CN1488000A - 纯化可溶性ssao的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种含有编码融合蛋白质的核苷酸序列的重组构建体，所述融合蛋白质含有一种可溶形式的人SSAO(氨基脲－敏感性胺氧化酶)、一种可分泌的融合配偶体、一个信号肽和一个蛋白质酶裂解位点。所述构建体用于纯化可溶形式的人SSAO的方法中。

Description

纯化可溶性SSAO的方法
技术领域
本发明涉及含有编码融合蛋白质的核苷酸序列的重组构建体，所述融合蛋白质含有可溶形式的人氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)、可分泌的融合配偶体、信号肽和蛋白酶裂解位点。本发明还涉及纯化可溶形式的人SSAO的方法，所述方法使用该重组构建体。
背景技术
氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)属于含铜胺氧化酶的酶家族(CuAO；EC.1.4.3.6)，并且广泛分布于真核和原核生物体内(Buffoni，1993)。这种丰富的酶的生理学作用基本上是未知的，而且尽管苄胺是一种高亲和力的人工底物，但是至今还没有鉴定出具有高亲和力的内源性底物(Buffoni，1993；Callingham等，1995；Lyles，1996，Hartmann和McIntire，1997；Holt等，1998)。在人体内的血管平滑肌细胞中发现SSAO的活性很高(Lewinsohn 1984；Nakos和Gossrau，1994；Yu等，1994；Lyles和Pino，1998；Jaakkola等，1999)。已经在非血管类的平滑肌细胞中和内皮细胞中检测到了SSAO活性(Lewinsohn 1984；Castillo等，1998；Jaakkola等，1999)。在血液中也发现了少量的SSAO蛋白质，与组织-结合形式的蛋白质具有相似的特性(Yu和Zuo，1993；Yu等，1994；Kurkijrvi等，1998)。
许多研究表明对于若干种人类病症如心力衰竭、动脉粥样硬化和糖尿病，血浆中的SSAO活性升高(Lewinsohn 1984；Boomsma等，1997；Ekblom，1998；Boomsma等，1999；Meszaros等，1999)。目前对酶活性发生这些改变的机理还不确定。已经证实由内源性胺氧化酶产生的反应性醛和过氧化氢可能是导致心血管病的原因，而且还证实了抑制糖尿病患者体内的SSAO活性可能会减少血管并发症(Ekblom 1998)。
最近发现人SSAO的cDNA序列(Zhang和McIntire，1996)与血管粘附蛋白1(VAP-1)的cDNA序列相同，所述血管粘附蛋白1(VAP-1)通过介导淋巴细胞与外周淋巴结血管内皮细胞的结合而参与了淋巴细胞的再循环过程(Smith等，1998；同时参见WO98/53049)。SSAO/VAP-1的cDNA序列在GenBank中的登记号为U39447和NM003734(SEQ ID NO：1)。还发现在有炎症的情况下，内皮细胞表面的VAP-1上调(Smith等，1998)。然而，只在内皮细胞内发现了SSAO的粘附特性。在平滑肌细胞中，SSAO不辅助淋巴细胞的结合(Jaakola等，1999)。DNA序列分析、结构模拟和实验数据表明人SSAO是一种由两个90-100kDa的亚基组成的同型二聚体糖蛋白，所述亚基通过单个N-端跨膜区固着在血浆膜上(Morris等，1997；Smith等，1998；Salminen等，1998)。
至今还没有关于纯化重组哺乳动物SSAO或从自然界大量纯化出接近同质性的人SSAO的报道。有一个报道已经记载了为了检测目的的FLAG肽用于与全长人SSAO的N-端融合在一起，但是没有提及该肽用于纯化人SSAO蛋白质的用途(Smith等，1998)。单克隆抗体已被用来从血清和组织匀浆中免疫亲和纯化少量的人SSAO用于免疫印迹(Smith等，1998；Kurkijrvi等，1998)。因此，需要一种用于大量纯化人SSAO的其它方法。
源于日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一种同型二聚体胞质酶，该酶可以通过利用固定化的辅因子谷胱甘肽进行亲和层析，接着通过利用还原型谷胱甘肽(GSH)进行竞争性洗脱来纯化。通过利用这种特定的相互作用，Smith及其同事研制出一种适于大肠杆菌(E.coli)胞内表达的基因融合系统(Smith &Johnson，1988；同时参见WO88/09372)，该系统便于检测和纯化融合了GST的重组蛋白质。以GST作为融合配偶体的潜在缺点是当暴露给氧化环境时其表面上的游离半胱氨酸可能会与例如被融合的靶蛋白质上的游离半胱氨酸进行交联。为了减少这种风险以及使GST-融合蛋白质能够分泌，最近研制出了突变型的GST，其既保留了形成同型二聚体的能力又保留了酶活性(Tudyka和Skerra，1997)。GST易于形成同型二聚体的性质可以被用来诱导被融合的靶蛋白质的二聚体化，这种二聚体化的目的例如是为了增强亲和作用(Tudyka和Skerra，1997)。
文献记载的另一种同型二聚体融合配偶体例如是免疫球蛋白的Fc区(Hollenbaugh等，1992；Sakurai等，1998；Lo等，1998；Dwyer等，1999)和亮氨酸拉链结构如GCN4(Rieker和Hu，2000；Müller等，2000)。已经将数种不同的蛋白质融合到这些同型二聚体蛋白质的结构域上用于不同的目的，例如为了增加亲和性(Dwyer等，1999；Müller等，2000)和为了保留截短的DNA-结合蛋白质与DNA的高亲和力结合(Rieker和Hu，2000)。Fc-融合蛋白质可以通过包括采用低pH缓冲液的洗脱的蛋白A-亲和层析来纯化(Sakurai等，1988，Lo等)，但该层析方法可能会降低被融合的靶蛋白质的活性(Grslund等，1997)。以Fc作为融合配偶体带来的另一个问题是要采用细胞生长所需的血清，由于血清含有大量的免疫球蛋白从而使得对分泌的Fc-融合体的检测和纯化复杂化(Sakurai等，1998)。所述亮氨酸拉链结构GCN4大多被用作由大肠杆菌表达的蛋白质的融合配偶体(Müller等，2000)而且需要融合一种便于纯化的亲和-标记物。
附图简述
图1是GST-SSAO DNA构建体的图解图。GST融合配偶体中的三个半胱氨酸向丝氨酸的突变(GeneBank登记序号为M14654的序列上的第85，138和178位残基)以黑体字母表示。方框内的序列表示3C-蛋白酶的识别序列。
图2是SSAO纯化过程的流程图。标出了每个纯化步骤的测定比活性。
图3是被命名为pMB887的GST-SSAO表达载体图。
发明内容
根据本发明，出乎预料地发现通过利用能够使可溶性SSAO二聚体化的融合配偶体的纯化系统能够生产毫克级的可溶性人SSAO。因此，本发明第一个方面提供了含有编码融合蛋白质的核苷酸序列的重组构建体，该融合蛋白质含有：
(i)可溶形式的人SSAO；
(ii)能够使SSAO二聚体化的可分泌融合配偶体；
(iii)使多肽从宿主细胞分泌到培养基中的信号肽；
(iv)位于人SSAO变异体和融合配偶体之间的蛋白酶裂解位点。
正如本领域技术人员所了解的，所述重组构建体可以任选地含有一个或多个编码各种长度间隔氨基酸序列的核苷酸序列。这种间隔序列可被用于增强融合蛋白质内的柔性，或者被用于增大蛋白质结构域之间的间隔以便相邻结构域分别进行折叠。而且，间隔区可被用于增强柔顺性以便蛋白酶对被引进的裂解识别序列进行裂解。
可溶形式的人SSAO优选地缺乏野生型人SSAO的跨膜区。SSAO多肽的跨膜区在本技术领域中是已知的(Morris等，1997；Holt等，1998；Smith等，1998)，并且基本上如SEQ ID NO：2的第5至27，优选地第6至26位氨基酸所示。
人SSAO的氨基酸序列，除了跨膜区以外，优选地含有SEQ ID NO：2中的第29至763位氨基酸，或者基本上由SEQ ID NO：2中的第29至763位氨基酸组成。然而，本领域技术人员能够理解SSAO多肽内可以含有部分跨膜区域，而该多肽仍基本保留其可溶特性。因此，人SSAO的氨基酸序列可以含有例如SEQ ID NO：2的第27至763，或第28至763位氨基酸，包括基本具有人SSAO生物活性的其片段。而且术语“人SSAO多肽”旨在包括人SSAO的突变体和自然存在的变异体，所述突变体或变异体或者保留了酶活性或蛋白质相互作用(例如粘附功能)，或者被设计成便于进行结构研究(例如结晶性能的改进)，或者被突变成便于进行结构/功能关系的研究(其包括非活性突变体)。
所述融合配偶体可被融合到人SSAO多肽的C-端或N-端部分。可以将融合蛋白质设计成可以含有多于一个的融合配偶体，例如一个被融合到SSAO的N-端部分和一个被融合到C-端部分。附加的融合配偶体可能是一种附加的亲和标记物或一种报道蛋白如增强绿荧光蛋白(EGFP)。
已经记载了大量的不同基因融合系统和融合配偶体。在这些系统中，利用了不同类型的相互作用，如酶-底物、细菌受体-血清蛋白、聚组氨酸-金属离子和抗体-抗原(Uhlén等，1992)。用于亲和纯化的多种基因融合系统在本技术领域中也是已知的。用于这种系统的融合配偶体的实例(这方面的综述，参见例如Nilsson等。1997；或Sheibani，1999)包括葡萄球菌蛋白A及其衍生物Z；源自链球菌蛋白G的白蛋白-结合蛋白质；谷胱甘肽S-转移酶(GST)；聚组氨酸标记物；生物素化亲和标记物(例如Biotin AviTag)；大肠杆菌麦芽糖-结合蛋白质；纤维素结合结构域；FLAG肽和Ttrep-标记物。利用蛋白支架结构可以产生另一种用于产生新型配体受体的系统(参见Skerra，2000，以及其中的引用的参考文献)。然后这些新型结合蛋白质，例如亲和体(affibody)，可以被用作不同用途的融合配偶体(Nygren和Uhlén，1997；Nord等，1997)。
根据本发明，所述融合配偶体应当能够使SSAO二聚体化。合适的融合配偶体是谷胱甘肽S-转移酶(GST)，这是由于它倾向于形成二聚体，而且还由于利用含有固定化谷胱甘肽的色谱介质(例如，源自Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)就能够在温和条件下进行纯化。另外，通过其酶活性或通过利用GST特异性抗体或谷胱甘肽，采用商购GST检测系统(例如，来源Amersham PharmaciaBiotech)能够方便地检测GST。所述融合配偶体也可以是GST的一种功能等价变异体，仍然保留了形成二聚体的倾向，并且具有能够进行亲和纯化的结合特性。所述融合配偶体更优选地是日本血吸虫(S.japonicum)GST的变异体(GenBank登记号M14654；SEQ ID NO：3和4)，该变异体被设计成能够分泌到宿主细胞外，在第85、138和178位上具有一个或多个半胱氨酸残基被其它氨基酸残基所取代。最优选地是，所述变异体在第85、138和178位上的所有半胱氨酸残基被丝氨基酸残基所取代(参见Tudyka & Skerra，1997和SEQ ID NO：5)。
另外，所述重组构建体应当含有编码N-端信号肽的核苷酸序列，所述信号肽使得所述融合蛋白质从宿主细胞分泌到培养基中。为了在真核细胞中生产人蛋白质如SSAO，同源信号肽是优选的。为了在HEK293细胞中生产SSAO，可以使用小鼠IgG1重链信号肽(Kabat等，1991)。其它合适的信号肽在本技术领域中是已知的，并被记载在例如Kabat等的文献中，见上文。
已经记载了几种用于位点特异性裂解融合蛋白质的方法，所述方法基于采用化学剂如CNBr或羟胺，或者酶如肠激酶、因子Xa、凝血酶、枯草杆菌蛋白酶或其它蛋白酶(参见，例如Nilsson等，(1997)以及其中引用的参考文献)处理。根据本发明，通过蛋白酶裂解反应可以方便地从人SSAO上除去所述融合配偶体。用于裂解的蛋白酶可以例如是源自细小核糖核酸病毒家族的3C蛋白酶，例如鼻病毒或肠病毒3C蛋白酶(Walker等，1994)。因此，所述蛋白酶裂解位点可以优选地是源自细小核糖核酸病毒家族的3C蛋白酶，例如鼻病毒或肠病毒3C蛋白酶的裂解位点。在本发明的一个实例中，所述3C蛋白酶裂解位点包含氨基酸序列EALFQG(SEQ ID NO：6)。然而，技术人员能够鉴定出其它合适的裂解位点，参见例如Blom等，(1996)以及其中引用的文献。
本发明的重组构建体可例如含有基本编码图1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还提供了通过标准方法制备的表达载体，该载体含有本发明的重组构建体。这种表达载体通过图3所示的被命名为pMB887的表达载体来例示。
另一方面，本发明提供了纯化重组人SSAO多肽的方法，该方法包括步骤：
(i)用上述本发明的表达载体转染细胞；
(ii)在允许由所述载体表达的融合蛋白质分泌到细胞培养基中的条件下培养所述细胞；
(iii)使获得的融合蛋白质与含有对所述融合配偶体具有亲和性的配体的介质结合；
(iv)分离所述的融合配偶体和SSAO多肽；和
(v)回收所纯化的人SSAO多肽。
当所述融合蛋白质仍然与亲和配体相连时，或者当所述融合蛋白质从所述亲和配体上释放出来时，可以将所述融合配偶体与人SSAO变异体分离开来。当所述融合配偶体是GST时，对配偶体具有亲和性的所述配体优选地是谷胱甘肽或其衍生物。或者，可以将针对GST的抗体用作亲和配体。
如上所述，可以通过采用例如细小核糖核酸病毒如鼻病毒3C-蛋白酶的蛋白酶裂解反应来将所述融合配偶体与人SSAO分离开来。所述蛋白酶可以被融合到融合配偶体上，从而获得“融合蛋白酶”(参见Walker等，1994；Grslund等，1997)。方便地是，这种融合配偶体可以与用于SSAO多肽的融合配偶体，例如谷胱甘肽S-转移酶相同。然而，对于蛋白酶的其它合适融合配偶体，诸如源自链球菌的蛋白G的白蛋白-结合蛋白，在本技术领域中是已知的，例如参见Grslund等，1997。所述融合蛋白酶通过包括以下步骤的方法与SSAO多肽分离开来：将融合蛋白酶与含有配体的基质结合，该配体对所述融合配偶体具有亲和性。因此，当融合配偶体是GST时，所述配体优选地是谷胱甘肽或其衍生物。如上所述，针对融合配偶体的抗体也可以被用作亲和配体。从商业途径获得的系统是PreScissionProtease(Amersham Pharmacia Biotech)，其是一种由日本血吸虫GST和人鼻病毒3C蛋白酶组成的基因工程融合蛋白质。
针对某些应用，将SSAO固定化可能是有利的。这可以例如通过采用如上所述的亲和-标记物如GST来实现。通过亲和-标记物将融合蛋白质固定化的应用实例包括：蛋白质配体的捕获、蛋白质-蛋白质之间的相互作用的分析以及在生物反应器中的用途(Nilsson等，1996；Nord等，1997；Shpigel等，1999)。然而，记载了其它多种用于蛋白质固定化的方法如共价结合和非共价吸附(参见例如Tischer和Kasche，1999以及其中引用的参考文献)，其也可以被用于GST-SSAO或经去除了融合配偶体后的SSAO的固定化。另外，SSAO蛋白质还可以被包囊在例如溶胶-凝胶或人工细胞，例如脂质体(参见例如Liang等，2000以及其中引用的文献)中。
采用亲和-标记物如GST的一个优点是可以实现定向固定化，经常是以一步法直接由例如细胞的溶胞产物进行定向固定化(Nilsson等，1997；Saleemuddin，1999)。这可以使得在空间上容易接近活性结合位点并且增强了稳定性(Saleemuddin，1999；Turkova，1999)。已被用于蛋白质固定化的其它亲和-标记物方法的实例是例如为了利用生物素与链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白之间的非常强的相互作用(Kd～10-15)(Nilsson等，1997)而被生物素连接酶特异生物素化以及被用作融合配偶体的肽和蛋白质和与纤维素特异性结合的CBD(Linder等，1998；Tomme等，1998)。通过利用与蛋白质结合的固定化抗体或者通过蛋白质表面可能存在的碳水化物部分也可以实现蛋白质的定向固定化(Turkova，1999)。
最近，通过利用改构的碳糊(carbon paste)将源自豌豆苗的胺氧化酶固定化以生产用于测定生物产生的和合成的胺的生物传感器(Wimmerova和Macholan，1999)。类似地，为了构建检测例如心血管毒素烯丙胺的生物传感器，可将重组人SSAO固定化，所述心血管毒素烯丙胺被用于有机工业过程并且是SSAO的底物(Boor和Hysmith，1987；Conklin等，1998)。当进行固定化时，可以预测重组SSAO以模拟膜-定位的SSAO及其特性，这可能不同于溶解状态。
因此，如下列实施例所示，本发明提供了用于生产高纯度可溶性重组人SSAO的方法，所述SSAO具有酶活性。所述实例性的方法包括利用突变体形式的日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)，其作为亲和融合配偶体被设计用来向宿主细胞外转移(Tudyka和Skerra，1997)。所述融合蛋白质从哺乳动物细胞中分泌出来，并且可以通过谷胱甘肽-亲和层析可以直接从培养基中纯化出来。通过特异性蛋白水解作用和附加的谷胱甘肽-亲和层析步骤，将融合配偶体和蛋白酶除去，由此得到毫克级的纯的、可溶性的和高活性的重组人SSAO蛋白质。据发明人所知，这是第一次生产可溶形式的重组活性人SSAO蛋白质并且被纯化成接近同质性。
确信所公开的用于生产重组人SSAO的方法对于其它哺乳动物胺氧化酶以及其它可分泌蛋白也是实用的，所述哺乳动物胺氧化酶诸如是人胎盘二胺氧化酶(Zhang等，1995)和人视网膜-特异性胺氧化酶(Imamura等，1998)。所公开的方法也有利于改构的发现和鉴定，例如通过分离含有辅因子的肽或通过晶体结构的测定来鉴定活性位点辅因子。
在下列实施例中，表明SSAO是活性的和可溶性的而不具有跨膜区域，而且表明GST可通过蛋白水解来除去。这些发现证实了SSAO通过在跨膜区域附近进行蛋白水解裂解(脱落)而被释放到循环系统中的假说，该方法通用于型I和型II膜蛋白(Hooper等，1997)。裂解膜-定位的SSAO的蛋白酶的蛋白水解活性的增强或增强现存蛋白酶底物利用性的表面定位能力的增强可能会导致例如糖尿病人血浆中的SSAO活性的提高(Boomsma等，1999)。
除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管与本文所记载的那些方法和材料类似的或相同的方法和材料也可以被用于本发明的实践或试验中，但是合适的方法和材料如以下所述。本文引用的所有出版物、专利出版物、专利和其它参考文献被全文引入本文作为参考。在出现矛盾的情况下，包括定义在内的本申请的说明书将起决定作用。另外，所述材料、方法和实施例只是说明性质的并不是限制目的的。
本发明的其它特性和优点通过以下的详细描述以及权利要求将更加明了。
实例性的方法
源自主动脉cDNA的人SSAO基因的PCR-扩增和克隆
借助公开的人胎盘胺氧化酶的cDNA序列设计两个PCR-引物(GenBank登记号U39447；Zhang和McIntire，1996)。5’-引物XNQZ-15(5’-CCG GAA TTC CAA CGC GTC CAT GAA CCA GAAGAC AAT CCT CGT G-3’；SEQ ID NO：7)被设计成与包含ATG起始密码子的SSAO编码序列的5’-端杂交以及含有用于克隆的限制性酶切位点EcoRI和MluI。3’-引物XNQZ-17(5’-CCC CCA AGC TTG TCGACT CAC TAG TTG TGA GAG AGA AGC CCC CCC-3’；SEQ IDNO：8)被设计成与包含天然终止密码子TAG的3’-端杂交，该终止密码子TAG后面接着一个附加的终止密码子TGA和用于克隆的两个限制性酶切位点SalI和HindIII。作为PCR的模板，对0.5μl人主动脉或人平滑肌细胞QUICK-Clone Cdna(1ng/μl，Clontech Laboratory，Palo Alto，CA)进行了试验。下列条件被用于PCR-反应，20pmol的每种引物XNQZ-15和XNQZ-17，1μl dNTP(10mM)，1μl AdvantagecDNA聚合酶混合物(Clontech)，5μl 10x cDNA PCR反应缓冲液(Clontech)，总体积为50μl。利用Perkin-Elmer 2400热循环仪(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)进行扩增。PCR程序由以下步骤组成：94℃维持5分钟进行初始变性，94℃30秒钟、60℃30秒钟和72℃3分钟循环35次，接着72℃3分钟进行最终的延伸反应。然后利用TA-克隆来将PCR-产物插入到载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。按照染色终端循环测序的标准程序从两个方向对被克隆的PCR-片段进行测序，并利用DNA测序仪ABI377(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行分析。
用于在哺乳动物细胞中表达SSAO的载体的构建
通过将源自pCR2.1-TOPO-SSAO载体的EcoRI和SalI片段插入到载体pCI-neo(Promega，Madison，WI)的相同位点上来制备用于在哺乳动物细胞中表达完整的SSAO蛋白质的载体，得到载体pMB843。该载体被用作对应于人SSAO的29-763位残基区域的PCR-扩增模板(Zhang和McIntire，1996)。将5’引物5’-GAG GAA GCT TTG TTCCAA GGT GGA GAT GGG GGT GAA-3’(SEQ ID NO：9)合成为含有部分3C蛋白酶切位点的密码子(见下文)和位于29位残基的密码子的上游的HindIII限制性酶切位点。3’-引物5’-GCA TTC TAG TTGTGG TTT GTC-3’(SEQ ID NO：10)是与被克隆的SSAO片段的下游退火的pCI-neo载体特异性引物。得到的PCR-产物用HindIII和NotI消化，并被克隆到用相同酶酶切的质粒pET38b(+)(Novagen，Inc.，Madison，WI)中，从而得到pET38-SSAO。按照上述方法进行DNA测序以便证实被克隆的SSAO片段具有所期望的序列。
通过PCR-介导的突变和按照下述方法进行的片段装配来制备源自日本血吸虫的、以前被用作重组蛋白质的分泌型的酶活性的二聚体化模块的突变形式(SEQ ID NO：5)的谷胱甘肽S-转移酶(GST)(Tudyka和Skerra，1997)。进行突变来取代定位在GST蛋白质表面附近的第85、138和178位的三个半胱氨酸残基，所述GST蛋白质表面如日本血吸虫GST的晶体结构(Lim等，1994；Tudyka和Skerra，1997)所示，具有丝氨酸残基从而在GST融合蛋白质被释放到氧化环境后避免不希望的二硫化物的形成(Tudyka和Skerra，1997)。用下列PCR-引物来构建突变的GST和引进第一部分的3C蛋白酶切位点(见下文)以及用于克隆的合适限制性酶切位点。另外，所述引物引进了用于调控酶切和通过连接可能用于装配PCR-片段的内部限制性位点：ROEL-1(5’-GCC GGA ATT CGA CGC GTC CCC TAT ACT AGGTTA TTG G-3’；SEQ ID NO：11)含有用于克隆的EcoRI和MluI，并且与GST的2-8位密码子(M14654)退火；ROEL-2(5’-CTC TGC GCGCTC TTT TGG AGA ACC CAA CAT GTT GTG C-3’；SEQ ID NO：12)含有BssHII位点；ROEL-3(5’-GGT TCT CCA AAA GAG CGC GCAGAG ATT TCA ATG CTT GAA G-3’；SEQ ID NO：13)含有BssHII位点；ROEL-4(5’-ATG AGA TAA ACG GTC TTC GAA CAT TTTCAG CAT TTC-3’；SEQ ID NO：14)含有BbsI位点；ROEL-5(5’-GTTCGA AGA CCG TTT ATC TCA TAA AAC ATA TTT AAA TGGTGA TC-3’；SEQ ID NO：15)含有BbsI位点；ROEL-6(5’-AAA AGAAAC TAG TTT TGG GAA CGC ATC CAG GCA-3’；SEQ ID NO：16)含有SpeI位点；ROEL-7(5’-CCC AAA ACT AGT TTC TTT TAAAAA ACG TAT TGA AGC TAT C-3’；SEQ ID NO：17)含有speI位点；ROEL-8(5’-ACC CAA GCT TCC TGA CTT TGT GAC TTT GGAGGA TGG TCG CCA CC-3’；SEQ ID NO：18)含有用于克隆的HindIII位点并且与GST的212-218位密码子(M14654)退火。ROEL-8还将在部分3C蛋白酶裂解位点前引进间隔-序列SQSQ的密码子。利用引物对ROEL-/2、ROEL-3/4、ROEL-4/5和ROEL-7/8，以质粒pGEX-6P-2(Amersham Pharmacia Biotech)为模板分别进行PCR反应来扩增GST基因的重叠部分。混合四种PCR-片段并且在利用引物ROEL-1和ROEL-8的PCR反应中以它们为模板来装配突变的完整GST基因。利用Advantage cDNA PCR试剂盒(Clontech)进行PCR-反应。在下一个步骤中，将GST片段用EcoRI和HindIII进行消化并克隆到pUC18(Amersham Pharmacia Biotech)的相同位点上，从而得到pMB809。按照上述方法进行DNA测序来证实所期望的突变GST片段的序列。pMB809载体采用EcoRI和HindIII进行裂解并分离出GST片段，然后将该GST片段克隆到用同种酶酶切的pET38-SSAO载体中的SSAO片段的上游位置。该步骤使得在GST和SSAO(残基29-763)之间形成了一个完整的人鼻病毒-14和柯萨奇病毒的3C蛋白酶裂解位点EALFQG(SEQ ID NO：6)(Miyashita等，1996；Wang等，1997)(参见图1)。
GST-SSAO片段被克隆到载体pMB565的MluI和SalI位点上，其中鼠IgG1重链的突变信号序列(图1)被克隆到哺乳动物表达载体pCI-neo(Promega)的多接头上。产生的GST-SSAO表达载体被命名为pMB887(图3)。
稳定克隆的转染和选择
将三个25cm2的T-烧瓶接种上约4×105的人胚胎肾293细胞(HEK293细胞，ATCC CRL-1573，Rockville，MD)。在含有Dulbecco的改性Eagle培养基(DMEM)的生长培养基中将细胞培养到～50％的汇合度，所述培养基补加了10％的胎牛血清(FBS)和2mM的L-谷氨酰胺。在与培养基成分混合之前在56℃下将FBS加热失活30分钟。然后利用LipofectAMINE(Life Technologies，Frederick，MD)按照厂商提供的说明书通过脂质体-介导的转染将表达载体pMB887引入到细胞当中。培养48小时后，将培养基整瓶倒入补加了1mg/ml遗传霉素(G418)的生长培养基中以筛选稳定转染的细胞。约两个星期后，出现抗性细胞并进行汇合培养。收集三个T-烧瓶中的细胞(克隆混合物)并用补加了1.2mg/ml的G418的生长培养基进行稀释，然后接种到15-cm的培养皿中。两个星期后，长出单独的菌落并挑出这些菌落进行单独扩增以便以后进行GST-SSAO生产的分析。利用GST 96-孔检测试剂盒(Detection Module)(Amersham Pharmacia Biotech)对所收集的培养基中的源自扩增克隆的GST蛋白进行检测。选择出7个阳性克隆并进行冷冻。
GST-SSAO在Cell Facrorv(细胞工厂)中的生产
10号克隆在含有补加了5％FBS(热失活的)、2Mm-谷氨酰胺和1.2mg/ml G418的DMEM的生长培养基中进行扩增和培养后被接种到含有1500ml生长培养基的6320cm2Nunc Cell Facrory(Nalge NuncInt.，Naperville，IL)中，然后在37℃下进行培养。培养4天后，细胞汇合并收集培养基。然后向同一Cell Facrory中的细胞中加入FBS含量降低的(2％)新鲜生长培养基(1500ml)，三天后收集条件培养基。将这次过程重复一次，从一个Cell Facrory中得到总量～4.5升的收集培养基。对收集到的培养基进行离心并在-70℃下进行保藏。
条件细胞培养基的浓缩
从两个Cell Facrory中得到的冷冻条件培养基(9.4升)利用30℃的水浴融化。利用Centramate超滤装置(Pall Filtered，Northborough，MA)将所述材料泵过Omega膜(MWCO(截留分子量)10000)，直至达到600ml的体积。通过装配了0.65μm预过滤器的0.45μm的过滤器，Sartobran P(Sartorius，Gttingen，德国)，过滤滞留物。用250ml的磷酸盐缓冲液(PBS)取代管中剩余的滤液结果得到850ml的过滤样品。
GST-SSAO的纯化和裂解
GST-SSAO融合蛋白质通过HR10/10柱(Amersham PharmaciaBiotech)进行谷胱甘肽-亲和层析来纯化，所述HR10/10柱装填了8ml的谷胱甘肽-Sepharose 4 Fast Flow(结合～10mg GST/ml凝胶Amersham Pharmacia Biotech)，并用10个体积的PBS进行平衡。在室温下以0.9ml/分钟的流速过夜上样过滤物(850ml)。收集流出的物质用于分析并保藏在-20℃下。用PBS冲洗柱后，用洗脱缓冲液(20mMGSH，0.1M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH8.2)洗脱结合的蛋白。
将得到的洗脱物上样在经氦-喷射裂解缓冲液(150mM NaCl，1mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.5，25℃)平衡的HiPrepDesalt26/10柱(Amersham Pharmacia Biotech)上并收集蛋白质峰。通过加入DTT至5mM和380个单位的PreScission蛋白酶(AmershamPharmacia Biotech)(二硫苏糖醇)来启动裂解反应。PreScission蛋白酶是一种遗传工程融合蛋白质，由GST和人鼻病毒3C蛋白酶组成，而且特异性裂解其识别序列中Gln(G)和Gly(G)残基之间的键。
在5℃下温育裂解混合物。温育63小时后，按照上述方法将该物质上样到谷胱甘肽-Sepharose柱上，该柱经裂解缓冲液平衡。收集流出液(36ml)，并在5℃下于敞开试管中保存约一个星期。取样并进行SDS-PAGE分析(非还原的)。用洗脱缓冲液洗脱被捕获在柱上的蛋白质用于分析。将被收集的蛋白样品上样到JumboSep装置(MWCO30000，Pall Filtron)上用于缓冲液更换和浓缩。离心并用含有50mMTris-HCl(pH7.5)和150mM NaCl的缓冲液稀释，该过程循环5次。取出样品用于不同分析。然后将缓冲液更换的和浓缩的物质(4.2ml)保存在-70℃。
蛋白质分析
通过SDS-PAGE分析SSAO的纯度和大小。在有或无2-巯基乙醇存在的条件下利用梯度凝胶4-20％或4-12％(Novex Copenhagen，Denmark)对样品进行电泳，并通过考马斯染色对蛋白进行显影(PhastGel Blue R，Amersham Pharmacia Biotech)。利用考马斯与蛋白检测试剂盒(Pierce，Rockford，IL)按照厂商建议的标准在含有牛血清白蛋白的96-孔板中测定蛋白质浓度。
利用SMART系统(Amersham Pharmacia Biotech)在Superdex200 PC 3.2/30柱(Amersham Pharmacia Biotech)上进行大小排阻层析。所述柱子在室温下经含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl和1mM EDTA的缓冲液平衡。进样体积是10μl，而且样品以0.1ml/分钟的流速进行洗脱。利用凝胶过滤HMW校准试剂盒(AmershamPharmacia Biotech)中的分子量标准品Blue Dextran 2000(～2000kDa)、甲状腺球蛋白(669kDa)、铁蛋白(440kDa)、过氧化氢酶(232kDa)和醛缩酶(158kDa)来对柱子进行校准。
利用连接了HP 1090 PTH分析仪的HP G1000A蛋白测序仪(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)通过反复进行Edman降解对纯化的GST-SSAO和SSAO进行N-端测序。对GST-SSAO样品进行脱盐以便在分析之前除去谷胱甘肽。裂解后从谷胱甘肽-Sepharose柱的流出液中提取SSAO。
由Holt及其同事所述的用于一元胺氧化酶的分光光度分析法(Holt等，1997)被用来测定来自不同纯化步骤的样品中的胺氧化酶活性。该分析法用37℃温育的96-孔微滴板于SPECTRAmax250微板分光光度计(Molecular Device，Sunnyvale，CA)中进行。在0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.6)中含有1mM香草酸(Sigma，St.Louis，MO)、500μM 4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)(Sigma)和4Uml-1过氧化物酶(源自辣根的型VI，Sigma)的试剂混合物在进行检测的当天配制，并在使用之前一直保存在5℃下。在有或无750μM盐酸苄胺(Sigma)存在的条件下通过混合50μl的样品、50μl的试剂混合物和200μl的磷酸钾缓冲液来开始进行反应，并且反应按照一式三份来进行。为了获得空白对照值，用缓冲液取代孔中的样品来进行分析。接下来在490nm下的吸光值在10-40分钟内发生变化。利用磷酸钾缓冲液将H2O2原液稀释为10nm/孔至120nm/孔的溶液来绘制标准曲线。当进行抑制实验时，于37℃下将样品在300μM氨基脲中温育30分钟，然后加入苄胺溶液。
本发明将通过下列实施例进行描述。这些实施例只是为了实例说明本发明而无论如何都不应被理解为是对本发明的限制。
实施例
实施例1：SSAO cDNA的克隆
用PCR方法扩增源自人主动脉cDNA的人SSAO的基因。PCR引物被设计成包含人胎盘胺氧化酶基因的侧翼序列(Zhang和McIntire，1996)以及包含用于克隆到不同表达载体中的限制性酶切位点。克隆～2300bp的PCR-产物，随后的DNA进行测序的结果表明克隆的PCR产物的序列与人胎盘胺氧化酶序列(Zhang和McIntire，1996)相同，并且与从肺cDNA克隆的VAP-1序列(Smith等，1998)相同。
实施例2：膜-结合的SSAO的纯化(对照实施例)
为了生产重组SSAO蛋白而进行的尝试表明活性SSAO可以通过利用pMB843载体在人胚胎肾(HEK293)细胞中来生产，所述pMB843载体中克隆了人SSAO的全长编码序列。利用溶解试剂进行提取后发现了活性蛋白，但是仅可以部分纯化微克量的蛋白质。
实施例3：用于表达可溶形式的SSAO的基因构建体的原理和设计
已经研究出另一种在哺乳动物细胞中生产非膜结合的SSAO的方法。通过利用具有内在的形成二聚体的倾向的亲和融合配偶体取代含有推测跨膜肽的N-端区域来进行纯化和检测。所述方法还包括利用可分泌的亲和融合配偶体来使融合蛋白质分泌到培养基中。选择日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶(GST)的突变变异体。该突变的GST保留了其活性以及形成二聚体的倾向，并且被优化成利于进行分泌(Tudyka和Skerra，1997)。
蛋白酶裂解位点被设计成能够使SSAO从纯化的GST-SSAO融合蛋白质中释放出来。对预测氨基酸序列进行的扫描结果表明第28个位点上的精氨酸的侧翼具有三个甘氨酸残基。若干种人蛋白酶碱性残基后裂解(Carter，1990；Hooper等，1997)，而且短序列的甘氨酸残基据说增强对蛋白酶的可接近性(Carter，1990)。另外，许多膜-定位蛋白的胞外区域向血流中进行的蛋白水解释放(脱落)发生在膜附近(Hooper等，1997)。因此选择第29位上的甘氨酸残基与合适的底物进行连接，该底物用于GST-SSAO融合蛋白质纯化后的位点-特异性蛋白水解。因此，能够裂解在P1位点上具有一个甘氨酸的底物以及具有高特异性的蛋白酶是理想的。现有几种具有这两种特性的商业蛋白酶如因子Xa、凝血酶、肠激酶和3C蛋白酶(Nilsson等，1997)。容易捕获裂解后的蛋白酶的能力是另一个要考虑的因素，因此选择了可商购的融合了GST的3C蛋白酶。3C蛋白酶裂解位点EALFQG(SEQ IDNO：6)(Miyashita等，1996；Wang等，1997)被引进GST-SSAO融合构建体(图1)。
将GST-SSAO片段克隆到具有信号序列的读框中从而实现GST-SSAO融合蛋白质向培养基中的分泌。使用得自鼠抗体的重链的信号序列(参见图1)。由此得到的最终构建体(SEQ ID NO：19和20)编码融合蛋白质，该融合蛋白质含有抗体信号肽、18个氨基酸的间隔区域、突变的GST蛋白质、3C蛋白酶的底物序列和由人主动脉cDNA克隆的人SSAO蛋白的第29-763位残基(图1)。未改构的GST-SSAO融合蛋白质的计算分子量是112kDa。
实施例4：对源自被GST-SSAO表达载体转染的HEK293细胞的条件培养基进行初步分析
源自小规模的HEK293细胞培养物的条件培养基中的苄胺氧化酶活性说明GST-SSAO被分泌到了培养基中，其中所述HEK293细胞被GST-SSAO表达载体pMB887稳定转染。进一步的分析表明谷胱甘肽-Sepharose珠子可被用来纯化少量的直接源自条件培养基的GST-SSAO融合蛋白质(没有显示数据)，并且表明被纯化的物质具有苄胺氧化酶活性。有趣地是，发现GST-SSAO融合蛋白质即使被固定在谷胱甘肽-Sepharose珠子上也具有活性。通过估计珠子上捕获蛋白质的量而计算的GST-SSAO融合蛋白质在条件培养基中的含量为～1mg/l。
实施例5：GST-SSAO融合蛋白质的制备型纯化和位点特异性裂解
亲和纯化过程的概述如图2所示。纯化结果列于表1中。对一个被筛选的克隆进行扩增并在Cell Factory中进行培养从而产生大量的用于纯化的GST-SSAO。对收集的条件培养基进行浓缩并进行过滤，从而缩短了在谷胱甘肽-Sepharose柱上的加样时间。然后通过谷胱甘肽-亲和层析来从所述被浓缩的且被过滤的条件培养基中纯化GST-SSAO融合蛋白质。被柱捕获的蛋白质用20mM的GSH洗脱并在还原条件下进行SDS-PAGE分析。这表明GST-SSAO融合蛋白质具有很高的纯度，并且表明可以通过单步法将其从培养基中的大量其它蛋白中分离出来。GST-SSAO融合蛋白质迁移至分子量标准品中的116kDa蛋白质的水平。从谷胱甘肽-Sepharose柱上回收到总量为8.8mg的蛋白质。GST-SSAO融合蛋白的比活性被测定为243nmol分钟-1·mg-1。有趣地是，通过缓冲液更换步骤去除了还原剂GST后的比活性几乎翻了一倍。
谷胱甘肽-亲和纯化的GST-SSAO用GST-3C蛋白酶融合蛋白，质(46kDa)裂解从而去除了SSAO上的GST融合配偶体。分析实验表明裂解反应的速度非常慢，但很精确，没有观察到副产物的产生。而且，完全的裂解可以通过～48小时的温育来实现。裂解混合物过谷胱甘肽-Sepharose柱以便捕获被除去的GST融合配偶体和GST-3C蛋白酶。收集流出的物质并在还原条件下进行SDS-PAGE分析，结果表明只含有～97kDa分子量的预期SSAO产物。也对捕获的物质进行了分析，结果表明只含有GST融合配偶体(～28kDa)和GST-3C蛋白酶。这表明发生了完全的裂解反应，而且所有含有蛋白质的GST被捕获在谷胱甘肽-Sepharose柱上。还表明全部的SSAO蛋白质流出了柱子，这是因为在洗脱出的物质中没有发现SSAO蛋白质的存在。
纯化的SSAO蛋白质的比活性被测定为522nmol分钟-1·mg-1，比裂解前测定的比活性低。由于用DTT来确保3C蛋白酶在裂解GST-SSAO融合蛋白质过程中的活性，所以我们通过SDS-PAGE分析(非还原的)来分析所述裂解缓冲剂是否影响SSAO均二聚体内可能的二硫键(Kurkijrvi等，1998；Smith等，1998；Salminen等，1998)。只发现了推定的SSAO单体(～97kDa)(没有显示数据)。然而，在5℃贮存过程中SSAO蛋白被转化成～170kDa的大小(由SDS-PAGE分析得到)，这表明形成了一个或多个二硫键。通过渗滤除去裂解缓冲液并且SDS-PAGE分析结果表明SSAO蛋白仍然主要是分子量为～170kDa的二聚体形式。从9.4升的条件培养基中获得总量为3.6mg的重组SSAO，该SSAO的比活性为809nmol分钟-1·mg-1。基于所测定的苄胺氧化酶活性，该过程的总产率是22％。
有趣地是，GST融合配偶体对SSAO蛋白质的苄胺氧化酶活性的影响不明显。缓冲液更换步骤后的纯化的GST-SSAO融合蛋白质的比活性被测定为634nmol分钟-1·mg-1。去除了GST融合配偶体后，SSAO的比活性被测定为809nmol分钟-1·mg-1。然而，GST融合配偶体的分子量是GST-SSAO融合蛋白质的～25％，并且去除了GST后的比活性的增加幅度相同。这为利用融合蛋白质进行酶的性质鉴定提供了可能。而且，亲和融合配偶体如GST可被用来以定向的方式将重组蛋白结合或固定在固体载体上以便研究例如蛋白质-蛋白质之间的相互作用和酶特性(Nilsson等，1997)。当与谷胱甘肽-Sepharose珠子结合时，GST-SSAO融合蛋白质确实具有活性。
实施例6：纯化的SSAO蛋白质的初步定性
通过在非变性条件下进行凝胶过滤实验来分析SSAO蛋白的大小。将源自SSAO蛋白质物质的样品上样到标准的Superdex 200分析柱上，其中所述SSAO蛋白质物质在非还原条件下进行SDS-PAGE分析时是以二聚体蛋白的形式进行迁移。所述SSAO蛋白质的洗脱体积为1.29ml，比过氧化氢酶(232kDa)略快一些，过氧化氢酶的洗脱体积是1.35ml。
对被纯化的SSAO蛋白质进行N-端氨基酸测序的结果表明GST-3C蛋白酶能够特异性裂解GST-SSAO融合蛋白质内的3C蛋白酶底物序列EALFQG(SEQ ID NO：6)(图1)。测定了29个氨基酸，而且这29个氨基酸精确地对应于预测的SSAO氨基酸序列(SEQ IDNO：2)的第29-58位残基。而且还对GST-SSAO融合蛋白质进行N-端测序，结果表明信号肽正如所期望的被进行了加工。
最后，发现被纯化的SSAO蛋白正如所料对氨基脲的抑制作用敏感。在有0.1mM氨基脲存在的条件下，大于95％的苄胺氧化酶活性受到抑制。
表1
重组人SSAO的纯化
    纯化步骤(样品) 总体积(ml)     总蛋白(mg) 总SSAO活性a(nmol分钟-1)     比活性(nmol分钟-1mg-1)    产率(％)
  条件培养基   9400     9024     9243     1.0     -
  浓缩培养基   600     9060     13200     1.5     100
  滤液   850     9065     11900     1.3     90
  GST-亲和步骤-1(洗脱)   6.8     8.8     3029     343     23
  缓冲液更换   15     8.9     5624b     634b     43
  GST-亲和步骤-2(流出)c   36     5.5     2859     522     22
  渗滤液d   4.2     3.6     2919     809     22
a将活性测定为以0.5mM苄胺为底物每分钟产生H2O2的nmol数。SSAO活性是以0.1mM氨基脲作为抑制剂来测定的。
b是在加入5mM DTT和GST-3C蛋白酶之前测定的。
c该步骤是在GST-SSAO融合蛋白质位点特异性裂解后进行，目的是截留被除掉的GST融合配偶体和GST-3C蛋白酶。
d缓冲液更换和通过超滤进行样品浓缩。
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            序列表<110>Biovitrum AB<120>蛋白质的纯化方法<130>00395<160>20<170>PatentIn 3.O版<210>1<211>4040<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(161)..(2452)<300><308>GenBank/NM_003734<309>2000-01-28<300><308>GenBank/U39447<309>1997-01-08<400>1gtccttccca cccttagtcc caggcatctg actaccggga acctcagcca gagtccggga    60gccccccacc ccgtccagga gccaacagag cccccgtctt gctggcgtga gaatacattg    120ctctcctttg gttgaatcag ctgtccctct tcgtgggaaa atg aac cag aag aca      175
                                        Met Asn Gln Lys Thr
                                        1               5atc ctc gtg ctc ctc att ctg gcc gtc atc acc atc ttt gcc ttg gtt     223Ile Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr Ile Phe Ala Leu Val
            10                  15                  20tgt gtc ctg ctg gtg ggc agg ggt gga gat ggg ggt gaa ccc agc cag     271Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly Gly Glu Pro Ser Gln
        25                  30                  35ctt ccc cat tgc ccc tct gta tct ccc agt gcc cag cct tgg aca cac      319Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala Gln Pro Trp Thr His
    40                  45                   50cct ggc cag agc cag ctg ttt gca gac ctg agc cga gag gag ctg acg      367Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser Arg Glu Glu Leu Thr
55                  60                  65gct gtg atg cgc ttt ctg acc cag cgg ctg ggg cca ggg ctg gtg gat      415Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly Pro Gly Leu Val Asp70                  75                  80                  85gca gcc cag gcc cgg ccc tcg gac aac tgt gtc ttc tca gtg gag ttg      463Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val Phe Ser Val Glu Leu
            90                  95                  100cag ctg cct ccc aag gct gca gcc ctg gct cac ttg gac agg ggg agc      511Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His Leu Asp Arg Gly Ser
        105                 110                 115ccc cca cct gcc cgg gag gca ctg gcc atc gtc ttc ttt ggc agg caa      559Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val Phe Phe Gly Arg Gln
    120                 125                 130ccc cag ccc aac gtg agt gag ctg gtg gtg ggg cca ctg cct cac ccc      607Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly Pro Leu Pro His Pro
135                 140                 145tcc tac atg cgg gac gtg act gtg gag cgt cat gga ggc ccc ctg ccc      655Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His Gly Gly Pro Leu Pro150                 155                 160                 165tat cac cga cgc ccc gtg ctg ttc caa gag tac ctg gac ata gac cag      703Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr Leu Asp Ile Asp Gln
            170             175                     180atg atc ttc aac aga gag ctg ccc cag gct tct ggg ctt ctc cac cac      751Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Leu His His
        185                 190                 195tgt tgc ttc tac aag cac cgg gga cgg aac ctg gtg aca atg acc acg      799Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu Val Thr Met Thr Thr
    200                 205                 210gct ccc cgt ggt ctg caa tca ggg gac cgg gcc acc tgg ttt ggc ctc      847Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala Thr Trp Phe Gly Leu
215                 220                 225tac tac aac atc tcg ggc gct ggg ttc ttc ctg cac cac gtg ggc ttg      895Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu His His Val Gly Leu230                 235                 240                 245gag ctg cta gtg aac cac aag gcc ctt gac cct gcc cgc tgg act atc      943Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro Ala Arg Trp Thr Ile
            250                 255                260cag aag gtg ttc tat caa ggc cgc tac tac gac agc ctg gcc cag ctg      991Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Gln Leu
        265                 270                 275gag gcc cag ttt gag gcc ggc ctg gtg aat gtg gtg ctg atc cca gac      1039Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val Val Leu Ile Pro Asp
    280                 285                 290aat ggc aca ggt ggg tcc tgg tcc ctg aag tcc cct gtg ccc ccg ggt      1087Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser Pro Val Pro Pro Gly
295                 300                 305cca gct ccc cct cta cag ttc tat ccc caa ggc ccc cgc ttc agt gtc      1135Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly Pro Arg Phe Ser Val310                 315                 320                 325cag gga agt cga gtg gcc tcc tca ctg tgg act ttc tcc ttt ggc ctc      1183Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr Phe Ser Phe Gly Leu
            330                 335                 340gga gca ttc agt ggc cca agg atc ttt gac gtt cgc ttc caa gga gaa      1231Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val Arg Phe Gln Gly Glu
        345                 350                 355aga cta gtt tat gag ata agc ctc caa gag gcc ttg gcc atc tat ggt      1279Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Gly
    360                 365                 370gga aat tcc cca gca gca atg acg acc cgc tat gtg gat gga ggc ttt      1327Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr Val Asp Gly Gly Phe
375                 380                 385ggc atg ggc aag tac acc acg ccc ctg acc cgt ggg gtg gac tgc ccc      1375Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg Gly Val Asp Cys Pro390                 395                 400                 405tac ttg gcc acc tac gtg gac tgg cac ttc ctt ttg gag tcc cag gcc     1423Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu Leu Glu Ser Gln Ala
            410                 415                 420ccc aag aca ata cgt gat gcc ttt tgt gtg ttt gaa cag aac cag ggc     1471Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe Glu Gln Asn Gln Gly
        425                 430                 435ctc ccc ctg cgg cga cac cac tca gat ctc tac tcg cac tac ttt ggg     1519Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr Ser His Tyr Phe Gly
    440                 445                 450ggt ctt gcg gaa acg gtg ctg gtc gtc aga tct atg tcc acc ttg ctc     1567Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser Met Ser Thr Leu Leu
455                 460                 465aac tat gac tat gtg tgg gat acg gtc ttc cac ccc agt ggg gcc ata     1615Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His Pro Ser Gly Ala Ile470                 475                 480                 485gaa ata cga ttc tat gcc acg ggc tac atc agc tcg gca ttc ctc ttt     1663Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser Ser Ala Phe Leu Phe
            490                 495                 500ggt gct act ggg aag tac ggg aac caa gtg tca gag cac acc ctg ggc     1711Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser Glu His Thr Leu Gly
        505                 510                 515acg gtc cac acc cac agc gcc cac ttc aag gtg gat ctg gat gta gca     1759Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val Asp Leu Asp Val Ala
    520                 525                 530gga ctg gag aac tgg gtc tgg gcc gag gat atg gtc ttt gtc ccc atg     1807Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met Val Phe Val Pro Met
535                 540                 545gct gtg ccc tgg agc cct gag cac cag ctg cag agg ctg cag gtg acc     1855Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln Arg Leu Gln Val Thr550                 555                 560                 565cgg aag ctg ctg gag atg gag gag cag gcc gcc ttc ctc gtg gga agc     1903Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser
            570                 575                 580gcc acc cct cgc tac ctg tac ctg gcc agc aac cac agc aac aag tgg     1951Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn His Ser Asn Lys Trp
        585                 590                 595ggt cac ccc cgg ggc tac cgc atc cag atg ctc agc ttt gct gga gag     1999Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu Ser Phe Ala Gly Glu
    600                 605                 610ccg ctg ccc caa aac agc tcc atg gcg aga ggc ttc agc tgg gag agg     2047Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly Phe Ser Trp Glu Arg
615                 620                 625tac cag ctg gct gtg acc cag cgg aag gag gag gag ccc agt agc agc     2095Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser630                 635                 640                 645agc gtt ttc aat cag aat gac cct tgg gcc ccc act gtg gat ttc agt     2143Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro Thr Val Asp Phe Ser
            650                 655                 660gac ttc atc aac aat gag acc att gct gga aag gat ttg gtg gcc tgg     2191Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys Asp Leu Val Ala Trp
        665                 670                 675gtg aca gct ggt ttt ctg cat atc cca cat gca gag gac att cct aac     2239Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala Glu Asp Ile Pro Asn
    680                 685                 690aca gtg act gtg ggg aac ggc gtg ggc ttc ttc ctc cga ccc tat aac     2287Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe Leu Arg Pro Tyr Asn
695                 700                 705ttc ttt gac gaa gac ccc tcc ttc tac tct gcc gac tcc atc tac ttc     2335Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala Asp Ser Ile Tyr Phe710                 715                 720                 725cga ggg gac cag gat gct ggg gcc tgc gag gtc aac ccc cta gct tgc     2383Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val Asn Pro Leu Ala Cys
            730                 735                 740ctg ccc cag gct gct gcc tgt gcc ccc gac ctc cct gcc ttc tcc cac     2431Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu Pro Ala Phe Ser His
        745                 750                 755ggg ggc ttc tct cac aac tag gcggtcctgg gatggggcat gtggccaagg        2482Gly Gly Phe Ser His Asn
    760gctccagggc cagggtgtga gggatgggga gcagctgggc actgggccgg cagcctggtt   2542ccctctttcc tgtgccagga ctctctttct tccactaccc tccctcgcat ccgcctctga   2602gccaggagcc tcctgaccct gtgatgcctg acacagggga cactgaacct tgttgatgcc   2662agctgtactg agttctcatc cacagaggcc aggcatggcc cagcctggag ccgtggccga   2722gggcttccct agatggttcc ctttgttgct gtctggcttt cccgaatctt tttaggccac   2782ctccaaggac tctaaaaggg ggctattccc tggagacccc agagtagggt tgccagtcct   2842gcaagtccat agctgagctg gaaaggatgc ttctgctcac attccctctc atccaggtcc   2902tttccttctc gtcttcctct ctctcaccta cttcctcctc ctcctcctgt tcctgccttc   2962tcttctatcc tgcaatttct cccgaatcct gaggggatat ccctatgtcc cagcccctgg   3022tactccccca gccctcagtt ttcagtcaag ttccgtctcc tctccagccc tatggaagtc   3082tcaaggtcac gggaccccta atcagagtgg ccaatccctg tgtgtcgttc ccttgtgtct   3142gttgcttatt gggagtagga gttgctccta cccctgtcct ggggctgggt gtgtttcagg   3202acagctgctt ctgtgcattt gtgtctgcct gcctcatgct ctctatagag gaggatggtc   3262atcgtgacag cagcagctca agttagcatt tcaagtgatt tgggggtgca atgataatga   3322agaatggcca ttttgtacca gggctctgta ttctgcaaca gcctgtttgg gaggctggag   3382tggaaacaaa gggtgggcat caaagatgag aagccaaagc ccctacaact ccagccaccc   3442agccaggagg ggctgtccaa tcacattcag gcatgcgaat gagctgggcc ctgggtgagg   3502tgggggtctg gcctagtggg gaggggcctg gcctgggtgg ggcagggcct ggcctggtcc   3562aggcttgggc tccattccca tcactgctgt ccctcctgag gtctggattg gggatgggga   3622caaagaaata gcaagagatg agaaacaaca gaaacttttt tctctaaagg actggttaaa   3682tcaattctga tacagcctta caatacaata gtatgcagct aaaaaataat tgtatgtctt   3742tatatactaa tatgtaataa tcttcaggtg aaaaaggcaa gccacagaaa tgtgtatagc    3802gcacttccca tttgtgtttc agaaaggagt agaatataaa cacataattg cttatgtatg    3862cctattcaga ataaatgggt aacactgatt acttttggga ggggaaccag taggttgagg    3922acaggagagg gaagggtctt aacacttaca cccttttgta cattttgaat tttgaaccat    3982gtgactgtat tacctattca ggataaacaa taaatgggcc caaaaaaaaa aaaaaaaa      4040<210>2<211>763<212>PRT<213>人<400>2Met Asn Gln Lys Thr Ile Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Val Ile Thr1               5                   10                  15Ile Phe Ala Leu Val Cys Val Leu Leu Val Gly Arg Gly Gly Asp Gly
        20                  25                  30Gly Glu Pro Ser Gln Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala
    35                  40                  45Gln Pro Trp Thr His Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser
50                  55                  60Arg Glu Glu Leu Thr Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly65                  70                  75                  80Pro Gly Leu Val Asp Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val
            85                  90                  95Phe Ser Val Glu Leu Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His
        100                 105                 110Leu Asp Arg Gly Ser Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val
    115                 120                 125Phe Phe Gly Arg Gln Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly
130                 135                 140Pro Leu Pro His Pro Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His145                 150                 155                 160Gly Gly Pro Leu Pro Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr
            165                 170                 175Leu Asp Ile Asp Gln Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser
        180                 185                 190Gly Leu Leu His His Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu
    195                 200                 205Val Thr Met Thr Thr Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala
210                 215                 220Thr Trp Phe Gly Leu Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu225                 230                 235                 240His His Val Gly Leu Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro
            245                 250                 255Ala Arg Trp Thr Ile Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp
        260                 265                 270Ser Leu Ala Gln Leu Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val
    275                 280                 285Val Leu Ile Pro Asp Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser
290                 295                 300Pro Val Pro Pro Gly Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly305                 310                 315                 320Pro Arg Phe Ser Val Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr
            325                 330                 335Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg lle Phe Asp Val
        340                 345                 350Arg Phe Gln Gly Glu Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala
    355                 360                 365Leu Ala Ile Tyr Gly Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr
370                 375                 380Val Asp Gly Gly Phe Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg385                 390                 395                 400Gly Val Asp Cys Pro Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu
            405                 410                 415Leu Glu Ser Gln Ala Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe
        420                 425                 430Glu Gln Asn Gln Gly Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr
    435                 440                 445Ser His Tyr Phe Gly Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser
450                 455                 460Met Ser Thr Leu Leu Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His465                 470                 475                 480Pro Ser Gly Ala Ile Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser
            485                 490                 495Ser Ala Phe Leu Phe Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser
        500                 505                 510Glu His Thr Leu Gly Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val
    515                 520                 525Asp Leu Asp Val Ala Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met
530                 535                 540Val Phe Val Pro Met Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln545                 550                 555                 560Arg Leu Gln Val Thr Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala
            565                 570                 575Phe Leu Val Gly Ser Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn
        580                 585                 590His Ser Asn Lys Trp Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu
    595                 600                 605Ser Phe Ala Gly Glu Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly
610                 615                 620Phe Ser Trp Glu Arg Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu625                 630                 635                 640Glu Pro Ser Ser Ser Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro
            645                 650                 655Thr Val Asp Phe Ser Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys
        660                 665                 670Asp Leu Val Ala Trp Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala
    675                 680                 685Glu Asp Ile Pro Asn Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe
690                 695                 700Leu Arg Pro Tyr Asn Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala705                 710                 715                 720Asp Ser Ile Tyr Phe Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val
            725                 730                 735Asn Pro Leu Ala Cys Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu
        740                 745                 750Pro Ala Phe Ser His Gly Gly Phe Ser His Asn
    755                 760<210>3<211>739<212>DNA<213>S.japonicum<220><221>CDS<222>(17)..(673)<300><308>GenBank/M14654<309>1994-03-14<400>3tttaggtaac ttggtc atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc     52
              Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly
              1               5                   10ctt gtg caa ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat      100Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr
    15                  20                  25gaa gag cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa      148Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys
30                  35                  40aag ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat      196Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp45                  50                  55                  60ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct      244Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala
            65                  70                  75gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att      292Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile
        80                  85                  90tca atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga      340Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg
    95                  100                 105att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc      388Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser
110                 115                 120aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa      436Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys125                 130                 135                 140aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat      484Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr
            145                 150                 155gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg      532Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala
        160                 165                 170ttc cca aaa tta gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa      580Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln
    175                 180                 185att gat aag tac ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag      628Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln
190                 195                 200ggc tgg caa gcc acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa taa          673Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys205                 210                 215attaagaatg attgttttag taaacattat ttatcactta caattaaact aaatataaat    733gtcgac                                                               739<210>4<211>218<212>PRT<213>S.japonicum<400>4Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1               5                   10                  15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
        20                  25                  30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
    35                  40                  45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50                  55                  60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65                  70                  75                  80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
            85                  90                  95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
        100                 105                 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
    115                 120                 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130                 135                 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145                 150                 155                 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
            165                 170                 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
        180                 185                 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
    195                 200                 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys
210                 215<210>5<211>217<212>PRT<213>S.japonicum<400>5Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro Thr1               5                   10                  15Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu Tyr
        20                  25                  30Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu Gly
    35                  40                  45Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys Leu
50                  55                  60Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn Met65                  70                  75                  80Leu Gly Gly Ser Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly
            85                  90                  95Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys
        100                 105                 110Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met
    115                 120                 125Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Ser His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly
130                 135                 140Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val145                 150                 155                 160Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val
            165                 170                 175Ser Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu
        180                 185                 190Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr
    195                 200                 205Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys
210                 215<210>6<211>6<212>PRT<213>未知<220><223>蛋白酶裂解位点<400>6Glu Ala Leu Phe Gln Gly1               5<210>7<211>43<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>7ccggaattcc aacgcgtcca tgaaccagaa gacaatcctc gtg                      43<210>8<211>45<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>8cccccaagct tgtcgactca ctagttgtga gagagaagcc ccccc                     45<210>9<211>36<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>9gaggaagctt tgttccaagg tggagatggg ggtgaa                               36<210>10<211>21<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>10gcattctagt tgtggtttgt c                                      21<210>11<211>37<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>11gccggaattc gacgcgtccc ctatactagg ttattgg                       37<210>12<211>37<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>12ctctgcgcgc tcttttggag aacccaacat gttgtgc                         37<210>13<211>40<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>13ggttctccaa aagagcgcgc agagatttca atgcttgaag                      40<210>14<211>36<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>14atgagataaa cggtcttcga acattttcag catttc                              36<210>15<211>44<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>15gttcgaagac cgtttatctc ataaaacata tttaaatggt gatc                    44<210>16<211>33<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>16aaaagaaact agttttggga acgcatccag gca                            33<210>17<211>40<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>17cccaaaacta gtttctttta aaaaacgtat tgaagctatc            40<210>18<211>44<212>DNA<213>未知<220><223>PCR引物<400>18acccaagctt cctgactttg tgactttgga ggatggtcgc cacc       44<210>19<211>3000<212>DNA<213>未知<220><223>重组构建体<220><221>CDS<222>(1)..(3000)<400>19atg gat tgg ctg cgg aac ttg cta ttc ctg atg gcg gcc gct caa agt       48Met Asp Trp Leu Arg Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser1               5                   10                  15atc aac gcc gcg caa cac gat gaa gcc gta gac aac aaa ttc aac aaa       96Ile Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys
        20                  25                  30gaa caa caa aac gcg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc       144Glu Gln Gln Asn Ala Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly
    35                  40                  45ctt gtg caa ccc act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat       192Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr
50                  55                  60gaa gag cat ttg tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa       240Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys65                  70                  75                  80aag ttt gaa ttg ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat      288Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
            85                  90                  95ggt gat gtt aaa tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct      336Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala
        100                 105                 110gac aag cac aac atg ttg ggt ggt tct cca aaa gag cgc gca gag att      384Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Ser Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile
    115                 120                 125tca atg ctt gaa gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga      432Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg
130                 135                 140att gca tat agt aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc      480Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser145                 150                 155                 160aag cta cct gaa atg ctg aaa atg ttc gaa gac cgt tta tct cat aaa      528Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Ser His Lys
            165                 170                 175aca tat tta aat ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat      576Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr
        180                 185                 190gac gct ctt gat gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg      624Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala
    195                 200                 205ttc cca aaa cta gtt tct ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa      672Phe Pro Lys Leu Val Ser Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln
210                 215                 220att gat aag tac ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag      720Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln225                 230                 235                 240ggc tgg caa gcc acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aag tca caa      768Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Gln
            245                 250                 255agt cag gaa gct ttg ttc caa ggt gga gat ggg ggt gaa ccc agc cag      816Ser Gln Glu Ala Leu Phe Gln Gly Gly Asp Gly Gly Glu Pro Ser Gln
        260                 265                 270ctt ccc cat tgc ccc tct gta tct ccc agt gcc cag cct tgg aca cac      864Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala Gln Pro Trp Thr His
    275                 280                 285cct ggc cag agc cag ctg ttt gca gac ctg agc cga gag gag ctg acg      912Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser Arg Glu Glu Leu Thr
290                 295                 300gct gtg atg cgc ttt ctg acc cag cgg ctg ggg cca ggg ctg gtg gat      960Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly Pro Gly Leu Val Asp305                 310                 315                 320gca gcc cag gcc cgg ccc tcg gac aac tgt gtc ttc tca gtg gag ttg     1008Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val Phe Ser Val Glu Leu
            325                 330                 335cag ctg cct ccc aag gct gca gcc ctg gct cac ttg gac agg ggg agc     1056Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His Leu Asp Arg Gly Ser
        340                 345                 350ccc cca cct gcc cgg gag gca ctg gcc atc gtc ttc ttt ggc agg caa     1104Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val Phe Phe Gly Arg Gln
    355                 360                 365ccc cag ccc aac gtg agt gag ctg gtg gtg ggg cca ctg cct cac ccc     1152Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly Pro Leu Pro His Pro
370                 375                 380tcc tac atg cgg gac gtg act gtg gag cgt cat gga ggc ccc ctg ccc     1200Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His Gly Gly Pro Leu Pro385                 390                 395                 400tat cac cga cgc ccc gtg ctg ttc caa gag tac ctg gac ata gac cag     1248Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr Leu Asp Ile Asp Gln
            405             410                     415atg atc ttc aac aga gag ctg ccc cag gct tct ggg ctt ctc cac cac     1296Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Leu His His
        420                 425                 430tgt tgc ttc tac aag cac cgg gga cgg aac ctg gtg aca atg acc acg     1344Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu Val Thr Met Thr Thr
    435                 440                 445gct ccc cgt ggt ctg caa tca ggg gac cgg gcc acc tgg ttt ggc ctc     1392Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala Thr Trp Phe Gly Leu
450                 455                 460tac tac aac atc tcg ggc gct ggg ttc ttc ctg cac cac gtg ggc ttg     1440Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu His His Val Gly Leu465                 470                 475                 480gag ctg cta gtg aac cac aag gcc ctt gac cct gcc cgc tgg act atc     1488Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro Ala Arg Trp Thr Ile
            485                 490                 495cag aag gtg ttc tat caa ggc cgc tac tac gac agc ctg gcc cag ctg     1536Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Gln Leu
        500                 505                 510gag gcc cag ttt gag gcc ggc ctg gtg aat gtg gtg ctg atc cca gac     1584Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val Val Leu Ile Pro Asp
    515                 520                 525aat ggc aca ggt ggg tcc tgg tcc ctg aag tcc cct gtg ccc ccg ggt     1632Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser Pro Val Pro Pro Gly
530                 535                 540cca gct ccc cct cta cag ttc tat ccc caa ggc ccc cgc ttc agt gtc     1680Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly Pro Arg Phe Ser Val545                 550                 555                 560cag gga agt cga gtg gcc tcc tca ctg tgg act ttc tcc ttt ggc ctc     1728Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr Phe Ser Phe Gly Leu
            565                 570                 575gga gca ttc agt ggc cca agg atc ttt gac gtt cgc ttc caa gga gaa     1776Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val Arg Phe Gln Gly Glu
        580                 585                 590aga cta gtt tat gag ata agc ctc caa gag gcc ttg gcc atc tat ggt     1824Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Gly
    595                 600                 605gga aat tcc cca gca gca atg acg acc cgc tat gtg gat gga ggc ttt     1872Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr Val Asp Gly Gly Phe
610                 615                 620ggc atg ggc aag tac acc acg ccc ctg acc cgt ggg gtg gac tgc ccc      1920Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg Gly Val Asp Cys Pro625                 630                 635                 640tac ttg gcc acc tac gtg gac tgg cac ttc ctt ttg gag tcc cag gcc      1968Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu Leu Glu Ser Gln Ala
            645                 650                 655ccc aag aca ata cgt gat gcc ttt tgt gtg ttt gaa cag aac cag ggc      2016Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe Glu Gln Asn Gln Gly
        660                 665                 670ctc ccc ctg cgg cga cac cac tca gat ctc tac tcg cac tac ttt ggg      2064Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr Ser His Tyr Phe Gly
    675                 680                 685ggt ctt gcg gaa acg gtg ctg gtc gtc aga tct atg tcc acc ttg ctc      2112Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser Met Ser Thr Leu Leu
690                 695                 700aac tat gac tat gtg tgg gat acg gtc ttc cac ccc agt ggg gcc ata      2160Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His Pro Ser Gly Ala Ile705                 710                 715                 720gaa ata cga ttc tat gcc acg ggc tac atc agc tcg gca ttc ctc ttt      2208Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser Ser Ala Phe Leu Phe
            725                 730                 735ggt gct act ggg aag tac ggg aac caa gtg tca gag cac acc ctg ggc      2256Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser Glu His Thr Leu Gly
        740                 745                 750acg gtc cac acc cac agc gcc cac ttc aag gtg gat ctg gat gta gca      2304Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val Asp Leu Asp Val Ala
    755                 760                 765gga ctg gag aac tgg gtc tgg gcc gag gat atg gtc ttt gtc ccc atg      2352Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met Val Phe Val Pro Met
770                 775                 780gct gtg ccc tgg agc cct gag cac cag ctg cag agg ctg cag gtg acc      2400Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln Arg Leu Gln Val Thr785                 790                 795                 800cgg aag ctg ctg gag atg gag gag cag gcc gcc ttc ctc gtg gga agc     2448Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser
            805                 810                 815gcc acc cct cgc tac ctg tac ctg gcc agc aac cac agc aac aag tgg     2496Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn His Ser Asn Lys Trp
        820                 825                 830ggt cac ccc cgg ggc tac cgc atc cag atg ctc agc ttt gct gga gag     2544Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu Ser Phe Ala Gly Glu
    835                 840                 845ccg ctg ccc caa aac agc tcc atg gcg aga ggc ttc agc tgg gag agg     2592Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly Phe Ser Trp Glu Arg
850                 855                 860tac cag ctg gct gtg acc cag cgg aag gag gag gag ccc agt agc agc     2640Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser865                 870                 875                 880agc gtt ttc aat cag aat gac cct tgg gcc ccc act gtg gat ttc agt     2688Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro Thr Val Asp Phe Ser
            885                 890                 895gac ttc atc aac aat gag acc att gct gga aag gat ttg gtg gcc tgg     2736Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys Asp Leu Val Ala Trp
        900                 905                 910gtg aca gct ggt ttt ctg cat atc cca cat gca gag gac att cct aac     2784Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala Glu Asp Ile Pro Asn
    915                 920                 925aca gtg act gtg ggg aac ggc gtg ggc ttc ttc ctc cga ccc tat aac     2832Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe Leu Arg Pro Tyr Asn
930                 935                 940ttc ttt gac gaa gac ccc tcc ttc tac tct gcc gac tcc atc tac ttc     2880Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala Asp Ser Ile Tyr Phe945                 950                 955                 960cga ggg gac cag gat gct ggg gcc tgc gag gtc aac ccc cta gct tgc     2928Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val Asn Pro Leu Ala Cys
            965                 970                 975ctg ccc cag gct gct gcc tgt gcc ccc gac ctc cct gcc ttc tcc cac    2976Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu Pro Ala Phe Ser His
        980                 985                 990ggg ggc ttc tct cac aac tag tga                                    3000Gly Gly Phe Ser His Asn
    995<210>20<211>998<212>PRT<213>未知<400>20Met Asp Trp Leu Arg Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser1               5                   10                  15Ile Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys
        20                  25                  30Glu Gln Gln Asn Ala Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly
    35                  40                  45Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr
50                  55                  60Glu Glu His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys65                  70                  75                  80Lys Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp
            85                  90                  95Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala
        100                 105                 1l0Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Ser Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile
    115                 120                 125Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg
130                 135                 140Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser145                 150                 155                 160Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Ser His Lys
            165                 170                 175Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr
        180                 185                 190Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala
    195                 200                 205Phe Pro Lys Leu Val Ser Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln
210                 215                 220Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln225                 230                 235                 240Gly Trp Gln Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Gln
            245                 250                 255Ser Gln Glu Ala Leu Phe Gln Gly Gly Asp Gly Gly Glu Pro Ser Gln
        260                 265                 270Leu Pro His Cys Pro Ser Val Ser Pro Ser Ala Gln Pro Trp Thr His
    275                 280                 285Pro Gly Gln Ser Gln Leu Phe Ala Asp Leu Ser Arg Glu Glu Leu Thr
290                 295                 300Ala Val Met Arg Phe Leu Thr Gln Arg Leu Gly Pro Gly Leu Val Asp305                 310                 315                 320Ala Ala Gln Ala Arg Pro Ser Asp Asn Cys Val Phe Ser Val Glu Leu
            325                 330                 335Gln Leu Pro Pro Lys Ala Ala Ala Leu Ala His Leu Asp Arg Gly Ser
        340                 345                 350Pro Pro Pro Ala Arg Glu Ala Leu Ala Ile Val Phe Phe Gly Arg Gln
    355                 360                 365Pro Gln Pro Asn Val Ser Glu Leu Val Val Gly Pro Leu Pro His Pro
370                 375                         380Ser Tyr Met Arg Asp Val Thr Val Glu Arg His Gly Gly Pro Leu Pro385                 390                 395                 400Tyr His Arg Arg Pro Val Leu Phe Gln Glu Tyr Leu Asp Ile Asp Gln
            405             410                     415Met Ile Phe Asn Arg Glu Leu Pro Gln Ala Ser Gly Leu Leu His His
        420                 425                 430Cys Cys Phe Tyr Lys His Arg Gly Arg Asn Leu Val Thr Met Thr Thr
    435                 440                 445Ala Pro Arg Gly Leu Gln Ser Gly Asp Arg Ala Thr Trp Phe Gly Leu
450                 455                 460Tyr Tyr Asn Ile Ser Gly Ala Gly Phe Phe Leu His His Val Gly Leu465                 470                 475                 480Glu Leu Leu Val Asn His Lys Ala Leu Asp Pro Ala Arg Trp Thr Ile
            485                 490                 495Gln Lys Val Phe Tyr Gln Gly Arg Tyr Tyr Asp Ser Leu Ala Gln Leu
        500                 505                 510Glu Ala Gln Phe Glu Ala Gly Leu Val Asn Val Val Leu Ile Pro Asp
    515                 520                 525Asn Gly Thr Gly Gly Ser Trp Ser Leu Lys Ser Pro Val Pro Pro Gly
530                 535                 540Pro Ala Pro Pro Leu Gln Phe Tyr Pro Gln Gly Pro Arg Phe Ser Val545                 550                 555                 560Gln Gly Ser Arg Val Ala Ser Ser Leu Trp Thr Phe Ser Phe Gly Leu
            565                 570                 575Gly Ala Phe Ser Gly Pro Arg Ile Phe Asp Val Arg Phe Gln Gly Glu
        580                 585                 590Arg Leu Val Tyr Glu Ile Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Gly
    595                 600                 605Gly Asn Ser Pro Ala Ala Met Thr Thr Arg Tyr Val Asp Gly Gly Phe
610                 615                 620Gly Met Gly Lys Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Arg Gly Val Asp Cys Pro625                 630                 635                 640Tyr Leu Ala Thr Tyr Val Asp Trp His Phe Leu Leu Glu Ser Gln Ala
            645                 650                 655Pro Lys Thr Ile Arg Asp Ala Phe Cys Val Phe Glu Gln Asn Gln Gly
        660                 665                 670Leu Pro Leu Arg Arg His His Ser Asp Leu Tyr Ser His Tyr Phe Gly
    675                 680                 685Gly Leu Ala Glu Thr Val Leu Val Val Arg Ser Met Ser Thr Leu Leu
690                 695                 700Asn Tyr Asp Tyr Val Trp Asp Thr Val Phe His Pro Ser Gly Ala Ile705                 710                 715                 720Glu Ile Arg Phe Tyr Ala Thr Gly Tyr Ile Ser Ser Ala Phe Leu Phe
            725                 730                 735Gly Ala Thr Gly Lys Tyr Gly Asn Gln Val Ser Glu His Thr Leu Gly
        740                 745                 750Thr Val His Thr His Ser Ala His Phe Lys Val Asp Leu Asp Val Ala
    755                 760                 765Gly Leu Glu Asn Trp Val Trp Ala Glu Asp Met Val Phe Val Pro Met
770                 775                 780Ala Val Pro Trp Ser Pro Glu His Gln Leu Gln Arg Leu Gln Val Thr785                 790                 795                 800Arg Lys Leu Leu Glu Met Glu Glu Gln Ala Ala Phe Leu Val Gly Ser
            805                 810                 815Ala Thr Pro Arg Tyr Leu Tyr Leu Ala Ser Asn His Ser Asn Lys Trp
        820                 825                 830Gly His Pro Arg Gly Tyr Arg Ile Gln Met Leu Ser Phe Ala Gly Glu
    835                 840                 845Pro Leu Pro Gln Asn Ser Ser Met Ala Arg Gly Phe Ser Trp Glu Arg
850                 855                 860Tyr Gln Leu Ala Val Thr Gln Arg Lys Glu Glu Glu Pro Ser Ser Ser865                 870                 875                 880Ser Val Phe Asn Gln Asn Asp Pro Trp Ala Pro Thr Val Asp Phe Ser
            885                 890                 895Asp Phe Ile Asn Asn Glu Thr Ile Ala Gly Lys Asp Leu Val Ala Trp
        900                 905                 910Val Thr Ala Gly Phe Leu His Ile Pro His Ala Glu Asp Ile Pro Asn
    915                 920                 925Thr Val Thr Val Gly Asn Gly Val Gly Phe Phe Leu Arg Pro Tyr Asn
930                 935                 940Phe Phe Asp Glu Asp Pro Ser Phe Tyr Ser Ala Asp Ser Ile Tyr Phe945                 950                 955                 960Arg Gly Asp Gln Asp Ala Gly Ala Cys Glu Val Asn Pro Leu Ala Cys
            965                 970                 975Leu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Ala Pro Asp Leu Pro Ala Phe Ser His
        980                 985                 990Gly Gly Phe Ser His Asn
    995

Claims (26)

1.含有编码可分泌的融合蛋白质的核苷酸序列的核酸，所述融合蛋白，质包含：
(i)指导所述融合蛋白质从宿主细胞中分泌出来的信号肽；
(ii)可溶形式的人氨基脲-敏感性胺氧化酶(SSAO)；
(iii)能够使可溶形式的人SSAO二聚体化的融合配偶体；
(iv)位于可溶形式的人SSAO和融合配偶体之间的蛋白酶裂解位点。
2.如权利要求1所述的核酸，其中所述可溶形式的人SSAO含有SEQ IA NO：2的第29至763位的氨基酸或其片段。
3.如权利要求2所述的核酸，其中所述融合蛋白质具有苄胺氧化酶活性。
4.如权利要求2所述的核酸，其中所述可溶形式的人SSAO含有SEQ ID NO：2的29至763位氨基酸。
5.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白质缺乏人SSAO的跨膜区域。
6.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白质缺乏SEQ IDNO：2的第6至26位氨基酸。
7.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合配偶体被融合到可溶形式的人SSAO的N-端部分。
8.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合配偶体是谷胱甘肽S-转移酶或其功能上等同的变异体。
9.如权利要求8所述的核酸，其中所述融合配偶体是日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶的变异体，所述变异体至少一个位于85、138和178位点上的半胱氨酸被另一个氨基酸残基所取代。
10.如权利要求8所述的核酸，其中所述融合配偶体合有SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的核酸，其中所述信号肽是小鼠IgG1重链信号肽。
12.如权利要求1所述的核酸，其中所述蛋白酶裂解位点是3C蛋白酶裂解位点。
13.如权利要求12所述的核酸，其中所述3C蛋白酶裂解位点含有氨基酸序列EALFQG(SEQ ID NO：6)。
14.如权利要求1所述的核酸，其中所述融合蛋白质含有SEQ IDNO：20的氨基酸序列。
15.含有权利要求1所述核酸的表达载体。
16.含有权利要求14所述核酸的表达载体。
17.用于纯化重组人SSAO的方法，该方法包括：
(i)用权利要求15所述的表达载体转染细胞；
(ii)在培养基中以及能够使由所述表达载体编码的融合蛋白质分泌到细胞培养基中的条件下培养所述细胞；
(iii)使分泌出的融合蛋白质与对所述融合配偶体具有亲和性的配体结合；
(iv)分离所述的融合配偶体和可溶形式的人SSAO；和
(v)回收可溶形式的人SSAO。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述对所述融合配偶体具有亲和性的配体是谷胱甘肽或其衍生物。
19.如权利要求17所述的方法，其中通过蛋白酶裂解将所述融合配偶体与可溶形式的人SSAO分离开来。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白酶是细小核糖核酸病毒3C蛋白酶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述蛋白酶是鼻病毒3C蛋白酶。
22如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白酶被融合到融合配偶体上从而产生融合蛋白酶。
23.如权利要求22所述的方法，其中通过包括将所述融合蛋白酶与对所述融合蛋白酶具有亲和性的配体相结合的方法来从可溶形式的人SSAO中分离出所述的融合蛋白酶。
24.用于分离固定化重组人SSAO的方法，该方法包括：
(i)用权利要求15所述的表达载体转染细胞；
(ii)在培养基中以及能够使由所述表达载体编码的融合蛋白质分泌到细胞培养基中的条件下培养所述细胞；
(iii)使分泌出的融合蛋白质与对所述融合配偶体具有亲和性的配体结合由此固定融合蛋白质。
25.由权利要求1的核酸编码的融合蛋白质。
26.权利要求25所述的融合蛋白质，其中所述融合蛋白质被固定在对所述融合配偶体具有亲和性的配体上。
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