jó festési láthatóságot érjünk el.

A rekombináns trombomodulin származékok molekulatömegét a standard fehérjék molekulatömegeinek foltjaihoz viszonyítva határozzuk meg, vizsgálva a gélen vándorló fehérjék távolságait. Az ezzel az eljárással kapott értékeket a 6. táblázatban foglaljuk össze.

·· ·

··· «v ···· • · · • · · • · · ·· ··

- 117’ -

σ\

SD rKO KO

I rH KO

KD I

OO

LA rekombináns trombomodulin származékok molekulatömeg-meghatározása

Cü c o > •P ω cn

ω e ρ ω

LA OS r*r— r*ΓΙΑA r-r—

CM	CM
ι—1	IA	rH	rA
>	OS	>	os
«í	CM	<	CM

cn	cn
	0)	ω	cn	CD
	e	E	Q)	ω
	:o	:o	E	E
	tó	tó	:o	:o
	CD	co	tó	tó
co	<tó	r—11	ro	CD
•n	Σ3	Ώ	ι—1	rtó
'CD		X	3	Z5
ε	ω	ω
P	ító	tó	ω	ω
□	o	o	r—1	1—1
tó	E	E	o	o
			E	E
X	>s	>,
tó	cn	CD	Φ	cn
	CD	CD	tó	•»H
<r	Z	Z	isi

- 118 * -

9. PÉLDA

A. Az oldható trombomodulin-származékok kondroitináz ABC kezelése

A 293 sejtekből tisztított oldható trombomodulin származékokból 200^1-t (75/jg/ml) inkubálunk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten, kondroitináz ABC-vel (50 milli-egység, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) és a nélkül, olyan oldatban, amely 100 mmól/1 NaCl-t, 50 mmól/1 Trisz.HCl-t és 30 mól/1 nátrium-acetátot (pH=8,0) tartalmaz, továbbá 2,5 mmól/1 1,10-fenantrolin , 10_vA(g/ml pepsztatin és 20ug/ml leupeptin jelenlétében.

B. A kondoitinázzal kezelt trombomodulin-származékok trombin alvadási ideje

A 9 A.

példa kondroitinázzal kezelt származékait használjuk fel a humán fibrinogén hatásának meghatározására a trombin alvadási idejére. Az alvadási reakciókeverék 3 mg/ml humán fibrinogént tartalmaz olyan oldatban, amely 150 mmól/1 NaCl-t, 20 mmól/1 Trisz.HCl-t és 3 mmól/1 CaCl₂-t (pH 7,4) tartalmaz, és a reakció hőmérséklete 37 °C. Az alvadási időt 16 nmól/1 trombin hozzáadása után mérjük. A 9 A. példa kondroitinázzal kezelt trombomodulin származékát 10 nmól/1 koncentrációban adjuk hozzá. Ennek a tanulmánynak az eredményeit a 7. táblázatban mutatjuk be.

• · · • ····· ·· · · · • · '‘ · · · · ♦ · ·

- 119

7. TÁBLÁZAT

A kondroitináz ABC hatása az oldható trombomodulin származékokra

Minta

Alvadási idő (másodperc)

Trombin

Trombin + kondroitináz

Trombin + kis molekulatömegű származék

Trombin + kis molekulatömegű származék + kondroitináz

Trombin + nagy molekulatömegű származék

250

Trombin + nagy molekulatömegű származék + kondroitináz

102 ····* · · ·· ··«· • · · » · · « • ·« · · * · · · • ····· · · · · · ·· ‘ · · · * · »·

- 120 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (4)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás aminosavszekvencia - amely az N-terminálistól indulva sorrendben magában foglalja a humán trombomodulin

   a) N-terminális;

   b) epidermális növekedési faktorral homológ; és

   c) szerinben/treoninban gazdag területeit, hiányzanak citoplazmás hogy DNS ahol az a humán említett aminosavszekvenciából trombomodulin transzmembrán és területei - előállítására, az említett aminosavszekvenciát azzal jellemezve, kódoló rekombináns transzformált AV12 vagy 293 gazdasejtet a kifejeződéshez alkalmas körülmények között tenyésztjük.

   vektorral
2. 2.Eljárás az alábbi aminosavszekvencia:

   ·♦·· ·

   - 121m₂n-(r)_x (R¹)y-AlaPróAlaGluProGlnProGlyGlySerGlnCysValGluHisAsp CysPheAlaLeuTyrProGlyProAlaThrPheLeuAsnAlaSerGlnlle

   CysAspGlyLeuArgGlyHisLeuMetTh.rValArgSerSerValAl.aAla

   AspValIleSerLeuLeuLeuAsnGlyAspGlyGlyValGlyArgArgArg LeuTrpIleGlyLeuGlnLeuProProGlyCysGlyAspProLysArgLeu GlyProLeuArgGlyPheGlnTrpValThrGlyAspAsnAsnThrSerTyr SerArgTrpAlaArgLeuAspLeuAsnGlyAlaProLeuCysGlyProLeu CysValAlaValSerAlaAlaGluAlaThrValProSerGluProIleTrp GluGluGlnGlnCysGluValLysAlaAspGlyPh.eLeuCysGluPheHis PheProAlaThrCysArgProLeuAlaValGluProGlyAlaAlaAlaAla AlayalSerlleThrTyrGlyThrProPheAlaAiaArgGlyAlaAspPhe GlnAlaLeuProValGlySerSerAlaAlaValAlaProLeuGlyLeuGln LeuMetCysThrAlaProProGlyAlaValGlnGlyHisTrpAlaArgGlu AlaProGlyAlaTrpAspCysSerValGluAsnGlyGlyCysGluHisAla CysAsnAlalleProGlyAlaProArgCysGlnCysProAlaGlyAlaAla LeuGlnAlaAspGlyArgSerCysThrAlaSerAlaThrGlnSerCysAsn AspLeuCysGluHisPheCysValProAsnProAspGlnProGlySerTyr SerCysMetCysGluThrGlyTyrArgLeuAlaAlaAspGlnHisArgCys GluAspValAspAspCysIleLeuGluProSerProCysProGlnArgCys ValAsnThrGlnGlyGlyPheGluCysHisCysTyrProAsnTyrAspLeu ValAspGlyGluCysValGluPr'oValAspProCysPheArgAlaAsnCys GluTyrGlnCysGlnProLeuAsnGlnThrSerTyrLeuCysValCysAla GluGlyPheAlaProIleProHisGluProHisArgCysGlnMetPheCys AsnGLnTh.rAlaCysProAlaAspCysAspProAsnThrGlnAlaSerCys GluCysProGluGlyTyrlleLeuAspAspGlyPhelleCysThrAspIle AspGluCysGluAsnGlyGlyPheCysSerGlyValCysHisAsnLeuPro GlyThrPheGluCysIleCysGlyProAspSerAlaLeuAlaArgHisIle GlyThrAspCysAspSerGlyLysValAspGlyGlyAspSerGlySerGly GluProProProSerProThrProGlySerThrLeuThrProProAlaVal

   GlyLeuValHisSer-COOH • · « · • 9 · · · • · · · · · · • · 9 999 9 99 • ····· 9 9 9 99

   99 9 9 9 999 9

   - 122 ‘ ahol ALA jelentése alanin, ARG jelentése arginin, ASN t jelentése aszparagin, ASP jelentése aszparaginsav, CYS jelentése cisztein, GLN jelentése glutamin, GLU jelentése glutaminsav, GLY jelentése glicin, HIS jelentése hisztidin, ILE jelentése izoleucin, LEU jelentése leucin, LYS jelentése lizin, MET jelentése metionin, PHE jelentése fenilalanin, PRO jelentése prolin, SER jelentése szerin, THR jelentése treonin, TRP jelentése triptofán, TYL jelentése tirozin, és VAL jelentése valin;

   R jelentése MetLeuGlyValLeuValLeuGlyAlaLeuAlaLeuAlaGly LeuGly-;

   R¹ jelentése PhePro-;

   x jelentése 0 vagy 1;

   y jelentése 0 vagy 1, azzal a feltétellel, hogy ha y jelentése 0, akkor x-nek is 0-nak kell lenni, és ha x=l, akkor y-nak is 1-nek kell lenni, előállítására azzal jellemezve, hogy az említett aminosavszekvenciát kódoló rekombináns DNS vektorral transzformált gazdasejtet a kifejeződéshez alkalmas körülmények között tenyésztjük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás glikozilezett aminosavszekvencia előállítására azzal jellemezve, hogy a tenyésztést a glikozilezésnek kedvező gazdasejttel és közegben végezzük.
4. 4. Az 1. vagy igénypont szerinti eljárás nem glikozilezett aminosavszekvencia előállítására azzal jellemezve, hogy a tenyésztést glikozilezés számára nem kedvező gazdasejttel és közegben végezzük.