ES2287353T3 - Procedimiento para la determinacion de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muerdago. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para la determinación de la capacidad de respuesta de un individuo para la lectina de muérdago o para las cadenas individuales de la lectina de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor situado en la membrana, en donde el receptor se caracteriza por un ácido N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), situado en el extremo, el cual está unido mediante una unión glicosídica a2-6 con una galactosa (Gal).
Description
Procedimiento para la determinación de la
capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la determinación de la capacidad de respuesta de
un individuo a la lectina de muérdago o a una cadena individual de
lectina de muérdago, en el cual la expresión de un receptor
específico situado en la membrana, para la lectina de muérdago, es
característica de una correspondiente capacidad de respuesta.
Diferentes documentos se citan en la presente
descripción. El contenido dado a conocer de los citados documentos
(incluidas todas las descripciones, datos, etc., de los
fabricantes), forma parte como referencia de la presente
descripción.
La lectina de muérdago es una proteína
inactivadora de los ribosomas del tipo II, emparentada con la ricina
(RIP), la cual está constituida por dos cadenas de proteína
(Barbieri et al., 1993). La cadena A, la cual posee una
actividad enzimática
ARNr-N-glicosidasa, y la cadena B la
cual presenta una actividad de unión con los hidratos de carbono.
La rViscumina recombinante constituida en E. coli es ya
conocida por el experto (patente EP 0 751 221 B1). En particular,
la rViscumina obtenida en la E. coli se desarrolla
clínicamente como monosubstancia. La rViscumina no corresponde
exactamente en su estructura primaria a ninguna de las
ML-I, ML-II ó ML-III
que se encuentran en la planta del muérdago. Se desprende de ello
que junto a la secuencia descrita de rViscumina existen todavía
otras obtenidas mediante mutaciones puntuales en las cuales el gen
primitivo da variantes modificadas de lectina de muérdago, las
cuales pueden diferenciarse fácilmente por su estructura primaria.
La rViscumina podría ser considerada como una variante de la lectina
de muérdago primitiva, y comprenderse como una mezcla de las
secuencias de ML-I, ML-II ó
ML-III.
Las actividades de ambas cadenas de la lectina
de muérdago son necesarias para la actividad citotóxica/ citostática
de la proteína. A este respecto, le corresponde al primer paso, a
saber la unión de la molécula a la superficie de la célula, una
importancia decisiva.
Como a la ricina, se atribuye también a la
lectina de muérdago (y a la rViscumina recombinante obtenida en el
E. Coli; Eck et al., 1999a, Eck et al., 1999b)
una especificidad a la galactosa/lactosa (Olsnes et al.,
1982; Lee et al., 1992; Gilleron et al., 1998). El
tipo de enlace glicosídico de la galactosa situada en el extremo y
el subsiguiente azúcar fue descrita hasta ahora como de poca
importancia para la especificidad de la lectina (Lee et al.,
1994; Gupta et al.,
1996).
1996).
Se han descrito diferentes lectinas de muérdago
(ML-I, ML-II y
ML-III) en la literatura, las cuales se diferencian
por su especificidad a los hidratos de carbono (Franz, 1986). A este
respecto se ha discutido que la especificidad de la
galactosa/lactosa (ML-I) en una forma mezcla de
galactosa/lactosa y
N-acetil-galactosamina
(ML-II), cambia a una lectina de muérdago, la cual
se une más fuertemente a la
N-acetil-galactosamina
(ML-III). La rViscumina muestra una actividad de
unión a la galactosa/lactosa detectable por distintos
procedimientos análogos al análisis ELISA (Eck et al.,
1999b). Hasta ahora, se han descrito sólo muy rudimentariamente
otras actividades de los hidratos de carbono para las lectinas de
muérdago, y en parte también lo contrario. Así, observaron p. ej.,
Wu et al. (1995a y 1995b), que la capacidad de la
ML-I ó bien el ácido
\alpha1-glicoproteína humana ó fetuína para la
unión, se reduce significativamente, cuando se emplean grupos
pendientes desializados. Por el contrario, estos autores
encontraron un aumento de la unión y una completa precipitación
cuando se empleó en el ensayo la siaologlicoproteína a partir de
ratas en forma desializada. Las conclusiones deducidas por Wu et
al., no han sido sin embargo interpretadas a causa de los
resultados contradictorios de las proteínas empleadas llevando
ácidos siálicos o respectivamente proteínas desializadas. También se
comprueba que la glicosilación de las proteínas no es homogénea. Un
proceso de desialización tiene lugar químicamente y varía según las
instrucciones del fabricante. Así, en una muestra desializada puede
haber todavía un resto de proteínas que llevan ácido siálico
situado en el extremo, el cual falsea los resultados comunicados.
Sin embargo, fue discutida una especificidad de la
ML-I para el ácido siálico puesto que los autores
han conseguido limitar el efecto recíproco
proteína-lectina de muérdago cuando se empleó la
mezcla de oligosacáridos
Neu5Ac\alpha2-3/Neu5Ac\alpha2-6Gal-\beta1-4Glc
como competidor. En el resumen tabular de los resultados de la
competición de un experimento de precipitación (técnica de
microprecipitina) sorprende sin embargo que en la misma ejecución
del ensayo puede ser inhibida una precipitación de
ML-I por diversas glicoproteínas (glicoproteina de
ácido \alpha-1 humana; fetuína,
Asialo-RSL) tanto mediante lactosa como también
mediante la mezcla
Neu5Ac\alpha2-3/Neu5Ac\alpha2-6Gal-\beta1-4Glc
así como mediante Gal\beta1-4GlcNAc en
aproximadamente las mismas concentraciones. Una especificidad de la
ML-I para el ácido siálico no puede deducirse
claramente de estos datos, no en último lugar, porque los
resultados con Asialo-RSL y con fetuína con ácido
siálico situado en el extremo, en cuanto a la tendencia, son
absolutamente iguales.
Aproximadamente al mismo tiempo, pudo mostrarse
por Debray et al., (1994), que la afinidad de la
ML-I inmovilizada en sefarosa 4B frente a, o bien
O-3 ó bien O-6 la lactosa sializada
o respectivamente los
Sialo-N-glicosilpéptidos en
comparación con los oligosacáridos tipo
N-acetillactosamina y los glicopéptidos, aumentaba
ligeramente. A este respecto, Debray et al., (1994)
emplearon oligosacáridos y glicopéptidos, los cuales obtuvieron
parcialmente a partir de fuentes humanas (p. ej., orina,
transferrina de suero humano, glicoproteína de ácido
\alpha-1 humana). Debray et al.,
efectuaron investigaciones mediante una columna en la cual
inmovilizaron la lectina de muérdago-I (sefarosa
ML-I). En la clasificación de los sacáridos
ensayados se distinguen tres fracciones. La fracción 1 (FNR) no
mostraba ninguna interacción con la lectina de muérdago y eluía en
PBS en el volumen de elución de la columna. Una segunda fracción
(FR) eluía temporalmente con algo de retraso pero siempre con
empleo de PBS. Los sacáridos de estas dos fracciones se diferencian
en correspondencia sólo muy poco en su capacidad de interaccionar
con la lectina inmovilizada sobre la columna. La fracción que
propiamente se unió (FE) pudo ser eluída solamente con galactosa
150 mM en tampón PBS. Los resultados no fueron concluyentes. Así,
los autores discutieron el retraso de la elución de FNR a FR, cuando
en los radicales de galactosa situados en el extremo se unieron a
un ácido siálico \alpha2-6 (comparar el sacárido
16 (FR) y 17 (FNR)). Sin embargo, un doble marcado con ácido
siálico, como puede verse en el sacárido 15(FR), no conduce a
que la substancia se una con más fuerza a la ML-I
en la columna. Sin embargo es difícil para el experto, discutir
explícitamente sobre los retrasos de FNR a FR. Así es muy probable
que el ligero retraso (FR) por acciones recíprocas inespecíficas
(p. ej., acciones recíprocas hidrófobas) sea debida a la proteína
unida a la columna, y no tenga que ver nada con la especificidad de
la lectina de muérdago. Solamente dos de las estructuras ensayadas
eluyeron después del lavado de la columna con tampón PBS + 150 mM
de NaCl + 150 mM de galactosa (FE). Estas dos estructuras fueron
aisladas de la tiroglobulina bovina o respectivamente del ovomucoide
de tórtolas. Contrariamente a todas las otras estructuras, las
empleadas por los autores contenían de preferencia la estructura
Gal(\beta1-4)GlcNAc, estando estas
estructuras provistas de dos radicales galactosa situados en el
extremo, los cuales están unidos o bien \alpha1-4
ó bien \alpha1-3 con la segunda galactosa.
Lee et al., (1994) describen la
importancia del segundo radical de azúcar, en el reconocimiento de
la ML-I. Subdividieron el reconocimiento de las
estructuras mediante ML-I en cuatro grupos y
pudieron mostrar que las estructuras GlcNAc perjudicaban
fuertemente en la segunda posición el reconocimiento del azúcar. La
afinidad más fuerte de la ML-I la encontraron en un
sacárido con radicales de azúcar
\beta-D-gal-(1-2)-\beta-D-gal
situados en los extremos. También galactosas unidas al
\beta1-3 mostraron de forma similar buenas
especificidades. Las galactosas unidas \beta1-4
no fueron ensayadas por Lee et al., (1994), pero de los
trabajos de Debray et al., (1994) se puede concluir que
también estos debían tener una alta especificidad a la
ML-I.
En la valoración de los trabajos de Debray y
col., (1994) debe tenerse en cuenta sin embargo, que las
investigaciones fueron efectuadas con lectina de muérdago, la cual
fue inmovilizada sobre una columna. Las acciones recíprocas
observadas de los sacáridos con la lectina inmovilizada constituyen
un sistema experimental no fisiológico. Una conclusión de la acción
recíproca de la lectina de muérdago disuelta, o respectivamente de
la rViscumina en solución con un receptor no es por consiguiente
directamente posible.
Los datos aquí representados por Lee et
al., (1994), Debray et al., (1994) y Wu et al.,
(1995) para la especificidad de la lectina de muérdago son en si
mismos contradictorias y pueden no aceptarse como demostración
concluyente para una especificidad de la lectina de muérdago frente
a Neu5Ac. En particular, es problemático que los datos no se
efectúen bajo unas condiciones de ensayo definidas. En esencia se
refiere esto a la calidad de las proteínas empleadas, las cuales
técnicamente consideradas, no muestran nunca una estructura
homogénea como los hidratos de carbono.
Sobre la base de las observaciones de Lee et
al., (1992), Galalina et al. (1997), desarrollaron un
sistema experimental en el cual la lectina de muérdago fue copulada
con un conjugado de neoglico estructuralmente definido. En este
sistema se investigó la potencia competitiva de los oligosacáridos
sintéticos para la supresión de la unión de la lectina de muérdago.
Los resultados obtenidos con ayuda de este sistema son sin embargo,
igualmente heterogéneos. Como era de esperar se mostró una potencia
competitiva de la lactosa. La competición con la
N-acetillactosamina conduce a resultados semejantes.
Además, se investigaron también isómeros de la sialillactosa
existentes en la naturaleza. El isómero \alpha2-3
sializado poseía una actividad competitiva mayor que el isómero
\alpha2-5 sializado, la cual sin embargo está
claramente por debajo de la de la lactosa o de la
N-acetillactosamina. Además indicaron los autores
que el ácido N-acetilneuramínico solo no tiene
ninguna actividad inhibitoria.
En el análisis de los trabajos basados en los
estudios de competición llama la atención que las glicoproteínas
investigadas que se encuentran en la naturaleza comprenden solamente
proteínas solubles. Las glicoproteínas de la membrana no se
investigaron en los experimentos descritos.
La lectina de muérdago, pero también p. ej.,
otras proteínas específicas de la lactosa/galactosa como la ricina
o galectina están descritas como proteínas que se unen a la
asialofetuína. Esta propiedad puede aprovecharse también para una
cuantificación (Vang et al., 1986). Gupta et al.,
(1996) pudieron describir algo más exactamente la acción recíproca
de las proteínas ricina, galectina o lectina de muérdago (aquí
llamada Viscum album-aglutinina). Descubrieron que las tres
proteínas formaban complejos definidos con la asialofetuína. El o
los receptores, responsables de la unión de la lectina de muérdago
o de la ricina con las células diana, todavía no son conocidos.
En 1982 fue identificado el receptor para la
toxina del cólera sobre células Balb/c 3T3 (Critchley et al.,
1982). Se trata en este caso del gangliósido GM1. A partir de este
trabajo se ensayó también la búsqueda de los receptores de otras
toxinas/lectinas en este terreno. A este respecto, se pudo mostrar
para la ricina y la aglutinina del cacahuete que en el caso de los
receptores sobre linfocitos humanos se trata de glicoproteínas
mientras que la aglutinina del ricino y la aglutinina de las habas
de soja, se unen aproximadamente con las mismas partes con las
glicoproteínas y con los gangliósidos (Turpin et al., 1984).
En investigaciones con membranas modelo en las que se incorporó el
monosialogangliósido GM1 (con galactosa terminal), fueron observadas
solamente muy inespecíficas acciones recíprocas con las dos
proteínas ricina y lectina de muérdago, las cuales no hacían
posible ninguna clara diferencia de la permeabilidad de las
membranas en función del RIPs tipo II añadido (Pohl et al.,
1998a). Además Pohl et al., (1998b) observaron que tanto la
ricina como también la lectina de muérdago estaban en situación de
inducir fusiones vesícula-vesícula. El modelo de la
inducción de la fusión no tiene sin embargo, ninguna relevancia
decisiva para la recepción de la lectina de muérdago o ricina in
vivo, puesto que las fusiones de membranas no son responsables
de la recepción de estas proteínas por una célula diana. Ya en 1990
mostraron Tonevitsky et al., que el gangliósido GM1 no podía
ser visto como el receptor. Utsumi et al., (1987) informaron
acerca de una unión de la ricina en liposomas que contenían GM1,
los cuales mediante la adición del competidor lactosa no pudieron
ser observados.
Samal et al., (1995) observaron que la
lectina de muérdago igualmente que la ricina agregaba las plaquetas
de la sangre. Sin embargo, la lectina de muérdago no agregó según
este estudio ningún liposoma aislado de estas plaquetas de la
sangre, los cuales si son agregados por la ricina. Un potencial
receptor para estas lectinas no fue cuestionado por los
autores.
En 1994 se observó que la estructura de la
superficie modificada de células degeneradas podía aprovecharse
(Gottstein et al., 1994; Usui & Hakomori, 1994). Por
ejemplo, fueron propuestas inmunotoxinas para una terapia, las
cuales se componen de anticuerpos monoclonales contra estructuras
específicas de glicolípidos o respectivamente estructuras de
glicoproteínas, en lo posible solamente sobre las células
degeneradas, y los componentes tóxicos de la ricina (cadena A de la
ricina) (Gottstein et al., 1994; Usui & Hakomori, 1994).
Este modelo aclara la importancia de un vehículo específico para la
célula, el cual hace posible un transporte de una toxina a una
célula diana.
En el caso de la ricina, la cadena B de unión
con los hidratos de carbono, no satisface las exigencias de un tal
vehículo, puesto que para la ricina no se ha identificado claramente
una unión con uno de ellos sino que se ha descrito un receptor en
continuo movimiento. Esta observación explica los efectos
secundarios descritos en una terapia de pacientes con ricina.
Puesto que, contrariamente a la ricina, la
lectina de muérdago parece unirse a un receptor, lo cual sucede de
forma que dicho receptor no está moviéndose continuamente, fue
propuesta la cadena B como posible vehículo para un transporte de
toxinas fusionadas. Las correspondientes proteínas de fusión de la
cadena B de la rViscumina con compuestos citotóxicos fueron
descritos en la solicitud de patente EP 1012256 A1. Para un
eficiente y preciso empleo de las substancias terapéuticas sería
por este motivo deseable identificar al receptor, al cual se une la
cadena B de la lectina de muérdago o respectivamente de la
rViscumina obtenida recombinantemente.
El empleo de los extractos de lectina de
muérdago (extracto de Viscum album) como medicamento, ya es
conocido desde hace siglos. Como componentes activos de estos
extractos se identificaron componentes designados como lectinas.
Estas lectinas son albúminas que reconocen muy específicamente las
estructuras de hidratos de carbono, también en forma unida a
lípidos o proteínas, y se unen con las mismas. La lectina de
muérdago que fue caracterizada como proteína de clase II
inactivadora de ribosomas, actúa farmacológicamente solamente
mediante el juego combinado de sus dos subunidades. La cadena B de
la lectina de muérdago, la cual posee motivos secuenciales con
propiedades específicas de unión a hidratos de carbono, es
responsable del transporte de la proteína a la célula diana. En la
célula diana la subunidad A bloquea a continuación, mediante su
actividad enzimática
rARN-N-glicosidasa, el metabolismo
ribosómico de las células y ocasiona de esta manera la muerte
programada de las células (apoptosis).
En la patente europea EP 0 602 686 B1, se
describió la acción de la planta de muérdago y del extracto obtenido
a partir de la misma, para el tratamiento de las enfermedades
descritas. Desde el principio de este siglo se emplean preparados
de muérdago para la terapia del cáncer con diferente éxito (Bocci,
1993; Gabius et al., 1994; Gabius & Gabius, 1994;
Ganguly & Das, 1994). Hajto et al., (1989, 1990) pudieron
mostrar que los efectos terapéuticos eran debidos en particular a
la llamada lectina de muérdago (Viscumina, Viscum album
aglutinina, VAA). Junto a una acción citotóxica, se discute hoy en
particular una inmunoestimulación (inespecífica), cuyos efectos
positivos se aprovechan para una terapia complementaria y para los
cuidados posteriores de los pacientes tumorales. Un aumento de la
calidad de vida en dichos pacientes es debido al vertido de
endorfinas propias del cuerpo (Heiny y Beuth, 1994).
Numerosos estudios in vitro (Hajto et
al., 1990; Männel et al., 1991, Beuth et al.,
1993) e in vivo (Hajto, 1986; Hajto et al., 1989,
Beuth et al., 1991, Beuth et al., 1992), así como
estudios clínicos (Beuth et al., 1992) justifican la
liberación aumentada debida a la lectina de muérdago, de citocinas
inflamatorias (TNF-\alpha, IL-1,
IL-6) así como una activación de componentes
celulares del sistema inmunológico (células TH, células NK).
Como principio activo del extracto de muérdago
se considera hoy una proteína de 60 kDa de la lectina de muérdago,
la cual puede obtenerse por una ruta bioquímica a partir de los
extractos (Franz et al., 1977; Gabius et al., 1992).
La proteína ML consta de dos subunidades unidas por puentes
S-S, cuya cadena A es responsable de la
inactivación enzimática de los ribosomas (Endo et al., 1988)
y cuya cadena B es responsable de la unión con los hidratos de
carbono. La actividad biológica está correlacionada con la recepción
de la actividad de la cadena B de la lectina (Hajto et al.,
1990).
La presente invención tiene por finalidad el
resolver el problema técnico, que hasta ahora ningún pronóstico
preciso ha podido acertar, de si la terapia que incluye la
administración de rViscumina u otros compuestos semejantes, es
apropiada para el tratamiento de una enfermedad o transtorno de un
individuo.
Este problema técnico se resuelve mediante las
versiones caracterizadas en las reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a un procedimiento in vitro para la determinación de
la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago
o a una(s) cadena(s) individual(es) de la
lectina de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la
detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor
situado en la membrana, el cual receptor se caracteriza por un ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac)
situado en un extremo, el cual está unido a una galactosa (Gal)
mediante un enlace glicosídico \alpha2-6.
Según la invención, se emplea de preferencia un
procedimiento in vitro, para la determinación de la capacidad
de respuesta de un individuo a la lectina de muérdago o a la (una)
cadena individual de lectina de muérdago, en el cual la capacidad
de respuesta está mediada por la unión específica de la subunidad de
unión con los hidratos de carbono, de la lectina de muérdago a un
receptor de la membrana, el cual receptor se caracteriza por
comprender un ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac), unido
mediante una unión glicosídica \alpha2-6 a una
galactosa (Gal). La determinación comprende la detección específica
cuantitativa y/o cualitativa de la citada glicosilación
específica.
El término "lectina de muérdago" incluye
tanto la aquí descrita y conocida por el experto como natural, como
también la lectina de muérdago recombinante, la cual comprende la
cadena individual de la lectina de muérdago de preferencia la
cadena B de la lectina de muérdago o (un) fragmento(s) de la
misma.
El término "capacidad de respuesta" define,
en relación con la invención, la generación de una reacción
beneficiosa para la curación de una enfermedad o un transtorno, de
una célula individual, de una población celular, de una asociación
celular, de un tejido, de un órgano o de un organismo. Además, el
término "capacidad de respuesta" abarca también la
sensibilidad de una célula individual, de una población celular, de
una asociación celular, de un tejido, de un órgano o un organismo
en el empleo preventivo de la rViscumina o compuestos semejantes.
Por consiguiente, una capacidad de respuesta de las correspondientes
células diana está unida a un efecto terapéutico positivo, pero
también a un efecto preventivo. De preferencia, la "capacidad de
respuesta" comprende la sensibilidad de una célula humana, de
una población celular, de una asociación celular, de un tejido, de
un órgano o de un organismo humano.
El término "unión específica" puede
caracterizarse por ejemplo con el principio de
llave-cerradura. El ligando (lectina de muérdago) y
la molécula diana (receptor de la membrana) poseen estructuras o
motivos, que se acoplan específicamente entre sí. Un ejemplo de
ello son los determinantes de antígenos (epitopo), los cuales
interaccionan con el punto de unión de un anticuerpo con el
antígeno. En correspondencia, existe una unión específica
contrariamente a una unión universal, inespecífica. Mediante el
conocimiento de la estructura de uno de los socios interactivos que
se unen específicamente entre sí, se pueden sacar conclusiones sobre
posibles estructuras preferidas o respectivamente sobre elementos
estructurales especiales de un socio interactivo. La invención
emplea el socio interactivo específico para la lectina de muérdago,
en particular la rViscumina.
El término "subunidad de unión a hidratos de
carbono de la lectina de muérdago" describe los motivos de la
secuencia de la cadena B de la lectina de muérdago, la cual se une
específicamente al receptor de la membrana de la lectina de
muérdago. Estos motivos fueron descritos por Langer et al.,
(2000). Al igual que la subunidad de la ricina que se une a los
hidratos de carbono, la cadena B de la lectina de muérdago está
compuesta de 2 dominios. Estos están divididos cada uno de nuevo en
3 subdominios. Los dominios se designan como 1 y 2, los subdominios
como \alpha, \beta y \gamma. Para la ricina se describe que
cada subdominio deriva de una estructura de unión a hidratos de
carbono supuestamente bacteriana (Rutenber et al., 1987).
Debido a la alta identidad estructural de la cadena B de la ricina
con la de la lectina de muérdago (62% de identidad y 70% de
homología según Eck et al., 1999) parece que esta observación
es también transferible a la lectina de muérdago. La diferente
especificidad de la subunidad de unión a los hidratos de carbono de
la ricina y la lectina de muérdago es según Langer et al.,
(2000) atribuible a la diferencia de los subdominios. Estas
diferencias son en particular en el subdominio 1\alpha los
radicales D23 y W38, en el subdominio 1\beta los radicales Y68,
Y70, Y75 y F79, y en los subdominios 2\gamma los radicales D235,
Y249; para la numeración, véase Eck et al., (1999a).
El término "receptor de la membrana"
define, referido a la invención, una estructura unida a la membrana,
la cual se caracteriza por tener un ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac)
situado en el extremo. Este está de nuevo unido mediante una unión
\alpha2-6 glicosídica con una galactosa (Gal).
Ejemplos de estructuras correspondientes unidas a la membrana son
las proteínas o los péptidos, los cuales están anclados a la
membrana de una célula. Esta definición comprende tanto la
transmembrana como también las proteínas y péptidos asociados a la
membrana. Igualmente los lípidos, los cuales o bien son ellos
mismos parte de la membrana o están asociados a la misma, son
ejemplos para dichas estructuras. La estructura unida a la membrana,
dada a conocer, puede tanto ser parte de una glicoproteína
(proteína glicosilada), como ser también parte de un
glicolípido.
El término "membrana", referido a la
invención, comprende todas las dobles capas de lípidos, membranosas,
celulares. Por consiguiente, son tanto membranas del retículo
endoplasmático (ER), del Golgi, de la cavidad del núcleo celular,
de vesículas y vacuolas, así como también comprende explícitamente,
la membrana celular exterior.
En el estado actual de la técnica se han
descrito proteínas que están glicosiladas con un ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac)
situado en el extremo, las cuales de nuevo mediante una unión
\alpha2-6 glicosídica están unidas con una
galactosa (Gal). Estas proteínas glicosiladas son
proteínas/proteínas séricas (véase p. ej., Hanasaki et al.
1995) solubles, las cuales no son relevantes ni para efectos
farmacológicos ni para el modo de actuar de la lectina de muérdago.
En relación con esta invención se da a conocer por primera vez una
estructura glicosilada unida a la membrana.
La identificación del ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac)
situado en el extremo, el cual mediante una unión
\alpha2-6 glucosídica está unido con una galactosa
(Gal), como estructura diana específica de la subunidad de unión a
hidratos de carbono de la lectina de muérdago, permite a un experto,
solo o en combinación con las instrucciones de Langer et al.
(2000), modificar por ejemplo la subunidad de unión con hidratos de
carbono de la ricina mediante mutagénesis específica puntual. Un
péptido/proteína correspondientemente mutado ya no pudo a
continuación unirse a estructuras diana específicas para la ricina,
sino que en su lugar, pudo unirse a estructuras diana específicas
para la lectina de muérdago.
Ejemplos de una detección cuantitativa y/o
cualitativa de la citada glicosilación ya son conocidos por el
experto, entre otros el ejemplo 7 anexo y la figura 9 que ilustra
este ejemplo. Tales procedimientos comprenden por ejemplo análisis
Western-Blot modificados, como se muestra en los
ejemplos. Igualmente comprenden dichos procedimientos, técnicas
como p. ej., el ensayo radioinmunológico (RIA), el ensayo sándwich
(ensayo inmunométrico) y el ensayo Western-Blot,
IRMA (ensayo inmunológico radioinmunométrico), EIA (ensayo
inmunoenzimático), ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas),
FIA (ensayo inmunofluorescente), CLIA (ensayo inmunológico
quimioluminiscente), ensayo de aglutinación y procedimientos de
citrometría de flujo.
El procedimiento según la invención hace posible
entre otros, una prognosis de la efectividad de una terapia con
lectina de muérdago. Esto comprende que pueda hacerse un pronóstico
de si una terapia con lectina de muérdago, de preferencia con
rViscumina, tiene en principio posibilidades de éxito en la terapia
para el tratamiento de una enfermedad en determinadas células de
una determinada población popular o un determinado tejido, órgano u
organismo. Por ejemplo, si se identifica con ayuda del procedimiento
según la invención la glicosilación sobre una célula tumoral más
arriba citada, entonces puede unirse la rViscumina a la célula, ser
absorbida por ella y actuar citotóxicamente en la misma. Además, el
procedimiento según la invención hace posible una prognosis para la
efectividad de una terapia con lectina de muérdago en un individuo.
En un colectivo de pacientes pueden diferenciarse por consiguiente
aquellos que responden (pacientes que reaccionan a la terapia), de
aquellos que no responden a la misma. Este procedimiento de
prognosis efectúa por consiguiente una tarea semejante a las
conocidas investigaciones efectuadas por el experto, antes de una
terapia de pacientes con cáncer de mama tratados con Herceptin.
Antes de administrar una terapia con el preparado de anticuerpos
Herceptin, debe investigarse si el paciente posee el receptor EGF,
Her-2. A partir de la FDA (Food and Drug
Administration de USA) se admiten a este respecto en particular,
dos procedimientos de ensayo (coloración inmunohistoquímica (IHC) y
fluorescencia de hibridación in situ (FISH)). Véase entre
otros, Thomson et al., (2001). Análogamente, éstos y otros
procedimientos pueden emplearse en las técnicas aquí descritas, para
reconocer y/o determinar según las instrucciones de la invención,
aquellos pacientes individuales que responden a una terapia con
lectina de muérdago, en particular una terapia con rViscumina.
Para el procedimiento según la invención pueden
emplearse muestras de líquidos en particular líquidos corporales,
células, poblaciones celulares o tejidos. Estas muestras pueden
proceder de muestras de sangre u otras muestras de líquidos
corporales, pero también pueden ser muestras de tejidos, células
aisladas o células tumorales diseminadas. Ejemplos de tales
muestras y su extracción se describen con más detalle en esta
solicitud en conexión con otras versiones.
El procedimiento según la invención hace también
posible un reconocimiento temprano de los pacientes con respuesta
en un colectivo de pacientes. De esta manera es posible mediante un
ensayo fácil de ejecutar, sin un mayor retraso antes del comienzo
de la terapia, valorar el éxito de esta terapia. Esta característica
del procedimiento según la invención, es ante todo relevante desde
el punto de vista económico de la enfermedad. Se evita una
eventualmente muy cara terapia para los pacientes individuales,
aunque inefectiva. De esta manera, puede también evitarse en una
terapia efectiva, el correr el riesgo de efectos secundarios en
estos pacientes individuales, en los cuales parece dudosa una
terapia exitosa con rViscumin.
En las investigaciones que tienen por base la
invención y en los ejemplos descritos puede mostrarse fuera de toda
duda, que la lectina de muérdago y la ricina se unen a los
glicoesfingolípidos (GSL). Por primera vez pudo aquí documentarse
una diferencia cuantitativa y cualitativa entre la especificidad de
la unión de la lectina de muérdago (en particular rViscumina) y la
de la ricina. Las estructuras de los hidratos de carbono
reconocidos en ambas proteínas pueden representarse esquemáticamente
en la figura 1.
Como se representa en los ejemplos ilustrados,
pudo mostrarse en ensayos específicos que la especificidad primaria
de la lectina de muérdago (en particular rViscumina) no es una
galactosa situada en el extremo. En las figuras 2 a 5 y 7 se
muestra una detección inmunológica mediante un Western Blot
modificado de la ricina o respectivamente rViscumina unidas a una
placa DC (ensayo TLC), sobre GSL neutro y ácido, fueron previamente
separadas tomando como base sus diferentes propiedades de recorrido
en diferentes fluidos. Mientras que la ricina muestra una clara
especificidad para el GSL neutro, con una galactosa situada en el
extremo (Lc2, nLc4, nLc6, Gg4) (tabla 1; figura 4B huella b), la
rViscumina muestra de forma sorprendente frente a la
Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer (Cer
representa aquí Ceramida), sola-mente una
extremadamente débil unión (tabla 1; figura 2A, huella b, "mancha
negativa", después de una incubación ü.N.).
De manera sorprendente se demostró que esto no
sirve sin embargo para un grupo de gangliósidos en los cuales se
asienta situado en el extremo, un ácido
N-acetil-neuramínico (Neu5Ac). Este
es muy bien reconocido por la rViscumina, pero por la ricina no es
reconocido en absoluto (ver tabla 1; figura 2B, huella b; figura 5B,
huella b "manchas negativas"). Además se encontró de manera
sorprendente, que para el reconocimiento de la estructura del
receptor por la rViscumina, es decisivo que el ácido
N-acetil-neuramínico esté unido con
la galactosa terminal de la estructura básica del azúcar neutro
mediante un enlace \alpha2-6 (en cuyo caso es
reconocido), ó mediante un enlace \alpha2-3 (en
cuyo caso no es reconocido) (ver ejemplos y figuras anexos).
Este reconocimiento específico, según la
invención, del ácido
N-acetil-neuramínico en la
configuración
Neu5Ac-\alpha2-6-Gal,
recuerda la especificidad en el reconocimiento del epitopo de
anticuerpos monoclonales, y hasta el momento no ha sido descrito
todavía para la lectina de muérdago. También fue sorprendente la
diferente especificidad absoluta de la ricina y rViscumina y para
el experto no fue predecible. Los diferentes motivos de
reconocimiento de las dos proteínas inactivadoras de los ribosomas
tipo II ensayados, están resumidos en la tabla 1. Del estado actual
de la técnica pudo deducirse que tanto la ricina, como también la
lectina de muérdago (en particular la rViscumina), cuando
generalmente se unen antes a los GSL neutros, poseen como radical de
azúcar situado en el extremo, una galactosa.
En una versión preferida del procedimiento, el
recep- tor comprende gangliósidos, los cuales después de la
galactosa \alpha2-6-sializada
poseen por lo menos una
N-acetil-glucosamina (GlcNAc), es
decir, gangliósidos, los cuales después del ácido
N-acetil-neuramínico unido
\alpha2-6 a la galactosa, comprenden por lo menos
una N-acetil-glucosamina (GlcNAc).
Sin embargo, como se menciona más adelante, el subsiguiente
N-acetil-glucosamina (GlcNAc) puede
unirse tanto directa como también indirectamente a la estructura
Neu5Ac\alpha2-6-Gal. Por
consiguiente, es posible en relación con esta invención, que el
procedimiento según la invención se base sobre el reconocimiento
(de la estructura) de un receptor gangliósido, el cual comprende la
estructura
Neu5Ac\alpha2-6-Gal-Y-[GlcNAc]_{x}-Cer.
Y puede comprender p. ej., otra galactosa (Gal).
El término "gangliósido" define en relación
con la invención, ceramidoligosacáridos ácidos, que contienen ácido
siálico. Las unidades de hidrato de carbono están unidas mediante
un enlace glicosídico con el grupo C1-OH de
N-acilesfingosina (= ceramida). Los gangliósidos
pueden ser tanto de cadena larga (p. ej., IV^{3}nLc4,
VI^{3}nLc6, etc.), como también de cadena ramificada (GM1 ó GM2)
(Voet y Voet (1992), en particular la figura de la página 271 de
esta referencia).
En una versión preferida del procedimiento, el
receptor comprende gangliósidos con la estructura
Neu5Ac\alpha2-6-Gal-[Gal/GlcNAc]_{x}-Cer,
en donde Cer es ceramida. Particularmente preferido es sin embargo
el descrito en el procedimiento,
Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.
Los procedimientos de uso corriente para la
caracterización estructural de gangliósidos permiten actualmente un
análisis exacto solamente de aquellos gangliósidos, en los cuales x
tiene un valor \leq 6. La subunidad de unión a los hidratos de
carbono de la lectina de muérdago reconoce las estructuras de azúcar
situadas en el extremo. Corresponientemente el valor de las
variables x es fundamentalmente insignificante para la unión
específica. De preferencia la variable tiene un valor máximo de 10.
Además, de preferencia la variable tiene un valor de \leq 6, con
mayor preferencia un valor de 5, 4, 3, 2 ó 1. Todavía con mayor
preferencia, en los gangliósidos ramificados el valor de x
individualmente, o en todas las cadenas, es diferente.
Igualmente de preferencia, el receptor comprende
en una versión del procedimiento, gangliósidos de estructura
Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer,
con particular preferencia,
Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc
\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer ó un gangliósido Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.
\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer ó un gangliósido Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.
También mediante esta versión preferida están
comprendidos los gangliósidos lineales y ramificados.
En correspondencia, en otra versión preferida,
el receptor está situado en la membrana celular.
Esta versión del procedimiento según la
invención describe el análisis de los receptores situados en la
membrana, los cuales son parte de la membrana celular exterior o
están unidos a la misma. En particular, esta versión comprende
receptores los cuales son glicoproteínas o glicolípidos.
En otra versión preferida la lectina de muérdago
es una lectina de muérdago recombinante/rViscumina.
Como se ha descrito más arriba, las distintas
lectinas de muérdago que se encuentran en la naturaleza
(ML-I, ML-II y
ML-III), están diferenciadas en la literatura. Estas
se diferencian por su especificidad a los hidratos de carbono
(Franz, 1986). Respecto a ello, se discute si la especificidad a la
galactosa/lactosa (ML-I), mediante una forma mixta
de galactosa/lactosa y
N-acetil-galactosamina
(ML-II), de una lectina de muérdago, que se une con
más fuerza a la
N-acetil-galactosamina
(ML-III), cambia. La lectina de muérdago/rViscumina
recombinante obtenida en E. coli, es ya conocida por el
experto (EP 0 751 221 B1, Eck et al., 1999a y 1999b). La
rViscumina no corresponde exactamente en su estructura primaria a
una ML-I, ML-II ó
ML-III que se encuentran en la planta de muérdago.
De esto se desprende que junto a las secuencias descritas de la
rViscumina, existen todavía otras mediante mutaciones puntuales en
la variante de la lectina de muérdago modificada en el gen original,
las cuales pueden diferenciarse fácilmente en su estructura
primaria. La rViscumina podría considerarse como una variante de la
lectina de muérdago primitiva, y considerarse como una mezcla de las
secuencias de ML-I, ML-II y
ML-III.
Además, mediante esta versión están comprendidas
las proteínas de fusión recombinantes sobre la base de la
rViscumina, como se describen en la solicitud de patente de la
patente EP A2 1012256.
Con más preferencia, la lectina de muérdago
recombinante comprende en una versión de la invención, una secuencia
de aminoácidos la cual es codificada por un polinucleótido como
está representado en SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 3 ó SEQ ID nº 5.
En una versión también preferida está de
preferencia comprendida la lectina de muérdago recombinante, que es
codificada por uno o varios polinucleótidos.
Igualmente comprende la lectina de muérdago
recombinante en una versión preferida del procedimiento según la
invención, un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como está
representado en SEQ ID nº: 2, SEQ ID nº: 4 ó SEQ ID nº: 6, ó un
fragmento funcional de la misma.
El término "fragmento funcional" define en
relación a esta invención, fragmentos de los citados polipéptidos
los cuales poseen la misma función biológica que los polipéptidos
representados con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID). La función
de la lectina de muérdago, en particular la rViscumina, y las
conocidas subunidades de la lectina de muérdago ya se han descrito
aquí. La "función" comprende la propiedad de unión específica,
también dada aquí a conocer, de la lectina de muérdago, en
particular de la cadena B de la lectina de muérdago, con el
descrito receptor de la lectina de muérdago. Con esto, están también
comprendidos fragmentos de la cadena B de la lectina de muérdago,
en particular aquellos fragmentos que pueden inducir una interacción
especifica con el descrito receptor de la lectina de muérdago.
El término "misma función biológica"
describe en esta conexión por ejemplo, que fragmentos o derivados
del polipéptido inducen las mismas señales en una célula que los
citados péptidos. Ejemplos de fragmentos son dominios de péptidos
con funciones definidas o determinados grupos prostéticos. Las
"mismas funciones biológicas" comprenden también la
citotoxicidad, la inmunoestimulación (tanto del sistema inmunológico
nativo como también del sistema inmunológico adoptivo),
estimulación de la liberación de citocinas, antigenidad, inducción
de la expresión o de la activación de marcadores en la superficie
(p. ej., CD56 sobre células NK), inducción de apoptosis o
estimulación de endorfinas.
En una versión asimismo preferida, se comprende
también la lectina de muérdago recombinante la cual está codificada
por uno o varios polinucleótidos, los cuales codifican un
polipéptido con una secuencia de aminoácidos como la representada
en SEQ ID nº: 2, SEQ ID nº: 4 ó SEQ ID nº: 6, ó codifican un
fragmento funcional de la misma, la cual secuencia sin embargo,
desde el punto de vista del código genético, está degenerada.
El receptor de la lectina de muérdago descrito
aquí por primera vez, juega también un papel en los ensayos
celulares, como está representado en los ejemplos. Puede verse en
los mismos, que las células en el tratamiento con rViscumina
reaccionan de manera distinta. En particular las células tumorales o
las células que derivan de los tumores, muestran las reacciones
bioquímicas específicas descritas en los ejemplos, cuando son
tratadas con rViscumina.
Mediante los experimentos representados en los
ejemplos puede igualmente ser identificada sin duda alguna la
especificidad de la rViscumina para el receptor aquí dado a conocer.
Además fue mostrado claramente que la rViscumina en comparación con
la ricina posee una especificidad para los hidratos de carbono
cuantitativamente distinta.
En las investigaciones basadas en la invención,
que están descritas en los ejemplos que se adjuntan, se mostró que
las células tumorales o respectivamente, las líneas de células
tumorales, expresan el receptor específico para la lectina de
muérdago o en particular para la rViscumina, más arriba
descrito.
Las sialiltransferasas son responsables en las
células eucariotas de la glicosilación terminal de estructuras
glicosiladas. La actividad de estas enzimas se localizó en el
aparato de Golgi (en el compartimento trans-Golgi).
Las enzimas catalizan la transferencia de éteres del ácido siálico.
La actividad enzimática de dichas sialiltransferasas cataliza por
ejemplo en células degeneradas (células cancerosas) una específica
glicosilación de los péptidos y/o lípidos. Una presencia de dichas
sialiltransferasas en las muestras de células o tejidos puede
valorarse como una indicación de degeneración de las células. Esto
sirve con mayor razón para la detección de una actividad enzimática
de estas sialiltransferasas en una muestra.
Los procedimientos de biología molecular y de
bioquímica de las proteínas para la determinación cuantitativa y/o
cualitativa de la(s) sialiltransferasa(s), son ya
conocidos por los expertos a partir de la Literatura (ver entre
otros, Mülhardt (2000) y Rehm (2000)). Métodos de biología molecular
son por ejemplo las técnicas RT-PCR, ensayos de
protección ARNsa, análisis Northern blot o Southern blot. Métodos
químicos para proteínas son por ejemplo los procedimientos para la
detección de una actividad transferasa pero también los
procedimientos como el análisis Western blot u otras técnicas, las
cuales pueden compendiarse bajo la denominación de análisis
Proteom.
Además, la determinación cuantitativa de la
sialil-transferasa de células individuales,
comprende p. ej., las células tumorales diseminadas. Los análisis
de células individuales son ya conocidos por el experto y se
describen en EP A1 11009938 y Klein (1999).
Un ejemplo de una correspondiente
sialiltransferasa es el \beta-galactósido
\alpha-2,6-sialiltransferasa E.C.
2.4.99.1 (\alpha2-6STN). La
\alpha2-6STN es una proteína transmembránica de 47
kDa. Los hepatocitos segregan también, una forma de 41 kDa de esta
enzima. La \alpha2-6STN es una glicoproteína del
suero, la cual se añade al grupo de los "reactantes de fase
aguda" y en procesos patógenos juega un papel (actividad
reforzada en muchos carcinomas, p. ej., carcinoma de colon y
carcinoma cervical). Las secuencias de aminoácidos de formas
conocidas de enzima, y las secuencias de nucleótidos que codifican
las mismas son ya conocidas por el experto (véase Accession
n^{os} L29554 (Rattus norvegicus), X75558 (Gallus
gallus), NM_003032 (Homo sapiens) y NM_009175 (Mus
musculus)).
Los procedimientos según la invención aquí
representados pueden efectuarse mediante el empleo de un reactivo
de detección específico. Estos reactivos específicos de detección
son capaces de interaccionar o respectivamente unirse con el
receptor de la lectina de muérdago aquí descrito. Esta interacción o
unión puede ser directa o indirecta, pero debe ser específica para
el receptor aquí descrito. Reactivos particularmente preferidos son
los anticuerpos específicos, fragmentos de anticuerpos o derivados
de anticuerpos, aptámeros, moléculas que se unen a hidratos de
carbono (p. ej., péptidos y/o proteínas), en donde el reactivo debe
ser capaz de reconocer y/o unirse al receptor de la lectina de
muérdago aquí descrito o a sus componentes específicos (p. ej., el
aquí definido ácido
N-acetil-neuramínico situado en el
extremo, el cual está unido mediante un enlace glicosídico
alfa2-6 con una galactosa). De preferencia, estos
reactivos de detección están marcados, el cual marcado puede
comprender substancias radiactivas, colorantes fluorescentes,
biotina-(estrept)avidina, lucife-rasas, CAT,
beta-galactosidasa, fosfatasa(s)
alcalina(s), peroxidasa(s), otros marcados
enzimáticos, digitonina, colorantes en general, etc. El
procedimiento según la invención puede sin embargo efectuarse
también mediante detección indirecta del receptor aquí descrito.
Detecciones del receptor están ilustradas en los ejemplos y pueden,
como se ha indicado más arriba, comprender también procedimientos
como los ensayos RIA, ELISA, CLIA, FIA, ELLA, TLC, procedimientos
histológicos, procedimientos de
(inmuno)-fluorescencia directos e indirectos, o
procedimientos de flujo (p. ej., análisis FACS, citometría de flujo,
BIAcore).
En una versión alternativa la invención se
refiere a una composición para diagnóstico, la cual comprende una
substancia que reconoce o une específicamente el receptor definido
más arriba, de preferencia escogida del grupo formado por
anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos,
aptámeros, en donde la substancia está marcada detectablemente o el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual puede obtenerse a
partir de una línea de células hibridomas, la cual fue depositada el
20 de Diciembre de 2002 en la DSMZ de Brunswick con el número de
acceso DSM ACC2580.
Procedimientos para la obtención de anticuerpos
(policlonales o monoclonales), los cuales reconocen o se unen a una
estructura diana específica, son ya conocidos por el experto. La
obtención de anticuerpos monoclonales contra los gangliósidos GD1 y
GD2, los cuales juegan un papel en enfermedades neurológicas, fue
descrita por Magnani et al., (1982), Tur et al.,
(2001) y Pan et al., (2001). La detección de la especificidad
de dichos anticuerpos puede efectuarse entre otros, mediante el
ensayo Overlay ("de capa sobrepuesta"), el cual se basa en una
inmunocoloración mediante cromatografía en capa fina (Müthing y
Mühlradt (1988), Müthing y Kemminer (1966), Müthing (1998)). Este
procedimiento puede combinarse eventualmente con el análisis
ELISA.
Los anticuerpos empleados en los procedimientos
aquí descritos son de preferencia anticuerpos monoclonales (o
fragmentos o derivados de los mismos) los cuales se unen
específicamente a la estructura del receptor unido a la membrana,
dado aquí a conocer. En los ejemplos se describe como pueden ser
obtenidos dichos anticuerpos. Por ejemplo los anticuerpos descritos
en los ejemplos con los códigos 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6, están
dirigidos contra los gangliósidos tipo neolacto
\alpha2-6 sializados aquí descritos, es decir el
receptor aquí descrito para la lectina de muérdago
(recombinante).
Los anticuerpos pueden ser, entre otros,
anticuerpos del tipo IgG, IgA, IgD, IgM. Un anticuerpo
particularmente preferido puede ser obtenido a partir de una célula
hibridoma/línea de células hibridomas, la cual fue depositada con
la denominación 59.33.3 el 20 de Diciembre de 2002 en la
"Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
(Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares")
(DSMZ) en Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580 según el
Tratado de Budapest.
Está previsto también que las composiciones aquí
descritas como diagnósticas como también farmacéuticas (ver más
adelante) comprendan anticuerpos, los cuales se obtienen de los
anticuerpos aquí descritos mediante modificaciones de los mismos.
Así pueden ser aisladas mediante técnicas conocidas por el experto,
las CDR (regiones determinantes de la complementariedad; las cuales
tres regiones determinantes de la complementariedad CDR1, CDR2 y
CDR3 forman curvas en el extremo de un dominio V de los anticuerpos
o receptores de células T. Estos entran en contacto directo con un
antígeno o un péptido: el complejo MHC) de los anticuerpos aquí
descritos, son aislados y estos CDR son unidos a anticuerpos de
otra estructura. A este respeto es posible p. ej., aislar las
regiones CDR del anticuerpo 59.33.3 (un IgM), e integrar estas CDR
en otras inmunoglobulinas p. ej., en una IgG, de preferencia en una
estructura IgG1. Estos procedimientos (p. ej., "injerto de
CDR"), ya son bien conocidos por el experto. Los anticuerpos
aquí descritos comprenden también anticuerpos quimera, anticuerpos
humanizados o también anticuerpos de una única cadena ("single
chain antibodies") o fragmentos de anticuerpos de una sola
cadena como la construcción scFv. Sin embargo, dichas modificaciones
de anticuerpos no están limitadas a modificaciones de los
anticuerpos descritos aquí detalladamente 59.33.3, 59.33.5 ó
59.33.6. Los anticuerpos empleados pueden ser todos los
anticuerpos/moléculas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o
derivados de anticuerpos, los cuales se unen específicamente al
receptor aquí descrito para la lectina de muérdago (recombinante)
(r)Viscumina).
Los fragmentos de anticuerpo, como Fv,
F(ab')_{2} y Fab, pueden obtenerse por escisión de la
proteína intacta (anticuerpo), p. ej., mediante proteasas o
mediante escisión química. Sin embargo, puede formarse un gen más
corto. Por ejemplo, comprende un gen quimera, el cual codifica una
parte del fragmento F(ab')_{2}, secuencias de ADN que
codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido
de un codon de interrupción translacional, mediante lo cual se
obtiene una molécula más corta.
El término "derivados de anticuerpos"
describe formas modificadas de los anteriormente llamados
anticuerpos. Estas modificaciones comprenden modificaciones
químicas, en particular bioquímicas, de preferencia
proteinbioquímicas, de los anticuerpos o sus fragmentos. La
característica común de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos
y sus derivados, es el reconocimiento y/o la unión a una estructura
diana específica. Esta estructura diana es según la invención el
receptor unido a la membrana aquí descrito, para la lectina de
muérdago.
Los aptámeros y sus propiedades específicas han
sido descritos en resumen, entre otros, por Hermann y Patel (2000).
Procedimientos de aislamiento de los aptámeros ya son conocidos para
el experto igualmente a partir del estado actual de la técnica.
El término "péptido de unión a los hidratos de
carbono" se define aquí como en la versión de la invención la
cual se refiere al empleo para la preparación de un medicamento.
Además, en una versión preferida de la
composición diagnóstica, la substancia detectable está marcada.
Ejemplos de marcas detectables de substancias
son ya conocidas por el experto. Estas son entre otras, marcas
radiactivas, enzimáticas o fluorescentes. Igualmente, la
biotinilación y una detección con ayuda de avidina o estreptavidina
son un ejemplo para una correspondiente versión preferida.
Una versión de la invención abarca el empleo de
la composición diagnóstica para análisis según la invención, tanto
de células individuales, como de una población de células o de un
conjunto celular, células de un tejido, órgano u organismo, las
cuales poseen un receptor funcional para la lectina de muérdago.
En otra versión alternativa, la invención se
refiere también al empleo de una substancia más arriba definida,
para la obtención de una composición diagnóstica para la detección
de un receptor funcional de la lectina de muérdago.
También es preferido el empleo según la
invención, de la composición diagnóstica para la detección del
receptor aquí descrito e investigada en los ejemplos, sobre las
células.
Como se representa en los ejemplos, las células
tumorales se caracterizan por expresar los ácidos
N-acetil-neuramínicos (Neu5Ac)
situados en el extremo, los cuales mediante un enlace
\alpha2-6 glicosídica están unidos con galactosa
(Gal), como respondedores particulares a la lectina de muérdago, en
particular la lectina de muérdago obtenida recombinantemente
(rViscumina).
En una versión preferida, las células
investigadas son células tumorales. Más preferido es que estas
células tumorales sean células animales, de preferencia células
tumorales de mamíferos, y todavía con más preferencia, células
tumorales de seres humanos. Se prefiere además que estas células
sean células leucémicas, carcinomas pulmonares de células pequeñas
y no pequeñas, carcinoma de colon, carcinoma ZNS, melanoma,
carcinoma ovárico, carcinoma renal, carcinoma de próstata,
carcinoma de mama, carcinoma de vesícula biliar, carcinoma de
estómago, carcinoma de páncreas, o carcinoma de testículos.
En otra versión preferida de la invención las
células proceden del material de una biopsia.
Procedimientos para la obtención del material de
una biopsia son ya conocidos por el experto. Mediante esta
descripción se abarcan diferentes tipos de extracción, en los cuales
se extraen células a un probando o paciente. Son preferidas las
células vivas. Estas son por ejemplo biopsias con aguja fina
(aspirados de aguja fina), biopsias de troquel, extracción de
trozos de tejido sólidos (p. ej., mediante procedimiento quirúrgico)
o muestras de un órgano completo (p. ej., cápsulas suprarrenales).
Las diferentes técnicas de extracción están descritas p. ej., en:
Kremer et al (1999), Pichlmayr y Löhlein (1991), Niethard y
Pfeil (1997), Malte (1998) y Bonk.
En una versión igualmente preferida, las células
se aislan de muestras de sangre.
Junto al aislamiento de las células de muestras
de sangre se refieren igualmente versiones preferidas de la
invención como el aislamiento de células de derrames pleurales,
muestras de líquido ascítico, líquidos de lavados, muestras de
orina, muestras de esperma o muestras de líquido cefalorraquídeo y
líquido cerebral.
Para la detección de la capacidad de respuesta
de p. ej., pacientes de cáncer a la rViscumina, se extraen tejidos
del paciente antes de planificar una terapia o durante el transcurso
de la terapia. También es posible recurrir a muestras/conservas
coleccionadas de diferente(s) pacientes (las cuales están
almacenadas ordenadas por indicaciones en bancos de bloques de
parafina en muchas clínicas), para poder hacer una afirmación
estadísticamente asegurada p. ej., para una indicación
específica.
Estos tejidos se secan por ejemplo por
liofilización, se conservan en formalina o se obtienen mediante
conservación por congelación (congelación planificada, p. ej., por
perfusión con una solución citoprotectiva, p. ej., solución de
azúcar) y seguidamente se manipulan según procedimientos habituales
al experto, p. ej., conservados en bloques de parafina. A partir de
las muestras se obtienen cortes apropiados para una investigación
microscópica. Estos cortes son investigados a continuación mediante
procedimientos habituales al experto (p. ej., el método LSAP un
procedimiento semejante al ELISA o mediante el empleo del método
ENVISION de la firma DAKO de Hamburgo) para detectar la presencia
de antígenos específicos, es decir, del receptor aquí definido para
la lectina de muérdago (recombinante). Para ello pueden emplearse
por ejemplo las muestras de pacientes mediante el empleo del aquí
descrito mAk 59.33.3, ó bien los otros dos, mAks 59.33.5 ó 59.33,6
que reconocen el epitopo "CD75s" del receptor aquí descrito.
Los anticuerpos unidos, los cuales pueden emplearse por ejemplo en
una concentración de 500 ng/ml a 10 \mug/ml, son detectados a
continuación con anticuerpos secundarios u otros métodos de
detección. Por ejemplo, puede emplearse un anticuerpo IgM
anti-ratón, en el cual un polidextrano previsto
está copulado con fosfatasa alcalina. Es igualmente posible una
comparación entre tejidos sanos y tejidos degenerados para
distinguir si en un paciente o en una indicación específica de un
tumor, un tratamiento con rViscumina es prometedor de éxito.
Además, puede detectarse si un tratamiento con lectina de muérdago
(recombínate) (rViscumina) será eficaz, es decir, si puede
esperarse un curso terapéutico
exitoso.
exitoso.
Además, la invención descrita hasta aquí hace
posible otros procedimientos diagnósticos, como entre otros, la
investigación de material de biopsia con aguja fina y líneas
celulares para xenoinjertos u otras líneas celulares.
Las células pueden fijarse por ejemplo en placas
de 96 pocillos y con un procedimiento análogo al ELISA como se ha
descrito en el ejemplo 8, puede investigarse la presencia de motivos
CD75s unidos a membrana/estables en membrana (motivos de unión a
rViscumina, es decir, la estructura del receptor de unión a la
membrana, aquí descrita). Otro procedimiento que puede emplearse
para el ensayo es el análisis FACS. En éste pueden seleccionarse un
grupo de células (particularmente interesante en biopsias de aguja
fina) que llevan un determinado antígeno de superficie. A este
respecto se emplean por ejemplo las células en primer lugar mediante
el empleo de anticuerpos específicos o derivados de anticuerpos,
como por ejemplo los mAks 59.33.3, 59.33.5 ó 59.33.6 aquí descritos.
Los anticuerpos unidos, los cuales pueden emplearse de preferencia,
aunque sin ser limitantes, en una concentración de 500 ng/ml hasta
10 \mug/ml, se añaden a continuación con un anticuerpo secundario,
p. ej., un anticuerpo IgM anti-ratón, el cual con
FITC u otro distinto está marcado (fluorescente), en un automático
Cell Sorter ("seleccionador de células"), p. ej., de Becton
Dickinson. Para seleccionar una población específica de células, se
puede en este procedimiento marcar (fluorescencia) también un
segundo epitopo presente sobre las células diana con otro
anticuerpo distinto al anticuerpo IgM anti-ratón, y
con ello seleccionar específicamente sólo las células en este caso
doblemente marcadas. Con ello se añaden otras posibilidades, como
lograr la predicción de un tratamiento de rViscumina para un
paciente. Adicionalmente se obtiene la información de qué tanto por
ciento una correspondiente población celular (células doblemente
coloreadas frente a células coloreadas solamente con el segundo
anticuerpo) lleva el epítopo CD75s deseado. A partir de un tal
análisis se puede valorar o respectivamente seleccionar si existe
todavía un residuo mínimo de la enfermedad ("minimal residual
disease"). Adicionalmente se pueden ensayar también terapias de
combinación con otros citostáticos juntamente con rViscumina in
vitro, y prepararlas para emplear en pacientes.
En los procedimientos de diagnóstico como se han
descrito aquí, está comprendido también el análisis de estructuras
de membrana lisadas. Es posible entre otros, tratar p. ej., material
de biopsia fresco, no fijado, con detergentes (p. ej., Triton
X-100®, Triton X-112®, Tween 80®,
Tween 20®, octilglicosido, etc.), y analizar el lisado, p. ej.,
mediante Western blot o en forma de ensayos ELISA/RIA. Es decir, los
lisados con detergente pueden ensayarse para detectar la primitiva
presencia del receptor aquí descrito, unido a la membrana, para la
lectina de muérdago (recombinante) (rViscumina). Existen
suficientes procedimientos a disposición del experto para el
análisis correspondiente.
Una substancia que se une con una unión
específica a un receptor definido más arriba, o una substancia que
lo reconoce, puede ser empleada para la obtención de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades proliferativas (p. ej.,
cáncer), enfermedades víricas (p. ej., herpes, HIV), enfermedades
autoinmunológicas o enfermedades neuronales en donde la substancia
que se une al receptor o que reconoce al receptor, se escoge entre
el grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos,
fragmentos de anticuerpo, aptámeros, substancias de bajo peso
molecular y péptidos unidos a hidratos de carbono. De preferencia la
substancia que se une al receptor o que reconoce al receptor es
capaz de inhibir o debilitar la unión de una cadena B de la lectina
de muérdago y/o rViscumina con este receptor.
El término "inhibir" describe en conexión
con la invención tanto una inhibición completa como una inhibición
parcial. Por consiguiente el término comprende un bloqueo completo
de la unión de la lectina de muérdago y/o la rViscumina a la
estructura de hidratos de carbono identificada como receptor
específico. Por consiguiente está igualmente comprendida la
capacidad de debilitar la unión de la lectina de muérdago y/o la
rViscumina al receptor.
La substancia más arriba descrita, empleada para
la obtención de un medicamento no es la lectina de muérdago y en
particular no es la cadena B de la lectina de muérdago.
Este empleo se refiere además de preferencia a
la formulación de medicamentos, eventualmente en combinación con un
"soporte farmacológicamente aceptable" y/o un diluyente.
Ejemplos de soportes farmacológicamente aceptables particularmente
apropiados son ya conocidos por el experto y comprenden soluciones
de sal común tamponadas, agua, emulsiones como p. ej., emulsiones
aceite/agua, diferentes clases de detergentes, soluciones estériles,
etc. Los medicamentos que comprenden dichos soportes pueden
formularse mediante métodos convencionales ya conocidos. Estos
medicamentos pueden administrarse a un individuo en una dosis
apropiada. La administración puede ser oral o parenteral, p. ej.,
intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, local,
intranasal, intrabronquial o intradérmica o mediante un catéter en
un determinado lugar de una arteria. El tipo de dosificación se
determina por el médico facultativo en correspondencia con los
factores clínicos. Ya es conocido por el experto que el tipo de
dosificación depende de distintos factores como p. ej., el tamaño
del cuerpo o respectivamente el peso, la superficie del cuerpo, la
edad, el sexo o la salud general del paciente, pero también depende
del medio especial que se va a administrar, la duración y clase de
administración, y de los otros medicamentos que posiblemente se
administren paralelamente. Una dosis típica puede estar comprendida
p. ej., en un margen entre 0,001 y 1000 \mug, la cual dosis puede
ajustarse por debajo o por arriba de este margen de ejemplo, ante
todo teniendo en cuenta los factores citados más arriba. En general,
en una administración regular, la dosis de la composición según la
invención debe estar comprendida en un margen de unidades de 10 ng y
10 mg por día o respectivamente por intervalo de aplicación. En
caso de que la administración deba ser por vía intravenosa, la
dosis estará comprendida en un margen entre unidades de 1 ng y 0,1
mg por kilo de peso corporal, por minuto.
La composición puede administrarse de forma
local o sistémica. Los preparados para una administración parenteral
comprenden soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no
acuosas, estériles. Ejemplos de disolventes no acuosos son el
propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como p. ej.,
aceite de oliva y ésteres orgánicos como p. ej., oleato de etilo,
los cuales son adecuados para inyección. Los soportes acuosos
comprenden agua, soluciones hidro-alcohólicas,
emulsiones, suspensiones, soluciones salinas y medios tamponados.
Los soportes parenterales comprenden soluciones de cloruro de
sodio, dextrosa Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato Ringer
y aceites unidos. Los soportes intravenosos comprenden p. ej.,
medios complementarios líquidos, nutritivos y electrolitos (como p.
ej., los basados sobre dextrosa Ringer). La composición según la
invención puede contener además, conservantes y otros aditivos,
como p. ej., compuestos antimicrobianos, antioxidantes, formadores
de complejos y gases inertes. Por lo demás, pueden contener en
función del empleo propuesto, compuestos como p. ej.,
interleucinas, factores de crecimiento, factores de diferenciación,
interferonas, proteínas quimiotácticas, o un agente
inmunomodulatorio inespecífico. Igualmente de preferencia, pueden
contener citostáticos, antibióticos y combinaciones de los
mismos.
Los medicamentos o productos medicinales
preparados se emplean o bien para la prevención o bien para el
tratamiento de un transtorno o una enfermedad de los citados más
arriba.
La obtención y el procedimiento de aislamiento
de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos
y aptámeros son ya conocidos por el experto como ya se ha mencionado
más arriba, a partir del estado actual de la técnica y ya ha sido
descrito detalladamente más arriba.
Según la invención, las substancias que
corresponden a una cadena B de la lectina de muérdago o
rViscumina o derivados de las mismas mediante el grupo de la
lectina y péptidos que se unen a los hidratos de carbono, no
están comprendidas. Sin embargo esta versión comprende, entre otros,
otras lectinas las cuales se adaptan mediante modificaciones
bioquímicas y/o de biología molecular (p. ej., mutagénesis
dirigida) en sus propiedades de unión, a las propiedades de unión
de la cadena B del receptor aquí descrito.
Además, la substancia que se une y/o que
reconoce al receptor en una versión también preferida, está unida a
un compuesto con actividad radiactiva, citotóxica o citostática.
El tipo de unión de la substancia con un
compuesto con actividad radiactiva, citotóxico o citostático es en
esta versión dependiente de la substancia y del compuesto. De
preferencia son ambos por ejemplo péptidos o proteínas. En este
caso la unión tiene lugar de preferencia mediante uno o varios
enlaces peptídicos y/o puentes de disulfuro.
Ejemplos de substancias radioinmunológicas son
los anticuerpos monoclonales (mAb) o las citocinas, los cuales
están marcados con substancias radiactivas. Igualmente se refiere a
una versión preferida la unión de las correspondientes substancias
con lectinas, toxinas o toxoides, de preferencia a partir de
bacterias (p. ej., toxoide del tétanos, toxina del tétanos, toxina
de la difteria, toxina del cólera, exotoxina de Pseudomonas,
toxoide de Pseudomonas, toxina Pertussis, toxoide Pertussis,
exotoxina de Clostridium o toxoide de Clostridium, o bien a partir
de vegetales (RIPs tipo I como saporina o gelonina o RIPs tipo II
como ricina ó la cadena A de RIPs tipo II ó una cadena A RIPs tipo
I homóloga de RIPs tipo II). Igualmente están comprendidas otras
moléculas activas de bajo peso molecular, radiactivas, citotóxicas o
citostáticas ("moléculas pequeñas") y otras, como las
macromoléculas descritas más arriba.
Con el término "macromoléculas" se entiende
moléculas con una alta complejidad molecular o un alto peso
molecular. De preferencia, éstas son biomoléculas, como p. ej.,
biopolímeros, en particular proteínas, oligo o polipéptidos pero
también ADN, ARN, oligo o polinucleótidos, grupos prostéticos,
lípidos, oligo y polisacáridos, así como sus modificaciones, así
como también moléculas sintéticas. Las proteínas comprenden de
preferencia también proteínas de fusión. El término "péptido o
proteína" abarca los péptidos o proteínas tanto naturales como
sintéticas. Ejemplos de proteínas naturales son entre otros,
anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores, los cuales se
unen a sus ligandos específicos, ligandos peptídicos que con sus
receptores específicos o dominios peptídicos, los cuales
interreaccionan con substratos específicos incluidos proteínas y
coenzimas, y otros péptidos o enzimas, etc. Igualmente están
comprendidos por consiguiente formas obtenidas recombinantemente de
las proteínas o péptidos antes citados. Los péptidos naturales
comprenden correspondientemente, entre otros, fragmentos de las
proteínas citadas más arriba, los cuales interreaccionan con
ligandos de afinidad específicos. Las proteínas y péptidos
sintéticos comprenden para la expresión tanto pseudógenos o
fragmentos de los mismos, como también de proteínas o péptidos con
una secuencia de aminoácidos accidental.
Con el término "moléculas de bajo peso
molecular" se entienden moléculas que son de poca complejidad
molecular como las macromoléculas definidas más arriba. En la
literatura el término "moléculas pequeñas" ("small
molecules") ó moléculas de bajo peso molecular ("low molecular
weight molecules") no se emplea de una manera uniforme. En WO
89/03041 y WO 89/03042 se describen moléculas con una masa molecular
de hasta 7000 g/mol como moléculas pequeñas. Normalmente se habla
de masas moleculares entre 50 y 3000 g/mol, más a menudo entre 75 y
2000 g/mol y la mayor parte de las veces en el margen entre 100 y
1000 g/mol. Ejemplos para el experto figuran en los documentos
WO86/02736, WO97/31269,
US-A-5928868,
US-A-5242902,
US-A-5468651,
US-A-5547853,
US-A-5616562,
US-A-5641690,
US-A-4956303 y
US-A-5928643.
Como ejemplos para dichas moléculas pequeñas
pueden mencionarse los oligómeros o también pequeñas moléculas
orgánicas, como los oligopéptidos, oligonucleótidos, hidratos de
carbono (glicosidos) isoprenoides o estructuras lípidas. En la
literatura, la mayor parte de las veces el peso molecular representa
la base de la definición de dichas moléculas pequeñas.
En una versión también preferida del empleo
según la invención, la substancia que se une al receptor o reconoce
al receptor, comprende otro dominio, el cual puede inducir una
función inmunológica efectora. El término "función inmunológica
efectora" describe en relación con la invención entre otras, las
funciones efectoras del sistema inmunológico, las cuales conducen a
una eliminación de la célula que lleva el receptor (célula diana).
La eliminación es de preferencia una inducción a la muerte
programada de células (apoptosis), pero eventualmente también una
eliminación necrótica de células diana. Procedimientos in
vitro para la detección de la muerte de células son ya
conocidos por el experto (véase entre otros, Dulat et al.,
(2001)).
La inducción de dichas funciones efectoras
inmunológicas es de preferencia la inducción de una señal, la cual
marca la célula diana para el sistema inmunológico del organismo. De
preferencia, la célula diana es reconocida solamente mediante esta
inducción del sistema inmunológico. Es igualmente preferido el que
mediante esta inducción la célula del sistema inmunológico se
reconoce mejor. El reconocimiento o respectivamente el mejor
reconocimiento de la célula diana mediante el sistema inmunológico
hace posible la terapia de la célula diana.
En una versión preferida, la función efectora
inducida inmunológicamente es una función efectora celular.
Ejemplos de funciones efectoras inducidas
inmunológicamente son la eliminación de células diana mediante
células T efectoras, monocitos o macrófagos. En particular, la
función efectora celular comprende las funciones efectoras
inducidas por MHC e inducidas por el receptor F_{c}.
En una versión alternativa preferida, la función
efectora inmunológicamente inducida es una función efectora
humoral.
Ejemplos de funciones efectoras humorales del
sistema inmunológico son las reacciones inducidas por los
anticuerpos o las reacciones del sistema complementario. Respecto a
esto, la inducción es una opsonización de las células diana, una
versión preferida de la invención.
Las figuras muestran:
Representación esquemática de los receptores de
la ricina (figura 1A) y rViscumina (figura 1B). La representación
resulta de la interpretación de los resultados compendiados de la
figura 2 y 3 así como de la figura 4 y 5, a partir de los "TLC
Overlay Assays" ("ensayos TLC de capa sobrepuesta"). Gal =
galactosa, GlcNAc =
N-acetil-glucosamina, Glc =
glucosa, Cer = ceramida, Sialic = ácido siálico. En el caso de los
receptores de la rViscumina, se trata de gangliósidos con radicales
ácido siálico unidos \alpha2-6, situados en los
extremos. El reconocimiento de estructuras reconocidas mediante
ricina (figura 1A) no tiene lugar mediante la rViscumina.
Ensayos TLC de capa sobrepuesta, de unión de
rViscumina con GSL (A) neutros y gangliósidos (B) de granulocitos
humanos. (A) línea a: cromatograma de 15 \mug de GSL neutros
(teñidos con orcinol, tintura total del azúcar); línea b:
perteneciente al ensayo de capa sobrepuesta. (B) línea a:
cromatograma de 15 \mug de gangliósidos de granulocitos humanos
(teñidos con resorcinol, coloración de ácido siálico); línea b:
perteneciente al ensayo de capa sobrepuesta.
(A) Tintura con resorcinol (ejemplo 1); (B)
Ensayo TLC de sobrecapa de antisuero
anti-IV^{6}nLc4Cer (ejemplo 1); (C) Ensayo TLC de
sobrecapa de rViscumina (ejemplo 2); todos los ensayos TLC fueron
efectuados con monosialogangliósidos de la serie Neolacto
\alpha2-3 y \alpha2-6,
sializados, purificados con HPLC. La aplicación es idéntica en los
tres cromatogramas: huellas a: 15 \mug de gangliósidos de cerebro
humano (HBG); huellas b: 15 \mug de gangliósidos de granulocitos
humanos (HGG); huellas c; 4 \mug IV^{3}nLc4Cer (HGG1); huellas
d: 4 \mug VI^{3}nLc6Cer (HGG2); huellas e: 4 \mug
IV^{6}nLc4Cer (HGG3); huellas f: 8 \mug VI^{6}nLc6Cer y
IV^{6}nLc4Cer.
\global\parskip0.900000\baselineskip
(A) tintura con orcinol y (B) ensayo TLC de capa
sobrepuesta de ricina con GSL neutros. La aplicación es igual en
ambos cromatogramas. Huellas a: 10 \mug de GSL neutros de
eritrocitos humanos: huellas b: 15 \mug de GSL neutros de
granulocitos humanos; huellas c: 20 \mug de GSL neutros de células
MDAY-D2.
(A) tintura con orcinol y (B) ensayo TLC de capa
sobrepuesta de ricina con gangliósidos. Huellas a: 10 \mug de
gangliósidos de cerebro humano (HBG); huellas b: 8 \mug de
gangliósidos de granulocitos humanos (HGG).
Descripción de la actividad biológica de la
rViscumina: Se registro la viabilidad de células
HL-60 (línea de puntos), células 5637 (líneas con
triángulos) y células CHO-K1 (líneas con círculos
blancos), frente a la concentración de rViscumina. La viabilidad se
representó mediante reacción colorimétrica de WST-1
medida y como % de células vivas en comparación con un control sin
tratar. La mitad de la citotoxicidad máxima, la cual corresponde al
punto de inflexión de la curva se tomó como magnitud de la medida.
Estos valores IC_{50} fueron para HL-60 de 66
pg/ml y para Las células 5637 de 690 pg/ml. Las células
CHO-K1 fueron clasificadas, a una concentración de
rViscumina medida empleada, de 300 ng/ml, como insensibles frente a
la rViscumina.
(A) Tintura con orcinol, y (B) ensayo TLC de
capa sobrepuesta de antisuero anti IV^{6}nLc4Cer, con gangliósidos
a partir de líneas celulares propagadas in vitro.
(A) Huella a: 7 \mug de gangliósidos de
granulocitos humanos (HGG); huella b: gangliósidos de 1 x 10^{7}
células CHO-K1; huella c: gangliósidos de 4 x
10^{7} células 5637: huella d: gangliósidos de 4 x 10^{7}
células HL-60; huella e: 10 \mug de gangliósidos
de cerebro humano (HBG).
(B) Huella a: 0,134 \mug de gangliósidos de
granulocitos humanos (HGG); huella b: gangliósidos de 1 x 10^{7}
células CHO-K1; huella c: gangliósidos de 1 x
10^{7} células 5637: huella d: gangliósidos de 1 x 10^{7}
células HL-60; huella e: 10 \mug de gangliósidos
de cerebro humano (HBG). La huella a muestra para la identificación
del gangliósido específico de la serie Neo-lacto,
los dos controles positivos IV^{6}nLc4Cer (ácido graso de 24C,
substancia 1) y IV^{6}nLc4Cer (ácido graso de 16C, substancia
2).
Se añadieron cantidades crecientes de
gangliósidos de granulocitos humanos (HGG) en cavidades cubiertas
con células CHO-K1, y allí se incubaron durante 48
horas. Las células fueron lavadas, o bien con medio exento de suero
(columnas de color gris claro) o con medio que contenía suero
(columnas oscuras) y a continuación se trataron con 300 ng/ml de
rViscumina durante otras 48 horas. La viabilidad se midió con
WST-1 y se expresó como % del control no tratado
(sin gangliósidos ni rViscumina).
Las cantidades de GSL de distintas procedencias
corresponden con las columnas de izquierda a derecha:
A) GSL neutros de eritrocitos humanos: 10, 5,
2,5, 1,25 y 0 \mug
B) GSL neutros de granulocitos humanos: 15,
7,5, 3,75, 1,9 y 0 \mug
C) GSL neutros de células
MDAY-D2: 20, 10, 5, 2,5, y 0 \mug
D) Gangliósidos de cerebro humano (HBG): 10, 5,
2,5, 1,25 y 0 \mug
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ensayo de diferentes clones de hibridomas
después del aislamiento en la producción de IgM (A) e IgG (B) en el
análisis ELISA. El análisis ELISA se ejecutó como se ha descrito en
el ejemplo 8. El tiempo de incubación de la solución del substrato
se varió (15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 120
minutos y 180 minutos). Los clones 33.3, 33.5 y 33.6 muestran un
título claro de IgM (A). Un título de IgG no ha podido comprobarse
en ninguno de los clones ensayados (B).
Ensayo TLC de capa sobrepuesta para la
caracterización del motivo de reconocimiento de los clones mAk. Los
clones ya representados en la figura 10, como se ha descrito en el
ejemplo 2 para la detección de los gangliósidos de granulocitos
humanos (4 \mug/huella), los cuales fueron separados sobre las
placas DC, fueron investigados para determinar su motivo de
reconocimiento. Los clones 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6 muestran
idéntico motivo de unión o respectivamente motivo de reconocimiento
para la rViscumina.
Ensayos TLC de capa sobrepuesta con (A) GSL
neutros aislados, de la serie Neolacto de granulocitos humanos (15
\mug por huella), (B) de la serie Globo (de eritrocitos humanos;
10 \mug por huella) así como (C), de la serie Ganglio (de células
MDAY-D2; 10 \mug por huella). El proceder
experimental está descrito en el ejemplo 9. En cada uno de las tres
primeras huellas de la figura 12 A hasta C, se emplearon los clones
mAk, 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6. Los controles positivos en las
huellas 4 de la figura 12 A-C mostraron cada vez
reacciones con anticuerpos específicas contra las estructuras de
azúcar situadas en los extremos de los GSL neutros aplicados. En
las huellas 5 se ha ensayado un antisuero policlonal de cabra (ver
Müthing et al., Glycobiology ("Glicobiología") 12,
485-487. Una actividad cruzada de los clones mAk
ensayados en las huellas 1 a 3, puede excluirse.
Sobre un gel de SDS se aplicaron cada vez, 1
\mug de las correspondientes proteínas en la huella T:
transferrina, proteína soluble con radicales
Neu5Aca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así
como en la huella AF: asialofetuina, (restos de
Gal\beta1-4GlcNAc y
Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), y a
continuación se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa.
En un procedimiento Western Blot se ensayó a continuación la
estructura del CD75s con rViscumina (1 \mug/ml), y a continuación
se detectó con el mAk TA5 anti-cadena A y la IgG
anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina (ver
ejemplo 2). M muestra las huellas del marcador. Los pesos
moleculares vienen dados en kDa.
Se aplican cada vez 1 \mug de las
correspondientes proteínas en la huella T: transferrina, proteína
soluble con radicales
Neu5Aca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así
como en la huella AF: asialofetuina, radicales
(Gal\beta1-4GlcNAc) y
Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), en un
gel de SDS, y a continuación se transfieren sobre una membrana de
celulosa. En un procedimiento de Western Blot se ensayó a
continuación, la detección de la estructura del CD75s mediante el
mAk 59.33.3 así como el 59.33.5, como se ha descrito en el ejemplo
9.
Los siguientes ejemplos aclaran le invención
descrita.
Se obtuvieron GSL neutros a partir de
granulocitos humanos, eritrocitos humanos, y células
MDAY-D2, y gangliósidos a partir de granulocitos
humanos y cerebro humano (figura 2, figura 4, figura 5 y figura 7) ó
se emplearon para el análisis muestras purificadas mediante HPLC
(figura 3). Las muestras correspondientes fueron separadas sobre
una placa cubierta de cromatografía en capa fina (placas HPTLC, 10 x
10 cm, 0,2 mm de grueso de Merck, Darmstadt, # 5633). Se separaron
los GSL neutros en el disolvente 1 (cloroformo/metanol/agua,
120/70/17 v/v/v) y los gangliósidos en el disolvente 2
(cloroformo/metanol/agua 120/85/20 v/v/v + 2 mM de CaCl_{2}). Los
GSL neutros se tiñeron con orcinol y los gangliósidos se tiñeron o
bien con orcinol o bien con resorcinol (Svennerholm, 1956, 1957).
Los GSL neutros de granulocitos humanos y las células
MDAY-D2 así como también los gangliósidos de
granulocitos humanos aparecen sobre las placas DC como bandas
dobles.
Para la identificación de los gangliósidos
individuales se efectuó un procedimiento inmunológico de tintura
según Müthing y Mühlradt (1988) así como Müthing (1998) mediante
antisueros específicos. Los gangliósidos de la serie Neolacto
\alpha2-6-sializados terminales
fueron identificados con un antisuero policlonal
anti-IV^{6}nLc4Cer. Para ello se fijó la placa en
primer lugar con metacrilato de poliisobutilo (Röhm, Darmstadt). A
continuación la placa fue bloqueada en PBS (20 mM de fosfato, 150
mM de Na Cl, pH 7,2) + 1% de BSA (solución A). A continuación el
antisuero policlonal más arriba citado se empleó en una dilución
1:1000 en la solución A y a continuación se lavó 3x con solución B
(PBS + 0,05% de Tween 20). El antisuero unido se detectó con el
antisuero secundario de conejo anti IgY de pollo en una dilución
1:2000 en solución A. A continuación se lavó 3x con solución B y 1x
con tampón de glicina (0,1 M de glicina, 1 mM de ZnCl_{2}, 1 mM de
MgCl_{2}, pH 10,4). La detección se efectuó con 0,05% (p/v) de
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
en tampón de glicina. Los gangliósidos de control caracterizados
con detalle, empleados en los diferentes ensayos TLC, los cuales
fueron empleados como material de referencia para la identificación
de los gangliósidos específicos para la rViscumina, procedían de
diferentes aislados de células sanguíneas humanas o cultivos
celulares (Müthing et al., 1994; Müthing y Kemminer, 1996;
Schwartz et al., 1985; Müthing y Cacic, 1997).
GSL neutros o gangliósidos separados sobre una
placa de cromatografía en capa fina, se lavaron con
PBS-Tween 80 (0,1 g/litro de Tween 80 en PBS). A
continuación, una solución de proteínas se recubrió con rViscumina
o ricina (1 \mug/ml en PBS-T80) y se incubó
durante 1 hora. A continuación se lavó con una solución B (ver
ejemplo 1) y a continuación se incubó la placa durante 15 minutos en
la solución A (ver ejemplo 1). A esto se añadió un reconocimiento
de la rViscumina unida mediante el AK TA5 monoclonal (1 \mug/ml en
solución A) descrito por Tonevitzky et al., 1995, ó
respectivamente un reconocimiento de la ricina unida mediante un
antisuero antiricina de conejo de Sigma #R-1254
(dilución 1:200 en la solución A). La detección del anticuerpo
unido se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 1 con los dos
anticuerpos necesarios cada vez contra la inmunoglobulina de ratón
o respectivamente de conejo.
Cultivo: células CHO-K1 (ATCC
CCL-81) y células HL-60 (ATCC
CCL-240) fueron cultivadas en una mezcla 1:1 de
DMEM y medio F12 de Ham. La línea celular de carcinoma de vejiga
5637 (ATCC HTB-9) fue cultivada en RPMI 1640. Un
cultivo de células se efectuó en condiciones estándar como se
describe por Möckel et al., 1997. La sensibilidad de las
líneas celulares a la rViscumina fue determinada en un ensayo de
citotoxicidad in vitro. Se plaquearon 8 x 10^{3} células
5637, 1 x 10^{4} células CHO-K1 y 1,8 x 10^{4}
células HL-60 cada vez por cavidad en placas de 96
pocillos (Nunc), y se incubó con concentraciones crecientes de
rViscumina en un volumen final de 100 \mulitros durante 72 horas
a 37ºC en una atmósfera con el 10% de CO_{2}. Todas las mediciones
fueron efectuadas en una determinación séxtuple. Después de 72
horas, para la detección de células vivas se pipetearon 10
\mulitros de WST-1 (Ishiyama et al., 1993;
Möckel et al., 1997). Las células se incubaron con sal de
colorante durante 4 horas a 37ºC, y a continuación se midieron a 450
nm en el Thermomax de Molecular Devices. La cantidad de colorante
es directamente proporcional al número de células vivas. En la
figura 6 se muestran las curvas de viabilidad de las diferentes
poblaciones de células frente a concentraciones crecientes de
rViscumina.
La línea celular HL-60 (línea de
puntos) representa una línea celular promieloica humana que
reacciona muy sensiblemente a la rViscumina con un valor IC_{50}
de 66 pg/ml. En la línea celular del carcinoma de vejiga 5637
(línea de triángulos) se midió un valor IC_{50} de 690 pg/ml, la
línea celular de hamster CHO K1 (línea de círculos blancos) no
mostró hasta una concentración ensayada de 300 ng/ml ninguna
sensibilidad frente a la rViscumina. En la figura 7 pudo
correlacionarse la sensibilidad de las diferentes líneas celulares
frente a la rViscumina con la aparición del potencial receptor. En
la figura 7A se representa un cromatograma en capa fina teñido con
orcinol de las fracciones del total de gangliósidos de las
correspondientes líneas celulares empleadas. La figura 7B muestra
la detección específica inmunológica de los receptores potenciales
de la rViscumina con un
anti-Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc-R
antisuero (ensayo de capa sobrepuesta). En las huellas b, c y d de
la figura 7B se aplican cada vez cantidades de gangliósidos del
mismo número de células de CHO-K1, 5637 y
HL-60. Las células CHO-K1 referidas
insensibles a la rViscumina, no muestran en la huella b de la figura
7B ninguna banda específica a la altura del receptor potencial,
mientras que la línea celular más sensible (HL-60)
con el mismo número de células aplicadas presenta la doble banda más
intensa.
Las distintas especificidades observadas en los
ensayos TLC de capa sobrepuesta de las lectinas investigadas,
permiten deducir el comportamiento de la unión de la ricina y la
lectina de muérdago (en particular, la rViscumina) con sus
receptores in vivo o respectivamente en cultivos celulares.
En los ejemplos se describe que la línea celular
CHO-K1 frente a una concentración de rViscumina
ensayada de hasta 300 ng/ml es insensible (ver figura 6). Mediante
una introducción de gangliósidos específicos para la rViscumina en
las membranas de las células CHO-K1 (estructuras
Neu5Ac \alpha2-6 Gal), dichas células que son muy
insensibles frente a la rViscumina, por el contrario, se
sensibilizaron (ver figura 8).
Se sembraron células CHO-K1 con
una densidad celular de 5 x 10^{3} por cavidad en placas de 96
pocillos. Las células se cultivaron durante 24 horas a 37ºC en un
medio de cultivo X-Vivo exento de suero
(Biowhittaker). A continuación el medio se tiró y se substituyó por
medio de cultivo X-Vivo que contenía 0 (control),
25, 50, 100 y 200 \muM de una fracción de gangliósidos de
granulocitos humanos. Para la incorporación de los gangliósidos en
la membrana de las células CHO-K1, éstas fueron
mantenidas a 37ºC durante 48 horas en condiciones de cultivo
celular. A continuación las células fueron lavadas intensamente, o
bien con X-Vivo sin suero ó bien con
X-Vivo conteniendo 5% de FCS. Las células fueron a
continuación tratadas con rViscumina (300 ng/ml) durante 48 horas.
La viabilidad de las células se cuantificó mediante tintura con
WST-1, y se correlacionó con el control no tratado
(sin adición ni de rViscumina ni de gangliósidos). Las pruebas se
repitieron por triplicado con un volumen final de 100 \mul por
cavidad.
Representación de la masa celular para el
aislamiento subsiguiente de GSL ó respectivamente gangliósidos: se
cultivaron células CHO-K1 (ATCC
CCL-81) y células HL-60 (ATCC
CCL-240) en una mezcla 1:1 de medio DMEM y F12 de
Ham. Las células fueron cultivadas en presencia de 50 mg/litro de
Gentamicina y 2,5 mg/litro de anfotericina B. Un cultivo de células
5637 se efectuó en frascos de 175 cm^{2}. Se cultivaron células
HL-60 y CHO-K1 en un frasco con
agitación de 1 litro como se describe en Duvar et al., (1996)
ó respectivamente Müthing et al., (1996b). Los ajustes
fisiológicos fueron: 37ºC, pH 7,2, desgasificado con oxígeno,
velocidad de agitación 40 rpm. Después de alcanzar la densidad
celular final, se recogieron las células, se lavaron 2x con PBS y a
continuación se sometieron a una extracción con cloroformo/metanol
(ver ejemplo 1). La línea celular de carcinoma de vejiga 5637 (ATCC
HTB-9) se cultivó en RPMI 1640. Los gangliósidos
fueron aislados según un procedimiento estándar empleando
cromatografía de intercambio aniónico en
DEAE-sefarosa CL-6B, como se
describe por Ledeen y Yu (1982), Müthing et al. (1987) ó
Duvar et al., (1997). Para la saponificación de los
fosfolípidos se incubaron los gangliósidos durante 1 hora a 37ºC en
NaOH 1 N. A continuación, la fracción de gangliósidos se neutralizó
con ácido acético y se dializó. Se añadió otro paso de purificación
mediante cromatografía de adsorción en "Iatrobeads"
6RS-8060 (Macherey & Nagel, Düren, Alemania)
(Ueno et al., 1978). En la separación de la fracción de
gangliósidos de los lisados celulares se partió siempre de un número
de células aproximadamente uniforme. Por consiguiente fue posible
una declaración semicuantitativa para la presencia del gangliósido
específico. La detección tuvo lugar inmunológicamente, como se ha
descrito en el ejemplo 1, con un antisuero policlonal
anti-IV^{6}nLc4Cer.
Una columna rellena de Fractogel EMD
TMAE-650-S (MERCK, Darmstadt) se
carga con los gangliósidos de granulocitos humanos (HGG). Los
gangliósidos unidos a TMAE se eluyen con un gradiente lineal de
acetato de amonio, se reunen y se eliminan las sales. Se obtuvieron
cuatro fracciones con terminales sialilizados
\alpha2-3 (HGG1 y HGG2) y terminales sialilizados
\alpha2-6 monosialogangliósidos del tipo neolacto
(HGG3 y HGG4). Todos los gangliósidos fueron separados mediante
cromatograsmas en capa fina en forma de bandas dobles. Las
diferencias tienen como base la unidad ceramida, la cual en el caso
de la banda superior tiene esterificado un ácido graso de 24
carbonos y en el caso de la banda inferior un ácido graso de 16
carbonos. Las estructuras de todos los gangliósidos obtenidos
mediante el método fueron ya caracterizados (Müthing et al.,
1993, Müthing et al., 1996, Metelmann et al., 2000).
Los gangliósidos purificados fueron separados en la figura 3 y
fueron referidos a una exacta especificación de la especificidad de
unión a los hidratos de carbono de la rViscumina.
El análisis ELLA se efectuó en placas
correspondientemente recubiertas con GSL neutro o gangliósidos (NUNC
MaxiSorp F96, Wiesbaden) a temperatura ambiente (RT). Las cavidades
se llenaron con los GSL correspondientes en 100 \mul de metanol.
A partir de una solución madre se prepararon diluciones 1:2. Estas
contenían los siguientes GSL: GSL neutros de eritrocitos humanos:
10, 5, 2,5 y 1,25 \mug; GSL neutros de granulocitos humanos: 15,
7,5, 3,75 y 1,9 \mug; GSL neutros de células
MDAY-D2: 20, 10, 5 y 2,5 \mug; gangliósidos de
cerebro humano (HBG): 10, 5, 2,5 y 1,25 \mug; gangliósidos de
granulocitos humanos (HGG): 10, 5, 2,5 y 1,25 \mug. A
continuación el metanol fue evaporado en una atmósfera seca (45
minutos a 37ºC). Todos los demás pasos se efectuaron con el ensayo
TLC de capa sobrepuesta como se ha descrito en el ejemplo 2. Todas
las incubaciones se efectuaron con un volumen de 100 \mul. Las
placas recubiertas con GSL se incubaron durante 15 minutos con
PBS-Tween 80® (0,01 mg/ml) y a continuación con 1
\mug de rViscumina (disuelta en PBS-Twenn 80)
durante 1 hora. A continuación las placas se lavaron con
PBS-Tween 20® (0,01 mg/ml) y a continuación se
incubaron 15 minutos en PBS. A continuación se incubaron las
muestras con anticuerpos monoclonales TA5 anti
ML-1A de ratón (1 \mug/ml en PBS) durante 1 hora.
Después de nuevos lavados de 3 veces con PBS-Tween
20® se incuban con un IgG anti-ratón (copulado con
fosfatasa alcalina) en una dilución 1:2000 en PBS (1 hora). Después
de nuevos lavados de 3 veces con PBS-Tween 20® tiene
lugar la detección colorimétrica con la reacción del substrato
4-nitrofenilfosfato disódico x 6 H_{2}O (16 mM en
tampón 0,1 M de glicina, pH 10,4). La placa se midió a 405 nm
después de 20 minutos de incubación a 25ºC, en un lector de placas
de microtitulación.
Contra lo esperado, solamente se pudo encontrar
una unión de la rViscumina en aquellos glicoesfingolípidos (GSL),
que presentaban una galactosa situada en el extremo de Neu5Ac unida
\alpha2-6 al GSL de la serie Neolacto (fracción
HGG de granulocitos humanos). Todos los otros GSL neutros de
diferentes procedencias (granulocitos y eritrocitos humanos,
células MDAY-D2), no mostraron en ningún caso
ninguna unión, incluso en las más altas concentraciones empleadas,
con radicales de galactosa situados en el extremo así como con
gangliósidos del cerebro humano de la serie Ganglio.
Los gangliósidos del tipo Neolacto sializados
\alpha2-6 se aislaron de leucocitos (obtenidos por
el método "buffy coat" a partir de sangre entera). La
purificación de los gangliósidos tuvo lugar como se ha descrito en
el ejemplo 5. En otro desarrollo sirvieron estos gangliósidos del
tipo Neolacto \alpha2-6 sializados, como
antígenos para la inmunización de 2 x 3 ratones. Puesto que los
antígenos solos debido a su pequeño tamaño no actúan como
inmunógenos, se administran a los ratones juntamente con los
llamados haptenos. A este respecto se efectúan paralelamente dos
procedimientos. En el procedimiento 1 se empleó
metil-BSA como hapteno en una concentración de 1
mg/ml. Los tres ratones recibieron distintas cantidades de antígeno
(5, 10 y 20 microgramos). Los ratones fueron inmunizados en
períodos conocidos y en total suplementados otras 2 veces en un
período de 10 días. En el procedimiento 2 se empleó una mezcla de
liposomas y lipopolisacárido (LPS) como hapteno. También aquí
fueron administradas a los tres ratones diferentes cantidades de
antígeno (5, 10 y 20 microgramos) cada vez en tres etapas de
aplicaciones en períodos de 10 días.
En el total de los seis ratones, que fueron
inmunizados mediante los dos procedimientos, pudieron determinarse
en la sangre de tres ratones títulos positivos frente al antígeno.
Las mezclas con los haptenos metil-BSA fueron
negativas. Las mezclas con el hapteno lipopolisacárido en liposomas
fueron todas positivas, independientemente de la dosis de antígeno
administrada. Un ratón fue sacrificado y las células del bazo se
aprovecharon para la fusión. Los sobrenadantes de las mezclas de
fusión se investigaron con un ensayo DC de capa sobrepuesta (como
se ha descrito en los ejemplos 1 y 2) y un análisis ELISA. A este
respecto, la placa de microtitulación, como se ha descrito en el
ejemplo 7, se recubrió con 1 \mug de gangliósidos HGG
(gangliósidos de granulocitos humanos), en 50 \mul de metanol. Se
añadieron 50 \mul de las correspondientes muestras de plasma o
respectivamente sobrenadantes de las mezclas de fusión sin diluir
sobre las placas recubiertas y se incubaron durante 60 minutos a
25ºC. A continuación, se lavaron 3 x con PBS-T. Una
detección de IgM ó respectivamente IgG se efectuó con un anticuerpo
IgG anti-ratón o respectivamente con un IgM
anti-ratón, el cual se marcó con fosfatasa alcalina.
Se efectuó una reacción del substrato p-NPP como se
ha descrito en el ejemplo 7. Mezclas de fusión con título positivo
fueron a continuación separadas a nivel de clones. En la figura 10A
se muestra una detección de tre clones positivos de IgM (59.33.3,
59.33.5 así como 59.33.6). Todos los clones fueron investigados
también respecto a la producción de IGG, pero sin embargo tampoco
mostraron ninguna reacción positiva a la IgG (figura 10B).
Los gangliósidos del tipo Neolacto sializados
\alpha2-6 llevan siempre en su extremo final un
Neu5Ac\alpha2-6-Gal. Otro motivo
descrito también en el curso de esta invención comprende la
estructura de gangliósido
Neu5Ac\alpha2-6-Gal\beta1-4GlcNAc-R;
en donde "R" representa un radical. Este motivo está descrito
en la literatura como CD75s (Schwartz-Albiez
(2000), J. Biol. Regul. Homeost, Agents 14,
284-285). En la figura 11 se representaron los
ensayos DC de capa sobrepuesta con diferentes clones IgM, los
cuales como se ha descrito en el ejemplo 8 fueron analizados con un
análisis ELISA. Mediante cromatografía en capa fina fueron separados
los gangliósidos de los granulocitos humanos (HGG). El ensayo se
efectúa como se ha descrito en el ejemplo 2. Se separaron aquí 4
\mug de HGG. La detección de los anti-CD75s mAk
unidos a la placa se efectuó como se ha descrito en el ejemplo 8.
Los clones 59.33.3, 59.33.5 así como 59.33.6 mostraron también en
este ensayo una señal positiva. Los tres clones reconocieron los
mismos gangliósidos (IV^{6}nLC4 así como IV^{6}nLC6) y por lo
tanto tuvieron idénticos comportamientos a la unión que la
rViscumina (figura 2Bb). Una reactividad cruzada eventualmente
esperada de los tres anticuerpos frente a la región original de las
estructuras de azúcar, pudo deducirse experimentalmente mediante el
empleo de GSL neutros aislados a partir de, o bien de la serie
Neolacto de granulocitos humanos (15 \mug por huella; figura
12A), o bien de la serie Globo (de eritrocitos humanos; 10 \mug
por huella; en la figura 12B), así como de la serie Ganglio
(células MDAY-D2; 10 \mug por huella; en la figura
12 C). El comportamiento experimental fue idéntico al descrito más
arriba. En cada una de las tres primeras huellas de la figura 12 A a
la C no pudo ser detectada ninguna señal con el empleo de los
clones mAk 59.33.3, 59.33.5 y 59.33.6. La falta de los ácidos
siálicos unidos \alpha2-6 situados en el extremo
conduce en todos los tres casos a que se suprima una señal
específica. Los controles positivos en las huellas 4 de la figura 12
A-C reflejan las reacciones con anticuerpos
específicos contra las estructuras de azúcar situadas cada vez en el
extremo de los GSL neutros aplicados. En las huellas 5 ha sido
arrastrado un antisuero policlonal, de cabra (ver Müthing (2002)
Glicobiología 12, 485-497). Este antisuero el cual
originariamente fue obtenido contra gangliósidos del tipo Neolacto
sialilizados \alpha2-6, muestra contra muchos de
los antígenos arrastrados una reactividad cruzada, lo cual en
particular en un empleo de este antisuero en una investigación de
material de pacientes podía conducir a señales falsamente
positivas. Tanto más importantes son los resultados con los
anticuerpos monoclonales representados en las huellas 1 a 3,
59.33.3, 59.33.5 así como 59.33.6 a valorar, en los cuales dichas
actividades cruzadas no deseadas no aparecieron. El clon mAk
59.33.3 fue depositado el 20 de Diciembre de 2002 con el número de
acceso DSM ACC2580 en la DSMZ en Brunswick de acuerdo con el
Tratado de Budapest.
Los anticuerpos monoclonales 59.33.3 y 59.33.5
(figura 14) así como la propia rViscumina (figura 13) fueron
investigados acerca de su aplicabilidad para la detección de motivos
CD75 sobre las glicoproteínas. Se aplicó cada vez, 1 \mug de la
correspondiente proteína, en la huella T: transferina, proteína
soluble con radicales
NeuSAca2-6Gal\beta1-4GlcNAc, así
como en la huella AF: asialofetuina, radicales
(Gal\beta1-4GlcNAc y radicales
Gal\beta1-3GalNAc-Ser/Thr), en gel
SDS y a continuación se transfirieron sobre nitrocelulosa. Se
ensayaron seguidamente con un procedimiento Western Blot, las
estructuras CD75s ó bien con rViscumina (1 \mug/ml) y a
continuación, se detectaron con el mAk TA5
anti-cadena A y el anti-ratón IgG
(ver ejemplo 2) marcado con fosfatasa alcalina.
En el caso del ensayo de la unión/reconocimiento
del epitopo CD75s mediante el mAk 59.33.3 así como el 59.33.5, se
procedió después de la transferencia de las proteínas sobre la
nitrocelulosa, como se ha descrito en el ejemplo 9. La transferrina
se reconoció claramente a partir de los mAks 59.33.3 y 59.33.5 así
como la rViscumina.
Los dos clones de los anticuerpos 59.33.3 y
59.33.5 reconocen los motivos CD75s sobre la glicoproteína
transferrina como epitopos.
Agapov, I.I., Tonevitsky, A.G.,
Shamshiev, A.T., Phol, E., Pohl, P.,
Palmer, R.A., Kirpichnikov, M.P. (1997): The
role of structural domains in RIP II Toxin model membrane binding.
FEBS Lett., 402, 91-93.
Andre S., Unverzagt, C.,
Kojima, S., Dong, X., Fink, C., Kayser,
K., Gabius, H.J. (1997) Neoglycoproteins with the
synthetic complex biantennary nonasaccharide or its alpha 2,3/
alpha2/6-sialylated derivatives: their preparation,
assessment of their ligand properties for purified lectins, for
tumor cells in vitro, and in tissue sections, and their
biodistribution in tumor-bearing mice. Bioconjug
Chem 8, 845-855.
Barbieri, L., Battelli, M.G. y
Stirpe, F. (1993)
Ribosome-inactivating proteins from plants.
Biochim. Biophys. Acta, 1154,
237-282.
Beuth J, Ko HL, Gabius HJ,
Pulverer G. (1991) Influence of treatment with the
immunomodulatory effective dose of the
beta-galactoside-specific lectin
from mistletoe on tumor colonization in BALB/c-mice
for two experimental model systems. In Vivo; 5(1):
29-32.
Beuth J, Ko HL, Gabius HJ,
Burrichter H, Oette K, Pulverer G.
(1992) Behavior of lymphocyte subsets and expression of
activation markers in response to immunotherapy with
galactoside-specific lectin from mistletoe in breast
cancer patients. Clin Investig.; 70(8):
658-61.
Beuth J, Ko HL, Tunggal L,
Geisel J, Pulverer G. (1993) [Comparative
studies on the immunoactive action of
galactoside-specific mistletoe lectin. Pure
substance compared to the standardized extract].
Arzneimittelforschung.; 43(2):166-9.
German language.
Bocci V. (1993) Mistletoe
(viscum album) lectins as cytokine inducers and
immunoadjuvant in tumor therapy. J Biol Regul Homeost
Agents; 7(1): 1-6.
Bonk, Biopsie und
Operationspräparat; Kompendium für Ärzte und Studenten.
Critchley, D.R. Streuli, C.H.,
Kellie, S., Ansell, S., y Patel., B.
(1982): Characterisation of the cholera toxin receptor on
Balb/c 3T3 cells as a ganglioside similar to, or identical with,
ganglioside GM1. No evidence for galactoproteins with receptor
activity. Biochem J., 204, 209-219.
Debray, H., Montreuil, J. y
Franz, H. (1994) Fine sugar specificity of the
mistletoe (Viscum album) lectin I.
Glyco-conjugate J., 11,
550-557.
Dulat, HJ., von Grumbkow, C,
Baars, W., Schroder, N., Wonigeit, K.,
Schwinzer, R. (2001) Down-regulation
of human alloimmune responses by genetically engineered expression
of CD95 ligand on stimulatory and target cells. Eur J
Immunol., 7, 2217-26.
\newpage
Duvar, S., Müthing, J.,
Mohr, H. y Lehmann, J. (1996) Scale up
cultivation of primary human umbilical vein endothelial cells on
microcarriers from spinner vessels to bioreactor fermentation.
Cytotechnology, 21, 61-72.
Duvar, S.,
Peter-Katalini, J., Hanisch, F.-G. y
Müthing, J. (1997) Isolation and structural
characterization of glyco-sphingolipids of in
vitro propagated bovina aortic endothelial celas.
Glycobiology, 7, 1099-1109.
Eck, J., Langer, M.,
Möckel, B., Baur, A., Rothe, M., Zinke,
H. y Lentzen, H. (1999a) Cloning of the mistletoe
lectin gene and characterization of the recombinant
A-chain. Eur. J. Biochem., 264,
775-784.
Eck, J., Langer, M.,
Möckel, B., Witthohn, K., Zinke, H. y
Lentzen, H. (1999b). Characterization of recombinant
and plant-derived mistletoe lectin and their
B-chain. Eur. J. Biochem., 265,
788-797.
Endo Y, Oka T, Tsurugi K,
Franz H. (1989) The mechanism of action of the
cytotoxic lectin from Phoradendron californicum: the RNA
N-glycosidase activity of the protein. FEBS
Lett.; 248(1-2):
115-8.
Franz H, Haustein B, Luther
P, Kuropka U, Kindt A. (1977) Isolation and
characterization of mistletoe extracts (Viscum album L.). I.
Affinity chromatography of mistletoe extracts on immobilized plasma
proteins. Acta Blof Med Ger.; 36(1):
113-7.
Franz, H. (1986) Mistletoe lectin
and their A and B chains. Oncology, 43,
23-24.
Frantz, M., Jung, M.L.,
Riberau-Gayon, G., y Anton, R.
(2000) Modulation of mistletoe lectin (Viscum album
L.) Ictins cytotoxicity by carbohydrates and serum
glycoproteins. Arzneimittelf./Drug Res.
50,471-478.
Gabius HJ, Walzel H, Joshi
SS, Kruip J, Kojima S, Gerke V, Kratzin
H, Gabius S. (1992) The immunomodulatory
beta-galactoside-specific lectin
from mistletoe: partial sequence analysis, cell and tissue binding,
and impact on intracellular biosignalling of monocytic leukemia
cells. Anticancer Res.; 12(3):
669-75.
Gabius HJ, Gabius S, Joshi
SS, Koch B, Schroeder M, Manzke WM,
Westerhausen M. (1994) From
ill-defined extracts to the immunomodulatory
lectin: will there be a reason for oncological application of
mistletoe? Planta Med., 60(1):
2-7.
Gabius HJ y Gabius S; Die
Misteltherapie auf dem naturwissenschaftlichen Prüfstand. PZ.,
1994; 139, 9-16.
Galanina, O.E., Kaltner, H.,
Khraltsova, L.S., Bovin, N.V. y Gabius, H.-J.
(1997) Further refinement of the description of the
ligand-binding mistletoe lectin, a plant agglutinin
with immunomodulatory potency. J. Mol. Recogn., 10,
139-147.
Ganguly C y Das S. (1994)
Plant lectins as inhibitors of tumour growth and modulators of host
immune response. Chemotherapy; 40(4):
272-8.
Gilleron, M., Siebert, H.-C.,
Kaltner, H., von der Lieth, C.-W., Kozar, T.,
Halkes, K.M., Korchagina, E.Y., Bovin, N.V.,
Gabius, H.-J. y Vliegenthart, J. (1998)
Conformar selection and differential restriction of ligand mobility.
Eur. J. Biochem., 252, 416-427.
Gottstein, C., Schon, G.,
Tawadros, S., Kube, D.,
Wargalla-Plate, U.C., Hansmann, M.L.,
Wacker, H.H., Berthold, F., Diehl, V.,
Engert, A. (1994): Antidisialoganglioside ricin
A-chain immunotoxins show potent antitumor effects
in vitro and in a disseminated human neuroblastoma severa
immunodeficiency mouse model. Cancer Res. 54,
6186-6193.
Gupta, D., Kaltner, H.,
Dong, X., Gabius, H.-J. y Brewer, C.F.
(1996) Comparativa cross-linking activities
of lactose-specific plant and animal lectins and a
natural lactose-binding immunoglobulin G fraction
from human serum with asoalofetuin. Glycobiology, 6,
843-849.
Hajto T. Immunomodulatory effects of
iscador: a Viscum album preparation. Oncology,
1986; 43 Suppl 1: 51-65.
Hajto T, Hostanska K,
Gabius HJ. (1989) Modulatory potency of the
beta-galactoside-specific lectin
from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in
vivo in rabbits and patients. Cancer Res.; 49(17):
4803-8.
Hajto T, Hostanska K, Frei
K, Rordorf C, Gabius HJ. (1990) Increased
secretion of tumor necrosis factors alpha, interleukin 1, and
interleukin 6 by human mononuclear cells exposed to
beta-galactoside-specific lectin
from clinically applied mistletoe extract. Cancer Res.;
50(11): 3322-6.
Hakomori, S.-I., Handa, K.,
Iwabuchi, K., Yamamura, S. y Prinetti, A.
(1998) New insights in glycosphingolipid function:
"glycosignaling domain", a cell surface assembly of
glycosphingolipids with signal transducer molecules, involved in
cell adhesion coupled with signaling. Glycobiology, 8,
xi-xix.
\newpage
Hanasaki, K., Powell, L.D.,
Varki, A. (1995) Binding of human plasma
sialoglycoproteins by the B cell-specific lectin
CD22. Selective recognition of immunoglobulin M and haptoglobin.
J Biol Chem. 270(13), 7543-50.
Heiny BM, Beuth J. (1994)
Mistletoe extract standardized for the
galactoside-specific lectin (ML-1)
induces beta-endorphin release and
immunopotentiation in breast cancer patients. Anticancer
Res.; 14(3B): 1339-42.
Hermann T., Patel DJ.
(2000) Adaptive recognition by nucleic acid aptamers.
Science; 287 (5454), 820-5.
Hooper, N.M. (1999)
Detergent-insoluble
glycosphingolipid/cholesterol-rich membrane domains,
lipid rafts and caeolae (Review) Mol. Membr. Biol.,
16, 145-156.
Ishiyama, M., Shiga, M.,
Sasamoto, K., Mizoguchi, M. y He, P.
(1993) A new sulfonated tetrazolium salt that produces a
highly water-soluble formazan dye. Chem. Pharm.
Bull., 41, 1118-1122.
Kaltner, H., Lips, K.S.,
Reuter, G., Lippert, S., Sinowatz, F.,
Gabius, H.J. (1997): Quantitation and histochemical
localisation of galectin-1 and
galectin-1-reactive glycoconjugates
in fetal development of bovine organs. Histol. Histopathol,
12, 945-960.
Klein CA,
Schmidt-Kittier O, Schardt JA,
Pantel K, Speicher MR, Riethmuller G.
(1999) Comparative genomic hybridization, loss of
heterozygosity, and DNA sequence analysis of single cells. Proc
Natl Acad Sci USA; 96 (8), 4494-9.
Kremer et al. (1999),
Chirurgische Operationslehren, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart/New York, Band 4, S. 186; Band 7, 2, S. 370; Band E,
Seiten 146 bis 147 y Band 5, S. 238.
Langer, M., Möckel, B.,
Eck, J., Zinke, H., Lentzen, H. (2000)
Both biochemical activities of rViscumin are prerequisite for its
cytotoxic action. Proceedings of the American Association for
Cancer Research, 41, 655.
Ledeen, R.W. y Yu, R.K.
(1982) Gangliosides: structure, isolation and analysis.
Methods Enzymol., 83, 139-191.
Lee, R.T., Gabius, H.-J. y
Lee, Y.C. (1992) Ligand binding characteristics of the
major mistletoe lectin. J. Biol. Chem., 267,
23722-23727.
Lee, R.T., Gabius, H.-J. y
Lee, Y.C. (1994) The sugar combining area of the
galactose-specific toxic lectin of mistletoe extends
beyond the terminal sugar residue: comparison with a homologous
toxic lectin, ricin. Carbohydr. Res., 254,
269-276.
Lee, J., Sundaram, S.,
Sharper, N.L., Raju, T.S., y Stanley, P.
(2001): CHO cells may express six {beta}
4Galactosyltransferases. Consequences of the loss of funcitonal
{beta}4GalT-1, {beta}4GalT-6 or both
in CHO glycosyltion mutants. J. Biol. Chem. Feb. 2nd.
Magnani, J. L., Nilsson, B.,
Brockhaus, M., Zopf, D., Steplewski, Z.,
Koprowski, H. y Ginsburg, V. (1982) A
monoclonal antibody-defined antigen associated with
gastrointestinal cancer is a ganglioside containing sialylated
lacto-N-fucopentaose II, J. Biol. Chem. 257,
14365-14369.
Malte (1998), Angiologie in
Klinik und Praxis, Georg Thieme Verlag, S. 258.
Mannel DN, Becker H, Gundt
A, Kist A, Franz H. (1991) Induction of tumor
necrosis factor expression by a lectin from Viscum album.
Cancer Immunol Immunother.; 33(3):
177-82.
Metelmann, W., Müthing, J. y
Peter-Katalini, J. (2000)
Nano-electrospray ionization quadrupole
time-of-flight tandem mass
spectrometry analysis of a ganglioside mixture from human
granulocytes. Rapid Commun. Mass Spectrom., 14,
543-550.
Möckel, B., Schwarz, T.,
Zinke, H., Eck, J., Langer, M. y
Lentzen, H. (1997) Effects of mistletoe lectin I on
human blood cell lines and peripheral blood cells: cytotoxicity,
apoptosis and induction of cytokines. Drug Res., 47,
1145-1151.
Müthing, J., Egge, H.,
Kniep, B., y Mühlradt, P. F. (1987) Structural
characterization of gangliosides from murine T lymphocytes, Eur.
J. Biochem. 163, 407-416.
Müthing, J. y Mühlradt, P. F.
(1988) Detection of gangliosides of the G_{M1b} type on
high-performance thin-layer
chromatography plates by immunostaining after neuraminidase
treatment, Anal. Biochem. 173,
10-17.
Müthing, J., Unland, F.,
Heitmann, D., Orlich, M., Hanisch, F.-G.,
Peter-Katalinic, J., Knäuper, V.,
Tschesche, H., Keim, S., Schauer, R. y
Lehmann, J. (1993) Different binding capacities of
influenza A and Sendai viruses to gangliosides from human
granulocytes, Glycoconjugate J. 10,
120-126.
Müthing, J., Maurer, U.,
Sostari, K., Neumann, U., Brandt, H.,
Duvar, S., Peter-Katalinic, J. y
Weber-Schürholz, S. (1994) Different
distributions of glycosphingolipids in mouse and rabbit skeletal
muscle demonstrated by biochemical and immunohistolical analyses.
J. Biochem., 115, 248-256.
Müthing, J. y Kemminer, S.E.
(1996) Nondestructive detection of neutral glycosphingolipids
with lipophilic anionic fluorochromes and their employment for
preparative high-performance
thin-layer chromatography. Anal. Biochem.,
238, 195-202.
Müthing, J., Spanbroek, R.,
Peter-Katalini, J., Hanisch, F.-G.,
Hanski, C., Hasegawa, A., Unland, F.,
Lehmann, J., Tschesche, H. y Egge, H.
(1996a) Isolation and structural characterization of
fucosylated gangliosides with linear
poly-N-acetyllactosaminyl chains
from human granulocytes. Glycobiology, 6,
147-156.
Müthing, J., Duvar, S.,
Nerger, S., Büntemeyer, H. y Lehmann, J.
(1996b) Microcarrier cultivation of bovina aortic
endothelial cells in spinner vessels and a
membrane-stirred bioreactor. Cytotechnology,
18, 193-206.
Müthing, J. y Cacic, M.
(1997) Glycosphingolipid expression in human skeletal and
heart muscle assessed by immunostaining thin-layer
chromatography. Glycoconjugate J., 14,
19-28.
Müthing, J. (1998) TLC in
structure and recognition studies of glycosphingolipids. In
Hounsell, E.F. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 76:
Glycoanalysis Protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.
183-195.
Mülhardt, C. (2000) Der
Experimentator: Molekularbiologie, 2. Auflage, Spektrum Akad.
Verlag.
Niethard y Pfeil (1997)
Orthopädie, 3. Auflage, Hippokrates Verlag Stuttgart.
Olsnes, S., Stirpe, F.,
Sandvig, K. y Phil, A. (1982) Isolation and
characterization of viscumin, a toxic lectin from Viscum album
L. (mistletoe). J. Biol. Chem., 257,
13263-13270.
Pan CL, Yuki N, Koga M,
Chiang MC, Hsieh ST. Acute sensory ataxic neuropathy
associated with monospecific anti-GD1b IgG
antibody. Neurology 2001, 9;
57(7):1316-8.
Pohl, P., Saparow, S.M.,
Pohl, E.E., Evtodienko, V.Y., Agapov, I.I., y
Tonevitsky, A.G. (1998a): Dehydration of model
membranas induced by lectins from Ricinus communis and
Viscum album. Biophys. J., 75,
2868-2876.
Pohl, P., Antonenko, Y.N.,
Evtodienko, V.Y., Pohl, E.E., Saparow, S.M.,
Agapov, I.I., y Tonevitsky, A.G. (1998b):
Membrana fusion mediated by ricin and viscumin. Biochim Biophys
Acta, 1371, 11-16.
Pichlmayr y Löhlein (1991),
Chirurgische Therapie, Springer Verlag, S. 225, 130, 89, 93,
116, 546 y 547.
Radsak, K., Schwarzmann, G. y
Wiegandt, H. (1982) Studies on cell association of
exogenously added sialo-glycolipids.
Hoppe-Seyter's Z. Physiol. Chem., 363,
263-272.
Rehm, H. (2000) Der
Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics, 3 Auflage, Spektrum
Akad. Verlag.
Rutenber, E., Ready, M, y
Robertus, J.D., (1987), Structure and evolution of
ricin B-chain. Nature, 326,
624-626.
Samal, A.B., Gabius, H.J.,
Timoshenko, A.V. (1995)
Galactose-specific lectin from Viscum album
as a mediator of aggregation and priming of human platlets.
Anticancer Res. 15, 361-367.
Saqr, H.E., Pearl, D.K., y
Yates, A.J. (1993) A review and predictive model of
ganglioside uptake by biological membranes. J. Neurochem.,
61, 395-411.
Schwartz, R., Kniep, B.,
Müthing, J. y Mühlradt, P.F. (1985)
Glycoconjugates of murine tumor fines with different metastatic
capacities. II. Diversity of glycolipid composition, Int. J.
Cancer, 36, 601-607.
Simons, K. y Ikonen, E.
(1997) Functional rafts in cell membranes. Nature,
387, 569-572.
Stoffel, B., Kramer, K.,
Mayer, H., y Beuth, J. (1997): Immunomodulating
efficacy of combined administration of
galactoside-specific lectin standardized mistletoe
extract and sodium selenits in BALB/c-mice.
Anticancer Res 17, 1893-1896.
Svennerholm, L. (1956) The
quantitative estimation of cerebrosides in nervous tissue. J.
Neurochem., 1, 42-53.
Svennerholm, L. (1957)
Quantitative estimation of sialic acids. Biochim. Biophys.
Acta., 24, 604-611.
Svennerholm, L. (1963)
Chromatographic separation of human brain gangliosides, J.
Neurochem., 10, 613-623.
Thomson, T.A., Hayes, M.M.,
Spinelli, J.J., Hilland, E., Sawrenko, C.,
Phillips, D., Dupuis, B. y Parker, R.L.
(2001) Her-2/neu in breast cancer:
interobserver variability and performance in immunohistochemistry
with 4 antibodies compared with fluorescent in situ
hybridisation. Mod. Pathol. 14,
1079-1086.
Tonevitsky, A.G., Zhukova, O.S.,
Mirimanova, N.V., Omelyanenko, V.G., Timofeeva,
N.V., y Bergelson, L.D. (1990) Effect of gangliosides
on binding, internalisation and cytotoxic activity of ricin. FEBS
Lett., 264, 249-252.
Tonevitsky, A.G., Rakhmanova,
V.A., Agapov, I.I., Shamshiev, A.T., Usacheva,
E.A., Prokoph'ev, S.A., Denisenko, O.N.,
Alekseev, Y. y Pfüller, U. (1995) The
interactions of anti-MLI monoclonal antibodies with
isoform of the lectin from Viscum album. Immunol.
Lett., 44, 31-34.
Tur MK, Sasse S, Stocker M,
Djabelkhir K, Huhn M, Matthey B,
Gottstein C, Pfitzner T, Engert A, Barth
S. An anti-GD2 single chain Fv selected by phage
display and fused to Pseudomonas exotoxin A develops specific
cytotoxic activity against neuroblastoma derived cell fines. Int
J Mol Med. 2001 8(5):579-84.
Turpin, E., Goussault, Y.,
Lis, H., y Sharon, N. (1984): Nature of the
receptor sites for galactosyl-specific lectins on
human lymphocytes. Exp. Cell Res., 152,
486-492.
Ueno, K., Ando, S. y Yu,
R.K. (1978) Gangliosides of human, cat, and rabbit spinal
cords and cord myelin. J. Lipid Res., 19,
863-871.
Usui, H. y Hakomori, S.
(1994): Evaluation of ricin A
chain-containing immunotoxins directed against
glycolipid and glycoprotein on mouse lymphoma cells. Acta Med.
Okayama 48, 305-309.
Utsumi, T., Aizono, Y., y
Funatsu, G. (1987): Receptor-mediated
interaction of ricin with the lipid bilayer of ganglioside
GM1-liposomes. FEBS Lett., 216,
99-103.
Vang, O., Pii Larsen, K., y
Bog-Hansen, T.C. (1986) A new
quantitative highly specific assay for lectinbinding activity. In:
Lectins. Biology, Biochemistry, Clinical Biochenistry Vol. 5;
Eds.: Bog-Hansen, T.C., y van Driessche, E.
pp637-644, W. de Gruyter, Berlin, N.Y.
Voet, D., Voet, JG., (1994)
Wiley-VCH Verlag.
Wu, A.M., Chin, L.K.,
Franz, H., Pfüller, U., Herp, A. (1992):
Carbohydrate Specificity of the receptor sites of mistletoe toxin
lectin I. Biochim Biophys. Acta, 1117,
232-234.
Wu, A.M., Song, S.-C.,
Hwang, P.-Y., Wu, J.H. y Pfüller, U.
(1995a) Interaction of mistletoe toxic
lectin-I with sialo-glycoproteins.
Biochem. Biophys. Res. Commun., 214,
396-402.
Wu, A.M., Watkins, W.M.,
Chen, C-P., Song,
S-C., Chow L-P., y
Lin, J-Y (1995b) Native and/or
asialo-Tamm-Horsfall glycoproteins
sd(a+) are important receptors for triticum vulgaris
(wheatgerm) agglutinin and for three toxic lectins
(abrin-a ricin and mistletoe toxic lectin I) FEBS
Lett., 371, 32-34.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Viscum AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detemiunaciuón
de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de
muérdago
\vskip0.400000\baselineskip
<130> F 1827 PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión 3.1 de PatentIn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 855
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 285
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1958
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 647
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Viscum album
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
Claims (18)
1. Procedimiento in vitro para la
determinación de la capacidad de respuesta de un individuo para la
lectina de muérdago o para las cadenas individuales de la lectina
de muérdago, el cual procedimiento comprende el paso de la
detección específica cuantitativa y/o cualitativa de un receptor
situado en la membrana, en donde el receptor se caracteriza
por un ácido N-acetil-neuramínico
(Neu5Ac), situado en el extremo, el cual está unido mediante una
unión glicosídica \alpha2-6 con una galactosa
(Gal).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
donde el receptor comprende un gangliósido el cual después del
ácido N-acetil-neuramínico unido
\alpha2-6 a la galactosa, comprende por lo menos
una N-acetil-glucosamina
(GlcNAc).
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en donde el receptor comprende un gangliósido con la estructura
Neu5Ac\alpha2-6-Gal-[Gal/GlcNAc]_{x}-Cer.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el receptor comprende un
gangliósido con la estructura
Neu5Ac\alpha2-6-[Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3]_{x}Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde el receptor comprende un
gangliósido con la estructura
Neu5Ac\alpha2-6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer
ó bien un gangliósido con la estructura
Neu5Ac\alpha2-6-Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-3Gal\beta1-4Glc\beta1-1Cer.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el receptor está situado en la
membrana.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde la lectina de muérdago es la
lectina de muérdago recombinante/rViscumina.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
donde la lectina de muérdago recombinante comprende una secuencia
de aminoácidos, la cual está codificada mediante un polinucleótido
como se representa en SEQ ID Nr: 1, SEQ ID Nr: 3 ó SEQ ID Nr:
5.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
en donde la lectina de muérdago recombinante comprende un
polipéptido con una secuencia de aminoácidos, como se representa en
SEQ ID Nr: 2, SEQ ID Nr: 4 ó SEQ ID Nr: 6, ó un fragmento funcional
del mismo.
10. Composición para diagnóstico, que comprende
una substancia, que reconoce o se une específicamente a un receptor
como se define en las reivindicaciones 1 a 9, y se selecciona del
grupo formado por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos
de anticuerpos y aptámeros, en los cuales
- (i)
- la substancia detectable está marcada; o bien
- (ii)
- el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, el cual puede obtenerse a partir de una línea celular de hibridomas, la cual fue depositada el 20 de Diciembre de 20002 en la DSMZ de Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580.
11. Empleo de una substancia la cual reconoce o
se une específicamente a un receptor, como se describe en las
reivindicaciones 1 a 9, y se selecciona a partir del grupo formado
por anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos
y aptámeros, para la preparación de una composición para
diagnóstico para la detección de un receptor funcional de la lectina
de muérdago.
12. Empleo según la reivindicación 11, en donde
la substancia detectable está marcada.
13. Empleo según la reivindicación 11 ó 12, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
14. Empleo según la reivindicación 13, en donde
el anticuerpo monoclonal puede obtenerse a partir de una línea de
hibridomas, depositada el 20 de Diciembre de 2002 en DSMZ de
Brunswick con el número de acceso DSM ACC2580.
15. Empleo según una de las reivindicaciones 11
a 14, en donde la composición para diagnóstico para la detección
del receptor, como está definida en una de las reivindicaciones 1 a
8, se emplea sobre las células.
16. Empleo según la reivindicación 15, en donde
las células son células tumorales.
17. Empleo según la reivindicación 15 ó 16, en
donde las células proceden de un material de biopsia.
18. Empleo según la reivindicación 17 ó 18, en
donde las células se aíslan a partir de muestras de sangre.
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