EA009414B1 - Терапевтические применения вариантов хемокинов - Google Patents

Терапевтические применения вариантов хемокинов Download PDF

Info

Publication number
EA009414B1
EA009414B1 EA200600782A EA200600782A EA009414B1 EA 009414 B1 EA009414 B1 EA 009414B1 EA 200600782 A EA200600782 A EA 200600782A EA 200600782 A EA200600782 A EA 200600782A EA 009414 B1 EA009414 B1 EA 009414B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
polypeptide
ccb2
ccl2
variants
Prior art date
Application number
EA200600782A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600782A1 (ru
Inventor
Аманда Праудфут
Джеффри Шо
Зо Джонсон
Original Assignee
Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. filed Critical Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В.
Publication of EA200600782A1 publication Critical patent/EA200600782A1/ru
Publication of EA009414B1 publication Critical patent/EA009414B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Abstract

Варианты гомодимеробразующих хемокинов, такие как CCL2 человека, имеющие единственную замену аминокислоты в границе димеризации, которая изменяет картину водородных связей, и действующие как облигатный мономер, могут быть антагонистами природных хемокинов и имеют противовоспалительную активность in vivo. Эти варианты могут быть использованы в качестве активного ингредиента в фармацевтических композициях для лечения воспалительных, аутоиммунных или инфекционных заболеваний.

Description

Данное изобретение относится к новым терапевтическим применениям вариантов хемокинов и, в частности, вариантов ССЬ2 человека.
Уровень техники
Хемокины являются небольшими, секретируемыми провоспалительными белками, которые опосредуют направленную миграцию лейкоцитов из крови к месту повреждения. В зависимости от положения консервативных цистеинов, характеризующих это семейство белков, семейство хемокинов может быть подразделено структурно на С, С-С, С-Х-С и С-Х3-С-хемокины, которые связываются с рядом мембранных рецепторов (Ваддюйш М. е! а1., 1997; Регпапбек Е.1. апб Ьойк Е., 2002).
Эти мембранные рецепторы, все являющиеся гептаспиральными С-белок-связанными рецепторами, позволяют хемокинам проявлять их биологическую активность на клетках-мишенях, которые могут представлять специфические комбинации рецепторов в соответствии с их состоянием и/или типом. Физиологические эффекты хемокинов происходят из комплексной и интегрированной системы одновременных взаимодействий: эти рецепторы часто имеют перекрывающуюся лигандную специфичность, так что единственный рецептор может связывать различные хемокины, а также единственный хемокин может связываться с различными рецепторами.
Обычно хемокины продуцируются в месте повреждения и вызывают миграцию и активацию лейкоцитов, играя фундаментальную роль в воспалительных, иммунных, гомеостатических, гемопоэтических и ангиогенных процессах. Даже при наличии потенциальных недостатков в использовании хемокинов в качестве терапевтических агентов (тенденции агрегироваться и разнородного связывания, в частности) эти молекулы считаются хорошими кандидатами-мишенями для терапевтического вмешательства в заболевания, ассоциированные с такими процессами, посредством ингибирования специфических хемокинов и их рецепторов с целью предотвращения избыточного рекрутинга и избыточной активации лейкоцитов (Ваддюйш М., 2001; Еое!ксйет Р. апб С1агк-Ье^15 I., 2001; Собеккай N. апб Кипке1 8.Й., 2001).
Исследование взаимосвязи структура-активность указывает на то, что хемокины имеют два главных сайта взаимодействия с их рецепторами, гибкий аминоконцевой район и конформационно жесткую петлю, которая следует за вторым цистеином. Считается, что хемокины стыкуются на рецепторах посредством района петли, и считается, что этот контакт облегчает связывание аминоконцевого района, которое приводит к активации рецептора. Эта важность аминоконцевого района была продемонстрирована также испытанием природных и синтетических хемокинов, в которых этот домен является модифицированным или укороченным. Этот процессинг после протеолитического расщепления, мутагенеза или химической модификации аминокислот, может либо активировать, либо делать эти молекулы неактивными с образованием соединений с агонистической и/или антагонистической активностью. Таким образом, хемокины со специфическими модификациями в аминоконцевом районе имеют терапевтический потенциал в отношении воспалительных и аутоиммунных заболеваний (8с11\\'агх апб Уе11к. 1999).
ССЬ2, также известный как моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (МСР-1) или моноцитарный хемотаксический и активирующий фактор (МСАР), был идентифицирован как имеющий центральную роль в воспалении, будучи способным стимулировать рекрутинг моноцитов и лимфоцитов в ответ на сигналы повреждения и инфекции в различных воспалительных заболеваниях, различных типах опухолей, аллотрансплантате сердца, СПИДе и туберкулезе (УокЫтита Т. е! а1., 1989; Си Ь. е! а1., 1999). Физиологические активности, ассоциированные с ССЬ2, интенсивно исследовались с использованием трансгенных животных, что позволило продемонстрировать, что этот хемокин контролирует не только рекрутинг моноцитов в моделях воспаления, но также экспрессию цитокинов, связанных с Тхелперными реакциями и инициацией атеросклероза (Си Ь. е! а1., 2000; 6ок1шд 1. е! а1., 1999; Ьи В. е! а1., 1998).
Структурно ССЬ2 состоит из Ν-концевой петли и β-складки, на которую наложена α-спираль на Сконцевой стороне, и образует гомодимеры, даже хотя он детектируется в виде мономера в специфических экспериментальных условиях (Напбе1 Т. е! а1., 1996; К1т К.8. е! а1., 1996; ЕиЬкотекк1 1. е! а1., 1997). Что касается многих других хемокинов, литература обеспечивает много примеров исследований структура-активность, в которых были созданы мутанты ССЬ2 экспрессией Ν-терминально укороченных или замещенных в единственном сайте вариантов для оценки роли делетированных или замененных аминокислот в ССЬ2-ассоциированных активностях связывания и других свойствах (Сопд 1. апб С1атк-Еетеик I., 1995; Ζΐιηπβ Υ. е! а1., 1996; 81ейх 8.А. е! а1., 1998; Си Ь. е! а1., 1999; Неттепсй 8. е! а1., 1999; 8ее! В.Т. е! а1., 2001).
В частности, изучалась роль димеризации в связывании и активации рецептора ССЬ2, и было показано, что различные мутации в концевом районе, препятствующие димеризации, могут изменять некоторые активности ССЬ2, такие как аффинность связывания рецептора, стимуляция хемотаксиса, ингибирование аденилатциклазы и стимуляцию вхождения кальция (Раауо1а С. е! а1., 1998). Хотя один мутант, описанный Раауо1а, называемый здесь Р8А*, не димеризуется, но сохраняет исходную силу и эффективность, было показано, что другой облигатный мутант, описанный Раауо1а, называемый здесь Υ13Α*, имеет в 100 раз более слабую аффинность связывания ш уйто, чтобы быть гораздо менее сильным ингибитором аденилатциклазы и стимулятором вхождения кальция ш уйто, и не способным стимулировать
- 1 009414 хемотаксис в культуре клеток. Подобно Υ13Α*, мутант [1+9-76]МСР-1 (мутант ССЬ2, лишенный остатков 2-8) является антагонистом активностей ССЬ2 ίη νίίτο.
Связывающие свойства мутанта ССЬ2, содержащего замену Р8А, также были исследованы в экспериментальной модели, основанной на узнавании вирусного хемокинсвязывающего белка М3, с демонстрацией эффективного связывания этого вирусного белка с данным мутантом ССЬ2 (А1ехапбег 1.М. с1 а1., 2002). Кроме того, было показано, что мономерные варианты хемокинов, такие как ССЬ2-Р8А, лишены активности ίη νίνο, хотя являются полностью активными и неотличимыми от димерной формы ίη νίίτο (ΤΐΌΐι6ίοοΙ А. еί а1., 2003).
Примеры мутантов ССЬ2, включающих в себя остатки, не влияющие на профиль димеризации полученного белка, уже были описаны в литературе как приводящие к молекулам, имеющим антагонистические свойства в отношении ССЬ2 (ИЗ 5739103, МО 03/84993). Однако в предыдущем уровне техники нет указания на то, что конкретный мутант хемокина и, в частности мутант ССЬ2, являющийся облигатным мономером вследствие замены единственного сайта (например, включающего в себя пролин), может действовать в качестве антагониста хемокина.
Сущность изобретения
Неожиданно было обнаружено, что варианты гомодимеробразующих хемокинов, таких как ССЬ2, имеющие единственную замену аминокислоты в границе димеризации, которая изменяет картину водородных связей таким образом, что образуется облигатный мономер, который связывается с рецептором и имеет агонистические свойства ίη νίίτο, может быть антагонистом природных хемокинов и иметь противовоспалительную активность ίη νίνο.
Описанные здесь варианты применимы в качестве лекарственного средства. Полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2, и полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2 с дополнительной мутацией в изолейцин в положении 64 ЗЕО ΙΌ N0:2 (ЗЕО ΙΌ N0:4), применимы в качестве лекарственных средств.
Описанные здесь варианты применимы в качестве лекарственных средств для лечения аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний. Полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2, и полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2 с дополнительной мутацией в изолейцин в положении 64 ЗЕО ΙΌ N0:2 (ЗЕО ΙΌ N0:4), применимы в качестве лекарственных средств для лечения аутоиммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний. В одном примере полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2, и полипептиды, содержащие ЗЕО ΙΌ N0:2 с дополнительной мутацией в изолейцин в положении 64 ЗЕО ΙΌ N0:2 (ЗЕО ΙΌ N0:4), применимы в качестве лекарственных средств для лечения рассеянного склероза.
Описанные здесь варианты дополнительно применимы для лечения аутоиммунных, воспалительных и инфекционных заболеваний. Такие способы предусматривают введение эффективного количества мономерного варианта данного изобретения, где указанный вариант происходит из по меньшей мере одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей в границе димеризации указанного хемокина. Примерами таких мономерных вариантов, которые могут быть использованы в таких способах, являются: а) полипептид, содержащий ЗЕО ΙΌ N0:2; Ь) полипептид, содержащий ЗЕО ΙΌ N0:4; с) активный мутант а) или Ь); б) полипептид, содержащий а), Ь) или с) и аминокислотную последовательность, принадлежащую белку, другому, чем указанный хемокин; а также соответствующие молекулы в форме их активных фракций, предшественников, солей, производных, комплексов или конъюгатов.
Далее, данное изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие полипептид, содержащий облигатные мономерные антагонистические варианты хемокина данного изобретения.
Далее, данное изобретение включает в себя слитые белки, содержащие облигатный мономерный антагонистический вариант хемокина, описанный здесь, слитый с последовательностью белканехемокина, например, аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ N0:2, слитую с константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина человека (ЗЕО ΙΌ N0:5).
Далее, данное изобретение включает в себя способы получения этих слитых белков.
Далее, данное изобретение включает в себя способы скрининга на облигатные мономерные антагонистические варианты хемокина, описанные здесь, предусматривающий:
a) получение моносайтовых мутаций в ССЬ2, которые блокируют способность димеризоваться;
b) идентификацию указанных вариантов, которые связываются с рецептором и обнаруживают агонистические свойства ίη νίίτο;
c) идентификацию указанных вариантов из группы, идентифицированной в (Ь) выше, которые дополнительно характеризуются как ингибирующие рекрутинг перитонеальных клеток.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидными из следующего подробного описания.
Описание фигур
Фиг. 1 - аминокислотные последовательности зрелого ССЬ2 человека (остатки 24-99 ЗМ[ЗЗВВ0Т Асе. # Р13500; ЗЕО ΙΌ N0:1), зрелого ССЬ2-Р8А (ЗЕО ΙΌ N0:2), зрелого ССЬ2* (ЗЕО ΙΌ N0:3), зрелого ССЬ2*-Р8А (ЗЕО ΙΌ N0:4). Мутация в положении 64 в изолейцин (Μ64Ι) заключена в блок в ССЬ2* и ССЬ2*-Р8А; релевантная мутация Р8А напечатана жирным шрифтом и подчеркнута.
- 2 009414
Фиг. 2 - диаграмма, сравнивающая активность рекрутинга клеток рекомбинантных ССЬ2 и ССЬ2Р8А человека с базовой линией (фоном) в анализе рекрутинга перитонеальных клеток.
Фиг. 3 - диаграмма, показывающая ингибирующую активность доза-ответ ССЬ2-Р8А в анализах рекрутинга перитонеальных клеток с использованием двух различных индукторов: ССЬ2 (А) или тиогликолата (В); эти результаты сравниваются с базовым уровнем, отрицательным контролем (только носителем, солевым раствором) и положительным контролем, дексаметазоном (Эе.х; только в В).
Фиг. 4 - диаграмма, показывающая ингибирующую активность ССЬ2-Р8А в анализе индуцированного овальбумином воспаления легких; этот результат сравнивается с базовым уровнем и отрицательным контролем (солевым раствором).
Фиг. 5 - график, показывающий эффективность ССЬ2-Р8А в уменьшении клинических оценок в модели рассеянного склероза животного, называемой ЕАЕ (экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом), при обнаружении животными либо легкого заболевания с низкой клинической оценкой (не более чем 2; А), либо тяжелого заболевания с высокой клинической оценкой (по меньшей мере 3; В); эти данные сравниваются с данными, наблюдаемыми с использованием только носителя (отрицательным контролем), или с данными положительного контроля для модели ЕАЕ (мышиного интерферона β; количество звездочек на нижней части каждого графика указывает уровень статистической значимости действия, наблюдаемого в сравнении с отрицательным контролем в каждой временной точке (* обозначает р<0,05, ** обозначает р<0,01 и *** обозначает р<0,001, как рассчитано однофакторным ΛΝϋνΛ с использованием критерия Фишера).
Фиг. 6 - диаграмма, показывающая ингибирующую активность ССЬ2-Р8А при введении в различных дозах в модели воспаления кожи животного (ΌΝΕΒ-индуцированного воспаления на ухе сенсибилизированных мышей); действие ССЬ2-Р8А на объем опухания уха после обработки, и его сравнивают со следующими контролями: животными, не сенсибилизированными, но получавшими обработку в день 5 ΌΝΕΒ (А), животным, сенсибилизированным и получавшим ΌΝΕΒ, но обработанным только носителем (В), и животными, обработанными дексаметазоном (Эех; вводимым таким же образом, что и ССЬ2-Р8А). Эти величины измеряли в день 6 (день после обработки и введения ΌΝΕΒ).
Фиг. 7 - альтернативные формы ССЬ2-Р8А, которые могут быть генерированы добавлением и/или заменой одной аминокислоты/множественных аминокислот (А) или слиянием с остатками 243-474 тяжелой цепи иммуноглобулина λ человека 1дО1 (В; сигнальная последовательность ССЬ2 подчеркнута двойной линией, зрелый ССЬ2-Р8А подчеркнут).
Подробное описание изобретения
В связи с вышеупомянутыми данными в предыдущем уровне техники, не было указания на то, что вариант ССЬ2, происходящий из по меньшей мере единственной аминокислотной замены в границе димеризации, которая изменяет картину водородных связей таким образом, что приводит к связыванию облигатного мономера с рецептором и наличию агонистических свойств ίη νίίτο, может быть антагонистом ССЬ2 ίη νίνο и обычно может ингибировать рекрутинг клеток и/или воспалительные реакции.
Единственная замена аминокислоты находится предпочтительно в положении 8 в зрелом ССЬ2 человека и, в частности, она состоит в замене пролина в положении 8 аланином. Эти варианты не содержат дополнительной мутации в положении, соответствующем положениям 9, 10 или 13 зрелого ССЬ2 человека.
Примером вышеописанных замен является мономерный вариант зрелой формы ССЬ2, называемый ССЬ2-Р8А, который может быть экспрессирован либо в виде включающего единственную замену пролина в положении 8 аланином (8ЕО ΙΌ N0:2), либо в виде включающего дополнительную замену (улучшающую экспрессию этого белка) метионина 64 на изолейцин (8Е0 ΙΌ N0:4). Замена пролина 8 на аланин (аминокислоту, имеющую отличающуюся ориентацию химической группы, возможно, образующей водородные связи) генерирует вариант ССЬ2, действующий в качестве облигатного мономера. ССЬ2Р8А и ССЬ2*-Р8А могут рассматриваться как молекулы, имеющие эквивалентную активность.
Фармацевтические применения, способы и композиции, которые могут затем ожидаться для этих специфических облигатных мономерных вариантов ССЬ2, называемых ССЬ2-Р8А и ССЬ2*-Р8А, могут ожидаться также для любого другого облигатного мономерного варианта ССЬ2 или других хемокинов, которые являются природно активными в качестве димеров, которые генерируют таким же образом. Эти мутанты должны предоставлять антагонистические и ингибиторные свойства, сходные со свойствами ССЬ2-Р8А и ССЬ2*-Р8А, против природного хемокина, и, следовательно, они должны иметь применимость в медицине.
Одним аспектом данного изобретения является применение облигатного мономерного варианта гомодимеробразующего хемокина, например, ССЬ2, который, как известно, является терапевтической мишенью для различных заболеваний, таких как аутоиммунные, воспалительные или инфекционные заболевания. Такие варианты происходят по меньшей мере из одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей на границе димеризации указанного хемокина таким образом, что приводит к облигатному мономеру, который связывается с рецептором и имеет агонистические свойства ίη νίίτο и антагонистические свойства ίη νίνο, в качестве активного ингредиента в фармацевтической ком
- 3 009414 позиции, в частности, для лечения или предупреждения аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний. Эти антагонистические свойства ίη νίνο могут становиться очевидными в анализах, позволяющих оценивать такие свойства, такие как рекрутинг эффекторных клеток в брюшной полости после индукции воспалительной молекулой (хемокином, таким как сам ССЬ2, тиогликолатом или овальбумином).
Этот облигатный мономерный вариант может происходить из единственной аминокислотной замены в границе димеризации, которая изменяет картину водородных связей. Более конкретно, поскольку хорошо известно, что пролин является аминокислотой, которая является особенно важной для установления стереоспецифических водородных связей, участвующих в образовании белковых комплексов, таких как гомодимеры, эта единственная аминокислотная замена должна быть заменой пролина аминокислотой, не являющейся пролином. Альтернативно, единственная аминокислотная замена должна быть заменой аминокислоты, не являющейся пролином, пролином, так что стереоспецифичность водородных связей становится измененной.
Альтернативные формы мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенные выше, которые могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях, включают в себя:
a) активный мутант или
b) полипептид, содержащий указанный вариант или указанный активный мутант, и аминокислотную последовательность, принадлежащую последовательности белка, другого, чем указанный хемокин.
Термин «активный» означает, что такие альтернативные соединения должны сохранять функциональные признаки мутантов ССЬ2 данного изобретения, т.е. должны быть антагонистами ССЬ2 ίη νίνο и ингибировать рекрутинг клеток и/или воспалительные реакции.
Облигатные мономерные антагонисты хемокина, определенные здесь, в качестве активного соединения в соответствии с данным изобретением, могут быть в форме их активных фракций, предшественников, солей, производных, комплексов или конъюгатов.
Эти альтернативные соединения должны рассматриваться как молекулы с изменениями относительно последовательности мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, которые не влияют на основные описанные здесь характеристики. Например, был генерирован ССЬ2*-Р8А на основе мутанта ССЬ2 (ССБ2-М641 или ССЬ2*), который сохраняет нормальные активности ССЬ2, но имеет улучшенные свойства в отношении рекомбинантной экспрессии.
Антагонистические свойства мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, и приведенных здесь в качестве примеров, с использованием ССБ2-Р8А в качестве антагониста ССЬ2, могут быть сохранены или даже усилены в этих активных мутантах. Эта категория молекул включает в себя природные или синтетические аналоги указанной последовательности, где один или несколько аминокислотных остатков были добавлены, делетированы или заменены, при условии, что они проявляют ту же самую биологическую активность, охарактеризованную в данном изобретении, в сравнимых или более высоких уровнях, как определено способами, известными в данной области и описанными в примерах ниже.
Предполагается, что природные аналоги являются соответствующими последовательностями белков-хемокинов человека, идентифицированных в других организмах, подобных мышиному ССЬ2 (δνίδδΡΚΟΤ Асе. # Р10148). Предполагается, что искусственные аналоги мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов являются полипептидами, полученными известным химическим синтезом и/или способами сайт-направленного мутагенеза, комбинаторными технологиями на уровне кодирующей последовательности ДНК (такими как перетасовка ДНК, фаговый дисплей/отбор), исследованиями конструирования с использованием компьютера или любым другим известным подходящим способом, которые обеспечивают имеющий предел набор по существу соответствующих мутированных или укороченных пептидов или полипептидов, которые могут быть получены рутинным образом и тестированы специалистом с обычной квалификацией в данной области с использованием описаний, представленных в предыдущем уровне техники и в примерах ниже.
Например, конкретные искусственные мутанты могут иметь одну или несколько аминокислот, замененных в других положениях ССЬ2, в отношении которых обнаружено, что они являются релевантными для генерирования антагонистов ССЬ2 (\УО 03/84993).
В соответствии с данным изобретением предпочтительными изменениями в активных мутантах являются замены, обычно называемые консервативными или безопасными заменами, и они включают в себя неосновные остатки. Консервативными аминокислотными заменами являются замены аминокислотами, имеющими достаточно сходные химические свойства, для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы. Ясно, что инсерции и делеции аминокислот могут быть также произведены в определенных выше последовательностях без изменения их функции, в частности, если эти инсерции или делеции включают в себя небольшое количество аминокислот, например, менее десяти и предпочтительно менее трех, и не удаляют или не заменяют аминокислот, которые являются решающими для функциональной конформации белка или пептида.
В литературе обеспечены многие модели, на которых отбор консервативных аминокислотных замен
- 4 009414 может выполняться на основе статистических и физико-химических исследований на последовательности и/или структуре природного белка (Кодоу 8.1. аиб Ыекгакоу Α.Ν., 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических субпопуляций аминокислот может давать способные к укладке и активные белки, способствуя классификации аминокислотных «синонимических» замен, которые могут более легко вмещаться в структуру белка и которые могут быть использованы для детектирования функциональных и структурных гомологов и паралогов (Мигрйу Ь.К. е! а1., 2000). Синонимические аминокислотные группы и более предпочтительные синонимические группы определены в табл. I. Например, замена метионина 64 изолейцином, общая для СО* и ССЬ2*-Р8А, была выбрана с использованием сходных критериев.
Дополнительной группой активных мутантов мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, являются пептидные миметики (также называемые пептидомиметиками), в которых природа пептида или полипептида была химически модифицирована на уровне боковых цепей аминокислот, хиральности аминокислот и/или пептидного скелета молекулы. Эти изменения предназначены для обеспечения мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, имеющих сходные или улучшенные свойства в отношении получения, эффективности и/или фармакокинетических признаков.
Например, когда пептид является чувствительным к расщеплению пептидазами, после инъекции в субъекта это является проблемой, и замена особенно чувствительной пептидной связи нерасщепляемым пептидным миметиком может обеспечивать пептид, более стабильный и, следовательно, более применимый в качестве терапевтического средства. Подобным образом, замена Ь-аминокислотного остатка является стандартным путем превращения этого пептида в пептид, менее чувствительный к протеолизу, и, наконец, более сходный с органическими соединениями, иными, чем пептиды. Применимы также аминоконцевые блокирующие группы, такие как трет-бутоксикарбонил, ацетил, теил, сукцинил, метоксисукцинил, суберил, адипил, азелаил, дансил, бензилоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, метоксиазелаил, метоксиадипил, метоксисуберил и 2,4-динитрофенил. Многие другие модификации, обеспечивающие увеличенную эффективность, пролонгированную активность, легкость очистки и/или увеличенный полупериод существования в организме, известны в данной области (УО 02/10195; Уййап М. е! а1., 2001).
Предпочтительными альтернативными «синонимическими» группами для аминокислот, включенных в пептидные миметики, являются группы, представленные в табл. II. Неисчерпывающий перечень аминокислотных производных включает в себя также аминоизомасляную кислоту (А1Ь), гидроксипролин (Нур), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-СООН, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, Ьтиазолидин-4-карбоновую кислоту, Ь-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин.
Под «аминокислотным производным» имеют в виду аминокислоту или подобную аминокислоте химическую частицу, другую, чем одна из 20 генетически кодируемых природно встречающихся аминокислот. В частности, аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные алкильные части, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими и могут включать в себя один или несколько гетероатомов. Амиинокислотные производные могут быть получены бе ηονο или получены из коммерческих источников (Са1Ь^οсйет-NονаЬ^οсйет АС, 8\\'йхег1апб; Ваейет, И8А).
Способы синтеза и развития пептидных миметиков, а также непептидных миметиков хорошо известны в данной области (НгиЬу УД. апб Ва1ке Р.М., 2000; Со1еЬютекку А. е! а1., 2001). Разнообразные методологии для включения неприродных аминокислот в белки с использованием систем трансляции как ίη νίΙΐΌ, так и ίη νίνΌ, для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков также описаны в литературе (Ооидйейу ЭА. 2000).
Данное изобретение описывает применение мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов и их активных мутантов в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях, а также белков, содержащих их аминокислотную последовательность и аминокислотную последовательность, принадлежащую последовательности белка, другого, чем указанный хемокин. Эта гетерологичная последняя последовательность должна обеспечивать дополнительные свойства без ухудшения фармацевтической применимости. Примерами таких дополнительных свойств являются более легкая процедура очистки, более длительный полупериод существования в жидкостях тела или внеклеточная локализация. Этот последний признак является особенно важным для определения конкретной группы слияния или химерных белков, включенных в приведенное выше определение, так как он позволяет этим мономерным вариантам быть локализованными в пространстве, где не только облегчается выделение и очистка этих пептидов, но также где ССЬ2 природным образом взаимодействует с другими молекулами.
Конструирование этих частей молекул, лигандов и линкеров, а также способы и стратегии для конструирования, очистки, детектирования и применения слитых белков широко обсуждаются в литературе (№1ккоп 1. е! а1., 1997; Аррйеабоп оГ еЫтепе депек апб ПуЬг1б рто!етк Мебюбк Епхуто1. Уо1. 326-328, Аеабетю Ргекк, 2000; УО 01/77137). Дополнительными белковыми последовательностями, которые могут быть использованы для генерирования альтернативных форм этих облигатных мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, являются последовательности внеклеточных доменов мембраносвязанного белка, константная область (Ре-район) иммуноглобулина, домены
- 5 009414 мультимеризации, внеклеточные белки, содержащие сигнальный пептид белки, содержащие сигнал экспорта белки. Выбор одной или нескольких из этих последовательностей, которые должны быть слиты с мономерным вариантом, является функциональным для конкретного применения указанного агента. Когда дополнительная белковая последовательность, как в случае последовательности внеклеточных содержащих сигнал экспорта или сигнальный пептид белков, позволяет мономерному варианту секретироваться во внеклеточное пространство, этот агент может быть более легко выбран и очищен от культивируемых клеток в связи с дополнительным процессингом, или, альтернативно, эти клетки могут быть непосредственно использованы или введены.
Облигатные мономерные варианты гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, могут быть также использованы в других предпочтительных формах, например в виде активных фракций, предшественников, солей, производных, конъюгатов или комплексов.
Термин фракция относится к любому фрагменту полипептидной цепи самого соединения, отдельно или в комбинации с родственными молекулами или остатками, присоединенными к нему, например остатками сахаров или фосфатов, или агрегатам исходного полипептида или пептида. Такие молекулы могут происходить также из других модификаций, которые обычно не изменяют первичную последовательность, например, из ίη νίνο или ίη νίίτο химической дериватизации пептидов (ацетилирования или карбоксилирования), пептидов, полученных модификацией распределения фосфорилирования (введения остатков фосфотирозина, фосфосерина или фосфотреонина) или гликозилирования (подверганием этого пептида действию ферментов, которые выполняют гликозилирование, например ферментов гликозилирования или дегликозилирования млекопитающих) пептидов во время их синтеза и процессинга или в дополнительных стадиях процессинга.
Предшественниками являются соединения, которые могут быть превращены в соединения данного изобретения метаболическим и ферментативным процессингом до или после введения в клетки или в тело.
Термин соли относится здесь как к солям карбоксильных групп, так и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп пептидов, полипептидов или их аналогов данного изобретения. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают в себя неорганические соли, например, соли натрия, кальция, аммония, железа (III) или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, такие как образуемые, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т. п. Кислотно-аддитивные соли включают в себя, например, соли с минеральными кислотами, такими как, например, хлористо-водородная кислота или серная: кислота, и соли с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Любая из таких солей должна иметь, по существу, сходную активность с активностью пептидов и полипептидов данного изобретения или их аналогов.
Термин производные относится в данном контексте к производным, которые могут быть получены из функциональных групп, присутствующих на боковых цепях аминокислотных частей молекул или на Ν- или С-концевых группах, в соответствии с известными способами. Такие производные включают в себя, например, сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп и Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп и образованы с ацильными группами, такими как, например, алканоильные или ароильные группы.
Применимые конъюгаты или комплексы облигатных мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, могут быть получены с использованием молекул и способов, известных в области взаимодействия рецептора или других белков (радиоактивных или флуоресцентных меток, биотина), терапевтической эффективности (цитотоксических агентов), или улучшения этих агентов в отношении эффективности доставки лекарственных средств, таких как полиэтиленгликоль или другие природные или синтетические полимеры (Наглк Ι.Μ. апб С11С55 В.В., 2003; Сгееппа1б В.В. с1 а1., 2003; РШат О. апб Рапейадпи1а В., 2001). Остатки могут быть использованы для присоединения, при условии, что они имеют боковую цепь, подходящую для присоединения полимера (т. е. боковую цепь аминокислоты, несущую функциональную группу, например, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, гистидина и т.д.). Альтернативно, остаток в таких сайтах может быть заменен другой аминокислотой, имеющей боковую цепь, подходящую для присоединения полимера. Боковые цепи генетически кодируемых аминокислот могут быть также химически модифицированы для присоединения полимера или может быть использована неприродная аминокислота с подходящими функциональными группами боковой цепи. Присоединение полимера может иметь место не только к боковой цепи аминокислоты, природно встречающейся в конкретном положении этого антагониста, или к боковой цепи природной или неприродной аминокислоты, которая заменяет аминокислоту, природно встречающуюся в конкретном положении этого антагониста, но также к углеводу или другой части молекулы, которая присоединена к этой боковой цепи аминокислоты в положении-мишени.
Полимеры, подходящие для этих целей, являются биосовместимыми, а именно, они являются нетоксичными в отношении биологических систем, и многие такие полимеры являются известными. Такие полимеры могут быть гидрофобными или гидрофильными по их природе, биодеградируемыми, небиодеградируемыми или их комбинацией. Эти полимеры включают в себя природные полимеры (такие как
- 6 009414 коллаген, желатин, целлюлоза, гиалуроновая кислота), а также синтетическими полимерами (такими как полиэфиры, полиортоэфиры, полиангидриды). Примеры гидрофобных недеградируемых полимеров включают в себя полидиметилсилоксаны, полиуретаны, политетрафторэтилены, полиэтилены, поливинилхлориды и полиметилметакрилаты. Примеры гидрофильных недеградируемых полимеров включают в себя поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поливиниловый спирт, поли(Ы-винилпирролидон), полиалкилены, полиакриламид и их сополимеры. Предпочтительные полимеры содержат в виде последовательного повторяющегося элементарного звена этиленоксид, например полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Предпочтительный способ присоединения использует комбинацию пептидного синтеза и химического лигирования. Предпочтительно присоединение водорастворимого полимера будет происходить через биодеградируемый линкер, особенно в амино-концевом районе белка. Такая модификация действует, обеспечивая этот белок в форме предшественника (или пролекарства), которая после деградации этого линкера высвобождает белок без модификации полимером.
В качестве обычной процедуры облигатные мономерные варианты гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, могут быть получены любой процедурой, известной в данной области, в том числе технологиями, связанными с рекомбинантной ДНК, и технологиями химического синтеза.
Многие книги и обзоры обеспечивают описания, каким образом можно клонировать и получать рекомбинантные белки с использованием векторов и прокариотических (например, Е. со11) или эукариотических клеток-хозяев (см., например, некоторые названия в серии А Ргаебеа1 АрргоаеЬ риЬШЬеб Ьу ОхГогб ИшуегШу Рге55 (ΌΝΑ С1ошид 2: Ехргеккюи Зуйепъ. 1995; ΌΝΑ С1ошид 4: МаттаЬаГ ЗуЧепъ. 1996; Рго1ет Ехргекыои, 1999; Рго1еш РиггГюабои ТесЬтдиек, 2001).
Другим вариантом осуществления в соответствии с данным изобретением является последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая облигатный мономерный вариант-антагонист хемокина, описанный здесь.
ДНК-последовательность, кодирующая облигатные мономерные варианты гомодимеробразующих хемокинов, может быть выделена и лигирована в подходящие эписомные или неэписомные/гомологично интегрирующиеся векторы, которые могут быть введены в подходящие клетки-хозяева любым подходящим способом (трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов, электропорацией, преципитацией фосфатом кальция, прямой микроинъекцией и т.д.) для их трансформации. Важные факторы в выборе конкретных плазмиды или вирусного вектора включают в себя: легкость, с которой реципиентные клетки, которые содержат этот вектор, могут быть распознаны и отобраны из реципиентных клеток, которые не содержат этого вектора; количество копий вектора, которые являются желательными в конкретном хозяине; и решение, является ли желательным, чтобы этот вектор был челночным вектором между клетками-хозяевами разных видов.
Векторы должны делать возможной экспрессию выделенного или слитого белка, в том числе антагониста данного изобретения, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине под контролем регуляторных последовательностей инициации/терминации транскрипции, которые выбраны таким образом, чтобы они были конститутивно активными или индуцируемыми в указанной клетке. Затем клеточная линия, существенно обогащенная такими клетками, может быть выделена с получением стабильной клеточной линии.
Для эукариотических хозяев (например, дрожжей, клеток насекомых или млекопитающих) могут быть использованы различные регуляторные последовательности транскрипции и трансляции. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, бычий папилломавирус, вирус обезьян или т.п., где эти регуляторные сигналы ассоциированы с конкретным геном, который имеет высокий уровень экспрессии. Примерами являются промотор ТК герпесвируса, ранний промотор 8У40, промотор гена да14 дрожжей и т.д. Могут быть выбраны регуляторные сигналы транскрипции, которые делают возможными репрессию и активацию, так что экспрессия генов может модулироваться. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, могут быть отобраны также введением одного или нескольких маркеров, которые делают возможным отбор клеток-хозяев, которые содержат этот экспрессирующий вектор. Этот маркер может также обеспечивать фототрофию ауксотрофному хозяину, устойчивость к биоцидам, например, антибиотикам, или тяжелым металлам, таким как медь, или т.п. Ген селектируемого маркера может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК гена, который должен быть экспрессирован, либо введен в ту же самую клетку котрансфекцией. Для оптимального синтеза этих белков могут быть также необходимы дополнительные элементы.
Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические хозяева, например клетки млекопитающих, такие как клетки человека, обезьяны, мыши и яичника китайского хомячка (СНО), так как они обеспечивают посттрансляционную модификацию белковых молекул, включающую в себя правильный фолдинг или гликозилирование в правильных сайтах. Дрожжевые клетки также могут проводить посттрансляционные модификации пептидов, в том числе гликозилирование. Существует ряд стратегий рекомбинантных ДНК, которые используют сильные промоторные последовательности и высокое число копий плазмид, которые могут быть использованы для получения желаемых белков в дрожжах. Дрожжи узнают лидерные последовательности в клонированных продуктах генов млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидерные последовательно
- 7 009414 сти (т.е. препептиды).
Для долгосрочного высокопроизводительного получения рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют представляющий интерес полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные элементы экспрессии и ген селектируемого маркера на одном и том же или на отдельном векторе. После введения этого вектора клеткам можно позволить расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде перед переключением их на селективную среду. Целью селектируемого маркера является придание устойчивости к отбору, и его присутствие делает возможным рост и извлечение клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности.
Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть пролиферированы с использованием способов культуры ткани, подходящих для данного типа клеток. Затем может быть выделена клеточная линия, существенно обогащенная такими клетками, для получения стабильной клеточной линии.
Клетки млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области и включают в себя многие иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), в том числе, но не только, клетки яичника китайского хомячка (СНО), НеЬа, почки детеныша хомячка (ВНК), клетки обезьяны (СО8), С127, 3Т3, ВНК, НЕК 293, меланомы Вопек и печеночно-клеточного рака человека (например, Нер С2) и ряд других клеточных линий. В бакуловирусной системе материалы для систем экспрессии бакуловирус/клетки насекомых являются коммерчески доступными в форме набора из 1п(ег айа. МахВас (1пуйгодеп).
Примерами технологий химического синтеза являются твердофазный синтез и жидкофазный синтез. В качестве твердофазного синтеза, например, аминокислоту, соответствующую С-концу пептида, который должен быть синтезирован, связывают с носителем, который является нерастворимым в органических растворителях, и посредством чередующегося повторения реакций, одной реакции, в которой аминокислоты с их аминогруппами и функциональными группами боковых цепей, защищенными подходящими защитными группами, конденсируют одну за другой от С-конца к Ν-концу, и одной реакции, в которой аминокислоты, связанные с этой смолой, или защитную группу аминогрупп этих пептидов высвобождают, пептидную цепь, следовательно, удлиняют таким образом. Способы твердофазного синтеза классифицируют в значительной степени по (Вос-способу и Ешое-способу в зависимости от типа используемых защитных групп. Обычно используемые защитные группы включают в себя (Вос (третбутоксикарбонил), С'1-Ζ (2-хлорбензилоксикарбонил), Вг-Ζ (2-бромбензилоксикарбонил), Βζΐ (бензил), Етос (9-флуоренилметоксикарбонил), МЬй (4,4'-диметоксидибензилгидрил), М!г (4-метокси-2,3,6триметилбензолсульфонил), Тг1 (тритил), Ток (тозил), Ζ (бензилоксикарбонил) и С'12-Βζΐ (2,6дихлорбензил) для аминогрупп; ΝΟ2 (нитро) и Рте (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил) для гуанидиногрупп); и (Ви (трет-бутил) для гидроксильных групп). После синтеза желаемого пептида его подвергают реакции удаления защитных групп и отрезают от твердого носителя. Такая реакция отрезания пептида может проводиться фторидом водорода или трифторметансульфоновой кислотой для Восспособа и ТФУ для Етос-способа. Полностью синтетические белки ССЬ2 описаны в литературе (Вгопп А. е! а1., 1996).
Очистку синтетических или рекомбинантных мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, определенных выше, проводят любым из способов, известных для этой цели, т.е. любой общепринятой процедурой, включающей в себя экстракцию, осаждение, хроматографию, электрофорез или т.п. Дополнительной процедурой очистки, которая может быть использована предпочтительно для очистки белка данного изобретения, является аффинная хроматография с использованием моноклональных антител или аффинных групп, которые связывают белок-мишень и продуцируются и иммобилизуются на гелевом матриксе, содержащемся в колонке. Неочищенные препараты, содержащие эти белки, пропускают через эту колонку. Белок будет связываться с колонкой посредством гепарина или специфическим антителом, тогда как примеси будут проходить через колонку. После промывки этот белок элюируют из геля изменением рН или ионной силы. Альтернативно, может быть использована ВЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Элюция может проводиться с использованием растворителя на основе воды-ацетонитрила, обычно используемого для очистки белков.
Мономерный вариант гомодимеробразующего хемокина может быть использован в фармацевтической композиции для лечения или предупреждения аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний. В частности, результаты, обеспеченные в примерах, рассматривающих модель рассеянного склероза животного, показывают, что эти мономерные варианты могут быть использованы в фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рассеянного склероза.
Другим аспектом данного изобретения является мономерный вариант гомодимеробразующего хемокина, где указанный вариант происходит по меньшей мере из одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей в границе димеризации указанного хемокина, используемый в качестве лекарственного средства. Примеры таких вариантов описаны здесь в виде ССЬ2-Р8А и ССЬ2*Р8А. Однако описание данного изобретения делает возможными идентификацию, получение и испыта
- 8 009414 ние сходных молекул на основе этой последовательности и активностей других хемокинов.
В частности, эти мономерные варианты могут быть выбраны из
a) ССЬ2-Р8Л (8ЕО ГО N0:2);
b) ССЬ2*-Р8Л (8ЕО ГО N0:4);
c) активного мутанта (а) или (Ь) или
б) полипептида, содержащего (а), (Ь) или (с) и аминокислотную последовательность, принадлежащую последовательности белка, иного, чем указанный хемокин;
а также соответствующих мономерных вариантов в форме их активных фракций, предшественников, солей, производных, комплексов или конъюгатов.
Другим аспектом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая мономерный вариант гомодимеробразующего хемокина в качестве активного ингредиента, где указанный вариант происходит по меньшей мере из одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей в границе димеризации указанного хемокина, такого как ССЬ2-Р8Л или ССЬ2*-Р8А, необязательно в формах, определенных выше (таких как активные мутанты, содержащие их полипептиды или конъюгаты), а также кодирующую их ДНК или экспрессирующие их клетки.
Фармацевтические композиции данного изобретения могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, биологически совместимые носители и добавки, которые пригодны для введения животному (например, физиологический солевой раствор), и необязательно содержащие вспомогательные вещества (такие как эксципиенты, стабилизаторы или разбавители), которые облегчают процессинг активных соединений в препаратах, которые могут быть использованы фармацевтически. Эти фармацевтические композиции могут быть приготовлены любым приемлемым способом, соответствующим требованиям способа введения. Например, применение биоматериалов и других полимеров для доставки лекарственных средств, а также различные способы и модели для валидизации конкретного способа введения описаны в литературе (Ьио Ό. апб Ргс51\\1с11 Ο.Ό., 2001; С1е1апб ЕЬ. с! а1., 2001).
Термин «эффективное количество» относится к количеству активных ингредиентов, которое является достаточным для влияния на ход и тяжесть заболевания, приводящего к уменьшению или ремиссии такой патологии. Эффективное количество будет зависеть от способа введения и состояния пациента.
Фармацевтически приемлемый обозначает любой носитель, который не уменьшает эффективность биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения описанные выше активные ингредиенты могут быть приготовлены в унифицированной дозированной форме для инъекции в носителях, таких как солевой раствор, раствор декстрозы, раствор сывороточного альбумина и раствор Рингера. Носители могут быть выбраны также из крахмала, целлюлозы, талька, глюкозы, лактозы, сахарозы, желатина, солода, риса, муки, мела, силикагеля, стеарата магния, стеарата натрия, моностеарата глицерина, хлорида натрия, сухого обезжиренного молока, глицерина, пропиленгликоля, воды, этанола и различных масел, в том числе масел, происходящих из нефти, растений, или масел синтетического происхождения (арахисового масла, соевого масла, минерального масла, кунжутного масла).
Любой приемлемый способ введения может быть использован и определен специалистами с квалификацией в данной области для установления желаемых уровней активных ингредиентов в крови.
Например, введение может выполняться различными парентеральными способами, такими как подкожный, внутривенный, интрадермальный, внутримышечный, интраназальный, трансдермальный, пероральный или буквальный способы. Парентеральное введение может быть болюсной инъекцией, постепенной перфузией на протяжении времени или дозированными формами регулируемого высвобождения, в том числе депо-инъекциями, осмотическими насосами и т.п., для пролонгированного введения полипептида при заданной скорости, предпочтительно в унифицированных дозированных формах, подходящих для отдельного введения точных доз. Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии, которые могут содержать вспомогательные агенты или эксципиенты, известные в данной области, и могут быть приготовлены в соответствии с рутинными способами. Кроме того, может вводиться суспензия активных соединений, в случае необходимости, масляные инъекционные суспензии. Подходящие липофильные растворители или носители включают в себя жирные масла, например, кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например, этилолеат или триглицериды. Водные инъекционные суспензии, которые могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включают в себя, например, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Необязательно, эта суспензия может также содержать стабилизаторы. Фармацевтические композиции включают в себя подходящие растворы для введения посредством инъекции и содержат приблизительно 0,01-99%, предпочтительно приблизительно 20-75% активного соединения вместе с эксципиентом. Композиции, которые могут вводиться ректально, включают в себя суппозитории.
Понятно, что вводимая доза будет зависеть от возраста, пола, здоровья и массы реципиента, типа одновременной терапии, если она имеется, частоты обработки и характера желаемого эффекта. Эту дозу подбирают для индивидуального субъекта, как это понятно и может быть определено специалистом с квалификацией в данной области. Общая доза, необходимая для каждой обработки, может вводиться в
- 9 009414 виде разделенных доз или в виде единственной дозы. Фармацевтическая композиция данного изобретения может быть введена отдельно или вместе с другими терапевтическими веществами, направленными на это состояние или направленными на другие симптомы данного состояния. Обычно суточная доза активного ингредиента содержит 0,01-100 мг на килограмм массы тела. Обычно 1-40 мг на килограмм в день, предоставляемые в разделенных дозах или в форме задержанного высвобождения, являются эффективными для получения желаемых результатов. Второе или последующие введения могут выполняться в дозе, которая является такой же, меньшей или большей, чем начальная или предыдущая доза, вводимая данному индивидууму.
Другой целью данного изобретения является способ лечения или предупреждения аутоиммунных или воспалительных (таких как рассеянный склероз) или инфекционных заболеваний, предусматривающий введение эффективного количества мономерных вариантов гомодимеробразующих хемокинов, где указанный вариант происходит по меньшей мере из одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей в границе димеризации указанного хемокина. Примерами таких мономерных вариантов, которые могут быть использованы в подобных способах, являются:
a) ССЙ2-Р8А (8ЕЦ ГО N0:2);
b) ССЬ2*-Р8Л (8ЕЦ ГО N0:4);
c) активный мутант (а) или (Ь) или
б) полипептид, содержащий (а), (Ь) или (с) и аминокислотную последовательность, принадлежащую последовательностии белка, иного, чем указанный хемокин;
а также соответствующих мономерных вариантов в форме их активных фракций, предшественников, солей, производных, комплексов или конъюгатов.
Неограничительный перечень примеров аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний, упомянутых выше в отношении применений, вариантов и способов данного изобретения, является следующим: артрит, ревматоидный артрит (ВЛ), псориатический артрит, остеоартрит, системная красная волчанка (8ЬЕ), системный склероз, склеродермия, полимиозит, гломерулонефрит, фиброз, аллергические заболевания или заболевания, связанные с повышенной чувствительностью, дерматит, астма, хроническая обструктуивная болезнь легких (С0РЭ). воспалительное заболевание пищеварительного тракта (ΙΒΌ), болезни Крона, язвенный колит, рассеянный склероз, рак, септический шок, вирусные или ВИЧ-инфекции, трансплантации, воспаление дыхательных путей, реакция трансплантат против хозяина (ΟνΗΌ) и атеросклероз.
Терапевтические применения полипептидов данного изобретения и родственных реагентов могут оцениваться (на основе безопасности, фармакокинетики и эффективности) с использованием анализов ίη νίνο или ίη νίίτο с применением клетки, ткани и моделей животных (Со1етап В. А. с1 а1., 2001; Ь1 А.Р., 2001; Ме1йобк Мо1. Βίο1. νο1. 138, Сйетокшек Ргоксок, ебйеб Ьу РгонбГоо! А. е1 а1., Нитапа Ргекк 1пс., 2000; МеФобк Епхуто1 νο1. 287 Ь 288, Асабетк Ргекк, 1997).
Другим аспектом данного изобретения являются способы скрининга на облигатные антагонистические варианты хемокинов, описанные здесь, предусматривающие:
a) получение моносайтовых мутаций в ССЬ2, которые блокируют его способность димеризоваться;
b) идентификацию указанных вариантов, которые связываются с рецептором и обнаруживают агонистические свойства ίη νίίτο;
c) идентификацию указанных вариантов из группы, идентифицированной в (Ь) выше, которые дополнительно характеризуются как ингибирующие рекрутинг перитонеальных клетов.
Эта оценка этих свойств может выполняться с использованием способов, известных в данной области и показанных в примерах, с применением молекулы, о которой известно, что она индуцирует воспаление и рекрутинг перитонеальных клеток, например, хемокина, такого как сам ССЬ2, тиогликолат или овальбумин.
Данное изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, но содержание этого описания содержит все модификации и замены, которые могут быть осуществлены лицом с квалификацией в данной области без отклонения от идеи и цели приведенной формулы изобретения.
Теперь данное изобретение будет описано посредством следующих примеров, которые не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом данное изобретение.
Примеры
Пример 1. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантных белков.
Зрелый белок ССЬ2 (фиг. 1; 8ЕЦ ГО N0:1) и мутантный белок ССЬ2-Р8А (фиг. 1; 8ЕЦ ГО N0:2), зрелый белок ССЬ2* (фиг. 1; 8ЕЦ ГО N0:3) и мутантный белок ССЬ2*-Р8А (фиг. 1; 8ЕЦ ГО N0:4) генерировали и экспрессивали в виде рекомбинантных белков в Е. сой, как описано в литературе (Рааνο1а 8.Ό. еί а1., 1998) на основе последовательности зрелой формы ССЙ2/МСР-1 человека, соответствующей сегменту 24-99 молекулы-предшественника. Для ССЬ2* и ССЬ2*-Р8А замена метионина изолейцином в положении 64 улучшает чистоту и гомогенность мутантов элиминацией образования разновидности, содержащей сульфоксид метионина в положении 64.
Вкратце, гены для ССЬ2 и для ССЬ2* конструировали стандартными способами синтеза генов с оптимальным использованием кодонов для экспрессии в Е. сой и кодона для метионина, добавленного на
- 10 009414
5'-конце последовательности, кодирующей зрелый ССЬ2 или ССЬ2* человека. Мутантные конструкции, включающие в себя аланин в положении 8, получали мутагенезом с использованием полимеразной цепной реакции матрицы ССЬ2 или ССЬ2* и клонировали в вектор рЕТЗа (Νονα^οη) между сайтами Х1ю1 и Ше1.
Плазмиды, кодирующие белки на основе ССЬ2*, использовали для трансформации клеток ТАР302, которые являются клетками ВЬ21 рЬук 8, сконструированными нокаутом тиоредоксинредуктазы, чтобы сделать внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал более проводимым для образования дисульфидной связи. С использованием этого штамма дисульфидные связи, по-видимому, образуются в этой клетке, устраняя необходимость стадии рефолдинга.
Все конструкции получали и контролировали стандартными способами молекулярной биологии (ПЦР-мутагенезом и амплификацией, секвенированием ДНК, расщеплением рестриктазами). Один из клонов, содержащий правильную последовательность МСР-1 (Р8А), использовали затем для получения этого белка в Е. сой. Эти плазмиды использовали также для трансформации ВЬ21 81аг™ (ΌΕ3) (1пуйгодеп Са1 # С6010-03) или ВЬ21 ΌΕ3 (Холден Са1 # 69387-3).
ССЬ2, ССЬ2* и ССЬ2*-Р8Л экспрессировали и очищали, как описано в оригинальной статье, с использованием стадии обработки ультразвуком, стадии лизиса и хроматографической стадии (колонка 8РБерйагоке; элюция градиентом №1С1 в 10 мМ К2РО4, рН 7,5). Фракции пиков объединяли и дополнительно очищали обращенно-фазовой ВЖХ (колонка С18 с размером частиц 5 мкм и размерами пор 100 А). Белки элюировали с использованием градиента увеличения ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусную кислоту; обычно белки элюировались при 34±5% ацетонитрила. Затем их лиофилизировали, растворяли при 1 мг/мл в 35 мМ Трис, рН 8, давали им реагировать с 15 мкг аминопептидазы (Рерго1есН. Воск НШ, ΝΙ)/1 мг белка в течение 36 ч при комнатной температуре и повторно очищали обращеннофазовой ВЖХ. Обработка аминопептидазой удаляет только Ν-концевой метионин, образуя либо Νконцевой глутамин, либо Ν-концевую пироглутаминовую кислоту (нет влияния на биологическую активность вследствие этого различия), как наблюдали секвенированием Ν-конца этого рекомбинантного белка. Затем этот белок лиофилизировали, повторно растворяли в воде при 1-5 мг/мл и хранили в виде небольших аликвот при 80°С.
Более высокие количества рекомбинантных белков и, в частности, ССЬ2-Р8Л, получали также с использованием альтернативного протокола, предназначенного для очистки, начинающейся от осадка клеток, полученного из больших ферментационных культур штаммов Е. сой, продуцирующих эти белки. Обычно ферментер на 5 л продуцирует приблизительно 200 г сырой массы осадка клеток, а ферментер на 50 л продуцирует 1,8 кг сырой массы осадка клеток. Процедура очистки, описанная здесь, обрабатывает 200 г сырой массы осадка клеток.
Этот осадок клеток оттаивали и добавляли 3 мл буфера для разрушения на грамм сырой массы (50 мМ Трис/НС1-буфер, рН 8,0 (Са1. 20092391, Вю§о1уе), содержащего 10 мМ МдС12 (Са1. 63065, Б1ика), 5 мМ бензамидин/НС1 (Са1. 12073, Б1ика), 1 мМ 1,4 дл дитиотреитол (ДТТ) (Са1. 43819, Б1ика) 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) (Са1. 78830, Б1ика)*, 20 мг/л ДНКазы (Б1ика) (Са1. ΌΝ-25, 81дта). Эту суспензию гомогенизировали с использованием политрона для получения хорошего гомогената, лишенного фрагментов или слипаний. Все манипуляции проводили при 4°С. Эту гомогенизированую бактериальную суспензию переносили в механический разрушитель клеток Бгепсй Рге§8 (дифференциальное давление). Количество пассажей было обычно 2-4 при 1500 бар. Разрушение клеток подвергали мониторингу при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием Кумасси синим.
Лизат помещали в центрифужные пробирки О8Л и центрифугировали при 10000 об./мин с использованием центрифуги 8огуа1 ВС5С (16300 х д) в течение 90 мин при 4°С. После центрифугирования супернатант выбрасывали после подтверждения анализом при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, что представляющий интерес растворимый белок не мог детектироваться в этом супернатанте. Осадок извлекали шпателем из центрифужной пробирки и переносили в предварительно взвешенный химический стакан для взвешивания осадка. Этот осадок промывали деионизованной водой добавлением 5 мл воды на грамм осадка в химическом стакане и перемешивали в течение 30 мин при 4°С с использованием магнитной мешалки. Суспензию центрифугировали в центрифужных пробирках О8Л при 10000 об./мин с использованием центрифуги 8огуа1 ВС5С (16300 х д) в течение 60 мин при 4°С. Стадию промывки повторяли 3 раза. После каждого центрифугирования супернатант выбрасывали после подтверждения анализом при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, что представляющий интерес растворимый белок не мог детектироваться в этом супернатанте.
Осадок солюбилизировали в свежеприготовленном буфере для экстракции телец включения (100 мМ Трис/НС1-буфер, рН 8,0 (Са1. 20092391, Вю§о1уе), содержащем 1 мМ 1,4 дл дитиотреитол (ДТТ) (Са1. 43819, Б1ика) и 6М гуанидиний/НС1 (Са1. 50950, Б1ика)) в соотношении 100 мл буфера на 25 г осадка клеток с использованием Ро1у1гоп. Этот раствор нагревали в течение 30 мин при 60°С и перемешивали для гарантии мономеризации, затем охлаждали до комнатной температуры. Гомогенат помещали в центрифужные пробирки Т145 и ультрацентрифугировали при 35000 об./мин с использованием ультрацентрифуги Весктап Ь-60 (100000 х д). Супернатант фильтровали с использованием фильтра 0,8-0,2 мм (8р1
- 11 009414 га1Сар (Са1. 12069, РАЬЬ), анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ и количественно определяли с использованием реагента для анализа белка Кумасси (Р1егсе) в соответствии с протоколом, поставляемым с этим набором.
Представляющий интерес рекомбинантный белок улавливали на колонке РтеЫпе 35 Ρϊΐοΐ, содержащей смолу 8оигсе 30 КРС, упакованную в соответствии с инструкциями поставщика (АтегЛат Рйагтас1а). После использования эту колонку регенерировали в соответствии с процедурой очистки, поставляемой изготовителем ((АтегЛат Рйагтааа). Для 100 г клеточного осадка упаковывали колонку 3,5 см диаметр х 23 см высота, дающую в целом 220 мл (эквивалентных 1 колоночному объему) 8оигсе 30 КРС. Эту колонку инсталлировали на АКТА РРЬС (АтегЛат Рйагташа). Скорость тока была 10 мл/мин и максимальное давление 1 мПа. Перед нанесением пробы колонку промывали деионизованной водой для 2 колоночных объемов (440 мл). После промывки колонку уравновешивали 5 КО (колоночными объемами) буфера для уравновешивания (100 мМ Трис/НС1-буфер, (Са1. 20092391, ВюкоКе), доведенного до рН
7,5 дымящей 37% НС1 (Са1. 84426, Р1ика).
Растворенные ΙΒ (тельца включения) в гуанидиний/НС1 наносили на эту колонку при скорости тока 5 мл/мин. Затем колонку промывали 5 колоночными объемами буфера для уравновешивания и затем 5 колоночными объемами (КО) буфера А (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) (Са1. 28904, Р1егсе) и 99,9% дистиллированной воды). Белок элюируют с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) (Са1. 28904, Р1егсе), 9,9% дистиллированной воды, 90% ацетонитрила (υΝ1648, Вакег) более чем 10 КО (колоночных объемов) со скоростью тока 10 мл/мин и пределом давления 1 МРа. Собирали фракции 10 мл. Все обнаруженные пики анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, ВЖХ и количественной УФ-спектроскопией. Фракции, содержащие представляющий интерес белок, объединяли и количество измеряли УФ-спектроскопией.
Этот белок ренатурировали 10-кратным разведением в буфер для ренатурации (100 мМ Трис/НС1буфер, рН 8,0 (Са1. 20092391, ВюсоКе)), содержащий 0,1М восстановленный глутатион (Са1. 0-4251, 81дта) и 0,01 мМ окисленный глутатион (Са1. 120 000 250, Асю Огдашс), с получением конечной концентрации приблизительно 0,1 мг/мл. Этот пул 8оигсе 30 КРС добавляли по каплям в буфер для ренатурации. Если объем является большим, эту процедуру можно проводить с использованием перистальтического насоса. Раствор перемешивали в течение ночи при 4°С. Раствор часто кажется мутным вследствие осаждения белка, который не ренатурировался. Конечные концентрации в диапазоне от 0,1 до 0,4 мг/мл в буфере для ренатурации давали эквивалентные количества ренатурированного белка (40-50%). Этот рН и ацетонитрил в исходном материале не влияли на стадию ренатурации. За ренатурацией может следовать ВЖХ для прослеживания рефолдинга.
Раствор ренатурации фильтровали с использованием перистальтического насоса Н1дй Р1он с двойным фильтром, состоящим из предварительного фильтра 0,8 мм с последующим фильтром 0,22 мм. Затем осветленный раствор концентрировали катионным обменом на НИоаб 8Р 8ербаюе НР после количественного определения посредством УФ-спектра. Размер этой ионообменной колонки зависит от количества белка. Для <500 мг использовали колонку 16/10 (1 колоночный объем = 20 мл); для 500-1000 мг колонку 26/10 (1 колоночный объем = 50 мл) и для 1-2 г колонку 50/5 (1 колоночный объем = 100 мл).
Колонку упаковывали в соответствии с инструкциями поставщика (АтегЛат Рйагташа). Эту колонку промывали 2 КО деионизованной воды и затем уравновешивали 4 КО катионообменного буфера А (50 мМ уксусная кислота (Р1ика)), доведенного до рН 4,5 №ОН (Са1. 71690 Р1ика). Этот раствор доводили до рН 4,5 уксусной кислотой и проводимость доводили до <10 мС. После нанесения раствора белка при скорости тока, рекомендуемой поставщиком для выбранной колонки, эту колонку промывали 5 КО буфера А. Белок элюировали линейным градиентом от 0 до 100% буфера В (буфер А, содержащий 2М №С1 (Са1. 71380, Р1ика) более чем 20 колоночными объемами (КО). Размер фракций определялся размером колонки. Все обнаруженные пики анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, ВЖХ и определяли количественно УФ-спектроскопией. После анализа фракции, содержащие А8900652, объединяли, количественно определяли посредством УФ-спектра и анализировали при помощи ВЖХ.
Удаление Ν-концевого метионина выполняли ферментативно с использованием метионинаминопептидазы (МАР) с последующей стадией очистки. Вкратце, пробу сначала диализовали с использованием мембранной трубки с пределом отсечения 3,5 кД в буфер для расщепления (35 мМ Трис/НС1-буфер, рН 7,5 (Са1. 20092391, Вюоке)). Буфер для диализа заменяли три раза на протяжении 24 ч. Метионинаминопептидазу (МАР) добавляли к раствору белка в соотношении 1:10000 (мм, фермент:белок). Расщепление выполняли при комнатной температуре в течение 48 ч. Затем расщепленный белок очищали катионным обменом, проводимым, как описано выше. Белок имел чистоту >98%, как было оценено электрофорезом в ДСН-ПААГ.
Систему очистки АКТА (Рйагтааа) использовали для дополнительной очистки желаемого белка. Эту систему очищали в течение 1 ч 1М №ОН, промывали стерильной водой и уравновешивали в буфере, отфильтрованном с использованием фильтра 0,22 мм (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) (Са1. 28904, Р1егсе), 99,9% дистиллированная вода). Белок обессоливали с использованием колонки 0-25 Пае 8ербагоке ХК50/30. Эту колонку промывали 1 колоночным объемом (1 КО) 1М №ОН и затем 4 колоночными
- 12 009414 объемами стерильной воды и затем уравновешивали 5 колоночными объемами 0,1% ТФУ. Для оптимальных условий обессоливания пробы 50-100 мл обессоливают на 450 мл 6-25 йие 8ерйагоке. Для объемов, больших чем 100 мл, стадию обессоливания повторяют. Эту пробу фильтровали с использованием фильтра 0,22 мм перед нанесением. Колонку элюируют 1,5 КО 0,1% ТФУ со скоростью тока 10 мл/мин и при максимальном давлении 1 МПа. Фракции 10 мл собирают в стерильные пробирки. После анализа фракции, содержащие этот белок, объединяют, определяют количественно при помощи УФ-спектра в стерильных условиях и анализируют при помощи ВЖХ, электрофореза в ДМН-ПААГ и массспектрометрии.
Оставшиеся загрязнители удаляют с использованием препаративной обращенно-фазовой хроматографии (ВРС) на ЭеИаРгер НРЬС (Ла1егк). Пробу подкисляли до 0,1% ТФУ и наносили на колонку Уубас С8 ВРС (Са1. 208ТВ101522, Уубас), уравновешенную в буфере А (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) (Са1. 28904, Р1егсе) и 99,9% дистиллированная вода). Белок элюировали с использованием линейного градиента от 0 до 100% буфера В (0,1% ТФУ (трифторуксусная кислота) (Са1. 28904, Р1егсе), 99% ацетонитрил (ϋΝ1648, Вакег), более 10 КО со скоростью тока 25 мл/мин и пределом давления 700 бар. Все обнаруженные пики анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, ВЖХ и определяли количественно УФ-спектроскопией. После анализа фракции, содержащие А8900652, объединяли, количественно определяли посредством УФ-спектра, делили на аликвоты, как это необходимо, и лиофилизировали. Белок хранили при -20 или при -80°С.
Рекомбинантный белок определяли количественно УФ-спектроскопией с использованием спектрофотометра ИУ-УТ8 (иу1кои кук!ет, ΚΟΝΤΒΟΝ). Кварцевую кювету (08 1.000, НЕТЬМА) использовали для эталона-буфера, а другая кювета содержит пробу. Измеряли отрезок длин волн 350-240 нм и поглощения при 280 нм использовали для определения количества в соответствии с коэффициентом экстинкции, полученным из композиции аминокислот с использованием Рго1Рагат, Ехраку. Используемая величина была 1,1 для раствора 1 мг/мл для окисленного белка, содержащего дисульфидные связи.
Анализы электрофореза в ДСН-ПААГ проводили с использованием 10% геля NиРА6Е (Са1. №0301, 1пуйгодеи). Эту пробу разбавляли в 2 раза в буфере для проб (Са1. ЬС2 676, 1иуйгодеи) и нагревали в течение 5 мин при 95°С. В качестве стандартов молекулярных масс использовали «лэддер» (лестницу) белков Веисйтагк. 10 мкл раствора стандартов молекулярных масс и 20 мкл пробы белка наносили в соответствующие лунки. Рабочим буфером электрофореза был МЕ8 (Са1. №0002, 1иуйгодеи). Миграцию проводили в соответствии с инструкциями поставщика при 200 В, 12 мА и 25 Вт в течение 35 мин (РомегЕаке500, 1иуйгодеи).
Гели №РА6Е окрашивали 0,1% В250 Кумасси синим в 10% уксусной кислоте, 30% метаноле в дистиллированной воде при медленном качании, пока фоновый уровень не терял окрашивание. Затем гель промывали несколько раз в воде перед погружением в осушающий раствор (1иуйгодеи), помещенный в виде сэндвича между двумя листами целофановой бумаги (1иуйгодеи), на 10 мин и затем помещали в миниатюрный пресс, позволяющий гелю храниться в виде тонкого листа. Альтернативно, этот гель окрашивали по протоколу красителя 81тр1уВ1ие 8аГе (Са1. ЬС6065, 1иуйгодеи).
Систему АШаисе НРЬС, поставляемую \Уа1ег5. использовали с аналитической колонкой С8 Ас.|иароге ВР-300 7т (0,2 см диаметр х 22 см), уравновешенной в 0,1 ТФУ. Инъецировали 10-50 мг белка, предварительно подкисленного 0,1% конечной ТФУ. Белки элюировали градиентом 25-50% ацетонитрила, более чем 20 колоночными объемами.
Идентичность рекомбинантного белка подтверждали масс-спектральными анализами и анализом Νконцевой последовательности. Для очищенного материала получали правильную Ν-концевую последовательность ОРЭЛШААУТ.
Масса 8655 Да была получена для основной разновидности, что соответствовало теоретической массе белковой цепи с 2 дисульфидными связями. Также наблюдали вторую разновидность с массой, меньшей чем 17 Да, соответствующую модификации Ν-концевого остатка глутамина в пироглутаминовую кислоту. Присутствие этой модификации не влияло на активность этого белка.
Пример 2. Анализы на основе клеток.
Материалы и способы.
Анализы для индуцированного хемокином рекрутинга перитонеальных клеток.
Самок мышей Ва1Ь/с (1аиу1ег, Бгаисе) в возрасте 8-12 недель содержали при нормальных условиях содержания животных со стандартным циклом 12 ч свет/темнота и со свободным доступом к корму и воде. Группы, состоявшие из 3-6 мышей, инъецировали внутрибрюшинно 200 мкл солевого раствора (стерильного, не содержащего ЬР8 9% №1С1 (м/о), или этого раствора, содержащего ССЬ2 или ССЬ2-Р8А в концентрации 10 мкг на одну инъекцию). Для исследований, изучающих ингибиторные действия ССЕ2-Р8А на индуцированный ССЬ2 рекрутинг перитонеальных клеток, эти молекулы вводили внутрибрюшинно за 30 мин перед внутрибрюшинной инъекцией ССЬ2. Все эти молекулы вводили при указанной концентрации и в указанном выше буфере (солевом растворе). Мышей умерщвляли при 4 ч после последней инъекции ССЬ2 или ССЕ2-Р8А.
Анализ на индуцированный тиогликолатом рекрутинг перитонеальных клеток был опубликован
- 13 009414 (Μίδΐιοίΐ В. 1980). Вкратце, тиогликолатную среду готовили суспендированием 30 г тиогликолатной среды (Вее1ои ΩίοΚίηδοη) в 1 л холодной дистиллированной воды, затем нагревали до кипения для полного растворения порошка. Затем среду делили на аликвоты в склянки на 100 мл и автоклавировали. После охлаждения среду хранили в темноте при комнатной температуре в течение по меньшей мере одного месяца. Клеточный рекрутинг индуцировали внутрибрюшинной инъекцией мышей в группах из 3 мышей 200 мкл 3% раствора тиогликолата в день 1, спустя 30 мин после введения ССЬ2*-Р8А. ССЬ2* вводили один раз в день после этого в течение 3 дней (дни 2, 3 и 4). Дексаметазон (81дша) использовали в качестве положительного контроля и вводили при 10 мг/кг внутрибрюшинно. Мышей умерщвляли в день 5.
Перитонеальные лаважи для оценки рекрутинга клеток в предыдущих анализах выполняли следующим образом. Мышей умерщвляли асфиксией повышающимися концентрациями СО2 в боксе из плексигласа. Кожу очищали 70% этанолом. Наружный слой кожи удаляли, обнажая перитонеальную мембрану. Перитонеальную полость промывали 3 раза 5 мл охлажденного на льду ЗФР (забуференного фосфатом солевого раствора) и жидкость объединяли в полистироловой пробирке Ра1соп (Вее1оп ΩίοΚίη8оп) на 15 мл на льду. Каждый лаваж сопровождался легким массажем перитонеальной полости. Жидкость лаважа центрифугировали при 425/д, супернатант выбрасывали и полученный осадок клеток ресуспендировали осторожным множественным пипетированием в 1 мл ЗФР. 10 мкл суспензии клеток окрашивали 90 мкл трипанового синего и общее количество клеток считали с использованием гемоцитометра №иЬаиег подсчетом 4 зон, по 1 мм2 каждая. Брали среднее из 4 подсчетов, умножали на фактор разведения 10 и снова умножали на 10 с получением количества клеток на мкл, в соответствии с инструкциями для применения, прилагаемыми к гемоцитометру. Наконец, общую величину умножали на 1000 (для расчета на 1 мл) для получения общего количества извлеченных клеток.
Результаты.
Рекомбинантный зрелый белок ССБ2/МСР-1 человека и мутанты, названные ССЬ2*, и соответствующие облигатные мономерные мутанты, названные ССЬ2-Р8А и ССЬ2*-Р8А (фиг. 1), зкспрессировали в Е. сой.
Литературные данные ясно показывают, что мутация Р8А в ССЬ2 блокирует образование димеров ССЬ2 без влияния на связывание с клетками, экспрессирующими рецептор, или с вирусным рецепторподобным белком, но также без обнаружения активностей известного антагониста ССЬ2 в релевантных анализах (см. (1+9-76)МСР-1 в табл. I Раауо1а ΟΌ. е! а1., 1998; А1ехаийег ЕМ. е! а1., 2002).
Облигатная мономерная форма ССЬ2 предоставляет специфические и неожиданные свойства в анализах, выполняемых в тестах на основе клеток. В анализе рекрутинга перитонеальных клетов: ССЬ2*Р8А и ССБ2-Р8А были не способны рекрутировать клетки в сравнении с природным ССЬ2 (фиг. 2). Кроме того, эти молекулы способны, зависимым от дозы образом, ингибировать индуцированный ССЬ2 (фиг. 3А) и индуцированный тиогликолатом рекрутинг макрофагов (фиг. 3В). В последнем анализе ССБ2-Р8А является, по-видимому, таким же эффективным, что и положительный контроль (дексаметазон, известное противовоспалительное соединение).
Пример 3. Свойства ССБ2-Р8А в моделях заболеваний животных.
Материалы и способы.
Модель индуцированного овальбумином воспаления легких.
Модель индуцированного овальбумином воспаления легких получают, как опубликовано (В1у1й Ό.Ι. е! а1., 1996). Группы из 6 мышей сенсибилизировали внутрибрюшинной инъекцией 10 мкг альбумина куриного яйца в 2 мг 2% гидроксида алюминия (8егуа) в общем объеме 200 мкл, который готовили смешиванием 25 мкл овальбумина (2 мг/мл), 250 мкг гидроксида алюминия в 725 мкл не содержащего ЬР8 0,9% №1С1 (солевого раствора) и осаждали 3-4 ч при 4°С. Спустя 15 дней после сенсибилизации мышей обрабатывали и провоцировали в группах из 6 мышей интраназальным введением 15 мкг овальбумина в 50 мкл солевого раствора, под анестезией ингаляцией изофлурана один раз в день со дня 15 до дня 19. ССБ2-Р8А (200 мкл, 10 мкг на одну внутрибрюшинную инъекцию) вводили за 30 мин перед каждой ингаляторной провокацией. Перитонеальные лаважи для оценки рекрутинга клеток и счета клеток выполняли, как описано выше в примере 2.
Модель ЕАЕ (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита).
Мышей С57В1/6 из Сйаг1е8 Р|уег 1!а1у (выбранный штамм имеет документированную восприимчивость к ЕАЕ; 8айгЬасйег и.С. е! а1., 1988) иммунизировали (день 0) инъекцией 8.с. в левый бок 0,2 мл эмульсии, состоящей из 200 мкг пептида МО635-55 (№обуб!ет, 81габЬигд, Егаисе) в полном адъюванте Фрейнда (СЕА, Ойсо, Оекой, И.8.А.), содержащем 0,5 мг МусоЬас!егшт !иЬегси1о818. Сразу же после этого они получали ί.ρ. инъекцию 500 нг коклюшного токсина (Ыб! Вю1оДса1 ЬаЬ., СатрЬе11, СА, И.8.А.), растворенного в 400 мкл буфера (0,5М ЫаС1, 0,017% Тритон Х-100, 0,015М Трис, рН 7,5). В день 2 животным давали вторую ί.ρ. инъекцию 500 нг коклюшного токсина. В день 7 мыши получали вторую дозу 200 мкг пептида МОС35-55 в СЕА инъекцией 8.с. в правый бок. Начиная приблизительно со дня 8-10, эта процедура приводит к постепенно прогрессирующему параличу, возникающему от хвоста и простирающемуся до передних конечностей. Со дня 7 животных индивидуально обследуют на присутствие паралича с использованием клинической оценки следующим образом:
- 14 009414 = нет признака заболевания
0,5 = частичный паралич хвоста = паралич хвоста
1.5 = паралич хвоста + частичный односторонний паралич задней конечности = паралич хвоста + слабость задних конечностей или частичный паралич задних конечностей
2.5 = паралич хвоста + частичный паралич задних конечностей (пониженный таз) = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей
3.5 = паралич хвоста + полный паралич задних конечностей + недержание = паралич хвоста + паралич задних конечностей + слабость или частичный паралич передних конечностей = агонизирующие или мертвые
Обработка соединениями или носителем начинается для каждого животного в день 7 после иммунизации и продолжается в течение 21 последовательного дня (10-12 животных на одну группу обработки). Интерферон β и ССЬ2-Р8А вводили й.с. или ί.ρ., соответственно, один раз в день, солюбилизированные в 10 мл/кг ЗФР, в дозах, указанных на фигуре.
Модель контактной аллергической реакции замедленного типа.
Мышиный тест опухания ушей для измерения контактной аллергической реакции выполняли, как описано ранее (Оаглдие 1.Ь. с1 а1., 1994). Вкратце, мышей предварительно сенсибилизировали местно нанесением 25 мкл 0,5% раствора 2,4-динитрофторбензола (ΌΝΕΒ; 81дша СйешкаВ Со.) в ацетоне/оливковом масле (4:1) на выбритый живот. Спустя пять дней 20 мкл 0,2% ΌΝΒΒ в том же самом носителе наносили на правые уши, а один носитель на левые уши. Мышей (п=6 на группу) обрабатывали один раз в день в день 5 внутрибрюшинным введением 0,05, 0,5 или 5 мг/кг (1, 10 или 100 мг на мышь соответственно) ССЬ2-Р8Л, дексаметазона (1 мг/кг) или только ЗФР в контрольной группе. Эту обработку производили за 30 мин перед введением ΌΝΒΒ. Толщину ушей измеряли измерителем с циферблатом толщины (МйиФуо Согр.). Опухание ушей оценивали вычитанием величины перед провокацией из величины после провокации и дополнительным вычитанием любого опухания, детектируемого в провоцированном носителем контралатеральном ухе.
Результаты.
Потенциальные терапевтические активности ССЬ2-Р8Л в качестве антагониста хемокинов испытывали в моделях воспалительных и аутоиммунных заболеваний животных.
ССЬ2*-Р8Л испытывали в модели заболевания, индуцированного овальбумином воспаления легких. В этой классической модели для аллергического воспаления легких мышей сенсибилизировали овальбумином с использованием гидроксида алюминия в качестве адъюванта во время фазы сенсибилизации для бустинга иммунной реакции и затем провоцировали интраназальным введением овальбумина на протяжении периода 5 последовательных дней, причем ССЬ2-Р8Л вводили внутрибрюшинно на протяжении этой фазы. Также и в этом случае ССЬ2-Р8Л был способен ингибировать рекрутинг клеток (фиг. 4).
Во второй модели ССЬ2-Р8Л испытывали в модели ЕАЕ (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита), хорошо известной модели для рассеянного склероза, которую использовали для валидизации антагонистов хемокинов (в том числе ССЬ2) для лечения этого аутоиммунного, воспалительного демиелинизирующего заболевания центральной нервной системы человека (Майаб Ό.Τ апб ВапйойоГГ КМ., 2003; 1/|к5оп Ь. е1 а1., 2002). ССЬ2-Р8А испытывали в животных, обнаруживающих либо легкий, либо тяжелый уровень этого заболевания, оцениваемый клинической оценкой, после обработки ЕАЕиндуцирующими соединениями. Каждую из двух групп животных делили на пять подгрупп: три из них обрабатывали различными количествами ССЬ2-Р8А, а две другие использовали в качестве либо отрицательного контроля (обрабатываемого только носителем), либо положительного контроля (обрабатывамого интерфероном-β, обычным терапевтическим продуктом для лечения рассеянного склероза). Развитие состояния животных сравнивали на основе клинической оценки, измеряемой во время периода обработки (21 день). В обеих моделях заболеваний введение ССЬ2-Р8А (в дозе, снижающейся до 0,15 мг/кг) улучшает состояние животных статистически значимым образом. Наблюдаемое уменьшение клинической оценки с использованием ССЬ2-Р8А является по меньшей мере сравнимым с уменьшением, наблюдаемым при использовании интерферона-β в качестве обработки (фиг. 5).
Модель другого заболевания, модель контактной аллергической реакции, использовали для оценки потенциальной терапевтической эффективности ССЬ2-Р8А на воспалении кожи, опосредованном Тклетками. Контактная аллергическая реакция (СН8) является зависимой от клеток Лангерганса (ЬС), опосредуемой Т-клетками кожной иммунной реакцией, отражающей кульминацию активностей ЬС ίη У1уо (поглощения надкожных антигенов, миграции в лимфатические узлы и презентации антигенов необученным Т-клеткам). Эта модель хорошо установлена для характеристики соединения в отношении дерматологических показаний, таких как псориаз и аллергический контактный дерматит (Хи Н. е1 а1., 1996). Она включает в себя фазу сенсибилизации и последующую стимуляцию (провокацию) антигеном, приводящую к воспалению кожи с образованием отека и клеточных инфильтратов в коже. Этот отек мо
- 15 009414 жет быть измерен штангенциркулем (инструментом для определения толщины) в месте введения антигена (ухе мышей). Было продемонстрировано участие хемокинов и, в частности, ССЬ2, в развитии заболевания с избыточной реакцией (Мйкш 6. с1 а1., 2003; ΜίζιιιηοΙο N. с1 а1., 2001). Внутрибрюшинное введение ССЬ2-Р8А за 30 мин перед стимуляцией антигеном (ΌΝΕΒ в данном случае) приводит к уменьшению опухания в сравнении с уменьшением, наблюдаемым с использованием известного противовоспалительного соединения (дексаметазона), спустя один день после этой обработки. Контрольных мышей получали стимуляцией их антигеном, но с предыдущей сенсибилизацией или без предыдущей сенсибилизации, так чтобы зависимое от Т-клеток воспаление образовывалось или не образовывалось (фиг. 6).
Таким образом, мономерный вариант гомодимеробразующего СС-хемокина, где указанный вариант происходит по меньшей мере из одной аминокислотной замены, которая изменяет картину водородных связей в границе димеризации, является ингибитором опосредованного хемокинами рекрутинга клеток в анализах рекрутинга клеток ίη νίνο, а также в моделях-животных заболеваний человека, что предполагает, что именно эта новая стратегия для генерирования вариантов хемокинов может быть использована для приготовления фармацевтических композиций и в терапевтических способах.
Пример 4. Альтернативные формы ССЬ2-Р8А.
Альтернативные формы вариантов хемокинов, описанных выше, могут быть получены введением мутаций, известных в данной области, в качестве улучшения конкретных признаков.
Одна или более отдельных аминокислотных замен и/или одно или более добавлений отдельных аминокислот могут вводиться в другом положении ССЬ2-Р8А (фиг. 7А). ССЬ2-Р8А может экспрессироваться в виде зрелого белка, лишенного природного Ν-концевого остатка глутамина, или с добавлением дополнительного небольшого остатка (такого как аланин или глицин) на Ν-конце перед глутамином, так что этот остаток глутамина не остается открытым и не превращается самопроизвольно в формупироглутамата (6οη§ ί. апб С1агк-Ьел18 I., 1995). ССЬ2-Р8А может быть также мутирован таким образом, что пятый цистеин является доступным для прохождения специфических реакций ПЭГилирования. Эти сайты ПЭГилирования могут быть интегрированы на уровне либо внутренней аминокислоты (например, в положении аспарагина 14 или 17 и даже в положении 8, так что единственная модификация может сделать возможными как мономеризацию, так и ПЭГилирование), либо на С-конце (прямым добавлением цистеина после природного С-концевого треонина).
Дополнительный вариант ССЬ2-Р8А может быть получен слиянием этой последовательности с константной областью домена иммуноглобулина, белкового домена, который, как известно, улучшает стабильность и эффективность рекомбинантных белков в кровотоке. Полученный слитый белок может быть экспрессирован непосредственно клетками млекопитающих (такими как клетки СНО или НЕК293) с использованием соответствующих экспрессирующих векторов, так что этот слитый белок секретируется в культуральную среду. В предпочтительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая зрелый ССЬ2-Р8А, может быть клонирована в экспрессирующий вектор, слитый с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность ССЬ2 человека, на его 5'-конце, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область (сегмент 246-467) тяжелой цепи иммуноглобулина лямбда человека 1дС1 (Νί.'ΒΙ Асе. Νο. САА75302), на его 3'-конце. Полученный вектор может быть использован для трансформации клеточной линии СНО или НЕК293 и могут быть отобраны клоны, стабильно экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный слитый белок, имеющий ССЬ2-Р8А на Ν-конце и последовательность 1дС1 на С-кокце (фиг. 7В). Затем этот клон может быть использован для увеличения масштаба получения и для очистки этого рекомбинантного слитого белка из культуральной среды. Альтернативно, положение нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область (сегмент 243-474) тяжелой цепи иммуноглобулина λ 1дС1 человека и ССЬ2-Р8А, может быть обращено, и полученный белок может экспрессироваться и секретироваться с использованием все еще сигнальной последовательности ССЬ2 человека или любой другой сигнальной последовательности.
- 16 009414
Таблица I
Амино :гсислота Синонимические ррушш Волее предпочтительные синонимические группы
Зег С1у, А1а, Зег, ТНг ТНг, Зег
Агд Авп, Ьуз, ΘΙη, Агд, Ηίβ Агд, Ьуз, Ηίβ
Ьеи РНе, Не, Уа1, Ьеи, Ме! Не, Уа1, Ьеи, Ме!
Рго Рго, А1а, Зег, ТНг Рго
ТНг С1у, А1а, Зег, ТНг ТНг, Зег
А1а 61у, ТНг, Зег С1у, А1а
Уа) Ме1, РЬе, Не, Ьеи, Уа1 Ме!, Не, Уа1, Ьеи
<31у А1а, ТНг, Зег, С1у С1у, А1а
Не РНе, Не, Уа1, Ьеи, Ме! Не, Уа1, Ьеи, Ме!
РНе Тгр, РНе,Туг Туг, РНе
Туг Тгр, РНе,Туг РНе, Туг
Сув Зег, ТНг, Суз Суз
Ηίβ Азп, Ьуз, С1п, Агд, Ηίβ Агд, Ьуз, Ηίβ
ΘΙη О1и, Азп, Азр, ΘΙη Азп, ΘΙη
Авп С1и, Азп, Азр, ΘΙη Азп, ΘΙη
Ьув Азп, Ьуз, С1п, Агд, Ηίβ Агд, Ьув, Ηίβ
Авр О1и, Азп, Азр, ΘΙη Азр, ΘΙυ
61и С1и, Азп, Азр, ΘΙη Азр, ΘΙυ
Ме! РНе, Не, Уа1, Ьеи, Ме! Не, Уа1, Ьеи, Ме!
Тгр Тгр, РНе,Туг Тгр
Таблица II
Аминокислота Синонимическая труппа
Зег β-Зег, ТНг, О-ТЪг, а11о-ТНг, Ме!, Ы-Ме!, Ме!(О), β-Μθί(Ο), Ь-Суз, ЫСуз
Агд β-Агд, Ьуз, β-Ьуз, гомо-Агд, β-гомо-Агд, Ме!, Не, β-Μβί, ОИе, От, β-От
Ьеи β-Ьеи, Уа1,1>Уа1, АбаА, АбаО, Ьеи, β-Ьеи, Ме!, Ы-Ме!
Рго СтРго, Ь-1-тиазолидин-4-карбоновая кислота, β- или Ь-1оксазолидин-4-карбоновая кислота
ТНг β-ТЬг, Зег, О-Зег, аВо-ТНг, Μβί,β-Μθί, Ме!(О), β-МеЦО), Уа! О-Уа1
А1а В-А1а, С1у, ΑΪΗ, В-А1а, Аср, Ь-Суз, β-Суз
Уа1 Е)-Уа1, Ьеи, β-Ьеи, Не, Ο-Пе, Ме!, В-Ме!, Ас!аА, Ас1аС
ΘΙν А!а, В-А1а, Рго, В-Рго, Αίϋ, .Ье!а.-А1а, Аср
Не Β-Не, Уа1, ВА/а1, АбаА, АбаС, Ьеи, β-Ьеи, Ме!, В-Ме!
РНе β-РЬе, Туг, Ο-ТНг, Ь-Вора, Ηίβ, β-Ηίβ, Тгр, Ο-Тгр, Транс-3,4, или 5фенилпролин, А<1аА, АДаС, аз-3,4, или 5-фенилпролин, Вра, В-Вра
Туг В-Туг, РЬе, О-РЬе, Ь-Вора, Ηίβ, 0-Н|'з
Суз 0-Суз, З-Ме-Суз, Ме!, В-Ме!, ТНг, β-ТНг
ΘΙη Β-ΘΙη, Азп, β-Азп, С1и, В-61и Азр, β-Азр
Авп β-Азп, Азр, Β-Азр, С1и, ОСЮ, Θίη, β-ΘΙη
Ьуз О-1_уэ, Агд, О-Агд, гомо-Агд, Ο-гомо-Агд, Ме1, О-Ме1, Иет ϋ-Пе, От, ϋ-От
Авр β-Азр, Ο-Азп, Азп, О1и, β-ΘΙυ, ΘΙη, Β-ΘΙη
ΘΙυ Β-ΘΙιι, β-Азр, Азр, Азп, Β-Азп, Θίη, β-ΘΙη
Ме! β-Ме!, 8-Ме-Суз, Не, Β-Пе, Ьеи, β-Ьеи, Уа1, О-Уа1
- 17 009414
Ссылки
Акха^ег ТМ. е1 а1., Се11, 111; 343-356, 2002.
Βα^^ίοΐίηί М. еί а1., Аппи Вет Iттиηο1, 15: 675-705, 1997.
Β᧧ίο1ίηί М., 1 ЕЛет Мей, 250: 91-104, 2001.
Β1γίΗ Ό.Ι. е1 а1., Ат 1 Веэри Се11 Мс1 Βίο1., 14: 425-438, 1996.
ΒΐΌ\νη А. еί а1., 1 Рерί 8с1 2 :40-46, 1996.
С1е1аг1й ТЬ. еί а1., Сигг Ορίη Β^οίесЬηο1,12: 212-219, 2001.
Сс1етап К.А. еί а1., Эгид Икс Τοαγ, 6:1116-1126, 2001.
ОсидЬейу И.А., Сигг Ορίη СНет Βίο, 4: 645-652, 2000.
Еетаийех ЕЛ. апй Εο1ί§ Е., Аппи Вее РНагта^ Τοχκο1, 42:469-499, 2002.
Сатдие ТЬ. еί а1., Ссп1зс1: ЭегтайЙБ, 30: 231-237, 1994.
Сοйе88ай Ν. анй КипЪЦ 8.Ь., Сигг Ορίη Iттиηο1, 13: 670-675, 2001.
Οο^όίο\ν51<ί А. еί а1., Сигг Ορίη Эгид Όί^ον Оетек 4: 428-434, 2001.
Οοη§ 1. анй С1агк-ЬеЩ8 I., 1 Ехр Мей 181: 631-640, 1995.
Сс81шд 1. е1 а1., 1 С1ш Ιηνοβί, 103: 773-778, 1999.
Сгееиета1й Κ.Β. еί а1., Айу Эгид ОеНе Вео 55: 217-50, 2003.
Си Ь. еί а1., СНет Iттипο1, 72: 7-29, 1999.
Си Ь. е1 а1., №акге, 404: 407-411, 2000.
Нагле ТМ. авй СНеее Κ.Β., №11 Вег Эгид Όί^ον, 2: 214-21, 2003.
Напйе1 Τ. еί а1., Β^οсНет^8ί^у, 35: 6569-6584, 1996.
НеттепсН 8. еί а1., Β^οсНет^8ί^у, 38: 13013-13025, 1999.
НгиЬу ν.ί. 1пй Баке Р.М., Сигг Мей СНет, 7:945-970, 2000.
ΙζίΕδοη Ь. еί а1., С1т Iттипο1, 103: 125-31 2002.
К1т К.8. е1 а1.,, ΡЕΒ8 Ьей, 395:277-282, 1996.
Ь1 А.Р., Эгид Экс ^йау, 6: 357-366, 2001.
^οеί8сНе^ Р. анй С1агк-Ее\ск I., 1 Ьеи^с Βίο1, 69: 881-884, 2001.
Ьи В. е1 а1., 1 Ехр Мей, 187: 601-608, 1998.
ΕιιΝ<ο\ν№ί 1. еί а1., №П 81гис1 Βίο1, 4: 64-69, 1997.
Мю В. анй РгееЖкН С.Э., Ехр Ορίη ТНег Раίепί8, 11: 1395-1410, 2001.
МкНе11 Β., IттипορНа^т, 2: 233-245. 1980.
МаНай ИЛ. анй Κап8οНοΓΓ К.М., 8етт Iттипο1, 15: 23-32, 2003.
М1кш С. еί а1., Iттипο1 Ьей, 86: 191-7, 2003.
М^ζитοίο Ν. еί а1., IттипοЬ^ο1οду, 204:477-93, 2001.
МигрНу Ь.В. еί а1., Рго1ет Бид, 13:149-152, 2000.
ΝίΕδοη 1. еί а1., Рго1ет Ехрг РипГ, 11: 1-16, 1997.
Рааνο1а С. е1 а1., 1 Βίο1 СНет, 273: 33157-33165, 1998.
Р111а1 О. 1нй Рам^дшИ В., Сигг Ορίη СНет Βίο1, 5: 447-451, 2001.
ΒΐΌΐΜΓοοΙ А. еί а1., Ргос №111 Асай 8а И8А, 100: 1885-1890, 2003.
Κοдον 8.Ι. 1пй Nек^а8ον А.№., Рго1ет Е^, 14: 459-463, 2001.
8аНгЬасНег и.С. еί а1., Еиг 1 ^тиго^ 28: 1332-8, 1998.
8с11\\'а17 М.К. 1пй \Уе1к Τ.Ν., Сигг Ορίη СНет Βίο1, 3: 407-417, 1999.
8ееί В.Т. е1 а1., Ргос №аЙ Асай 8а И8А, 98: 9008-9013, 2001.
8ωιΙζ. 8.А. е1 а1., ΡЕΒ8 Ьей, 430: 158-164, 1998.
Ж11ат М. е1 а1., СНет Βίο1, 8: 673-679, 2001.
Υοδίιίιηιιη Τ. еί а1., ΡЕΒ8 Ьей, 244: 487-493, 1989.
Хи Н. е1 а1., 1 Ехр Мей, 183: 1001-12, 1996.
Ζ1ιηη§ Υ. е1 а1., МеШсйз, 10: 93-103, 1996.

Claims (11)

1. Применение полипептида, содержащего 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2, для изготовления лекарственного средства для лечения аутоиммунных, воспалительных или инфекционных заболеваний.
2. Применение по п.1, где этот полипептид дополнительно содержит изолейцин в положении 64 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и таким образом содержит 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4.
3. Применение по п.1 или 2, дополнительно отличающееся тем, что указанный полипептид не содержит мутацию в положении 9, 10 или 13 в соответствующей последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4.
4. Применение по п.1 или 2, дополнительно отличающееся тем, что указанный полипептид содержит в соответствующей последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ:2 и 8ЕО ΙΌ ΝΟ:4:
a) цистеин в положении 8, 14, 17 или 77 или
b) аланин или глицин в положении 1.
5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный полипептид содержит константную область тя
- 18 009414 желой цепи иммуноглобулина человека.
6. Применение по п.1 или 2, где указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из артрита, ревматоидного артрита (КА), псориатического артрита, остеоартрита, системной красной волчанки (ЗЬЕ), системного склероза, склеродермии, полимиозита, гломерулонефрита, фиброза, аллергических заболеваний или заболеваний, связанных с повышенной чувствительностью, дерматита, астмы, хронической обструктивной болезни легких (С0РИ), воспалительного заболевания пищеварительного тракта (ΙΒΌ), болезней Крона, язвенного колита, рассеянного склероза, рака, септического шока, вирусных или ВИЧ-инфекций, трансплантации, воспаления дыхательных путей, реакции трансплантат против хозяина (ОУНИ) и атеросклероза.
7. Применение по п.6, где заболеванием является рассеянный склероз.
8. Слитый полипептид, образованный аминокислотной последовательностью ЗЕО ΙΌ N0:2 и константной областью тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем слитый полипептид имеет последовательность, идентифицированную как ЗЕО ΙΌ N0:5.
9. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид ЗЕО ΙΌ N0:5.
10. Способ получения слитого полипептида по п.8, включающий:
a) клонирование последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей зрелый ССЬ2-Р8А, в экспрессирующий вектор, слитый с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность ССЬ2 человека, на его 5'-конце и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область (сегмент 243-474) тяжелой цепи иммуноглобулина лямбда человека Ι§01, на его 3'-конце;
b) трансформацию клеточной линии СНО или НЕК293 полученным вектором;
c) отбор клонов, стабильно экспрессирующих и секретирующих рекомбинантный слитый белок, имеющий ССЬ2-Р8А на №конце и последовательность Ι§01 на С-конце;
б) очистку этого слитого белка из культуральной среды.
11. Способы скрининга на облигатные мономерные варианты-антагонисты хемокинов, предусматривающие:
a) получение моносайтовых мутаций в ССЬ2, которые блокируют его способность димеризоваться;
b) идентификацию указанных вариантов, которые связываются с рецептором и обнаруживают агонистические свойства ίη νίίτο;
c) идентификацию указанных вариантов из группы, идентифицированной в (Ь) выше, которые дополнительно характеризуются как ингибирующие рекрутинг перитонеальных клеток.
- 19 009414
Список последовательностей <110> Αρρίίθά КезеагсИ ЗузЬешз АЕ8 Ьо1<Ппд <120> ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВАРИАНТОВ ХЕМОКИНОВ <130> НО933 <163> 5 <170> РаЬепЫп νβτβίοη 3.0 <210> 1 <211> 76 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <220>
<223> ССЬ2 человека <400> 1
С1п 1 Рго Азр А1а 11е Азп 5 А1а Рго Ча1 ТНг 10 Суз Суз Туг Азп РЬе 15 ТЬг Азп Агд Ьуз 11е Зег Ча1 С1п Агд Ьеи А1а Зег Туг Агд Агд Не ТЬг 20 25 30 Зег Зег Ьуз Суз Рго ьуз С1и А1а Ча! 11е РЬе Ьуз ТЬг 11е Ча1 А1а 35 40 45 Ьуз С1и Не Суз А1а Азр Рго Ьуз С1п Ьуз Тгр Ча1 С1п Азр Зег МеЬ 50 55 60 Аар Н15 Ьеи Азр Ьуз С1п ТЬг С1п ТЬг Рго Ьуз ТНг 65 70 75 <210 2 <213 > 76 <212> Белок <21· искусственная последовательность
EA200600782A 2003-10-16 2004-10-18 Терапевтические применения вариантов хемокинов EA009414B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03078308 2003-10-16
PCT/EP2004/052572 WO2005037305A1 (en) 2003-10-16 2004-10-18 Therapeutic uses of chemokine variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600782A1 EA200600782A1 (ru) 2006-08-25
EA009414B1 true EA009414B1 (ru) 2007-12-28

Family

ID=34442986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600782A EA009414B1 (ru) 2003-10-16 2004-10-18 Терапевтические применения вариантов хемокинов

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7740833B2 (ru)
EP (1) EP1673103A1 (ru)
JP (1) JP2007510403A (ru)
KR (1) KR20070008510A (ru)
CN (1) CN1867352A (ru)
AR (1) AR046594A1 (ru)
AU (1) AU2004281552B2 (ru)
BR (1) BRPI0415290A (ru)
CA (1) CA2536082A1 (ru)
EA (1) EA009414B1 (ru)
IL (1) IL175020A0 (ru)
MX (1) MXPA06003695A (ru)
NO (1) NO20062109L (ru)
UA (1) UA91820C2 (ru)
WO (1) WO2005037305A1 (ru)
ZA (1) ZA200601900B (ru)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008002101A (es) 2005-08-12 2008-04-19 Schering Corp Fusiones de la proteina-1 quimiotactica de monocito.
EP2007815A2 (en) * 2006-03-31 2008-12-31 Biotherapix Molecular Medicines S.L.U. Mono- and bifunctional molecules with ability to bind to g protein-coupled receptors
WO2007148317A1 (en) * 2006-06-21 2007-12-27 Compugen Ltd. Mcp-1 splice variants and methods of using same
AU2007278054B2 (en) * 2006-07-24 2012-11-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising CCL2 and use of same for the treatment of inflammation
US20080076120A1 (en) * 2006-09-14 2008-03-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification, evaluation and treatment of patients having CC-Chemokine receptor 2 (CCR-2) mediated disorders
US20120046218A1 (en) * 2009-01-30 2012-02-23 Protaffin Biotechnologie Ag Glycosaminoglycan-antagonising mcp-i mutants and methods of using same
US8524217B2 (en) 2010-05-11 2013-09-03 Merck Sharp & Dohme Corp. MCP1-Ig fusion variants
US8796422B2 (en) * 2011-06-01 2014-08-05 Morehouse School Of Medicine Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
US8541564B2 (en) * 2011-06-01 2013-09-24 Morehouse School Of Medicine Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
US9249204B2 (en) 2011-06-01 2016-02-02 Jyant Technologies, Inc. Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
EP2718311B1 (en) * 2011-06-13 2018-01-17 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating multiple sclerosis
US9726666B2 (en) 2011-06-13 2017-08-08 Tla Targeted Immunotherapies Ab Diagnosing and treating inflammatory diseases
EP3613435A1 (en) 2015-01-28 2020-02-26 Universite De Bordeaux Chemokine receptor cxcr4 inhibitors for treating and/or preventing chronic obstructive pulmonary disease
EP3253797A4 (en) * 2015-02-03 2018-10-03 Jyant Technologies, Inc. Chemokine-immunoglobulin fusion polypeptides, compositions, method of making and use thereof
US20180193003A1 (en) 2016-12-07 2018-07-12 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3554541B1 (en) 2016-12-14 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
KR102066149B1 (ko) * 2018-08-17 2020-01-14 고려대학교 산학협력단 Ccl2를 유효성분으로 포함하는 임신촉진용 조성물
US20220249814A1 (en) 2018-11-19 2022-08-11 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
EP3870261B1 (en) 2019-12-13 2024-01-31 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5739103A (en) * 1993-11-12 1998-04-14 Dana-Farber Cancer Institute Chemokine N-terminal deletion mutations
WO2003083059A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Mcp-1 mutant proteins, antibodies, compositions, methods and uses
WO2003084993A1 (en) * 2002-04-10 2003-10-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Novel antagonists of mcp proteins

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU687872B2 (en) * 1993-09-14 1998-03-05 Imperial College Of Science, Technology And Medicine Eotaxin: eosinophil chemotactic cytokine
US5459128A (en) * 1993-11-12 1995-10-17 Dana-Farber Cancer Institute Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) derivatives
JP3837748B2 (ja) * 1997-01-17 2006-10-25 東亞合成株式会社 Ｖｅｇｆ結合性ポリペプチド
US6100387A (en) * 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
HUP0202442A3 (en) * 1999-08-09 2005-01-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Multiple cytokine-antibody complexes
US7332474B2 (en) * 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
CA2463003A1 (en) * 2001-10-19 2003-04-24 Zymogenetics, Inc. Dimerized growth factor and materials and methods for producing it
EP2007815A2 (en) * 2006-03-31 2008-12-31 Biotherapix Molecular Medicines S.L.U. Mono- and bifunctional molecules with ability to bind to g protein-coupled receptors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5739103A (en) * 1993-11-12 1998-04-14 Dana-Farber Cancer Institute Chemokine N-terminal deletion mutations
WO2003083059A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-09 Centocor, Inc. Mcp-1 mutant proteins, antibodies, compositions, methods and uses
WO2003084993A1 (en) * 2002-04-10 2003-10-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Novel antagonists of mcp proteins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEMMERICH S. ET AL.: "Identification of residues in the monocyte chemotactic protein-1 that contact the MCP-1 receptor, CCR2." BIOCHEMISTRY. 5 OCT 1999, vol. 38, no. 40, 5 October 1999 (1999-10-05), pages 13013-13025, XP002319264 ISSN: 0006-2960 *
KIM KEY-SUN ET AL.: "Structural characterization of a monomeric chemokine: Monocyte chemoattractant protein-3" FEBS LETTERS, vol. 395, no. 2-3, 1996, pages 277-282, XP002283332 ISSN: 0014-5793 page 281, column 2, line 9 - line 11 *
PAAVOLA CHAD D. ET AL.: "Monomeric monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) binds and activates the MCP-1 receptor CCR2B" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 273, no. 50, 11 December 1998 (1998-12-11), pages 33157-33165, XP002283331 ISSN: 0021-9258 cited in the application the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007510403A (ja) 2007-04-26
NO20062109L (no) 2006-05-11
ZA200601900B (en) 2007-07-25
US7740833B2 (en) 2010-06-22
AU2004281552A1 (en) 2005-04-28
AR046594A1 (es) 2005-12-14
EA200600782A1 (ru) 2006-08-25
US20070280958A1 (en) 2007-12-06
CN1867352A (zh) 2006-11-22
BRPI0415290A (pt) 2006-12-19
WO2005037305A1 (en) 2005-04-28
UA91820C2 (ru) 2010-09-10
IL175020A0 (en) 2006-08-20
CA2536082A1 (en) 2005-04-28
KR20070008510A (ko) 2007-01-17
AU2004281552B2 (en) 2009-10-22
MXPA06003695A (es) 2006-06-20
EP1673103A1 (en) 2006-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA009414B1 (ru) Терапевтические применения вариантов хемокинов
US5334584A (en) Recombinant, non-glycosylated bpi protein and uses thereof
NO332309B1 (no) Antagonister av CXCRX3-bindene CXC-kjemokiner, samt fremgangsmate for fremstilling derav, DNA molekyler kodende for nevnte antagonister, ekspresjonsvektor, vertcelle, farmasoytisk preparat og anvendelse av nevnte antagonister.
US20070004906A1 (en) Novel antagonists of mcp proteins
JP3908165B2 (ja) 多発性硬化症の治療におけるケモカイン変異体
AU2002358144B2 (en) Chemokine mutants acting as chemokine antagonists
IL176327A (en) Compositions comprising cc-chemokine binding tick saliva proteins and pharmaceutical compositions comprising them
EP1673388B1 (en) Cxcl8 antagonists
CA2371514C (en) Adsorption and removal of endotoxin from physiological fluids using cationic helix peptides
WO2008015199A1 (en) Chemokine antagonists
JPH0770194A (ja) ヒトインターロイキン−２蛋白質

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU