KR0150000B1 - 사람 macif 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 발현 벡터, 형질전환 세포 및 사람 macif 활성을 갖는 단백질 - Google Patents

사람 macif 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 발현 벡터, 형질전환 세포 및 사람 macif 활성을 갖는 단백질

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KR0150000B1 KR1019900005532A KR900005532A KR0150000B1 KR 0150000 B1 KR0150000 B1 KR 0150000B1 KR 1019900005532 A KR1019900005532 A KR 1019900005532A KR 900005532 A KR900005532 A KR 900005532A KR 0150000 B1 KR0150000 B1 KR 0150000B1
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모리오카 시게오
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Abstract

내용없음

Description

사람 MACIF 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 발현 백터, 형질전환 세포 및 사람 MACIF 활성을 갖는 단백질
제1도는 사람 백혈구로부터 분리되는, 천연의 사람 MACIF를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 나타내는 것이다.
제2도는 제1도에서 도시된 유전자의 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 아미노산 서열을 나타내는 것이다.
제3도는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 사용하기 위한 발현백터 pKK223-3의 전체 구조를 나타내는 것이다.
제4도는 CHO 세포내에서 사용하기 위한 발현벡터 pVY1의 전체 구조를 나타내는 것이다.
제5도는 기니아 피그(guinea pig) 적혈구에서의 이의 항용혈 활성에 대한 몇몇 해독산물의 시험 결과를 나타내는 것이다.
제6도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 해독 산물의 억제활성에 대한 용량 의존성, 및 항-사람 MACIF 항체에 의한 산물의 중화 결과를 나타내는 것이다.
제7도는 발현벡터 pVY1 작제도이다.
제8도는 형질전환체 CHO 세포에서의 재조함 사람 MACIF 발현에 대한 유동 세포 계수 분석을 나타내는 것이다.
제9도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 형질전환체 CHO 세포에서 발현된 재조함 사람 MACIF의 억제활성에 대한 용량 의존성, 및 항-사람 MACIF 항체로 실시한 이의 중화 결과를 나타내는 것이다.
제10도는 에스케리키아 콜라이 내에서 발현시키기 위한 벡터 pYEJ001의 전체 구조이다.
제11도는 Q-세파로스를 사용하여 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(E103)을 정제한 결과를 나타내는 것이다.
제12도는 Q-세파로스를 사용하여 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 E103을 정제하여 수득한 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 것이다.
제13도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 에스 케리챠 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 E103의 억제 활성에 대한 용량의존성, 및 항-사람 MACIF 항체에 의한 이의 중화 결과를 나타내는 것이다.
제14도는 Q-세파로스를 사용하여 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(E86)을 정제한 결과를 나타내는 것이다.
제15도는 Q-세파로스를 사용하여 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 E86을 정제하여 수득한 분획의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 것이다.
제16도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 E86의 억제 활성에 대한 용량 의존성, 및 항-사람 MACIF 항체에 의한 이의 중화 시험 결과를 나타내는 것이다.
제17도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 형질 전환체 CHO 세포 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(C77)의 억제 활성에 대한 용량 의존성, 및 항-사람 MACIF 항체에 의한 이의 중화 시험 결과를 나타내는 것이다.
제18도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 형질 전환체 CHO 세포내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(C76)의 억제 활성에 대한 용량 의존성을 나타내는 것이다.
제19도는 기니아 피그 적혈구의 용혈에 있어서 형질 전환체 CHO 세포내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(C70)의 억제 활성에 대한 용량 의존성을 나타내는 것이다.
본 발명은 사람 MACIF(막 공격 복합체 억제 인자: membrane attatck complex inhibition factor) 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자, 당해 유전자가 각각 삽입된 발현 벡터로 형질 전환된 세포 및 사람 MACIF 활성을 지닌 단백질에 관한 것이다. 용어 사람 MACIF 활성을 지닌 단백질의 의미내에는 보체 활성화의 최종 단계에서 보체 시스템을 조절하고 막 공격 복합체 형성에 의한 사람 세포 및 조직의 상해를 억제하는 단백질 그룹이 포함된다.
본 발명자들은 이미, 보체 시스템을 조절하는 비공지된 단백질인 천연의 사람 MACIF를 사람의 정상 적혈구막으로부터 순수한 형태로 분리시키는데 성공했다. (일본국 특허원 제63-310642호.) 이들은, 사람 MACIF가 후기 보체 성분의 활성을 억제하거나, 다른 의미로, 사람 MAC 형성으로 인한 용혈작용을 억제하고, 이러한 관점에서, 사람 MACIF가 초기 보체 성분의 활성을 억제하는 공지의 보체-조절 물질과 구별되고 이보다 우수하다는 것 및 천연의 사람 MACIF가 하기의 N-말단 아미노산 서열을 가짐을 발견했다:
Figure kpo00001
또한, 이들은 천연의 사람 MACIF가 C 말단에 포스파티딜 이노시톨 앵커(anchor)(하기 PI 앵커로 약칭)를 지닌 분자량 18,000 ± 1,000( SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정)의 당단백질임을 발견했다.
사람 MACIF 활성을 지닌 상기-언급된 단백질에 관한 추가의 연구 및 이 단백질의 약제로서의 실제적 용도의 개발을 위해서는, 순수하고 균일한 형태의 단백질을 충분히 다량으로 수득해야만 한다. 이러한 목적을 위해, 재조합 DNA 기술의 적용이 가장 효과적인 방법인듯하다. 하지만, 이러한 방법에 필요한 유전자가 현대까지 분리되지 않았다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 사람 MACIF 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 사람 MACIF 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 유전자를 발현할 수 있는 복제가능한 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 발현 벡터로 형질전환된 미생물 또는 세포를 제공하는 것이다.
또다른 추가의 목적은 유전 공학적으로 조작된, 사람 MACIF 활성을 지닌 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명은 아미노산 서열이 하기 서열식(I)과 같고 사람 MACIF 활성을 지닌 폴리펩타이드를 각각 암호화하는 유전자를 제공한다:
Figure kpo00002
상기식에서, X 는 H, Met 또는 아미노산 서열
Figure kpo00003
을 나타내고, Y 는 OH 또는 아미노산 서열
Figure kpo00004
을 나타내거나 이 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1 내지 32개의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 유도된 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 상기 언급한 유전자를 각각 함유하는 발현벡터, 당해 벡터로 형질 전환된 미생물 또는 세포, 및 당해 미생물 또는 세포내에서 발현되고 사람 MACIF 활성을 지닌 유전공학적으로 조작된 단백질을 추가로 제공한다.
본 발명자들에 의해 사람 백혈구로부터 분리한 유전자의 한 예는 제1도에 도시된 DNA 서열에 의해 정의된 유전자이다. 이 유전자는 천연의 사람 MACIF의 생리학적 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열 및 천연의 사람 MACIF 전구체 아미노산 서열(분비 시그날 펩타이드 및 PI 앵커-결합 시그날 아미노산 서열을 포함)을 암호화하는 유전자를 포함한다.
분비 시그날 펩타이드-암호화 유전자는, 숙주세포내에서 생성되는 사람 MACIF 활성을 지니는 단백질을 세포로부터 방출시키는데 필요한 펩타이드를 암호화하는 유전자이며, PI 앵커-결합 시그날 아미노산 서열-암호화 유전자는, 사람 MACIF 활성을 갖는 단백질에 PI 앵커를 결합시키는데 필요한 소수성 아미노산 서열 부위를 암호화하는 유전자이다.
천연의 사람 MACIF의 정제된 형태의 C-말단 분석을 기준으로, 본 발명자들은 천연의 사람 MACIF에서, PI 앵커가 제2도에 도시된 아미노산 서열의 76번 아미노산(글루탐산) 잔기에 결합함을 발견했다. PI 앵커는 포스포-에탄올아민, 글리칸 및 포스파티딜 이노시톨(PI)로 구성된 기본구조를 갖는다. 포스포-에탄올아민의 아미노 그룹은 펩타이드의 C-말단 아미노산 잔기의 카복시 그룹에 결합하고, PI의 지방산 측쇄는 세포막에 결합한다. 이러한 방법으로, PI 앵커는 펩타이드를 세포막에 결합시키는 앵커로서 작용한다. 제2도에 도시된 아미노산 서열중에서, 위치-25의 메티오닌 잔기로부터 위치-1의 세린 잔기까지의 서열이 분비 시그날 서열이고, 위치 77의 아스파라긴 잔기로부터 위치 103의 프롤린 잔기까지의 서열이 PI 앵커-결합 시그날 서열임이 밝혀졌다. 따라서, 1 내지 76번 아미노산 잔기로 아루어진 아미노산 서열이 천연의 사람 MACIF의 펩타이드 코어(core)를 구성한다. 본 명세서에서, 용어 사람 MACIF란 1번 아미노산(루이신) 잔기 내지 76번 아미노산(글루탐산)잔기로 이루어진 펩타이드 및 이 펩타이드의 C 말단에 결합된 PI 앵커를 필수 성분으로하여 이루어진 특정 단백질을 의미한다. 이러한 사람 MACIF는 표현형적 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 따라, 또는 본원에서 사용된 세포의 배양 조건에 따라 각종 구조의 당(sugar) 쇄를 가질 수 있다. 당 쇄를 갖지 않는 사람 MACIF 뿐 아니라 특정 구조의 당 쇄를 갖는 사람 MACIF도 본 발명에 따른 사람 MACIF의 영역 내에 있다.
사람 MACIF의 생리적 활성을 지닌 약제로서 실제 사용하기 위해, 단백질은 상기 언급된 사람 MACIF의 모든 구성요소를 가질 필요는 없다. PI 앵커가 결여될수 있거나, 사람 MACIF 활성을 갖는다는 조건하에서, 사람 MACIF와 아미노산 서열이 부분적으로 상이할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 목적 단백질은 또한 서열 MACIF와 유사한 생리적 활성을 지니지만, 사람 MACIF의 아미노산 서열의 일부가 결여되었거나 몇몇 다른 아미노산 서열로 대체되었고, 몇몇 아미노산 서열이 첨가되거나 삽입되었으며, 이들이 PI 앵커를 지니지 않고/않거나 이들이 탄수화물 쇄를 지니지 않거나 탄수화물의 종류에 있어서 상이하다는 점에서 사람 MACIF와는 상이한 단백질을 포함한다. 본 명세서에서, 이들 목적 단백질은 변형된 사람 MACIF 단백질로서 언급된다.
본 발명에 의해 제공되는 유전자는 상기 언급된 사람 MACIF 및 변형된 사람 MACIF 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 변형된 사람 MACIF 단백질-암호화 유전자의 전형적 예로서, 상기 언급된 서열식(I)의 아미노산 서열의 1번 아미노산(루이신) 잔기 내지 70번 아미노산(Asn) 잔기의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열식(I)의 서열의 1번 내지 75번 아미노산(Leu) 잔기의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열식(I)의 서열의 1번 내지 77번 아미노산 잔기(Asn)의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열식(I)의 서열의 1번 내지 82번 아미노산(Leu) 잔기의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 및 서열식(I)의 서열의 1번 내지 86번 아미노산(Thr) 잔기의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 언급될 수 있다. 또한, 일반식(I)의 서열의 11번 내지 103번 아미노산 잔기(Pro)의 아미노산 서열을 암호 화하는 유전자도 언급될 수 있다. 보다 고등 동물 세포가 이의 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 때, 이 유전자는 PI 앵커가 76번 아미노산 잔기(Glu)에 결합 되어진 사람 MACIF를 생성하고, 세균 내에서 발현될 때, 예를 들어, 유전자는 103번 아미노산(Pro) 잔기까지의 펩타이드를 포함하는 변형된 사람 MACIF 단백질을 생성한다; 이 경우 PI 앵커 결합은 일어나지 않는다. 따라서, 편의상, 이러한 유전자는 변형된 단백질-암호화 유전자의 범주내에 포함된다. 또한, 사람 MACIF의 펩타이드 코어를 구성하는 76번 아미노산 잔기(Glu) 까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가, 벡터상에서 발현될 때, PI 앵커를 갖지 않는 가용성 사람 MACIF 폴리펩타이드 부분을 생성한다. 이러한 유전자가 또한 상기 정의한 변형된 단백질-암호화 유전자의 범주내에 포함될 수 있다. 상기에서 언급한 이들 유전자 이외에도, 1번부터 71번 내지 85번 아미노산 잔기까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자가 사람 MACIF 활성을 갖는 단백질을 제조할 수 있으므로 본 발명에 속하는 유전자 중에 포함된다.
본 발명에 따른 유전자는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 적합한 방법은, 사람 MACIF-생성 세포로부터 수득된 mRNA 로부터 제조한 cDNA 라이브러리로부터 사람 MACIF를 암호화하는 cDNA를 함유하는 클론을 분리시키고 이와 같이 분리된 클론으로부터 MACIF cDNA를 분리시키는 단계를 포함한다. 또다른 방법은, 본 명세서중에 기술된 바와 같이 사람 MACIF를 암호화하는 유전 정보를 기준으로, 예를 들어 포스포아미디트방법[참조; Hunkapiller, M. et al., Nature, 310, 105-111(1984)]에 의해 통상의 방식으로 핵산을 화학적으로 합성하는 단계를 포함한다. 상기 두 방법의 병합을 추가의 실시예로서 언급할 수 있다. 하기에서, mRNA를 이용하는 상기 언급된 방법을 좀 더 상세히 기술한다.
올리고뉴클레오타이드 탐침 제조
사람 적혈구로부터 분리되고 정제된, 천연의 사람 MACIF의 N-말단 아미노산 서열을 암호화하는 mRNA에 상보적인 올리고 데옥시리보뉴클레오타이드 탐침을, 예를 들어, 시판되는 DNA 합성기(예: Applied Biosystems의 모델 380A DNA 합성기)를 사용하여 포스포아미디트 방법에 의한 화학적 합성을 통해 제조한다.
cDNA 라이브러리 제조
(1) 원료 세포의 제조:
본 발명에 따른 사람 MACIF가 발현될 수 있는 어떠한 종류의 사람 세포도 본 발명의 실시에서 사람 MACIF mRNA용 재료로서 사용될 수 있다. mRNA가 고함량이어서 유리한 세포로는 사람 말초혈-유래된 백혈구 세포, 사람의 림프구 세포 및 다른 조직세포 뿐 아니라 이들로부터 제조된 적합한 세포주 들이다.
사람의 말초혈-유래된 백혈구 및 림프구는, 예를 들어 덱스트란 또는 피콜-하이파크( Ficoll-Hypaque)를 사용하여 밀도 구배 원심분리[참조: Bφyum, A., Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigations, 21, Supplement 97, 77-89(1968)]를 통해 정상인 사람-유래의 바피 코트(buffy coat)로부터 분리할 수 있다. 조직 세포는 통상의 방식으로 조직 균등질(homogenate)등으로부터 제조될 수 있다.
설정된 사람 세포주로서, 예를 들어, 사람 적아구성 백혈병 세포주(예: K562), 사람 B 세포 백혈병 세포주(예: Raji), 사람 T 세포 백혈병 세포주(예: MT-2), 사람 단핵구성 백혈병 세포주(예: U937, HL60) 및 이외의 조직암 세포주(예: 보위스 흑색종)가 언급될 수 있다. 하지만 사용되는 세포주는 이들에 제한되지는 않는다. 이들 세포주는 살크 인스티튜트 셀 뱅크(Salk Institute Cell Bank, California, U.S.A.) 및 다른 유사 기관으로부터 용이하게 구입가능하다. 세포는, 예를 들어 적합한 동물 세포 배양 배지(예: 시판되는 RPMI 1640 배지)를 사용하여 정치 배양, 스피너 배양 또는 로울러 병 배양의 방법으로 배양한다[참조; Moore, G.E. et al., Journal of American Medical Association, 199, 519-524(1967)].
일부의 경우, 배양하는 동안 세포를 자극시키면 사람 MACIF mRUN의 세포내 발현이 증가될 수 있다. 자극제로서 면역 복합체의 사용이 유리하다. 자극제로서,렉틴[예: 콘카나발린 A(ConA), 식물성 혈구 응집소(PHA)], 다양한 항원, 포르볼 에스테르 [특히, 12-0-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)] 및 생리적 자극인자(예: 인터루킨, 인터페론, 콜로니 자극인자) 등이 추가로 언급될 수 있다.
이들중 둘 또는 셋을 병용할 수 있다.
(2) mRNA 추출:
사람 MACIF-암호화 mRNA를 함유하는 RNA 분획은 통상의 방식으로 상기 언급된 어떠한 종류의 세포로부터도 추출될 수 있다. 예를 들어, 세포는 구아니딘-티오시아네이트 용액 또는 적합한 세제(예: SDS, NP-40, 트리톤 X-100, 데옥시콜린산)에 의하거나 균등질화(homogenization) 또는 용혈과 같은 물리적 방법에 의해 부분적으로 또는 완전히 분해되고/되거나 용해된다. 그런다음 염색체 DNA를 혼합기(예: 폴리트론) 또는 주사기로 어느정도 전단 작용을 가한 후 단백질로부터 핵산 분획을 분리시킨다. 이같은 분획화 공정에 특히 유용한 기술은 페놀 및 클로로포름을 이용한 추출 또는 염화세슘 밀도 구배 초원심분리 등의 기술이다[참조; Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry, 18. 5294-5299(1979); Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)].
상기 언급된 추출 방법에 있어서, 예를 들어 헤파린, 폴리비닐설페이트, 디에틸 피로카보네이트 도는 바나듐 복합체 같은 RNAase 억제제가 RNase에 의한 RNA 분해를 억제하기 위한 부가물로서 사용될 수 있다.
상기 추출 방법에 의해 수득된 RUN로부터의 mRNA의 분리 및 정제는, 예를 들어 올리고-dT-셀룰로스(Collaborative Research) 또는 폴리-U-세파로스(Pharmacia)의 흡수컬럼을 사용하거나 배치 방식으로 실시할 수 있다.
이와 같이 수득된 mRNA는 다양한 단백질을 암호화하는 mRNA의 혼합물이다. 따라서, cDNA 라이브러리 제조에 앞서 사람 MACIF에 상응하는 목적하는 mRNA에 대해 정제시키고 농축시킬 수 있다. 정제 및 농축은 하기와 같이 실시할 수 있다. 즉, 상기 방식으로 수득된 mRNA를 예를 들어 슈크로즈 밀도 구배 원심분리에 의해 분획화시키고, 생성된 분획을 도트 플롯 하이브리드화에 의해 목적하는 사람 MACIF mRNA의 존재에 대해 시험한다.
(3) cDNA 라이브러리 제조:
상기 방식으로 수득 정제된 mRNA는 일반적으로 불안정 하다. 따라서, 정제된 mRNA를 안정한 상보적 DNA(cDNA)로 전환(역전사)시킨 후, 미생물-유래된 레플리콘에 연결시켜 목적하는 유전자를 증폭시킨다. 시험관내 mRNA 전환은 오까야마 버그 방법[참조; Okayama, H. 및 Berg. P., Molecular and Cellular Biology, 2, 161-170(1982)]에 의해 일반적으로 실시될 수 있다.
따라서, 올리고-dT가 프라이머로서 사용되는데, 이는 유리 올리고-dT이거나 벡터 프라이머에 이미 부착된 형태이며, mRNA에 상보성인 일본쇄 cDNA는 mRNA를 주형으로하여 dNTP(dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)의 존재하에 역전사효소를 사용하여 합성한다. 다음 단계는 올리고 dT가 유리형태로 또는 벡터 프라이머에 부착된 형태로 사용되는지의 여부에 의존한다.
올리고 dT가 유리 형태로 사용되는 경우, 주형 mRNA는, 예를 들어 알칼리로 처리함으로서 이를 분해시켜 제거한 후, 주형으로서 일본쇄 DNA를 사용하여 역전사 효소 또는 DNA 폴리머라제 I의 존재하에 이본쇄 DNA를 합성한다. 생성된 이본쇄 DNA의 양 말단을 SI 뉴클레아제로 처리하고, 연결시 어닐링을 가능하게하는 적합한 링커 DNA 또는 다수의 염기를 각각의 말단에 첨가시킨후, 적합한 벡터, 예를 들어, EK 시스템 플라스미드 벡터(엄격한 유형이거나 완화된 유형), 또는 λgt 파지 벡터내에 삽입시킨다.
올리고 dT가 벡터 프라이머에 결합된 형태로 사용되는 경우에는, 주형으로서 작용하는 mRNA는 그대로 두고, 이에 가해지는 상기 언급된 바와 같은 링커를 지닌 개환된 환상 플라스미드를 링커 DNA(종중 세포내에서 자가복제할 수 있는 영역 및 mRNA 전사 프로모터 영역을 함유하는 DNA 단편)와 어닐링시켜 폐환 형태의 환을 생성한다. 그런 다음, dNTP와 동시에 RNase H 및 DNA 폴리머라제 I의 존재하에 mRNA를 DNA 쇄로 대체시켜 완전한 플라스미드 DNA를 생성한다.
상기 방법으로 수득된 cDNA-함유 플라스미드 벡터는 형질전환을 위해 숙주내로 도입될 수 있다. 전형적인 숙주는 에스케리키아 콜라이이다. 하지만 숙주는 이에 제한 된지는 않고, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 될 수도 있다.
당해분야에서 보편적으로 사용되는 다양한 방법, 예를 들어 주로 대수기의 세포를 수거하고, 이들이 자발적으로 DNA를 흡수하도록 염화칼슘으로 세포를 처리하여 세포가 플라스미드를 흡수하도록함으로써, 상술된 DNA를 도입시켜 숙주를 형질전환 시킬 수 있다. 상기 언급된 방법에 있어, 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 염화마그네슘 또는 염화루비듐을 형질 전환 효율을 더욱 향상시키기 위해 형질전환 시스템 내에 부가적으로 가할 수 있다. 또한 형질전환 이전에 숙주 세포를 스페로플라스트 또는 원형질체 상태로 전환시킬 수도 있다.
cDNA의 클로닝
목적하는 사람 MACIF cDNA를 수반하는 균주는, 예를 들어 하기 언급되는 방법과 같은 다양한 방법에 의해 상기 방식으로 수득된 형질전환체들로부터 검출될 수 있다.
(1) 합성 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용한 스크리닝:
본 발명의 경우에서처럼 목적하는 단백질의 아미노산 서열의 일부가 공지된 경우, 이 아미노산 서열 부위에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이것을 니트로셀룰로스 필터 상에서 변성되고 고정된 형질전환체-유래된 DNA와 하이브리드화시킴으로써 양성 균주를 검출하고 선별하기 위한 탐침(32P 또는35S로 표지시킨 후)으로서 사용한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 코돈 빈도 자료 또는 추정염기 서열의 조합을 토대로 유도된 염기 서열을 지닐 수 있다. 후자의 경우, 탐침의 수는 이노신을 삽입시킴으로서 감소시킬 수 있다.
(2) 사람 MACIF에 대한 항체를 사용한 선별:
cDNA를 형질전환체내에서 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터내로 미리 삽입시켜, 단백질 합성을 진행시키고, 항-사람 MACIF 항체 및 이 항체에 대한 2차 항체를 목적하는 사람 MACIF 생성 세포를 검출하고 선별하는데 사용한다.
(3) 다른 동물 세포내에서 사람 MACIF 생성에 의한 스크리닝:
형질전환체 균주를 유전자 증폭을 위해 배양한다. 동물 세포를 형질감염 시키기 위해 유전자를 사용한다(자가복제할 수 있고 RNA 전사 프로모터 영역을 함유한 플라스미드 또는 동물 세포 염색체에 통합될 수 있는 플라스미드를 사용). 유전자에 의해 암호화되는 단백질이 생성되도록하여 배양 상등액 또는 세포 추출물에 대해 사람 MACIF 활성을 검정한다. 다른 방편으로, 사람 MACIF를 암호화하는 목적하는 cDNA를 수반하는 형질전환체 균주는, 사람 MACIF에 대한 항체를 사용하여 생성된 사람 MACIF를 검출함으로써 형질전환체 균주중으로부터 선별된다.
[사람 MACIF cDNA의 확인]
출발물질로서 mRNA를 사용하여 수득된 본 발명에 따른 유전자는 적합한 해독 시스템을 사용함으로써 사람 MACIF를 적절히 암호화하는 유전자로서 확인될 수 있다. 가장 보편적으로 사용되는 방법은 크리이그 등[참조; Kreig, P.A. et al., Nucleic Acids Research, 12, 7057-7070(1984)]에 의해 개발된 방법으로서, 이는 강한 프로모터 및 이 프로모터에 특이적인 RNA 폴리머라제를 사용하여 다량의 mRNA를 시험관내에서 합성한 후, 단순 해독 시스템을 사용하여 mRNA를 단백질로 해독함을 특징으로 한다. 따라서, 상기 방법에서, 본 발명의 cDNA는 적합한 플라스미드 내의 SP6 프로모터, T7 프로모터 또는 T3 프로모터(출발물질로서 mRNA를 사용하는 경우, 이들 프로모터를 함유하는 벡터는 라이브러리 제조중 미리 사용될 수 있다)와 같은 강한 프로모터의 하부에 삽입되고, 생성된 플라스미드는 정제된 후, 이러한 프로모터 하부에 위치한 사람 MACIF cDNA의 하부에 있는 적합한 제한 효소 절단부위에서 절단된다. 생성된 이본쇄 DNA는 사용된 프로모터에 특이적인 폴리머라제(예: SP6 폴리머라제, T4폴라머라제, 또는 T3 폴리머라제)를 각각 사용함으로써 시험관 내에서 mRNA로 전사된다. 그런 다음, 이와 같이 전사된 mRNA는 토끼 망상적 혈구 용해물 또는 밀 배종 용해물과 같은 세포-비함유 단백질 합성 시스템을 사용 하거나 mRNA를 제노푸스 래비스(Xenopus laevis) 난모세포로 주입시킴을 특징으로 하는 방법을 사용함으로써 단백질로 해독된다. 사람 MACIF를 정확하게 암호화하는 유전자가 수득되었다는 것은 해독 산물 단백질의 MACIF 활성을 분석하거나 사람 MACIF에 특이적인 항체를 사용한 면역학적 방법을 통해 확인할 수 있다.
[유전자 서열 결정]
본 발명의 이와같이 수득된 유전자의 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 플라스미드 벡터를 사용한 디데옥시 방법[참조; Chen, E.Y., DNA, 4, 165-170(1985)]또는 7-DEAZA 방법[참조; Mizusawa, S. et al., Nucleic Acids Research 14, 1319-1324(1986)]에 의해 결정될 수 있다. 천연의 사람 MACIF(사람 백혈구로부터 추출)에 대한 이와 같이 수득된 유전자가 제1도에 도시되어 있다.
상기에서 세부적으로 기술된 본 발명의 유전자 제조 방법이 mRNA를 경유하여 실시되는 반면, 사람 MACIF를 암호화 하는 유전자는 본 명세서에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 토대로하여 화학적 방법에 의해 또한 제조될 수 있다. 화학적 합성 방법의 전형적 예는 포스포아미디트 방법이다.
발현 벡터의 작제
(1) 숙주-벡터 시스템의 선택:
이와 같이 수득된 사람 MACIF 유전자의 암호화 영역의 전체 길이를 숙주로서 원핵생물 또는 진핵생물을 사용하여 발현시킬 수 잇다. 이러한 숙주 세포로 삽입되는 벡터는 숙주 세포에 따라 적합한 방식으로 작제될 수 있다.
원핵 세포 숙주로서, 에스케리키아 콜라이 균주[예, 이. 콜라이 K12 294(ATCC 31446), 이.콜라이 B, 이.콜라이 X1776(ATCC 31537), 이.콜라이 C600, 이.콜라이 W3110(F-, λ-, 기본유기영양균; ATCC 27375)], 바실러스 균주[예: 비.서브틸 리스], 이.콜라이 이외의 장내 세균, 예를 들어 살모넬라 티피 뮤리움 균주(Salmonella typhimurium) 및 세라티아 마르세센스 균주(Serratia marcescens) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 균주가 언급될 수 있다.
이같은 미생물 숙주에 대해 유용한 벡터는 단백질 합성 개시를 위해 필요한 ATG와 더불어 본 발명의 유전자의 상부에 위치한 프로모터 및 SD 염기 서열[참조; Shine, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 1342-1346(1974)]을 지닌 본 발명의 유전자를 함유하는 발현 벡터이다. 일반적으로 pBR322, pBR327등이 에스케리키아. 콜라이 및 다른 세균 균주내에서 사용하기에 적합한 벡터들이다.
예를 들어, 프로모터로서 유용한 것은, 트립토판 프로모터, PL 프로모터, lac 프로모터, lpp 프로모터 및 β-락타마제 프로모터이다.
표식자 유전자의 전형적 예로서, 앰피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자가 언급될 수 있다.
진핵성 미생물로서 효모가 일반적으로 사용된다. 특히, 삭카로마이세스 속에 속하는 효모가 유리하게 사용된다. 효모 및 다른 진핵성 미생물중에서 사용하기 위한 발현벡터의 전형적 예는 YRp7이다.
효모 내에서의 발현을 위해 발현 벡터가 지녀야 하는 프로 모터의 유용한 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 엔올라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 또는 헥소 키나제 프로모터이다.
예를 들어, trpl 유전자가 표식자 유전자로서 사용될 수 있다.
효모 세포내에서 전사 및 해독을 조절하는데 기여하는 복제원, 종료 코돈 및 기타 DNA 서열은 효모세포 내에서의 사용에 적합한 것으로 공지된 통상의 DNA 서열일 수 있다.
배양된 보다 고등한 동물 세포가 숙주로서 사용되는 경우, 이들은, 예를 들어, 리서스(rhesus) 원숭이 신장 세포, 모기 유충 세포, 아프리카산 녹색 원숭이 신장세포, 마우스 태아 섬유아세포, 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포, 이의 디하이 드로폴레이트 환원효소 결핍 균주[참조; Urlaub, G, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216-4220(1980)], 사람의 경부 상피 세포, 사람 태아 신장 세포, 나방 난소 세포, 사람 골수종 세포 또는 마우스 섬유아세포이다.
벡터는 숙주세포 내에서 본 발명의 DNA의 발현을 위한 가능성 서열, 예를 들어 복제원, 본 발명의 DNA로부터 상부에 위치된 프로모터, 리보소옴 결합 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사종료 서열을 일반적으로 함유한다.
바람직한 프로모터의 예로는 아데노바이러스 2 주요 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 진핵성 유전자-유래된 프로모터(예: 에스트로겐-유도성 달걀 알부민 유전자, 인터페론 유전자, 글루코코르티코이드-유도성 티로신 아미노트란스퍼라제 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 아데노바이러스 주요 초기 및 후기 유전자, 포스포글리세레이트 키나제 유전자, α-인자 유전자)이다.
복제원은 아데노바이러스, SV40, TH 유두종 바이러스(BPV), 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 이들로부터 유래된 어떠한 벡터로부터도 유래될 수 있다.
네오마이신 내성 유전자 및 메토트렉세이트 내성 디하이드 로폴레이트 환원 효소(DHFR) 유전자 등이 이 경우 표식자 유전자 로서 사용될 수 있다.
사람 MACIF cDNA 및 변형된 사람 MACIF 단백질 cDNA의 발현을 위해 유용한 것으로 상기 기술한 숙주, 벡터 및 이의 구성요소의 예는 본 발명의 범위를 결코 제한하지 않는다.
(2) 사람 MACIF 발현 벡터의 작제:
상기에서 언급한 바와 같이, 사람 MACIF는 폴리펩타이드 쇄의 C말단에 PI 앵커를 지닌 단백질이기 때문에, 이의 발현을 위한 숙주 세포는 PI 앵커 합성기작을 지닌 세포중으로부터 선택되어야 한다. 이러한 기작은 원핵생물, 효모 및 점균류(Myxomycetes)로부터 곤충 및 포유동물에 이르기까지 다양한 유기체 사이에 분포되어 있는 것으로 공지되어 있다. 당해 분야에서 C 말단에 PI 앵커를 지닌 폴리펩다이드의 제조를 가능하게 하는 것으로 기대될 수 있는 숙주세포의 예로는, CHO 세포[참조; Caras, I.W. et al., Nature, 322, 545-549(1987)], COS 세포[참조; Caras, I.W. et al., Science, 243, 1196-1198(1989)] 및 R1.1 흉선종 세포[참조; Waneck, G.L. et al., Science, 241, 697-699(1988)]가 언급될 수 있으나, 숙주 세포는 이에 제한되지는 않는다. 하기에는 숙주세포로서 중국산 햄스터 난소 세포(CHO 세포) 내에서의 발현에 특히 적합한 사람 MACIF cDNA 발현 벡터의 작제 방법을 상세히 기술 하고 있다.
사람 MACIF cDNA-함유 클론 pGEM352-3은, 시험관내 전사를 위해 주로 사용되는 시판되는 플라스미드 벡터 pGEM4(Promega)로 작제된 사람 단핵구 cDNA 라이브러리로부터 분리 된다. 플라스미드 pGEM 352-3을 제한 효소 SacI 및 HincII로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 약 425 bp의 SacI/HincII DNA 단편을 수득한다. 이 단편을 녹두 뉴클레아제로 처리함으로서 평활-말단화한다.
한편, CHO 세포내에서 사용하기 위한 발현 벡터 작제용의 주요부 벡터는 pVY-1(제4도)을 BglII로 절단한 후, 생성된 BglII 말단을 평활-말단화 하기 위해 녹두 뉴클레아제로 처리 함으로서 제조한다. 상기 언급한 이러한 주요부 벡터 및 평활-말단 SacI/HincII DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시키고, 이 연결혼합물을 에스케리키아 콜라이 HB101을 형질전환시키는데 사용한다. 플라스미드를 이와같이 수득된 형질 전환체로부터 알칼리 방법에 의해 제조하여 제한효소 분석을 실시한다. 이러한 방식으로, 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드가 선별 된다.
이와 같이 제조한 발현 플라스미드를 인산칼슘 방법에 따라 메토트렉세이트(Mtx)-민감성 CHO 세포로 형질전환시킨다. 형질전환체는 Mtx 내성을 획득하기 때문에, 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 균주는 Mtx-내성균주 중에서 선별될 수 있다. 유전자가 CHO 세포내에서 발현되는 경우, 추가 공정의 존재여부에 무관하게 발현 산물 폴리펩타이드는 시그날 펩타이드가 없으며 C 말단에 부착된 PI 앵커를 지닌 단백질을 주로 생성한다.
또한, C 말단에 포스파티딜이노시톨 앵커를 지닌 사람 MACIF의 발현용 벡터는 서열식(I)의 폴리펩타이드의 77번 아미노산 잔기(Asn)로부터 시작되는 PI 앵커 부착을 위한 소수성 시그날 서열을 암호화하는 부위가 변형된 상기 유전자의 변형물을 사용하여 하기에 언급된 공지 기술에 의해 제조할 수 있다.
카라스 등[참조; Caras, I.W. et al., Science, 238, 1280-1283(1987)]의 교시로부터, 목적하는 단백질을 암호화 하는 DNA의 3'말단에 공지의 PI-앵커 단백질을 위한 전구체의 C 말단에 PI 앵커 부착을 위한 소수성 시그날 서열을 암호화하는 DNA를 가하여 하이브리드 DNA를 작제하고 상기 언급한 제조합 벡터를 사용하여 발현시킬수 있는 경우, 포스파디딜이노시톨 앵커가 목적하는 단백질의 C 말단에 부착될 수 있다는 것이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. PI 앵커 부착을 위한 소수성 시그날 서열로는 퍼거슨등[참조; Ferguson, M.A. et al., Annual Review of Biochemistry, 57, 285-320(1988)]의 조사 및 그밖의 고찰에서 기술된 PI-앵커를 갖는 단백질 전구체를 위한 어떠한 공지된 PI 앵커 부착 시그날 서열도 가능하다.
카라스 등[참조; Caras, I.W. et al., Science, 243, 1196-1198(1989)]에 의하면, 사람 성장 호르몬의 N-말단 분비 시그날 서열 또는 불일정한 소수성 펩타이드 서열이 C 말단에 PI 앵커 부착을 위한 시그날로서 유용한 폴리펩타이드 서열로서 사용될 수 있다. 이것은, 76번 아미노산 잔기(Glu)에서 종결된 사람 MACIF의 일부를 암호화하는 DNA 서열의 3' 부위에 상기 언급한 소수성 서열을 연결시켜 제조된 하이브리드 유전자를 사용함으로써 PI 앵커가 부착된 사람 MACIF를 발현시킬 수 있음을 시사한다.
상기 관점에서, C 말단에 부착된 PI 앵커를 지닌 사람 MACIF 제조용 발현벡터 작제에 사용되는 유전자 서열이 제1도에 도시된 DNA 서열에 제한되지는 않음이 명백하다.
C 말단에 부착된 PI 앵커를 지닌 사람 MACIF 폴리펩타이드는 일반적으로 형질전환체의 세포막 상에서 발현된다. 따라서, 세포 표면상의 재조합 사람 MACIF는 형질전환 세포를 항-사람 MACIF 항체 및 형광 표지된 2차 항체와 반응시킨 후 유동세포 계수 또는 형광-활성화된 세포 분류기(FACS)상의 분석을 통한 통상의 방법을 통해 검출할 수 있다. 만일 형질전환체 세포를 포스파티딜이노시톨-특이 포스포리파제 C(PI-PLC)로 처리한 후 상기방법에 의해 더 이상 세포 표면상에서 사람 MACIF가 검출되지 않으면, 상기 방법으로 수득된 재조합 MACIF에는, PI 앵커가 부착되어 있음이 역으로 입증될 수 있다.
상기 언급한 이러한 방법에 따라, 재조합 사람 MACIF가 상기 방식으로 형질 전환된 세포 내에서 제조된다는 것을 입증할 수 있다.
(3) 변형된 사람 MACIF 단백질 발현 벡터의 작제:
변형된 사람 MACIF 단백질 발현용 벡터의 작제방법이 하기에 기술되어 있다.
생리적 활성에 있어서 사람 MACIF와 실질적으로 동등한 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터가 있다. 이들은, 예를 들어 발현 산물의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 서열의 일부가 결여되도록 특정 부위를 결실시키거나, 상응하는 아미노산 서열이 다른 아미노산 서열에 의해 대체되어지도록 특정 부위를 변형시키거나, 일부 아미노산 서열이, 상기 섹션(I)에서 언급된 다양한 숙주 시스템내 발현에 필요한 구성 요소와 함께 발현산물에 첨가되도록 적절한 서열을 가함으로써 제1도에 도시된 DNA 염기 서열로부터 유래된 DNA 서열을 포함하는 벡터이다. 더욱 구체적으로, 이들 발현 벡터에는 서열식(I)의 아미노산 서열에 의해 정의된 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자가 폴리펩타이드의 발현을 야기시킬 수 있는 조절 DNA 서열에 효율적으로 연결되어 이의 조절하에 놓이게된 일련의 재조합 벡터가 포함된다.
PI 앵커 합성기작을 지니지 않는 세균 세포가 상기 언급된 발현 벡터의 발현을 위한 숙주로서 사용될 때, 발현산물은 항상 PI 앵커를 지니지 않는 폴리펩타이드이다.
포유동물 세포가 숙주로서 사용될 때, PI 앵커 부착은 복잡한 방식으로 조절된다. 폴리펩타이드의 C 말단에 PI 앵커가 부착되는 경우, 폴리펩타이드 전구체로부터 특이적 소수성 C-말단 폴리펩타이드 부위(PI-앵커 부착 시그날 서열)의 제거가 PI 앵커에 의한 변형에 선행된다는 것이 일반적으로 공지되어 있다. 사람 MACIF의 경우, 77번 아미노산 잔기(Asn) 내지 103번 아미노산 잔기(Pro)의 폴리펩타이드가 PI 앵커 부착을 위한 시그날로서 작용한다. 하지만, 약 1번 내지 70 내지 86번 아미노산 잔기를 함유하는 상기 언급한 변형된 단백질을 위한 발현 벡터내에 삽입된 각각의 변형된 단백질 유전자는 PI 앵커 부착 시그날 서열의 일부 또는 전체를 암호화하는 DNA 부위가 결실되어 있다. PI 앵커가 부착될 단백질 전구체를 암호화하는 유전자로부터 소수성 부착 시그날 서열의 일부를 암호화하는 유전자 단편이 결실되는 경우 가용성 단백질이 생성된다는 것이 공지되어 있다[참조; Berger, J. et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 10016-10021(1988)]. 따라서, 변형된 단백질을 암호화하는 본 발명의 유전자를 변형된 가용성 사람 MACIF 단백질을 제조하기 위한 유전자로서 사용할 수 있다.
이들 변형된 단백질의 발현용 벡터중에서, 제2도에 도시된 바와 같은 103번 까지의 아미노산 잔기를 함유하는 단백질의 에스케리키아 콜라이 내에서의 발현용 벡터, 및 86번, 77번 및 70번 까지의 아미노산 잔기를 함유하는 변형된 MACIF 단백질의 에스케리키아 콜라이 및 포유동물 세포 내에서의 발현용 벡터가, 각각 이의 작제 및 발현 방법과 함께 하기에 좀더 상세하게 기술되어 있다.
(a) 1번 내지 103번 아미노산 잔기를 함유하는 단백질의 에스케리키아 콜라이 내에서의 발현:
플라스미드 pGEM352-3을 제한효소 PstI 및 HincII로 절단하고 약 310 bp의 PstI/HincII DNA 단편을 분리시켜 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제시킨다.
PstI 절단 부위에서 포스포릴화된 서열 5의 합성 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 PstI 절단 부위에서 상기 언급된 바와 같이 제조된 PstI/HincII 단편에 연결시킨다. 이와같이 제조된 합성 DNA-연결된 DNA 단편(EcoRI/HincII 단편)을 분리시켜 아가로스 겔 전기영동을 통해 정제한다:
Figure kpo00005
별도로, 에스케리키아 콜라이내에서 사용하기 위한 발현 벡터 작제를 위한 주요 벡터는 예를 들어, 제3도의 pKK223-3을 EcoRI 및 SmaI으로 절단함으로써 제조한다. 이 벡터 및 상기 언급된 EcoRI/HincII DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시키고 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 K12 JM109를 염화 칼슘 방법에 의해 형질전환시킨다. 알칼리 방법에 의해 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고 제한 효소를 사용하여 분석한다. 이러한 방식으로, EcoRI/HincII DNA 단편이 삽입된 목적하는 플라스미드를 지닌 형질전환체가 선별될 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드는 적합한 배지(에: 100mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 함유하는 L 배지) 내에서 상기에서와 같이 수득된 형질전환체를 배양함으로써 발현시키고 제조할 수 있다. 발현된 폴리펩타이드의 N 말단에는 메티오닌 잔기가 있다. 발현 산물에는 또한 에스케리키아 콜라이 내에 존재하는, N 말단 메티오닌 잔기를 제거할 수 있는 효소의 작용에 의해 제거된 결과로써 N-말단 메티오닌이 없는 폴리 펩타이드 종이 포함된다.
(b) 1번 내지 86번 아미노산 잔기로 이루어진 단백질의 발현:
에스케리키아 콜라이가 숙주로서 사용될 때, pGEM352-3을 AvaII로 절단한다. 별도로, 서열식(III)의 합성 DNA를 AvaII 절단부위에서 포스포릴화시킨다.
Figure kpo00006
절단 산물 및 포스포릴화된 합성 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결 시킨다. 그런 다음 연결산물을 PstI으로 절단하고 T4 DNA 리가제를 사용하여 PstI 절단부위에서 포스포릴화된 서열 5의 합성 DNA와 함께 연결시킨다. 합성 DNA 및 DNA 단편으로부터 이와 같이 제조된 연결산물(EcoRI/HindIII단편)을 분리하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다.
이와같이, 제조된 EcoRI/HindIII DNA 단편을 pKK223-3의 EcoRI/HindIII 단편과 연결시킨다. 1번 내지 86번 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 재조합체 에스케리키아 콜라이 균주는 연결 산물을 사용하여 상기 기술한 동일한 공정을 통해 수득할 수 있다.
CHO 세포내에서 폴리펩타이드 발현을 위해, 에스케리키아 콜라이 세포 내에서의 발현의 경우에서 처럼, pGEM352-3을 AvaII로 절단한 후 서열 6의 합성 DNA와 연결한다. 그런 다음 연결산물을 SacI으로 절단하여 약 375 bp의 DNA 단편을 분리하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다. 녹두 뉴클레아제로 처리하여 이 DNA 단편을 평활-말단화한다. 생성된 DNA 단편을 BglII로 절단되어 평활-말단화된 pVY1내로 삽입시켜 발현 플라스미드를 생성한다. 발현 플라스미드로 CHO 세포를 형질전환시켜 1번 내지 86번 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드를 발현하여 제조할 수 있는 CHO 세포를 수득한다.
(C) 1번 내지 77번 아미노산 잔기 및 1번 내지 70번 아미노산 잔기를 각각 함유하는 단백질의 발현:
에스케리키아 콜라이 또는 CHO 세포내에서 1번 내지 77번 아미노산 잔기 또는 1번 내지 70번 아미노산 잔기를 암호화하는 유전자를 발현시키기 위해, 플라스미드 제조 단계중에서 pGEM 352-3을 AvaII로 절단시킨 후, PGEM352-3으로 연결되는 합성 DNA가 1번 내지 77번 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드가 발현될 때는 서열식(IV)의 합성 DNA 이거나, 1번 내지 70번 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드가 발현될 때는 서열식(V)의 합성 DNA인 점을 제외하고는 상기 언급된 바와 실질적으로 동일한 방법을 수행할 수 있다;
Figure kpo00007
Figure kpo00008
연속 단계에서, 상응하는 유전자 및 유전자 발현용 재조합 벡터는 상기(b)에서 기술한 바와 같이 동일한 방법을 실시함으로써 수득할 수 있다.
[형질전환]
사람 MACIF cDNA 또는 변형된 사람 MACIF 단백질 cDNA를 함유하는 이와 같이 수득된 발현 벡터의 목적하는 숙주 세포로의 도입, 즉 벡터를 사용한 세포의 형질전환은 일반적으로 이용하여 실시할 수 있다.
각각의 발현 벡터 플라스미드는 유전자 작제를 위해 사용되는 숙주(예: 이.콜라이 HB 101)로부터 일반적으로 사용 되는, 예를 들어 알칼리 용균의 방법에 의해 제조할 수 있다. 제조된 벡터 플라스미드는 숙주를 형질전환시키기 위해 사용한다. 형질전환은 예를 들어, 세균 세포가 숙주로서 사용될 때는 하나한의 방법[참조; Hanahan, D., Journal of Molecular Biology, 166, 557-580(1983)] 또는 예를 들어, 포유동물 세포가 숙주로서 사용될 때는 인산칼슘 방법[참조; van der Eb, A.J. et al., Methcds in Enzymology, 65, 826-839(1980), Academic Press]에 의해 실시될 수 있다.
[배양 및 정제]
상기 방식으로 수득되는 형질전환체는 통상의 방식으로 성장시킬 수 있으며 이의 배양으로 생물학적으로 활성인 사람 MACIF 또는 변형된 사람 MACIF 단백질이 생성 및 축적된다. 배양용 배지는 사용되는 숙주세포에 따라 다양한 통산 배지로부터 선택됨이 바람직하다. 예를 들어, 상기 언급한 CHO 세포가 숙주로서 사용될 때 필요한 경우 태아 송아지 혈청(FCS)과 같은 혈액 성분이 보충된 MEM-α 배지를 사용할 수 있다.
형질전환체 내에서 재조합 사람 MACIF 또는 재조합 변형된 사람 MACIF 단백질의 제조를 위한 발현 부위는 선택된 cDNA에 의해 암호화되는 아미노산 서열, 벡터종류, 숙주세포 종류 및 이들의 조합에 따라 상이하다. 따라서, 재조합 사람 MACIF 또는 이의 변형물은 세포막 상에서, 세포 내에서 또는 세포 배양 상등액 내에서 제조될 수 있다. 형질전환된 세포내에서 제조된 사람 MACIF 또는 변형된 사람 MACIF 단백질을 이의 물리적 및 화학적 특성을 기준으로 다양한 분리 기술에 의해 이로부터 분리하고 정제할 수 있다[예: Japanese Biochemical Society(ed.), Dojin(1980)].
구체적으로, 분리 및 정제에 이용되는 기술에는 통상의 단백질-침전제의 처리, 한외여과, 분자제 크로마토그래피(겔 여과), 흡수 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 이외의 액체 크로마토그래피 기술, 투석 및 이들의 조합 등을 포함한다. 더욱 구체적으로, 사용되는 기술은 재조합 단백질의 발현 부위에 따라 다양할 수 있다.
배양 상등액 내에서 제조되는 재조합 단백질은 하기 방식으로 분리 및 정제한다.
먼저, 목적하는 물질을 미리 배양 상등액으로부터 부분적으로 정제한다. 이 부분 정제는, 예를 들어 황산암모늄, 황상나트륨 또는 인산나트륨 같은 염석용 제제에 의한 처리 및/또는 투석막, 편평막(flat menbrane) 또는 유공(hollow) 섬유막을 사용한 한외여과 처리에 의해 수행한다. 이러한 처리 각각의 방법 및 조건은 당해 분야에 일반적으로 사용되는 바와 동일하다. 상기 방법으로 수득된 조악하게 정제된 산물에 흡수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과, 이온교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등 또는 이의 조합을 실시하여 사람 MACIF 활성을 나타내는 분획을 수득한다. 이 방법으로, 목적하는 물질이 순수하고 균질형태로 분리될 수 있다.
세포막 상에서 제조된 재조합 단백질은 PI 앵커를 가질 수 있고, 따라서 앵커를 통해 세포막에 결합될 수 있다. 이와 같은 막-결합된 재조합 단백질은 적합한 세제(예: NP-40, 트리톤 X-100, 옥틸글리코시드)로 처리함으로써 세포막을 파괴시킨 후 상기 기술한 바와 같은 동일한 방법으로 실시하여 정제한다. 다른 방도로 PI 앵커를 통해 세포막과 결합된 재조합 단백질은 PI 앵커 절단을 위한 적합한 처리에 의해 가용화될 수 있다. PI 앵커 절단의 수단으로서, 예를 들어, 포스파디딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC)로의 절단 및 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 D(PI-PLD)로의 절단을 언급할 수 있다. 상기 처리에 의해 가용화 되는 재조합 단백질은 세포 배양 상등액으로 방출되므로, 상기 기술한 바와 같은 동일한 방법으로 정제할 수 있다.
세포내에서 제조된 재조합 단백질은, 막-결합된 재조합 단백질의 경우에서와 마찬가지로 적합한 세제로 처리함으로써 세포막을 파괴시켜 용액상으로 재조합 단백질을 방출시킨 후 상기 언급한 바와 같은 동일한 방식으로 정제할 수 있다.
이와 같이 정제된 재조합 사람 MACIF, 가용성 재조합 사람 MACIF 또는 재조합 변형된 사람 MACIF 단백질의 활성은, 예를 들어 반응성 용해[참조; Thompson, R.A. et al., Journal of Experimental Medicine, 131, 629-641(1970) 및 Lachmann, P.J. et al., Journal of Experimental Medicine, 131,643-657(1970)]억제 활성 검정에 의해 확인될 수 있다.
상기에서, 본 발명에 상응하는 유전자, 이 유전자의 발현용 벡터 및 이 유전자의 발현이 가능한 형질전환된 미생물 및 세포 및 이의 제조 방법을 기술했다. 본 발명의 결과로서, 사람 MACIF 유전자의 DNA 서열이 최초로 결정되었고 동시에 약제로서 실용적 으로 유용한 변형된 사람 MACIF 단백질을 암호화하는 유전자가 제공되었다. 따라서, 본 발명에 이르러, 재조합 DNA 기술을 이용하여 순수하고 균일한 등급의 사람 MACIF 또는 이의 변형물을 대량으로 합성할 수 있게 되었다.
사람 MACIF 및 변형된 사람 MACIF 단백질은 사람 기원이다. 따라서, 이들은 항원성을 지니지 않으며 독성이 낮다. 이들은 보체 활성의 최종단계에서 MAC 형성의 결과로 인한 세포 및 조직 손상을 방지할 수 있다. 따라서 이들은 다양한 질환, 특히 보체-조절 성분(들)의 부재 또는 감소된 수준으로 인한 질환 및 유형 II 또는 유형 III 알레르기로 분류될 수 있는 모든 질환을 위한 치료제로서 유리하게 사용될 수 있다.
더욱이, 하나 이상의 보체-조절 성분의 부재 또는 감소된 수준으로 인한 질환, 전형적으로 발작성 야간성 혈색 소뇨증(PNH)에서 뿐 아니라 세포 및/또는 조직 손상을 수반하는 다양한 염증 또는 자가 면역 질환에서 사람 MACIF의 질적 또는 양적 이상이 관찰될 수 있다. 따라서, 사람 MACIF 및 이로부터 유래된 변형 단백질, 사람 MACIF 또는 이의 변형물에 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 사람 MACIF 또는 변형된 사람 MACIF 단백질 DNA 및 추가로 사람 MACIF에 상보적인 DNA 또는 변형된 사람 MACIF 단백질 유전자가 상기 언급된 질환의 특이 진단시 사용될 수 있다.
사람 MACIF 또는 변형된 사람 MACIF 단백질의 복용 형태는 질환, 증상 및 환자의 상태에 따라 다양할 수 있다. 하지만 일반적으로, 주사제, 비제제(nasal preparation), 좌제 및 삽입제와 같은 비-경구 복용 형태가 전신적 투여를 위해 이용되는 반면, 예를 들어 관절내 제제 및 작용부위로 삽입되는 제제는 국소 투여를 위해 사용된다.
이러한 복용 형태의 제조시, 각각의 형태에 적합한 조성물이 사용된다. 주사제를 제조시, 사람 MACIF 또는 변형된 사람 MACIF 단백질을 예를 들어 인산염-완충된 생리적 염수 또는 덱스트로스 수용액내에 용해시키고, 안정화제 및/또는 분산제 등의 첨가후, 필요한 경우 앰플내로 분배시키거나 바이알 내에서 동결건조시킨다. 바이알내에 동결시킨 경우, 당해 제제는 주사용 증류수 또는 생리적 염수내에 용해시킴으로서 사용전에 재구성한다.
성인을 위한 MACIF의 1일 용량은 일반적으로 100㎍ 내지 5,000mg, 바람직하게는 1mg 내지 500mg의 범위내이다. 이와 같은 1일용량은 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여한다.
[복용형 제제 실시예]
생리적 염수 100ml 중 MACIF 5g의 용액을 멸균 여과시킨 후 바이알내로 2ml씩 분배한다. 동결건조시켜 바이알당 MACIF 100mg을 함유하는 주사용 제제를 수득 한다.
[실시예]
(1) 천연 사람 MACIF의 정제된 샘플의 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열의 결정
1) N-말단 아미노산 서열 결정
천연 사람 MACIF(18kd)의 정제된 샘플을 8M 우레아의 존재하에 2-머캅토에탄올로 통상의 방식으로 환원시킨 후, 요도 아세트산으로 S-카복시메틸화시켜 가스상 단백질 서열분석기(모델 470A, Applied Biwsystems, U.S.A.)를 사용하여 이의 N-말단 아미노산 서열을 분석한다. 결과는 하기와 같다.
Figure kpo00009
2) C-말단 아미노산 서열 결정
천연 사람 MACIF의 정제된 샘플 0.6mg 분량을 6M 구아니딘 염산염의 존재하에 디티오트레이톨로 통상의 방식으로 환원시킨 후 요도아세트산으로 S-카복시메틸화 시킨다. 알킬화 혼합물을 밤새 4℃에서 증류수에 대해 투석시키고 투석물을 원심분리-형 감압 농축기를 사용하여 0.5ml로 농축시킨다. 카복시메틸화된 사람 MACIF 용액 전체를 1M 트리스 염산염 완충용액(pH 8.0)을 가함으로서 완충시킨다. 그런다음, 50mM 트리스 염산염 완충용액 20㎕ 중 프로나제(Calbiochem) 100㎍의 용액을 상기 용액내로 가하고 반응을 37℃에서 22시간 동안 진행시킨다.
클로로포름-메탄올(1:1) 혼합물(0.5ml)을 반응혼합물에 가한다. 철저히 진탕시킨 후, 전체 혼합물을 원심분리시키면 투명한 상층, 탁한 중층 및 투명한 하층으로 분리된다. 각 층의 부위를 취해 6N 염산으로 가수분해시키고, 피코타그 워크 스테이션 장치(Waters, U.S.A.)를 사용하여 통상의 방식으로 분석한다. 중층에서 에탄올아민이 검출된다. 따라서 중층이 C 말단에 부착된 PI 앵커를 지닌 프로나제 분해 단편을 함유함을 알 수 있다. 상기 PI 앵커-부착된 C-말단 단편을 함유하는 중층(600μl)을 동결건조시키고, 물: n-부탄올: 1N 염산(600:600:3) 혼합물 1.2ml를 가하여, 철저히 진탕시킨 후, 혼합물을 원심분리한다. 상기 기술한 바와 동일한 방식으로 6N 염산으로 가수분해를 실시하고 피코타그 워크 스테이션 장치를 사용하여 분석한다. 에탄올아민은 부탄올층(상층)에서 검출된다. 동일 용적의 n-부탄올-포화된 5mM 염산을 상층에 가하고 혼합물을 진탕시킨 후 원심분리하여 상층을 분리해낸다. 산성 부탄올을 사용한 이러한 추출 공정을 총 2회 반복한다.
최종 n-부탄올 층의 절반을 상기 언급한 단백질 서열 분석기를 사용하여 아미노산 서열을 결정한다.
그 결과 하기 서열이 밝혀졌다:
Figure kpo00010
이것은 제2도에 도시된 서열중 72번 내지 76번 아미노산 잔기를 포함한다. 76번 아미노산 잔기(Glu)뒤에는 어떠한 아미노산 잔기도 검출되지 않는다. 상기 사실은 적혈구-유래된 천연 사람 MACIF가 N 말단으로부터 76번 아미노산 잔기인 Glu에 부착된 PI 앵커를 지님을 나타낸다.
(2) 사람 MACIF를 암호화하는 cDNA 클론을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오타이드 탐침의 제조:
상기 섹션(1)에서 나타낸 아미노산 서열을 기준으로, 각각 아미노산 잔기 +1 내지 +5번 및 +4 내지 +9번을 암호화 하는 mRNA 영역에 상보성인 15-량체(15-mer) 및 17-량체(17-mer) 혼합된 데옥시올리고뉴클레오타이드 탐침을 모델 380A DNA 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 포스포아미디트 방법에 의해 화학적으로 합성해 5' 말단을32P로 표지한다.
15-량체 혼합된 탐침(하기에서 M1 탐침으로 언급)은 뉴클레오타이드 서열
Figure kpo00011
을 갖는 반면, 17-량체 혼합된 탐침(하기 M4 탐침으로 언급)은 뉴 클레오타이드 서열
Figure kpo00012
을 갖는다.
(3) 사람 단핵구 cDNA 라이브러리의 제조:
재조합 플라스미드를 면역 복합체-자극된 사람 말초혈 단핵구로부터 유래된 mRNA 및 시판되는 플라스미드 벡터 pGEM4(Promega)를 출발 물질로하여 오까야마-버그 방법(상기 참조)에 의해 작제한다. 이와 같아 작제된 재조합 플라스미드는 pGEM4의 SP6 프로모터와 T4 프로모터 영역사이의 다중 클로닝 부위의 KpnI 절단부위와 SacI 절단부위 사이에 삽입된 cDNA를 갖는다. cDNA의 방향은 KpnI 부위(T4 프로모터 부위)는 mRNA의 3'부위에, SacI 부위(SP6 프로모터 부위)는 mRNA의 5'부 위에 존재하는 것으로 결정된다.
이와 같이 수득된 재조합 플라스미드 혼합물을 이.콜라이 HB101 컴피턴트 세포(Takara Shuzo)를 형질전환시키는데 사용하여 약 400,000개의 형질전환체를 함유하는 cDNA 라이브러리를 수득한다.
(4) 사람 MACIF cDNA의 클로닝:
사람 MACIF를 암호화하는 cDNA를 함유하는 플라스미드를 지닌 형질전환체를 분리시키기 위하여, 섹션(3)에서 기술한 바와 같이 수득한 사람 단핵구 cDNA 라이브러리를 센션(2)에서 기술한 바와 같이 제조된 합성 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하여 콜로니 하이브리드화시켜 M1 및 M4 탐침 모두와 하이브리드화하는 클론을 검출한다. 최장 cDNA(DIR 2,000bp)를 함유하는 클론을 선별하고, 이로부터 분리된 플라스미드 pGEM 352-3에 대해, cDNA 부위의 부분 염기 서열을 플라스미드 벡터를 사용한 디데옥시 방법(상기 참조) 및 7-DEAZA 방법(상기 참조)에 의해 결정한다. pGEM4의 SP6 프로모터 부위(mRNA의 5' 부위)로부터 이와같이 결정된 cDNA 서열(약 500bp)이 제1도에 나타나 있다.
pGEM 352-3 클론의 cDNA 서열에는, N 말단 상부 -25번 아미노산 잔기에 상응하는 부위에 해독개시코돈 ATG 및 N 말단으로 하부 +104번 아미노산 잔기에 상응하는 부위에 해독 종료 코돈 TAA를 갖는, 섹션(1)에서 기술된 정제된 사람 MACIF의 N-말단 10개 아미노산 잔기를 암호화하는 서열이 존재한다. 이와 같이 형성된 개방 판독 프레임은 128개 아미노산 잔기를 포함하는 단백질을 암호화한다. 이는 -25 내지 -1의 영역에 상응하는 아미노산 서열이 소수성이 매우 풍부한 소위 분비 시그날 서열임을 강력하게 시사한다.
(5) 난모세포내에서 사람 MACIF cDNA의 발현 및 이의 생물학적 활성의 확인:
상기 언급된 pGEM352-3 클론을 SP6 RNA 폴리머라제의 존재하에 cDNA 상부에 존재하는 SP6프로모터를 이용하여 이의 cDNA 부위를 mRNA로 시험관내에서 전사하는데 사용한다. 이와 병행하여, 사람 IL-lα cDNA-함유 클론으로부터의 플라스 미드를 또한 mRNA로의 시험관내 전사에 사용한다. 이들 mRNA를 이의 용매인 TE 완충용액(10mM 트리스-HCl, ph 8.0, lmM EDTA)과 함께 제노푸스 래비스 난모세포 내로 미소주입(microinjection) 시킨 후, 난모세포를 변형된 바스의 배지[참조; Gurdon, J.B., The Control of Gene Expression in Animal Development, Oxford University Press(1974)](면역 침전의 경우35S- Cys 0.1μCi/μl를 가함)내에서 48시간동안 20℃에서 배양하여 시험관내 해독을 실시한다. 그런 다음 난모 세포를 0.01% 노니뎃 P40(Nonidet P40:NP40)(Sigma, U.S.A.)을 함유한 용액내에서 음파파쇄로 붕괴시키고 원심분리시킨다. 수성 중층(하기 해독산물로 언급)을 면역침전시킨 후 활성을 측정한다.
1) 해독산물의 항체와의 반응성(면역침전)
각각의 해독산물을 토끼의 항-사람 MACIF 폴리클로날 항체 또는 토끼의 항-사람 TNF 폴리클로날 항체와 반응시키고, 항체를 PANSORBIN (스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 세포, Hoechst, West Germany)에 결합시키며, 결합 혼합물을 원심분리시키고, 침전을 결합 완충액(Affi-gel Protein A MAPS-II 키트, Bio-Rad, U.S.A.)으로 3회 세척한 후 0.17M 글리신 염산염(pH 3.0)으로 원심분리시키고, 상등액을 액체 섬광 계수기(TRI-CARB 460, Packard, U.S.A.)를 사용하여35S-Cys를 측정한다. 하기표 1에 나타낸 바와 같이, pGEM 352-3을 시험관내 전사/해독 시스템에 따르게 한 해독산물만이 토끼 항-사람 MACIF 폴리클로날 항체와 특이적으로 반응할 수 있음이 나타났다.
Figure kpo00013
2) 해독산물의 생물학적 활성:
2-1) 항-사람 MACIF 항체 컬럼 상에서의 부분 정제
상기 해독산물을, 정제된 마우스 모노클로날 항-사람 MACIF 항체를 활성화된 세파로스 4B(Pharmacia, Sweden)에 결합시켜 제조한 항체 컬럼 상에 각각 흡착시킨다. 그런 다음 컬럼을 0.1% NP40을 함유하는 인산염-완충 염수(PBS) 및 0.1% NP40을 함유하는 2M 염화나트륨 수용액으로 철저히 세척한다.
각각의 항체 컬럼 상에 흡수된 해독산물을 0.1% NP40을 함유하는 3M 나트륨 티오시아네이트 수용액으로 용출시킨다. 0.01% NP40을 함유하는 SGVB 에 대해 완충교환시킨 후, 용출물을 활성 측정에 사용한다. 상기 언급된 SGVB 완충액은 하기 조성물을 갖는다: 0.1% 젤라틴, 5mM 나트륨 바르비투레이트 완충액(pH 7.4), 8.56% 슈크로즈, 0.15mM 염화칼슘, 1mM 염화마그네슘.
2-2) 해독산물의 활성검정
사람 C5-C6 복합체(냉동저장시켜 사용전 해동시킴; C5,6 )를 데사우어 등[참조; Dessauer, A. et al., Acta Pathologica Microbiologica Scandinavia Section C, Supplement 284, 92, 75-81(1984)]의 방법에 의해 사람 C5 및 C6 로부터 제조하고, 기니아 피그 적혈구 현탁액(10 개 세포/ml)과 혼합시킨 후, 혼합물을 33℃에서 5분 동안 항온 처리한다. 그런 다음, C7을 첨가한 후, 추가로 15분 동안 항온처리하여 기니아 피그 적혈구-사람 보체 C5-7 복합체(하기 EC5-7 중간체로 언급)를 수득한다. EC5-7 중간체 현탁액(1.5x10 /ml)을 C8, C9 및 샘플 용액과 혼합하여 총 용적 1ml가 되게한다(1.5x10 /ml). 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 이와 병행하여, 동일 방식으로 제조되었으나 샘플 용액을 첨가하지 않은 대조 현탁액을 동시에 항온처리한다. 반응 혼합물을 5분 동안 2,000xg에서 원심분리시키고, 상등액을 용혈율(%)을 계산하기 위해 흡광도(414nm)를 측정한다. 따라서, 적혈구 당 부위(Z)의 수를 헤머 등[참조; Hammer, C.H. et al., Iournal of Biological Chemistry, 256, 3995-4005(1981)]의 방법에 의해 계산하고 대조군의 Z값에 대한 Z값의 % 비율을 활성의 지수로서 취한다.
각각의 대조군으로서 사용된 TE 및 ILI-α로는 어떠한 활성도 관찰되지 않는 반면, 유의한 용혈 억제 활성이 사람 MACIF로 관찰되었다(제5도). 이 활성은 용량-의존적이고 사람 MACIF에 대한 마우스 모노클로날 항체로 완전히 중화되었다(제6도).
따라서 상기 기술한(4)에서 수득된 pGEM 352-3 클론내에 함유된 cDNA가 사람 MACIF를 암호화함이 명백하다.
(6) 발현 벡터 pVYl의 작제:
발현 벡터 pVYl을 제7도에 도시된 바와 같이 작제한다.
1) 벡터 pAdD26SV(A) NO. 3[Dr. H. Handa로부터 수득; 논문에 공지됨: Kaufman, R. J. 및 Sharp, P.A., Molecular and Cellular Biology, 2, 1304-1319(1982)]의 DNA를 먼저 BglII로 절단한 후 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시한다. 이와같이 수득된 침전물을 멸균 증류수에 용해시키고 클레나우 효소(Boehringer Mannheim)를 사용한 통상의 방식으로 평활- 말단화 후 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시하여 멸균 증류수에 용해시킨다. DNA 연결키트(Takara Shuzo)를 사용하여 추가로 자가-연결시킨다. 연결 혼합물을 이.콜라이 HB101의 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용한다. 플라스미드 DNA를 테트라사이클린-내성 형질전환체로부터 수득한다. 각각의 이들 DNA의 부분을 BglII로 처리하고 0.7% 아가로스 겔 상에서 전기영동시킨다. 이러한 방식으로, 더 이상 BglII 부위를 지니지 않는 클론 pAdD 26SV(A) No. 3(N)을 수득한다.
그런다음 플라스미드 D A를 EcoRI으로 분해시킨후, 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 실시한다. 침전물을 멸균 증류수내에 용해시키고 EcoRI 절단부위를 녹두 뉴클레아제(Pharmacia)를 사용하여 평활말단화 한후, 페놀-클로로 포름 추출 및 에탄올 침전을 실시한다. 이와 같이 수득된 침전물을 멸균 증류수내에 용해시킨다.
2) pKSV10(Pharmacia) DNA를 통상방식으로 제한 효소 KpnI 및 BamHI으로 절단한 후 T4 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 및 클레나우 효소를 사용하여 평활-말단화 한다. 0.7% 아가로스 겔 상에서 전기영동시킨 후, 약 2.9kbp 단편을 함유하는 겔 부분을 분리시키고 DNA를 전기용출에 의해 회수한다.
3) 상기 1)에서 기술한 바와 같이 수득된 DNA 단편 및 상기 2)에서 기술한 바와 같이 수득된 DNA 단편을 DNA 연결 기트를 사용하여 함께 연결시키고 연결 혼합물을 이.콜라이 HB101의 컴피턴트 세포를 형질전환시키는데 사용한다.
플라스미드 DNA를 통상의 방법에 의해 테트라사이클린 내성 형질전환체로부터 제조한다. 각각의 플라스미드 DNA의 일부를 PstI으로 분해하고 분해물을 1.0% 아가로스 겔 전기 영동시킨다. 이러한 방법으로, 약 3.6kbp, 약 3.25kbp 및 약 1.5kbp에 밴드를 지닌 플라스미드 pVYl을 수득한다.
(7) CHO 세포내에서 사람 MACIF cDNA의 발현:
1) 사람 MACIF cDNA 발현 벡터의 작제
플라스미드 pGEM352-3을 제한 효소 SacI 및 HincII로 절단하고 약 425 bp의 SacI/HincII DNA 단편을 분리하고 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한다. 이 DNA 단편을 녹두 뉴클레아제로 처리하여 평활-말단화한다.
상기 (6)에서 기술한 바와 같이 수득된 pVYl을 CHO 세포내에서 사용하기 위한 발현백터로서 사용한다. 따라서 pVYl을 BglII로 절단하고 녹두 뉴클레아제로 처리하여 BglII 절단 부위를 평활-말단화한다. 생성된 평활-말단 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 상기-언급된 평활-말단 SacI/HincII DNA 단편과 연결시키고 연결 혼합물을 이.콜라이 HB101을 형질전환시키는데 사용해 테트라사이클린 내성 형질전환체를 수득한다. 알칼리 용균 방법[참조; Birnboim, H.C. 및 Dolly, J., Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523(1979)]에 의해 이들로부터 플라스미드를 제조하고, PstI 등을 사용하여 제한 효소 분석을 실시한다. 이러한 방식으로, 문제의 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드가 선별된다.
2) CHO 세포내에서 사람 MACIF 유전자 발현의 확인
상기 방법으로 작제된 발현 플라스미드를 인산칼슘 방법(상기 참조)에 의해 DHFR-결핍 CHO 세포[참조; Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216-4220(1980)]로 형질감염시킨다. 선별배지 [MEM α(-), Gibco] 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다.
형질전환체 CHO 세포 균주를 선별배지 상에서 성장시키고, 이의 5x10 개 세포를 인산염-완충 염수(PBS)로 3회 세척하고, 사람 MACIF에 대한 모노클로날 항체(IgGl)를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포를 배양함으로써 수득된 배양 상등액 500μl 중에 현탁시킨다. 빙 냉각시키면서 반응을 1시간동안 진행시킨다. 이와 병행하여, 사람 단백질 S에 대한 모노클로날 항체(IgGl)를 생성할 수 있는 하이브리도마 세포의 배양으로부터 수득된 배양 상등액을 사용하여, 동일한 방법으르 대조 실험을 실시한다. 반응 후, 세포를 2% 태아 송아지 혈청 및 0.1% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS(하기 세척용액으로 언급)로 3회 세척한 후, 동일한 세척 용액으로 50배 희석된 FITC(플로오레세인 이소티오시아네이트)-표지된 항-마우스 면역 글로불린(Amersham Japan)과 1x10 개 세포/ml의 농도로 30분 동안 빙냉각시키며 반응시킨다. 그런 다음 세포를 세척용액으로 3회 세척하고 유동 세포 계수기(EPICS PROFILE, Coulter, U.S.A.)로 분석한다. 항-사람 MACIF 항체가 사용될 때, 제8도(a 및 b)에 도시된 바와 같이 형광강도는 보다 높은 수준으로 전이됨을 알수 있는데, 이는 세포에 항-사람 MACIF 항체가 결합됨을 나타낸다. 이로써 형질전환된 CHO 세포가 사람 MACIF를 발현 한다는 것이 확인되었다.
더욱이, 형질전환된 CHO 세포를 PBS로 세척한 후 37℃에서 30분 동안 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC, Funakoshi, Sapporo Breweries)와 함께 항온처리한다. 세척용액으로 3회 세척한 후, 상기에서와 동일한 방법으로 항-사람 MACIF 모노클로날 항체 및 FITC-표지된 항-마우스 면역글로불린으로 형광염색시킨다. 제8C도에 도시된 바와 같이, PI-PLC로 처리했을 때 형광 강도는 대조수준으로 저하 되는데, 이는 형질전환된 CHO 세포 내에서 발현된 사람 MACIF가 PI-PLC로 처리할 때 막으로부터 방출된다는 것을 나타낸다. 이로써 형질전환된 CHO 세포상에서 발현된 사람 MACIF가 PI-PLC로의 절단에 민감한 PI 앵커를 지닌 단백질로서 세포 막상에서 발현된다는 것이 확인되었다.
3) CHO 세포내에서 사람 MACIF cDNA 발현으로부터 생성된 단백질의 생물학적 활성 평가
상기 언급한 형질전환된 CHO 세포내에서 발현된 사람 MACIF의 생물학적 활성 특성을 확인하기 위하여, 형질전환체 CHO 세포를 배양하여 다량으로 제조하고, PBS로 세척하여 세포를 다양한 단백질 분해효소 억제제[1mM 벤즈아미딘, 2mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 2mM 에틸렌디아민테트라 아세트산(EDTA) 및 2mM 에틸렌 글리콜 비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)(모두 Sigma로부터 수득)]를 함유하는 PBS 중에서 2%의 NP40으로 4℃에서 밤새 처리하여 가용화시킨다. 원심분리(12,000rpm, 30분)에 의해 수득한 각각의 상등액을 상기(5)-2-1)에서 언급한 방법에 의해 항-사람 MACIF 모노클로날 항체 컬럼을 사용하여 부분 정제시킨 후 생물학적 활성을 평가한다.
형질전환체 CHO 세포로부터 부분 정제된 사람 MACIF의 MAC 형성 억제 활성(반응성 용해 억제 활성)을 (5)-2-2)에서 기술한 방법에 의해 평가한다. 제9도에 나타낸 바와 같이, CHO 세포내에서 발현된 사람 MACIF는 MAC 형성 억제 활성을 나타내는데, 이는 용량-의존적이다. 이 억제 활성은 사람 적혈구-유래된 MACIF에 대한 마우스 모노클로날 항체에 의해 중화된다.
상기 결과는 CHO 세포내에서 발현된 사람 MACIF가 활성에 있어서 사람 적혈구-유래된 MACIF와 동일함을 명백하게 나타낸다.
(8) 변형된 사람 MACIF 단백질을 암호화하는 유전자의 에스케리키아 콜라이 내에서의 발현:
1) 변형된 사람 MACIF 단백질 발현 벡터의 작제 및 에스케리키아 콜라이 내에서의 발현
1-1) 에스케리키아 콜라이 내에서의 발현을 위한 벡터의 제조
에스케리키아 콜라이 내에서의 발현을 위한 벡터 pYEJOO1(Pharmacia; 제10도)을 제한 효소 HindIII로 절단하고 복제원 및 문제의 유전자 발현을 위한 프로모터를 함유하는 벡터 주요부를 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고 정제한 후 말단 인산염 그룹 제거를 위해 알칼리 포스파타제로 처리한다.
SD 서열, 변형된 사람 MACIF 단백질 유전자 및 전사 터미네이터를 포함하는 벡터에 삽입된 DNA 단편을 하기 방법으로 제조한다.
1-2) 103번 아미노산 잔기까지의 펩타이드 서열을 포함 하는 변형된 사람 MACIF 단백질(E103)의 발현을 위한 삽입 DNA 단편의 제조
pGEM 352-3을 제한 효소 PstI, HincII 및 Bam HI으로 절단하고 약 310bp의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동을 통해 분리하고 정제한다. 별도로, 하기 서열식(VI)에 의해 나타낸 합성 DNA B 및 C를 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 말단 포스포릴화시킨다:
Figure kpo00014
합성 DNA A(상기 도시) 및 포스포릴화된 B를 90℃로 가열한 후 서서히 16℃까지 냉각시켜 어닐링시킨다. 포스포릴화된 C 및 합성 DNA D(상기 도시)를 동일한 방법으로 처리하여 어닐링 시킨다. 2개의 DNA 어닐링 산물 및 이미 제조된 약310bp의 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시키고, 변형된 사람 MACIF 단백질 E103을 암호화하는 영역을 포함하는 약 375bp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기 영동을 통해 분리하고 정제한다.
1-3) 86번 아미노산 잔기까지의 펩타이드 서열을 포함하는 변형된 사람 MACIF 단백질(E86)의 발현을 위한 삽입 DNA 단편의 제조
이미 제조된 약 310bp의 DNA 단편을 제한 효소 NboII로 절단하고 약 250bp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고 정제한다.
별도로, 서열식(VII)의 4개의 합성 DNA 중 2개(B 및 C)를 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 말단 포르포릴화시킨다:
Figure kpo00015
A 및 포스포릴화된 B를 90℃까지 가열한 후, 16℃로 단계적으로 냉각시켜 어닐링 시킨다. 포스포릴화된 C 및 비포스포릴화된 D를 동일한 방식으로 처리하여 어닐링 시킨다. 2개의 어닐링 산물 DNA 및 이미 제조된 약 250bp의 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 함께 연결시키고 변형된 MACIF 단백질 E86을 암호화하는 영역을 포함하는 약 325bp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고, 정제한다.
1-4) 에스케리키아 콜라이내에서 변형된 사람 MACIF 단백질의 발현을 위한 벡터의 제조 및 이 벡터를 사용한 형질전환
이와 같이 제조한 2기의 DNA 단편을 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 말단 포스포릴화시킨 후, T4 DNA 리가제를 사용하여 별도로 제조한 벡터 주요부와 연결시킨다. 연결 혼합물을 이.콜라이 K12JM109를 형질전환시키기 위해 사용한다. 알칼리 방법(상기 참조)에 의해 수득한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고 제한효소를 사용하여(예: PstI으로 절단) 분석한 수, 유전자가 발현될 수 있는 방향으로 삽입된 문제의 유전자를 지닌 플라스미드를 선별한다.
1-5) 발현 및 배양
100μm/m의 엠피실린으로 보충된 2xYT 배지(리터당 박토트립톤 16g, 효모추출물 10g 및 리터당 염화나트륨 5g) 1용적을 문제의 유전자의 발현을 가능하게는 재조합 이.콜라이 균주의 예비배양물 1/50 용적으로 접종한다. 그런 다음 배양물을 37℃에서 진탕시키고 재조합 이.콜라이 균주를 세포 밀도가 약 5x107/ml에 도달할 때까지 성장시킨 후 이소프로필티오갈락토피라노사이드를 2.5mM의 농도로 가한다. 추가로 16시간 배양한 후 세포를 수거한다.
수거한 세포를 2mM EDTA, 2mM EGTA, lmM 벤즈아미딘, 2mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)(모두 Sigma로부터 구입)를 함유하는 PBS 내에 현탁시키고 만톤-가우린 균질기를 사용하여 분쇄한다.
2) 에스케리키아 콜라이내에서 변형된 사람 MACIF 단백질 유전자의 발현으로부터 생성된 단백질의 정제 및 생물학적 활성 검정
2-1)정제
상기에서와 같이 제조한 에스케리키아 콜라이 세포 분쇄 산물을 원심분리(12,000rpm, 30분)시키고 침전물을 가용화를 위해 5M 구아니딘 염산염의 존재하에서 4℃에서 밤새 교반한다.
잔존 불용성 물질을 상기 언급한 바와 동일한 조건하에서 원심분리시킴으로써 제거한다. 상등액 내에 함유된 발현 산물 단백질(E103 또는 E86)을 윙클러 및 블레이버[참조; Winkler, M.E. 및 Blaber, M., Biochemistry, 256, 4041-4045(1986)]의 방법에 따라 산화 형태 및 환원 형태의 글루타티온(Sigma)의 존재하에 처리함으로써 재구성한다.
재구성된 혼합물을 10mM 트리스 완충액(pH 8.0)에 대해 완전히 투석시킨 후, 동일한 완충용액으로 예비평형시킨 Q-세파로스(Pharmacia)에 적용시켜 정제한다.
2-2) 변형된 사람 MACIF 단백질 (E103)의 활성:
제11도에 나타낸 바와 같이, 섹션(5)2-2)에 기술한 방법으로 수득한 반응성 용해 억제 활성 자료는 두 개의 피크를 보여준다. 그러나, 두 번째 활성 피크(25번 분획 주위) 자체는 항-사람 MACIF 모노클로날 항체에 의해 부분적으로 중화된다.
제12도에 나타낸 바와 같이, 나트륨 도데실 설페이트(SDS-PAGE)의 존재하에 수행한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 제2 활성 피크와 일치하는 주요 밴드를 생성한다. 따라서, 이들 활성 분획을 항-사람 MACIF 항체 컴럼상에서 더욱 정제하여, 동일한 방법으로 반응성 용해 억제 활성을 측정한다. 제13도에 나타낸 바와 같이. 정제된 발현산물 단백질(E103)은 용량-의존적 방식으로 용혈 억제활성을 보이고 억제활성은 항-사람 MACIF 모노클로날 항체에 의해 완전히 중화된다.
2-3) 변형된 사람 MACIF 단백질 (E86)의 활성
E103의 경우와는 달리, 수득된 활성자료는 항체에 의해 중화될 수 있는 활성의 주요 피크를 나타내지 않는다(제14도). 그러나, 제15도에 나타낸 SDS-PAGE 분석 결과를 기준으로 주요 밴드-함유 분획(26번 내지 30번)을 항-사람 MACIF 항체컬럼 상에서 정제한 후 반응성 용해 억제 활성 측정을 실시한다. 제16도에 나타낸 바와 같이, 정제된 발현 산물 단백질(E86)은 용량-의존적 방식으로 용혈 억제 활성을 나타낸다. 또한, 억제 활성은 항체에 의해 완전히 중화된다.
상기 결과는 에스케리키아 콜라이 내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질이 사람 적혈구-유래된 MACIF의 활성과 동일한 활성을 지니고 사람 MACIF가 탄수화물 쇄 또는 PI 앵커를 갖지 않을지라도 반응성 용해 억제 활성을 나타낼 수 있음을 나타낸다.
(9) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 및 이의 생물학적 활성의 확인:
1) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질(C86)의 발현
1-1) CHO 세포내에서 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제 섹션(6)에서 수득한 플라스미드 pVY1을 CHO 세포 내에서의 발현용 벡터로서 사용한다. 따라서, pVY1을 Bg1II로 절단하여 하기의 재조합 플라스미드 작제를 실시한다.
pGEM352-3을 Eco0109I 및 StyI으로 절단하고, StyI 절단 부위에서 포스포릴화된 서열 15의 합성 DNA와, Eco01091 절단부위에서 포스포릴화된 서열 16의 합성 DNA와 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결한다:
Figure kpo00016
Figure kpo00017
그런다음 341bp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고 정제한다. 이 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 BglII-절단된 pVY1과 연결하고 연결 혼합물을 이.콜라이 HB101을 형질전환시키는데 사용하여 테트라사이클린-내성 형질전환체를 수득한다. 이것으로부터 알칼리 용균 방법에 의해 플라스미드를 제조하고, 제한 효소(PstI등)를 사용하여 분석한 후, 문제의 유전자를 위한 재조합 발현 플라스미드를 선별한다.
1-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인:
DHFR-결핍 CHO 세포(상기 참조)를 상기 방식으로 작제된 발현 벡터로 인산칼슘 방법에 의해 형질감염시킨다. 메토트렉세이트의 존재하에 선별배지[MEM α(-), Gibco] 내에서 성장할 수 있는 형질전환체 균주를 수득하고 연속되는 연구중에 사용한다.
상기 방식으로 형질전환된 108개 CHO 세포를 배양하고 배양 상등액을 항-MACIF 모노클로날 항체 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피시킨 후, 섹션(5)-2-1)에서 기술한 공정을 진행한다. 이 항체 컬럼에 결합된 분획을 나트륨 티오시아네이트 3M 수용액으로 용출시킨다. 각각의 용출물 분획을 PD-10 컬럼(Pharmacia) 상에서 탈염시키고 토끼 항-천연 사람 MACIF 항체를 사용한 경쟁적 ELISA로 항원의 유무를 평가한다. 그 결과, 사람 MACIF 항원이 상기 친화성 크로마토그래피에서 결합된 분획내에 존재한다는 것이 확인되었다.
이 결과는 1번 내지 86번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 함유하는 변형된 사람 MACIF가 본 발명에 따라 CHO 세포내에서 성공적으로 발현된다는 것을 입증한다.
2) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질(C82)의 발현
2-1) CHO 세포내에서 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제
Eco 01091I 부위에서 포스포릴화된 서열 17의 DNA 단편이 발현 플라스미드 작제에 사용된다는 점을 제외하고는 (9)-1-1)의 방법을 반복한다:
Figure kpo00018
2-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인
(9)-1-2)의 공정을 실시하고, 상기 언급된 재조합 벡터로 형질전환된 CHO 세포로 수득된 배양 상등액 내에서 사람 MACIF 항원을 검출한다. 이러한 결과는 1번 내지 82번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 함유하는 변형된 사람 MACIF 단백질이 본 발명에 따라 CHO 세포 내에서 성공적으로 발현된다는것을 나타낸다.
3) CHO 세포내 변형된 사람 MACIF 단백질(C77)의 발현 및 이의 생물학적 활성의 확인
3-1) CHO 세포내에서 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제
상기(6)에서 기술한 바와 같이 수득한 플라스미드 pVY1을 CHO 세포내에서 유전자 발현을 위한 벡터로서 사용한다. pVY1을 Bg1II로 절단하고 이어서 재조합 플라스미드 작제를 실시한다.
pGEM352-3을 Eco0109I 및 StyI으로 절단하고, StyI 절단 부위에서 포스포릴화된 서열 15의 합성 DNA와, Eco0109I에서 포스포릴화된 서열 18의 합성 DNA 단편과 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결시킨다:
Figure kpo00019
그런 다음 314bp의 DNA 단편을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분리하고 정제한다. 이 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 Bg1II-절단된 pVY1으로 연결하고 연결혼합물을 이.콜라이 HB101을 형질전환시키는데 사용하여 테트라사이클린-내성 형질전환체를 수득한다. 이들로부터 알칼리 용균 방법에 의해 플라스미드를 제조하고, 제한 효소(PstI 등)를 사용하여 분석한 후, 문제의 유전자를 발현할 수 있는 재조합 플라스미드를 선별한다.
3-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인
DHFR-결핍 CHO 세포(상기 참조)를 상기 방식으로 작제한 발현 플라스미드로 인산 칼슘 방법에 의해 형질감염시키고 메토트렉세이트의 존재하에 선별 배지(MEMα(-), Gibco]내에서 성장할 수 있는 형질전환체를 분리하여 추가 연구를 위해 사용한다.
상기 방법으로 형질 전환된 108개 CHO 세포를 배양하고, 배양 상등액을 항-MACIF 모노클로날 항체 컬럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피시킨 후, (5)-2-1)에서 기술한 바와 같이 실시한다. 이 항체 컬럼에 결합된 분획을 나트륨 티오시아네이트 3M 수용액으로 용출시키고, 용출물 분획물 PD-10 컬럼(Pharmacia) 상에서 탐염시키고, 토끼 항-MACIF 항체를 사용한 경쟁 ELISA로 항원의 유무를 검정한다. MACIF 항원의 존재는 상기 친화성 크로마토그래피에서 결합된 분획 내에 있다는 것을 확인한다.
이 결과는 1번 내지 77번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 함유하는 변형된 사람 MACIF 단백질이 CHO 세포내에서 성공적으로 발현된다는 것을 나타낸다.
3-3) 생물학적 활성의 확인:
상기 (9)-3-2)에서 기술한 정제방법에 의해 형질전환된 CHO 세포의 대량 배양으로부터 생성된 배양 상등액으로부터 부분 정제된 변형된 사람 MACIF 단백질 C77의 샘플을 SGVB2+을 위한 완충액 교환을 실시한 후 (5)-2-2)에서 기술한 바와 같이 수행되는 MAC 형성 억제 활성 검정을 실시한다. 제17도에 나타낸 바와 같이, CHO 세포내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 C44은 용량-의존 방식으로 MAC형성 억제 활성을 나타낸다. 억제 활성은 적혈구-유래된 천연 사람 MACIF에 대한 마우스 모노클로날 항체에 의해 중화된다.
상기 결과로부터, CHO 세포내에서 발현되어 배지내로 분비되는 변형된 사람 MACIF 단백질 C77이 사람 적혈구-유래된 천연 MACIF의 활성과 동일한 활성을 지닌다는 것이 명백하다.
4) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질(C76)의 발현 및 이의 생물학적 활성의 확인
4-1) CHO 세포내에서 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제
Eco0109I 부위에서 포스포릴화된 서열 19의 DNA 단편이 발현 플라스미드 작제에 사용된다는 점을 제외하고는 (9)-1-1)에서 기술한 바와 동일한 공정을 실시한다:
4-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인
(9)-1-2의 방법에 따라, 사람 MACIF 항원이 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포의 배양으로부터 생성된 배양상등액내에서 검출된다. 이 결과는 1번 내지 76번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드로 이루어진 변형된 사람 MACIF 단백질이 CHO 세포내에서 성공적으로 발현된다는 것을 나타낸다.
4-3) 생물학적 활성의 확인
형질전환된 CHO 세포의 대량 배양으로부터 생성된 배양 상등액을 (9)-3-3)에 기술한 방법에 따라 CHO 세포내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질 (C76)의 MAC 형성 억제 활성을 평가하는데 사용한다. 제18도에 나타낸 바와 같이, C76은 용량 의존적 방식으로 활성을 나타낸다.
상기 언급한 결과로부터, CHO 세포내에서 발현되고 배지내로 분비된 변형된 사람 MACIF 단백질(C76)은 사람 적혈구-유래된 천연 MACIF의 활성과 동일한 활성을 가진다는 것이 명백하다.
5) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질(C75)의 발현
5-1) CHO 세포내에서 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제
Eco0109I 부위에서 포스포릴화된 서열 20의 DNA 단편이 발현 플라스미드 작제에 사용된다는 점을 제외하고는 (9)-1-1)에서 기술한 바와 동일한 공정을 실시한다:
Figure kpo00021
Figure kpo00022
5-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인
(9)-1-2)의 방법에 따라, 상기 언급한 재조합 벡터로 형질전환된 세포로 수득된 배양 상등액내에서 사람 MACIF 항원을 검출한다. 이 결과는 1번 내지 75번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 함유하는 변형된 사람 MACIF 단백질이 CHO 세포 내에서 성공적으로 발현된다는 것을 나타낸다.
(6) CHO 세포내에서 변형된 사람 MACIF 단백질(C70)의 발현 및 이의 생물학적 활성의 확인:
6-1) CHO 세포내에서 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 작제
Eco 0109I 부위에서 포스포릴화된 서열 21의 DNA 단편이 발현 플라스미드 작제에 사용된다는 점을 제외하고는 (9)-1-1)에서 기술한 바와 동일한 공정이 실시된다:
Figure kpo00023
Figure kpo00024
6-2) CHO 세포내에서 유전자 발현의 확인
(9)-1-2)의 방법에 의해, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포로 수득된 배양 상등액 내에서 사람 MACIF 항원을 검출한다. 이 결과는 1번 내지 70번 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드를 함유하는 변형된 사람 MACIF 단백질이 CHO 세포내에서 성공적으로 발현된다는 것을 나타낸다.
6-3) 생물학적 활성의 확인
CHO 세포내에서 발현된 변형된 사람 MACIF 단백질(C70)의 MAC 형성 억제 활성은 형질전환된 CHO 세포의 대량 배양에 의해 수득된 배양 상등액을 사용하여 (9)-3-3)의 방법에 따라 측정한다. 제19도에 나타낸 바와 같이, C70은 용량-의존적 방식으로 활성을 나타낸다.
상기 언급된 결과로부터, CHO 세포내에서 발현되어 배지로 분비된 변형된 사람 MACIF 단백질(C70)이 사람 백혈구-유래된 천연 MACIF의 활성과 동일한 활성을 가진다는 것이 명백하다.
본 발명이 이의 특정 양태를 참조로 상세히 기술되었으나, 당해분야의 숙련가에게는 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형을 할 수 있음이 명백하다.

Claims (34)

  1. 사람 MACIF(Membrane Attack Complex Inhibition Factor) 활성을 갖는, 하기 아미노산 서열의 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00025
    상기서열에서, X 는 H, Met 또는 아미노산 서열
    Figure kpo00026
    을 나타내고, Y는 OH 또는 아미노산 서열
    Figure kpo00027
    을 나타내거나 이 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1 내지 32개의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 유도된 아미노산 서열을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00028
  3. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00029
  4. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00030
  5. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00031
  6. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00032
  7. 제1항에 있어서, Y가 하기 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 유전자.
    Figure kpo00033
  8. 제1항에 있어서, Y가 OH인 펩타이드를 암호화하는 유전자
  9. 제1항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할 수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제1항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  10. 제2항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제3항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  11. 제3항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 졀합된 제4항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  12. 제5항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제4항의 조절유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  13. 제5항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제5항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  14. 제6항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제6항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  15. 제7항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제8항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  16. 제8항의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 할 수 있는 조절 유전자 DNA에 효율적으로 결합된 제8항의 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터.
  17. 제9항에 있어서, 포스파티딜이노시톨 앵커 (PI anchor)가 폴리펩타이드의 C 말단에 부착될 수 있는 숙주 세포내에서 복제되고 유지될 수 있는 재조합 발현 벡터.
  18. 제9항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  19. 제10항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  20. 제11항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  21. 제12항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  22. 제13항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  23. 제14항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  24. 제15항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  25. 제16항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
  26. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00034
    상기서열에서, X는 H 또는 Met이고, Y 는 OH 또는 아미노산 서열
    Figure kpo00035
    을 나타내거나 이 아미노산 서열의 C 말단으로부터 1 내지 32개의 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 유도된 아미노산 서열을 나타낸다.
  27. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00036
    Figure kpo00037
    상기서열에서, X는 H 또는 Met이다.
  28. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00038
    상기서열에서, X는 H 또는 Met이다.
  29. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00039
    상기서열에서, X는 H 또는 Met이다.
  30. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00040
    상기서열에서, X는 H 또는 Met이다.
  31. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00041
    상기서열에서, X 는 H 또는 Met 이다.
  32. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00042
    상기서열에서, X 는 H 또는 Met 이다.
  33. 하기 아미노산 서열의 펩타이드.
    Figure kpo00043
    상기서열에서, X 는 H 또는 Met 이다.
  34. 하기 아미노산 서열의 펩타이드의 C 말단에 PI 앵커를 부착시킴으로써, 하기 아미노산 서열의 펩타이드로부터 유도된 단백질.
    Figure kpo00044
    상기서열에서, X 는 H 또는 Met이다.
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