JP4681226B2 - ヤドリギレクチンに対する個体の応答性を判定する方法 - Google Patents
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Description
リシン(図1A)および組換えヴィスクミン(図1B)のレセプターの概略図。示されるものは,図2および3および図4および5にまとめられているTLC重層アッセイの結果の解釈の結果である。Gal=ガラクトース,GlcNAc=N−アセチル−グルコサミン,Glc=グルコース,Cer=セラミド,Sialic=シアル酸。組換えヴィスクミンのレセプターは末端α2−6結合シアル酸残基を有するガングリオシドである。リシンにより認識される構造(図1A)の認識は,組換えヴィスクミンによっては行われない。
組換えヴィスクミンと,ヒト顆粒球の中性GSL(A)およびガングリオシド(B)とのTLC重層結合試験。(A)レーンa:15μgの中性GSLのクロマトグラム(オルシノールで染色,完全糖染色);レーンb:対応する重層アッセイ。(B)レーンa:ヒト顆粒球からの15μgのヒトガングリオシドのクロマトグラム(レゾルシノールで染色,シアル酸染色);レーンb:対応する重層アッセイ。
(A)レゾルシノール染色(実施例1);(B)抗IV6nLc4Cer抗血清のTLC重層試験(実施例1);(C)組換えヴィスクミンのTLC重層試験(実施例2):すべてのTLCアッセイは,HPLCで精製したα2−3−およびα2−6−シアリル化ネオラクト系モノシアロガングリオシドを用いて行った。適用は3つのクロマトグラムすべてについて同一である:レーンa:15μgのヒト脳ガングリオシド(HBG);レーンb:15μgのヒト顆粒球ガングリオシド(HGG);レーンc:4μgのIV3nLc4Cer(HGG1);レーンd:4μgのVI3nLc6Cer(HGG2);レーンe:4μgのIV6nLc4Cer(HGG3);レーンf:8μgのVI6nLc6CerおよびIV6nLc4Cer。
中性GSLを用いる(A)オルシノール染色および(B)リシンTLC重層試験。適用は両方のクロマトグラムについて同一である。レーンa:ヒト赤血球からの10μgの中性GSL:レーンb:ヒト顆粒球からの15μgの中性GSL;レーンc:MDAY−D2細胞からの20μgの中性GSL。
ガングリオシドを用いる(A)オルシノール染色および(B)リシンTLC重層試験。レーンa:10μgのヒト脳ガングリオシド(HBG);レーンb:8μgのヒト顆粒球ガングリオシド(HGG)。
組換えヴィスクミンの生物学的活性の説明:HL−60細胞(点),5637細胞(三角)およびCHO−K1細胞(白丸)の生存率を,組換えヴィスクミン濃度に対して示す。生存率はWST−1の比色反応により測定し,未処理対照と比較した%生存細胞として示す。最大の半分の細胞毒性は曲線の変曲点に対応し,これを測定可能な変数とした。これらのIC50値は,HL−60については66pg/ml,5637細胞については690pg/mlと計算された。CHO−K1細胞は,測定に適用した組換えヴィスクミン濃度である300ng/mlまでの組換えヴィスクミンに対して非感受性であると考えられる。
インビトロで増殖させた細胞株からのガングリオシドを用いる(A)オルシノール染色,および(B)抗IV6nLc4Cer抗血清TLC重層試験。(A)レーンa:7μgのヒト顆粒球ガングリオシド(HGG);レーンb:1x107個のCHO−K1細胞からのガングリオシド;レーンc:4x107個の5637細胞からのガングリオシド;レーンd:4x107個のHL−60細胞からのガングリオシド;レーンe:10μgのヒト脳ガングリオシド(HBG)。(B)レーンa:0.134μgのヒト顆粒球ガングリオシド(HGG);レーンb:1x107個のCHO−K1細胞からのガングリオシド;レーンc:1x107個の5637細胞からのガングリオシド;レーンd:1x107個のHL−60細胞からのガングリオシド;レーンe:10μgのヒト脳ガングリオシド(HBG)。レーンaは,ネオラクト系の特異的ガングリオシドの同定のための陽性対照IV6nLc4Cer(C24脂肪酸,物質1)およびIV6nLc4Cer(C16脂肪酸,物質2)を示す。
増加する量のヒト顆粒球ガングリオシドをウエルに入れ,ここでCHO−K1細胞を成長させ,48時間インキュベートした。細胞を無血清培地(薄い灰色のバンド)または血清含有培地(濃いバンド)のいずれかで洗浄し,次に300ng/mlの組換えヴィスクミンでさらに48時間処理した。生存率はWST−1を用いて測定し,未処理対照(ガングリオシドおよび組換えヴィスクミンを加えない)に対する%で表した。
異なる起源からのGSLの量は,左から右に以下のバンドに対応する:
A) ヒト赤血球からの中性GSL:10,5,2.5,1.25および0μg
B) ヒト顆粒球からの中性GSL:15,7.5,3.75,1.9および0μg
C) MDAY−D2細胞からの中性GSL:20,10,5,2.5および0μg
D) ヒト脳ガングリオシド(HBG):10,5,2.5,1.25および0μg
E) ヒト顆粒球ガングリオシド(HGG):10,5,2.5,1.25および0μg
種々のハイブリドーマクローンを薄めた後にELISAでIgM(A)およびIgG(B)の産生について試験した。ELISAは実施例8に記載されるようにして行った。基質溶液のインキュベート時間を変化させた(15分間,30分間,45分間,60分間,120分間および180分間)。クローン33.3,33.5および33.6は,IgMに対して明らかなタイターを示した(A)。試験したクローンのいずれにおいても,IgGに対するタイターは検出できなかった(B)。
mAbクローンの認識モチーフの特性決定のためのTLC重層アッセイ。実施例2に記載されるように,DCプレート上で分離されたヒト顆粒球ガングリオシド(4μg/レーン)を検出するために,図10に既に示したクローンを,その認識モチーフについて調べた。クローン59.33.3,59.33.5および59.33.6は,組換えヴィスクミンと同一の結合または認識モチーフを示す。
(A)ヒト顆粒球から単離したネオラクト系の中性GSL(15μg/レーン),(B)グロボ系(ヒト赤血球より;10μg/レーン)および(C)ガングリオ系(MDAY−D2細胞より;10μg/レーン)を用いるTLC重層アッセイ。実験方法は実施例9に記載される。図12A−Cのそれぞれの最初の3つのレーンにおいては,mAbクローン50.33.3,59.33.5および59.33.6を用いた。図12A−Cのレーン4の陽性対照は,適用した中性GSLの末端糖構造のそれぞれに対する特異的抗体との反応を反映する。レーン5においては,ヤギ由来のポリクローナル抗血清(Muthingら,Glycobiology 12,485−497を参照)を試験した。レーン1−3で試験したmAbクローンの交叉反応性は無視することができる。
それぞれ1μgの対応する蛋白質。レーンT:トランスフェリン,Neu5Aca2−6Galβ1−4GlcNAc残基を有する可溶性蛋白質,およびレーンAF:アシアロフェツイン,(Galβ1−4GlcNAc−残基およびGalβ1−3GalNAc−Ser/Thr)をSDSゲルに負荷し,次にニトロセルロース膜に写した。次にこれをウエスタンブロット手法において,組換えヴィスクミン(1μg/ml)により,次に抗A鎖mAbTA5およびアルカリホスファターゼ標識抗マウスIgGにより,CD75s構造の検出を試みた(実施例2を参照)。Mは標識の痕跡を反映する。分子量はkDaで示される。
それぞれ1μgの対応する蛋白質。レーンT:トランスフェリン,Neu5Aca2−6Galβ1−4GlcNAc残基を有する可溶性蛋白質,レーンAF:アシアロフェツイン,(Galβ1−4GlcNAc−残基およびGalβ1−3GalNAc−Ser/Thr)をSDSゲルに適用し,次にニトロセルロース膜に写した。次に,実施例9に記載されるように,ウエスタンブロットにおいて,mAb59.33.3および59.33.5を用いてCD75s構造の検出を試みた。
実施例1: スフィンゴ糖脂質を分離および検出し,これらを特異的に検出するための薄層クロマトグラフィー
中性GSLはヒト顆粒球,ヒト赤血球およびMDAY−D2細胞から回収し,ガングリオシドはヒト顆粒球およびヒト脳から回収した(図2,図4,図5および図7)。分析にはHPLC精製サンプルを用いた(図3)。対応するサンプルは,シリカゲルでコーティングした薄層クロマトグラフィープレート(HPTLCプレート,10x10cm,0.2mm厚さ,Merck,Darmstadt#5633)で分離した。中性GSLは溶媒1(クロロホルム/メタノール/水,120/70/17 v/v/v)中で,ガングリオシドは溶媒2(クロロホルム/メタノール/水120/85/20 v/v/v+2mMCaCl2)中で分離した。中性GSLはオルシノールで染色し,ガングリオシドはオルシノールまたはレゾルシノールのいずれかで染色した(Svennerholm,1956,1957)。ヒト顆粒球およびMDAY−D2細胞からの中性GSL,およびヒト顆粒球からのガングリオシドはDCプレート上で二本のバンドとして現れる。
薄層クロマトグラフィープレートで分離した中性GSLまたはガングリオシドをPBS−Tween80(0.1g/L Tween80,PBS中)で洗浄した。次に,組換えヴィスクミンまたはリシン蛋白質溶液(1μg/ml,PBS−T80中)でコーティングを行い,1時間インキュベートした。次に,溶液B(実施例1を参照)で洗浄し,次にプレートを溶液A(実施例1を参照)中で15分間インキュベートした。次に,結合した組換えヴィスクミンは,モノクローナルAbTA5(1μg/ml,溶液A中)(Tonevitzkyら1995に記載)を用いて認識し,または結合したリシンは,ウサギ抗リシン抗血清(Sigma#R−1254(溶液A中1:200希釈))で認識した。結合した抗体の検出は,それぞれマウスまたはウサギイムノグロブリンに対する二次抗体を用いて,実施例1に記載されるようにして行った。
培養:
CHO−K1細胞(ATCC CCL−81)およびHL−60細胞(ATCC CCL−240)は,DMEMおよびHam’sF12培地の1:1混合物中で成長させた。ヒト膀胱癌細胞株5637(ATCC HTB−9)はRPMI1640中で培養した。細胞の培養は,Mockelら(1997)に記載される標準的な条件下で行った。組換えヴィスクミンに対する細胞株の感受性は,インビトロ細胞毒性試験において確認した。それぞれウエルあたり8x103個の5637細胞,1x104個のCHO−K1細胞および1.8x104個のHL−60細胞を96ウエルプレート(Nunc)に播種し,増加する濃度の組換えヴィスクミンとともに,最終容量100μlで10%CO2雰囲気で37℃で72時間インキュベートした。すべての測定は6回の判定で行った。72時間後,生きている細胞を検出するために,10μlのWST−1をピペットで加えた(Ishiyamaら,1993;Mockelら,1997)。細胞は着色塩とともに37℃で4時間インキュベートし,次にThermomax(Molecular Devices)で450nmで測定した。ここでは,染料の量は生きている細胞の数に直接比例する。図6は,増加する組換えヴィスクミン濃度に対する種々の細胞集団の生存曲線を示す。
CHO−K1細胞を96ウエルプレートに細胞密度5x103細胞/ウエルで播種した。細胞は無血清X−Vivo培地(Biowhittaker)で37℃で24時間培養した。次に,培地を廃棄し,0(対照),25,50,100および200μMのヒト顆粒球ガングリオシド画分を含むX−Vivo培地で置き換えた。ガングリオシドをCHO−K1細胞の膜に取り込ませるために,細胞を細胞培養条件下で37℃で48時間保持した。次に,細胞を無血清X−Vivoまたは5%FCSを含有するX−Vivoのいずれかでよく洗浄した。次に,細胞を組換えヴィスクミン(300ng/ml)で48時間処理した。細胞の生存率はWST−1染色により定量し,未処理対照(組換えヴィスクミンおよびガングリオシドを加えない)と相関させた。サンプルは最終容量100μl/ウエルで三重に成長させた。
続くGSLまたはガングリオシドの単離のために細胞重量を示す:CHO−K1細胞(ATCC CCL−81)およびHL−60細胞(ATCC CCL−240)はDMEMとHam’sF12培地との1:1混合物中で培養した。細胞は50mg/Lのゲンタマイシンおよび2.5mg/LのアンホテリシンBの存在下で培養した。5637細胞の培養は,175cm2フラスコ中で行った。HL−60およびCHO−K1細胞は,Duvarら(1996)およびMuthingら(1996b)に記載されるようにして,1L−スピナーフラスコ中で培養した。生理学的パラメータは以下のとおりである:37℃,pH7.2,酸素燻蒸,撹拌速度:40rpm。最終細胞密度に達した後に細胞を回収し,PBSで2回洗浄し,次にクロロホルム/メタノール抽出を行った(実施例1を参照)。ヒト膀胱癌細胞株5637(ATCC HTB−9)は,RPMI1640中で培養した。Ledeen and Yu(1982),Muthingら(1987)またはDuvarら(1997)に記載されるように,陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる標準的方法により,DEAEセファロースCL−6Bでガングリオシドを単離した。リン脂質のサポニン化のためには,ガングリオシドを1N NaOH中で37℃で1時間インキュベートした。次に,ガングリオシド画分を酢酸で中和し,透析した。ラクトビーズ6RS−8060(Macherey&Nagel,Duren,Germany)(Uenoら,1987)への吸着クロマトグラフィーによりさらなる精製工程を行った。次に,細胞溶解物からガングリオシド画分を分離したとき,細胞の数が常にほぼ同じであると仮定した。すなわち,特定のガングリオシドの存在に関して,半定量的であるということが可能であった。検出は,実施例1に記載されるように,ポリクローナル抗IV6nLc4Cer抗血清を用いて免疫学的に行った。
Fractogel EMD TMAE−650−S(MERCK,Darmstadt)を充填したカラムにヒト顆粒球(HGG)からのガングリオシドを加える。TMAEに結合したガングリオシドは,酢酸アンモニアの直線勾配を用いて溶出し,プールし,脱イオン化する。末端α2−3−シアル化(HGG1およびHGG2)および末端α2−3−シアル化ネオラクト系モノシアロガングリオシド(HGG3およびHGG4)の4つの画分を得た。すべてのガングリオシドは,薄層クロマトグラフィーで二本のバンドとして分離された。この相違は,セラミド単位によるものであり,上側バンドはC24脂肪酸で,下側バンドはC16脂肪酸でエステル化されたものである。この方法で表すことができるすべてのガングリオシドの構造は既に特性決定されている(Muthingら,1993;Muthingら,1996,Metelmannら,2000)。精製したガングリオシドは,図3に示されるように分離され,組換えヴィスクミンの炭水化物結合特異性をより詳細に特徴づけるために参照された。
ELLAは,対応する中性GSLまたはガングリオシドで室温でコーティングされたプレート(NUNC MaxiSorp F96,Wiesbaden)で行った。ウエルに100μlメタノール中の対応するGSLを加えた。GSL保存溶液から出発して,1:2希釈を調製した。これには以下のGSLが含まれる:ヒト赤血球の中性GSL:10,5,2.5および1.25μg;ヒト顆粒球の中性GSL:15,7.5,3.75および1.9μg;MDAY−D2細胞からの中性GSL:20,10,5および2.5μg;ヒト脳ガングリオシド(HBG):10,5,2.5および1.25μg;ヒト顆粒球ガングリオシド(HGG):10,5,2.5および1.25μg。次に,乾燥雰囲気下でメタノールを蒸発させた(45分間,37℃)。以降のすべての工程は実施例2に記載されるTLC重層アッセイと同様にして行った。すべてのインキュベーションは,100μlの容量で行った。GSLをコーティングしたプレートを,PBS−Tween80(登録商標)(0.01mg/ml)とともに15分間インキュベートし,次に1μgの組換えヴィスクミン(PBS−Tween80に溶解)とともに1時間インキュベートした。その後,プレートをPBS−Tween20(登録商標)(0.01mg/ml)で洗浄し,次にPBSとともに15分間インキュベートした。次に,サンプルをネズミ抗ML−1Aモノクローナル抗体TA5(1μg/ml,PBS中)とともに1時間インキュベートした。PBS−Tween20(登録商標)でさらに3回洗浄した後,PBS中で1:2000希釈の抗マウスIgG(アルカリホスファターゼ結合)とともに1時間インキュベートした。PBS−Tween20(登録商標)でさらに3回洗浄した後,基質である4−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムx6H2O(16mM,0.1Mグリシンバッファー中,pH10.4)との反応により比色検出を行った。プレートを25℃で20分間インキュベートした後に,マイクロタイタープレートリーダーで405nmで測定した。
ネオラクト系のα2−6−シアリル化ガングリオシドは白血球(全血からのバフィコート)から単離した。ガングリオシドの精製は,実施例5に記載されるようにして行った。追加の工程においては,これらのネオラクト系のα2−6−シアリル化ガングリオシドを抗原として用いて,2x3匹のマウスを免疫した。抗原はサイズが小さいために単独では免疫原効果を有しないため,これらはいわゆるハプテンとともにマウスに投与した。ここでは,2つの方法を平行して行った。方法1においては,メチル−BSAを1mg/mlの濃度でハプテンとして用いた。3匹のマウスに異なる量の抗原を与えた(5,10および20μg)。マウスは既知の間隔で免疫し,10日間の間隔でさらに合計2回ブースターを行った。方法2においては,リポソームとリポ多糖(LPS)の混合物をハプテンとして用いた。この場合にも,異なる濃度の抗原(5,10および20μg)を,マウスに10日間の間隔で3回与えた。
ネオラクト系のα2−6−シアリル化ガングリオシドは常にその末端にNeu5Acα2−6−Galを持つ。別のモチーフ(これもまた本発明において記載される)は,Neu5Acα2−6−Galβ1−4GlcNAc−R;("R"は残基を表す)のガングリオシド構造を有する。このモチーフは,文献ではCD75sと記述される(Schwartz−Albiez(2000),J.Biol.Regul.Homeost.Agents 14,284−285)。図11は種々のIgMクローンを用いるDC重層アッセイを示し,これは実施例8に記載されるようにしてELISAで試験した。ここでは,ヒト顆粒球(HGG)からのガングリオシドを薄層クロマトグラフィーを用いて分離した。アッセイは実施例2に記載されるようにして行った。ここでは,4μgのHGGを分離した。プレートに結合した抗CD75smAbの検出は,実施例8に記載されるようにして行った。クローン59.33.3,59.33.5および59.33.6は,この試験においても陽性シグナルを示した。3つのクローンはすべて同じガングリオシド(IV6nLC4およびIV6nLC6)を認識し,したがって,組換えヴィスクミン(図2Bb)と同一の結合挙動を有していた。予測される,糖構造のコア部分に対する3種類の抗体の交叉反応性は,ヒト顆粒球からのネオラクト系(1レーンあたり15μg;図12A),またはグロボ系(ヒト赤血球より,10μg/レーン,図12B)およびガングリオ系(MDAY−D2細胞より;10μg/レーン;図12C)からの単離された中性GSLを用いることにより,実験的に無視することができた。実験方法は,上述したものと同一であった。図12A−Cのそれぞれについて,最初の3つのレーンにおいては,mAbクローン59.33.3,59.33.5および59.33.6を用いてシグナルを検出することができなかった。3つの場合すべてにおいて,末端α2−6結合シアル酸がないため,特異的シグナルが得られなかった。図12A−Cのレーン4の陽性対照は,負荷した中性GSLのそれぞれの末端糖構造に対する特異的抗体との反応を反映する。レーン5においては,ヤギからのポリクローナル抗血清(Muthing(2002)Glycobiology 12,485−497を参照)を加えた。この抗血清は,元々はネオラクト系のα2−6−シアリル化ガングリオシドに対して調製したものであり,ここで適用した抗原の多くに対して交叉反応性を示す。このことは,特にこの抗血清を患者からの材料の試験に用いる場合に偽陽性シグナルにつながる可能性がある。レーン1−3に示される,モノクローナル抗体59.33.3,59.33.5および59.33.6を用いた結果は,そのような望ましくない交叉反応性は生じず,これはより重要であると考えなければならない。mAb−クローン59.33.3は,ブダペスト条約にしたがって,2002年12月20日にDSMZ,Brunswickに受託番号として寄託した。
モノクローナル抗体59.33.3および59.33.5(図14)および組換えヴィスクミン(図13)それ自体について,糖蛋白質上のCD75sモチーフの検出に用いることができるかどうかを試験した。ここでは,各1μgの対応する蛋白質をSDSゲルに適用し,次にニトロセルロースに写した:レーンT:トランスフェリン(NeuSAca2−6Galβ1−4GlcNAc−残基を有する可溶性蛋白質),およびレーンAF:アシアロフェツイン(Galβ1−4GlcNAc残基およびGalβ1−3GalNAc−Ser/Thr)。次に,組換えヴィスクミン(1μg/ml)および次に抗A鎖mAb TA5およびアルカリホスファターゼで標識した抗マウスIgGを用いてウエスタンブロットによりCD75s構造の検出を試みた(実施例2を参照)。蛋白質をニトロセルロースに写した後にmAb59.33.3および59.33.5によるCD75sエピトープの結合/認識を調べる場合には,実施例9に記載されるようにして行った。トランスフェリンはmAb59.33.3および59.33.5により,および組換えヴィスクミンにより明白に認識される。試験した抗体クローン59.33.3および59.33.5のいずれも,糖蛋白質トランスフェリン上のCD75sモチーフをエピトープとして認識する。
Claims (9)
- ヤドリギレクチンまたはヤドリギレクチン一本鎖に対する個体の応答性を判定するためのインビトロ方法であって,膜結合レセプターを定量するか、および/または、その存在の有無を検出する工程を含み,レセプターはα2−6グリコシド結合によりガラクトース(Gal)に結合した末端N−アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)により特徴づけられる方法。
- レセプターが,ガラクトースにα2−6結合で結合したN−アセチルノイラミン酸の後に少なくともN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を含むガングリオシドを含む,請求項1記載の方法。
- レセプターが,Neu5Acα2−6−Gal−[Gal/GlcNAc]X−Cerの構造のガングリオシドを含む,請求項1または2記載の方法。
- レセプターが,Neu5Acα2−6−[Galβ1−4GlcNAcβ1−3]XGalβ1−4Glcβ1−1Cerの構造を有するガングリオシドを含む,請求項1−3のいずれかに記載の方法。
- レセプターが,Neu5Acα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glcβ1−1Cerの構造を有するガングリオシド,またはNeu5Acα2−6Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4GlcNAcβ1−3Galβ1−4Glcβ1−1Cerの構造を有するガングリオシドを含む,請求項1−4のいずれかに記載の方法。
- レセプターが細胞膜結合性である,請求項1−5のいずれかに記載の方法。
- ヤドリギレクチンが組換えヤドリギレクチンまたは組換えヴィスクミンである,請求項1−6のいずれかに記載の方法。
- 組換えヤドリギレクチンが,配列番号1,配列番号3または配列番号5に示されるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む,請求項7記載の方法。
- 組換えヤドリギレクチンが,配列番号2,配列番号4または配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか,またはその機能的フラグメントを含む,請求項7または8記載の方法。
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