IT8922620A1 - Peptide-2 che attiva i neutrofili - Google Patents
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dell'invenzione industriale dal titolo:
"Peptide-2 che attiva i neutrofili"
RIASSUNTO
Si descrive un nuovo fattore avente l'attivit? di stimolare i neutrofili e che viene isolato da luocociti e/o piastrine del sangue. Esso ? strutturalmente e funzionalmente correlato al fattore che attiva i neutrofili NAF/NAP-1 ed ? anche strutturalmente correlato alla B-tromboglobulina, PBP e CTAP--III.
Si ? stabilita la sequenza, il peso molecolare del fattore ? circa 650U-77Q0. Si sono trovate anche tre varianti.
Il fattore pu? venire preparato da sorgenti naturali oppure mediante tecniche del DNA ricombinante.
La presente invenzione riguarda una sostanza immuno-modulante.
Essa riguarda pi? in particolare un fattore immuno-stimolante che attiva i leucociti neutrofili, in particolare leucociti neutrofili umani. Essa qui di seguito viene denominata attivit? stimolante dei neutrofili 1 (NSA-1) oppure, come sinonimo, peptide--2 che attiva i neutrofili (NAP-2).
I leucociti neutrofili (neutrofili) sono i leucociti pi? comuni e rappresentano circa i 2/3 dei globuli bianchi nel sangue umano. Essi hanno una funzione principale che ? quella di proteggere l'organismo ospite contro infezioni microbiche. I neutrofili sono mobili, sono reattivi nei confronti di stimoli chemiotattici generati in seguito ad infezione e sono in grado di muoversi nei tessuti infettati per uccidere i microorganismi. La distruzione dipende dalla capacit? dei neutrofili a fagocitare i microorganismi e liberare radicali ossigeno ed enzimi microbicidi. Il rilascio di tali prodotti dipende dalla attivazione dei neutrofili.
Sono note poche proteine che hanno una tale attivit?, come fattore attivante dei neutrofili (NAF) (P. Peveri et al., J. Exp. Med. 167 /1988/ 1547), denominato anche peptide-1 attivante i neutrofil i (NAP-1).
Si ? ora trovato che si produce una attivit? stimolante dei neutrofili, da leucotici stimolati in coltura e pu? venire ottenuta dal fluido della coltura. L'attivit? stimolante i neutrofili viene denominata qui come NSA-1 oppure come sinonimo peptite-2 che attiva i neutrofili (NAP-2)
'Si ? inoltre trovato che NSA-l/NAP-2 ? strutturalmente molto simile alla ?-trombog lobulina (?-TG), al peptide III che attiva il tessuto connettivo (CTAP-III) e alla proteina di base delle piastrine (PBP).
Un oggetto dell'invenzione ? quello di mettere a disposizione NSA-l/NAP-2 oppure una variante funzionale, un frammento oppure un suo derivato che ha ancora questa attivit? biologica, per esempio una muteina, in un grado di purezza sufficiente a consentire la sua ulteriore caratterizzazione e preparazione per esempio mediante tecniche del DNA ricombinante e il suo impiego farmaceutico.
L'invenzione mette a disposizione inoltre un procedimento per la produzione di NSA-l/NAP-2 per esempio da leucociti e/o piastrine del sangue umano.
Essa inoltre mette a disposizione l'impiego di NSA-l/NAP-2 nella attivazione di leucociti neutrofili e cos? fa aumentare la resiste-nza alle infezioni .
L?invenzione mette a disposizione inoltre un procedimento per produrre NSA-l/NAP-2 oppure una sua variante funzionale, un suo frammento, oppure un suo derivato oppure un suo prodotto strutturalmente simile biologicamente attivo come S-TG, CTAP-Iil o P8P mediante tecniche del DNA ricombinante il quale procedimento consiste nel clonare un gene corrispondente che comprende una sequenza leader naturale per esempio una sequenza leader naturale endogena alle piastrine umane, nell'esprimerla in un ospite adatto e opportunamente nel recuperare il prodotto peptidico, se indicato impiegando una opportuna proteasi.
3. ABBREVIAZIONE
BSA albumina di siero bovino;
CTAP-III: peptide che attiva il tessuto connettivo I II DDS: dodecilsolfato di sodio,
DTT: ditiotreitolo;
fMLP: N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina; LPS: 1ipopolisaccaride ottenuto da E.coli 055:D5; MEM-1: mezzo essenziale minimo di Eagle (Seromed GmbH, Munich, FAG), integrato con 25 ug/m? di neomicina, tamponato a pH 7,4 con 25 mM NaHC03 e 20 mM HEPES; ??M-PPL: contiene in aggiunta una so-luzione di proteina del plasma pastorizzata all'1% (5% PPl-SRK, Swiss Red Cross Laboratory, Bern, Switzerland) e 100 Ul/ml di penicillina e streptomicina (Gi?co AG, Basel, Switzerland);
MoAbs: Anticorpi monoclonali;
mRNA: RNA messaggero;
NAF: fattore attivante dei neutrofili (= NAP-1); NAP-1: peptide-1 che attiva i neutrofili (= NAF); NAP-2: peptide-2 che attiva i neutrofili (= NSA-1); NEM: N-etilmaleimmide;
NSA-1: attivit? stimolante i neutrofili 1 (= NAP-2); PBP: proteina di base delle piastrine;
PBS: salina tamponata con fosfato senza Ca e Mg ; PBS-BSA: PBS integrata con 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2 e 2,5 mg/ml di BSA;
PRP:plasma ricco in piastrine;
PHA-P: fitoemoagg1utinina (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)
PMN: cellule polimorfonucleari-neutrofili
PMSF : fenilmetano-solfonilfluoruro;
SDS-PAGE: elettroforesi su gel di poiiacri1ammidedodecilsolfato di sodio;
SSPE : 180 mM NaC l ; 1 0 mM NaH2PO4 ; 1 mM EDTA ; pH 7 , 4 ; ? -TG : ?-tromboglobulina.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
NSA-l/NAP-2 ? caratterizzato biologicamente dalle sue propriet? di attivare i neutrofili, in particolare l'induzione del rilascio di enzimi-granuli. In termini molecolari il NSA-l/NAP-2 ? caratterizzato daunpeso molecolare di circa 7500 e da un punto isoelettrico calcolato di circa 8,7.
Esso viene prodotto per esempio da leucociti e/o piastrine di sangue umano mediante un procedimento che comprende una purificazione da fluidi di coltura di leucociti e/o piastrine di sangue stimolati, mediante cromatografia su fosfocel1ulosa e cromatografia a fasi inverse.
Si pu? produrre NSA-l/NAP-2 da specie diversa da quella umana in modo simile da corrispondenti leucociti e/o piastrine del sangue.
Si pu? effettuare la stimolazione con qualsiasi agente noto come LPS e PHA-P.
La cromatografia su fosfocellulosa pu? venire effettuata per esempio su una colonna di fosfocellulosa equilibrata con un tampone fosfato di potassio-/NaCl/EDTA/glicerolo ad un pH circa neutro per esempio pH 7,2 e mediante successiva eluizione per esempio con un gradiente a concentrazione lineare di cloruro di sodio nel medesimo tampone.
La cromatografia a fasi inverse preferibilmente viene effettuata dopo la cromatografia su fosfocellulosa e viene effettuata preferibiImente dapprima su una colonna C4 a fasi inverse preparativa eluita con per esempio un gradiente da 0 a 80% di acetonitrile in acido trif1uoroacetico allo 0,1%; quindi su una colonna CN-propile eluita con per esempi? un gradiente da 0 a 80% di acetonitrile in acido trifiuoroaceti co allo 0,1%; e quindi le frazioni attive vengono di nuovo fatte passare su una colonna C4 a fasi inverse analitica in condizioni simili a quelle adottate per la cromatografia su CN-propile.
Si pud seguire l'andamento della purificazione dalle figure la, Ib e le.
L'andamento della purificazione viene seguita mediante analisi sulla attivit? di stimolazione dei neutrofili, per esempio come capacit? di indurre il rilascio di elastasi da neutrofili umani preventivamente trattati con citocalasina B (B. Dewald and M. Baggiolini, Biochem. Pharmacol . 36 /?987 J 2505--2510).
Si trova che il NSA-l/NAP-2 ha un peso molecolare apparente di circa 6500 in seguito ad elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS-urea al 20%.
Il punto isolelettrico apparente ? circa 8,3.
L'analisi della sequenza di amminoacidi mostra (figura 2) che i primi 20 amminoacidi N-terminali corrispondono esattamente ad una porzione comune della sequenza di proteina di base delle piastrine {PBP ) e di suoi derivati strutturali CTAP-III (C.W. Castor et al., PNAS 80 [19837 765-769) e B-tromboglobulina (G.S. Begg et al., Biochemistry 17 /?9787 1739-1744). L'estremit? amminica del NSA-l/NAP-2 corrisponde all'amminoacido 16 del CTAP-III e all'amminoacido 12 di 0-TG. La digestione con carbossipeptidasi Y mostra che le sequenze degli amminoacidi C-tprminali sono identiche (-Glu-Ser--Ala-Asp). Il NSA-l/NAP-2 corrisponde completamente alla sequenza di B-TG ed ? costituito da 70 amminoacidi con un peso molecolare calcolato di 7628 e con un punto isoelettrico calcolato di 8,7. La sequenza completa di 70 amminoacidi viene mostrata nella figura 4. La totale omologia tra NSA-l/NAP-2 e NAF/NAP-1 ? 46%. La sequenza di NSA-l/NAP-2 non contiene eventuale siti evidenti per N-glicosilazione. Vi ? un sito potenziale per la fosforilazione con proteina-chinasi C (Thr) in corrispondenza della posizione 39 e un possibile sito di amminazione (Asp) in corrispondenza della posizione 42.
Il NSA-l/NAP-2 pu? quindi venire visto come un frammento di B-TG.
La sequenza di NSA-l/NAP-2 pu? venire allineata a quella di NAF/NAP-1 sulla base dei due primi residui di cisteina (cis 5 e cis 7 per NSA-l/NAP-2 e Cis 7 e Cis 9 per NAF/NAP-1). Quando si allinea in questo modo, circa met? dei primi 20 amminoacidi di NSA-1 NAP-2 e NAF/NAP-1 sono identici. I due fattori sono cos? correlati non solo funzionalmente ma in certa misura anche strutturalmente.
La disponibilit? della sequenza di amminoacidi di NSA-l/NAP-2 consente la sua preparazione mediante ulteriori procedimenti oltre all'isolamento da una sorgente naturale descritta sopra. Cos?, poich? il peptide comprende soltanto 70 amminoacidi, ? possibile la sintesi totale in modo convenzionale, per esempio adottando il metodo allo stato solido di Merrifield e tenendo conto della presenza di due legami di disolfuro.
Ulteriori procedimenti di produzione comprendono tecniche del DNA ricombinante, per esempio mediante clonazione ed espressione di un corrispondente gene sintetico, eventualmente dopo ottimizzazione del codone. La sintesi chimica e la espressione in lievito di un gene che codifica CTAP-III ? stata descritta (G.T. Mullenbach et-al., J. Biol. Chem. 261 [1986] 719) e cos? ? anche applicabile alla produzione di peptidi simili come il NSA-1/-NAP-2. Tuttavia, soltanto parte del CTAP-III prodotto aveva una attivit? biologica. Sembra probabile che un avvolgimento sbagliato e una formazione non corretta di legami di disolfuro fossero i problemi principali. Nessun DNA codificante per una sequenza guida ? stato incorporato nel gene sintetico poich? per questa classe di composti non era ancora nota nessuna tale sequenza guida.
Un ulteriore metodo di produzione mediante tecniche del DNA ricombinante ? la clonazione e l'espressione di un gene che comprende una sequenza guida naturale, per esempio una sequenza guida naturale endogena alle piastrine umane, per esempio mediante clonazione ed espressione di un cDNA scelto da una opportuna raccolta di espressioni e che codifica per NSA-I/NAP-2 oppure un peptide pi? grande che comprende NSA-l/NAP-2 come ?-TG, CTAP-III o PBP e il recupero di NSA-l/NAP-2 in modo convenzionale dal prodotto di espressione. Tale sequenza guida ? per esempio costituita dai primi 34 amminoacidi nella sequenza della figura 5 oppure ? un suo frammento o derivato funzionale. L'esempio 7 descrive la ci?nazione di un cDNA che codifica per CTAP-III da una raccolta di espressioni ? gtll derivata da piastrine umane. Il recupero del peptide desiderato ottenuto da un peptide di partenza pi? grande per esempio pu? venire effettuato tagliando opportunamente il peptide pi? grande in modo convenzionale con una proteasi come per esempio una serina-proteasi.
Opportune proteasi possono venire isolate per esempio in modo convenzionale da monociti purificati. Esse sono molto sensibili a PMSF, sono moderatamente sensibili a leupeptina e sono insensibili nei confronti di EDTA.
Come alternativa, la sequenza guida pu? essere direttamente legata al gene che codifica per il peptide desiderato.
Una preparazione tramite clonazione di un gene che comprende una sequenza guida naturale porta come risultato a prodotti costituiti da peptidi che hanno l'opportuno avvolgimento per una completa attivit? biologica, per esempio per dirigersi verso alfa-granulo, quando viene espresso in cellule di mammiferi.
Secondo metodi noti nel settore si possono preparare frammenti oppure derivati funzionali, per esempio muteine, di NSA-l/NAP-2.
Si sono inoltre trovate tre varianti di NSA-1/NAP-2 con una attivit? biologica alquanto ridotta, che hanno la sequenza dei 70 animino acidi mostrati nella figura 4 per? allungata in corrispondenza dell'estremit? N con 3,4 e rispettivamente 5 corrispondenti animino acidi di CTAP-III (vedere figura 5). Esse hanno cos? la sequenza della figura 4 preceduta rispettivamente da
e hanno una lunghezza di 73, 74 e rispettivamente 75 ammino acidi.
Esse possono venire prodotte come descr?tto sopra nella preparazione di NAP-2 da leucac?ti e/o piastrine del sangue stimolati: dopo stimolazione con LPS in presenza di un liquido surnatante di una coltura di monociti, si ottiene oltre a NAP-2 un picco intermedio pi? piccolo contenente le varianti di 73-75 residui di NAP-2. Questo ulteriore picco ? costituito rispettivamente fino a 65,20 e 15% dalla forma con 74,75 e 73 residui.
Il NSA-l/NAP-2 e varianti, frammenti e derivati funzionali possiedono una attivit? biologica che li rende adatti per l'impiego come prodotti farmaceutici.
Per esempio, essi provocano una infiltrazione di neutrofili in ratti in un dosaggio compreso tra circa 1 ?g/kg e circa 100 ?g/kg di peso corporeo dell 'animale.
Il NSA-l/NAP-2 e sue varianti, frammenti e derivati funzionali sono quindi indicati per l'impiego nel trattamento di condizioni che sono associate oppure provocate, in modo locale oppure sistemico, da una modificazione del numero oppure dello stato di attivazione dei PMN (neutrofili- cellule polimorfonucleari). Essi modificano ampiamente questi parametri di PMN e pertanto sono indicati per l'impiego nel trattamento di condizioni nelle quali un aumento del numero oppure un miglioramento dello stato di attivazione dei PMN porta ad un miglioramento clinico, per esempio in infezioni provocate da batteri, micoplasma, lieviti e funghi e in infezioni virali. Inoltre essi sono indicati per l'impiego in malattie infiammatorie come psoriasi, condizioni artritiche e asma oppure in condizioni di un conteggio di neutrofili basso in modo anormale e/o in condizioni di un basso livello generalizzato di neutrofili e nella preparazione di antagonisti, per esempio anticorpi monoclonali per l'impiego in questi indicazioni.
Poich? come il NAP-1, si ? dimostrato che essi sono anche chemiotattici per linfociti T, essi sono indicati anche per l'impiego in certi stati di immunodeficienza.
Per queste indicazioni il dosaggio adatto naturalmente dipender? per esempio dall'ospite, dalla modalit? di somministrazione, dalla natura e dalla gravit? della condizione che viene trattata; tuttavia, viene indicato in generale che si ottengono risultati soddisfacenti in modo sistemico con dosaggi giornalieri compresi tra circa 1 mg/kg e circa 100 mg/kg di peso corporeo dell'animale. Per il soggetto pi? largo una dose giornaliera indicata ? compresa tra circa 0,1 mg e circa 100 mg, preferibilmente tra circa 0,1 mg e circa 10 mg, oppurtunamente somministrati per esempio,in dosi suddivise fino a 4 volte al giorno.
Composizioni farmaceutiche che comprendono il composto in associazione con almeno una sostanza--veicolo oppure un diluente farmaceuticamente accettabile possono venire fabbricate in modo convenzionale mescolando il composto con una sostanza-veicolo o diluente farmaceuticamente accettabile. Forme di dosaggio unitario contengono per esempio da circa 0,025 mg fino a circa 50 mg di composto.
Mentre il NSA-l/NAP-2 ? funzionalmente ampiamente simile a NAP-1, essa probabilmente pu? venire generato soltanto in vivo quando PBP e/o CTAP-III vengono liberati dalle piastrine, mentre la produzione di NAF/NAP-1 da parte di fagociti mononucleari e da una grande variet? di cellule di tessuti viene indotta da citochine infiammatorie simili al fattore di necrosi dei tumori e alla inter1eucina-?. Pertanto si pu? prevedere che i due peptidi si formino in situazioni fisiologiche differenti e in corrispondenza di siti differenti. Essendo derivato dalle piastrine, il NAP-2 viene prodotto principalmente in modo intravascolare quando avviene l'attivazione e l'aggregazione delle piastrine, per esempio in trombi e in lesioni aterosclerotiche, mentre il NAF-/NAP-1 si forma quasi invariabilmente nei tessuti.
Il NSA-l/NAP-2 e sue varianti non vengono trovati in piastrine o altri componenti delle colture di cellule manonucleari e sembra che vengano formati in seguito a rilascio. Essi presentano le propriet? tipiche di agonisti di recettori chemiotattici e inducono cambiamenti nel calcio libero citosolico, nella chemiotassi e nella esocitosi nel medesimo intervallo molare come NAF/NAP-1, mentre PBP, CTAP--III e PF-4 hanno seppure una scarsa attivit? in corrispondenza di concentrazioni da 100 a 10000 volte superiori. Si prevede che essi siano altrettanto efficaci come NAF/NAP-1 e C5a nel rinforzare i neutrofili e hanno un ruolo nella trombosi, in cui essi potrebbero attrarre neutrofili coinvolti nella ricanalizzazione di vasi ostruiti.
5. SPIEGAZIONE DELLE FIGURE
Figura la: Cromatografia in fase liquida ad alta pressi?ne a fasi inverse preparativa di NSA-1 su una colonna C4. Grafico superiore: distribuzione delle proteine, D0 in corrispondenza di 226 nm; grafico inferiore: attivit? di NSA-1, rilascio relativo di elastasi da neutrofili umani.
Sono evidenti due picchi: quello piccolo corrisponde a NSA-1/NAP-2 e quello pi? grande corrisponde a NAF/NAP-1.
Figura 1b: Cromatografia in fase liquida ad alta pressione a fasi inverse di NSA-l/NAP-2 su una colonna di CN-propile. I dettagli sono come nella figura la.
figura 1c: cromatografia in fase liquida ad alta pressione a fasi inverse di NSA-l/NAP-2 su una colonna C4. I dettagli sono come nella figura la.
Figura 2: Sequenza ammino-terminale di NSA-l/NAP-2. Vengono mostrati i primi 20 residui. Essi corrispondono ad una parte della sequenza della ?-tromboglobulina.
Figura 3: Esodtosi indotta da NSA-l/NAP-2 in neutrofili umani trattati con citocalasina B. Dipendenza dalla concentrazione.
Figura 4: Sequenza di animino acidi di NSA-l/NAP-2. Figura 5: Sequenza di cDNA e sequenza degli ammino acidi dedotta del precursore di PBP (inizia con nuclotide 103); CTAP-III (inizia con nucleotide 130); B-TG (inizia con il nucleotide 142) e NSA-l/NAP-2 (inizia con nucleotide 175). I due legami interni di disolfuro vengono identificati rispettivamente con asterischi e con quadrati. Il segnale di poliadenilazione presunta ? sottolineato (nucleotidi 581-586). Il sito di riconoscimento EcoRI ? segnato con una linea al di sopra.
ESEMPI
Gli esempi che seguono illustrano l'invenzione PARTE 1: PRODUZIONE DI NSA-l/NAP-2 DA SANGUE UMANO, PURIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE
esempio 1: Produzione di NSA-l/NAP-2 da leucociti e/o piastrine di sangue umano stimolati con LPS Si ? usato sangue di un donatore anticoagu1ato ottenuto dal Swiss Red Cross Laboratory ? conservato fino a 20 ore a 4-10?C. Le cellule mononucleari (costituite da monociti e linfociti in un rapporto di circa 1:5) sono state isolate da. singoli strati buffy su gradienti Ficol1-Hypaque (A. Boyum, 5cand. d. Immunol. 5 ??9767 9-15), e sono state lavate in MEM. Le cellule lavate ottenute da 6 strati buffy sono state di nuovo poste in sospensione in MEM-PPL (5x10 cellule/ml) e sono state sottoposte a coltura per 20 ore in presenza di 1 ug/ml di LPS in flaconi di vetro dotati di un dispositivo di agitazione. In corrispondenza di tempi differenti, si sono prelevati campioni del mezzo di coltura e si ? determinata l'attivit? di stimolazione dei neutro* fili come capacit? di indurre rilascio di elastasi da neutrofili umani preventivamente trattati con citocalasina B (B. Dewald and M. Baggiolini Biochem Pharm. 36 [1987] 2505-2510). Questa prova mette in evidenza NSA-1 e anche NAF, un fattore di attivazione dei neutrofili descritto in tempi precedenti (P. Peveri et al., J. Exp. Med. 167 Z1988.7 1547--1559). L'attivit? di stimolazione dei neutrofili ? aumentata con il passare del tempo e ha raggiunto un livello costante dopo 24-48 ore.
Esemplo 2: Produzione di NSA-1/NAP-2 da leucociti e/o piastrine di sangue umano stimolati con PHA-P Si ? usato sangue di un donatore anticoagulato, ottenuto dal laborazione della croce rossa svizzera e conservato per fino a 20 ore a 4-10?C. Le cellule mononucleari (costituite da monociti e linfociti in un rapporto di circa 1:5) sono state isolate da singoli strati buffy su gradienti Fico?l-Hypaque (Boyum, 1976), e sono state lavate in MEM. Le cellule lavate ottenute da 6 strati buffy sono state di nuovo poste in sospensione in MEM-PPL (5x10^ ce?lule/ml) e sono state sottoposte a coltura per 20 ore in presenza di 5 ul/ml di PHA-P in flaconi di vetro dotati in un dispositivo di agitazione. In corrispondenza di periodi di tempo differenti, si sono prelevati campioni del mezzo di coltura e si ? determinata l'attivit? di stimolazione dei neutrofili come la capacit? a indurre il rilascio di elastasi da neutrofili umani preventivamente trattati con citocalasina-B. L'attivit? di stimolazione dei neutrofili ? aumentata con il passare di tempo ed ha raggiunto un livello costante dopo 24-48 ore. Esemplo 3: Purificazione di NSA-1 /NAP-2 ottenuto da fluidi di coltura di leucociti e/o piastrine di sangue umano stimolati con LPS
a) cromatografia su fosfocel1ulosa
Porzioni da 700 mi di fluidi di coltura privi di cellule di leucociti umani stimolati come descritto nell?esempio 1 sono state direttamente caricate su una colonna di fosfocellulosa
Whatman PII) equilibrata con un tampone A (tampone di fosfato di potassio 20 mM, pH 7,2, contenente cloruro di sodio 20 mM, EDTA ImM e 5% di glicerolo. La colonna ? stata lavata con il medesimo tampone e quindi ? stata eluita (24 ml/ora) con 120 mi di un gradiente a concentrazione lineare di cloruro di sodio "(0,02 fino a 1,5 M) in tampone A. Le frazioni sono state analizzate per determinare l'attivit? di stimolazione dei neutrofili.
b) Cromatografia a fasi inverse
Frazioni attive ottenute dalla separazione mediante cromatografia su fosfocellulosa sono state riunite e sono state ulterioremente purificate mediante 4 passaggi ripetuti su una colonna C4 a fasi inverse preparativa a pori larghi (IO x250 mm, 7 um, Macherey-Nagel, Dueren, FRG). La colonna ? stata eluita ad una portata di 2 ml/minuto con un gradiente variante da 0 fino a 80% di acetonitrile in acido trifuoroacetico allo 0,1% con un incremento di 0,66% al minuto.
Le frazioni attive con un tempo di ritenzione di 20-26 minuti sono state riunite, sono state concentrate su una centrifuga Speed Vac e sono state caricate su una colonna di CN-propile e fasi inverse anal i ti ca ( 4 , 6 x 250 mm , 5 um , pori ampi Baker Research Products, Phillipsburg , N.J., USA). La colonna ? stata eluita a 0,5 ml/minuto con un gradiente da 0 fino a 80% di acetonitrile in acido trifiuoroacetico allo 0,1% con un incremento di 0,66% al minuto. Le frazioni attive con un tempo di ritenzione di 22-25 minuti sono state riunite, sono state concentrate e sono state fatte passare di nuovo su una colonna C4 a fasi inverse analitica (4,6x250mra, 5 micropori, pori ampi, Baker Research Products) nelle condizioni descritte per la colonna CN-propile. Le frazioni attive con un tempo di ritenzione di 42,5 minuti sono state essiccate in una centrifuga Speed Vac sono state di nuovo poste in sospensione in acqua sterile,e quindi sono state usate per l'analisi della sequenza in fase gassosa e per la prova biologica. La figura 1 mostra la separazione di NSA-l/NAP-2 da NAF/NAP-1 e le frazioni usate per l'analisi della sequenza di animino acidi.
Esempio 4: Elettroforesi su gel di NSA-l/NAP-2 purificato
NSA-l/NAP-2 purificato ? stato analizzato su un gel di poliacrilammide SDS-urea al 20% secondo B. Kadenbach et al., Analyt. Biochem. 129 /?983/ 517--521). Si ? ottenuta una singola banda con un peso molecolare apparente di 6500 dopo -visualizzazione mediante colorazione con argento. Il NAP-2 ? migrato in modo leggeremente pi? rapido rispetto a NAF/-NAP-1 .
Esempio 5: Analisi della sequenza di animino addi di NSA-l/NAP-2
L'analisi della sequenza di amminoacidi ? stata effettuata mediante degradazione con fenili.sotiocianato automatizzata impiegando un dispositivo per l'analisi della sequenza in fase gassosa Applied Biosystems modello 477A. Campioni di NSA-l/NAP-2 (500 p moli) sono stati applicati direttamente oppure dopo la modificazione chimica. La riduzione e la alchllazlone sono state effettuate come segue: 1 nmole di NSA-l/NAP-2 ? stata diluita in 150 ul di cloridrato di guanidinio 6M, EDTA 2mM, tris-HCl 0,2 M, PH 8,3, quindi si sono aggiunti 225 ni di tributilfosfina in 15 ul di acetonitrile e la soluzione ? stata fatta incubare a temperatura ambiente. Dopo 60 minuti si sono aggiunti 160 ni di 4-vinilpiridina in 10 ul di acetonitrile. Dopo 30 minuti si ? aggiunta una quantit? uguale di tributilfosfina e vinilpiridina e la reazione ? stata fatta proseguire ancora per 40 minuti sotto azoto. La soluzione ? stata acidificata con acido trif luoroacetico fino a pH 2,0 ed ? stata desalificata mediante HPLC a fasi inverse in acido trifluoroacetico allo 0,1% con un gradiente di acetonitri1e.
L'estremit? carbossi ? stata determinata con 0,5 nanomoli di NAP-2 e 0,4 ug di carbossipeptidasi P oppure carbossipeptidasi ? (qualit? per l'analisi della sequenza Boehringer).
"La figura 2 mostra l'analisi dei primi 20 amminoacidi amminoterminali.
Esempio 6: Effetto di attivazione dei neutrofili di NSA-1/NAP-2
Neutrofili sono stati isolati dal sangue umano, sono stati posti in sospensione in PBS/BSA e quindi sono stati usati per valutare la capacit? di NSA-l/NAP-2 ad Indurre il rilascio di elastasi adottando il metodo del saggio in piastra di microtitolazione di Dewald and Bagglolini (1987). Il NSA--l/NAP-2 ha indotto il rilascio selettivo di eiastasi in un modo dipendente dalla concentrazione. La dipendenza dalla concentrazione era simile a quella osservata con NAF/NAP-l e la potenza era circa met? di quella di NAF e circa 1/3 di quella di fMLP. La figura 3 mostra l'attivit? dipendente dalla concentrazione di MSA-l/NAP-2.
PARTE II: CLONAZIONE DI cDNA CHE CODIFICA PER CTAP-III DA UNA RACCOLTA DI ESPRESSIONI gt11 DERIVATA DA PIASTRINE UMANE
Esempio 7
a) isolamento e lavaggio delle piastrine Piastrine sono state isolate da sangue trattato con citrato mediante centrifugazione a 160 g per 10 minuti in modo da ottenere plasma ricco in piastrine (PRP) e mediante una ulteriore fase di centrifugazione a 1100 g per 10 minuti in modo da ottenere un agglomerato di piastrine. Le piastrine sono state quindi lavate due volte con 30 mrnoll/-litro di glucosio, con 120 mmoli/litro di cloruro di sodio, con 129 mmoli/litro di citrato di sodio, 10 mmoli/litro di EOTA pH 6,5 e una volta con 10 mmoli/litro di tris-HCl, 154 mmoli/litro di cloruro di sodio, 10 mmoli/litro di EDTA pH 7,4.
b) Megacariociti umani
Questi sono stati isolati dal sangue periferico di un paziente affetto da leucemia megacariobiastica mediante centrifugazione di densit? a gradiente Ficol1-metrizoate. Il fenotipo megacariobiastico di queste cellule leucemiche ? basato sulla loro reattivit? con anticorpi monoclonali (MoAbs) verso la piastrina GPIIb, il complesso GPIIb/GPIIIa e il fattore di Willebrand (vWF). Una sonda cDNA per la piastrina GPIb ha dato anche un segnale positivo con un RNA messaggero (mRNA) di 2,4 kb (medesima dimensione come nelle piastrine) nel "Northern b?otting" con mRNA ottenuto da queste cellule.
c) Preparazione di anticorpi
Piastrine lavate sono state solubi1izzate in Triton X-114 all'1% in presenza di N-etilmaleimmide (NEM ) e fenilmetano solfonilfluoruro (PMSF, sciolto in metanolo) ad una concentrazione finale di 2 mmoll/litro ciascuno e si ? effettuata la ripartizione delle fasi come descritto 1n Biochim. Blophis. Acta 778 (1984) 463. La fase acquosa ? stata usata per la cromatografia di esclusione AcA-34 Ultrogel (LKB) in dodecilsolfato di sodio allo 0,1% (DOS), 0,1 moli/litro di NH4HCO3, pH 7,4. Per immunizzare i conigli si ? usata una frazione contenente proteine nell'intervallo di 8-9 Kd, come viene valutato mediante elettroforesi su gel di poiiacri1ammide--dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE).
d) "Immunoblotting"
Prodotti di degranulazione sono stati ottenuti dal liquido surnatante di piastrine lavate stimolate con trombina (2 U/4 x 109 /mi, cinque minuti, 37?C) e trattate con 2 mmoli/?itro di PMSF e con 2 mmoli/1 di NEM. Essi sono stati solubilizzati in SDS all'1%, sono stati ridotti con 0,1% di ditiotreitolo (DTT), e sono stati separati mediante SDS-PAGE al 20% a cui si ? fatta seguire un trasferimento elettroforetico verso nitrocellulosa (BA 85, Schleicher & Schuell, Feldbach, Switzerland) con un electroblotter semisecco a 150 mA per 90 minuti. Dopo incubazione con un antisiero policlonale di coniglio anti-CTAP-III, si ? usato un secondo anticorpo anticoniglio di capra copulato a fosfatasi alcalina (Bio-Rad Laboratories, Glattbrugg, Switzerland), per la macchiatura con i substrati nitro blu tetrazolio e 5-bromo--4-cloro-3-indolil fosfato.
e) Costruzione della "library" di espressione del cDNA
Il RNA totale di piastrine ottenute da 180 litri di sangue ? stato preparato adottando il procedimento con cloridrato di guanidina. Si ? isolato PolyA mRNA mediante cromatografia di affinit? su oligo(dT) cellulosa (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Il primo filamento ? stato sintetizzato impiegando oligo (dT) inneschi (Pharmacia P-L Biochemicals) e trascrittasi inversa (Bethesda Research Laboratories, Gibco, Basel, Switzerland). Il secondo filamento ? stato preparato con RNase H (New England Biolabs, Schwalbach a Frankfurt, FRG) e con DNA-polimerasi 1 di Escherichia coli (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerland). Dopo produzione di estremit? tagliate con T4 DNA-polimerasi e con enzima di Klenow, dopo metilazione con EcoRI e legatura a elementi di collegamento EcoRI, il cDNA ottenuto ? stato incorporato in estratto di incorporazione ? gtll (Gigapack Gold, Stratagene, San Diego, CA) e amplificato in E.coli yl088.
f) Selezione della raccolta e caratterizzazione dei cloni positivi
La raccolta di espressione di ?gII cDNA di piastrine ? stata selezionata mediante un metodo stanard con antisiero di coniglio policlonale. Anticorpi specifici di E.coli sono stati rimossi mediante immunoadsorbimento su un lisato legato con nitrocellulosa di E.coli BNN 97. I fagi ricombinanti positivi sono stati messi in evidenza mediante il medesimo secondo anticorpo e i substrati cromogenici come per "immunoblotting". Dopo purificazione, il ? -DNA ? stato sottoposto a digestione con EcoRI (Boehringer Mannheim) e gli inserti sono stati isolati mediante elettroforesi su gel di agarosio allo 0,8% e mediante elettroeluizione in un Bio-Trap (Schleicher & Schuell). Il DNA ? stato fatto precipitare con etanolo ed ? stato sottoposto a legatura a 5 ng di M13 Bluescript? (Stratagene) linearizzato con EcoRI usando T4 ligasi (Bio-Lab) ed ? stato transinfettato in E.coli JM?01. Si sono esaminate colonie bianche per i plasmidi ricombinanti positivi mediante il procedimento di estrazione con alcali e si sono preparati stampi di cDNA a singolo filamento mediante infezione con un fago "helper" M13K07. La sequenza di DNA di entrambi i filamenti ? stata determinata mediante il metodo di terminazione della dideossi-catena impiegando il Sequenase Kit (United States Biochemical Corporation) e dATP 35S alfa-marcato (New England Nuclear, Du Pont),
g) "Northern blot analysis"
Dopo l'elettroforesi in un gel di agaroslo all11%, il mRNA ? stato macchiato su Hybond N (Amersham) ed ? stato quindi sottoposto a ibridazione con una sonda di cDNA solfolinato a 68?C per 18 ore in 4 x SSPE, 0,1% di Na^P^^, 0,2% di SDS, 0,5 mg/ml di eparina contenente 100 ug/ml di DNA di sperma di salmone. Dopo lavaggio per 2 volte a 5 minuti in 1 x SSPE, 1% di SDS, 0,1% di Na4P2O7 a temperatura ambiente e due volte per 30 minuti in 0,2 x SSPE, 0,1% di DSDS, 0,1% di Na4P2Oa7 68?C, il corrispondente mRNA ? stato messo in evidenza mediante immunocolorazione con un anticorpo monoclonale di topo (MoAB; Sigma, Deisenhofen, FRG) contro DNA solfonilato e con un secondo anticorpo IgG antitopo di capra coniugato ad una fosfatasi alcalina. I substrati erano uguali a quelli indicati sopra .
h) Risultati
Anticorpi policlonali prodotti mediante immunizzazione di conigli con una frazione di filtrazione su gel contenente proteine solubili in acqua di piastrine nell'intervallo di 8 fino a 9 kd hanno presentato una elevata attivit? e specificit? su immunoblots e sono state usate per la selezione di una raccolta di espressione cDNA ?gtll derivato da piastrine. Due cloni positivi da 100 000 fagi ricombinanti inizialmente selezionati, sono stati purificati su piastra e i due frammenti EcoRI interni sono stati subclonati in M13 Bluescript . Le sequenze di nucleotidi di entrambi i filamenti sono state determinate mediante il metodo di terminazione della dideossi-catena. Si ? ottenuto un clone di cDNA a lunghezza completa {?CI) da 690 coppie di basi (figura 5) contenente una regione non codificante 5' di 66 coppie di basi, uno schema di lettura aperto che codifica per una proteina di 128 residui di amminoacidi (13894 da) e -una regione non codificante 3' contenente il codone di terminazione (TAA), il presunto segnale di poliadenilazione e la coda poliA. Un secondo clone ( C2) che inizia in corrispondenza della rispettiva posizione-9, ha presentato una identica sequenza di nucleotidi.
La sequenza consensus per l'inizio di traduzione in mRNA eucariotico (5' CCACCAUGA 3') inizia in corrispondenza del nucleotide-5.
La ibridazione a macchie di Northern di mRNA da una linea di cellule di leucemia megacariocitica, megacariociti e piastrine ma non da un controllo di epatociti ha dato un segnale positivo in corrispondenza di circa 0,8 kb con il mRNA del CTAP-III precursore, suggerendo che il corrispondente cDNA ? di lunghezza completa. Non si ? ottenuto alcun segnale con HEL mRNA, probabilmente a causa della minore sensibilit? del metodo di marcatura non radioattivo per la sonda cDNA e/o per il basso contenuto in mRNA CTAP-III-specifico della linea di cellule Hel usata.
La sequenza di amminoacidi dedotta (figura 5) ? identica alla sequenza ben stabilita di CTAP-III di piastrine umane. L'estremit? amminica di CTAP-III ? in corrispondenza della posizione dell'ammino acido 44 della sequenza tradotta e l'inizio del suo prodotto di degradazione con plasmina oppure tripsina inattivo dal punto di vista mitogenico la beta-trombog?obul ina ? 4 residui a valle in corrispondenza della posizione 48. Si ? dimostrato che un precursore di queste proteine, PBP, prende parte ai primi 10 residui di CTAP-III per? la sua estremit? amminica ? 9 residui a monte in corrispondenza della posizione 35. Tutta l'informazione strutturale nota su queste tre proteine si adatta esattamente alla sequenza di amminoacidi derivata dal clone di cDNA codificante, fornendo una notevole prova di un singolo precursore per tutte e tre le proteine.
Cos? la sequenza guida di 34 ammino acidi di CTAP-III mostrata nella figura 5 ? eccezionalmente lunga, differisce dai peptidi di segnale classici ed ? probabilmente responsabile del "targeting" la proteina agli alfa-granuli di megacariociti in fase di maturazione.
Claims (24)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptide-2 che attiva i neutrofili (NAP-2) oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali.
- 2. Un fattore denominato attivit? di stimolezione dei neutrofili 1 che attiva -i neutrofili ed ? derivato da leucociti e/o piastrine del sangue.
- 3.Un fattore secondo la rivendicazione 1 che attiva neutrofili umani per il rilascio di enzimi di granuli .
- 4. Un fattore secondo la rivendicazione 1 con un peso molecolare di circa 6500-7500.
- 5. Un fattore secondo la rivendicazione 4 con un peso molecolare evidente di circa 6500 determinato in seguito a elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS-urea al 20% e un punto isoelettrico apparente di circa 8,3.
- 6. Un fattore secondo la rivendicazione 4 con un peso molecolare calcolato di 7628 e un punto isoelettrico calcolato di 8,7.
- 7. Un fattore secondo la rivendicazione 1 con la sequenza di amminoacidi N-terminalioppure una sua variante, un suo frammento o un suo derivato funzionale.
- 8. Il fattore secondo la rivendicazione 7, con la sequenza di ammino acidi N-terminali seguita dalla corrispondente sequenza successiva di ammino acidi C-terminali di beta-TG, oppure una sua variante, un suo frammento oppure ?n suo derivato funzionali.
- 9. Il fattore secondo la rivendicazione 1 avente la seguente sequenza di 70 animino acidioppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali.
- 10. Una variante del fattore secondo la rivendicazione 9 avente la sequenza di 70 animino acidi definita nella rivendicazione 9 preceduta da Asp-Leu-Tyr-.
- 11. Una variante del fattore secondo la rivendicazione 9 avente la sequenza di 70 ammino acidi definita nella rivendicazione 9 preceduta da
- 12. Una variante del fattore secondo la rivendicazione 9 avente la sequenza di 70 amminoacidi definiti nella rivendicazione 9 preceduta da
- 13. Un procedimento per la preparazione di NSA-l/NAP-2 che comprende la purificazione da fluidi di coltura di leucociti del sangue stimolati mediante cromatografia su fosfocellulosa e cromatografia a fasi inverse.
- 14. Un procedimento secondo la rivendicazione 13 che comprende a) cromatografia su fosfocellulosa b) cromatografia in fase liquida ad alta pressione a fasi inverse su una colonna C4 e c) una cromatografia in fase liquida a bassa pressione a fasi inverse su una colonna CN-propile.
- 15. Un procedimento per la preparazione di NSA-l/NAP-2 oppure di una sua variante, di un suo frammento oppure di un suo derivato funzionale oppure di un suo elemento simile strutturale biologicamente attivo come B-TG, CTAP-III o PBP che consiste nel sottoporre a clonazione un corrispondente gene che comprende una sequenza guida naturale, nell'esprimere il gene in un adatto ospite e nel recuperare opportunamente il peptide prodotto se indicato impiegando una adatta proteasi.
- 16. Un procedimento secondo la rivendicazione 15 in cui la sequenza guida ? codificante per:oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali.
- 17. Una composizione farmaceutica che comprende il fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali, insieme con una sostanza-veicolo o diluente farmaceuticamente accettabi1e.
- 18. Il fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali da usare come prodotto farmaceutico.
- 19. Il fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionali per -l'impiego nel trattamento di condizioni che sono associate oppure provocate, in modo locale oppure sistemico, da una modificazione del numero oppure dello stato di attivazione dei PMN (neutrofili-cellule polimorfonucleari ).
- 20. Fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionale, per l'impiego nel trattamento di infezioni provocate da batteri, mlcoplasmi, lieviti e funghi e infezioni virali oppure nel trattamento di malattie infiammatorie oppure in condizioni di conteggio di neutrofili basso in modo anormale e/o in un livello generaliizzato basso di neutrofili e nella preparazione di antagonisti da usare in queste indicazioni.
- 21. Il peptide guida avente la seguente sequenza di ammino acidioppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionale.
- 22. Un metodo per il trattamento di una condizione secondo la rivendicazione 19 oppure 20 che consiste nel somministrare un fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionale ad un soggetto che richiede un tale trattamento.
- 23. IL fattore secondo la rivendicazione 1, oppure una sua variante, un suo frammento oppure un suo derivato funzionale ogni qual volta viene ottenuto mediante un procedimento secondo la rivendicazione 13 oppure 15.
- 24. Il fattore secondo la rivendicazione 1 oppure una sua variante, un suo framment? oppure un suo derivato funzionale, ogni qual volta vengono ottenuti da ?-TG, CTAP-III o PBP oppure da un gene che codifica per ?-TG, CTAP-III o PBP.
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