ES2287353T3 - Procedimiento para la determinacion de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muerdago. - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo para la lectina de muérdago o para las cadenas individuales de la lectina de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor situado en la membrana, en donde el receptor se caracteriza por un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), situado en el extremo, el cual está unido mediante una unión glicosídica a2-6 con una galactosa (Gal).

Description

Procedimiento para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago o a una cadena individual de lectina de muérdago, en el cual la expresión de un receptor específico situado en la membrana, para la lectina de muérdago, es característica de una correspondiente capacidad de respuesta.

Diferentes documentos se citan en la presente descripción. El contenido dado a conocer de los citados documentos (incluidas todas las descripciones, datos, etc., de los fabricantes), forma parte como referencia de la presente descripción.

La lectina de muérdago es una proteína inactivadora de los ribosomas del tipo II, emparentada con la ricina (RIP), la cual está constituida por dos cadenas de proteína (Barbieri et al., 1993). La cadena A, la cual posee una actividad enzimática ARNr-N-glicosidasa, y la cadena B la cual presenta una actividad de unión con los hidratos de carbono. La rViscumina recombinante constituida en E. coli es ya conocida por el experto (patente EP 0 751 221 B1). En particular, la rViscumina obtenida en la E. coli se desarrolla clínicamente como monosubstancia. La rViscumina no corresponde exactamente en su estructura primaria a ninguna de las ML-I, ML-II ó ML-III que se encuentran en la planta del muérdago. Se desprende de ello que junto a la secuencia descrita de rViscumina existen todavía otras obtenidas mediante mutaciones puntuales en las cuales el gen primitivo da variantes modificadas de lectina de muérdago, las cuales pueden diferenciarse fácilmente por su estructura primaria. La rViscumina podría ser considerada como una variante de la lectina de muérdago primitiva, y comprenderse como una mezcla de las secuencias de ML-I, ML-II ó ML-III.

Las actividades de ambas cadenas de la lectina de muérdago son necesarias para la actividad citotóxica/ citostática de la proteína. A este respecto, le corresponde al primer paso, a saber la unión de la molécula a la superficie de la célula, una importancia decisiva.

Como a la ricina, se atribuye también a la lectina de muérdago (y a la rViscumina recombinante obtenida en el E. Coli; Eck et al., 1999a, Eck et al., 1999b) una especificidad a la galactosa/lactosa (Olsnes et al., 1982; Lee et al., 1992; Gilleron et al., 1998). El tipo de enlace glicosídico de la galactosa situada en el extremo y el subsiguiente azúcar fue descrita hasta ahora como de poca importancia para la especificidad de la lectina (Lee et al., 1994; Gupta et al.,
1996).

Se han descrito diferentes lectinas de muérdago (ML-I, ML-II y ML-III) en la literatura, las cuales se diferencian por su especificidad a los hidratos de carbono (Franz, 1986). A este respecto se ha discutido que la especificidad de la galactosa/lactosa (ML-I) en una forma mezcla de galactosa/lactosa y N-acetil-galactosamina (ML-II), cambia a una lectina de muérdago, la cual se une más fuertemente a la N-acetil-galactosamina (ML-III). La rViscumina muestra una actividad de unión a la galactosa/lactosa detectable por distintos procedimientos análogos al análisis ELISA (Eck et al., 1999b). Hasta ahora, se han descrito sólo muy rudimentariamente otras actividades de los hidratos de carbono para las lectinas de muérdago, y en parte también lo contrario. Así, observaron p. ej., Wu et al. (1995a y 1995b), que la capacidad de la ML-I ó bien el ácido \alpha1-glicoproteína humana ó fetuína para la unión, se reduce significativamente, cuando se emplean grupos pendientes desializados. Por el contrario, estos autores encontraron un aumento de la unión y una completa precipitación cuando se empleó en el ensayo la siaologlicoproteína a partir de ratas en forma desializada. Las conclusiones deducidas por Wu et al., no han sido sin embargo interpretadas a causa de los resultados contradictorios de las proteínas empleadas llevando ácidos siálicos o respectivamente proteínas desializadas. También se comprueba que la glicosilación de las proteínas no es homogénea. Un proceso de desialización tiene lugar químicamente y varía según las instrucciones del fabricante. Así, en una muestra desializada puede haber todavía un resto de proteínas que llevan ácido siálico situado en el extremo, el cual falsea los resultados comunicados. Sin embargo, fue discutida una especificidad de la ML-I para el ácido siálico puesto que los autores han conseguido limitar el efecto recíproco proteína-lectina de muérdago cuando se empleó la mezcla de oligosacáridos Neu5Ac\alpha2-3/Neu5Ac\alpha2-6Gal-\beta1-4Glc como competidor. En el resumen tabular de los resultados de la competición de un experimento de precipitación (técnica de microprecipitina) sorprende sin embargo que en la misma ejecución del ensayo puede ser inhibida una precipitación de ML-I por diversas glicoproteínas (glicoproteina de ácido \alpha-1 humana; fetuína, Asialo-RSL) tanto mediante lactosa como también mediante la mezcla Neu5Ac\alpha2-3/Neu5Ac\alpha2-6Gal-\beta1-4Glc así como mediante Gal\beta1-4GlcNAc en aproximadamente las mismas concentraciones. Una especificidad de la ML-I para el ácido siálico no puede deducirse claramente de estos datos, no en último lugar, porque los resultados con Asialo-RSL y con fetuína con ácido siálico situado en el extremo, en cuanto a la tendencia, son absolutamente iguales.

Aproximadamente al mismo tiempo, pudo mostrarse por Debray et al., (1994), que la afinidad de la ML-I inmovilizada en sefarosa 4B frente a, o bien O-3 ó bien O-6 la lactosa sializada o respectivamente los Sialo-N-glicosilpéptidos en comparación con los oligosacáridos tipo N-acetillactosamina y los glicopéptidos, aumentaba ligeramente. A este respecto, Debray et al., (1994) emplearon oligosacáridos y glicopéptidos, los cuales obtuvieron parcialmente a partir de fuentes humanas (p. ej., orina, transferrina de suero humano, glicoproteína de ácido \alpha-1 humana). Debray et al., efectuaron investigaciones mediante una columna en la cual inmovilizaron la lectina de muérdago-I (sefarosa ML-I). En la clasificación de los sacáridos ensayados se distinguen tres fracciones. La fracción 1 (FNR) no mostraba ninguna interacción con la lectina de muérdago y eluía en PBS en el volumen de elución de la columna. Una segunda fracción (FR) eluía temporalmente con algo de retraso pero siempre con empleo de PBS. Los sacáridos de estas dos fracciones se diferencian en correspondencia sólo muy poco en su capacidad de interaccionar con la lectina inmovilizada sobre la columna. La fracción que propiamente se unió (FE) pudo ser eluída solamente con galactosa 150 mM en tampón PBS. Los resultados no fueron concluyentes. Así, los autores discutieron el retraso de la elución de FNR a FR, cuando en los radicales de galactosa situados en el extremo se unieron a un ácido siálico \alpha2-6 (comparar el sacárido 16 (FR) y 17 (FNR)). Sin embargo, un doble marcado con ácido siálico, como puede verse en el sacárido 15(FR), no conduce a que la substancia se una con más fuerza a la ML-I en la columna. Sin embargo es difícil para el experto, discutir explícitamente sobre los retrasos de FNR a FR. Así es muy probable que el ligero retraso (FR) por acciones recíprocas inespecíficas (p. ej., acciones recíprocas hidrófobas) sea debida a la proteína unida a la columna, y no tenga que ver nada con la especificidad de la lectina de muérdago. Solamente dos de las estructuras ensayadas eluyeron después del lavado de la columna con tampón PBS + 150 mM de NaCl + 150 mM de galactosa (FE). Estas dos estructuras fueron aisladas de la tiroglobulina bovina o respectivamente del ovomucoide de tórtolas. Contrariamente a todas las otras estructuras, las empleadas por los autores contenían de preferencia la estructura Gal(\beta1-4)GlcNAc, estando estas estructuras provistas de dos radicales galactosa situados en el extremo, los cuales están unidos o bien \alpha1-4 ó bien \alpha1-3 con la segunda galactosa.

Lee et al., (1994) describen la importancia del segundo radical de azúcar, en el reconocimiento de la ML-I. Subdividieron el reconocimiento de las estructuras mediante ML-I en cuatro grupos y pudieron mostrar que las estructuras GlcNAc perjudicaban fuertemente en la segunda posición el reconocimiento del azúcar. La afinidad más fuerte de la ML-I la encontraron en un sacárido con radicales de azúcar \beta-D-gal-(1-2)-\beta-D-gal situados en los extremos. También galactosas unidas al \beta1-3 mostraron de forma similar buenas especificidades. Las galactosas unidas \beta1-4 no fueron ensayadas por Lee et al., (1994), pero de los trabajos de Debray et al., (1994) se puede concluir que también estos debían tener una alta especificidad a la ML-I.

En la valoración de los trabajos de Debray y col., (1994) debe tenerse en cuenta sin embargo, que las investigaciones fueron efectuadas con lectina de muérdago, la cual fue inmovilizada sobre una columna. Las acciones recíprocas observadas de los sacáridos con la lectina inmovilizada constituyen un sistema experimental no fisiológico. Una conclusión de la acción recíproca de la lectina de muérdago disuelta, o respectivamente de la rViscumina en solución con un receptor no es por consiguiente directamente posible.

Los datos aquí representados por Lee et al., (1994), Debray et al., (1994) y Wu et al., (1995) para la especificidad de la lectina de muérdago son en si mismos contradictorias y pueden no aceptarse como demostración concluyente para una especificidad de la lectina de muérdago frente a Neu5Ac. En particular, es problemático que los datos no se efectúen bajo unas condiciones de ensayo definidas. En esencia se refiere esto a la calidad de las proteínas empleadas, las cuales técnicamente consideradas, no muestran nunca una estructura homogénea como los hidratos de carbono.

Sobre la base de las observaciones de Lee et al., (1992), Galalina et al. (1997), desarrollaron un sistema experimental en el cual la lectina de muérdago fue copulada con un conjugado de neoglico estructuralmente definido. En este sistema se investigó la potencia competitiva de los oligosacáridos sintéticos para la supresión de la unión de la lectina de muérdago. Los resultados obtenidos con ayuda de este sistema son sin embargo, igualmente heterogéneos. Como era de esperar se mostró una potencia competitiva de la lactosa. La competición con la N-acetillactosamina conduce a resultados semejantes. Además, se investigaron también isómeros de la sialillactosa existentes en la naturaleza. El isómero \alpha2-3 sializado poseía una actividad competitiva mayor que el isómero \alpha2-5 sializado, la cual sin embargo está claramente por debajo de la de la lactosa o de la N-acetillactosamina. Además indicaron los autores que el ácido N-acetilneuramínico solo no tiene ninguna actividad inhibitoria.

En el análisis de los trabajos basados en los estudios de competición llama la atención que las glicoproteínas investigadas que se encuentran en la naturaleza comprenden solamente proteínas solubles. Las glicoproteínas de la membrana no se investigaron en los experimentos descritos.

La lectina de muérdago, pero también p. ej., otras proteínas específicas de la lactosa/galactosa como la ricina o galectina están descritas como proteínas que se unen a la asialofetuína. Esta propiedad puede aprovecharse también para una cuantificación (Vang et al., 1986). Gupta et al., (1996) pudieron describir algo más exactamente la acción recíproca de las proteínas ricina, galectina o lectina de muérdago (aquí llamada Viscum album-aglutinina). Descubrieron que las tres proteínas formaban complejos definidos con la asialofetuína. El o los receptores, responsables de la unión de la lectina de muérdago o de la ricina con las células diana, todavía no son conocidos.

En 1982 fue identificado el receptor para la toxina del cólera sobre células Balb/c 3T3 (Critchley et al., 1982). Se trata en este caso del gangliósido GM1. A partir de este trabajo se ensayó también la búsqueda de los receptores de otras toxinas/lectinas en este terreno. A este respecto, se pudo mostrar para la ricina y la aglutinina del cacahuete que en el caso de los receptores sobre linfocitos humanos se trata de glicoproteínas mientras que la aglutinina del ricino y la aglutinina de las habas de soja, se unen aproximadamente con las mismas partes con las glicoproteínas y con los gangliósidos (Turpin et al., 1984). En investigaciones con membranas modelo en las que se incorporó el monosialogangliósido GM1 (con galactosa terminal), fueron observadas solamente muy inespecíficas acciones recíprocas con las dos proteínas ricina y lectina de muérdago, las cuales no hacían posible ninguna clara diferencia de la permeabilidad de las membranas en función del RIPs tipo II añadido (Pohl et al., 1998a). Además Pohl et al., (1998b) observaron que tanto la ricina como también la lectina de muérdago estaban en situación de inducir fusiones vesícula-vesícula. El modelo de la inducción de la fusión no tiene sin embargo, ninguna relevancia decisiva para la recepción de la lectina de muérdago o ricina in vivo, puesto que las fusiones de membranas no son responsables de la recepción de estas proteínas por una célula diana. Ya en 1990 mostraron Tonevitsky et al., que el gangliósido GM1 no podía ser visto como el receptor. Utsumi et al., (1987) informaron acerca de una unión de la ricina en liposomas que contenían GM1, los cuales mediante la adición del competidor lactosa no pudieron ser observados.

Samal et al., (1995) observaron que la lectina de muérdago igualmente que la ricina agregaba las plaquetas de la sangre. Sin embargo, la lectina de muérdago no agregó según este estudio ningún liposoma aislado de estas plaquetas de la sangre, los cuales si son agregados por la ricina. Un potencial receptor para estas lectinas no fue cuestionado por los autores.

En 1994 se observó que la estructura de la superficie modificada de células degeneradas podía aprovecharse (Gottstein et al., 1994; Usui & Hakomori, 1994). Por ejemplo, fueron propuestas inmunotoxinas para una terapia, las cuales se componen de anticuerpos monoclonales contra estructuras específicas de glicolípidos o respectivamente estructuras de glicoproteínas, en lo posible solamente sobre las células degeneradas, y los componentes tóxicos de la ricina (cadena A de la ricina) (Gottstein et al., 1994; Usui & Hakomori, 1994). Este modelo aclara la importancia de un vehículo específico para la célula, el cual hace posible un transporte de una toxina a una célula diana.

En el caso de la ricina, la cadena B de unión con los hidratos de carbono, no satisface las exigencias de un tal vehículo, puesto que para la ricina no se ha identificado claramente una unión con uno de ellos sino que se ha descrito un receptor en continuo movimiento. Esta observación explica los efectos secundarios descritos en una terapia de pacientes con ricina.

Puesto que, contrariamente a la ricina, la lectina de muérdago parece unirse a un receptor, lo cual sucede de forma que dicho receptor no está moviéndose continuamente, fue propuesta la cadena B como posible vehículo para un transporte de toxinas fusionadas. Las correspondientes proteínas de fusión de la cadena B de la rViscumina con compuestos citotóxicos fueron descritos en la solicitud de patente EP 1012256 A1. Para un eficiente y preciso empleo de las substancias terapéuticas sería por este motivo deseable identificar al receptor, al cual se une la cadena B de la lectina de muérdago o respectivamente de la rViscumina obtenida recombinantemente.

El empleo de los extractos de lectina de muérdago (extracto de Viscum album) como medicamento, ya es conocido desde hace siglos. Como componentes activos de estos extractos se identificaron componentes designados como lectinas. Estas lectinas son albúminas que reconocen muy específicamente las estructuras de hidratos de carbono, también en forma unida a lípidos o proteínas, y se unen con las mismas. La lectina de muérdago que fue caracterizada como proteína de clase II inactivadora de ribosomas, actúa farmacológicamente solamente mediante el juego combinado de sus dos subunidades. La cadena B de la lectina de muérdago, la cual posee motivos secuenciales con propiedades específicas de unión a hidratos de carbono, es responsable del transporte de la proteína a la célula diana. En la célula diana la subunidad A bloquea a continuación, mediante su actividad enzimática rARN-N-glicosidasa, el metabolismo ribosómico de las células y ocasiona de esta manera la muerte programada de las células (apoptosis).

En la patente europea EP 0 602 686 B1, se describió la acción de la planta de muérdago y del extracto obtenido a partir de la misma, para el tratamiento de las enfermedades descritas. Desde el principio de este siglo se emplean preparados de muérdago para la terapia del cáncer con diferente éxito (Bocci, 1993; Gabius et al., 1994; Gabius & Gabius, 1994; Ganguly & Das, 1994). Hajto et al., (1989, 1990) pudieron mostrar que los efectos terapéuticos eran debidos en particular a la llamada lectina de muérdago (Viscumina, Viscum album aglutinina, VAA). Junto a una acción citotóxica, se discute hoy en particular una inmunoestimulación (inespecífica), cuyos efectos positivos se aprovechan para una terapia complementaria y para los cuidados posteriores de los pacientes tumorales. Un aumento de la calidad de vida en dichos pacientes es debido al vertido de endorfinas propias del cuerpo (Heiny y Beuth, 1994).

Numerosos estudios in vitro (Hajto et al., 1990; Männel et al., 1991, Beuth et al., 1993) e in vivo (Hajto, 1986; Hajto et al., 1989, Beuth et al., 1991, Beuth et al., 1992), así como estudios clínicos (Beuth et al., 1992) justifican la liberación aumentada debida a la lectina de muérdago, de citocinas inflamatorias (TNF-\alpha, IL-1, IL-6) así como una activación de componentes celulares del sistema inmunológico (células TH, células NK).

Como principio activo del extracto de muérdago se considera hoy una proteína de 60 kDa de la lectina de muérdago, la cual puede obtenerse por una ruta bioquímica a partir de los extractos (Franz et al., 1977; Gabius et al., 1992). La proteína ML consta de dos subunidades unidas por puentes S-S, cuya cadena A es responsable de la inactivación enzimática de los ribosomas (Endo et al., 1988) y cuya cadena B es responsable de la unión con los hidratos de carbono. La actividad biológica está correlacionada con la recepción de la actividad de la cadena B de la lectina (Hajto et al., 1990).

La presente invención tiene por finalidad el resolver el problema técnico, que hasta ahora ningún pronóstico preciso ha podido acertar, de si la terapia que incluye la administración de rViscumina u otros compuestos semejantes, es apropiada para el tratamiento de una enfermedad o transtorno de un individuo.

Este problema técnico se resuelve mediante las versiones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago o a una(s) cadena(s) individual(es) de la lectina de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor situado en la membrana, el cual receptor se caracteriza por un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac) situado en un extremo, el cual está unido a una galactosa (Gal) mediante un enlace glicosídico \alpha2-6.

Según la invención, se emplea de preferencia un procedimiento in vitro, para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago o a la (una) cadena individual de lectina de muérdago, en el cual la capacidad de respuesta está mediada por la unión específica de la subunidad de unión con los hidratos de carbono, de la lectina de muérdago a un receptor de la membrana, el cual receptor se caracteriza por comprender un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), unido mediante una unión glicosídica \alpha2-6 a una galactosa (Gal). La determinación comprende la detección específica cuantitativa y/o cualitativa de la citada glicosilación específica.

El término "lectina de muérdago" incluye tanto la aquí descrita y conocida por el experto como natural, como también la lectina de muérdago recombinante, la cual comprende la cadena individual de la lectina de muérdago de preferencia la cadena B de la lectina de muérdago o (un) fragmento(s) de la misma.

El término "capacidad de respuesta" define, en relación con la invención, la generación de una reacción beneficiosa para la curación de una enfermedad o un transtorno, de una célula individual, de una población celular, de una asociación celular, de un tejido, de un órgano o de un organismo. Además, el término "capacidad de respuesta" abarca también la sensibilidad de una célula individual, de una población celular, de una asociación celular, de un tejido, de un órgano o un organismo en el empleo preventivo de la rViscumina o compuestos semejantes. Por consiguiente, una capacidad de respuesta de las correspondientes células diana está unida a un efecto terapéutico positivo, pero también a un efecto preventivo. De preferencia, la "capacidad de respuesta" comprende la sensibilidad de una célula humana, de una población celular, de una asociación celular, de un tejido, de un órgano o de un organismo humano.

El término "unión específica" puede caracterizarse por ejemplo con el principio de llave-cerradura. El ligando (lectina de muérdago) y la molécula diana (receptor de la membrana) poseen estructuras o motivos, que se acoplan específicamente entre sí. Un ejemplo de ello son los determinantes de antígenos (epitopo), los cuales interaccionan con el punto de unión de un anticuerpo con el antígeno. En correspondencia, existe una unión específica contrariamente a una unión universal, inespecífica. Mediante el conocimiento de la estructura de uno de los socios interactivos que se unen específicamente entre sí, se pueden sacar conclusiones sobre posibles estructuras preferidas o respectivamente sobre elementos estructurales especiales de un socio interactivo. La invención emplea el socio interactivo específico para la lectina de muérdago, en particular la rViscumina.

El término "subunidad de unión a hidratos de carbono de la lectina de muérdago" describe los motivos de la secuencia de la cadena B de la lectina de muérdago, la cual se une específicamente al receptor de la membrana de la lectina de muérdago. Estos motivos fueron descritos por Langer et al., (2000). Al igual que la subunidad de la ricina que se une a los hidratos de carbono, la cadena B de la lectina de muérdago está compuesta de 2 dominios. Estos están divididos cada uno de nuevo en 3 subdominios. Los dominios se designan como 1 y 2, los subdominios como \alpha, \beta y \gamma. Para la ricina se describe que cada subdominio deriva de una estructura de unión a hidratos de carbono supuestamente bacteriana (Rutenber et al., 1987). Debido a la alta identidad estructural de la cadena B de la ricina con la de la lectina de muérdago (62% de identidad y 70% de homología según Eck et al., 1999) parece que esta observación es también transferible a la lectina de muérdago. La diferente especificidad de la subunidad de unión a los hidratos de carbono de la ricina y la lectina de muérdago es según Langer et al., (2000) atribuible a la diferencia de los subdominios. Estas diferencias son en particular en el subdominio 1\alpha los radicales D23 y W38, en el subdominio 1\beta los radicales Y68, Y70, Y75 y F79, y en los subdominios 2\gamma los radicales D235, Y249; para la numeración, véase Eck et al., (1999a).

El término "receptor de la membrana" define, referido a la invención, una estructura unida a la membrana, la cual se caracteriza por tener un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac) situado en el extremo. Este está de nuevo unido mediante una unión \alpha2-6 glicosídica con una galactosa (Gal). Ejemplos de estructuras correspondientes unidas a la membrana son las proteínas o los péptidos, los cuales están anclados a la membrana de una célula. Esta definición comprende tanto la transmembrana como también las proteínas y péptidos asociados a la membrana. Igualmente los lípidos, los cuales o bien son ellos mismos parte de la membrana o están asociados a la misma, son ejemplos para dichas estructuras. La estructura unida a la membrana, dada a conocer, puede tanto ser parte de una glicoproteína (proteína glicosilada), como ser también parte de un glicolípido.

El término "membrana", referido a la invención, comprende todas las dobles capas de lípidos, membranosas, celulares. Por consiguiente, son tanto membranas del retículo endoplasmático (ER), del Golgi, de la cavidad del núcleo celular, de vesículas y vacuolas, así como también comprende explícitamente, la membrana celular exterior.

En el estado actual de la técnica se han descrito proteínas que están glicosiladas con un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac) situado en el extremo, las cuales de nuevo mediante una unión \alpha2-6 glicosídica están unidas con una galactosa (Gal). Estas proteínas glicosiladas son proteínas/proteínas séricas (véase p. ej., Hanasaki et al. 1995) solubles, las cuales no son relevantes ni para efectos farmacológicos ni para el modo de actuar de la lectina de muérdago. En relación con esta invención se da a conocer por primera vez una estructura glicosilada unida a la membrana.

La identificación del ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac) situado en el extremo, el cual mediante una unión \alpha2-6 glucosídica está unido con una galactosa (Gal), como estructura diana específica de la subunidad de unión a hidratos de carbono de la lectina de muérdago, permite a un experto, solo o en combinación con las instrucciones de Langer et al. (2000), modificar por ejemplo la subunidad de unión con hidratos de carbono de la ricina mediante mutagénesis específica puntual. Un péptido/proteína correspondientemente mutado ya no pudo a continuación unirse a estructuras diana específicas para la ricina, sino que en su lugar, pudo unirse a estructuras diana específicas para la lectina de muérdago.

Ejemplos de una detección cuantitativa y/o cualitativa de la citada glicosilación ya son conocidos por el experto, entre otros el ejemplo 7 anexo y la figura 9 que ilustra este ejemplo. Tales procedimientos comprenden por ejemplo análisis Western-Blot modificados, como se muestra en los ejemplos. Igualmente comprenden dichos procedimientos, técnicas como p. ej., el ensayo radioinmunológico (RIA), el ensayo sándwich (ensayo inmunométrico) y el ensayo Western-Blot, IRMA (ensayo inmunológico radioinmunométrico), EIA (ensayo inmunoenzimático), ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas), FIA (ensayo inmunofluorescente), CLIA (ensayo inmunológico quimioluminiscente), ensayo de aglutinación y procedimientos de citrometría de flujo.

El procedimiento según la invención hace posible entre otros, una prognosis de la efectividad de una terapia con lectina de muérdago. Esto comprende que pueda hacerse un pronóstico de si una terapia con lectina de muérdago, de preferencia con rViscumina, tiene en principio posibilidades de éxito en la terapia para el tratamiento de una enfermedad en determinadas células de una determinada población popular o un determinado tejido, órgano u organismo. Por ejemplo, si se identifica con ayuda del procedimiento según la invención la glicosilación sobre una célula tumoral más arriba citada, entonces puede unirse la rViscumina a la célula, ser absorbida por ella y actuar citotóxicamente en la misma. Además, el procedimiento según la invención hace posible una prognosis para la efectividad de una terapia con lectina de muérdago en un individuo. En un colectivo de pacientes pueden diferenciarse por consiguiente aquellos que responden (pacientes que reaccionan a la terapia), de aquellos que no responden a la misma. Este procedimiento de prognosis efectúa por consiguiente una tarea semejante a las conocidas investigaciones efectuadas por el experto, antes de una terapia de pacientes con cáncer de mama tratados con Herceptin. Antes de administrar una terapia con el preparado de anticuerpos Herceptin, debe investigarse si el paciente posee el receptor EGF, Her-2. A partir de la FDA (Food and Drug Administration de USA) se admiten a este respecto en particular, dos procedimientos de ensayo (coloración inmunohistoquímica (IHC) y fluorescencia de hibridación in situ (FISH)). Véase entre otros, Thomson et al., (2001). Análogamente, éstos y otros procedimientos pueden emplearse en las técnicas aquí descritas, para reconocer y/o determinar según las instrucciones de la invención, aquellos pacientes individuales que responden a una terapia con lectina de muérdago, en particular una terapia con rViscumina.

Para el procedimiento según la invención pueden emplearse muestras de líquidos en particular líquidos corporales, células, poblaciones celulares o tejidos. Estas muestras pueden proceder de muestras de sangre u otras muestras de líquidos corporales, pero también pueden ser muestras de tejidos, células aisladas o células tumorales diseminadas. Ejemplos de tales muestras y su extracción se describen con más detalle en esta solicitud en conexión con otras versiones.

El procedimiento según la invención hace también posible un reconocimiento temprano de los pacientes con respuesta en un colectivo de pacientes. De esta manera es posible mediante un ensayo fácil de ejecutar, sin un mayor retraso antes del comienzo de la terapia, valorar el éxito de esta terapia. Esta característica del procedimiento según la invención, es ante todo relevante desde el punto de vista económico de la enfermedad. Se evita una eventualmente muy cara terapia para los pacientes individuales, aunque inefectiva. De esta manera, puede también evitarse en una terapia efectiva, el correr el riesgo de efectos secundarios en estos pacientes individuales, en los cuales parece dudosa una terapia exitosa con rViscumin.

En las investigaciones que tienen por base la invención y en los ejemplos descritos puede mostrarse fuera de toda duda, que la lectina de muérdago y la ricina se unen a los glicoesfingolípidos (GSL). Por primera vez pudo aquí documentarse una diferencia cuantitativa y cualitativa entre la especificidad de la unión de la lectina de muérdago (en particular rViscumina) y la de la ricina. Las estructuras de los hidratos de carbono reconocidos en ambas proteínas pueden representarse esquemáticamente en la figura 1.

Como se representa en los ejemplos ilustrados, pudo mostrarse en ensayos específicos que la especificidad primaria de la lectina de muérdago (en particular rViscumina) no es una galactosa situada en el extremo. En las figuras 2 a 5 y 7 se muestra una detección inmunológica mediante un Western Blot modificado de la ricina o respectivamente rViscumina unidas a una placa DC (ensayo TLC), sobre GSL neutro y ácido, fueron previamente separadas tomando como base sus diferentes propiedades de recorrido en diferentes fluidos. Mientras que la ricina muestra una clara especificidad para el GSL neutro, con una galactosa situada en el extremo (Lc2, nLc4, nLc6, Gg4) (tabla 1; figura 4B huella b), la rViscumina muestra de forma sorprendente frente a la Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer (Cer representa aquí Ceramida), sola-mente una extremadamente débil unión (tabla 1; figura 2A, huella b, "mancha negativa", después de una incubación ü.N.).

De manera sorprendente se demostró que esto no sirve sin embargo para un grupo de gangliósidos en los cuales se asienta situado en el extremo, un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac). Este es muy bien reconocido por la rViscumina, pero por la ricina no es reconocido en absoluto (ver tabla 1; figura 2B, huella b; figura 5B, huella b "manchas negativas"). Además se encontró de manera sorprendente, que para el reconocimiento de la estructura del receptor por la rViscumina, es decisivo que el ácido N-acetil-neuramínico esté unido con la galactosa terminal de la estructura básica del azúcar neutro mediante un enlace \alpha2-6 (en cuyo caso es reconocido), ó mediante un enlace \alpha2-3 (en cuyo caso no es reconocido) (ver ejemplos y figuras anexos).

Este reconocimiento específico, según la invención, del ácido N-acetil-neuramínico en la configuración Neu5Ac-\alpha2-6-Gal, recuerda la especificidad en el reconocimiento del epitopo de anticuerpos monoclonales, y hasta el momento no ha sido descrito todavía para la lectina de muérdago. También fue sorprendente la diferente especificidad absoluta de la ricina y rViscumina y para el experto no fue predecible. Los diferentes motivos de reconocimiento de las dos proteínas inactivadoras de los ribosomas tipo II ensayados, están resumidos en la tabla 1. Del estado actual de la técnica pudo deducirse que tanto la ricina, como también la lectina de muérdago (en particular la rViscumina), cuando generalmente se unen antes a los GSL neutros, poseen como radical de azúcar situado en el extremo, una galactosa.

En una versión preferida del procedimiento, el recep- tor comprende gangliósidos, los cuales después de la galactosa \alpha2-6-sializada poseen por lo menos una N-acetil-glucosamina (GlcNAc), es decir, gangliósidos, los cuales después del ácido N-acetil-neuramínico unido \alpha2-6 a la galactosa, comprenden por lo menos una N-acetil-glucosamina (GlcNAc). Sin embargo, como se menciona más adelante, el subsiguiente N-acetil-glucosamina (GlcNAc) puede unirse tanto directa como también indirectamente a la estructura Neu5Ac\alpha2-6-Gal. Por consiguiente, es posible en relación con esta invención, que el procedimiento según la invención se base sobre el reconocimiento (de la estructura) de un receptor gangliósido, el cual comprende la estructura Neu5Ac\alpha2-6-Gal-Y-[GlcNAc]_{x}-Cer. Y puede comprender p. ej., otra galactosa (Gal).

El término "gangliósido" define en relación con la invención, ceramidoligosacáridos ácidos, que contienen ácido siálico. Las unidades de hidrato de carbono están unidas mediante un enlace glicosídico con el grupo C1-OH de N-acilesfingosina (= ceramida). Los gangliósidos pueden ser tanto de cadena larga (p. ej., IV^{3}nLc4, VI^{3}nLc6, etc.), como también de cadena ramificada (GM1 ó GM2) (Voet y Voet (1992), en particular la figura de la página 271 de esta referencia).

En una versión preferida del procedimiento, el receptor comprende gangliósidos con la estructura Neu5Ac\alpha2-6-Gal-[Gal/GlcNAc]_{x}-Cer, en donde Cer es ceramida. Particularmente preferido es sin embargo el descrito en el procedimiento, Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.

Los procedimientos de uso corriente para la caracterización estructural de gangliósidos permiten actualmente un análisis exacto solamente de aquellos gangliósidos, en los cuales x tiene un valor \leq 6. La subunidad de unión a los hidratos de carbono de la lectina de muérdago reconoce las estructuras de azúcar situadas en el extremo. Corresponientemente el valor de las variables x es fundamentalmente insignificante para la unión específica. De preferencia la variable tiene un valor máximo de 10. Además, de preferencia la variable tiene un valor de \leq 6, con mayor preferencia un valor de 5, 4, 3, 2 ó 1. Todavía con mayor preferencia, en los gangliósidos ramificados el valor de x individualmente, o en todas las cadenas, es diferente.

Igualmente de preferencia, el receptor comprende en una versión del procedimiento, gangliósidos de estructura Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer, con particular preferencia, Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc
\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer ó un gangliósido Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.

También mediante esta versión preferida están comprendidos los gangliósidos lineales y ramificados.

En correspondencia, en otra versión preferida, el receptor está situado en la membrana celular.

Esta versión del procedimiento según la invención describe el análisis de los receptores situados en la membrana, los cuales son parte de la membrana celular exterior o están unidos a la misma. En particular, esta versión comprende receptores los cuales son glicoproteínas o glicolípidos.

En otra versión preferida la lectina de muérdago es una lectina de muérdago recombinante/rViscumina.

Como se ha descrito más arriba, las distintas lectinas de muérdago que se encuentran en la naturaleza (ML-I, ML-II y ML-III), están diferenciadas en la literatura. Estas se diferencian por su especificidad a los hidratos de carbono (Franz, 1986). Respecto a ello, se discute si la especificidad a la galactosa/lactosa (ML-I), mediante una forma mixta de galactosa/lactosa y N-acetil-galactosamina (ML-II), de una lectina de muérdago, que se une con más fuerza a la N-acetil-galactosamina (ML-III), cambia. La lectina de muérdago/rViscumina recombinante obtenida en E. coli, es ya conocida por el experto (EP 0 751 221 B1, Eck et al., 1999a y 1999b). La rViscumina no corresponde exactamente en su estructura primaria a una ML-I, ML-II ó ML-III que se encuentran en la planta de muérdago. De esto se desprende que junto a las secuencias descritas de la rViscumina, existen todavía otras mediante mutaciones puntuales en la variante de la lectina de muérdago modificada en el gen original, las cuales pueden diferenciarse fácilmente en su estructura primaria. La rViscumina podría considerarse como una variante de la lectina de muérdago primitiva, y considerarse como una mezcla de las secuencias de ML-I, ML-II y ML-III.

Además, mediante esta versión están comprendidas las proteínas de fusión recombinantes sobre la base de la rViscumina, como se describen en la solicitud de patente de la patente EP A2 1012256.

Con más preferencia, la lectina de muérdago recombinante comprende en una versión de la invención, una secuencia de aminoácidos la cual es codificada por un polinucleótido como está representado en SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 3 ó SEQ ID nº 5.

En una versión también preferida está de preferencia comprendida la lectina de muérdago recombinante, que es codificada por uno o varios polinucleótidos.

Igualmente comprende la lectina de muérdago recombinante en una versión preferida del procedimiento según la invención, un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como está representado en SEQ ID nº: 2, SEQ ID nº: 4 ó SEQ ID nº: 6, ó un fragmento funcional de la misma.

El término "fragmento funcional" define en relación a esta invención, fragmentos de los citados polipéptidos los cuales poseen la misma función biológica que los polipéptidos representados con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID). La función de la lectina de muérdago, en particular la rViscumina, y las conocidas subunidades de la lectina de muérdago ya se han descrito aquí. La "función" comprende la propiedad de unión específica, también dada aquí a conocer, de la lectina de muérdago, en particular de la cadena B de la lectina de muérdago, con el descrito receptor de la lectina de muérdago. Con esto, están también comprendidos fragmentos de la cadena B de la lectina de muérdago, en particular aquellos fragmentos que pueden inducir una interacción especifica con el descrito receptor de la lectina de muérdago.

El término "misma función biológica" describe en esta conexión por ejemplo, que fragmentos o derivados del polipéptido inducen las mismas señales en una célula que los citados péptidos. Ejemplos de fragmentos son dominios de péptidos con funciones definidas o determinados grupos prostéticos. Las "mismas funciones biológicas" comprenden también la citotoxicidad, la inmunoestimulación (tanto del sistema inmunológico nativo como también del sistema inmunológico adoptivo), estimulación de la liberación de citocinas, antigenidad, inducción de la expresión o de la activación de marcadores en la superficie (p. ej., CD56 sobre células NK), inducción de apoptosis o estimulación de endorfinas.

En una versión asimismo preferida, se comprende también la lectina de muérdago recombinante la cual está codificada por uno o varios polinucleótidos, los cuales codifican un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID nº: 2, SEQ ID nº: 4 ó SEQ ID nº: 6, ó codifican un fragmento funcional de la misma, la cual secuencia sin embargo, desde el punto de vista del código genético, está degenerada.

El receptor de la lectina de muérdago descrito aquí por primera vez, juega también un papel en los ensayos celulares, como está representado en los ejemplos. Puede verse en los mismos, que las células en el tratamiento con rViscumina reaccionan de manera distinta. En particular las células tumorales o las células que derivan de los tumores, muestran las reacciones bioquímicas específicas descritas en los ejemplos, cuando son tratadas con rViscumina.

Mediante los experimentos representados en los ejemplos puede igualmente ser identificada sin duda alguna la especificidad de la rViscumina para el receptor aquí dado a conocer. Además fue mostrado claramente que la rViscumina en comparación con la ricina posee una especificidad para los hidratos de carbono cuantitativamente distinta.

En las investigaciones basadas en la invención, que están descritas en los ejemplos que se adjuntan, se mostró que las células tumorales o respectivamente, las líneas de células tumorales, expresan el receptor específico para la lectina de muérdago o en particular para la rViscumina, más arriba descrito.

Las sialiltransferasas son responsables en las células eucariotas de la glicosilación terminal de estructuras glicosiladas. La actividad de estas enzimas se localizó en el aparato de Golgi (en el compartimento trans-Golgi). Las enzimas catalizan la transferencia de éteres del ácido siálico. La actividad enzimática de dichas sialiltransferasas cataliza por ejemplo en células degeneradas (células cancerosas) una específica glicosilación de los péptidos y/o lípidos. Una presencia de dichas sialiltransferasas en las muestras de células o tejidos puede valorarse como una indicación de degeneración de las células. Esto sirve con mayor razón para la detección de una actividad enzimática de estas sialiltransferasas en una muestra.

Los procedimientos de biología molecular y de bioquímica de las proteínas para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de la(s) sialiltransferasa(s), son ya conocidos por los expertos a partir de la Literatura (ver entre otros, Mülhardt (2000) y Rehm (2000)). Métodos de biología molecular son por ejemplo las técnicas RT-PCR, ensayos de protección ARNsa, análisis Northern blot o Southern blot. Métodos químicos para proteínas son por ejemplo los procedimientos para la detección de una actividad transferasa pero también los procedimientos como el análisis Western blot u otras técnicas, las cuales pueden compendiarse bajo la denominación de análisis Proteom.

Además, la determinación cuantitativa de la sialil-transferasa de células individuales, comprende p. ej., las células tumorales diseminadas. Los análisis de células individuales son ya conocidos por el experto y se describen en EP A1 11009938 y Klein (1999).

Un ejemplo de una correspondiente sialiltransferasa es el \beta-galactósido \alpha-2,6-sialiltransferasa E.C. 2.4.99.1 (\alpha2-6STN). La \alpha2-6STN es una proteína transmembránica de 47 kDa. Los hepatocitos segregan también, una forma de 41 kDa de esta enzima. La \alpha2-6STN es una glicoproteína del suero, la cual se añade al grupo de los "reactantes de fase aguda" y en procesos patógenos juega un papel (actividad reforzada en muchos carcinomas, p. ej., carcinoma de colon y carcinoma cervical). Las secuencias de aminoácidos de formas conocidas de enzima, y las secuencias de nucleótidos que codifican las mismas son ya conocidas por el experto (véase Accession n^{os} L29554 (Rattus norvegicus), X75558 (Gallus gallus), NM_003032 (Homo sapiens) y NM_009175 (Mus musculus)).

Los procedimientos según la invención aquí representados pueden efectuarse mediante el empleo de un reactivo de detección específico. Estos reactivos específicos de detección son capaces de interaccionar o respectivamente unirse con el receptor de la lectina de muérdago aquí descrito. Esta interacción o unión puede ser directa o indirecta, pero debe ser específica para el receptor aquí descrito. Reactivos particularmente preferidos son los anticuerpos específicos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos, aptámeros, moléculas que se unen a hidratos de carbono (p. ej., péptidos y/o proteínas), en donde el reactivo debe ser capaz de reconocer y/o unirse al receptor de la lectina de muérdago aquí descrito o a sus componentes específicos (p. ej., el aquí definido ácido N-acetil-neuramínico situado en el extremo, el cual está unido mediante un enlace glicosídico alfa2-6 con una galactosa). De preferencia, estos reactivos de detección están marcados, el cual marcado puede comprender substancias radiactivas, colorantes fluorescentes, biotina-(estrept)avidina, lucife-rasas, CAT, beta-galactosidasa, fosfatasa(s) alcalina(s), peroxidasa(s), otros marcados enzimáticos, digitonina, colorantes en general, etc. El procedimiento según la invención puede sin embargo efectuarse también mediante detección indirecta del receptor aquí descrito. Detecciones del receptor están ilustradas en los ejemplos y pueden, como se ha indicado más arriba, comprender también procedimientos como los ensayos RIA, ELISA, CLIA, FIA, ELLA, TLC, procedimientos histológicos, procedimientos de (inmuno)-fluorescencia directos e indirectos, o procedimientos de flujo (p. ej., análisis FACS, citometría de flujo, BIAcore).

En una versión alternativa la invención se refiere a una composición para diagnóstico, la cual comprende una substancia que reconoce o une específicamente el receptor definido más arriba, de preferencia escogida del grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, aptámeros, en donde la substancia está marcada detectablemente o el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual puede obtenerse a partir de una línea de células hibridomas, la cual fue depositada el 20 de Diciembre de 2002 en la DSMZ de Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580.

Procedimientos para la obtención de anticuerpos (policlonales o monoclonales), los cuales reconocen o se unen a una estructura diana específica, son ya conocidos por el experto. La obtención de anticuerpos monoclonales contra los gangliósidos GD1 y GD2, los cuales juegan un papel en enfermedades neurológicas, fue descrita por Magnani et al., (1982), Tur et al., (2001) y Pan et al., (2001). La detección de la especificidad de dichos anticuerpos puede efectuarse entre otros, mediante el ensayo Overlay ("de capa sobrepuesta"), el cual se basa en una inmunocoloración mediante cromatografía en capa fina (Müthing y Mühlradt (1988), Müthing y Kemminer (1966), Müthing (1998)). Este procedimiento puede combinarse eventualmente con el análisis ELISA.

Los anticuerpos empleados en los procedimientos aquí descritos son de preferencia anticuerpos monoclonales (o fragmentos o derivados de los mismos) los cuales se unen específicamente a la estructura del receptor unido a la membrana, dado aquí a conocer. En los ejemplos se describe como pueden ser obtenidos dichos anticuerpos. Por ejemplo los anticuerpos descritos en los ejemplos con los códigos 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6, están dirigidos contra los gangliósidos tipo neolacto \alpha2-6 sializados aquí descritos, es decir el receptor aquí descrito para la lectina de muérdago (recombinante).

Los anticuerpos pueden ser, entre otros, anticuerpos del tipo IgG, IgA, IgD, IgM. Un anticuerpo particularmente preferido puede ser obtenido a partir de una célula hibridoma/línea de células hibridomas, la cual fue depositada con la denominación 59.33.3 el 20 de Diciembre de 2002 en la "Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares") (DSMZ) en Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580 según el Tratado de Budapest.

Está previsto también que las composiciones aquí descritas como diagnósticas como también farmacéuticas (ver más adelante) comprendan anticuerpos, los cuales se obtienen de los anticuerpos aquí descritos mediante modificaciones de los mismos. Así pueden ser aisladas mediante técnicas conocidas por el experto, las CDR (regiones determinantes de la complementariedad; las cuales tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 forman curvas en el extremo de un dominio V de los anticuerpos o receptores de células T. Estos entran en contacto directo con un antígeno o un péptido: el complejo MHC) de los anticuerpos aquí descritos, son aislados y estos CDR son unidos a anticuerpos de otra estructura. A este respeto es posible p. ej., aislar las regiones CDR del anticuerpo 59.33.3 (un IgM), e integrar estas CDR en otras inmunoglobulinas p. ej., en una IgG, de preferencia en una estructura IgG1. Estos procedimientos (p. ej., "injerto de CDR"), ya son bien conocidos por el experto. Los anticuerpos aquí descritos comprenden también anticuerpos quimera, anticuerpos humanizados o también anticuerpos de una única cadena ("single chain antibodies") o fragmentos de anticuerpos de una sola cadena como la construcción scFv. Sin embargo, dichas modificaciones de anticuerpos no están limitadas a modificaciones de los anticuerpos descritos aquí detalladamente 59.33.3, 59.33.5 ó 59.33.6. Los anticuerpos empleados pueden ser todos los anticuerpos/moléculas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpos, los cuales se unen específicamente al receptor aquí descrito para la lectina de muérdago (recombinante) (r)Viscumina).

Los fragmentos de anticuerpo, como Fv, F(ab')_{2} y Fab, pueden obtenerse por escisión de la proteína intacta (anticuerpo), p. ej., mediante proteasas o mediante escisión química. Sin embargo, puede formarse un gen más corto. Por ejemplo, comprende un gen quimera, el cual codifica una parte del fragmento F(ab')_{2}, secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido de un codon de interrupción translacional, mediante lo cual se obtiene una molécula más corta.

El término "derivados de anticuerpos" describe formas modificadas de los anteriormente llamados anticuerpos. Estas modificaciones comprenden modificaciones químicas, en particular bioquímicas, de preferencia proteinbioquímicas, de los anticuerpos o sus fragmentos. La característica común de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y sus derivados, es el reconocimiento y/o la unión a una estructura diana específica. Esta estructura diana es según la invención el receptor unido a la membrana aquí descrito, para la lectina de muérdago.

Los aptámeros y sus propiedades específicas han sido descritos en resumen, entre otros, por Hermann y Patel (2000). Procedimientos de aislamiento de los aptámeros ya son conocidos para el experto igualmente a partir del estado actual de la técnica.

El término "péptido de unión a los hidratos de carbono" se define aquí como en la versión de la invención la cual se refiere al empleo para la preparación de un medicamento.

Además, en una versión preferida de la composición diagnóstica, la substancia detectable está marcada.

Ejemplos de marcas detectables de substancias son ya conocidas por el experto. Estas son entre otras, marcas radiactivas, enzimáticas o fluorescentes. Igualmente, la biotinilación y una detección con ayuda de avidina o estreptavidina son un ejemplo para una correspondiente versión preferida.

Una versión de la invención abarca el empleo de la composición diagnóstica para análisis según la invención, tanto de células individuales, como de una población de células o de un conjunto celular, células de un tejido, órgano u organismo, las cuales poseen un receptor funcional para la lectina de muérdago.

En otra versión alternativa, la invención se refiere también al empleo de una substancia más arriba definida, para la obtención de una composición diagnóstica para la detección de un receptor funcional de la lectina de muérdago.

También es preferido el empleo según la invención, de la composición diagnóstica para la detección del receptor aquí descrito e investigada en los ejemplos, sobre las células.

Como se representa en los ejemplos, las células tumorales se caracterizan por expresar los ácidos N-acetil-neuramínicos (Neu5Ac) situados en el extremo, los cuales mediante un enlace \alpha2-6 glicosídica están unidos con galactosa (Gal), como respondedores particulares a la lectina de muérdago, en particular la lectina de muérdago obtenida recombinantemente (rViscumina).

En una versión preferida, las células investigadas son células tumorales. Más preferido es que estas células tumorales sean células animales, de preferencia células tumorales de mamíferos, y todavía con más preferencia, células tumorales de seres humanos. Se prefiere además que estas células sean células leucémicas, carcinomas pulmonares de células pequeñas y no pequeñas, carcinoma de colon, carcinoma ZNS, melanoma, carcinoma ovárico, carcinoma renal, carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de estómago, carcinoma de páncreas, o carcinoma de testículos.

En otra versión preferida de la invención las células proceden del material de una biopsia.

Procedimientos para la obtención del material de una biopsia son ya conocidos por el experto. Mediante esta descripción se abarcan diferentes tipos de extracción, en los cuales se extraen células a un probando o paciente. Son preferidas las células vivas. Estas son por ejemplo biopsias con aguja fina (aspirados de aguja fina), biopsias de troquel, extracción de trozos de tejido sólidos (p. ej., mediante procedimiento quirúrgico) o muestras de un órgano completo (p. ej., cápsulas suprarrenales). Las diferentes técnicas de extracción están descritas p. ej., en: Kremer et al (1999), Pichlmayr y Löhlein (1991), Niethard y Pfeil (1997), Malte (1998) y Bonk.

En una versión igualmente preferida, las células se aislan de muestras de sangre.

Junto al aislamiento de las células de muestras de sangre se refieren igualmente versiones preferidas de la invención como el aislamiento de células de derrames pleurales, muestras de líquido ascítico, líquidos de lavados, muestras de orina, muestras de esperma o muestras de líquido cefalorraquídeo y líquido cerebral.

Para la detección de la capacidad de respuesta de p. ej., pacientes de cáncer a la rViscumina, se extraen tejidos del paciente antes de planificar una terapia o durante el transcurso de la terapia. También es posible recurrir a muestras/conservas coleccionadas de diferente(s) pacientes (las cuales están almacenadas ordenadas por indicaciones en bancos de bloques de parafina en muchas clínicas), para poder hacer una afirmación estadísticamente asegurada p. ej., para una indicación específica.

Estos tejidos se secan por ejemplo por liofilización, se conservan en formalina o se obtienen mediante conservación por congelación (congelación planificada, p. ej., por perfusión con una solución citoprotectiva, p. ej., solución de azúcar) y seguidamente se manipulan según procedimientos habituales al experto, p. ej., conservados en bloques de parafina. A partir de las muestras se obtienen cortes apropiados para una investigación microscópica. Estos cortes son investigados a continuación mediante procedimientos habituales al experto (p. ej., el método LSAP un procedimiento semejante al ELISA o mediante el empleo del método ENVISION de la firma DAKO de Hamburgo) para detectar la presencia de antígenos específicos, es decir, del receptor aquí definido para la lectina de muérdago (recombinante). Para ello pueden emplearse por ejemplo las muestras de pacientes mediante el empleo del aquí descrito mAk 59.33.3, ó bien los otros dos, mAks 59.33.5 ó 59.33,6 que reconocen el epitopo "CD75s" del receptor aquí descrito. Los anticuerpos unidos, los cuales pueden emplearse por ejemplo en una concentración de 500 ng/ml a 10 \mug/ml, son detectados a continuación con anticuerpos secundarios u otros métodos de detección. Por ejemplo, puede emplearse un anticuerpo IgM anti-ratón, en el cual un polidextrano previsto está copulado con fosfatasa alcalina. Es igualmente posible una comparación entre tejidos sanos y tejidos degenerados para distinguir si en un paciente o en una indicación específica de un tumor, un tratamiento con rViscumina es prometedor de éxito. Además, puede detectarse si un tratamiento con lectina de muérdago (recombínate) (rViscumina) será eficaz, es decir, si puede esperarse un curso terapéutico
exitoso.

Además, la invención descrita hasta aquí hace posible otros procedimientos diagnósticos, como entre otros, la investigación de material de biopsia con aguja fina y líneas celulares para xenoinjertos u otras líneas celulares.

Las células pueden fijarse por ejemplo en placas de 96 pocillos y con un procedimiento análogo al ELISA como se ha descrito en el ejemplo 8, puede investigarse la presencia de motivos CD75s unidos a membrana/estables en membrana (motivos de unión a rViscumina, es decir, la estructura del receptor de unión a la membrana, aquí descrita). Otro procedimiento que puede emplearse para el ensayo es el análisis FACS. En éste pueden seleccionarse un grupo de células (particularmente interesante en biopsias de aguja fina) que llevan un determinado antígeno de superficie. A este respecto se emplean por ejemplo las células en primer lugar mediante el empleo de anticuerpos específicos o derivados de anticuerpos, como por ejemplo los mAks 59.33.3, 59.33.5 ó 59.33.6 aquí descritos. Los anticuerpos unidos, los cuales pueden emplearse de preferencia, aunque sin ser limitantes, en una concentración de 500 ng/ml hasta 10 \mug/ml, se añaden a continuación con un anticuerpo secundario, p. ej., un anticuerpo IgM anti-ratón, el cual con FITC u otro distinto está marcado (fluorescente), en un automático Cell Sorter ("seleccionador de células"), p. ej., de Becton Dickinson. Para seleccionar una población específica de células, se puede en este procedimiento marcar (fluorescencia) también un segundo epitopo presente sobre las células diana con otro anticuerpo distinto al anticuerpo IgM anti-ratón, y con ello seleccionar específicamente sólo las células en este caso doblemente marcadas. Con ello se añaden otras posibilidades, como lograr la predicción de un tratamiento de rViscumina para un paciente. Adicionalmente se obtiene la información de qué tanto por ciento una correspondiente población celular (células doblemente coloreadas frente a células coloreadas solamente con el segundo anticuerpo) lleva el epítopo CD75s deseado. A partir de un tal análisis se puede valorar o respectivamente seleccionar si existe todavía un residuo mínimo de la enfermedad ("minimal residual disease"). Adicionalmente se pueden ensayar también terapias de combinación con otros citostáticos juntamente con rViscumina in vitro, y prepararlas para emplear en pacientes.

En los procedimientos de diagnóstico como se han descrito aquí, está comprendido también el análisis de estructuras de membrana lisadas. Es posible entre otros, tratar p. ej., material de biopsia fresco, no fijado, con detergentes (p. ej., Triton X-100®, Triton X-112®, Tween 80®, Tween 20®, octilglicosido, etc.), y analizar el lisado, p. ej., mediante Western blot o en forma de ensayos ELISA/RIA. Es decir, los lisados con detergente pueden ensayarse para detectar la primitiva presencia del receptor aquí descrito, unido a la membrana, para la lectina de muérdago (recombinante) (rViscumina). Existen suficientes procedimientos a disposición del experto para el análisis correspondiente.

Una substancia que se une con una unión específica a un receptor definido más arriba, o una substancia que lo reconoce, puede ser empleada para la obtención de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas (p. ej., cáncer), enfermedades víricas (p. ej., herpes, HIV), enfermedades autoinmunológicas o enfermedades neuronales en donde la substancia que se une al receptor o que reconoce al receptor, se escoge entre el grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, aptámeros, substancias de bajo peso molecular y péptidos unidos a hidratos de carbono. De preferencia la substancia que se une al receptor o que reconoce al receptor es capaz de inhibir o debilitar la unión de una cadena B de la lectina de muérdago y/o rViscumina con este receptor.

El término "inhibir" describe en conexión con la invención tanto una inhibición completa como una inhibición parcial. Por consiguiente el término comprende un bloqueo completo de la unión de la lectina de muérdago y/o la rViscumina a la estructura de hidratos de carbono identificada como receptor específico. Por consiguiente está igualmente comprendida la capacidad de debilitar la unión de la lectina de muérdago y/o la rViscumina al receptor.

La substancia más arriba descrita, empleada para la obtención de un medicamento no es la lectina de muérdago y en particular no es la cadena B de la lectina de muérdago.

Este empleo se refiere además de preferencia a la formulación de medicamentos, eventualmente en combinación con un "soporte farmacológicamente aceptable" y/o un diluyente. Ejemplos de soportes farmacológicamente aceptables particularmente apropiados son ya conocidos por el experto y comprenden soluciones de sal común tamponadas, agua, emulsiones como p. ej., emulsiones aceite/agua, diferentes clases de detergentes, soluciones estériles, etc. Los medicamentos que comprenden dichos soportes pueden formularse mediante métodos convencionales ya conocidos. Estos medicamentos pueden administrarse a un individuo en una dosis apropiada. La administración puede ser oral o parenteral, p. ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, local, intranasal, intrabronquial o intradérmica o mediante un catéter en un determinado lugar de una arteria. El tipo de dosificación se determina por el médico facultativo en correspondencia con los factores clínicos. Ya es conocido por el experto que el tipo de dosificación depende de distintos factores como p. ej., el tamaño del cuerpo o respectivamente el peso, la superficie del cuerpo, la edad, el sexo o la salud general del paciente, pero también depende del medio especial que se va a administrar, la duración y clase de administración, y de los otros medicamentos que posiblemente se administren paralelamente. Una dosis típica puede estar comprendida p. ej., en un margen entre 0,001 y 1000 \mug, la cual dosis puede ajustarse por debajo o por arriba de este margen de ejemplo, ante todo teniendo en cuenta los factores citados más arriba. En general, en una administración regular, la dosis de la composición según la invención debe estar comprendida en un margen de unidades de 10 ng y 10 mg por día o respectivamente por intervalo de aplicación. En caso de que la administración deba ser por vía intravenosa, la dosis estará comprendida en un margen entre unidades de 1 ng y 0,1 mg por kilo de peso corporal, por minuto.

La composición puede administrarse de forma local o sistémica. Los preparados para una administración parenteral comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas, estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como p. ej., aceite de oliva y ésteres orgánicos como p. ej., oleato de etilo, los cuales son adecuados para inyección. Los soportes acuosos comprenden agua, soluciones hidro-alcohólicas, emulsiones, suspensiones, soluciones salinas y medios tamponados. Los soportes parenterales comprenden soluciones de cloruro de sodio, dextrosa Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato Ringer y aceites unidos. Los soportes intravenosos comprenden p. ej., medios complementarios líquidos, nutritivos y electrolitos (como p. ej., los basados sobre dextrosa Ringer). La composición según la invención puede contener además, conservantes y otros aditivos, como p. ej., compuestos antimicrobianos, antioxidantes, formadores de complejos y gases inertes. Por lo demás, pueden contener en función del empleo propuesto, compuestos como p. ej., interleucinas, factores de crecimiento, factores de diferenciación, interferonas, proteínas quimiotácticas, o un agente inmunomodulatorio inespecífico. Igualmente de preferencia, pueden contener citostáticos, antibióticos y combinaciones de los mismos.

Los medicamentos o productos medicinales preparados se emplean o bien para la prevención o bien para el tratamiento de un transtorno o una enfermedad de los citados más arriba.

La obtención y el procedimiento de aislamiento de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos y aptámeros son ya conocidos por el experto como ya se ha mencionado más arriba, a partir del estado actual de la técnica y ya ha sido descrito detalladamente más arriba.

Según la invención, las substancias que corresponden a una cadena B de la lectina de muérdago o rViscumina o derivados de las mismas mediante el grupo de la lectina y péptidos que se unen a los hidratos de carbono, no están comprendidas. Sin embargo esta versión comprende, entre otros, otras lectinas las cuales se adaptan mediante modificaciones bioquímicas y/o de biología molecular (p. ej., mutagénesis dirigida) en sus propiedades de unión, a las propiedades de unión de la cadena B del receptor aquí descrito.

Además, la substancia que se une y/o que reconoce al receptor en una versión también preferida, está unida a un compuesto con actividad radiactiva, citotóxica o citostática.

El tipo de unión de la substancia con un compuesto con actividad radiactiva, citotóxico o citostático es en esta versión dependiente de la substancia y del compuesto. De preferencia son ambos por ejemplo péptidos o proteínas. En este caso la unión tiene lugar de preferencia mediante uno o varios enlaces peptídicos y/o puentes de disulfuro.

Ejemplos de substancias radioinmunológicas son los anticuerpos monoclonales (mAb) o las citocinas, los cuales están marcados con substancias radiactivas. Igualmente se refiere a una versión preferida la unión de las correspondientes substancias con lectinas, toxinas o toxoides, de preferencia a partir de bacterias (p. ej., toxoide del tétanos, toxina del tétanos, toxina de la difteria, toxina del cólera, exotoxina de Pseudomonas, toxoide de Pseudomonas, toxina Pertussis, toxoide Pertussis, exotoxina de Clostridium o toxoide de Clostridium, o bien a partir de vegetales (RIPs tipo I como saporina o gelonina o RIPs tipo II como ricina ó la cadena A de RIPs tipo II ó una cadena A RIPs tipo I homóloga de RIPs tipo II). Igualmente están comprendidas otras moléculas activas de bajo peso molecular, radiactivas, citotóxicas o citostáticas ("moléculas pequeñas") y otras, como las macromoléculas descritas más arriba.

Con el término "macromoléculas" se entiende moléculas con una alta complejidad molecular o un alto peso molecular. De preferencia, éstas son biomoléculas, como p. ej., biopolímeros, en particular proteínas, oligo o polipéptidos pero también ADN, ARN, oligo o polinucleótidos, grupos prostéticos, lípidos, oligo y polisacáridos, así como sus modificaciones, así como también moléculas sintéticas. Las proteínas comprenden de preferencia también proteínas de fusión. El término "péptido o proteína" abarca los péptidos o proteínas tanto naturales como sintéticas. Ejemplos de proteínas naturales son entre otros, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, los cuales se unen a sus ligandos específicos, ligandos peptídicos que con sus receptores específicos o dominios peptídicos, los cuales interreaccionan con substratos específicos incluidos proteínas y coenzimas, y otros péptidos o enzimas, etc. Igualmente están comprendidos por consiguiente formas obtenidas recombinantemente de las proteínas o péptidos antes citados. Los péptidos naturales comprenden correspondientemente, entre otros, fragmentos de las proteínas citadas más arriba, los cuales interreaccionan con ligandos de afinidad específicos. Las proteínas y péptidos sintéticos comprenden para la expresión tanto pseudógenos o fragmentos de los mismos, como también de proteínas o péptidos con una secuencia de aminoácidos accidental.

Con el término "moléculas de bajo peso molecular" se entienden moléculas que son de poca complejidad molecular como las macromoléculas definidas más arriba. En la literatura el término "moléculas pequeñas" ("small molecules") ó moléculas de bajo peso molecular ("low molecular weight molecules") no se emplea de una manera uniforme. En WO 89/03041 y WO 89/03042 se describen moléculas con una masa molecular de hasta 7000 g/mol como moléculas pequeñas. Normalmente se habla de masas moleculares entre 50 y 3000 g/mol, más a menudo entre 75 y 2000 g/mol y la mayor parte de las veces en el margen entre 100 y 1000 g/mol. Ejemplos para el experto figuran en los documentos WO86/02736, WO97/31269, US-A-5928868, US-A-5242902, US-A-5468651, US-A-5547853, US-A-5616562, US-A-5641690, US-A-4956303 y US-A-5928643.

Como ejemplos para dichas moléculas pequeñas pueden mencionarse los oligómeros o también pequeñas moléculas orgánicas, como los oligopéptidos, oligonucleótidos, hidratos de carbono (glicosidos) isoprenoides o estructuras lípidas. En la literatura, la mayor parte de las veces el peso molecular representa la base de la definición de dichas moléculas pequeñas.

En una versión también preferida del empleo según la invención, la substancia que se une al receptor o reconoce al receptor, comprende otro dominio, el cual puede inducir una función inmunológica efectora. El término "función inmunológica efectora" describe en relación con la invención entre otras, las funciones efectoras del sistema inmunológico, las cuales conducen a una eliminación de la célula que lleva el receptor (célula diana). La eliminación es de preferencia una inducción a la muerte programada de células (apoptosis), pero eventualmente también una eliminación necrótica de células diana. Procedimientos in vitro para la detección de la muerte de células son ya conocidos por el experto (véase entre otros, Dulat et al., (2001)).

La inducción de dichas funciones efectoras inmunológicas es de preferencia la inducción de una señal, la cual marca la célula diana para el sistema inmunológico del organismo. De preferencia, la célula diana es reconocida solamente mediante esta inducción del sistema inmunológico. Es igualmente preferido el que mediante esta inducción la célula del sistema inmunológico se reconoce mejor. El reconocimiento o respectivamente el mejor reconocimiento de la célula diana mediante el sistema inmunológico hace posible la terapia de la célula diana.

En una versión preferida, la función efectora inducida inmunológicamente es una función efectora celular.

Ejemplos de funciones efectoras inducidas inmunológicamente son la eliminación de células diana mediante células T efectoras, monocitos o macrófagos. En particular, la función efectora celular comprende las funciones efectoras inducidas por MHC e inducidas por el receptor F_{c}.

En una versión alternativa preferida, la función efectora inmunológicamente inducida es una función efectora humoral.

Ejemplos de funciones efectoras humorales del sistema inmunológico son las reacciones inducidas por los anticuerpos o las reacciones del sistema complementario. Respecto a esto, la inducción es una opsonización de las células diana, una versión preferida de la invención.

Las figuras muestran:

Figura 1 Potenciales estructuras de diferentes receptores de rViscumina y ricina (esquemáticamente)

Representación esquemática de los receptores de la ricina (figura 1A) y rViscumina (figura 1B). La representación resulta de la interpretación de los resultados compendiados de la figura 2 y 3 así como de la figura 4 y 5, a partir de los "TLC Overlay Assays" ("ensayos TLC de capa sobrepuesta"). Gal = galactosa, GlcNAc = N-acetil-glucosamina, Glc = glucosa, Cer = ceramida, Sialic = ácido siálico. En el caso de los receptores de la rViscumina, se trata de gangliósidos con radicales ácido siálico unidos \alpha2-6, situados en los extremos. El reconocimiento de estructuras reconocidas mediante ricina (figura 1A) no tiene lugar mediante la rViscumina.

Figura 2 Ensayo de TLC para la identificación de gan-gliósidos específicos de la rViscumina en diferentes fracciones celulares

Ensayos TLC de capa sobrepuesta, de unión de rViscumina con GSL (A) neutros y gangliósidos (B) de granulocitos humanos. (A) línea a: cromatograma de 15 \mug de GSL neutros (teñidos con orcinol, tintura total del azúcar); línea b: perteneciente al ensayo de capa sobrepuesta. (B) línea a: cromatograma de 15 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos (teñidos con resorcinol, coloración de ácido siálico); línea b: perteneciente al ensayo de capa sobrepuesta.

Figura 3 Ensayo TLC para la especificación de la especificidad de unión de los hidratos de carbono de rViscumina con gangliósidos aislados

(A) Tintura con resorcinol (ejemplo 1); (B) Ensayo TLC de sobrecapa de antisuero anti-IV^{6}nLc4Cer (ejemplo 1); (C) Ensayo TLC de sobrecapa de rViscumina (ejemplo 2); todos los ensayos TLC fueron efectuados con monosialogangliósidos de la serie Neolacto \alpha2-3 y \alpha2-6, sializados, purificados con HPLC. La aplicación es idéntica en los tres cromatogramas: huellas a: 15 \mug de gangliósidos de cerebro humano (HBG); huellas b: 15 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos (HGG); huellas c; 4 \mug IV^{3}nLc4Cer (HGG1); huellas d: 4 \mug VI^{3}nLc6Cer (HGG2); huellas e: 4 \mug IV^{6}nLc4Cer (HGG3); huellas f: 8 \mug VI^{6}nLc6Cer y IV^{6}nLc4Cer.

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Figura 4 Ensayo TLC para la identificación de motivos de unión específicos con la ricina

(A) tintura con orcinol y (B) ensayo TLC de capa sobrepuesta de ricina con GSL neutros. La aplicación es igual en ambos cromatogramas. Huellas a: 10 \mug de GSL neutros de eritrocitos humanos: huellas b: 15 \mug de GSL neutros de granulocitos humanos; huellas c: 20 \mug de GSL neutros de células MDAY-D2.

Figura 5 Ensayo TLC con ricina de la unión con gangliósidos

(A) tintura con orcinol y (B) ensayo TLC de capa sobrepuesta de ricina con gangliósidos. Huellas a: 10 \mug de gangliósidos de cerebro humano (HBG); huellas b: 8 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos (HGG).

Figura 6 Ensayo de citotoxicidad con líneas celulares diferentemente sensibles

Descripción de la actividad biológica de la rViscumina: Se registro la viabilidad de células HL-60 (línea de puntos), células 5637 (líneas con triángulos) y células CHO-K1 (líneas con círculos blancos), frente a la concentración de rViscumina. La viabilidad se representó mediante reacción colorimétrica de WST-1 medida y como % de células vivas en comparación con un control sin tratar. La mitad de la citotoxicidad máxima, la cual corresponde al punto de inflexión de la curva se tomó como magnitud de la medida. Estos valores IC_{50} fueron para HL-60 de 66 pg/ml y para Las células 5637 de 690 pg/ml. Las células CHO-K1 fueron clasificadas, a una concentración de rViscumina medida empleada, de 300 ng/ml, como insensibles frente a la rViscumina.

Figura 7 Correlación semicuantitativa de la sensibilidad frente a la rViscumina con aparición de bandas de gangliósidos específicos de la rViscumina

(A) Tintura con orcinol, y (B) ensayo TLC de capa sobrepuesta de antisuero anti IV^{6}nLc4Cer, con gangliósidos a partir de líneas celulares propagadas in vitro.

(A) Huella a: 7 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos (HGG); huella b: gangliósidos de 1 x 10^{7} células CHO-K1; huella c: gangliósidos de 4 x 10^{7} células 5637: huella d: gangliósidos de 4 x 10^{7} células HL-60; huella e: 10 \mug de gangliósidos de cerebro humano (HBG).

(B) Huella a: 0,134 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos (HGG); huella b: gangliósidos de 1 x 10^{7} células CHO-K1; huella c: gangliósidos de 1 x 10^{7} células 5637: huella d: gangliósidos de 1 x 10^{7} células HL-60; huella e: 10 \mug de gangliósidos de cerebro humano (HBG). La huella a muestra para la identificación del gangliósido específico de la serie Neo-lacto, los dos controles positivos IV^{6}nLc4Cer (ácido graso de 24C, substancia 1) y IV^{6}nLc4Cer (ácido graso de 16C, substancia 2).

Figura 8 Sensibilización de la línea CHO-K1 insensible frente a la rViscumina, mediante previa incubación con gangliósidos específicos

Se añadieron cantidades crecientes de gangliósidos de granulocitos humanos (HGG) en cavidades cubiertas con células CHO-K1, y allí se incubaron durante 48 horas. Las células fueron lavadas, o bien con medio exento de suero (columnas de color gris claro) o con medio que contenía suero (columnas oscuras) y a continuación se trataron con 300 ng/ml de rViscumina durante otras 48 horas. La viabilidad se midió con WST-1 y se expresó como % del control no tratado (sin gangliósidos ni rViscumina).

Figura 9 Ensayo inmunoenzimático de lectina (ELLA) de la rViscumina con GSL neutros y gangliósidos adsorbidos en las placas de microtitulación

Las cantidades de GSL de distintas procedencias corresponden con las columnas de izquierda a derecha:

A) GSL neutros de eritrocitos humanos: 10, 5, 2,5, 1,25 y 0 \mug

B) GSL neutros de granulocitos humanos: 15, 7,5, 3,75, 1,9 y 0 \mug

C) GSL neutros de células MDAY-D2: 20, 10, 5, 2,5, y 0 \mug

D) Gangliósidos de cerebro humano (HBG): 10, 5, 2,5, 1,25 y 0 \mug

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Figura 10 Identificación de anticuerpos específicos contra el antígeno gangliósido empleado para la inmunización

Ensayo de diferentes clones de hibridomas después del aislamiento en la producción de IgM (A) e IgG (B) en el análisis ELISA. El análisis ELISA se ejecutó como se ha descrito en el ejemplo 8. El tiempo de incubación de la solución del substrato se varió (15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120 minutos y 180 minutos). Los clones 33.3, 33.5 y 33.6 muestran un título claro de IgM (A). Un título de IgG no ha podido comprobarse en ninguno de los clones ensayados (B).

Figura 11 Caracterización de los anticuerpos monoclonales gangliósidos tipo neolacto sialilizados anti-\alpha2-6

Ensayo TLC de capa sobrepuesta para la caracterización del motivo de reconocimiento de los clones mAk. Los clones ya representados en la figura 10, como se ha descrito en el ejemplo 2 para la detección de los gangliósidos de granulocitos humanos (4 \mug/huella), los cuales fueron separados sobre las placas DC, fueron investigados para determinar su motivo de reconocimiento. Los clones 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6 muestran idéntico motivo de unión o respectivamente motivo de reconocimiento para la rViscumina.

Figura 12 Otra caracterización de los anticuerpos mono-clonales gangliósidos tipo neolacto sialilizados anti-\alpha2-6

Ensayos TLC de capa sobrepuesta con (A) GSL neutros aislados, de la serie Neolacto de granulocitos humanos (15 \mug por huella), (B) de la serie Globo (de eritrocitos humanos; 10 \mug por huella) así como (C), de la serie Ganglio (de células MDAY-D2; 10 \mug por huella). El proceder experimental está descrito en el ejemplo 9. En cada uno de las tres primeras huellas de la figura 12 A hasta C, se emplearon los clones mAk, 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6. Los controles positivos en las huellas 4 de la figura 12 A-C mostraron cada vez reacciones con anticuerpos específicas contra las estructuras de azúcar situadas en los extremos de los GSL neutros aplicados. En las huellas 5 se ha ensayado un antisuero policlonal de cabra (ver Müthing et al., Glycobiology ("Glicobiología") 12, 485-487. Una actividad cruzada de los clones mAk ensayados en las huellas 1 a 3, puede excluirse.

Figura 13 Detección del reconocimiento del CD75s de la rViscumina sobre las glicoproteínas

Sobre un gel de SDS se aplicaron cada vez, 1 \mug de las correspondientes proteínas en la huella T: transferrina, proteína soluble con radicales Neu5Aca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así como en la huella AF: asialofetuina, (restos de Gal\beta1-4GlcNAc y Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), y a continuación se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. En un procedimiento Western Blot se ensayó a continuación la estructura del CD75s con rViscumina (1 \mug/ml), y a continuación se detectó con el mAk TA5 anti-cadena A y la IgG anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (ver ejemplo 2). M muestra las huellas del marcador. Los pesos moleculares vienen dados en kDa.

Figura 14 Detección del reconocimiento del CD75s de la rViscumina sobre las glicoproteínas

Se aplican cada vez 1 \mug de las correspondientes proteínas en la huella T: transferrina, proteína soluble con radicales Neu5Aca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así como en la huella AF: asialofetuina, radicales (Gal\beta1-4GlcNAc) y Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), en un gel de SDS, y a continuación se transfieren sobre una membrana de celulosa. En un procedimiento de Western Blot se ensayó a continuación, la detección de la estructura del CD75s mediante el mAk 59.33.3 así como el 59.33.5, como se ha descrito en el ejemplo 9.

Los siguientes ejemplos aclaran le invención descrita.

Ejemplo 1 Cromatografía en capa fina para la separación y detección de los glicoesfingolípidos así como para su detección específica

Se obtuvieron GSL neutros a partir de granulocitos humanos, eritrocitos humanos, y células MDAY-D2, y gangliósidos a partir de granulocitos humanos y cerebro humano (figura 2, figura 4, figura 5 y figura 7) ó se emplearon para el análisis muestras purificadas mediante HPLC (figura 3). Las muestras correspondientes fueron separadas sobre una placa cubierta de cromatografía en capa fina (placas HPTLC, 10 x 10 cm, 0,2 mm de grueso de Merck, Darmstadt, # 5633). Se separaron los GSL neutros en el disolvente 1 (cloroformo/metanol/agua, 120/70/17 v/v/v) y los gangliósidos en el disolvente 2 (cloroformo/metanol/agua 120/85/20 v/v/v + 2 mM de CaCl_{2}). Los GSL neutros se tiñeron con orcinol y los gangliósidos se tiñeron o bien con orcinol o bien con resorcinol (Svennerholm, 1956, 1957). Los GSL neutros de granulocitos humanos y las células MDAY-D2 así como también los gangliósidos de granulocitos humanos aparecen sobre las placas DC como bandas dobles.

Para la identificación de los gangliósidos individuales se efectuó un procedimiento inmunológico de tintura según Müthing y Mühlradt (1988) así como Müthing (1998) mediante antisueros específicos. Los gangliósidos de la serie Neolacto \alpha2-6-sializados terminales fueron identificados con un antisuero policlonal anti-IV^{6}nLc4Cer. Para ello se fijó la placa en primer lugar con metacrilato de poliisobutilo (Röhm, Darmstadt). A continuación la placa fue bloqueada en PBS (20 mM de fosfato, 150 mM de Na Cl, pH 7,2) + 1% de BSA (solución A). A continuación el antisuero policlonal más arriba citado se empleó en una dilución 1:1000 en la solución A y a continuación se lavó 3x con solución B (PBS + 0,05% de Tween 20). El antisuero unido se detectó con el antisuero secundario de conejo anti IgY de pollo en una dilución 1:2000 en solución A. A continuación se lavó 3x con solución B y 1x con tampón de glicina (0,1 M de glicina, 1 mM de ZnCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2}, pH 10,4). La detección se efectuó con 0,05% (p/v) de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato en tampón de glicina. Los gangliósidos de control caracterizados con detalle, empleados en los diferentes ensayos TLC, los cuales fueron empleados como material de referencia para la identificación de los gangliósidos específicos para la rViscumina, procedían de diferentes aislados de células sanguíneas humanas o cultivos celulares (Müthing et al., 1994; Müthing y Kemminer, 1996; Schwartz et al., 1985; Müthing y Cacic, 1997).

Ejemplo 2 Ensayo TLC para la detección específica de un GSL neutro o proteínas unidas a hidratos de carbono unidos a gangliósidos, como la ricina y la rViscumina

GSL neutros o gangliósidos separados sobre una placa de cromatografía en capa fina, se lavaron con PBS-Tween 80 (0,1 g/litro de Tween 80 en PBS). A continuación, una solución de proteínas se recubrió con rViscumina o ricina (1 \mug/ml en PBS-T80) y se incubó durante 1 hora. A continuación se lavó con una solución B (ver ejemplo 1) y a continuación se incubó la placa durante 15 minutos en la solución A (ver ejemplo 1). A esto se añadió un reconocimiento de la rViscumina unida mediante el AK TA5 monoclonal (1 \mug/ml en solución A) descrito por Tonevitzky et al., 1995, ó respectivamente un reconocimiento de la ricina unida mediante un antisuero antiricina de conejo de Sigma #R-1254 (dilución 1:200 en la solución A). La detección del anticuerpo unido se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 1 con los dos anticuerpos necesarios cada vez contra la inmunoglobulina de ratón o respectivamente de conejo.

Ejemplo 3 Comparación de la sensibilidad de diferentes líneas celulares a la rViscumina

Cultivo: células CHO-K1 (ATCC CCL-81) y células HL-60 (ATCC CCL-240) fueron cultivadas en una mezcla 1:1 de DMEM y medio F12 de Ham. La línea celular de carcinoma de vejiga 5637 (ATCC HTB-9) fue cultivada en RPMI 1640. Un cultivo de células se efectuó en condiciones estándar como se describe por Möckel et al., 1997. La sensibilidad de las líneas celulares a la rViscumina fue determinada en un ensayo de citotoxicidad in vitro. Se plaquearon 8 x 10^{3} células 5637, 1 x 10^{4} células CHO-K1 y 1,8 x 10^{4} células HL-60 cada vez por cavidad en placas de 96 pocillos (Nunc), y se incubó con concentraciones crecientes de rViscumina en un volumen final de 100 \mulitros durante 72 horas a 37ºC en una atmósfera con el 10% de CO_{2}. Todas las mediciones fueron efectuadas en una determinación séxtuple. Después de 72 horas, para la detección de células vivas se pipetearon 10 \mulitros de WST-1 (Ishiyama et al., 1993; Möckel et al., 1997). Las células se incubaron con sal de colorante durante 4 horas a 37ºC, y a continuación se midieron a 450 nm en el Thermomax de Molecular Devices. La cantidad de colorante es directamente proporcional al número de células vivas. En la figura 6 se muestran las curvas de viabilidad de las diferentes poblaciones de células frente a concentraciones crecientes de rViscumina.

La línea celular HL-60 (línea de puntos) representa una línea celular promieloica humana que reacciona muy sensiblemente a la rViscumina con un valor IC_{50} de 66 pg/ml. En la línea celular del carcinoma de vejiga 5637 (línea de triángulos) se midió un valor IC_{50} de 690 pg/ml, la línea celular de hamster CHO K1 (línea de círculos blancos) no mostró hasta una concentración ensayada de 300 ng/ml ninguna sensibilidad frente a la rViscumina. En la figura 7 pudo correlacionarse la sensibilidad de las diferentes líneas celulares frente a la rViscumina con la aparición del potencial receptor. En la figura 7A se representa un cromatograma en capa fina teñido con orcinol de las fracciones del total de gangliósidos de las correspondientes líneas celulares empleadas. La figura 7B muestra la detección específica inmunológica de los receptores potenciales de la rViscumina con un anti-Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc-R antisuero (ensayo de capa sobrepuesta). En las huellas b, c y d de la figura 7B se aplican cada vez cantidades de gangliósidos del mismo número de células de CHO-K1, 5637 y HL-60. Las células CHO-K1 referidas insensibles a la rViscumina, no muestran en la huella b de la figura 7B ninguna banda específica a la altura del receptor potencial, mientras que la línea celular más sensible (HL-60) con el mismo número de células aplicadas presenta la doble banda más intensa.

Las distintas especificidades observadas en los ensayos TLC de capa sobrepuesta de las lectinas investigadas, permiten deducir el comportamiento de la unión de la ricina y la lectina de muérdago (en particular, la rViscumina) con sus receptores in vivo o respectivamente en cultivos celulares. En los ejemplos se describe que la línea celular CHO-K1 frente a una concentración de rViscumina ensayada de hasta 300 ng/ml es insensible (ver figura 6). Mediante una introducción de gangliósidos específicos para la rViscumina en las membranas de las células CHO-K1 (estructuras Neu5Ac \alpha2-6 Gal), dichas células que son muy insensibles frente a la rViscumina, por el contrario, se sensibilizaron (ver figura 8).

Ejemplo 4 Sensibilización de líneas celulares mediante la preincubación con gangliósidos específicos (ver figura 8)

Se sembraron células CHO-K1 con una densidad celular de 5 x 10^{3} por cavidad en placas de 96 pocillos. Las células se cultivaron durante 24 horas a 37ºC en un medio de cultivo X-Vivo exento de suero (Biowhittaker). A continuación el medio se tiró y se substituyó por medio de cultivo X-Vivo que contenía 0 (control), 25, 50, 100 y 200 \muM de una fracción de gangliósidos de granulocitos humanos. Para la incorporación de los gangliósidos en la membrana de las células CHO-K1, éstas fueron mantenidas a 37ºC durante 48 horas en condiciones de cultivo celular. A continuación las células fueron lavadas intensamente, o bien con X-Vivo sin suero ó bien con X-Vivo conteniendo 5% de FCS. Las células fueron a continuación tratadas con rViscumina (300 ng/ml) durante 48 horas. La viabilidad de las células se cuantificó mediante tintura con WST-1, y se correlacionó con el control no tratado (sin adición ni de rViscumina ni de gangliósidos). Las pruebas se repitieron por triplicado con un volumen final de 100 \mul por cavidad.

Ejemplo 5 Purificación de los gangliósidos de células propagadas in vitro y correlación de la aparición de gangliósidos específicos en líneas celulares y sensibilidad frente a la rViscumina

Representación de la masa celular para el aislamiento subsiguiente de GSL ó respectivamente gangliósidos: se cultivaron células CHO-K1 (ATCC CCL-81) y células HL-60 (ATCC CCL-240) en una mezcla 1:1 de medio DMEM y F12 de Ham. Las células fueron cultivadas en presencia de 50 mg/litro de Gentamicina y 2,5 mg/litro de anfotericina B. Un cultivo de células 5637 se efectuó en frascos de 175 cm^{2}. Se cultivaron células HL-60 y CHO-K1 en un frasco con agitación de 1 litro como se describe en Duvar et al., (1996) ó respectivamente Müthing et al., (1996b). Los ajustes fisiológicos fueron: 37ºC, pH 7,2, desgasificado con oxígeno, velocidad de agitación 40 rpm. Después de alcanzar la densidad celular final, se recogieron las células, se lavaron 2x con PBS y a continuación se sometieron a una extracción con cloroformo/metanol (ver ejemplo 1). La línea celular de carcinoma de vejiga 5637 (ATCC HTB-9) se cultivó en RPMI 1640. Los gangliósidos fueron aislados según un procedimiento estándar empleando cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-sefarosa CL-6B, como se describe por Ledeen y Yu (1982), Müthing et al. (1987) ó Duvar et al., (1997). Para la saponificación de los fosfolípidos se incubaron los gangliósidos durante 1 hora a 37ºC en NaOH 1 N. A continuación, la fracción de gangliósidos se neutralizó con ácido acético y se dializó. Se añadió otro paso de purificación mediante cromatografía de adsorción en "Iatrobeads" 6RS-8060 (Macherey & Nagel, Düren, Alemania) (Ueno et al., 1978). En la separación de la fracción de gangliósidos de los lisados celulares se partió siempre de un número de células aproximadamente uniforme. Por consiguiente fue posible una declaración semicuantitativa para la presencia del gangliósido específico. La detección tuvo lugar inmunológicamente, como se ha descrito en el ejemplo 1, con un antisuero policlonal anti-IV^{6}nLc4Cer.

Ejemplo 6 Purificación de gangliósidos sialilizados con terminal \alpha2-3- y \alpha2-6 de la serie neolacto

Una columna rellena de Fractogel EMD TMAE-650-S (MERCK, Darmstadt) se carga con los gangliósidos de granulocitos humanos (HGG). Los gangliósidos unidos a TMAE se eluyen con un gradiente lineal de acetato de amonio, se reunen y se eliminan las sales. Se obtuvieron cuatro fracciones con terminales sialilizados \alpha2-3 (HGG1 y HGG2) y terminales sialilizados \alpha2-6 monosialogangliósidos del tipo neolacto (HGG3 y HGG4). Todos los gangliósidos fueron separados mediante cromatograsmas en capa fina en forma de bandas dobles. Las diferencias tienen como base la unidad ceramida, la cual en el caso de la banda superior tiene esterificado un ácido graso de 24 carbonos y en el caso de la banda inferior un ácido graso de 16 carbonos. Las estructuras de todos los gangliósidos obtenidos mediante el método fueron ya caracterizados (Müthing et al., 1993, Müthing et al., 1996, Metelmann et al., 2000). Los gangliósidos purificados fueron separados en la figura 3 y fueron referidos a una exacta especificación de la especificidad de unión a los hidratos de carbono de la rViscumina.

Ejemplo 7 Ensayo inmunoenzimático de la lectina (ELLA)

El análisis ELLA se efectuó en placas correspondientemente recubiertas con GSL neutro o gangliósidos (NUNC MaxiSorp F96, Wiesbaden) a temperatura ambiente (RT). Las cavidades se llenaron con los GSL correspondientes en 100 \mul de metanol. A partir de una solución madre se prepararon diluciones 1:2. Estas contenían los siguientes GSL: GSL neutros de eritrocitos humanos: 10, 5, 2,5 y 1,25 \mug; GSL neutros de granulocitos humanos: 15, 7,5, 3,75 y 1,9 \mug; GSL neutros de células MDAY-D2: 20, 10, 5 y 2,5 \mug; gangliósidos de cerebro humano (HBG): 10, 5, 2,5 y 1,25 \mug; gangliósidos de granulocitos humanos (HGG): 10, 5, 2,5 y 1,25 \mug. A continuación el metanol fue evaporado en una atmósfera seca (45 minutos a 37ºC). Todos los demás pasos se efectuaron con el ensayo TLC de capa sobrepuesta como se ha descrito en el ejemplo 2. Todas las incubaciones se efectuaron con un volumen de 100 \mul. Las placas recubiertas con GSL se incubaron durante 15 minutos con PBS-Tween 80® (0,01 mg/ml) y a continuación con 1 \mug de rViscumina (disuelta en PBS-Twenn 80) durante 1 hora. A continuación las placas se lavaron con PBS-Tween 20® (0,01 mg/ml) y a continuación se incubaron 15 minutos en PBS. A continuación se incubaron las muestras con anticuerpos monoclonales TA5 anti ML-1A de ratón (1 \mug/ml en PBS) durante 1 hora. Después de nuevos lavados de 3 veces con PBS-Tween 20® se incuban con un IgG anti-ratón (copulado con fosfatasa alcalina) en una dilución 1:2000 en PBS (1 hora). Después de nuevos lavados de 3 veces con PBS-Tween 20® tiene lugar la detección colorimétrica con la reacción del substrato 4-nitrofenilfosfato disódico x 6 H_{2}O (16 mM en tampón 0,1 M de glicina, pH 10,4). La placa se midió a 405 nm después de 20 minutos de incubación a 25ºC, en un lector de placas de microtitulación.

Contra lo esperado, solamente se pudo encontrar una unión de la rViscumina en aquellos glicoesfingolípidos (GSL), que presentaban una galactosa situada en el extremo de Neu5Ac unida \alpha2-6 al GSL de la serie Neolacto (fracción HGG de granulocitos humanos). Todos los otros GSL neutros de diferentes procedencias (granulocitos y eritrocitos humanos, células MDAY-D2), no mostraron en ningún caso ninguna unión, incluso en las más altas concentraciones empleadas, con radicales de galactosa situados en el extremo así como con gangliósidos del cerebro humano de la serie Ganglio.

Ejemplo 8 Obtención de anticuerpos monoclonales contra gangliósidos tipo Neolacto sializados \alpha2-6

Los gangliósidos del tipo Neolacto sializados \alpha2-6 se aislaron de leucocitos (obtenidos por el método "buffy coat" a partir de sangre entera). La purificación de los gangliósidos tuvo lugar como se ha descrito en el ejemplo 5. En otro desarrollo sirvieron estos gangliósidos del tipo Neolacto \alpha2-6 sializados, como antígenos para la inmunización de 2 x 3 ratones. Puesto que los antígenos solos debido a su pequeño tamaño no actúan como inmunógenos, se administran a los ratones juntamente con los llamados haptenos. A este respecto se efectúan paralelamente dos procedimientos. En el procedimiento 1 se empleó metil-BSA como hapteno en una concentración de 1 mg/ml. Los tres ratones recibieron distintas cantidades de antígeno (5, 10 y 20 microgramos). Los ratones fueron inmunizados en períodos conocidos y en total suplementados otras 2 veces en un período de 10 días. En el procedimiento 2 se empleó una mezcla de liposomas y lipopolisacárido (LPS) como hapteno. También aquí fueron administradas a los tres ratones diferentes cantidades de antígeno (5, 10 y 20 microgramos) cada vez en tres etapas de aplicaciones en períodos de 10 días.

En el total de los seis ratones, que fueron inmunizados mediante los dos procedimientos, pudieron determinarse en la sangre de tres ratones títulos positivos frente al antígeno. Las mezclas con los haptenos metil-BSA fueron negativas. Las mezclas con el hapteno lipopolisacárido en liposomas fueron todas positivas, independientemente de la dosis de antígeno administrada. Un ratón fue sacrificado y las células del bazo se aprovecharon para la fusión. Los sobrenadantes de las mezclas de fusión se investigaron con un ensayo DC de capa sobrepuesta (como se ha descrito en los ejemplos 1 y 2) y un análisis ELISA. A este respecto, la placa de microtitulación, como se ha descrito en el ejemplo 7, se recubrió con 1 \mug de gangliósidos HGG (gangliósidos de granulocitos humanos), en 50 \mul de metanol. Se añadieron 50 \mul de las correspondientes muestras de plasma o respectivamente sobrenadantes de las mezclas de fusión sin diluir sobre las placas recubiertas y se incubaron durante 60 minutos a 25ºC. A continuación, se lavaron 3 x con PBS-T. Una detección de IgM ó respectivamente IgG se efectuó con un anticuerpo IgG anti-ratón o respectivamente con un IgM anti-ratón, el cual se marcó con fosfatasa alcalina. Se efectuó una reacción del substrato p-NPP como se ha descrito en el ejemplo 7. Mezclas de fusión con título positivo fueron a continuación separadas a nivel de clones. En la figura 10A se muestra una detección de tre clones positivos de IgM (59.33.3, 59.33.5 así como 59.33.6). Todos los clones fueron investigados también respecto a la producción de IGG, pero sin embargo tampoco mostraron ninguna reacción positiva a la IgG (figura 10B).

Figura 9 Caracterización de anticuerpos monoclonales gangliósidos tipo Neolacto sializados anti-\alpha2-6

Los gangliósidos del tipo Neolacto sializados \alpha2-6 llevan siempre en su extremo final un Neu5Ac\alpha2-6-Gal. Otro motivo descrito también en el curso de esta invención comprende la estructura de gangliósido Neu5Ac\alpha2-6-Gal\beta1-4GlcNAc-R; en donde "R" representa un radical. Este motivo está descrito en la literatura como CD75s (Schwartz-Albiez (2000), J. Biol. Regul. Homeost, Agents 14, 284-285). En la figura 11 se representaron los ensayos DC de capa sobrepuesta con diferentes clones IgM, los cuales como se ha descrito en el ejemplo 8 fueron analizados con un análisis ELISA. Mediante cromatografía en capa fina fueron separados los gangliósidos de los granulocitos humanos (HGG). El ensayo se efectúa como se ha descrito en el ejemplo 2. Se separaron aquí 4 \mug de HGG. La detección de los anti-CD75s mAk unidos a la placa se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 8. Los clones 59.33.3, 59.33.5 así como 59.33.6 mostraron también en este ensayo una señal positiva. Los tres clones reconocieron los mismos gangliósidos (IV^{6}nLC4 así como IV^{6}nLC6) y por lo tanto tuvieron idénticos comportamientos a la unión que la rViscumina (figura 2Bb). Una reactividad cruzada eventualmente esperada de los tres anticuerpos frente a la región original de las estructuras de azúcar, pudo deducirse experimentalmente mediante el empleo de GSL neutros aislados a partir de, o bien de la serie Neolacto de granulocitos humanos (15 \mug por huella; figura 12A), o bien de la serie Globo (de eritrocitos humanos; 10 \mug por huella; en la figura 12B), así como de la serie Ganglio (células MDAY-D2; 10 \mug por huella; en la figura 12 C). El comportamiento experimental fue idéntico al descrito más arriba. En cada una de las tres primeras huellas de la figura 12 A a la C no pudo ser detectada ninguna señal con el empleo de los clones mAk 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6. La falta de los ácidos siálicos unidos \alpha2-6 situados en el extremo conduce en todos los tres casos a que se suprima una señal específica. Los controles positivos en las huellas 4 de la figura 12 A-C reflejan las reacciones con anticuerpos específicos contra las estructuras de azúcar situadas cada vez en el extremo de los GSL neutros aplicados. En las huellas 5 ha sido arrastrado un antisuero policlonal, de cabra (ver Müthing (2002) Glicobiología 12, 485-497). Este antisuero el cual originariamente fue obtenido contra gangliósidos del tipo Neolacto sialilizados \alpha2-6, muestra contra muchos de los antígenos arrastrados una reactividad cruzada, lo cual en particular en un empleo de este antisuero en una investigación de material de pacientes podía conducir a señales falsamente positivas. Tanto más importantes son los resultados con los anticuerpos monoclonales representados en las huellas 1 a 3, 59.33.3, 59.33.5 así como 59.33.6 a valorar, en los cuales dichas actividades cruzadas no deseadas no aparecieron. El clon mAk 59.33.3 fue depositado el 20 de Diciembre de 2002 con el número de acceso DSM ACC2580 en la DSMZ en Brunswick de acuerdo con el Tratado de Budapest.

Ejemplo 10 Detección de las glicoproteínas de los CD75s

Los anticuerpos monoclonales 59.33.3 y 59.33.5 (figura 14) así como la propia rViscumina (figura 13) fueron investigados acerca de su aplicabilidad para la detección de motivos CD75 sobre las glicoproteínas. Se aplicó cada vez, 1 \mug de la correspondiente proteína, en la huella T: transferina, proteína soluble con radicales NeuSAca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así como en la huella AF: asialofetuina, radicales (Gal\beta1-4GlcNAc y radicales Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), en gel SDS y a continuación se transfirieron sobre nitrocelulosa. Se ensayaron seguidamente con un procedimiento Western Blot, las estructuras CD75s ó bien con rViscumina (1 \mug/ml) y a continuación, se detectaron con el mAk TA5 anti-cadena A y el anti-ratón IgG (ver ejemplo 2) marcado con fosfatasa alcalina.

En el caso del ensayo de la unión/reconocimiento del epitopo CD75s mediante el mAk 59.33.3 así como el 59.33.5, se procedió después de la transferencia de las proteínas sobre la nitrocelulosa, como se ha descrito en el ejemplo 9. La transferrina se reconoció claramente a partir de los mAks 59.33.3 y 59.33.5 así como la rViscumina.

Los dos clones de los anticuerpos 59.33.3 y 59.33.5 reconocen los motivos CD75s sobre la glicoproteína transferrina como epitopos.

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<110> Viscum AG

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<120> Procedimiento para la detemiunaciuón de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago

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<130> F 1827 PCT

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<160> 6

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<170> Versión 3.1 de PatentIn

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<210> 1

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<211> 855

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<212> DNA

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<213> Viscum album

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 285

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<212> PRT

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<213> Viscum album

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<400> 2

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3

4

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<210> 3

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<211> 789

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<212> DNA

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<213> Viscum album

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<400> 3

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5

6

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<210> 4

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<211> 263

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<212> PRT

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<213> Viscum album

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<400> 4

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7

8

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<210> 5

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<211> 1958

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<212> DNA

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<213> Viscum album

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<400> 5

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9

10

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<210> 6

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<211> 647

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<212> PRT

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<213> Viscum album

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<400> 6

11

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Claims (18)

1. Procedimiento in vitro para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo para la lectina de muérdago o para las cadenas individuales de la lectina de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor situado en la membrana, en donde el receptor se caracteriza por un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), situado en el extremo, el cual está unido mediante una unión glicosídica \alpha2-6 con una galactosa (Gal).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el receptor comprende un gangliósido el cual después del ácido N-acetil-neuramínico unido \alpha2-6 a la galactosa, comprende por lo menos una N-acetil-glucosamina (GlcNAc).

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en donde el receptor comprende un gangliósido con la estructura Neu5Ac\alpha2-6-Gal-[Gal/GlcNAc]_{x}-Cer.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el receptor comprende un gangliósido con la estructura Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el receptor comprende un gangliósido con la estructura Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer ó bien un gangliósido con la estructura Neu5Ac\alpha2-6-Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el receptor está situado en la membrana.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la lectina de muérdago es la lectina de muérdago recombinante/rViscumina.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en donde la lectina de muérdago recombinante comprende una secuencia de aminoácidos, la cual está codificada mediante un polinucleótido como se representa en SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 ó SEQ ID Nr: 5.

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en donde la lectina de muérdago recombinante comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos, como se representa en SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 ó SEQ ID Nr: 6, ó un fragmento funcional del mismo.

10. Composición para diagnóstico, que comprende una substancia, que reconoce o se une específicamente a un receptor como se define en las reivindicaciones 1 a 9, y se selecciona del grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y aptámeros, en los cuales

(i)

la substancia detectable está marcada; o bien

(ii)

el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual puede obtenerse a partir de una línea celular de hibridomas, la cual fue depositada el 20 de Diciembre de 20002 en la DSMZ de Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580.

11. Empleo de una substancia la cual reconoce o se une específicamente a un receptor, como se describe en las reivindicaciones 1 a 9, y se selecciona a partir del grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y aptámeros, para la preparación de una composición para diagnóstico para la detección de un receptor funcional de la lectina de muérdago.

12. Empleo según la reivindicación 11, en donde la substancia detectable está marcada.

13. Empleo según la reivindicación 11 ó 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. Empleo según la reivindicación 13, en donde el anticuerpo monoclonal puede obtenerse a partir de una línea de hibridomas, depositada el 20 de Diciembre de 2002 en DSMZ de Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580.

15. Empleo según una de las reivindicaciones 11 a 14, en donde la composición para diagnóstico para la detección del receptor, como está definida en una de las reivindicaciones 1 a 8, se emplea sobre las células.

16. Empleo según la reivindicación 15, en donde las células son células tumorales.

17. Empleo según la reivindicación 15 ó 16, en donde las células proceden de un material de biopsia.

18. Empleo según la reivindicación 17 ó 18, en donde las células se aíslan a partir de muestras de sangre.