MXPA06003695A - Usos terapeuticos de variantes de quimiocinas. - Google Patents

Abstract

Las variantes de quimiocinas que forman homodimeros tales como CCL2 humanas que tienen una sustitucion de aminoacidos simples en la interfase de dimerizacion que altera el patron de los enlaces de hidrogeno y que actuan como un monomero obligado, pueden antagonizar quimiocinas naturales y tienen actividad anti-inflamatoria in vivo. Estas variantes pueden usarse como ingrediente activo en las composiciones farmaceuticas para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias, autoinmunes o infecciosas.

Description

USOS TERAPEUTICOS DE VARIANTES DE QUIMIOCINAS Campo de la Invención La invención se refiere a los nuevos usos terapéuticos de las variantes de quimiocina y en particular de las variantes CCL2 humanas . Antecedentes de la Invención Las quimiocinas son proteínas proinflamatorias secretadas pequeñas, que median la migración direccional de los leucocitos de la sangre al sitio dañado. Dependiendo de la posición de las cisternas conservadas que caracterizan a esta familia de proteínas, la familia de las quimiocinas puede dividirse estructuralraente en las quimiocinas C, C-C, C-X-C y C-X3-C que enlazan a una serie de receptores de la membrana (Baggiolini M et al., 1997; Fernandez EJ y Lolis E, 2002). Estos receptores de membrana, todos receptores acoplados a la proteína G heptahelicoidal permiten a las quimiocinas ejercer su actividad biológica en las células de direccionamiento que pueden estar presentes en combinaciones específicas de acuerdo a su estado, y/o tipo. Los efectos fisiológicos de las quimiocinas resultan de un sistema integrado y complejo de interacciones concurrentes: los receptores tienen frecuentemente una especificidad de ligandos que se traslapan de manera que un receptor simple puede enlazarse a diferentes quimiocinas, también, una quimiocina KEF:170263 puede enlazar a diferentes receptores. Usualmente, las quimiocinas se producen en el sitio de la lesión y provocan la migración y activación de los leucocitos, los cuales juegan un papel fundamental en los procesos inflamatorios, inmunes, homeostáticos, hematopoyéticos y de angiogénesis . Incluso, se piensa que existen desventajas potenciales al usar quimiocinas como agentes terapéuticos (en particular, la tendencia a agregar y enlaces promiscuos) , estas moléculas se consideran candidatos de direccionamiento adecuados para la intervención terapéutica en enfermedades asociadas a tales propósitos mediante la inhibición de quimiocinas específicas y sus receptores para alcanzar a prevenir el refuerzo excesivo y la activación de los leucocitos (Baggiolini M, 2001; Loetscher P y Clark-Lewis I, 2001; Godessart N y Kunkel SL, 2001) . Los estudios en relación con la actividad de la estructura indican que las quimiocinas tienen principalmente dos sitios de interacción con sus receptores, la región amino terminal flexible y el rizo rígido que lleva a cabo la segunda cisteina. Se piensa que las quimiocinas entran sobre los receptores por medio de la región de rizo y este contacto se cree facilita el enlace de la región amino terminal que resulta en la activación del receptor. Esta importancia de la región amino terminal ha sido también demostrada probando las quimiocinas naturales y sintéticas en las que el dominio se modifica o se acorta. Este proceso siguiendo la digestión proteolítica, mutagénesis o modificación química de los aminoácidos pueden tanto activarse como suministrar estas moléculas inactivas generando compuestos con actividad agonista y/o antagonista. Así, las quimiocinas con modificaciones específicas en la región amino terminal tienen potencial terapéutico para las enfermedades inflamatorias y autoinmunes (Schwarz y Wells, 1999) . La CCL2 también conocida como la proteína 1 Quimioatractiva de Monocitos (MCP-1) o Factor de Activación y Quimiotáctica de Monocitos (MCAF) se ha identificado que juega un papel central en la inflamación, que es capaz de promover el refuerzo de los monocitos y los linfocitos en respuesta a las señales de infección y daño en diversas enfermedades inflamatorias, diferentes tipos de tumores, aloinjerto cardiaco, SIDA y tuberculosis (Yoshimura T et al . , Gu L et al., 1999) . Las actividades fisiológicas asociadas con CCL2 se han estudiado extensivamente por medio de animales transgénicos que permiten demostrar que esta quimiocina controla no solo el refuerzo de los monocitos en los modelos inflamatorios, sino también la expresión de citocinas relacionadas con las respuestas auxiliadoras T y el inicio de la aterosclerosis (Gu L et al., 2000; Gosling et al, 1999; Lu B et al, 1998) . Estructuralmente, la CCL2 consiste de un rizo N terminal y una hoja beta recubierta por una hélice alfa en el extremo C terminal y forma homodímeros , incluso, se piensa que se ha detectado como un monómero en condiciones experimentales específicas (Handel T et al., 1996; im KS et al., 1996; Lubkowski J, et al., 1997). Como para muchas otras quimiocinas, la literatura proporciona muchos ejemplos de estudios de la actividad de la estructura en los que los mutantes CCL2 han sido generados expresando un sitio simple o truncado N terminal sustituido con variantes para evaluar el papel de los aminoácidos eliminados o sustituidos en actividades de enlace asociadas con CCL2 y otras propiedades (Gong J y Clark-Lewis I, 1995; Zhang Y et al., 1996; Steitz SA et al., 1998; Gu L et al., 1999; Hemmerich S et al., 1999; Seet BT et al., 2001). En particular, el papel de dimerizacion en la activación y enlace del receptor CCL2 se estudió demostrando que diferentes mutaciones en la región terminal que impide la dimerizacion puede alterar algunas actividades CCL2 tales como la afinidad de enlace del receptor, estimulación de la quimiotaxis, inhibición de la adenilato ciclasa y la estimulación del influjo de calcio (Paavola C et al, 1998) . Aun cuando un mutante descrito por Paavola, llamado en la presente P8A*, no dimeriza pero mantiene una eficacia y potencia original, otro mutante monomérico obligado descrito por Paavola llamado en la presente Y13A*, demostró tener una afinidad de enlace 100 veces más débil in vit.ro, por ser un inhibidor mucho menos potente de adenilato ciclasa y estimulador del influjo de calcio in vitro, y no permite la estimulación de la quimiotaxis en el cultivo celular. De igual manera a Y13A*, un mutante, [1+9-76] MCP-1 (una variante CCL2 que carece de los residuos 2-8) , antagoniza las actividades CCL2 in vitro. Las propiedades de enlace del mutante CGL2 que contiene la sustitución P8A se estudiaron también en un modelo experimental basado en el reconocimiento de la proteína M3 que enlaza quimiocinas virales, demostrando el enlace eficiente de esta proteína viral a este mutante CCL2 (Alexander JM et al., 2002) . Por otra parte, se ha demostrado que las variantes monoméricas de las quimiocinas tales como CCL2-P8A, están desprovistas de actividad in vivo, a pesar de que es completamente activa e indistinguible de la forma dimérica in vitro (Proudfoot A et al., 2003). Ejemplos de mutantes CCL2 que involucran residuos que no afectan el perfil de dimerización de la proteína resultante - han sido ya descritos en la literatura como conducentes a las moléculas que tienen propiedades antagonistas hacia CCL2 (US 5739103, WO 03/84993) . Sin embargo, no existe una indicación en el arte previo en el que un mutante de quimiocina específica, en particular, un mutante CCL2 que es un monómero obligado debido a una sustitución de sitio simple (por ejemplo, que involucra Prolina) , pueda actuar como un antagonista de quimiocina.

Breve Descripción de la Invención Se ha encontrado sorprendentemente que las variantes de quimiocinas que forman heterodímeros tales como CCL2, que tienen una substitución de aminoácidos simples en la interfase de dimerización que altera el patrón de enlaces de hidrógeno, de manera que resulte en un monómero obligado que enlaza al receptor y tiene propiedades agonistas in vi tro, pueden antagonizar quimiocinas naturales y que tienen actividad antiinflamatoria in vivo. Las variantes descritas en la presente son útiles como un medicamento. Los polipéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 2 y aquellos que comprenden la SEQ ID NO:2 con una mutación adicional a la isoleucina en la posición 64 de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4) son útiles como medicamentos. Las variantes descritas en la presente son útiles como medicamentos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, inflamatorias e infecciosas. Los polipéptidos que comprenden la SEQ ID NO: 2 y aquellos que comprenden a la SEQ ID NO: 2 con una mutación adicional a la isoleucina en la posición 64 de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4) son útiles como medicamentos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias e infecciosas. En un ejemplo, los polipéptidos que comprenden a la SEQ ID NO: 2 y aquellos que comprenden la SEQ ID NO: 2 con una mutación adicional a la isoleucina en la posición 64 de la SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 4) son útiles como medicamentos para el tratamiento de esclerosis múltiple. Las variantes descritas en la presente son útiles en los métodos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias e infecciosas . Tales métodos comprenden la administración de una cantidad efectiva de una variante monomerica de la invención, en donde las -variantes resultan de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerización de las quimiocinas . Ejemplos de tales variantes monoméricas que pueden usarse en tales métodos son: a) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO .-2, b) un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 4, c) un mutante activo de a) o b) ; d) un polipéptido que comprende a) , b) o c) y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una proteína distinta a las quimiocinas; asi como a las moléculas correspondientes en la forma de sus factores activos, precursores, sales, derivados, complejos o conjugados. La invención incluye además, composiciones f rmacéuticas que contienen un polipéptido que comprende las variantes de quimiocina antagonista monomérica obligada de la invención. La invención incluye además proteínas de fusión que comprenden una variante de quimiocina antagonista monomérica obligada descrita en la presente fusionada a una secuencia de proteína de no quimiocina, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 fusionada a la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana (SEQ ID NO: 5) . La invención incluye además, métodos para producir estas proteínas de fusión. La invención incluye además, métodos de separación por exclusión a variantes de quimiocina antagonistas monoméricas obligadas descritas en la presente que comprenden: a) elaborar mutaciones de punto simples en CCL2 que bloquean su capacidad en la dimerizacion; b) identificar las variantes que enlazan al receptor y muestran propiedades agonistas in vitro; c) identificar las variantes del grupo identificado en (b) anterior que se caracterizan además que inhibe el refuerzo de células peritoneales . Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : las secuencias de aminoácidos de CCL2 maduras humanas (residuos 24-99 de SWISSPROT Acc. N° P13500; SEQ ID NO:l), CCL2-P8A maduro (SEQ ID N0:2), CCL2 maduro* (SEQ ID N0:3), CCL2*-P8A maduro (SEQ ID N0:4). La mutación en la posición 64 de la isoleucina (M641) está en el recuadro en CCL2* y CCL2*-P8A; la mutación P8A relevante está en negrita y subrayada . Figura 2 : la gráfica compara la actividad de reclutamiento celular de CCL2 humano y CCL2-P8A con la línea base en el ensayo de reclutamiento celular peritoneal . Figuras 3A-3B: las gráficas muestran la actividad que inhibe la respuesta-dosis de CCL2-P8A en los ensayos de reclutamiento celular peritoneal usando dos diferentes inductores: CCL2 (fig. 3A) o Tioglicolato (fig. 3B) , los resultados se comparan con el nivel de línea base, un control negativo (solo vehículo salino) y un control positivo, Dexametasona (Dex, solo en la fig. 3B) . Figura 4 : la gráfica muestra la actividad de inhibición de CCL2-P8A en ensayos de inflamación de pulmón inducida con ovalbúmina; los resultados se comparan con el nivel de la línea base y un control negativo (salina) . Figuras 5A-5B: Las gráficas muestran la eficacia de CCL2-P8A que reduce registros clínicos en un modelo animal para la esclerosis múltiple llamada EAE (encefalomielitis autoinmune experimental) , ya sea cuando los animales presentan una enfermedad moderada con un registro clínico bajo (no más de 2; a) o una enfermedad severa con un registro clínico alto (al menos 3, Fig. 5B) ; los datos se comparan con aquellos observados usando solo el vehículo (control negativo) o control positivo para el modelo EAE (interferón beta de ratón) ; el número de asteriscos en la parte inferior de cada gráfica indica el nivel de importancia estadística del efecto observado cuando se compara con el control negativo en cada intervalo de tiempo (* media p<0.05, ** media p< 0.001, calculado por un medio ANOVA seguido por una prueba Fisher.

Figura 6: la gráfica muestra la actividad de inhibición de CCL2-P8A cuando se administra en diferentes dosificaciones en un modelo animal para la inflamación de la piel (inflamación inducida por DMFB en la oreja del ratón sensibilizado) ; el efecto de CCL2-P8A en volumen del volumen de hinchazón de la oreja después del tratamiento, y se compara con los siguientes controles : animales no sensibilizados pero estimulados el día 5 con DNFB (A) , animal sensibilizado y estimulado con DNFB pero solo con el vehículo tratado (B) , y animales tratados con Dexametasona (Dex; administrado de la misma manera que con CCL2-P8A) . Los valores se midieron el día 6 (el día después del tratamiento y de la prueba inmunogénica) . Figuras 7A-7B: Las formas alternativas de CCL2-P8A que pueden generarse mediante la adición y/o sustitución de aminoácidos (fig. 7A) sencillo/múltiple o mediante la fusión de los residuos 243-474 de la cadena IgGl pesada lambda de inmunoglobulina humana (fig. 7B; secuencia de señal CCL2 está subrayada doblemente, la CCL2-P8A madura está subrayada) . Descripción Detallada de la Invención En vista de las evidencias mencionadas en el arte previo, no existe indicación que una variante CCL2 resultado de al menos una sustitución de aminoácidos simple en la interfase de dimerización, que altere el patrón de los enlaces de hidrógeno de manera que resultan en un monómero obligado que enlaza al receptor y que tiene propiedades agonistas in vitro, pueden antagonizar CCL2 in vivo, y en general, pueden inhibir el reclutamiento celular y/o reacciones inflamatorias. La sustitución de aminoácidos simple es preferiblemente en la posición 8 en la CCL2 madura humana, y en particular, consiste del reemplazo de prolina en la posición 8 con una alanina. Estas variantes no contienen una mutación adicional en la posición que corresponde a 9, 10, ó 13 de CCL2 madura humana. Un ejemplo de las sustituciones descritas anteriormente es una variante monomérica de la forma madura de CCL2 llamada ' CCL2-P8A que puede expresarse que incluye ya sea la sustitución simple de la prolina en la posición 8 para la alanina (SEQ ID NO: 2) o que incluye una sustitución adicional (que mejora la expresión de la proteína) de metionina 54 a la isoleucina (SEQ ID NO: 4) . La sustitución de la prolina 8 en la alanina (un aminoácido que tiene una orientación distinta del grupo químico que forma posiblemente enlaces de hidrógeno) genera una variante CCL2 que actúa como un monómero obligado. Las CCL2-P8A y CCL2*-P8A pueden considerarse como moléculas que tienen actividad equivalente. Los usos, métodos y composiciones farmacéuticas que pueden vislumbrarse consecuentemente para estas variantes monoméricas obligadas específicas de CCL2 llamadas CCL2-P8A y CCL2 -P8A pueden también afrontarse para cualquier variante monomérica obligada de CCL2 o de otras quimiocinas que son naturalmente activas como dímeros, que se generan en la misma manera. Estas mutantes deben presentar propiedades inhibidoras y antagonistas similares a aquellas de CCL2-P8A y CCL2*-P8A contra las quimiocinas naturales y por lo tanto deben tener una aplicabilidad médica. Un aspecto de la presente invención es el uso de una variante monomérica obligada de una quimiocina que forma heterodimeros, por ejemplo, CCL2 que se conoce por ser un objetivo terapéutico para distintas enfermedades tales como enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas. Tales variantes resultan de al menos una sustitución de aminoácidos que alteran el patrón de enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerización de la quimiocina, para que resulte en un monómero obligado que enlaza del receptor y tiene propiedades agonistas in vitro y propiedades antagonistas in vivo, como ingredientes activos en una composición farmacéutica, en particular, para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas. Estas propiedades antagonistas in vivo pueden volverse evidentes en ensayos que permiten la evaluación de propiedades tales como el efecto de reclutamiento celular en el peritoneo siguiendo la inducción con una molécula inflamatoria (una quimiocina tal como la misma CCL2 , tioglicolato o ovalbúmina) .

La variante monomérica obligada puede resultar de una sustitución de aminoácidos simple en la interfase de dimerizacion que altera el patrón de los enlaces de hidrógeno. Más preferiblemente, la prolina es un aminoácido bien conocido por ser particularmente importante para establecer enlaces de hidrógeno estereoespecificos involucrados en la formación de complejos de proteínas tales como homodímeros , la sustitución de aminoácidos simple debe ser la sustitución de una prolina con un aminoácido sin prolina, la sustitución de aminoácidos simples debe ser la sustitución de una prolina con aminoácidos sin prplina, para que la estereoespecificidad de los enlaces de hidrógeno resulten alterados . Las formas alternativas de las variantes monoméricas de las quimiocinas que forman los homodimeros arriba definidos, pueden usarse como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas incluyen: a) un mutante activo, o b) un polipéptido que comprende la variante o el mutante activo, y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia de proteínas distinta a la quimíocina. El término "activo" significa que tales compuestos alternativos deben mantener las características funcionales de los mutantes CCL2 de la presente invención, es decir, deben antagonizar CCL2 in vivo e inhiben el reclutamiento celular y/o reacciones inflamatorias.

Un antagonista de quimiocina monomerica obligada definida en la presente como un compuesto activo de acuerdo con la invención, puede estar en la forma de sus fracciones activas, precursores, sales, derivados, complejos o conjugados. Estos compuestos alternativos pretenden comprender moléculas con cambios a la secuencia de las variantes monomericas de las quimiocina que forman heterodímeros que no afecten las características básicas descritas en la presente. Por ejemplo, CCL2*-P8A se ha generado en base a un mutante de CCL2 (CCL2-M641 o CCL2*) que mantiene actividades CCL2 normales pero tiene propiedades mejoradas con respecto a la expresión recombinante . Las propiedades antagonistas de las variantes monomericas de quimiocinas que forman homodímeros definidas arriba y ejemplificadas en la presente que usan CCL2-P8A como antagonistas CCL2 pueden determinarse, o incluso potenciar en los mutantes activos. Esta categoría de moléculas incluye análogos naturales o sintéticos de la secuencia, en donde uno o más de los residuos de aminoácidos se han añadido, eliminado, o sustituido, con tal de que desplieguen la misma actividad biológica caracterizada en la presente invención en niveles comparables o superiores, determinados por medios conocidos en el arte y descritos en los ejemplos de abajo. Se pretende que los análogos naturales sean las secuencias correspondientes de proteínas de quimiocinas humanas identificadas en otros organismos, como CCL2 de ratón (SWISSPROT Acc. N° P 10148) . Los análogos artificiales de las variantes monoméricas de quimiocinas que forman homodímeros se pretende que sean polipéptidos preparados mediante la síntesis química conocida y/o mediante técnicas de mutagénesis dirigidas en el sitio, tecnologías combinatorias en el nivel de la secuencia de ADN de codificación (tales como mezclado del ADN, selección/despliegue de fagos) , mediante estudios de diseño asistido por computadora o mediante cualquier otra técnica adecuada de la misma, que proporciona un conjunto finito que corresponde sustancialmente a péptidos o polipéptidos acortados o mutados que pueden obtenerse rutinariamente y probado por un experto en el arte usando las enseñanzas presentadas en el arte previo y en los ejemplos de abajo. Por ejemplo, las mutantes artificiales específicas pueden tener uno o más aminoácidos que se sustituyen en otras posiciones de CCL2 y se encuentran importantes para generar antagonistas CCL2 (WO 03/84993) . De acuerdo con la presente invención, los cambios preferidos en los mutantes activos se conocen comúnmente como sustituciones "conservadoras" o "seguras" e involucran residuos no básicos . Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas con aminoácidos que tienen propiedades químicas suficientemente similares para preservar la estructura y la función biológica de la molécula. Está claro que las inserciones y eliminaciones de los aminoácidos también pueden elaborarse en las secuencias definidas anteriormente sin alterar su función, particularmente si las inserciones o eliminaciones solo involucran un poco de aminoácidos, por ejemplo, bajo diez, y preferiblemente bajo tres, y no remueven o desplazan los aminoácidos que son críticos para la conformación funcional de una proteína o un péptido . La literatura proporciona muchos modelos en los que la selección de las sustituciones de aminoácidos conservadoras pueden realizarse en base a estudios fisico-químicos y estadísticos en la secuencia y/o la estructura de la proteína natural (Rogov SI y Nekrasov AN, 2001) . Los experimentos de diseño de proteínas han demostrado que el uso de un subconjunto específico de aminoácidos puede producir proteínas activas y plegables, ayudando en la clasificación de sustituciones de aminoácidos "sinónimos" que pueden acomodarse más fácilmente en la estructura de la proteína, y que pueden usarse para detectar homólogos estructurales y funcionales y parálogos (Murphy LR et al., 2000). Los grupos de aminoácidos sinónimos y grupos sinónimos más preferidos son aquellos definidos en la tabla 1. Por ejemplo, la sustitución de la metionina 64 con la isoleucina común a CCL2* y CCL2*-P8A se ha elegido usando un criterio similar.

Un grupo adicional de mutantes activos de las variantes monoraéricas de la quimiocinas que forman homodímeros definidos anteriormente son imitaciones del péptido (también llamadas peptidoimitaciones) , en los que la naturaleza de péptidos o polipéptidos se han modificado químicamente en el nivel de las cadenas laterales de aminoácidos de quxralidad de aminoácidos, y/o de la estructura del péptido. Se pretende que estas alteraciones proporcionen variantes monoméricas de las quimiocinas que forman homodímeros, que tienen propiedades mejoradas o similares en términos de preparación, potencia y/o características farmacocinéticas . Por ejemplo, cuando el péptido es susceptible de desdoblarse mediante peptidasas siguiendo la inyección en el sujeto es un problema el reemplazo de un enlace de péptido particularmente sensible con una imitación del péptido no escindible puede proporcionar un péptido más estable y por lo tanto, más útil como un terapéutico. De igual manera, el reemplazo de un residuo de aminoácidos L es una forma estándar de suministrar el péptido menos sensible a la proteólisis, y finalmente, más parecidos a los compuestos orgánicos distintos a los péptidos. También son útiles los grupos de bloqueo amino terminal tales como t-butiloxicarbonilo, acetilo, teilo, succinilo, metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelalilo, dansilo, benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelalilo, metoxiadipilo, metoxisuberilo y 2,4-dinitrofenilo . Muchas otras modificaciones que proporcionan una potencia incrementada, actividad prolongada, facilidad de purificación, y/o vida media incrementada se conocen en el arte (WO 02/10195; Villain M et al., 2001). Los grupos "sinónimos" alternativos preferidos para los aminoácidos incluidos en las imitaciones del péptido son aquellos definidos en la tabla II. Una lista no exhaustiva de derivados de aminoácidos incluyen también ácido aminoisobutírico (Aib) , hidroxiprolina (Hyp) , 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolino-3 -COOH, ácido indol-2 -carboxílico, 4-difluoro-prolina, L-tiazolidina-4-ácido carboxílico, L-homoprolina, 3 , 4-dehidro-prolina, 3 , 4-dihidroxi-fenilalanina, ciclohexil-glicina y fenilglicina. Por "derivados de aminoácidos" se entiende un aminoácido o aminoácidos como una entidad química distinta a los 20 aminoácidos que se presentan naturalmente codificados genéticamente. En particular, el derivado del aminoácido puede contener porciones de alquilo sustituidos o no sustituidos que pueden ser lineales, ramificadas o cíclicas y pueden incluir uno o más heteroátomos . Los derivados de aminoácidos pueden elaborarse de novo u obtenerse de fuentes comerciales (Calbiochem-Novabiochem AG, Suiza; Bachem, USA) . Las técnicas para la síntesis y el desarrollo de imitaciones de péptidos, así como imitaciones sin péptidos son bien conocidas en el arte (Rubí VJ y Balse PM, 2000; Golebiowski A et al., 2001). Distinta metodología para incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas, usando tanto sistemas de traducción in vitro como in vivo para probar y/o mejorar la estructura de la proteína y su función se describen también en la literatura (Dougherty DA, 2000) . La presente invención describe el uso de variantes monoméricas de las quimiocinas que forman homodímeros y sus mutantes activas como ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas, así como de proteínas que comprenden su secuencia de aminoácidos y una secuencia de aminoácidos que pertenece a una secuencia de proteínas distintas a la quimiocina. Esta última secuencia heteróloga debe proporcionar propiedades adicionales sin dañar la aplicabilidad industrial. Ejemplos de tales propiedades adicionales son un procedimiento de purificación más fácil, una vida media que dura mucho tiempo en los fluidos corporales o localización extracelular. Esta última característica es de particular importancia para definir un grupo específico de proteínas de fusión o quiméricas en la definición anterior puesto que permite que estas variantes monoméricas se localicen en el espacio en donde no solo se facilita el aislamiento y purificación de estos péptidos, sino también en donde CCL2 interactua naturalmente con otras moléculas . El diseño de las porciones, ligandos y enlazadores así como métodos y estrategias para la construcción, purificación, detección y uso de proteínas de fusión se discuten ampliamente en la literatura (Nilsson J et al., 1997; "Applications of chimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol . Vol . 326-328, Academic Press; WO 01/77137). Las secuencias de proteínas adicionales que pueden usarse para generar formas alternativas de estas variantes monoméricas obligadas de quimiocinas que forman heterodímeros definidas anteriormente son dominios extracelulares de la proteína que enlazan a la membrana, región constante de la inmunoglobulina región Fe) , dominios de multimerización, proteínas extracelulares, proteínas que contienen péptidos de señal, proteínas que contienen señales de exportación. La elección de una o más de estas secuencias que van a fusionarse a la variante monomérica es funcional para el uso específico de el agente. Cuando la secuencia de la proteína adicional como en el caso de una secuencia de proteínas que contienen péptidos de señal o señal de exportación extracelular permite a la variante monomérica secretarse en el espacio extracelular, el agente puede congregarse más fácilmente y purificarse a partir de células cultivadas en vista de un proceso adicional o, alternativamente, las células pueden administrarse o usarse directamente. Las variantes monoméricas obligadas de quimiocinas que forman homodímeros definidos anteriormente pueden también usarse en otras formas preferidas, por ejemplo, como fracciones activas, precursores, sales, derivados, conjugados o complejos. El término "fracción" se refiere a cualquier fragmento de la cadena polipeptídica del mismo compuesto, solo o en combinación con las moléculas relacionadas o residuos enlazadas a estas, por ejemplo, residuos de azúcares o fosfatos, o agregados del péptido o polipéptido original. Tales moléculas pueden resultar también de otras modificaciones que no alteran normalmente la secuencia primaria, por ejemplo, derivación química ín vivo o in vitro de los péptidos (acetilación o carboxilación) , aquellos elaborados al modificar el patrón de fosforilación (introducción de residuos de fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina) o glicosilacion (exponiendo al péptido a las enzimas que afectan la glicosilacion, por ejemplo, enzimas de glicosilacion de mamíferos o de desglicosilación) de un péptido durante su síntesis y proceso o en etapas de procesos adicionales . Los "precursores" son compuestos que pueden convertirse en los compuestos de la presente invención mediante el proceso enzimático y metabólico previo o después de la administración de las células o al cuerpo. El término "sales" en la presente se refiere tanto a sales de los grupos carboxilo y a las sales de adición acidas de grupos amino de los péptidos, polipéptidos o análogos de los mismos, de la presente invención. Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse por medios conocidos en el arte e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sodio, calcio, amonio, sales férricas o de zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas tales como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaina y similares . Las sales de adición ácidas incluyen por ejemplo, sales con aminoácidos tales como por ejemplo, ácido clorhídrico o sulfúrico y sales con ácidos orgánicos tales como por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Cualquiera de tales sales debe tener sustancialmente una actividad similar a los peptidos y polipéptidos de la invención o sus análogos. El término "derivados" como se usa en la presente, se refiere a derivados que pueden prepararse a partir de grupos funcionales presentes en las cadenas laterales de las porciones de aminoácidos o los grupos N o C terminales para métodos conocidos. Tales derivados incluyen por ejemplo, ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y derivados N-acilo de grupos amino libres o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres y se forman con grupos acilo como or ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo. Los conjugados o complejos útiles de variantes monoméricas obligadas de quimiocinas que forman homodímeros definidos anteriormente, pueden generarse usando moléculas y métodos conocidos en el arte de la interacción con el receptor u otras proteínas (etiquetas radioactivas o fluorescentes, biotina) , eficacia terapéutica (agentes citotóxicos) , o mejorar los agentes en términos de su eficacia de suministro del fármaco, tales como polietilen glicol y otros polímeros sintéticos o naturales (Harris JM y Chess RB, 2003; Greenwald B et al., 2003; Pillai O y Panchagnula R, 2001). Los residuos pueden usarse para la unión, con la condición que tengan una cadena lateral responsable de la unión del polímero (es decir, la cadena lateral de un aminoácido lleva un grupo funcional, por ejemplo, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, etc.). Alternativamente, un residuo de estos sitios pueden reemplazarse con un aminoácido diferente que tiene una cadena lateral responsable de la unión del polímero. También, las cadenas laterales de los aminoácidos codificados genéticamente pueden modificarse químicamente para la unión del polímero, o pueden emplearse aminoácidos no naturales con grupos funcionales de cadena lateral apropiados . La unión de los polímeros pueden ser no solo la cadena lateral de los aminoácidos que se presentan naturalmente en una posición específica del antagonista o la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural , que reemplaza a los aminoácidos que se presentan naturalmente en una posición específica del antagonista, pero también a un carbohidrato u otra porción que se une a la cadena lateral del aminoácido en la posición de direccionamiento .

Los polímeros adecuados para estos propósitos son biocompatibles, en particular, no son tóxicos para los sistemas biológicos, y se conocen muchos de tales polímeros. Tales polímeros pueden ser de naturaleza hidrofóbica o hidrofílíca, biodegradable, no biodegradable o una combinación de los mismos. Estos polímeros incluyen polímeros naturales (tales como colágeno, gelatina, celulosa, ácido hialurónico) , así como polímeros sintéticos (tales como poliésteres, poliortoésteres, polianhídridos) . Ejemplos de polímeros no degradables hidrofóbicos incluyen polidimetil siloxanos, poliuretanos, politetrafluoroetileno, polietileno, cloruros de polivinilo y metaerilatos de polimetilo. Ejemplos de polímeros no hidrofílicos no degradables incluyen poli (2-hidroxietil metacrilato) , alcohol polivinílico, poli (N-vinil pirrolidona) , polialquilenos, poliacrilamida y copolímeros de los mismos. Los polímeros preferidos comprenden un óxido de etileno de unidad repetida secuencxal tal como polietilen glicol (PEG) . El método preferido de unión emplea una combinación de síntesis de péptidos y ligación química. Ventajosamente, la unión de un polímero soluble en agua será a través de un enlazador biodegradable, especialmente en la región amino terminal de una proteína. Tales modificaciones actúan para proporcionar la proteína en una forma precursora (o "prof rmaco") es decir, luego de la degradación del enlazador que libera la proteína sin la modificación del polímero.

Como un procedimiento general, las variantes monoméricas ' obligadas de qúimiocina que forman homodímeros definidas arriba pueden ser producidas y preparadas mediante cualquier procedimiento conocido en el arte, que incluye tecnologías relacionadas con el ADN recombinante y tecnologías de síntesis químic . Muchos libros y publicaciones proporcionan enseñanzas de cómo clonar y producir proteínas recombinantes usando vectores y células hospedadoras eucarióticas o procarióticas (por ejemplo, E. coli) o tales como algunos títulos en la serie "A Practical Approach" publicada por la prensa de la Universidad de Oxford ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; nDNA Cloning a: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expresión", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001). Otra modalidad de acuerdo con la invención es la secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la variante antagonista de qúimiocina monomérica obligada descrita en la presente . La secuencia de ADN que codifica a las variantes monoméricas obligadas de quimiocinas que forman homodímeros puede insertarse y ligarse en vectores episomales adecuados o que no se integran homólogamente, que pueden ser introducidos en las células hospedadoras apropiadas mediante cualquier medio adecuado (transformación, conjugación, fusión del protoplasto, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, etc.) para transformarlas. Los factores de importancia en la selección de un plásmido particular o vector viral incluye: la facilidad con la que los recipientes que contienen al vector, pueden ser reconocidos y seleccionados de aquellos recipientes que no contienen el vector, el número de copias del vector que se desean en una hospedadora particular; y por medio de la cual es deseable ser capaz de "transferir" el vector entre las células hospedadoras de distintas especies . Los vectores deben permitir la expresión de la proteina de fusión o aislada que incluye el antagonista de la invención en las células hospedadoras procarióticas y eucarioticas bajo el control de las secuencias reguladoras de iniciación/terminación transcripcional , que son elegidas por estar constitutivamente activas o inducibles en la célula. Una línea celular enriquecida sustancialmente pueden aislarse entonces para proporcionar una línea celular estable. Para los hospedadores eucarióticos (por ejemplo, levaduras, células de insecto o mamíferos) , pueden emplearse secuencias reguladoras traduccionales y transcripcional diferentes dependiendo de la naturaleza de la hospedadora. Estas pueden derivarse de fuentes virales tales como el adenovirus, virus del papiloma de bovino, virus del simio o similares, en donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión.

Ejemplos son el promotor TK del virus del herpes, el promotor temprano SV40, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Las señales reguladoras de iniciación transcripcional pueden seleccionarse para conceder la represión y activación de manera que pueda modularse la expresión de los genes . Las células que se han transformado establemente mediante el ADN introducido, pueden seleccionarse también introduciendo uno o más marcadores que permitan la selección de células hospedadoras que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar también para una fototrofía a una hospedadora auxotrófica, resistencia a biocidas, por ejemplo, antibióticos o metales pesados tales como cobre o similares . El gen marcador seleccionable puede estar enlazado directamente a las secuencias del gen de ADN que van a expresarse o introducirse en la misma célula mediante la co-transfección. Elementos adicionales pueden ser necesarios para la síntesis óptima de las proteínas . Las células hospedadoras pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas . Se prefieren las hospedadoras eucarióticas , por ejemplo, células de mamíferos tales como células de mamíferos tales como células humanas, mono, ratón y células de ovario de hámster chino (CEO) , debido a que proporcionan modificaciones post-traduccionales para las moléculas de proteínas que incluyen la glicosilación o repliegue correcto en los sitios correctos. También, las células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones de péptido post-traduccionales que incluyen la glicosilación. Existe una variedad de estrategias de ADN recombinantes que utilizan secuencias promotoras fuertes y un número de copias elevadas de plásmidos que pueden ser utilizadas para la producción de las proteínas deseadas en la levadura. La levadura reconoce las secuencias líder en los productos del gen mamífero clonado y secreta péptidos que llevan secuencias líder (es decir, pre-péptidos) . Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de un polipéptido recombinante, se prefiere una expresión estable Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable los polipéptidos de interés, pueden transformarse usando los vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo en un vector individual. Siguiendo la introducción del vector, las células se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiar a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas establemente pueden proliferarse usando técnicas de cultivo del tejido apropiado al tipo de célula. Una línea celular sustancialmente enriquecida en tales células pueden entonces aislarse para proporcionar una línea celular estable.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadoras para la expresión se conocen en el arte e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles del American Type Culture Collection (ATCC) que incluye pero no se limita a, ovario de hámster chino (CHO) , HeLa, riñon de hámster bebe (BHK) , riñon de mono (COS) , C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma de Bowes y células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Help G2) y una variedad de otras líneas celulares. En el sistema del baculovirus, los materiales para los sistemas de expresión de células del baculovirus/insecto se encuentran comercialmente disponibles en forma de un kit de inter alia, el kit ¾MaxBac" (Invitrogen) . Ejemplos de tecnologías de síntesis química son la síntesis de fase sólida y la síntesis de fase líquida. Por ejemplo, como una síntesis de fase sólida el aminoácido que corresponde al término C del peptido que va a sintetizarse, se enlaza a un soporte que es insoluble en solventes orgánicos y mediante la repetición alterna de reacciones, un en donde los aminoácidos con sus grupos amino y grupos funcionales de cadena lateral protegidos con los grupos protectores apropiados se condensan uno por uno en orden desde el término C hasta el término N, y uno en donde los aminoácidos se enlazan a la resina o al grupo protector de los grupos amino de los péptidos que se liberan, la cadena del péptido se extiende así de esta manera. Los métodos de síntesis de fase sólida se clasifican ampliamente mediante el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo del grupo protector usado. Los grupos protectores típicamente usados incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo) , Cl-Z (2-clorobenciloxicarbonilo) , Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo) , Bzl (bencilo) , Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , Mbh (4 , 4 ' -dimetoxidibenzhidrilo) , Mtr (4-metoxi-2 , 3 , 6-trimetilbencenosulfonilo) , Trt (tritilo) , Tos (tosilo) , Z (benciloxicarbonilo) y C12-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; N02 (nitro) y Pmc (2,2,5, 7, 8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino) ; y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo) . Después de la síntesis del péptido deseado, este se somete a la reacción de desprotección y corte del soporte sólido. Tal reacción de corte del péptido puede llevarse a cabo con fluoruro de hidrógeno o ácido sulfónico trifluorometano para el método Boc y con TFA para el método Fmoc . Las proteínas CCL2 totalmente sintéticas se describen en la literatura (Brown A et al., 1996) . La purificación de las variantes monoméricas recombinantes o sintéticas de quimiocinas que forman homodímeros definidos arriba pueden llevarse a cabo mediante cualquiera de uno de los métodos conocidos para este propósito, es decir, cualquier procedimiento convencional que involucra la extracción, precipitación, cromatografía, electrofóresis o similares . Un procedimiento de purificación adicional que puede usarse en la preferencia para purificar la proteína de la invención es cromatografía de afinidad usando los anticuerpos monoclonales o grupos de afinidad que enlazan a la • proteína de direccionamiento y son producidos e inmovilizados en una matriz de gel que se encuentra contenida dentro de una columna. La proteína se enlazará a la columna mediante heparina o mediante el anticuerpo específico mientras que las impurezas pasarán a través de ella. Después del lavado, la proteína se eluye del gel mediante un cambio en el pH o resistencia iónica. Alternativamente, puede usarse CLAR (cromatografía líquida de alta resolución) . La elución puede llevarse a cabo usando un solvente basado en agua-acetonitrilo empleado comúnmente para la purificación de las proteínas. La variante monomérica de una quimiocina que forma heterodímeros puede usarse en la composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes , inflamatorias o infecciosas. En particular, los resultados proporcionados en los ejemplos en relación con un modelo animal para la esclerosis múltiple muestra que estas variantes monoméricas pueden usarse en la composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la esclerosis múltiple. Otro aspecto de la invención es una variante monomérica de una quimiocina que forma homodímeros , en donde la variante resultan de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerización de la quimiocina usada como un medicamento. Ejemplos de tales variantes se describen en la presente como CCL2-P8A y CCL2*-P8A. Sin embargo, la enseñanza de la invención permite la identificación, producción y pruebas de moléculas similares en base a la secuencia y las actividades de otras quimiocinas . En particular, estas variantes monomericas pueden seleccionarse de : a) CCL2-P8A (SEQ ID N0:2), b) CCL2*-P8A (SEQ ID NO:4) , c) Un mutante activo de (a) o (b) ; o d) un polipéptido que comprende (a) , (b) , o (c) , y una secuencia de aminoácidos que pertenece a la secuencia de proteínas distinta a la quimiocina; así como las variantes monomericas correspondientes en la forma de sus fracciones activas, precursores, sales, derivados, complejos o conjugados. Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene una variante monomérica de una quimiocina que forma heterodímeros como ingrediente activo, en donde la variante resulta de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de los enlaces de hidrogeno en la interfase de dimerización de la quimiocina, tal como CCL2-P8A o CCL2*-P8A, opcionalmente en las formas definidas anteriormente (tales como mutantes activas, polipéptidos que los comprenden o conjugados) así como la codificación del ADN o células que lo expresan. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener portadores adecuados farmacéuticamente aceptables, vehículos compatibles biológicamente y aditivos que son adecuados para la administración a un animal (por ejemplo, solución fisiológicamente salina) y que comprenden eventualmente auxiliares (como excipientes, estabilizadores o diluyentes) que facilitan el proceso de los compuestos activos en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en cualquier forma aceptable para reunir lo necesario para el modo de administración. Por ejemplo, el uso de biomateriales y otros polímeros para el suministro de fármacos, así como las diferentes técnicas y modelos para validar un modo específico de administración se describe en la literatura (Luo B y Prestwich GD, 2001; Cleland JL et al., 2001). Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar el curso y la severidad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o remisión de tal patología. La cantidad efectiva dependerá de la ruta de administración y de la condición del paciente. "Farmacéuticamente aceptable" significa abarcar cualquier portador que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para la hospedadora que se administra. Por e emplo, para la administración parenteral, los ingredientes activos anteriores pueden formularse en forma de dosificación unitaria para la inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringers. Los portadores pueden seleccionarse también de almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y varios aceites que incluyen aquellos de petróleo, animal, vegetal o de origen sintético (aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo) . Cualquier modo aceptado de administración puede usarse y determinarse por medio de los expertos en el arte para establecer los niveles sanguíneos deseados de los ingredientes activos. Por ejemplo, la administración puede ser mediante varias rutas parenterales tales como rutas subcutáneas, intravenosa, intradermal , intramuscular, intraperitoneal , intranasal, oral o bucal. La administración puede realizarse mediante una inyección del bolo, por medio de una perfusión gradual en el tiempo o mediante formas de dosificación de liberación controlada que incluyen inyecciones de depósito, bombas osmóticas y similares para la administración prolongada del polipéptido en una proporción determinada, preferiblemente en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración simple de dosificaciones precisas. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones no acuosas o acuosas estériles, suspensiones y emulsiones, que pueden contener agentes auxiliares o excipientes conocidos en el arte y que pueden prepararse de acuerdo a los métodos de rutina. Además, pueden administrarse la suspensión de los compuestos activos como suspensiones de inyección aceitosa apropiadas . Los vehículos o solventes lipofílieos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o esteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosas que pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión incluyen por ejemplo, carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores. Las composiciones farmacéuticas incluyen soluciones adecuadas para la administración por medio de inyecciones y contienen desde alrededor de 0.01 hasta 99 por ciento, preferiblemente desde alrededor de 20 a 75 por ciento del compuesto activo junto con el excipiente. Las composiciones que pueden administrarse rectalmente incluyen supositorios . Se comprende que la dosificación administrada dependerá de la edad, sexo, salud y peso del paciente, tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia de tratamiento y naturaleza del efecto deseado. La dosificación se adecuará al sujeto individual, como se comprende y determinará por un experto en el arte . La dosis total requerida para cada tratamiento puede administrarse mediante dosis múltiples o en una dosis simple. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada sola o en conjunto con otros terapéuticos dirigidos hacia la condición, o dirigidos a otros síntomas de la condición. Normalmente, una dosis diaria del ingrediente activo está comprendida entre 0.01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Ordinariamente de 1 a 40 miligramos por kilogramo por día suministrados en dosis fraccionadas o en forma de liberación sostenida son efectivas para obtener los resultados deseados. Las administraciones secundarias o posteriores pueden realizarse en una dosificación que es la misma, menor a, o mayor que la inicial o dosis previa administrada al individuo. Otro objetivo de la presente invención es un método para tratar o prevenir enfermedades infecciosas autoinmunes o inflamatorias (tales como esclerosis múltiple) que comprenden la administración de una cantidad efectiva de variantes monoméricas de quimiocinas que forman homodímeros, en donde la variante resulta de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de los enlaces de hidrogeno en la interfase de dimerización de la quimiocina. Ejemplos de tales variantes monomericas que pueden usarse en tales métodos son: a) CCL2-P8A (SEQ ID NO: 2) b) CCL2*-P8A (SEQ ID N0:4) c) un mutante activo de (a) o (b) ; d) Un polipéptido que comprende (a) , (b) , o (c) , y una secuencia de aminoácidos que pertenecen a una secuencia de proteína distinta a la quimiocina; Así como las variantes monomericas correspondientes en la forma de sus fracciones, precursores, sales, derivados, complejos o conjugados activos. Una lista no limitativa de ejemplos para las enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas mencionadas anteriormente con respecto a los usos, las variantes y los métodos de la invención son los siguientes: artritis, artritis reumatoide (RA) , artritis psoriática, osteoartritis, lupus sistémico eritomatoso (SLE) , esclerosis sistémica, escleroderma, polimiositis , glomerulonefritis, fibrosis, fibrosis, enfermedades alérgicas o de hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad del intestino inflamatoria (IBD) , enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, esclerosis múltiple, cáncer, choque séptico, infecciones del VIH o virales, transplantes, inflamación de las vías aéreas, enfermedad de injertos versus hospedadoras (GVHD) y aterosclerosis . Las aplicaciones terapéuticas de los polipéptidos de la invención y los reactivos relacionados pueden evaluarse (en términos de seguridad, farmacocinéticos y eficacia) por medio de ensayos in vivo e in vi tro haciendo uso de células animales, tejidos y modelos (Coleman RA et al., 2001; Li Ap, 2001; methods Mol. Biol . vol . 138, "Chemokines Protocols" , editado por Proudfoot A et al., Humana Press Inc., 2000; Methods Enzymol, vol. 287 y 288, Academia Press, 1997). Otro aspecto de la invención son los métodos de separación por exclusión para las variantes de quimiocina antagonistas monoméricas obligadas descritas en la presente, que comprenden: a) elaborar mutaciones de punto simple en CCL2 que bloquea su capacidad para dimerizar; b) identificar las variantes que se enlazan al receptor y que muestran propiedades agonistas in vitro; c) identificar las variantes del grupo identificado en (b) anterior que se caracterizan además, por inhibir el reclutamiento celular peritoneal . La evaluación de estas propiedades pueden hacerse usando técnicas conocidas en el arte, que se muestran en los ejemplos, aplicando una molécula conocida por inducir la inflamación y el refuerzo de las células perifonéales, por ejemplo, una quimiocina tal como la misma CCL2, tioglicolato u ovalbúmina.

La presente invención se ha descrito con respecto a las modalidades especificas, pero el contenido de la descripción comprende todas las modificaciones y sustituciones que pueden ser aportadas por una persona experta en el arte sin extenderse más allá del significado y propósito de las reivindicaciones . La invención se describirá ahora por medio de los siguientes ejemplos, los cuales no deberán construirse en cualquier forma limitando la presente invención. EJEMPLOS Ejemplo 1: Clonación, expresión y purificación de las proteínas recombinantes La CCL2 madura (figura 1; SEQ ID W0:1) y las proteínas mutantes CCL2-P8A (figura 1; SEQ ID NO: 2) CCL2* madura (figura 1, SEQ ID NO: 3) y las proteínas mutantes CCL2*-P8A (figura 1, SEQ ID NO:4) se generaron y expresaron como proteínas recombinantes en la E. coli como se describe en la literatura (Paavola Cd et al., 1998) en base a la secuencia de la forma madura de CCL2/MCP-1 humana que corresponde al segmento 24-99 de la molécula precursora. Para CCL2* y CCL2*-P8A, la sustitución de una metionina con una isoleucina en la posición 64 mejora la pureza y la homogeneidad de los mutantes eliminando la formación de especies que contienen metionina-sulfóxido en la posición 64.

De manera breve, los genes de CCL2 para CCL2* se construyeron mediante técnicas de síntesis de genes estándar con el uso de un codón óptimo para la expresión en la E. colí y un codón para la metionina añadida en el extremo 57 de la secuencia que codifica a la CCL2 o CCL21 humana madura. Los constructos mutantes que incluyen Alanina en la posición 8 se elaboraron mediante la mutagénesis de una reacción de cadena polimerasa de la plantilla CCL2 o CCL2* y clonada en un vector pET3a (Novagen) entre los sitios Xho I y Nde I . Los plásmidos que codifican a las proteínas basadas en CCL2* se usaron para transformar a las células TAP302, que son células S BL21 pLys diseñadas genéticamente con una reductasa de tioredoxina agénica para elaborar el potencial de óxido-reducción intracelular más conductivo para la formación de enlaces de disulfuro. Usando esta cepa, los enlaces de disulfuro parecen formarse en la célula eliminando la necesidad de una etapa de replegado. Todos los constructos se obtuvieron y se controlaron mediante tecnologías de biología molecular estándar (amplificación y mutagénesis PCR) , secuenciación de ADN, digestión por restricción) . Uno de los clones que contienen la secuencia correcta de MCP-1 (P8A9 se usaron posteriormente para producir la proteína en la E. colí. Los plásmidos se usaron también para transformar BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen Cat n° C6010-03) o BL21 DE3 (Novagen Cat n° 69387-3) .

La CCL2, CCL2* y CCL2*-P8A se expresan y purifican como se describió en el artículo original usando una etapa de sonicación, una etapa de lisis y una etapa cromatogr fica (SP-columna de sefarosa; elución con un gradiente de NaCl en 10 mM K2P04, pH 7.5) . Las fracciones pico se agrupan y se purifican además mediante CLAR de fase inversa (columna C18 con un tamaño de partícula de 5-µp? y tamaño de poro de 300-Á) . Las proteínas se eluyeron usando un gradiente de acetonitrilo acrecentado que contiene ácido trifluoroacético al 0.1%, típicamente, proteínas eluidas en 34 ± 5% de acetonitrilo. Estas se liofilizaron, se disolvieron en 1 mg/ml en Tris 35 mM, pH 8, se hizo reaccionar con 15 µg de aminopeptidasa (Peprotech, Rock Hill, NJ) /l mg de proteína durante 36 horas a la temperatura ambiente y se repurifico mediante CLAR de fase inversa. El tratamiento con aminopeptidasa remueve solo la metionina N terminal generando ya sea ácido piro-glutámico N terminal o glutamina N terminal (no existe un efecto en la actividad biológica debido a esta diferencia) , como se observa en la secuenciación N terminal de la proteína recombinante . La proteína se liofilizó entonces, se redisolvió en agua a 1-5 mg/ml y se almacenó en alícuotas pequeñas a 80 °C. Las cantidades más grandes de las proteínas recombxnantes y en particular de CCL2-P8A se obtuvieron también usando un protocolo alternativo diseñado para purificaciones que se inician desde el peletizado celular obtenida a partir de grandes cultivos de fermentación de cepas E. coli que producen estas proteínas. Generalmente, un fermentador de 5 L produce aproximadamente 200 g de peletizados celulares en peso húmedo y un fermentador de 50 L produce 1.8 kg de peletizados celulares en peso húmedo. El procedimiento de purificación descrito en la presente trata 200 g de peletizados celulares en peso húmedo. Los peletizados celulares se derritieron y se añadieron 3 mi de solución amortiguadora fraccionada por gramo de peso húmedo (solución amortiguadora Tris/HCl 50 M, pH 8.0 (Cat. 20092391, Biosolve) que contiene MgC12 10 mM (cat. 63065, Fluka) , Benzamidina/HCl 5 mM (cat. 12073, Fluka) , 1,4 DL ditiotreitol 1 mM (DTT) (Cat. 43819, Fluka), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF) (Cat. 7 8830, Fluka)* 20 mg/L DNasa (Fluka) (Cat. DN-25, Sigma) . La suspensión se homogenizó con un politron para obtener un homogeneizado adecuado desprovisto de fragmentos o grumos. Todas las manipulaciones se llevaron a cabo a 4°C. La suspensión bacteriana homogenizada se transfirió a un interruptor mecánico de células de prensa francesa (presión diferencial) . El número de pasos fue típicamente de 2 a 4 bajo 1500 bar. La célula fraccionada se monitoreo por medio de SDS-PAGE teñida con azul de coomasie. El lisado se distribuyó en tubos de centrifugación GSA y se centrifugaron a 10,000 r.p.m. con el RC5C Sorval (16,300 x g) durante 90 minutos a 4°C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se descartó después de la confirmación mediante el análisis SDS-PAGE en la que la proteína no soluble de interés puede detectarse en el sobrenadante. Los peletizados se removieron con una espátula de los tubos de centrifugación y se transfirieron a un vaso previamente pesado para pesar los peletizados. Los peletizados se lavaron con agua desionizada añadiendo 5 mi de agua por gramo de peletizados en un vaso y se agitaron durante 30 minutos a 4°C con un agitador magnético La suspensión se centrifugó en tubos de centrifugadora GSA a 10,000 r.p.m. con la centrifugadora Sorval RC5C (16' 300 x g) durante 60 minutos a 4°C. La etapa de lavado se repitió 3 veces. Después de cada centrifugación, el sobrenadante se descartó después de la confirmación mediante un análisis SDS-PAGE en el que la proteina no soluble de interés puede detectarse en el sobrenadante. Los peletizados se solubilizaron en una solución amortiguadora de extracción preparada recientemente del cuerpo de inclusión (solución amortiguadora Tris/HCl 100 mM, pH 8.0 (Cat. 20092391, Biosolve) que contiene 1,4 DL ditiotreitol 1 mM (DTT) (Cat.43819, Fluka) y Guanidio/HCl 6 M (Cat. 50950, Fluka) en una proporción de 100 mi de solución amortiguadora para 25 g de peletizados celulares usando un Polytron. La solución se calentó durante 30 minutos a 60 °C y se agitó para medir la monomeriz ción, después se dejó enfriar a la temperatura ambiente. El homogeneizado se distribuyó en tubos de centrifugación Ti45 y se ultracentrifugó a 35,000 r.p.m. con el Beckman L-60 (100, 000 x g) . El sobrenadante se filtró con un filtro de 0.8-0.2 mm (SpiralCap (Cat. 12069, PALL) , se analizó mediante SDS-PAGE y se cuantificó usando un reactivo del ensayo de la proteína coomassie (Pierce) seguido por el protocolo suministrado con el kit. La proteína recombinante de interés se captura en una columna 35 Pilot FineLine que contiene una resina RPC Source 30 empacada siguiendo las instrucciones del proveedor (Amersham Pharmacia) . Después de usarse, al columna se regenera siguiendo el procedimiento de limpieza suministrado por el fabricante (Amersham Pharmacia) . Para lo 100 gramos de los peletizados celulares, se empaca una columna de 3.5 cm de diámetro x 23 cm de alto dando un total de 220 mi (equivalentes al volumen de 1 columna) de Source 30 RPC. la columna se instaló en un A TA FPLC (Amersham Pharmacia) . La proporción de flujo fue de 10 ml/min, y la presión máxima fue de 1 MPa. Antes de cargar la muestra, la columna se lavó con agua desionizada para el volumen de la columna 2 (440 mi) . Después del lavado, la columna se equilibró con 5 CVs (volúmenes de columna) de la solución de equilibrio (solución amortiguadora Tris/HCl 100 mM, (Cat. 20092391, Biosolve) se ajustó a un pH 7.5 con un fumante de HC1 al 37% (cat. 84426, Fluka) .

Las libras disueltas (cuerpos de inclusión) en Guanidio/HCl se cargaron sobre la columna en una proporción de flujo de 5 ml/min. La columna se lavó entonces con 5 volúmenes de columna de la solución amortiguadora de equilibrio seguido por 5 CVs de la solución amortiguadora A (ácido trifluoroacético TFA al 0.1% (Cat. 28904, Pierce) y agua destilada al 99.9%). La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de 0% a 100% de la solución amortiguadora B (ácido trifluoroacético TFA al 0.1% (Cat. 28904, Pierce) agua destilada al 9.9%, acetonitrilo al 90% (U 1648, Baker) sobre 10 Cv con una proporción de flujo de 10 ml/min, y se recogieron fracciones de 10 mi de 1 MPA de presión límite. Todos los picos detectados se analizaron por SDS-PAGE, CLAR y se cuantificaron mediante espectroscopia de UV. Las fracciones que contenían la proteína de interés se agruparon y la cantidad se midió mediante espectroscopia de UV. La proteína se renaturalizó mediante la dilución de 10 veces en la solución de re-naturalización (solución amortiguadora Tris/HCl 100 mM, pH 8.0 (Cat. 20092391, Biosolve) que contenía glutatión reducido 0.1 mM (Cat.G-4251, Sigma) y glutation oxidado 0.01 mM (Cat. 120 000 250, Acros Organic) para obtener una concentración final de aproximadamente 0.1 mg/ml. La concentración de Source 30 RPC se añadió por goteo en la solución amortiguadora de desnaturalización. Si el volumen es grande, este puede llevarse a cabo usando una bomba peristáltica, la solución se agitó durante toda la noche a 4°C La solución parece frecuentemente turbia debido a la precipitación de la proteína que no se renaturalizó . Las concentraciones finales que oscilan en el rango de 0.1 a 0.4 mg/ml en la solución amortiguadora de renaturalización produjeron cantidades equivalentes de la proteina desnaturalizada (40 a 50%) . El pH y el acetonitrilo en el material de inicio no afectan la etapa de renaturalización. La renaturalización puede seguirse por medio de CLAR para continuar el replegado. La solución de renaturalización se filtró usando una bomba peristáltica de flujo elevado con un filtro doble que consiste de un prefiltro de 0.8 mm seguido por uno de 0.22 mm. La solución clarificada se concentró entonces mediante intercambio de cationes en un HP de sefarosa SP Hiload después de la cuantificación mediante un espectro de UV. El tamaño de la columna de intercambio de iones depende de la cantidad de proteínas. Para < de 500 miligramos, se usó una columna de 16/10 (1 CV = 20 mi) ; 500-1000 mg, una columna de 26/10 (1 CV = 50 mi) y para 1-2 gramos, una columna 50/5 (1 Cv = 100 mi) .

La columna se empacó de acuerdo a las instrucciones del proveedor (Amersham Pharmaci) . La columna se lavó con 2 CV de agua desionizada y después se equilibró con 4 CV de una solución amortiguadora de intercambio de cationes A (ácido acético 50 mM (Fluka) , se ajustó a un pH 4.5 con NaOh (Cat. 71690 Fluka) . La solución se ajustó a un Ph de 4.5 con ácido acético y la conductividad se ajustó a < 10 Ms : Después de cargar la solución de la proteina en la proporción de flujo recomendada por el proveedor para la columna seleccionada, la columna se lavó con 5 CVs de la solución amortiguadora A. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 0% a 100% de la solución amortiguadora B (solución amortiguadora A, que contiene NaCl 2 M (cat 71380, Fluka) sobre 20 Cv. El tamaño de fracción se determinó mediante el tamaño de columna. Todos los picos detectados se analizaron por SDS-PAGE, HPLVC y se cuantificaron mediante espectroscopia de UV. Después del análisis, las fracciones que contenían AS900652 se agruparon, cuantificaron mediante el espectro de UV y se analizaron por CLAR. La remoción de la metionina N terminal se realizó enzimáticamente usando aminope tidasa de metionina (MAP) , seguido por una etapa de purificación. De manera breve, la muestra se dializó primero usando una tubería de membrana con un corte de 3.5 kD en la solución amortiguadora de división (solución amortiguadora Tris/HCl de 35 mM, pH 7.5 (Cat. 20092391, Bisolve) . La solución amortiguadora de diálisis se cambió tres veces durante 24 horas. La aminopeptidasa de metionina (MAP) se añadió a la solución de la proteína en la proporción de 1 : 10000 (enzima rproteína, p:p). La digestión se realizó a la temperatura ambiente durante 48 horas. La proteína digerida se purificó entonces mediante intercambio de cationes que se lleva a cabo como se describe anteriormente. La proteína fue > 98% de pureza como se estima por la SDS-PAGE El sistema purificador AKTA (Pharmacia) se usó para purificar adicionalmente a la proteína deseada. El sistema se limpió durante 1 hora con NaOH 1 M, se lavó con agua esterilizada y se equilibró en la solución amortiguadora filtrada con un filtro de 0.22 mm (TFA 0.1% (ácido trifluoroacético) (Cat. 28904, Pierce) agua destilada al 99.9%) . La proteína se desalo usando una columna de Sefarosa XK50/30 fina G-25. La columna se lavó con 1 Cv de NaOh 1 M seguido por 4 CVs de agua estéril y después se equilibró con 5 Cvs 0.1% de TFA. Para las condiciones de desalación óptimas, las muestras 50 a 100 se desalaron en la Sefarosa fina G-25 de 450 mi. Para volúmenes mayores a 100 mi, se repitió la etapa de desalación. La muestra se filtró con un filtro de 0.22 mm antes de cargarse. La columna se eluye con 1.5 Cv de TFA al 0.1% con una proporción de flujo de 10 ml/min y una presión máxima de 1 MPa. Las fracciones de 10 mi se acumularon en tubos estériles. Después del análisis, se reunieron las fracciones que contenían la proteína, se cuantificaron mediante las condiciones estériles bajo un espectro de UV y se analizaron por CLAR, SDS-PAGE y espectrometría de masa. Los contaminantes restantes se removieron usando una cromatografía de fase inversa preparatoria (RPC) o CLAR DeltaPrep (WATERS) . La muestra se acidificó al TFA al 0.1% y se cargó sobre un RPC C8 Vydac (Cat. 208TB101522, Vydac) equilibrado en la solución amortiguadora A (ácido trifluoroacético TFA 0.1% (Cat. 28904, Pierce) y 99.9% de agua destilada) . La proteína se eluyó usando un gradiente lineal de 0% a 100% de la solución amortiguadora B (0.1% de ácido trifluoroacético TFA (cat. 28904, Pierce), acetonitrilo al 99% (U 1648, Baker), sobre 10 CV con una proporción de flujo de 25 ml/min, y un límite de presión de 700 barias. Todos los picos detectados se analizaron por SDS-PAGE, CIAR y se cuantificaron mediante espectroscopia de UV. Después del análisis, las fracciones que contenían AS900652 se reunieron, se cuantificaron por medio del espectro UV, se formaron en alícuotas requeridas y se liofilizaron. La proteína se almacena a -20°C u -80°C. La proteína recombinante se cuantifica mediante espectroscopia de UV usando un espectrofotómetro UV-VIS (sistema Uvikon, KONTRON) . Una cubeta de cuarzo (QS 1.000, HELLMA) se usó para la referencia de la solución amortiguadora y la otra cubeta contiene la muestra. Una exploración de 350 a 240 nm se midió y la absorción a 280 nm se usó para determinar la cuantificación de acuerdo con el coeficiente de extinción obtenido a partir de la composición de los aminoácidos usando ProtParam, Expasy. El valor usado fue de 1.1 para una solución de 1 mg/ml por la proteína oxidada que contiene enlaces de disulfuro.

Los análisis SDS-PAGE se llevaron a cabo usando 10% de gel NuPAGE (Cat . NP0301, Invitrogen) . La muestra se diluyó 2 veces en la solución amortiguadora de la muestra (Cat. LC2S76, Invitrogen) y se calentó durante 5 minutos a 95°C. La escala de la proteína Benchmark se usó como estándares de peso molecular. 10 µ? de una solución estándar de peso molecular y 20 µ? de la muestra de la proteína se cargaron en pozos apropiados . La electroforesis al ejecutar la solución amortiguadora fue MES (Cat. NP0002, Invitrogen) . La migración se llevó a cabo de acuerdo c las instrucciones del proveedor de 200 V, 12 mA y 25 durante 35 minutos (PowerEase 500, Invitrogen) . Los geles NuPAGE se tañeron con 0.1% de azul de coomassie R250 en ácido acético al 10%, 30% de metanol en agua destilada durante 30 minutos y se destiño en ácido acético al 10%, 30 % de metanol en agua destilada bajo un movimiento oscilante bajo hasta que no se coloree a un nivel profundo. El gel se lavó entonces varias veces en agua previo al sumergimiento en una solución secante (Invitrogen) intercalada entre dos hojas de papel de celofán (Invitrogen) durante 10 minutos y después se montan en una prensa pequeña permitiendo que el gel se almacene como una hoja fina. Alternativamente, el gel se tiñó con el protocolo de la mancha segura SimplyBlue (Cat. LC6065, Invitrogen) . El sistema Alliance CLAR suministrado por WATERS se usó con un Aquapore RP-300 7 m analítico C8 (0.2 cm de diámetro x 22 cm) equilibrado en TFA al 0.1%. Se inyectaron 10-50 mg previamente acidificados al TFA final al 0.01%. Las proteínas se eluyeron con un gradiente de 25 a 50% de acetonitrilo sobre 20 CVs. La identidad de la proteína recombinante se confirmó mediante un análisis de espectro de masa y el análisis de la secuencia N terminal. La secuencia N terminal" correcta QPDAINAAVT se obtuvo para el material purificado. Una masa de 8655 Da se obtuvo para las especies principales que corresponden a la masa teórica de la cadena de proteína con 2 enlaces de disulfuro. Una segunda especie con una masa inferior a 17 Da se observó también correspondiente a la modificación del residuo N terminal glutamina en un ácido piroglut mico . La presencia de esta modificación no tiene influencia en la actividad de la proteína. Ejemplo 2: Ensayos basados en células Materiales y métodos Ensayos para el reclutamiento celular peritoneal inducido por quimiocinas . Los ratones hembras Balb/C (Janvier, Francia) de 8 a 12 semanas se alojaron bajo condiciones de retención animales normales con un ciclo de 12 horas estándar luz/oscuridad y libre acceso de alimento y agua. Los grupos compuestos de 3-6 ratones se inyectaron intraperitonealmente con 200 µ? de una solución salina (NaCl libre LPS estéril 0.9% (p/v) o de esta solución que contiene CCL2 o CCL2-P8A en 10 µg por inyección.

Para los estudios que investigan los efectos inhibidores de CCL2-P8A en el reclutamiento celular peritoneal inducido por CCL2, estas moléculas se administraron intraperitonealmente 30 minutos antes de la inyección intraperitoneal de CCL2. Todas las moléculas se administraron en la concentración y solución amortiguadora anterior indicada (salina) . Los ratones se sacrificaron durante 4 horas después de la inyección final de CCL2 o CCL2-P8A. Se ha publicado el ensayo para el reclutamiento celular peritoneal inducido por tioglicolato (Mishell B, 1980) . De manera breve, el medio de tioglicolato se preparó suspendiendo 30 g de un medio de tioglicolato deshidratado (Becton Dickinson) en 1 litro de agua destilada fría, después se calentó hasta hervir para disolver completamente el polvo. El medio luego se formó en alícuotas en cajas de 100 mi y se procesan en autoclave. Después del enfriamiento, el medio se almacenó en la oscuridad a la temperatura ambiente durante al menos un mes. El reclutamiento celular se indujo mediante una inyección intraperitoneal de ratones en grupos de 3 con 200 µ? de una solución al 3% de tioglicolato en el día 1, 30 minutos después de la administración de CCL2*-P8A. Después de eso, la CCL2* se administró diariamente durante 3 días (días 2, 3 y 4) . La dexametasona (Sigma) se usó como un control positivo y se administró 10 mg/kg intraperitonealmente. Los ratones se sacrificaron el día 5.

Los lavados peritoneales para valorar el reclutamiento celular en los ensayos previos se realizaron como sigue. Los ratones se sacrificaron mediante asfixia con concentraciones elevadas de C02 en una caja de vidrio plexi . La piel se limpió con etanol al 70%. La capa externa de la piel se removió exponiendo la membrana peritoneal . La cavidad peritoneal se lavó 3 veces con 5 mi de PBS frío (solución salina amortiguada con fosfato) y el fluido se concentró en 15 mi de un tubo Falcon de poliestireno (Bbecton Dickinson) en hielo. Cada lavado se acompañó con un masaje ligero de la cavidad peritoneal. El fluido del lavado se centrifugó a 425 x g, el sobrenadante se descartó y los peletizados celulares resultantes se resuspendieron mediante una pipetas ligeras múltiples en 1 mi de PBS. La suspensión celular de 10 µ? se tiñó con 90 µ? de azul de tripano y el conteo total de células se enumeró con un hemocitómetro Neubauer contando 4 áreas cada una de 1 mm2. Se tomó la media de los 4 conteos multiplicada por el factor de dilución de 10, y se multiplicó nuevamente por 10 para dar el número de células por µ?, de acuerdo a las direcciones de uso que acompañan al hemocitómetro. Finalmente, el valor total se multiplicó mediante 1000 (igual a 1 mi) para llegar al número de células totales recuperadas . Resultados Las CCL2/MCP-1 humanas maduras recombinantes , las mutantes llamadas CCL2* y mutantes del monómero obligado correspondiente llamadas CCL2-P8A y las CCL2*-P8A (figura 1) se expresaron en la E. coli. La literatura muestra claramente que la mutación P8A en la CCL2 bloquea la formación de dímeros CCL2 sin afectar el enlace de las células que expresan al receptor o a una proteína tipo receptor viral, pero también sin mostrar las actividades de un antagonista CCL2 conocido en ensayos relevantes (ver (1+9-76) MCP-1 en la tabla 1 de Paaavola CD et al., 1998; Alexander JM et al., 2002). La forma monomerica obligada de CCL2 presenta propiedades inesperadas y específicas en ensayos realizados en ensayos basados en células. En el ensayo de reclutamiento celular peritoneal, la CCL2*~P8A y CCL2-P8A fueron incapaces de reforzar células en comparación con la CCL2 natural (figura 2) También, estas moléculas fueron capaces en una forma dependiente de la dosis, de inhibir la CCL2 inducida (figura 3A) y el refuerzo del macrófago inducido por tioglicolato (figura 3 B) . En el último ensayo, la CCL2-P8A parece ser efectiva como un control positivo (dexametasona, un compuesto anti-inflamatorio conocido) . Ejemplo 3Í Propiedades de CCL2-P8A en modelos animales para las enfermedades . Materiales y Métodos Modelo de inflamación de pulmón inducido por ovalbúmina El modelo de inflamación de pulmón inducido por ovalbúmina se realizó como se publicó (Blyth Di et al., 1996). Grupos de 6 ratones se sensibilizaron mediante una inyección intraperitoneal de 10 µg de albúmina de huevos de pollo en 2 mg de hidróxido de aluminio al 2% (Serva) en un volumen total de 200 µ? que se preparó mezclando 25 µ? de ovalbúmina (2 mg/ml) , 250 µ? de hidróxido de aluminio en 725 µ? libre de LPS al 0.9% de NaCl (salina) y se precipitó 3-4 horas a 4°C. Quince días después de la sensibilización, los ratones se trataron y se cambiaron en grupos de 6 ratones con la administración intranasal de 15 µg de ovalbúmina en 50 µ? de solución salina, bajo anestesia inhalada (isoflurano) diariamente desde el día 15 a 19. La CCL2-P8A (200 µ?, 10 µg por inyección intraperitoneal) se administró 30 minutos antes de cada prueba inmunogénica. Los lavados peritoneales para valorar el reclutamiento celular y el conteo celular se realizaron como se describe anteriormente en el ej emplo 2. Modelo EAE {Encefalomielitis Autoinmune Experimental) Los ratones C57BI/6 del Río Charles Italia (la cepa seleccionada tiene susceptibilidad documentada para EAE; Sahrbacher UG et al., 1998.) se inmunizaron (día = 0) inyectando s.c. en el flanco izquierdo a partir de 0.2 mi de una emulsión compuesta de 200 µg del péptido MOG35.55 (Neosystem, Estrasburgo, Francia) en el adyuvante de Freund completo (CFA, Disco, Detroit, U.S.A.) que contiene 0.5 mg de Mycobacterium tuberculosis. Inmediatamente después, recibieron una inyección i.p. de 500 ng de toxinas pertussis (List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A) disuelta en 400 µL de una solución amortiguadora (NaCl 0.5 ra, Tritón X-100 0.017%, Tris 0.015 M, pH = 7.5) . En el día 2, se les suministró a los animales una segunda inyección i.p. de 500 ng de la toxina pertussis. En el día 7, los ratones recibieron una segunda dosis de 200 µg del péptido MOG35-S5 en CFA inyectado s.c. en el flanco derecho. Al inicio, aproximadamente a partir del día 8-10, este procedimiento resulta en una parálisis que progresa gradualmente apareciendo desde la cola y ascendiendo hasta los miembros anteriores. Al inicio desde el día 7, los animales se examinan diariamente por la presencia de parálisis por medio de un registro clínico como sigue: 0 = sin señales de la enfermedad 0.5 = parálisis parcial de la cola 1 = parálisis de la cola. 1.5 = parálisis de la cola + parálisis de los miembros posteriores unilaterales parcial 2 = parálisis de la cola + debilidad de los miembros posteriores o parálisis de los miembros posteriores parcial. 2.5 = parálisis de la cola + parálisis de los miembros posteriores parcial (pelvis inferior) 3 = parálisis de la cola + parálisis de los miembros posteriores completa 3.5 = parálisis de la cola + parálisis de los miembros posteriores completa + incontinencia 4 = parálisis de la cola + parálisis de los miembros posteriores + debilidad o parálisis parcial de los miembros anteriores 5 = moribundo o muerto. El tratamiento con compuestos o vehículos inicia para cada animal en el día 7 después de la inmunización y se continúa durante 21 días consecutivos (10-12 animales por grupo de tratamiento) . La CCL2-P8A y el interferon beta se administraron s.c. o i.p. respectivamente, una vez al día solubilizado en 10 mg/kg de PBS en la dosis indicada de la figura. Modelo de hipersensibilidad por contacto retrasado La prueba de hinchazón de la oreja en el ratón para medir la hipersensibilidad por contacto se realizó como se describió previamente (garrigue JL et al., 1994). De manera breve, los ratones se pre-sensibilizaron tópicamente aplicando 25 µ? de una solución de 2 , 4-dinitrofluorobenceno al 0.5% (DNFB; Sigma Chemical Co.) en acetona/aceite de oliva (4:1) al abdomen rasurado. Cinco días después, 20 µ? de DNFB al 0.2% en el mismo vehículo se aplicaron a las orejas derechas y el vehículo únicamente a las orejas izquierdas. Los ratones (n=6 por grupo) se trataron diariamente en el día 5 con una administración peritoneal de 0,05, 0.5 o 5 mg/kg (1,10 o 100 microgramos/ratón, respectivamente) de CCL2-P8A, Dexametasona (1 mg/kg) , o PBS únicamente en el grupo de control. El tratamiento se administró 30 minutos previo a la prueba inmunogenica DNFB. Se midió el espesor de las orejas con un calibrador de espesor de disco (Mitutoyo Corp.), la hinchazón de las orejas se estimó substrayendo la prueba inmunogenica previa a partir del valor de la prueba inmunogenica posterior y substrayendo además, cualquier hinchazón detectada en la oreja contralateral por medio de la prueba inmunogenica con el vehículo. Resultados Las actividades potenciales terapéuticas de CCL2-P8A como antagonistas de quimiocinas se han probado en modelos animales para las enfermedades inflamatorias y autoinmunes . La CCL2*-P8A se probó en un modelo de la enfermedad, la inflamación de pulmón inducida por ovalbúmina . En esta clase de modelo para la inflamación del pulmón alérgica, los ratones se sensibilizan con ovalbúmina con un adyuvante de hidróxido de aluminio durante la fase de sensibilización para ayudar a la respuesta inmune, y después se prueba inmunogénicamente mediante la administración intranasal de ovalbúmina durante un periodo de 5 días consecutivos, en donde la CCL2-P8A se administró intraperitonealmente a través de esta fase. También en este caso, la CCL2-P8A fue capaz de inhibir el reclutamiento celular (figura 4) . En un segundo modelo, la CCL2-P8A se probó en el modelo EAE (Encefalomielitis Autoinmune Experimental) un modelo bien conocido por esclerosis múltiple que ha sido usado para validar antagonistas de quiraiocinas (que incluyen CCL2) para el tratamiento de esta enfermedad de desmielinización inflamatoria autoinmune del sistema nervioso central humano (Manad DJ y Ransohoff RM, 2003; Izikson L et al., 2002). La CCL2-P8A se probó en animales que muestran ya sea niveles moderados o severos de la enfermedad, evaluados mediante un registro clínico siguiendo el tratamiento de los compuestos que inducen EAE. Cada uno de los dos grupos de animales se dividieron en cinco subgrupos : tres de los mismos se trataron con diferentes cantidades de CCL2-P8A y los otros dos se usaron y sea como control negativo (tratado únicamente con el vehículo) o como control positivo (tratado con el interferón beta, un producto terapéutico común para el tratamiento de la esclerosis múltiple) . La evolución del estado de los animales se comparó en base al registro clínico medido durante el periodo de tratamiento (21 días) . En modelos de la enfermedad, la administración de CCL2-P8A (en una dosificación inferior a 0.15 mg/kg) mejora el estado de los animales en un manera estadísticamente significativa. La disminución observada del registro clínico usando CCL2-P8A es al menos comparable al observado cuando el interferón beta se usa como tratamiento (figuras 5A-5B) . Otro modelo de enfermedad, el modelo de hipersensibilidad por contacto se usó para evaluar la eficacia terapéutica potencial de CCL2-P8A en la inflamación de la piel mediada por las células T. La hipersensibilidad por contacto (CHS) es una respuesta inmune cutánea mediada por las células T dependiente de las células Langerhans LC) que reflejan una culminación de las actividades LC in vivo (absorción de antígenos epicutáneos, migración en los ganglios linfáticos y la presentación de antígenos para las células T sencillas) . El modelo se establece bien para la caracterización del compuesto mediante indicaciones dermatológicas como la psoriasis y la dermatitis de contacto alérgico (Xu H et al. 1996) . Este involucra una fase de sensibilización y una prueba inmunogénica subsecuente con un antígeno, que resulta en la inflamación de la piel con la formación del edema e infiltrados celulares en la piel . El edema pude medirse mediante un calibrador en el sitio probado estimulado (oreja del ratón) . Se ha demostrado el involucramiento de las quimiocinas y en particular de CCL2, en el desarrollo de esta enfermedad de respuesta excesiva (Mitsui G et al., 2003; Mizumoto N et al . ; 2001). La administración intraperitoneal de CCL2-P8A 30 minutos antes de la prueba inmunogénica con el antígeno (DNFB, en este caso) la como resultado una disminución en la hinchazón comparable al observado usando un compuesto antiinflamatorio conocido (Dexametasona) un día después del tratamiento. Los ratones de control se obtuvieron por medio de pruebas inmunogénicas con el antígeno, pero también con o sin sensibilización previa de manera que la inflamación y el edema dependiente de las células T se formara o no (figura 6) . Por lo tanto, una variante monomerica de una quimiocina CC que forma homodimeros en donde la variante resulta de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerización, son inhibidores del refuerzo de la célula mediada por la quimiocina en ensayos de reclutamiento celulares in vivo asi como en modelos anímales para enfermedades humanas que implican que esta nueva estrategia para generar las variantes de quimiocina que pueden usarse para preparar composiciones farmacéuticas y en métodos terapéuticos . Ejemplo 4: Formas alternas de CCL2-P8A Las formas alternas de las variantes de quimiocina descritas arriba pueden generarse mediante la introducción de mutaciones conocidas en el arte que mejoran las características específicas . Una o más sustituciones de aminoácidos simples y/o adiciones pueden introducirse en diferentes posiciones de CCL2-P8A (figura 7A) . La CCL2-P8A puede expresarse como una proteína madura que pierde el residuo N terminal de glutamina natural o añadiendo un residuos pequeño adicional (tal como Alanina o Glicina) en el término N antes de la glutamina, de manera que el residuo no permanezca y no se convierta espontáneamente en la forma piroglutamato (Gong J y Clark-Lewis I, 1995) . La CCL2-P8A también puede imitarse en la forma en la que la quinta cisteína está disponible para permitir reacciones de PEGilacion específicas . Estos sitios de Pegilación pueden integrarse en el nivel de ya sea un aminoácido interno (por ejemplo, en la Asparagina 14 o 17, e incluso en la posición 8, para que una modificación simple pueda permitir tanto la monomerizacion como la PEGilacion) o del término C (añadiendo directamente a la cisteína después de la treonina C terminal natural) . Una variante adicional de CCL2-P8A puede obtenerse fusionando esta secuencia a una región constante del dominio de la inmunoglobulina, un dominio de la proteína conocido por mejorar la estabilidad y la eficacia de las proteínas recombinantes en la circulación. La proteína de fusión resultante puede ser expresada directamente mediante células de mamíferos (tales como las células CHO o las HEK293) usando los vectores de expresión apropiados de manera que la proteína de fusión se secrete en el medio de cultivo. En una configuración preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la CCL2-P8A madura puede ser clonada en un vector de expresión fusionada a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la secuencia de señal CCL2 humana en su extremo 5', y la secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la región constante (segmento 246-467) de la cadena IgGl pesada lambda de la inmunoglobulina humana (NCBI Acc. No. CAA75302) en su extremo 3 ' . El vector resultante puede usarse para transformar una línea de célula CHO o HEK293 y los clones que se expresan establemente y pueden seleccionarse los clones que secretan la ' proteina de fusión recombinante que tienen CCL2-P8A en el término N y en la secuencia IgGl en el término C (figura 7B) . Este clon puede usarse entonces para escalar la producción y para purificar la proteina de fusión recombinante desde el medio de cultivo. Alternativamente, la posición de los ácidos nucleicos que codifican a la región constante (segmento 243-474) de CCL2-P8A e IgGl de cadena pesada lambda de inmunoglobulina de humano pueden invertirse y la proteina de fusión puede expresarse y secretarse usando aún la secuencia de señal CCL2 humana o cualquier otra secuencia de señal. TABLA I TABLA II REFERENCIAS Alexander JM et al., Cell, 111; 343-356, 2002. Baggiolini M et al., Annu Rev Immunol, 15: 675-705, 1997. Baggiolini M, J Intern Med, 250: 91-1 04, 2001. Blyth DI et al., Am J Respir Cell Mol Biol . , 14:425-438, 1996. Brown A et al., J Pept Sci 2: 40-46, 1996. Cleland JL et al., Curr Opin Biotechnol, 12: 212-219, 2001. Coleman RA et al., Drug Disc Toay, 6: 1116-1126, 2001.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invasión, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. El uso de un polipeptido que comprende la SEQ ID NO: 2 como un medicamento. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 en donde el polipeptido comprende además una isoleucina en la posición 64 de la SEQ ID NO:2.
3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 en donde además el polipeptido no contiene una mutación en la posición 9, 10 ó 13 en la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO-.2 y la SEQ ID NO: 4.
4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 en donde el polipeptido contiene en la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: : a) una cisteína en la posición 8, 14, 17 ó 77; o b) una alanina o una glicina en la posición 1.
5. 5. El uso de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipeptido comprende la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.
6. 6. El uso de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas.
7. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 6 en donde el polipéptido comprende además una isoleucina en la posición 64 de la SEQ ID NO: 2.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 6 o 7 en donde además el polipéptido no contiene una mutación en la posición 9, 10 ó 13 en la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID N0:4.
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 6 ó 7 en donde además el polipéptido contiene en la secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO:4. a) cisteína en la posición 8, 14, 17 ó 77; o b) una alanina o una glicina en la posición 1.
10. 10. El uso de conformidad con las reivindicaciones 6 a 9, en donde el polipéptido comprende la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 6 en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de : artritis, artritis reumatoide (RA), artritis psoriática, osteoartritis , lupus sistémico eritomatoso (SLE) , esclerosis sistémica, escleroderma, polimiositis, glomerulonefritis , fibrosis, enfermedades alérgicas o de hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad del intestino inflamatoria (IBD) , enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, esclerosis múltiple, cáncer, choque séptico, infecciones del VIH o virales, transplantes, inflamación de las vías aéreas, enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) y aterosclerosis.
12. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 7 en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste de artritis, artritis reumatoide (RA) , artritis psoriática, osteoartritis, lupus . sistémico eritomatoso (SLE) , esclerosis sistémica, escleroderma, polimiositis, glomerulonefritis, fibrosis, fibrosis, enfermedades alérgicas o de hipersensibilidad, dermatitis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , enfermedad del intestino inflamatoria (IBD) , enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, esclerosis múltiple, cáncer, choque séptico, infecciones del VIH o virales, transplantes, inflamación de las vías aéreas, enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD) y aterosclerosis.
13. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11 en donde la enfermedad es esclerosis múltiple.
14. 14. El uso de conformidad con la reivindicación 12 en donde la enfermedad es esclerosis múltiple.
15. 15. La secuencia de los aminoácidos del polipéptido de fusión de la SEQ ID NO: 2, caracterizada porque se fusiona a la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana de la SEQ ID NO:5.
16. 16. La secuencia de ácidos nucleicos caracterizada porque codifica al polipéptido de fusión de la SEQ ID N0:5.
17. 17. El método para producir el polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porgue comprende : a) clonación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la CCL2-P8A madura en un vector de expresión fusionado a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a la secuencia de señal CCL2 humana en su extremo 5' y la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a la región constante (segmento 243-474) de IgGl de cadena pesada lambda de inmunoglobulina humana en su extremo 3 ' ; b) transformar una linea de células CHO o HEK293 con el vector resultante; c) seleccionar los clones que secretan y expresan establemente la proteína de fusión recombinante que tiene CCL2-P8A en el término N y en la secuencia IgGl en el término C; d) purificar la proteína de fusión del medio de cultivo.
18. 18. Métodos para separar por exclusión las variantes de quimiocina antagonistas monoméricas obligadas descritas en la presente, caracterizados porque comprenden: a) elaborar mutaciones de punto simples en CCL2 que bloquean su capacidad para dimerizar; b) identificar las variantes que enlazan al receptor y muestran propiedades agonistas in vitro,- c) identificar las variantes del grupo identificado en (b) anterior que se distingue además por inhibir el reclutamiento de células peritoneales .
19. 19. La composición farmacéutica caracterizada porque comprende una variante monomérica de una quimiocina que forma homodímeros como ingrediente activo, en donde la variante resulta de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerización de la quimiocina.
20. 20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19 caracterizada porque la variante monomérica se selecciona de: a) CCL2-P8A (SEQ ID NO: 2) b) CCL2*-P8A (SEQ ID NO: ) ; c) un mutante activo de (a) o (b) ; o d) un polipéptido que comprende (a) , (b) o (c) , y una secuencia de aminoácidos que pertenecen a una secuencia de proteínas distinta a la quimiocina.
21. 21. La composición farmacéutica de la composición de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizada porque las variantes monoméricas se encuentran en la forma de una fracción activa, precursores, sales, derivados, complejos o conjugados .
22. 22. Un método para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes, inflamatorias o infecciosas caracterizado porque comprenden la administración de una cantidad efectiva de un variante monomérica de una quimiocina que forma homodimeros, en donde la variante resulta de al menos una sustitución de aminoácidos que altera el patrón de los enlaces de hidrógeno en la interfase de dimerizacion de la quimiocina.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la variante monomérica se selecciona de: a) CCL2-P8A (SEQ ID NO: 2) b) CCL2*-P8A (SEQ ID N0:4); c) un mutante activo de (a) o (b) ; o d) un polipéptido que comprende (a) , (b) , (c) , y una secuencia de aminoácidos que pertenecen a una secuencia de proteínas distinta a la quimiocina.