JP2005500535A - 腫瘍特異的オリゴ糖配列およびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト腫瘍によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、腫瘍特異的末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出し、該配列の存在を指標として癌の検出を行う方法に関する。本発明は、多価の形態で該オリゴ糖配列を含む抗原性物質を提供し、さらに該オリゴ糖配列または該オリゴ糖配列に結合する結合性物質を包含する診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト腫瘍が特異的に発現するオリゴ糖配列に関する。本発明は、腫瘍特異的オリゴ糖配列と結合する試薬を製造するための方法のみならず、腫瘍特異的オリゴ糖配列を検出するための方法も開示する。また、本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の診断方法にも関する。さらに本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、腫瘍、癌および悪性腫瘍の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の腫瘍は、同種の細胞や組織の非悪性グリコシル化産物とは異なるオリゴ糖配列を発現する。公知のまたは推測される癌関連オリゴ糖構造の例としては、次のオリゴ糖構造が挙げられる：糖脂質構造、例えばグロボ−Ｈ（Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacβCer）、ガングリオシドであるＧＭ１（Galβ3GalNAcβ4(NeuNAcα3)LacβCer）やＧＤ２（GalNAcβ4(NeuNAcα8NeuNAcα3)LacβCer）；ルイス型フコシル化構造、例えばルイスａおよびｘ（Galβ3/4(Fucα4/3)GlcNAc）、ルイスｙ（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）、シアリルルイスｘ（NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAc）およびポリラクトサミン鎖中でのこれらの組み合わせ；ならびにＯ−グリカンコア構造、例えばＴ−抗原（Galβ3GalNAcαSer/Thr-タンパク質）、Ｔｎ−抗原（GalNAcαSer/Thr-タンパク質）やシアリルＴｎ−抗原（NeuNAcα6GalNAcαSer/Thr-タンパク質）。非ヒト型の構造、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸、が癌に存在することも示されている。癌においては、関連するオリゴ糖構造およびその特異性について十分に確立されている症例はわずかであり、これらの構造の中には、正常な細胞および組織に存在するものもあることから、癌には単に高濃度で存在しているだけだと考えられる。
【０００３】
末端GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc配列を含む構造がヒト白血病細胞に存在することを示した報告（Hu et al., 1994）があるが、この構造は、正常な白血球にも同様に提示されている場合がある。従って、固形腫瘍に広く見られるグリコシル化パターンと上記知見との関連性は示されなかった。この種の糖構造は、ヒト組織の希少な正常グリコシル化産物の一部であると考えられ、Ｏ−グリカンに結合したGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6配列は、おそらくヒト胃粘液に提示されている。ある研究によると、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6配列を認識するモノクローナル抗体は、粘液性卵巣腫瘍、胆嚢およびすい臓上皮の偽幽門腺化生（pseudopyloric metaplasia）や胃、胆嚢およびすい臓の分化型癌（gastric differentiated carcinoma）などの悪性化組織、ならびにヒト羊水などの非悪性化組織に提示されている類似の構造をも認識する可能性を示しているものの、悪性化組織由来の構造は特徴付けられていない（Hanisch et al., 1993）。この抗体は、ネオ糖脂質構造であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4および肺、結腸、子宮内膜などの臓器の癌を認識しなかった。睾丸細胞に対して作製した別のモノクローナル抗体は、分岐Ｎ−アセチルラクトサミン、例えばGlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc-、を認識すると考えられる（Symington et al., 1984）。また、末端GlcNAcはヒト胎児粘液由来のムチン類に見出されている（Hounsell et al., 1989）。正常な組織においては、末端GlcNAcはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの生合成における生合成中間体として少量存在する場合がある。
【０００４】
半合成糖脂質であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3LacβCerに対する複数のモノクローナル抗体が作製されており、これらの抗体は培養結腸癌細胞系および腫瘍から得た糖脂質を認識することが示されている（Holmes et al., 1991）。しかしながら、抗体は複数の構造を認識し、結合データは矛盾した。さらに、糖脂質は全ての抗体によっては認識されることはなく、癌細胞または腫瘍から得た糖脂質構造を特徴付けるには至らなかった。従って、腫瘍上の末端GlcNAc構造の存在は確立されなかった。他の研究には、GlcNAcβ3LacβCerに対するモノクローナル抗体の製造に関する記載がある（Nakamura et al., 1993）。この抗体による上記の五糖構造の認識も弱かった。さらにこの抗体は、ヒト由来の細胞系ではないＣＯＳ−１細胞上のプロテアーゼ感受性エピトープを認識した。上記のいずれの研究に示された免疫化プロトコールも、糖の多価結合体に対して誘導された抗体反応については記載されておらず、免疫化は糖脂質によるものである。
【０００５】
通常、ヒト血清中には末端GlcNAc構造を認識する多量の抗体が存在する。末端Galα3Galβ4GlcNAc-構造を認識する天然の抗体のクラスもある。Galα抗原はヒトに天然には存在しないが、天然の抗体が、例えばGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcといった構造に結合することも近年報告されている（Teneberg et al., 1996）。Ｘ２−構造であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcはヒト組織に提示されている正常な抗原であり、GalNAcα3Galβ4GlcNAc および Galα3Galβ4GlcNAcといった構造は、正常な組織や癌化組織からは報告されていない。このように、末端GlcNAc構造が腫瘍抗原であるという本願の知見は、天然の抗体の実際の機能が、末端GlcNAc構造を含む癌の予防である可能性を示している。
【０００６】
以下の特許には、癌抗原、ならびにそれを用いた治療用および診断用の抗体の製造方法および癌ワクチンの製造方法に関する記載がある。しかし、抗原の構造は、本願で開示する糖類とは関係ない。
癌ワクチン： 米国特許第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号。
治療用抗体： 米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号。
診断方法： 米国特許第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,679,769号、第5,543,505号、第5,902,725号および第6,203,999号。
【０００７】
従来技術としては、キトビオース−マンノース三糖を認識する、腫瘍の診断用抗体および治療用抗体がDE 38 07 594 A1に記載されている。この特許出願は、抗体以外にも、異なる末端構造を有する複数のＮ−グリカンも開示しており、その中には、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有するものもある。望ましい構造のいくつかは、後に正常なグリカンであり、癌特異的構造ではないと特徴付けられた。この出願は、癌の分野に有用な構造を開示し、請求しているが、望ましいグリカンがどのような構造のものかは出願明細書からは明らかではない。GlcNAc残基がα２、α４およびα６−結合できることが示されているが、本発明はこのような通常は見られない構造に関するものではない。
【０００８】
別の特許出願であるWO 00/21552は、ウシ下顎腺ムチンから単離した複数の通常は見られないＯ−グリカン構造を請求している。上記の構造の中には、例えば、GlcNAcβ6GalNAcα6GalNAc および GalNAcβ3(GlcNAcβ6)GalNAcのように末端GlcNAc-残基を有するものもある。本発明は２個のGalNAc残基を有するこれらの構造に関するものではない。上記特許出願は、上記構造を癌に関連する抗原として用いる潜在的な治療用途の可能性に関する記載を含む。しかし、上記構造がウシ癌に関連することは示されておらず、ウシ正常下顎腺分泌物に存在することしか示されていない。さらに、この構造がヒト組織に存在する可能性はほとんどない。それはグリコシル化反応は種特異的でヒトとウシの間では異なっており、グリコシル基転移酵素およびグリコシル化の反応方式がウシとヒトにおいては異なるためである。ヒトゲノムも公知であるが、上記特許出願で請求されているウシ構造の合成に関連する可能性のあるグリコシル基転移酵素は製造されておらず、特徴づけもされていない。現時点では、請求されている６種の新規なグリコシル基転移酵素のいずれもがヒトまたはヒト癌（あるいはウシ癌）について報告されていない。さらに、いかなるウシグリコシル化産物も詳細に特徴づけられているヒト唾液腺ムチンには見出されていない。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ヒト腫瘍によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、腫瘍特異的末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出し、該配列の存在を指標として癌の検出を行う方法に関する。本発明は、多価の形態で該オリゴ糖配列を含む抗原性物質を提供し、さらに該オリゴ糖配列または該オリゴ糖配列に結合する結合性物質を包含する診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。
【００１０】
発明の詳細の説明
本発明は、ヒト腫瘍によって提示される末端β−結合Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖鎖構造およびタンパク質結合単糖Ｎ−アセチルグルコサミンに関する。本発明によってヒト腫瘍に特異的な欠陥が見出されたが、この欠陥は、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む、通常は見られない炭水化物の細胞表面および細胞外の提示を生じる。一般的に、末端GlcNAc-構造は、ヒトの正常な組織においては非常に希少である。このような構造の発現は二つの要素によって生じる。第一は、腫瘍細胞における生合成および分解機構が正しく機能していないためである。正常な組織においては、多くの末端構造はGlcNAc残基に結合したガラクトースを含み、この構造は、シアル酸や血液型抗原などによってキャップされている。本願のデータは、癌炭水化物が通常は見られないグリコシダーゼ活性および欠陥のあるグリコシル化反応、即ち、β4-ガラクトシルトランスフェラーゼの（更にβ3-ガラクトシルトランスフェラーゼも関与すると考えられる）反応、に曝されていることを示している。上記欠陥は、三種のβ−ガラクトシル化オリゴ糖配列の全てに見られた。第二に、糖タンパク質構造と糖脂質構造を含むグリコシル化産物の細胞内ターゲティングおよび品質管理機構に欠陥があると考えられる。正常な細胞においては、グリコシル化の不十分なタンパク質及び脂質を再循環させて天然のグリコシル化反応を完了させる品質管理が行われているので、本発明のようなグリコシル化構造が細胞表面上に存在することは、正常な細胞では非常に稀である。正常な細胞または組織においては、本願で開示するオリゴ糖構造はヒトゴルジ装置に少量存在し、公知のタンパク質結合GlcNAcは、細胞質および核に見られるタンパク質修飾物であることに間違いないと考えられている。ゴルジ装置の機構における欠陥は、本願で開示する腫瘍特異的構造の部分細胞表面発現を生じる。特定の態様においては、本発明は、特に細胞表面型または組織表面型の本発明の腫瘍関連GlcNAc-構造に関する。細胞内で過剰発現した本発明の構造でさえも、診断の分野に直接的に有用である。
【００１１】
ガラクトシル化の欠陥、通常は見られないグリコシダーゼ活性の存在、および細胞内制御の喪失は、以下の三種の腫瘍関連グリコシル化産物を生じる：
１．ガラクトシル化の不十分な、不完全なタンパク質結合Ｎ−グリカン；
２．ガラクトシル化の不十分な、不完全なＯ-グリカンコア構造；および
３．ガラクトシル化の不十分なポリラクトサミン（例えば、ヒト副腎腫由来のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型糖脂質）。
これらの欠陥は、糖タンパク質および糖脂質中に複数の通常は見られない末端エピトープを生じる。本発明は上記三種のグループに属するオリゴ糖エピトープに関する。本発明は、正常なβ−ガラクトシル化オリゴ糖配列を有する三種類のグリカン鎖の全てに普遍的に存在する、類似した欠陥に始めて着目した。末端β−結合GlcNAcは末端構造として存在する。この構造は、末端GlcNAc-残基を直接修飾するための、β1,4(3)-Gal-残基転移酵素反応を含む酵素反応の欠陥を示し、その一方で、末端構造を分解することのできるゴルジ経路における増加したグリコシダーゼ活性を示す。しかしながら、三種の炭水化物における欠陥の普遍性は、ゴルジ装置の機構がかなり乱れているので、ゴルジ経路の後期に位置する末端修飾酵素が腫瘍細胞の発現する全グリカンを効果的に修飾できないことを示す。さらに、本発明は以下について開示する：
４．癌および腫瘍上のタンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミン単糖の誤った発現。
タンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミンは、一般的に、いわゆるＯ-GlcNAc-構造の一部として細胞内に存在する。本発明者らは、タンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミンの強い過剰発現に着目した。過剰発現によって、ヒト腫瘍は細胞表面にＯ−結合GlcNAcによるいくらかの標識さえも有することとなる。
【００１２】
末端β−結合GlcNAcは、上記グループ１〜３の全てに共通だが、末端近傍の構造は、腫瘍や癌の診断または治療において認識されなければならない構造に影響を与えることが判明した。本発明は、特に末端GlcNAcと三種の欠陥オリゴ糖配列グループにおいて末端GlcNAcの近傍に位置する少なくとも１つの単糖残基を有する末端オリゴ糖配列を用いた、治療剤および診断剤に関する。また、本発明は、ポリラクトサミンの非還元末端β−GlcNAcオリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖、Ｏ−グリカンまたはＮ−グリカンに関する。
【００１３】
１．不十分なガラクトシル化または分解によって生じた、不完全なＮ−結合グリカン
本発明者らは、喉頭、胃、結腸および肺などの腫瘍に由来する、末端GlcNAc残基を有する複数のＮ−グリカン構造を質量分析法によって特徴付けた。本明細書は、腫瘍においてはＮ-グリカンの過剰発現が普遍的であることを示す。新規なＮ−グリカン型腫瘍抗原も新規なグリコシル基転移法によって腫瘍の組織片から特異的に検出されたが、対応する正常組織や非悪性化組織からは全く検出されないか少量しか検出されなかった。本発明は、下記式で表されるＮ−グリカン構造：
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAcβAsn
およびその部分オリゴ糖構造であって、非還元末端タンパク質またはペプチド結合末端GlcNAcを含むものに関する。式中のAsnは、天然の抗原においては、タンパク質に直接結合しているアミノ酸であるアスパラギンを示す。腫瘍に結合した形の天然タンパク質結合オリゴ糖配列は、本発明に従って用いられる還元末端GlcNAcβAsn-構造と、末端GlcNAcβ2Manを含む少なくとも一種の分岐鎖とを含んでいるはずである。Ｎ−グリカン構造を抗原性エピトープを製造するのに用いる場合、本発明は、下記式（Ｉ）で表される少なくとも一種のオリゴ糖配列、即ち、上記Ｎ−グリカン構造をその還元末端から縮めた構造および天然オリゴ糖配列に関する。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN[β4(Fucα6)r3GN]r4]r5}r6 （Ｉ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ３、ｒ４、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（Ｉ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている；そして
｛ ｝は主鎖に存在するか存在しない基を表し、（ ）は分岐鎖を表す。）
【００１４】
上記式で表される構造は、ヒトＮ−グリカンに見られる公知のＮ−結合グリカン構造をその末端から縮めた構造を表す。正常な組織においてはこれらの構造の存在は稀であるため、免疫学的診断に適している。
【００１５】
より好ましいオリゴ糖配列は、下記式（ＩＩ）で表される構造である。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN]r5}r6 （ＩＩ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（ＩＩ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている。
【００１６】
さらに好ましい態様においては、ＧＮはGlcNAcであるが、但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) および (ii) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（ＩＩ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、および (ii) １つのGNβ2ManがManまたはManα6-残基に縮められている。最も好ましい態様においては、全てのＧＮがGlcNAcである。
【００１７】
伸長されていない構造としては、以下のオリゴ糖配列が好ましい：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Man、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Man、
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、そして
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc 。
【００１８】
より好ましいＮ−グリカン型オリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Man、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Man、そして
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAc 。
【００１９】
最も好ましいＮ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、そして
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc 。
【００２０】
２．不十分なガラクトシル化または分解によって生じた、不完全なＯ−結合グリカン
本発明者らは、腫瘍の発現するＯ−グリカンは末端β−結合GlcNAcを含む構造を有することも見出した。腫瘍に対するＯ−グリカンの特異性は、後述する実施例において、卵巣癌から生還したヒトから得た特異的な癌関連天然抗体が存在することと、癌の病歴のないヒトから得た血清プールには抗体が存在しないことによって示されている。
【００２１】
本発明は、末端β−結合GlcNAc残基を有するヒト腫瘍特異的Ｏ−グリカンコア構造、好ましくは、GalNAc-GalNAc配列は含まないＯ−グリカン配列にも関する。好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列は、下記式（ＩＩＩ）で表される少なくとも一種のオリゴ糖配列を含むものである：
[GlcNAcβ3]s1[Galβ3]s2({[GlcNAcβ3]s3Galβ4}s4GlcNAcβ6)s5GalNAc（ＩＩＩ）
（式中、ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４およびｓ５は各々独立に０または１の整数であるが、式（ＩＩＩ）で表される末端オリゴ糖配列が少なくとも一種の非還元末端GlcNAcβ-残基を有するために、下記条件の少なくとも一種を満足する：ｓ１は１である；ｓ５、ｓ３およびｓ４は共に１である；そしてｓ５は１であるが、ｓ３とｓ４は共に０である。）
【００２２】
より好ましいＯ−グリカン構造としては、下記式（ＩＶ）で表される少なくとも一種の構造が挙げられる：
[GlcNAcβ3]s1[Galβ3]s2(GlcNAcβ6)s5GalNAc （ＩＶ）
（式中、ｓ１、ｓ２およびｓ５は各々独立に０または１の整数であるが、ｓ１とｓ５の少なくとも一方は１である。）
【００２３】
好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3GalNAc、Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ6GalNAc、そして GlcNAcβ3GalNAc 。
【００２４】
さらに好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3GalNAc、Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ6GalNAc、そして
GlcNAcβ3GalNAc 。
【００２５】
最も好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、そしてGlcNAcβ6GalNAc 。
【００２６】
本発明は、特にＯ−グリカンオリゴ糖配列であるGalβ3(GlcNAcβ6)GalNAc および／または GlcNAcβ6GalNAcを認識するが、Galβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc および／または
Galβ4GlcNAcβ6GalNAcは認識しないヒト抗体、ならびに上記抗体を用いた、本明細書で定義した治療剤および診断剤に関する。好ましい態様においては、本発明は、オリゴ糖配列であるGalβ3(GlcNAcβ6)GalNAcを効果的に認識するが、オリゴ糖配列であるGalβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAcを認識しないヒト抗体に関する。好ましい態様においては、ヒト抗体は天然の抗体である。他の一つの好ましい態様においては、上記抗体は癌ワクチンによって誘導されたものである。さらに好ましい態様においては、ヒト抗体はＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体であり、ＩｇＧ抗体であることが最も好ましい。
【００２７】
別の一つの態様においては、本発明はＯ−グリカンコア構造の希少なシアリル化異型、例えばGlcNAcβ3(NeuNAcα6)GalNAc または NeuNAcα3Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、の用途に関する。
【００２８】
３．末端 GlcNAc β 3 および／または末端 GlcNAc β 6 を含むポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型配列
本発明は、ヒト腫瘍に提示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型構造中の末端Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の存在を開示する。上記構造は、検討した四つのヒト副腎腫のうちの一つから多量に見出されたのが初めである。腫瘍の糖脂質画分は、特異的な放射性標識Escherichia coli株とパーメチル化した試料のＦＡＢ−質量分析法によって、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含むと特徴付けられた。糖脂質画分は、特異的なレクチンを用いて検出することのできる末端Ｎ−アセチルラクトサミンも含んでいた。正常な腎臓由来糖脂質を細菌でスクリーニングしたところ、末端GlcNAcは対応の正常組織には存在しないことが判明した。これは複数の他の対照組織にも存在しないことからも明かである。本発明の一つの態様は、腫瘍由来の末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する少なくとも一種のオリゴ糖配列の検出または単離に関する。
【００２９】
本発明において、単離または検出される腫瘍特異的構造としては、以下の糖配列が挙げられる：GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ6Gal、そして GlcNAcβ6Galβ4GlcNAc。上記糖配列は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖の一部であるため、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖は少なくとも一種の末端β−結合GlcNAcを含んでいる。
【００３０】
さらに好ましい態様においては、本発明は、次に示される非β６−結合含有直鎖状ポリラクトサミン配列に関する：GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、そして GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。
【００３１】
別の態様においては、本発明は、次に示されるβ６−結合含有非分岐ポリラクトサミン配列に関する：GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ6Galβ4GlcNAc、そして GlcNAcβ6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。
【００３２】
好ましいポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型配列としては、次に示すようなβ３−分岐構造及びβ６−分岐構造が挙げられる：GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc、そして Galβ4GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc。このような分岐構造は、分岐Ｏ-グリカン構造に類似している。
【００３３】
１型Ｎ−アセチルラクトサミンであるGlcNAcβ3Galβ3GlcNAc または GlcNAcβ6Galβ3GlcNAcを含む構造も、本発明の化合物の範囲に含まれる。
【００３４】
４．タンパク質結合Ｎ - アセチルグルコサミン
本発明者らは、喉頭、胃、結腸および肺などの腫瘍に由来する、タンパク質結合GlcNAc残基を特徴付けた。本明細書は、腫瘍においてはタンパク質結合GlcNAcの過剰発現が普遍的であることを示す。新規なＮ−グリカン型腫瘍抗原も新規なグリコシル基転移法によって腫瘍の組織片から特異的に検出されたが、対応する正常組織や非悪性化組織からは、全く検出されないか少量しか検出されなかった。タンパク質結合GlcNAcの分析により、種々の形態のタンパク質結合GlcNAcの存在が示された。
【００３５】
具体的な態様においては、本発明は、本願で定義した治療剤や診断剤におけるβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン単糖残基（GlcNAcβ）の用途、およびGlcNAcβを包含する医薬組成物に関する。大部分の腫瘍細胞は、β−脱離法（β-elimination）によって遊離させることができるＯ−グリカン様GlcNAcを有する。
【００３６】
本発明の好ましい態様は、本発明で定義した診断剤や治療剤における、次のＯ−グリコシド構造の用途に関する。
GlcNAcSer および／または GlcNAcThr
（式中、セリン（Ser）残基およびスレオニン（Thr）残基の水酸基はGlcNAc残基にグリコシド結合している。）
【００３７】
本発明のより好ましい態様においては、アミノ酸であるセリン（Ser）残基およびスレオニン（Thr）残基は、ペプチドまたはペプチド結合体の一部であるかアミノ基および／またはカルボン酸基から誘導される。
【００３８】
他の一つの好ましい態様においては、本発明はGlcNAcX（式中、Ｘはアグリコンであり、好ましくは上記のアミノ酸残基であるセリンまたはスレオニンを模倣する）の用途に関する。
【００３９】
より好ましい態様においては、GlcNAcβSerおよび／またはGlcNAcβThr、即ち、GlcNAcβXは、本明細書で説明する多価の担体に結合しており、本発明で説明する用途に用いる。GlcNAcβXは予防接種に有用な担体に結合していることが好ましく、本明細書で説明する炭水化物担体に結合していることが最も好ましい。
【００４０】
他の一つの好ましい態様においては、本発明で説明する用途に用いるために、GlcNAcαSer および／または GlcNAcαThr、即ち、GlcNAcαXを、本明細書で説明する多価の担体に結合する。GlcNAcβXは予防接種に有用な担体に結合していることが好ましく、本明細書で説明する炭水化物担体に結合していることが最も好ましい。
【００４１】
本発明は、上記のＯ−グリカン型構造のβ−結合Ｎ−グリコシド類似体、例えばGlcNAcβ-Asn、およびペプチド誘導体ならびにそれらの類似体にも関する。生物学的試料においては、このような構造はエキソグリコシダーゼまたはエンド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによって形成される。
【００４２】
本発明のオリゴ糖配列を表す一般構造
本発明のオリゴ糖配列は、糖脂質の一部、糖タンパク質の一部および／またはＮ−アセチルラクトサミン鎖の一部であってもよい。腫瘍特異的オリゴ糖配列も、糖脂質の一部、糖タンパク質中のＮ−結合グリカンまたはＯ−結合グリカンの一部であってもよい。腫瘍関連オリゴ糖配列は、Ｏ−グリコシドGalNAcに直接結合していてもよい。腫瘍の生合成経路および／または生分解経路における欠陥または変更は、本発明のオリゴ糖配列を有した糖脂質および糖タンパク質の両方の合成をもたらす。末端Ｎ−アセチルグルコサミンの存在は、オリゴ糖鎖中の非還元末端GlcNAc残基が他のいかなる単糖にも置換されていないことを意味する。本発明における「オリゴ糖配列」は、オリゴ糖配列中の少なくとも１つの単糖残基が、他の単糖残基からなるオリゴ糖鎖を含むより大きな糖結合体の一部であり、上記オリゴ糖鎖は分岐していてもよいし、天然の置換修飾物であってもよい。上記のオリゴ糖鎖は、通常、脂質アンカーまたはタンパク質に結合している。好ましい態様においては、本発明のオリゴ糖配列は、非還元末端オリゴ糖配列である。本明細書において「非還元末端オリゴ糖配列」とは、所望によりオリゴ糖配列の還元末端から他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合している場合を除いては、他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合していない構造を意味する。オリゴ糖配列が結合体として存在している場合には、オリゴ糖配列の還元末端から結合することが好ましいが、抗体や結合性物質との結合が可能な他の結合位置も利用することができる。さらに好ましい具体的な態様においては、本発明のオリゴ糖配列には、糖結合体の一部に対応するオリゴ糖残基であって、天然のグリコシド結合によって他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合していないものも含まれる。上記のオリゴ糖残基は、遊離のオリゴ糖、ならびにオリゴ糖残基の還元末端から結合した結合体または誘導体であることが好ましい。
【００４３】
本明細書において、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型およびポリラクトサミン型のオリゴ糖配列と関連して記載した本発明の末端GlcNAcオリゴ糖鎖の用途は、いずれも本願で開示する単糖構造であるタンパク質結合GlcNAcおよびその誘導体にも適用される。
【００４４】
希少な種類のガングリオシド型またはガラクトシル型のグロボシドも、腫瘍特異的末端GlcNAcとして用いることができる。いくつかの組織では末端Galβ4GlcNAcβ3/β6構造が糖脂質コアに結合されており、本発明で説明する低ガラクトシル化条件においては、末端GlcNAcを形成することができる。
【００４５】
本発明の他の一つの態様においては、腫瘍を診断するために腫瘍特異的オリゴ糖配列を検出する。
【００４６】
本明細書において「オリゴ糖配列」または「オリゴ糖」という用語には、本願で開示するタンパク質結合GlcNAcおよびその誘導体も含まれる。
【００４７】
腫瘍特異的オリゴ糖配列は、特異的な結合性物質によって検出されることが好ましく、結合性物質としては、アプタマー、レクチン、ペプチドまたはタンパク質（例えば抗体）、それらの断片あるいは遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。特異的な結合性物質は二価、オリゴ価または多価であることがより好ましい。結合性物質はレクチンまたは抗体であることが最も好ましい。
【００４８】
特異的な結合性物質のコンビナトリアル ケミストリー ライブラリーは、結合性分子を探索するために用いることができる。糖結合性のタンパク質、抗体またはレクチンは生物工学的に作製することができ、例えば、ファージディスプレイ法によって本発明の構造に対して特異的な結合性物質を製造することができる。標識した細菌または細胞、あるいは重合体の表面であって、本発明の構造を認識する分子を有するものを検出に用いることができる。オリゴ糖配列は、エンドグリコシダーゼ酵素によって腫瘍細胞から遊離することができる。また、オリゴ糖配列をプロテアーゼ酵素により糖脂質として遊離することもできる。オリゴ糖またはその誘導体を遊離させるための化学的方法の具体例には、糖脂質の音波分解法（otsonolysis）、および糖タンパク質からオリゴ糖を遊離させるためのβ−脱離法（beta-elimination）またはヒドラジン分解法（hydrazinolysis method）が含まれる。その他の方法としては、糖脂質画分の単離が挙げられる。腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する結合性物質は、細胞表面上の該配列の分析に用いることもできる。該配列は、例えば、糖結合体あるいは遊離のおよび／または単離したオリゴ糖画分として検出することができる。種々の形態の該配列の分析に用いることができる方法としては、ＮＭＲ分光法、質量分析法およびグリコシダーゼ分解法が挙げられる。特に、特異性に限定のある方法を用いる場合には、少なくとも二種の分析法を用いることが好ましい。
【００４９】
本発明は、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を用いて、オリゴ糖構造を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法に関し、以下の工程に従って該抗体を製造する：
１）本願で開示するオリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を多価の形態で含んでいる結合体を、化学的または生化学的に合成する。多価の結合体は、例えば、本願で開示する腫瘍特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖（ＯＳ）が、そのＣ１位の還元末端からスペーサー基（Ｙ）を介して、所望により単糖またはオリゴ糖残基（Ｘ）をさらに介して、オリゴ価または多価の担体（Ｚ）に原子（Ｌ）によって結合している、下記式で表される構造を形成する：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z
（式中、
ｍは１より大きい整数であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
ＯＳはヒト腫瘍特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖であり、
Ｌは酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子であり、
Ｘは単糖またはオリゴ糖残基、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、あるいはＯ−グリカンまたはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部であり、
Ｙはスペーサー基または末端結合体、例えばセラミド脂質部またはＺへの結合部であり、
Ｚはオリゴ価または多価の担体である。）；そして
２）免疫応答活性化物質と共に多価結合体で動物またはヒトを免疫する。
オリゴ糖配列は免疫応答活性化物質に多価の形態で結合していることが好ましく、結合体は単独、またはさらなる免疫応答活性化物質と共に免疫に用いる。好ましい態様においては、オリゴ糖結合体を、少なくとも一種のアジュバンド分子と共に抗体産生生物に注射または粘膜投与する。抗体産生のためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質、例えばＢＳＡ、スカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン、リポペプチド、ペプチド、細菌の毒素、ペプチドグリカンまたは免疫活性多糖の一部、あるいは他の抗体産生活性化分子に多価の形態で結合する。当業界で知られている慣習的な抗体産生法で抗体を誘導するために、多価結合体をアジュバンド分子と共に動物に注射することができる。
【００５０】
抗体産生または予防接種は、腫瘍特異的オリゴ糖配列の類似体または誘導体によっても達成されうる。Ｎ−アセチル基を含むオリゴ糖配列の単純な類似体としては、修飾されたＮ−アセチル基、例えばＮ−プロパノイル基などのＮ−アルキル基を含む化合物が挙げられる。
【００５１】
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcに結合する抗体の産生に用いることができる類似体としては、Hex(NAc)0-1α3Galβ4GlcNAcやHex(NAc)0β3Galβ4GlcNAc（式中、Hexはヘキソースであり、好ましくはGalまたはGlcである）などの配列が含まれる。類似体には、上記式中のGlcNAcが類似の異性体、例えばManNAcで置換された分子も含まれる。
【００５２】
本発明によると、抗体を血清、好ましくはヒトの血清から精製するために腫瘍特異的オリゴ糖配列を用いることができる。通常、ヒト血清には末端GlcNAc構造を認識する抗体が大量に存在する。末端Galα3Galβ4GlcNAc構造を認識する天然抗体のクラスも存在する。Galα抗原はヒトに天然には存在せず、天然抗体がin vitroの構造物であるGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcにも結合することが近年示された（Teneberg et al., 1996）。Ｘ２−構造であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcは、ヒト組織に提示される正常な抗原であるが、GalNAcα3Galβ4GlcNAc構造および Galα3Galβ4GlcNAc構造はヒトの正常組織および癌組織からは見出されていない。このように、末端GlcNAc-構造が腫瘍抗原であるという本発明の知見は、天然抗体の実際の機能が癌の予防および末端GlcNAc-構造を有する腫瘍の破壊の両方である可能性を示した。腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体（例えば類似の異性体）は、血清、好ましくはヒトの血清、から抗体を精製するために固定することもできる。本発明は、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に強固に結合する天然のヒト抗体に関する。
【００５３】
腫瘍特異的オリゴ糖配列は、腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するヒト抗体の検出および／または定量、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やアフィニティークロマトグラフィーによる分析にも用いることができる。腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するヒト抗体の検出は、癌の診断、癌の治療剤の開発、特に本発明のオリゴ糖配列に対する癌ワクチンの開発、および大量の抗体またはある一種類の抗体を保持する血液提供者の探索を目的とすることが好ましい。
【００５４】
さらに、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体を、腫瘍や癌を破壊したり、その増殖能を低下させるために用いることができる。ヒト抗体は、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対する天然のヒト抗体の耐性を高めた類似体でもよい。このような類似体は、組換え遺伝子工学および／または生物工学によって製造することができ、ヒト抗体の断片または最適化した誘導体などが挙げられる。精製した天然の抗腫瘍抗体は予想されるいかなる副作用も生じることなくヒトに投与することができ、標準的な輸血の際にこのような抗体は移植されている。これは、腫瘍特異的構造が正常の組織または細胞に提示されておらず、且つ、血液型抗原とは異なり、個体差がないとした条件下では確実であり、末端GlcNAcを含む構造には血液型のような多様性は知られていない。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。特異的な人体適応抗体を遺伝子工学および生物工学で製造することも可能であり、人体に適応させた抗体の製造方法は、例えば米国特許第5,874,060号および第6,025,481号に記載されている。人体に適応させた抗体はヒト抗体の配列を模倣するように設計されるので、ヒトの患者に投与した際に、動物抗体のように免疫系によって拒絶されることはない。癌の増殖能を低下させたり癌を破壊するための方法は、固形腫瘍および広義の意味における癌細胞の両方に適用可能であることが知られている。いかなるヒト癌特異的抗原、好ましくはオリゴ糖からなる抗原を認識する精製した天然のヒト抗体を、腫瘍または癌の増殖能を低下させたりそれを破壊するために用いることが可能であることも知られている。他の一つの好ましい態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。
【００５５】
本発明によると、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体、あるいは腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合する、生体に許容される他の物質は、腫瘍または癌細胞を毒性物質の標的とするために有用である。毒性物質としては、例えば細胞殺傷化学療法薬（cell killing chemotherapeutics medicine）（例えばドキソルビシン（Arap et al., 1998））、毒性タンパク質または放射線化学薬剤などの腫瘍の破壊に有効な物質が挙げられる。このような療法は、当業界では発表されており、特許にもなっている。毒性物質は、癌細胞または腫瘍にアポトーシスを起こさせたり、その分化を誘導したり、癌細胞または腫瘍に対する防御反応を増強したりすることもできる。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。本発明の癌結合性抗体または腫瘍結合性抗体は、例えば、いわゆる「ＡＤＥＰＴ−アプローチ」において、腫瘍に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを腫瘍または癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするために用いることもできる。
【００５６】
上記の治療用抗体は、癌または腫瘍の治療または予防を目的とした医薬組成物に用いることができる。本発明の治療方法は、患者が免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている時にも用いることもできる。
【００５７】
末端GlcNAc型（または好ましくはGlcNAcβ3/6Galβ4GlcNAc型）の、癌のまたは腫瘍のグリコシル化産物は、免疫不全状態、例えば、免疫不全を生じる疾病（ＡＩＤＳなど）や免疫抑制剤療法によって生じる免疫不全、に陥っている患者の腫瘍に広く見られる傾向がある。カポジ肉腫は、ＡＩＤＳおよび免疫不全に関連して広く見られる癌である。免疫抑制剤療法は、例えば、腎臓、心臓、肝臓または肺の移植の際の拒絶反応を抑制するために、臓器移植と共に実施する。このような療法を実施している間に現れる腫瘍は通常は良性であるが、貴重な移植臓器の損失をしばしば引き起こす。潜在的な天然の抗癌抗体の中には、以下の類似したエピトープを認識すると考えられるものもある：GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3Galβ4GlcNAc、そして Galα3Galβ4GlcNAc。第一の構造であるＸ2は、Ｐ血液型の希少な異型に属するヒトにより多く見られるものであり、このようなヒトは、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc構造を認識する抗体の量が少ない場合もある。腫瘍または癌に特異的な抗原に対する抗体の産生能は、免疫系に見られる個体差によって異なる場合がある。癌から生還したヒトは、特に多量の天然の抗癌抗体を保有している場合がある。
【００５８】
抗体を介した、腫瘍組織に対する免疫反応の考えられる例としては、腫瘍の大部分を切除した後に副腎腫から完全に回復した例が挙げられる。末端GlcNAcを有するオリゴ糖配列はこのような免疫反応の潜在的な標的である。
【００５９】
腫瘍に対する治療的ターゲティングを行うための他の方法
診断用物質の場合と同様に、癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いる物質としては、抗体、抗体断片や人体に適応させた抗体以外にも、多くの薬剤が利用可能であることが知られている。癌または腫瘍に対するターゲティングには、非免疫原性の許容される物質を用いることが特に好ましい。癌または腫瘍に結合するターゲティング物質の例には、癌または腫瘍を破壊または抑制する特異的な毒性、細胞溶解性または細胞調節性の薬剤も含まれる。癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いる非抗体分子は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列または腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子を包含することが好ましく、このような結合性の分子（即ちオリゴ糖鎖結合性物質）としては、はアプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、末端GlcNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、その構造を認識する分子を有するものも癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いることができる。本願で開示する癌結合性非抗体物質または腫瘍結合性非抗体物質は、癌または腫瘍を標的とする、癌または腫瘍に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌または腫瘍を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするためにも用いることもできる。
【００６０】
グリコシル基転移酵素による末端 GlcNAc を有する腫瘍抗原のターゲティング
本発明は特に、癌細胞または腫瘍に、修飾された単糖誘導体を転移させる新規な治療方法または診断方法に関する。本発明は、毒性物質、標識物質、薬剤または免疫学的に活性のある炭水化物と、転移酵素によって認識される受容体構造を有する、患者の病原性細胞の表面との間に共有結合を生じさせるための、以下の工程を包含する方法を開示する：
(i)毒性物質、標識物質、薬剤または免疫学的に活性のある炭水化物を、転移酵素の供与分子と結合させて結合体を得、そして
(ii)（ａ）得られた結合体および所望により転移酵素を腫瘍の治療のために患者に投与する、または
（ｂ）腫瘍の診断のために、得られた結合体を腫瘍試料に接触させて、結合体からなる標識を検出する。
【００６１】
グリコシル基転移酵素によって転移される単糖誘導体は、グリコシド結合したヌクレオチド残基も有する。単糖誘導体は、二位の修飾物（2-modified）、例えばＵＤＰ−ガラクトサミンのアミド誘導体が好ましい。治療または診断のための単糖誘導体としては、下記式で表されるものが好ましい：
UDP-GalN[-S]-D
（式中、
Ｓは所望により結合しているスペーサー基であり、
Ｄは誘導体化した基、例えば、ビオチンまたは蛍光性分子などの標識分子、あるいは他の癌や腫瘍のターゲティング法に関連して開示されている、毒性物質、プロドラッグまたはプロドラッグを遊離させる物質である。）
【００６２】
スペーサーは、修飾された単糖ヌクレオチドを転移酵素に結合させるのに十分な可とう性を有することが好ましい。
単糖誘導体は、ＵＤＰ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミンであることが好ましい。
使用する酵素は、二位修飾単糖を効果的に転移させるように工学的に改変したガラクトシルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。また、例えば、動物から得た類似の特異性を有する天然のGalNAc/GlcNAc-転移酵素を用いることもできる。
本発明は、特に、UDP-GalN−スペーサー−ビオチンおよび修飾ガラクトシルトランスフェラーゼと共に組織をインキュベートすることによって、ビオチンで腫瘍組織を標識する方法に関する。
【００６３】
別の態様においては、本発明は下記の工程からなる診断方法に関する：
１．ガラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくはβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼによって、放射性標識UDP-Galから放射性標識Galをヒト腫瘍組織に転移し；そして
２．組織に組み込まれた放射能を利用して、腫瘍上の末端GlcNAc残基を定量する。
【００６４】
ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた標識方法は、本発明の全ての末端β−GlcNAc構造に有効である。
【００６５】
抗体、好ましくは動物から得た抗体の胃腸器系疾患関連分野および食品関連分野での用途
本発明は特に、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合する物質および抗体を用いた、患者、好ましくはヒトの患者、の胃腸器系疾患の治療方法に関する。ヒトの胃腸器系で用いる治療用の抗体は、動物によって産生された抗体、例えば家畜（具体的には家畜用反芻動物であるウシ、ヒツジ、ヤギまたはスイギュウなど）の乳に含まれる抗体や、鶏卵で産生した抗体でもよい。公知の方法に従って、動物を腫瘍特異的炭水化物結合体によって免疫することができる。本発明は、ヒトの胃腸器系の腫瘍の抑制または破壊に用いることができる、他の許容される物質、好ましくは食品として許容されるタンパク質にも関し、このような物質の具体例には、腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的な植物レクチンが含まれる。本発明は、胃腸器系に存在する本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を認識する抗体を含む機能性食品および食品添加剤に関し、さらに本発明は、食品として許容される他の物質（特に胃腸器系に存在する腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するレクチン）を用いた機能性食品または食品添加剤にも関する。
【００６６】
腫瘍特異的末端 GlcNAc に結合する結合性物質のスクリーニング
本発明は特に、腫瘍特異的末端GlcNAc-オリゴ糖配列を用いた、上記オリゴ糖配列からなる構造に特異的な結合性物質のスクリーニングに関する。スクリーニングは、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に対する最適な結合性物質の検索を可能にする。特異的な結合性物質は、本明細書で開示した上記グリカンに結合する治療用や診断用の抗体または他の分子であってもよい。
【００６７】
本発明のオリゴ糖配列に結合する結合性物質のスクリーニングは、酵素免疫測定法（いわゆるＥＬＩＳＡ分析）によって行うことができる。直接的な結合は、例えば結合性物質か末端GlcNAc-グリカン構造のいずれかを固相マトリックスに結合することで定量することができる。
【００６８】
本発明の遊離オリゴ糖またはオリゴ糖結合体は、特異的な阻害剤としてアッセイ法にも用いることもできる。蛍光偏向の変化量（Fluoresence polararization difference）やＮＭＲは、本発明のオリゴ糖配列に結合する結合性物質を液相からスクリーニングするための手法の例である。
【００６９】
癌ワクチン
さらに、本発明によると、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体は、癌細胞または腫瘍細胞を抑制するか排除するための免疫応答を刺激するために、ヒトの癌ワクチンとして使用することができる。このような治療は必ずしも癌を根治するわけではないが、腫瘍による負担を軽減させたり、癌患者の病態を安定化し、癌の転移能も低下させることができる。ワクチンとして用いるためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質（例えばＢＳＡまたはスカシガイヘモシアニン）、脂質またはリポペプチド、細菌の毒素（例えばコレラ毒素または熱不安定毒素）、ペプチドグリカン、免疫活性多糖、あるいはワクチン分子に対する免疫反応を活性化する他の分子に結合させることができる。癌ワクチンは、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドをさらに包含してもよい。適切な担体またはアジュバンドは、例えば免疫応答を刺激することが知られている脂質である。糖類あるいはその誘導体または類似体、好ましくは該糖類の結合体は、少なくとも一種の許容されるアジュバンド分子と共に癌患者に注射あるいは粘膜的（例えば経口的または経鼻的）に投与することができる。癌ワクチンは、癌または腫瘍に対する治療方法において薬剤として使用することができる。このような方法は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。また、この治療方法は、免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌または腫瘍の治療に用いることが好ましい。
【００７０】
さらに、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌や腫瘍を治療するための医薬組成物を製造することができる。医薬組成物は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌または腫瘍の治療に医薬組成物を用いることが好ましい。上記の治療方法または医薬組成物は、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を発現していると診断された癌または腫瘍の治療に用いることが特に好ましい。治療方法または医薬組成物は、癌の治療のための他の治療方法または医薬組成物と共に用いることができる。好ましい他の治療方法や医薬組成物には、細胞成長抑止剤、抗血管形成薬、抗癌タンパク質（例えばインターフェロンまたはインターロイキン）または放射線療法が含まれる。
【００７１】
癌または腫瘍の診断および薬剤を癌または腫瘍に対してターゲティングするために抗体を用いる方法は、他の抗原やオリゴ糖構造と関連して開示されている（米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号、第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,902,725号および第6,203,999号）。癌特異的オリゴ糖を癌ワクチンとして用いることも、他のオリゴ糖配列に関連して開示されている（米国特許第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号）。
【００７２】
治療方法および診断方法の組み合わせ
本発明は特に、ヒトの腫瘍または癌に存在する異常なグリコシル化構造および正常なグリコシル化構造の分析、ならびにその分析結果を用いた、本発明の治療用抗体または癌ワクチンの製造方法に関する。本発明は特に、以下の工程を包含する癌の治療方法に関する：
１．患者の腫瘍組織または癌組織のグリコシル化産物を分析し、
２．一部が癌化した組織の正常なグリコシル化産物を分析し、そして
３．患者の癌に本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列が存在するが、正常組織の細胞表面には該腫瘍特異的オリゴ糖配列が提示されていないか、微量しか提示されていない場合に、本発明の治療方法を実施する。
【００７３】
腫瘍組織および正常な組織のグリコシル化には個体差があるので、本発明の腫瘍特異的構造の分析は、異常なグリコシル化構造と正常なグリコシル化構造とを組み合わせて分析することが有用であり、これは本願の実施例に示したデータによって明示される。腫瘍の近傍に位置する正常な組織は、腫瘍により分泌された物質で部分的に汚染されていることもあるので、正常な組織のデータを分析する際には考慮したほうがよい。
【００７４】
本発明の抗原性物質は、担体に結合することができる。オリゴ糖を一価または多価の担体に結合する方法は当業界では知られている。癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をその還元末端から担体分子に結合することが好ましい。担体分子を用いると、一つの担体に多数の本発明の抗原性物質分子を結合することができるので、免疫応答の刺激および抗体結合効率が増大する。最適な抗体産生を達成するためには、分子量が１０ｋＤａよりも大きい結合体で、一般的に１０個を超えるオリゴ糖配列を担持したものを用いることが好ましい。
【００７５】
本発明のオリゴ糖配列は、グリコシル基転移酵素によって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（文献としてErnst et al., 2000を参照）。これらの酵素の特異性および補因子（例えば糖ヌクレオチド供与体）の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシル基転移反応を触媒するが、グリコシダーゼ反応は触媒しない酵素を得ることができる。本発明で開示する糖類および糖結合体またはそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。炭水化物材料を天然の原料から単離して、化学的または酵素学的に修飾して本願で開示する化合物とすることができる。種々の反芻動物や他の動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。
【００７６】
本発明のオリゴ糖配列は、所望により担体と共に、患者の癌または腫瘍の治療に適当な医薬組成物に加えることができる。本発明によって治療することのできる病態の例としては、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を少なくとも一種発現している腫瘍からなる癌が挙げられる。治療可能な癌の症例は、患者から得た生物学的試料中に腫瘍特異的オリゴ糖配列の存在を検出することによって発見することができる。該試料としては、例えば生検材料または血液試料が挙げられる。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【００７８】
本発明の物質または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよい。治療用抗体またはワクチンの投与方法は公知である。
【００７９】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。
【００８０】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするいかなる哺乳類も意味する。
腫瘍特異的オリゴ糖または本発明の腫瘍特異的オリゴ糖を特異的に認識する化合物を診断または型の同定に用いる場合、例えば、オリゴ糖または化合物はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックが、癌患者から得た抗体を包含する試料あるいは患者の癌細胞または癌組織と接触すると、癌陽性試料の成分はプローブまたはテストスティックに結合し、試料から取り出されてさらに分析される。
【００８１】
本願において「腫瘍」は、固形の多細胞腫瘍組織を意味する。さらに、本願において「腫瘍」は、前悪性状態の組織であって、固形腫瘍に分化し、腫瘍に特異的な特徴を有するものを意味する。本願において「腫瘍」という用語は、白血病のような単一細胞癌、培養した癌細胞、またはそのような細胞のクラスターを意味するものではない。本発明は特に、初期のヒト癌試料を対象とする。培養した癌細胞のグリコシル化反応は変化し、それは癌との関連性を通常は示さないことが知られている。さらにトランスフェクション、細胞培養用培地および単一細胞への固形腫瘍の分離はグリコシル化反応に劇的な影響を与える場合があることも知られている。治療においては、腫瘍特異的オリゴ糖または腫瘍特異的オリゴ糖配列（時に「癌特異的オリゴ糖／オリゴ糖配列」ということもできる）は全ての種類の癌および腫瘍の治療を目的としている。「癌」という用語は腫瘍も意味する。
【００８２】
本発明は特に、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を発現している全ての癌および腫瘍の治療に関する。好ましい癌の種類としては、喉頭癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌および肺癌が挙げられる。特に本発明のＮ−グリカン型末端GlcNAcが関連する治療法および組成物は、このような種類の癌に対して好ましい。肺癌は、本発明のタンパク質結合GlcNAcに関連した治療法および組成物の好ましい標的である。Ｏ−グリカン型物質は、特に卵巣癌および粘液性癌（特に卵巣腺癌）に対する本発明の治療方法および組成物に用いることが好ましい。好ましい態様においては、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型末端GlcNAc-構造を副腎腫である癌の治療および診断に用いる。本発明は特に、本発明の末端GlcNAc-構造をその表面に発現しているいかなる種類の癌および腫瘍に対する本発明の治療の実施に関する。
【００８３】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydr. Res. 1998, 322:167; Carbohydr. Res. 1997, 297:1; Eur. J. Biochem. 1998, 257:29）に従った。
【００８４】
Gal、Glc、GlcNAc および NeuNAcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNと示し、ガラクトサミンはGalNと示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、NeuNAc残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれβ３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミンまたはGalβ3/4GlcNAcは、１型構造残基であるGalβ3GlcNAcおよび２型構造残基であるGalβ1-4GlcNAcのいずれかを示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸またはNeuNAcであり、Lacはラクトースを示し、Cerはセラミドを示す。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
実施例１
細菌の培養および標識
GlcNAc認識GafDアドへシンを発現している、組換えＧ−フィンブリェ発現 Escherichia coli（G-fimbriated Escherichia coli）IHE11088（pRR-5）株（Rhen, M. et al., 1986）を、テトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）および１０μｌの［35Ｓ］−メチオニン（４００ｍＣｉ；英国、リトルチャルフォント、Amersham Pharmacia Biotech社製）を含有するルリア培地中で３７℃で一晩培養した。細菌を遠心分離で回収してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で二回洗浄し、１×１０9ＣＦＵ／ｍｌになるようにＰＢＳに再懸濁した。比活性は約１００ＣＦＵ／ｃｐｍであった。
【００８６】
Erythrina cristagalli 由来レクチンの標識
Erythrina cristagalli由来のGalβ4GlcNAcβ−結合レクチン（Teneberg et al., 1994）をVector Laboratories社（カリフォルニア州、バーリンゲーム）から購入した。一つが１００μｇの複数のタンパク質標本を125Ｉで標識した。具体的には、Ｎａ125Ｉ（１００ｍＣｉ/ｍｌ；Amersham Pharmacia Biotech社製）とＩＯＤＯ−ＧＥＮ試薬（イリノイ州、ロックフォード、Pierce社製）を用いて、製造者のプロトコールに従って標識した。約５×１０3ｃｐｍ／μｇのタンパク質が得られた。
【００８７】
グリコスフィンゴ脂質結合アッセイ
薄層クロマトグラムで分離したグリコスフィンゴ脂質に対する、放射性標識した細菌およびレクチンの結合を、公知の方法（Teneberg et al., 1994; Hansson et al., 1985）に従って行った。グリコスフィンゴ脂質の薄層クロマトグラフィーは、アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck社製）上で、クロロフォルム／メタノール／水（容量比は６０：３５：８）を溶媒系として行った。乾燥したクロマトグラムを、０．５％（ｗ／ｖ）ポリイソブチルメタクリレート（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、Aldrich Chem. Comp. Inc.社製）を含有するジメチルエーテル／ｎ−ヘキサン（容量比は１：５）に１分間浸した。乾燥後、クロマトグラムを２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3を含有するＰＢＳに室温で２時間浸漬した。続いてクロマトグラムを、ＰＢＳで希釈した放射性標識細菌（２〜５×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）または放射性標識レクチンのＢＳＡ溶液（２×１０3ｃｐｍ／ｍｌ）で被覆した。室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで繰り返し洗浄した。その後クロマトグラムをXAR-5 Ｘ線フィルム（ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak社製）に１２時間露光させた。
【００８８】
実施例２
末端 GlcNAc 構造の腫瘍特異性の説明
放射性標識したＧ−フィンブリェ発現 Escherichia coliを用いて薄層オーバーレイアッセイを行い、種々の腫瘍組織および正常な組織のスクリーニングを行った。E. coli IHE11088 (pRR-5) 株は、末端GlcNAcβ−構造を特異的に認識する（Rhen, M. et al. 1986）。結合活性のある糖脂質は、検討した四つの副腎腫である腫瘍の一つに由来する非酸性画分から検出された（図１）。ここで検討した、ヒトの正常な腎臓由来の非酸性グリコスフィンゴ脂質からなる対応画分や対照組織には、上記結合は見られなかった。
【００８９】
実施例３
ヒトの副腎腫由来の末端 GlcNAc β−構造の特徴づけ
ヒトの副腎腫である腫瘍に由来する非酸性グリコスフィンゴ脂質を分画し、薄層オーバーレイアッセイによってGlcNAcβ−特異的Ｇ−フィンブリェ発現 E. coli（図１Ａ）および末端Galβ4GlcNAcβ−構造を認識するErythrina cristagalli由来レクチン（図２Ｂ）のそれぞれによる結合を分析した。二種の結合試薬のそれぞれに結合するグリコスフィンゴ脂質種の一部は重複している。このデータは、末端GlcNAc−種の大部分がＮ−アセチルラクトサミン型非酸性グリコスフィンゴ脂質に存在することを示す。レクチン結合活性種とは重複しない末端GlcNAc−種においては、その末端構造は、Ｎ−アセチルラクトサミンをGlcNAc（例えばGlcNAcβ3Galβ3/4GlcNAcβ-）で誘導化したものである可能性が最も高く、拡散したバンドも、異性体であるGlcNAcβ6Galβ3/4GlcNAcβ-の存在を示すと考えられる。この試料には、一つの糖脂質に末端GlcNAcおよびＮ−アセチルラクトサミンの両方が存在する希少な種も含まれていると考えられる。これは分岐構造、例えばGalβ3/4GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ3/4GlcNAcβ-およびGlcNAcβ3(Galβ3/4GlcNAcβ6)Galβ3/4GlcNAcβ-の存在を示し、グリコスフィンゴ脂質のサイズ分布は、少なくとも二つの末端GlcNAcを有する脂質種の存在も示すと考えられる。Erythrina cristagalli由来レクチンの結合は、ほとんどのラクトサミンがおそらく２型Ｎ−アセチルラクトサミン構造であるGalβ4GlcNAcを含むことを示す。パーメチル化後の糖脂質をＦＡＢ質量分析法およびＥＩ質量分析法によって部分的に分析したところ、末端HexNAcの存在を示し、さらに末端GlcNAcを含むもっとも小さい脂質種が五糖グリコスフィンゴ脂質であり、おそらくはラクト系またはネオラクト系であることを示した。また、七量体およびより大きな十五量体までの構造も観察された（図１）。レクチンの結合は、ラクトサミンの大部分がおそらくは２型Ｎ−アセチルラクトサミン構造を有することを示す。
【００９０】
実施例４
タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法
ホルマリン固定化組織試料またはホルマリン固定化・パラフィン包埋組織試料からのグリカンの単離
ホルマリン固定化試料からグリカンを単離する前に、Manzi et al. (2000)の記載と実質的に同様のクロロホルム−メタノール抽出を行うことでタンパク質を濃縮した。糖タンパク質の定量的抽出は、放射性標識標準糖タンパク質によって確認した（データは示さない）。ホルマリン固定化・パラフィン包埋試料からグリカンを単離する前に、試料を脱パラフィン処理に付した。糖タンパク質試料から非還元的β脱離法でグリカンを分離し、クロマトグラフィーにより精製した。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstationを用い、Saarinen et al. (1999)、Papac et al. (1996)およびHarvey(1993)の記載と実質的に同様に行った。
【００９２】
エキソグリコシダーゼ消化
全てのエキソグリコシダーゼ反応をNyman et al. (1998)およびSaarinen et al. (1999)の記載と実質的に同様に行い、結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。使用した酵素とそれによって特徴付けられるオリゴ糖を用いた特異的な対照反応を以下に示す：β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、オリゴ糖中のGlcNAcβ1-6Gal-Rを消化したが、GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rは消化しなかった；β１，４−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、オリゴ糖中のGalβ1-4GlcNAc-Rを消化したが、Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった；α−マンノシダーゼ（ナタマメ由来；英国、Glyko社製）は高マンノースＮ−グリカン類からなる混合物をMan1GlcNAc2Ｎ−グリカンコア三糖に転換した。対照の消化反応も分析用のエキソグリコシダーゼ反応と並行して行い、その結果も同様に分析した。
【００９３】
UDP-GalN −ビオチンの合成
ＵＤＰ−ガラクトサミン（UDP-GalN）を、UDP-Glcおよびガラクトサミン−１−リン酸からガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（E.C. 2.7.7.12；米国、Sigma社製）の作用により合成する。典型的な合成プロトコールを以下に示す。反応混合物は、１０ｍＭのガラクトサミン−１−リン酸、２０ｍＭのUDP-Glc、５Ｕ／ｍｌのガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、１００ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する。反応容器を窒素雰囲気下、室温で３日間インキュベートし、その後、Maki et al. (2002)の記載と実質的に同様に、黒鉛化炭素のカラム（graphitised carbon column）を用いて糖ヌクレオチドを反応混合物から単離する。UDP-GlcおよびUDP-GalNを含有する糖ヌクレオチド混合物を、過剰モル量のスルフォスクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（sulfo-NHS-LC-ビオチン；米国、Pierce社製）を含む５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で、室温で２．５時間インキュベートする。生成物であるUDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）をゲルろ過および逆層ＨＰＬＣによって精製する。
【００９４】
UDP-GalN −ビオチンによる、オリゴ糖中および組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
RamakrishnanとQasba (2002)に記載の酵素に類似する組換えβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミンをUDP-GalN−ビオチンから末端GlcNAc含有受容体へ転換することができる。典型的な方法においては、オリゴ糖受容体（例えばGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）または脱パラフィンした、ホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を、１０ｍＭのUDP-GalN−ビオチン、１６０Ｕ／ｌの酵素、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび２０ｍＭのＭｎＣｌ2を含有する反応混合物と共に３７℃でインキュベートする。洗浄後、ストレプトアビジン結合試薬またはアビジン結合試薬、例えばストレプトアビジン−ＦＩＴＣ、を用いて、当業界では標準的な方法によってビオチン基を視覚化する。
【００９５】
UDP-[ 14 C]Gal による組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
ホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を脱パラフィンし、UDP-[14C]Gal、２００Ｕ／ｌのウシ乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（米国、Calbiochem社製）、５０ｍＭのＮａ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）および２０ｍＭのＭｎＣｌ2を含有する反応混合物中で３７℃でインキュベートした。洗浄後、標識した組織片をオートラジオグラフィーに付した。Nyman et al. (1998)の記載と実質的に同様の方法に従って、Chryseobacterium meningosepticum Ｎ−グリコシダーゼＦ（米国、Calbiochem社製）を用いて組織片からＮ−グリカンを分離した。クロマトグラフィーは、図７Ａおよび図７Ｂに関する「図面の簡単な説明」の欄に記載したように行った。
【００９６】
実施例５
肺腺癌試料由来の癌関連末端 GlcNAc 含有Ｎ−グリカン
腫瘍およびその周囲の健康な組織のホルマリン固定化試料を、肺腺癌の患者から調製した。腫瘍試料（図３Ａ）と健康組織の試料（図３Ｂ）のそれぞれから単離した中性Ｎ−グリカン、具体的には、m/z 1485.48に観測される、[Hex3HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1485.53）に対応するピークにおいて、有意な差が見られた。このグリカンのピークの相対強度は、健康な組織と比較して、腫瘍試料では６．１倍以上も増加した。さらに、m/z 1647.53に観測される、[Hex4HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1647.59）に対応するピークは、腫瘍組織においてはより高いシグナル強度を有していた。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の際には（図３Ｃ）、２種のピークはそれぞれ、m/z 1079.18に観測される、[Hex3HexNAc2Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1079.38）に対応するピーク、およびm/z 1444.24に観測される、[Hex4HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1444.51）に対応するピーク、に完全に変化し、これは末端β−GlcNAc残基の存在を示す。ナタマメ由来α−マンノシダーゼ消化の際には（図３Ｄ）、これらのピークはそれぞれ、m/z 755.19に観測される、[Hex1HexNAc2Fuc1+Na]+ イオン（計算値：m/z 755.27）に対応するピーク、およびm/z 1282.29に観測される、[Hex3HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1282.45)に対応するピーク、にさらに変化した。しかしながらβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の前にα−マンノシダーゼ消化を実施しても、２種のピークに影響を与えることはなく、これは、α−Man残基は末端β−GlcNAc残基に隣接して存在することを示している。さらに、もとの中性グリカン試料のβ１，４−ガラクトシダーゼ消化によって、m/z 1647.5に観測されるピークがm/z 1485.5に観測されるピークに変化したことは、末端Galβ1-4GlcNAc単位の存在を示す。これらの結果を全て考慮すると、肺腺癌腫瘍試料においては、周囲の健康な組織と比較して、複合Ｎ−結合グリカンコア構造であるGlcNAcβ-Manα1-6(GlcNAcβ-Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcは非常に増量しており、該構造のモノ−β１，４−ガラクトシル化誘導体（GalがGlcNAcに結合している）はわずかに増量していることが示唆された。
【００９７】
実施例６
癌試料における末端 GlcNAc 含有Ｎ−グリカンの出現
種々の腫瘍および健康な対照試料における上記構造の出現は、中性グリカン画分の単離と分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳとエキソグリコシダーゼ消化行うことで検討した。検討した腫瘍−対照のペアは次の通りである：七種の肺癌試料のペアおよび各一種の結腸癌、胃癌および喉頭癌のペア。分析の結果、全てのペアにおいて、m/z 1485.5に観測される２つの末端GlcNAcを含有するＮ−グリカンの相対的な存在量が、癌試料では上昇することが判明した。しかしながら、健康な組織と癌化組織の両方において、このグリカンエピトープの発現レベルに有意な個体差が存在した。表１に、単離した中性グリカン画分について、m/z 1485.5に観測されるＮ−グリカンの特異的な発現量をまとめた。
【００９８】
実施例７
UDP-GalN −ビオチンの合成
ＵＤＰ−ガラクトサミンを、上記の「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように合成した。生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて特徴付けたところ（[C15H25N3O16P2-H]_イオンの実測値はm/z 564.42であり、計算値はm/z 564.31）（図４Ａ）、予想されたピークは、マススペクトルにおいて、UDP-Glcのピークよりも１質量単位小さい位置に現れた（[C15H24N2O17P2-H]_イオンの実測値はm/z 565.37であり、計算値はm/z 565.29）（図４Ａ）。粗糖ヌクレオチド調製物をビオチン化試薬、即ちスクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートと反応させた。反応後、予想された生成物を反応混合物の質量分析スペクトルに観察することができた（[C31H50N6O19P2S-H]_イオンの実測値はm/z 902.93であり、計算値はm/z 903.76）（図４Ｂ）。UDP-Glcはビオチン化試薬とまったく反応しなかった。合成したUDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）を、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc および RamakrishnanとQasba (2002)に記載の酵素と類似の組換えβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させた。生成物である［Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン］β1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて特徴づけた（[M+Na]+イオンの実測値はm/z 1433.38であり、計算値はm/z 1433.55）。これらの結果を全て考慮すると、合成した生成物は予想通りの構造を有することが判明した（図５）。生成物は、均質になるまでクロマトグラフィーで精製した。
【００９９】
実施例８
UDP-[ 14 C]Gal および UDP-GalN −ビオチンによる、組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
脱パラフィンしたホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を、UDP-[14C]Galおよびウシ乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように放射性標識した。オートラジオグラフィーによって、腫瘍試料と健康組織の試料の間にはっきりとした差異が示され（図６）、肺腺癌試料においては、末端GlcNAc残基の量が非常に上昇していることが判明した。同様の結果は、「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように、UDP-GalN−ビオチン試薬としてストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いた実験および蛍光顕微鏡観察からも得られた。重要なことは、癌細胞はこのビオチン化試薬で標識できることである。
【０１００】
実施例９
肺腺癌試料からの [ 14 C]Gal 標識オリゴ糖の単離
肺腺癌試料および周囲の健康な組織の組織片を上記のように[14C]Galで標識した後に、標識したオリゴ糖をＮ−グリコシダーゼＦ消化およびβ−脱離反応のそれぞれで単離した。Ｎ−グリコシダーゼＦで遊離された肺腺癌由来グリカンのゲルろ過クロマトグラム（図７Ａ）においては、１つのピークだけが見られ、それは標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc および Galβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]と共に溶出した。このピークをプールし、多孔性黒鉛化炭素のカラムを用いたＨＰＬＣに付したところ、１つの大きなピークと二つの小さなピークに分割された（図７Ｂ）。総放射能のほぼ全てを含む大きなピークは、標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]と共に溶出した。
【０１０１】
肺腺癌から非還元的β−脱離法により遊離させた材料のゲルろ過ＨＰＬＣクロマトグラム（図７Ｃ）においては、総放射能の４５％を含む幅広いピークが、移動相の容量（void volume）（８ｍｌ）と標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]の溶出時間との間で溶出した。この幅広いピークをプールし、強カチオン交換材料のカラムとＣ18シリカのカラムに通したところ、すべての糖ペプチド材料は保持されたが、遊離のオリゴ糖は定量的に溶出された。プールした画分中のほぼ８０％の放射能がカラムに保持され、これは幅広いピークは[14C]Gal標識グリカン部分が分離されていないアルカリ−遊離糖ペプチドと実際に対応することを示した。残りの放射能の大部分は、上記のＮ−グリカン構造に対応することが判明したが、他の標識オリゴ糖の存在を否定することはできなかった。総放射能の５５％を含むゲルろ過ＨＰＬＣクロマトグラムの大きなピークは、標準Ｎ−アセチルラクトサミン（LacNAc）と共に溶出した。
【０１０２】
実施例１０
癌試料由来のタンパク質結合 GlcNAc
さらに、１５〜１８分に溶出した画分をプールしたものを、黒鉛化炭素のカラムを用いたＨＰＬＣに付したところ、主要なピークがLacNAcと共に溶出した。これは、試料が塩基不安定GlcNAc単糖−タンパク質結合体（最も可能性が高いのはGlcNAcβ-O-Ser/Thr単位）を含有することを示唆している。重要なことには、肺腺癌試料における[14C]−標識LacNAcの存在量は、その周囲の健康組織の試料と比較した場合に、有意に（１．９９倍にも）増加していた。
【０１０３】
これらの結果をまとめると、UDP-[14C]Gal標識肺腺癌試料組織片から遊離することのできる総放射能の約半分は、[14C]Gal標識型の癌関連Ｎ−グリカン（即ち、GlcNAcβ-Manα1-6(GlcNAcβ-Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc）であることが判明した。さらに、UDP-GalN−ビオチン反応においても、標識は上記の記載で特徴付けられたオリゴ糖構造に転移されることが明らかである。
【０１０４】
実施例１１
ヒト血清からの抗 GlcNAc 抗体の単離
粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得たヒト血清を、エピトープであるGlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαまたはGalβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαを共有結合でカップリングさせたセファロースカラムに通した。カラムを洗浄した後、初めに０．５ＭのGlcNAcを含有する緩衝液で特異的に溶出させ、次に酸性緩衝液で非特異的に溶出させた。対照としては、健康な提供者、即ち悪性疾患の病歴のないヒト、からプールしたヒト血清から調製したＩｇＧ調製物も上記のカラムクロマトグラフィー工程に付した。回収した画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した（図８）。その結果、標準ＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の分子量に類似した分子量を有するタンパク質に対応する２つのバンドが、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムからの０．５ＭのGlcNAcによる特異的溶出で溶出したが、これは癌から生還したヒトから得た血清試料のみで見られた。対照的に、このような特異的な溶出は、二種の試料をGalβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムクロマトグラフィーにかけても検出できなかった。それらの相対的な分子量から、特異的に溶出したタンパク質はＩｇＧヒト抗体またはＩｇＡヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のサブユニットを表すが、ＩｇＭヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のサブユニットは表さないと考えられる。上述の結果は、癌から生還したヒトの血清中には、上昇したレベルの末端GlcNAc特異的抗体、より具体的にはグリカンエピトープであるGlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαを認識するＩｇＧ抗体および／またはＩｇＡ抗体、が存在することを示す。
【０１０５】
【表１】
【０１０６】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】GlcNAcβ−特異的E. coliの菌体をオーバーレイして結合させた、薄層オーバーレイアッセイ後のオートラジオグラムであり、末端GlcNAc残基を有するオリゴ糖配列の腫瘍特異性を表すものである：副腎腫である腫瘍に由来する非酸性グリコスフィンゴ脂質類（第一レーン）およびそれに対応する、正常な腎臓由来のグリコスフィンゴ脂質画分（第二レーン）。
【図２】Ａは［35Ｓ］で標識したGlcNAcβ−特異的E. coliを用いて薄層オーバーレイアッセイを行った結果であり、Ｂは［125Ｉ］で標識したGalβ4GlcNAcβ−特異的Erythrina cristagalli由来レクチンを用いて薄層オーバーレイアッセイを行った結果である。レーン１〜８：ヒト副腎腫由来の非酸性グリコスフィンゴ脂質の副画分、レーン９：参照用のグリコスフィンゴ脂質であるGlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、レーン１０：参照用のグリコスフィンゴ脂質グロボシドであるGalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer。
【図３Ａ】肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｂ】健康な肺の試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｃ】S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化後の、肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｄ】S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメα−マンノシダーゼ消化後の、肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ａ】ＵＤＰ−ガラクトサミン合成反応後に精製した糖ヌクレオチドの、リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｂ】UDP-GalN−ビオチン合成反応後に精製した糖ヌクレオチドの、リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図５】UDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）の構造。
【図６】ａは[14C]Galで標識した肺腺癌切片のオートラジオグラムであり、ｂは健康な肺の組織片のオートラジオグラムである。
【図７Ａ】Ｎ−グリコシダーゼＦで消化した肺腺癌試料に由来する、[14C]Galで標識したオリゴ糖。グリカン類は、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ約８．３）で膨潤させたSuperdex Peptide HR 10/30 カラム（スウェーデン国、Pharmacia社製）を用い、流速１ｍｌ／分の条件下でゲルろ過ＨＰＬＣに付した。各１ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。１２〜１５分に得た画分をプールした。
【図７Ｂ】Ｎ−グリコシダーゼＦで消化した肺腺癌試料に由来する、[14C]Galで標識したオリゴ糖。Superdex Peptideカラムを用いたゲルろ過ＨＰＬＣで回収した１２〜１５分に得た画分（図１０Ａ）を、１０ｍＭのＮＨ3溶液で膨潤させたHypercarb 5uカラム（4.6 x 250 mm）（米国、Thermo Hypersil社製）を用い、流速０．７ｍｌ／分、移動相のアセトニトリル濃度勾配が１００分間で０〜４０％まで直線的に増加する条件下でＨＰＬＣに付した。各０．７ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。
【図７Ｃ】肺腺癌試料から非還元的β−脱離法によって遊離した、[14C]Galで標識した標品。これを、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3で膨潤させたSuperdex Peptide HR 10/30カラム（スウェーデン国、Pharmacia社製）を用い、流速１ｍｌ／分の条件下でゲルろ過ＨＰＬＣに付した。各１ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。８〜１５分に溶出した画分（プール１）のみならず、１５〜１８分に溶出した画分（プール２）もプールした。
【図８】クーマシーブルー染色した還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。矢じりはそれぞれＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の位置を示す。Ａ：粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得た血清を、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。Ｂ：ヒト血清からプールしたＩｇＧを、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。Ｃ：銀染色したゲル。粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得た血清を、Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。
【０００１】
本発明は、ヒト腫瘍が特異的に発現するオリゴ糖配列に関する。本発明は、腫瘍特異的オリゴ糖配列と結合する試薬を製造するための方法のみならず、腫瘍特異的オリゴ糖配列を検出するための方法も開示する。また、本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、癌および悪性腫瘍の診断方法にも関する。さらに本発明は、上記オリゴ糖配列およびそれに結合する試薬を用いた、腫瘍、癌および悪性腫瘍の治療方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の腫瘍は、同種の細胞や組織の非悪性グリコシル化産物とは異なるオリゴ糖配列を発現する。公知のまたは推測される癌関連オリゴ糖構造の例としては、次のオリゴ糖構造が挙げられる：糖脂質構造、例えばグロボ−Ｈ（Fucα2Galβ3GalNAcβ3Galα4LacβCer）、ガングリオシドであるＧＭ１（Galβ3GalNAcβ4(NeuNAcα3)LacβCer）やＧＤ２（GalNAcβ4(NeuNAcα8NeuNAcα3)LacβCer）；ルイス型フコシル化構造、例えばルイスａおよびｘ（Galβ3/4(Fucα4/3)GlcNAc）、ルイスｙ（Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc）、シアリルルイスｘ（NeuNAcα3Galβ4(Fucα3)GlcNAc）およびポリラクトサミン鎖中でのこれらの組み合わせ；ならびにＯ−グリカンコア構造、例えばＴ−抗原（Galβ3GalNAcαSer/Thr-タンパク質）、Ｔｎ−抗原（GalNAcαSer/Thr-タンパク質）やシアリルＴｎ−抗原（NeuNAcα6GalNAcαSer/Thr-タンパク質）。非ヒト型の構造、例えばＮ−グリコリルノイラミン酸、が癌に存在することも示されている。癌においては、関連するオリゴ糖構造およびその特異性について十分に確立されている症例はわずかであり、これらの構造の中には、正常な細胞および組織に存在するものもあることから、癌には単に高濃度で存在しているだけだと考えられる。
【０００３】
末端GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc配列を含む構造がヒト白血病細胞に存在することを示した報告（Hu et al., 1994）があるが、この構造は、正常な白血球にも同様に提示されている場合がある。従って、固形腫瘍に広く見られるグリコシル化パターンと上記知見との関連性は示されなかった。この種の糖構造は、ヒト組織の希少な正常グリコシル化産物の一部であると考えられ、Ｏ−グリカンに結合したGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6配列は、おそらくヒト胃粘液に提示されている。ある研究によると、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6配列を認識するモノクローナル抗体は、粘液性卵巣腫瘍、胆嚢およびすい臓上皮の偽幽門腺化生（pseudopyloric metaplasia）や胃、胆嚢およびすい臓の分化型癌（gastric differentiated carcinoma）などの悪性化組織、ならびにヒト羊水などの非悪性化組織に提示されている類似の構造をも認識する可能性を示しているものの、悪性化組織由来の構造は特徴付けられていない（Hanisch et al., 1993）。この抗体は、ネオ糖脂質構造であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4および肺、結腸、子宮内膜などの臓器の癌を認識しなかった。睾丸細胞に対して作製した別のモノクローナル抗体は、分岐Ｎ−アセチルラクトサミン、例えばGlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc-、を認識すると考えられる（Symington et al., 1984）。また、末端GlcNAcはヒト胎児粘液由来のムチン類に見出されている（Hounsell et al., 1989）。正常な組織においては、末端GlcNAcはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンの生合成における生合成中間体として少量存在する場合がある。
【０００４】
半合成糖脂質であるGlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3LacβCerに対する複数のモノクローナル抗体が作製されており、これらの抗体は培養結腸癌細胞系および腫瘍から得た糖脂質を認識することが示されている（Holmes et al., 1991）。しかしながら、抗体は複数の構造を認識し、結合データは矛盾した。さらに、糖脂質は全ての抗体によっては認識されることはなく、癌細胞または腫瘍から得た糖脂質構造を特徴付けるには至らなかった。従って、腫瘍上の末端GlcNAc構造の存在は確立されなかった。他の研究には、GlcNAcβ3LacβCerに対するモノクローナル抗体の製造に関する記載がある（Nakamura et al., 1993）。この抗体による上記の五糖構造の認識も弱かった。さらにこの抗体は、ヒト由来の細胞系ではないＣＯＳ−１細胞上のプロテアーゼ感受性エピトープを認識した。上記のいずれの研究に示された免疫化プロトコールも、糖の多価結合体に対して誘導された抗体反応については記載されておらず、免疫化は糖脂質によるものである。
【０００５】
通常、ヒト血清中には末端GlcNAc構造を認識する多量の抗体が存在する。末端Galα3Galβ4GlcNAc-構造を認識する天然の抗体のクラスもある。Galα抗原はヒトに天然には存在しないが、天然の抗体が、例えばGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcといった構造に結合することも近年報告されている（Teneberg et al., 1996）。Ｘ２−構造であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcはヒト組織に提示されている正常な抗原であり、GalNAcα3Galβ4GlcNAc および Galα3Galβ4GlcNAcといった構造は、正常な組織や癌化組織からは報告されていない。このように、末端GlcNAc構造が腫瘍抗原であるという本願の知見は、天然の抗体の実際の機能が、末端GlcNAc構造を含む癌の予防である可能性を示している。
【０００６】
以下の特許には、癌抗原、ならびにそれを用いた治療用および診断用の抗体の製造方法および癌ワクチンの製造方法に関する記載がある。しかし、抗原の構造は、本願で開示する糖類とは関係ない。
癌ワクチン： 米国特許第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号。
治療用抗体： 米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号。
診断方法： 米国特許第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,679,769号、第5,543,505号、第5,902,725号および第6,203,999号。
【０００７】
従来技術としては、キトビオース−マンノース三糖を認識する、腫瘍の診断用抗体および治療用抗体がDE 38 07 594 A1に記載されている。この特許出願は、抗体以外にも、異なる末端構造を有する複数のＮ−グリカンも開示しており、その中には、非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンを有するものもある。望ましい構造のいくつかは、後に正常なグリカンであり、癌特異的構造ではないと特徴付けられた。この出願は、癌の分野に有用な構造を開示し、請求しているが、望ましいグリカンがどのような構造のものかは出願明細書からは明らかではない。GlcNAc残基がα２、α４およびα６−結合できることが示されているが、本発明はこのような通常は見られない構造に関するものではない。
【０００８】
別の特許出願であるWO 00/21552は、ウシ下顎腺ムチンから単離した複数の通常は見られないＯ−グリカン構造を請求している。上記の構造の中には、例えば、GlcNAcβ6GalNAcα6GalNAc および GalNAcβ3(GlcNAcβ6)GalNAcのように末端GlcNAc-残基を有するものもある。本発明は２個のGalNAc残基を有するこれらの構造に関するものではない。上記特許出願は、上記構造を癌に関連する抗原として用いる潜在的な治療用途の可能性に関する記載を含む。しかし、上記構造がウシ癌に関連することは示されておらず、ウシ正常下顎腺分泌物に存在することしか示されていない。さらに、この構造がヒト組織に存在する可能性はほとんどない。それはグリコシル化反応は種特異的でヒトとウシの間では異なっており、グリコシル基転移酵素およびグリコシル化の反応方式がウシとヒトにおいては異なるためである。ヒトゲノムも公知であるが、上記特許出願で請求されているウシ構造の合成に関連する可能性のあるグリコシル基転移酵素は製造されておらず、特徴づけもされていない。現時点では、請求されている６種の新規なグリコシル基転移酵素のいずれもがヒトまたはヒト癌（あるいはウシ癌）について報告されていない。さらに、いかなるウシグリコシル化産物も詳細に特徴づけられているヒト唾液腺ムチンには見出されていない。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ヒト腫瘍によって特異的に発現されるオリゴ糖配列を開示する。本発明は、腫瘍特異的末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出し、該配列の存在を指標として癌の検出を行う方法に関する。本発明は、多価の形態で該オリゴ糖配列を含む抗原性物質を提供し、さらに該オリゴ糖配列または該オリゴ糖配列に結合する結合性物質を包含する診断剤、医薬組成物および癌ワクチンを提供する。また、本発明は癌の治療方法にも関する。
【００１０】
発明の詳細の説明
本発明は、ヒト腫瘍によって提示される末端β−結合Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖鎖構造およびタンパク質結合単糖Ｎ−アセチルグルコサミンに関する。本発明によってヒト腫瘍に特異的な欠陥が見出されたが、この欠陥は、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む、通常は見られない炭水化物の細胞表面および細胞外の提示を生じる。一般的に、末端GlcNAc-構造は、ヒトの正常な組織においては非常に希少である。このような構造の発現は二つの要素によって生じる。第一は、腫瘍細胞における生合成および分解機構が正しく機能していないためである。正常な組織においては、多くの末端構造はGlcNAc残基に結合したガラクトースを含み、この構造は、シアル酸や血液型抗原などによってキャップされている。本願のデータは、癌炭水化物が通常は見られないグリコシダーゼ活性および欠陥のあるグリコシル化反応、即ち、β4-ガラクトシルトランスフェラーゼの（更にβ3-ガラクトシルトランスフェラーゼも関与すると考えられる）反応、に曝されていることを示している。上記欠陥は、三種のβ−ガラクトシル化オリゴ糖配列の全てに見られた。第二に、糖タンパク質構造と糖脂質構造を含むグリコシル化産物の細胞内ターゲティングおよび品質管理機構に欠陥があると考えられる。正常な細胞においては、グリコシル化の不十分なタンパク質及び脂質を再循環させて天然のグリコシル化反応を完了させる品質管理が行われているので、本発明のようなグリコシル化構造が細胞表面上に存在することは、正常な細胞では非常に稀である。正常な細胞または組織においては、本願で開示するオリゴ糖構造はヒトゴルジ装置に少量存在し、公知のタンパク質結合GlcNAcは、細胞質および核に見られるタンパク質修飾物であることに間違いないと考えられている。ゴルジ装置の機構における欠陥は、本願で開示する腫瘍特異的構造の部分細胞表面発現を生じる。特定の態様においては、本発明は、特に細胞表面型または組織表面型の本発明の腫瘍関連GlcNAc-構造に関する。細胞内で過剰発現した本発明の構造でさえも、診断の分野に直接的に有用である。
【００１１】
ガラクトシル化の欠陥、通常は見られないグリコシダーゼ活性の存在、および細胞内制御の喪失は、以下の三種の腫瘍関連グリコシル化産物を生じる：
１．ガラクトシル化の不十分な、不完全なタンパク質結合Ｎ−グリカン；
２．ガラクトシル化の不十分な、不完全なＯ-グリカンコア構造；および
３．ガラクトシル化の不十分なポリラクトサミン（例えば、ヒト副腎腫由来のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型糖脂質）。
これらの欠陥は、糖タンパク質および糖脂質中に複数の通常は見られない末端エピトープを生じる。本発明は上記三種のグループに属するオリゴ糖エピトープに関する。本発明は、正常なβ−ガラクトシル化オリゴ糖配列を有する三種類のグリカン鎖の全てに普遍的に存在する、類似した欠陥に始めて着目した。末端β−結合GlcNAcは末端構造として存在する。この構造は、末端GlcNAc-残基を直接修飾するための、β1,4(3)-Gal-残基転移酵素反応を含む酵素反応の欠陥を示し、その一方で、末端構造を分解することのできるゴルジ経路における増加したグリコシダーゼ活性を示す。しかしながら、三種の炭水化物における欠陥の普遍性は、ゴルジ装置の機構がかなり乱れているので、ゴルジ経路の後期に位置する末端修飾酵素が腫瘍細胞の発現する全グリカンを効果的に修飾できないことを示す。さらに、本発明は以下について開示する：
４．癌および腫瘍上のタンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミン単糖の誤った発現。
タンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミンは、一般的に、いわゆるＯ-GlcNAc-構造の一部として細胞内に存在する。本発明者らは、タンパク質結合Ｎ−アセチルグルコサミンの強い過剰発現に着目した。過剰発現によって、ヒト腫瘍は細胞表面にＯ−結合GlcNAcによるいくらかの標識さえも有することとなる。
【００１２】
末端β−結合GlcNAcは、上記グループ１〜３の全てに共通だが、末端近傍の構造は、腫瘍や癌の診断または治療において認識されなければならない構造に影響を与えることが判明した。本発明は、特に末端GlcNAcと三種の欠陥オリゴ糖配列グループにおいて末端GlcNAcの近傍に位置する少なくとも１つの単糖残基を有する末端オリゴ糖配列を用いた、治療剤および診断剤に関する。また、本発明は、ポリラクトサミンの非還元末端β−GlcNAcオリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖、Ｏ−グリカンまたはＮ−グリカンに関する。
【００１３】
１．不十分なガラクトシル化または分解によって生じた、不完全なＮ−結合グリカン
本発明者らは、喉頭、胃、結腸および肺などの腫瘍に由来する、末端GlcNAc残基を有する複数のＮ−グリカン構造を質量分析法によって特徴付けた。本明細書は、腫瘍においてはＮ-グリカンの過剰発現が普遍的であることを示す。新規なＮ−グリカン型腫瘍抗原も新規なグリコシル基転移法によって腫瘍の組織片から特異的に検出されたが、対応する正常組織や非悪性化組織からは全く検出されないか少量しか検出されなかった。本発明は、下記式で表されるＮ−グリカン構造：
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAcβAsn
およびその部分オリゴ糖構造であって、非還元末端タンパク質またはペプチド結合末端GlcNAcを含むものに関する。式中のAsnは、天然の抗原においては、タンパク質に直接結合しているアミノ酸であるアスパラギンを示す。腫瘍に結合した形の天然タンパク質結合オリゴ糖配列は、本発明に従って用いられる還元末端GlcNAcβAsn-構造と、末端GlcNAcβ2Manを含む少なくとも一種の分岐鎖とを含んでいるはずである。Ｎ−グリカン構造を抗原性エピトープを製造するのに用いる場合、本発明は、下記式（Ｉ）で表される少なくとも一種のオリゴ糖配列、即ち、上記Ｎ−グリカン構造をその還元末端から縮めた構造および天然オリゴ糖配列に関する。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN[β4(Fucα6)r3GN]r4]r5}r6 （Ｉ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ３、ｒ４、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（Ｉ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている；そして
｛ ｝は主鎖に存在するか存在しない基を表し、（ ）は分岐鎖を表す。）
【００１４】
上記式で表される構造は、ヒトＮ−グリカンに見られる公知のＮ−結合グリカン構造をその末端から縮めた構造を表す。正常な組織においてはこれらの構造の存在は稀であるため、免疫学的診断に適している。
【００１５】
より好ましいオリゴ糖配列は、下記式（ＩＩ）で表される構造である。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN]r5}r6 （ＩＩ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（ＩＩ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている。
【００１６】
さらに好ましい態様においては、ＧＮはGlcNAcであるが、但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) および (ii) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（ＩＩ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、および (ii) １つのGNβ2ManがManまたはManα6-残基に縮められている。最も好ましい態様においては、全てのＧＮがGlcNAcである。
【００１７】
伸長されていない構造としては、以下のオリゴ糖配列が好ましい：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Man、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Man、
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、そして
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc 。
【００１８】
より好ましいＮ−グリカン型オリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Man、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Man、そして
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAc 。
【００１９】
最も好ましいＮ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、そして
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc 。
【００２０】
２．不十分なガラクトシル化または分解によって生じた、不完全なＯ−結合グリカン
本発明者らは、腫瘍の発現するＯ−グリカンは末端β−結合GlcNAcを含む構造を有することも見出した。腫瘍に対するＯ−グリカンの特異性は、後述する実施例において、卵巣癌から生還したヒトから得た特異的な癌関連天然抗体が存在することと、癌の病歴のないヒトから得た血清プールには抗体が存在しないことによって示されている。
【００２１】
本発明は、末端β−結合GlcNAc残基を有するヒト腫瘍特異的Ｏ−グリカンコア構造、好ましくは、GalNAc-GalNAc配列は含まないＯ−グリカン配列にも関する。好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列は、下記式（ＩＩＩ）で表される少なくとも一種のオリゴ糖配列を含むものである：
[GlcNAcβ3]s1[Galβ3]s2({[GlcNAcβ3]s3Galβ4}s4GlcNAcβ6)s5GalNAc（ＩＩＩ）
（式中、ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４およびｓ５は各々独立に０または１の整数であるが、式（ＩＩＩ）で表される末端オリゴ糖配列が少なくとも一種の非還元末端GlcNAcβ-残基を有するために、下記条件の少なくとも一種を満足する：ｓ１は１である；ｓ５、ｓ３およびｓ４は共に１である；そしてｓ５は１であるが、ｓ３とｓ４は共に０である。）
【００２２】
より好ましいＯ−グリカン構造としては、下記式（ＩＶ）で表される少なくとも一種の構造が挙げられる：
[GlcNAcβ3]s1[Galβ3]s2(GlcNAcβ6)s5GalNAc （ＩＶ）
（式中、ｓ１、ｓ２およびｓ５は各々独立に０または１の整数であるが、ｓ１とｓ５の少なくとも一方は１である。）
【００２３】
好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3GalNAc、Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ6GalNAc、そして GlcNAcβ3GalNAc 。
【００２４】
さらに好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3GalNAc、Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ6GalNAc、そして
GlcNAcβ3GalNAc 。
【００２５】
最も好ましいＯ−グリカンオリゴ糖配列としては、以下の配列が挙げられる：
Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、そしてGlcNAcβ6GalNAc 。
【００２６】
本発明は、特にＯ−グリカンオリゴ糖配列であるGalβ3(GlcNAcβ6)GalNAc および／または GlcNAcβ6GalNAcを認識するが、Galβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc および／または
Galβ4GlcNAcβ6GalNAcは認識しないヒト抗体、ならびに上記抗体を用いた、本明細書で定義した治療剤および診断剤に関する。好ましい態様においては、本発明は、オリゴ糖配列であるGalβ3(GlcNAcβ6)GalNAcを効果的に認識するが、オリゴ糖配列であるGalβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAcを認識しないヒト抗体に関する。好ましい態様においては、ヒト抗体は天然の抗体である。他の一つの好ましい態様においては、上記抗体は癌ワクチンによって誘導されたものである。さらに好ましい態様においては、ヒト抗体はＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体またはＩｇＭ抗体であり、ＩｇＧ抗体であることが最も好ましい。
【００２７】
別の一つの態様においては、本発明はＯ−グリカンコア構造の希少なシアリル化異型、例えばGlcNAcβ3(NeuNAcα6)GalNAc または NeuNAcα3Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、の用途に関する。
【００２８】
３．末端 GlcNAc β 3 および／または末端 GlcNAc β 6 を含むポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型配列
本発明は、ヒト腫瘍に提示されるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型構造中の末端Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の存在を開示する。上記構造は、検討した四つのヒト副腎腫のうちの一つから多量に見出されたのが初めである。腫瘍の糖脂質画分は、特異的な放射性標識Escherichia coli株とパーメチル化した試料のＦＡＢ−質量分析法によって、末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含むと特徴付けられた。糖脂質画分は、特異的なレクチンを用いて検出することのできる末端Ｎ−アセチルラクトサミンも含んでいた。正常な腎臓由来糖脂質を細菌でスクリーニングしたところ、末端GlcNAcは対応の正常組織には存在しないことが判明した。これは複数の他の対照組織にも存在しないことからも明かである。本発明の一つの態様は、腫瘍由来の末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する少なくとも一種のオリゴ糖配列の検出または単離に関する。
【００２９】
本発明において、単離または検出される腫瘍特異的構造としては、以下の糖配列が挙げられる：GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ6Gal、そして GlcNAcβ6Galβ4GlcNAc。上記糖配列は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖の一部であるため、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン鎖は少なくとも一種の末端β−結合GlcNAcを含んでいる。
【００３０】
さらに好ましい態様においては、本発明は、次に示される非β６−結合含有直鎖状ポリラクトサミン配列に関する：GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、そして GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。
【００３１】
別の態様においては、本発明は、次に示されるβ６−結合含有非分岐ポリラクトサミン配列に関する：GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ6Galβ4GlcNAc、そして GlcNAcβ6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc。
【００３２】
好ましいポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型配列としては、次に示すようなβ３−分岐構造及びβ６−分岐構造が挙げられる：GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Gal、GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc、そして Galβ4GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc。このような分岐構造は、分岐Ｏ-グリカン構造に類似している。
【００３３】
１型Ｎ−アセチルラクトサミンであるGlcNAcβ3Galβ3GlcNAc または GlcNAcβ6Galβ3GlcNAcを含む構造も、本発明の化合物の範囲に含まれる。
【００３４】
４．タンパク質結合Ｎ - アセチルグルコサミン
本発明者らは、喉頭、胃、結腸および肺などの腫瘍に由来する、タンパク質結合GlcNAc残基を特徴付けた。本明細書は、腫瘍においてはタンパク質結合GlcNAcの過剰発現が普遍的であることを示す。新規なＮ−グリカン型腫瘍抗原も新規なグリコシル基転移法によって腫瘍の組織片から特異的に検出されたが、対応する正常組織や非悪性化組織からは、全く検出されないか少量しか検出されなかった。タンパク質結合GlcNAcの分析により、種々の形態のタンパク質結合GlcNAcの存在が示された。
【００３５】
具体的な態様においては、本発明は、本願で定義した治療剤や診断剤におけるβ−結合Ｎ−アセチルグルコサミン単糖残基（GlcNAcβ）の用途、およびGlcNAcβを包含する医薬組成物に関する。大部分の腫瘍細胞は、β−脱離法（β-elimination）によって遊離させることができるＯ−グリカン様GlcNAcを有する。
【００３６】
本発明の好ましい態様は、本発明で定義した診断剤や治療剤における、次のＯ−グリコシド構造の用途に関する。
GlcNAcSer および／または GlcNAcThr
（式中、セリン（Ser）残基およびスレオニン（Thr）残基の水酸基はGlcNAc残基にグリコシド結合している。）
【００３７】
本発明のより好ましい態様においては、アミノ酸であるセリン（Ser）残基およびスレオニン（Thr）残基は、ペプチドまたはペプチド結合体の一部であるかアミノ基および／またはカルボン酸基から誘導される。
【００３８】
他の一つの好ましい態様においては、本発明はGlcNAcX（式中、Ｘはアグリコンであり、好ましくは上記のアミノ酸残基であるセリンまたはスレオニンを模倣する）の用途に関する。
【００３９】
より好ましい態様においては、GlcNAcβSerおよび／またはGlcNAcβThr、即ち、GlcNAcβXは、本明細書で説明する多価の担体に結合しており、本発明で説明する用途に用いる。GlcNAcβXは予防接種に有用な担体に結合していることが好ましく、本明細書で説明する炭水化物担体に結合していることが最も好ましい。
【００４０】
他の一つの好ましい態様においては、本発明で説明する用途に用いるために、GlcNAcαSer および／または GlcNAcαThr、即ち、GlcNAcαXを、本明細書で説明する多価の担体に結合する。GlcNAcβXは予防接種に有用な担体に結合していることが好ましく、本明細書で説明する炭水化物担体に結合していることが最も好ましい。
【００４１】
本発明は、上記のＯ−グリカン型構造のβ−結合Ｎ−グリコシド類似体、例えばGlcNAcβ-Asn、およびペプチド誘導体ならびにそれらの類似体にも関する。生物学的試料においては、このような構造はエキソグリコシダーゼまたはエンド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによって形成される。
【００４２】
本発明のオリゴ糖配列を表す一般構造
本発明のオリゴ糖配列は、糖脂質の一部、糖タンパク質の一部および／またはＮ−アセチルラクトサミン鎖の一部であってもよい。腫瘍特異的オリゴ糖配列も、糖脂質の一部、糖タンパク質中のＮ−結合グリカンまたはＯ−結合グリカンの一部であってもよい。腫瘍関連オリゴ糖配列は、Ｏ−グリコシドGalNAcに直接結合していてもよい。腫瘍の生合成経路および／または生分解経路における欠陥または変更は、本発明のオリゴ糖配列を有した糖脂質および糖タンパク質の両方の合成をもたらす。末端Ｎ−アセチルグルコサミンの存在は、オリゴ糖鎖中の非還元末端GlcNAc残基が他のいかなる単糖にも置換されていないことを意味する。本発明における「オリゴ糖配列」は、オリゴ糖配列中の少なくとも１つの単糖残基が、他の単糖残基からなるオリゴ糖鎖を含むより大きな糖結合体の一部であり、上記オリゴ糖鎖は分岐していてもよいし、天然の置換修飾物であってもよい。上記のオリゴ糖鎖は、通常、脂質アンカーまたはタンパク質に結合している。好ましい態様においては、本発明のオリゴ糖配列は、非還元末端オリゴ糖配列である。本明細書において「非還元末端オリゴ糖配列」とは、所望によりオリゴ糖配列の還元末端から他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合している場合を除いては、他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合していない構造を意味する。オリゴ糖配列が結合体として存在している場合には、オリゴ糖配列の還元末端から結合することが好ましいが、抗体や結合性物質との結合が可能な他の結合位置も利用することができる。さらに好ましい具体的な態様においては、本発明のオリゴ糖配列には、糖結合体の一部に対応するオリゴ糖残基であって、天然のグリコシド結合によって他の単糖構造またはオリゴ糖構造に結合していないものも含まれる。上記のオリゴ糖残基は、遊離のオリゴ糖、ならびにオリゴ糖残基の還元末端から結合した結合体または誘導体であることが好ましい。
【００４３】
本明細書において、Ｎ−結合型、Ｏ−結合型およびポリラクトサミン型のオリゴ糖配列と関連して記載した本発明の末端GlcNAcオリゴ糖鎖の用途は、いずれも本願で開示する単糖構造であるタンパク質結合GlcNAcおよびその誘導体にも適用される。
【００４４】
希少な種類のガングリオシド型またはガラクトシル型のグロボシドも、腫瘍特異的末端GlcNAcとして用いることができる。いくつかの組織では末端Galβ4GlcNAcβ3/β6構造が糖脂質コアに結合されており、本発明で説明する低ガラクトシル化条件においては、末端GlcNAcを形成することができる。
【００４５】
本発明の他の一つの態様においては、腫瘍を診断するために腫瘍特異的オリゴ糖配列を検出する。
【００４６】
本明細書において「オリゴ糖配列」または「オリゴ糖」という用語には、本願で開示するタンパク質結合GlcNAcおよびその誘導体も含まれる。
【００４７】
腫瘍特異的オリゴ糖配列は、特異的な結合性物質によって検出されることが好ましく、結合性物質としては、アプタマー、レクチン、ペプチドまたはタンパク質（例えば抗体）、それらの断片あるいは遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。特異的な結合性物質は二価、オリゴ価または多価であることがより好ましい。結合性物質はレクチンまたは抗体であることが最も好ましい。
【００４８】
特異的な結合性物質のコンビナトリアル ケミストリー ライブラリーは、結合性分子を探索するために用いることができる。糖結合性のタンパク質、抗体またはレクチンは生物工学的に作製することができ、例えば、ファージディスプレイ法によって本発明の構造に対して特異的な結合性物質を製造することができる。標識した細菌または細胞、あるいは重合体の表面であって、本発明の構造を認識する分子を有するものを検出に用いることができる。オリゴ糖配列は、エンドグリコシダーゼ酵素によって腫瘍細胞から遊離することができる。また、オリゴ糖配列をプロテアーゼ酵素により糖脂質として遊離することもできる。オリゴ糖またはその誘導体を遊離させるための化学的方法の具体例には、糖脂質の音波分解法（otsonolysis）、および糖タンパク質からオリゴ糖を遊離させるためのβ−脱離法（beta-elimination）またはヒドラジン分解法（hydrazinolysis method）が含まれる。その他の方法としては、糖脂質画分の単離が挙げられる。腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する結合性物質は、細胞表面上の該配列の分析に用いることもできる。該配列は、例えば、糖結合体あるいは遊離のおよび／または単離したオリゴ糖画分として検出することができる。種々の形態の該配列の分析に用いることができる方法としては、ＮＭＲ分光法、質量分析法およびグリコシダーゼ分解法が挙げられる。特に、特異性に限定のある方法を用いる場合には、少なくとも二種の分析法を用いることが好ましい。
【００４９】
本発明は、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を用いて、オリゴ糖構造を認識するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法に関し、以下の工程に従って該抗体を製造する：
１）本願で開示するオリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を多価の形態で含んでいる結合体を、化学的または生化学的に合成する。多価の結合体は、例えば、本願で開示する腫瘍特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖（ＯＳ）が、そのＣ１位の還元末端からスペーサー基（Ｙ）を介して、所望により単糖またはオリゴ糖残基（Ｘ）をさらに介して、オリゴ価または多価の担体（Ｚ）に原子（Ｌ）によって結合している、下記式で表される構造を形成する：
[OS-(X)n-L-Y]m-Z
（式中、
ｍは１より大きい整数であり、
ｎは各々独立に０または１であり、
ＯＳはヒト腫瘍特異的末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖であり、
Ｌは酸素原子、窒素原子、硫黄原子または炭素原子であり、
Ｘは単糖またはオリゴ糖残基、好ましくはラクトシル残基、ガラクトシル残基、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミニル残基、あるいはＯ−グリカンまたはＮ−グリカンオリゴ糖配列の一部であり、
Ｙはスペーサー基または末端結合体、例えばセラミド脂質部またはＺへの結合部であり、
Ｚはオリゴ価または多価の担体である。）；そして
２）免疫応答活性化物質と共に多価結合体で動物またはヒトを免疫する。
オリゴ糖配列は免疫応答活性化物質に多価の形態で結合していることが好ましく、結合体は単独、またはさらなる免疫応答活性化物質と共に免疫に用いる。好ましい態様においては、オリゴ糖結合体を、少なくとも一種のアジュバンド分子と共に抗体産生生物に注射または粘膜投与する。抗体産生のためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質、例えばＢＳＡ、スカシガイ（keyhole limpet）ヘモシアニン、リポペプチド、ペプチド、細菌の毒素、ペプチドグリカンまたは免疫活性多糖の一部、あるいは他の抗体産生活性化分子に多価の形態で結合する。当業界で知られている慣習的な抗体産生法で抗体を誘導するために、多価結合体をアジュバンド分子と共に動物に注射することができる。
【００５０】
抗体産生または予防接種は、腫瘍特異的オリゴ糖配列の類似体または誘導体によっても達成されうる。Ｎ−アセチル基を含むオリゴ糖配列の単純な類似体としては、修飾されたＮ−アセチル基、例えばＮ−プロパノイル基などのＮ−アルキル基を含む化合物が挙げられる。
【００５１】
GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcに結合する抗体の産生に用いることができる類似体としては、Hex(NAc)0-1α3Galβ4GlcNAcやHex(NAc)0β3Galβ4GlcNAc（式中、Hexはヘキソースであり、好ましくはGalまたはGlcである）などの配列が含まれる。類似体には、上記式中のGlcNAcが類似の異性体、例えばManNAcで置換された分子も含まれる。
【００５２】
本発明によると、抗体を血清、好ましくはヒトの血清から精製するために腫瘍特異的オリゴ糖配列を用いることができる。通常、ヒト血清には末端GlcNAc構造を認識する抗体が大量に存在する。末端Galα3Galβ4GlcNAc構造を認識する天然抗体のクラスも存在する。Galα抗原はヒトに天然には存在せず、天然抗体がin vitroの構造物であるGalNAcα3Galβ4GlcNAc、GalNAcβ3Galβ4GlcNAc および GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcにも結合することが近年示された（Teneberg et al., 1996）。Ｘ２−構造であるGalNAcβ3Galβ4GlcNAcは、ヒト組織に提示される正常な抗原であるが、GalNAcα3Galβ4GlcNAc構造および Galα3Galβ4GlcNAc構造はヒトの正常組織および癌組織からは見出されていない。このように、末端GlcNAc-構造が腫瘍抗原であるという本発明の知見は、天然抗体の実際の機能が癌の予防および末端GlcNAc-構造を有する腫瘍の破壊の両方である可能性を示した。腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体（例えば類似の異性体）は、血清、好ましくはヒトの血清、から抗体を精製するために固定することもできる。本発明は、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に強固に結合する天然のヒト抗体に関する。
【００５３】
腫瘍特異的オリゴ糖配列は、腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するヒト抗体の検出および／または定量、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やアフィニティークロマトグラフィーによる分析にも用いることができる。腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するヒト抗体の検出は、癌の診断、癌の治療剤の開発、特に本発明のオリゴ糖配列に対する癌ワクチンの開発、および大量の抗体またはある一種類の抗体を保持する血液提供者の探索を目的とすることが好ましい。
【００５４】
さらに、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体を、腫瘍や癌を破壊したり、その増殖能を低下させるために用いることができる。ヒト抗体は、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対する天然のヒト抗体の耐性を高めた類似体でもよい。このような類似体は、組換え遺伝子工学および／または生物工学によって製造することができ、ヒト抗体の断片または最適化した誘導体などが挙げられる。精製した天然の抗腫瘍抗体は予想されるいかなる副作用も生じることなくヒトに投与することができ、標準的な輸血の際にこのような抗体は移植されている。これは、腫瘍特異的構造が正常の組織または細胞に提示されておらず、且つ、血液型抗原とは異なり、個体差がないとした条件下では確実であり、末端GlcNAcを含む構造には血液型のような多様性は知られていない。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。特異的な人体適応抗体を遺伝子工学および生物工学で製造することも可能であり、人体に適応させた抗体の製造方法は、例えば米国特許第5,874,060号および第6,025,481号に記載されている。人体に適応させた抗体はヒト抗体の配列を模倣するように設計されるので、ヒトの患者に投与した際に、動物抗体のように免疫系によって拒絶されることはない。癌の増殖能を低下させたり癌を破壊するための方法は、固形腫瘍および広義の意味における癌細胞の両方に適用可能であることが知られている。いかなるヒト癌特異的抗原、好ましくはオリゴ糖からなる抗原を認識する精製した天然のヒト抗体を、腫瘍または癌の増殖能を低下させたりそれを破壊するために用いることが可能であることも知られている。他の一つの好ましい態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。
【００５５】
本発明によると、腫瘍特異的オリゴ糖配列に対するヒト抗体または人体に適応させた抗体、あるいは腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合する、生体に許容される他の物質は、腫瘍または癌細胞を毒性物質の標的とするために有用である。毒性物質としては、例えば細胞殺傷化学療法薬（cell killing chemotherapeutics medicine）（例えばドキソルビシン（Arap et al., 1998））、毒性タンパク質または放射線化学薬剤などの腫瘍の破壊に有効な物質が挙げられる。このような療法は、当業界では発表されており、特許にもなっている。毒性物質は、癌細胞または腫瘍にアポトーシスを起こさせたり、その分化を誘導したり、癌細胞または腫瘍に対する防御反応を増強したりすることもできる。本願の他の一つの態様においては、種特異的動物抗体を特定の動物の腫瘍または癌に対して用いる。本発明の癌結合性抗体または腫瘍結合性抗体は、例えば、いわゆる「ＡＤＥＰＴ−アプローチ」において、腫瘍に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを腫瘍または癌を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするために用いることもできる。
【００５６】
上記の治療用抗体は、癌または腫瘍の治療または予防を目的とした医薬組成物に用いることができる。本発明の治療方法は、患者が免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている時にも用いることもできる。
【００５７】
末端GlcNAc型（または好ましくはGlcNAcβ3/6Galβ4GlcNAc型）の、癌のまたは腫瘍のグリコシル化産物は、免疫不全状態、例えば、免疫不全を生じる疾病（ＡＩＤＳなど）や免疫抑制剤療法によって生じる免疫不全、に陥っている患者の腫瘍に広く見られる傾向がある。カポジ肉腫は、ＡＩＤＳおよび免疫不全に関連して広く見られる癌である。免疫抑制剤療法は、例えば、腎臓、心臓、肝臓または肺の移植の際の拒絶反応を抑制するために、臓器移植と共に実施する。このような療法を実施している間に現れる腫瘍は通常は良性であるが、貴重な移植臓器の損失をしばしば引き起こす。潜在的な天然の抗癌抗体の中には、以下の類似したエピトープを認識すると考えられるものもある：GalNAcβ3Galβ4GlcNAc、GalNAcα3Galβ4GlcNAc、そして Galα3Galβ4GlcNAc。第一の構造であるＸ2は、Ｐ血液型の希少な異型に属するヒトにより多く見られるものであり、このようなヒトは、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc構造を認識する抗体の量が少ない場合もある。腫瘍または癌に特異的な抗原に対する抗体の産生能は、免疫系に見られる個体差によって異なる場合がある。癌から生還したヒトは、特に多量の天然の抗癌抗体を保有している場合がある。
【００５８】
抗体を介した、腫瘍組織に対する免疫反応の考えられる例としては、腫瘍の大部分を切除した後に副腎腫から完全に回復した例が挙げられる。末端GlcNAcを有するオリゴ糖配列はこのような免疫反応の潜在的な標的である。
【００５９】
腫瘍に対する治療的ターゲティングを行うための他の方法
診断用物質の場合と同様に、癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いる物質としては、抗体、抗体断片や人体に適応させた抗体以外にも、多くの薬剤が利用可能であることが知られている。癌または腫瘍に対するターゲティングには、非免疫原性の許容される物質を用いることが特に好ましい。癌または腫瘍に結合するターゲティング物質の例には、癌または腫瘍を破壊または抑制する特異的な毒性、細胞溶解性または細胞調節性の薬剤も含まれる。癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いる非抗体分子は、本発明の癌特異的オリゴ糖配列または腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的に結合する分子を包含することが好ましく、このような結合性の分子（即ちオリゴ糖鎖結合性物質）としては、はアプタマー、レクチン、遺伝子工学的に作製したレクチン、末端GlcNAc-構造を認識する酵素（例えばグリコシダーゼやグリコシル基転移酵素）および遺伝子工学的に作製したそれらの異型が挙げられる。標識した細菌、ウイルスまたは細胞、あるいは重合体の表面であって、その構造を認識する分子を有するものも癌または腫瘍に対する治療的ターゲティングに用いることができる。本願で開示する癌結合性非抗体物質または腫瘍結合性非抗体物質は、癌または腫瘍を標的とする、癌または腫瘍に対して活性を示すプロドラッグ、あるいはプロドラッグを癌または腫瘍を破壊したり抑制する活性化毒性物質に変換する酵素または他の物質の標的とするためにも用いることもできる。
【００６０】
グリコシル基転移酵素による末端 GlcNAc を有する腫瘍抗原のターゲティング
本発明は特に、癌細胞または腫瘍に、修飾された単糖誘導体を転移させる新規な治療方法または診断方法に関する。本発明は、毒性物質、標識物質、薬剤または免疫学的に活性のある炭水化物と、転移酵素によって認識される受容体構造を有する、患者の病原性細胞の表面との間に共有結合を生じさせるための、以下の工程を包含する方法を開示する：
(i)毒性物質、標識物質、薬剤または免疫学的に活性のある炭水化物を、転移酵素の供与分子と結合させて結合体を得、そして
(ii)（ａ）得られた結合体および所望により転移酵素を腫瘍の治療のために患者に投与する、または
（ｂ）腫瘍の診断のために、得られた結合体を腫瘍試料に接触させて、結合体からなる標識を検出する。
【００６１】
グリコシル基転移酵素によって転移される単糖誘導体は、グリコシド結合したヌクレオチド残基も有する。単糖誘導体は、二位の修飾物（2-modified）、例えばＵＤＰ−ガラクトサミンのアミド誘導体が好ましい。治療または診断のための単糖誘導体としては、下記式で表されるものが好ましい：
UDP-GalN[-S]-D
（式中、
Ｓは所望により結合しているスペーサー基であり、
Ｄは誘導体化した基、例えば、ビオチンまたは蛍光性分子などの標識分子、あるいは他の癌や腫瘍のターゲティング法に関連して開示されている、毒性物質、プロドラッグまたはプロドラッグを遊離させる物質である。）
【００６２】
スペーサーは、修飾された単糖ヌクレオチドを転移酵素に結合させるのに十分な可とう性を有することが好ましい。
単糖誘導体は、ＵＤＰ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミンであることが好ましい。
使用する酵素は、二位修飾単糖を効果的に転移させるように工学的に改変したガラクトシルトランスフェラーゼを用いることが好ましい。また、例えば、動物から得た類似の特異性を有する天然のGalNAc/GlcNAc-転移酵素を用いることもできる。
本発明は、特に、UDP-GalN−スペーサー−ビオチンおよび修飾ガラクトシルトランスフェラーゼと共に組織をインキュベートすることによって、ビオチンで腫瘍組織を標識する方法に関する。
【００６３】
別の態様においては、本発明は下記の工程からなる診断方法に関する：
１．ガラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくはβ４−ガラクトシルトランスフェラーゼによって、放射性標識UDP-Galから放射性標識Galをヒト腫瘍組織に転移し；そして
２．組織に組み込まれた放射能を利用して、腫瘍上の末端GlcNAc残基を定量する。
【００６４】
ガラクトシルトランスフェラーゼを用いた標識方法は、本発明の全ての末端β−GlcNAc構造に有効である。
【００６５】
抗体、好ましくは動物から得た抗体の胃腸器系疾患関連分野および食品関連分野での用途
本発明は特に、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合する物質および抗体を用いた、患者、好ましくはヒトの患者、の胃腸器系疾患の治療方法に関する。ヒトの胃腸器系で用いる治療用の抗体は、動物によって産生された抗体、例えば家畜（具体的には家畜用反芻動物であるウシ、ヒツジ、ヤギまたはスイギュウなど）の乳に含まれる抗体や、鶏卵で産生した抗体でもよい。公知の方法に従って、動物を腫瘍特異的炭水化物結合体によって免疫することができる。本発明は、ヒトの胃腸器系の腫瘍の抑制または破壊に用いることができる、他の許容される物質、好ましくは食品として許容されるタンパク質にも関し、このような物質の具体例には、腫瘍特異的オリゴ糖配列に特異的な植物レクチンが含まれる。本発明は、胃腸器系に存在する本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を認識する抗体を含む機能性食品および食品添加剤に関し、さらに本発明は、食品として許容される他の物質（特に胃腸器系に存在する腫瘍特異的オリゴ糖配列に結合するレクチン）を用いた機能性食品または食品添加剤にも関する。
【００６６】
腫瘍特異的末端 GlcNAc に結合する結合性物質のスクリーニング
本発明は特に、腫瘍特異的末端GlcNAc-オリゴ糖配列を用いた、上記オリゴ糖配列からなる構造に特異的な結合性物質のスクリーニングに関する。スクリーニングは、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列に対する最適な結合性物質の検索を可能にする。特異的な結合性物質は、本明細書で開示した上記グリカンに結合する治療用や診断用の抗体または他の分子であってもよい。
【００６７】
本発明のオリゴ糖配列に結合する結合性物質のスクリーニングは、酵素免疫測定法（いわゆるＥＬＩＳＡ分析）によって行うことができる。直接的な結合は、例えば結合性物質か末端GlcNAc-グリカン構造のいずれかを固相マトリックスに結合することで定量することができる。
【００６８】
本発明の遊離オリゴ糖またはオリゴ糖結合体は、特異的な阻害剤としてアッセイ法にも用いることもできる。蛍光偏向の変化量（Fluoresence polararization difference）やＮＭＲは、本発明のオリゴ糖配列に結合する結合性物質を液相からスクリーニングするための手法の例である。
【００６９】
癌ワクチン
さらに、本発明によると、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体は、癌細胞または腫瘍細胞を抑制するか排除するための免疫応答を刺激するために、ヒトの癌ワクチンとして使用することができる。このような治療は必ずしも癌を根治するわけではないが、腫瘍による負担を軽減させたり、癌患者の病態を安定化し、癌の転移能も低下させることができる。ワクチンとして用いるためには、オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をタンパク質（例えばＢＳＡまたはスカシガイヘモシアニン）、脂質またはリポペプチド、細菌の毒素（例えばコレラ毒素または熱不安定毒素）、ペプチドグリカン、免疫活性多糖、あるいはワクチン分子に対する免疫反応を活性化する他の分子に結合させることができる。癌ワクチンは、医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドをさらに包含してもよい。適切な担体またはアジュバンドは、例えば免疫応答を刺激することが知られている脂質である。糖類あるいはその誘導体または類似体、好ましくは該糖類の結合体は、少なくとも一種の許容されるアジュバンド分子と共に癌患者に注射あるいは粘膜的（例えば経口的または経鼻的）に投与することができる。癌ワクチンは、癌または腫瘍に対する治療方法において薬剤として使用することができる。このような方法は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。また、この治療方法は、免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌または腫瘍の治療に用いることが好ましい。
【００７０】
さらに、腫瘍特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌や腫瘍を治療するための医薬組成物を製造することができる。医薬組成物は、ヒトの患者の治療に用いることが好ましい。免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者の癌または腫瘍の治療に医薬組成物を用いることが好ましい。上記の治療方法または医薬組成物は、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を発現していると診断された癌または腫瘍の治療に用いることが特に好ましい。治療方法または医薬組成物は、癌の治療のための他の治療方法または医薬組成物と共に用いることができる。好ましい他の治療方法や医薬組成物には、細胞成長抑止剤、抗血管形成薬、抗癌タンパク質（例えばインターフェロンまたはインターロイキン）または放射線療法が含まれる。
【００７１】
癌または腫瘍の診断および薬剤を癌または腫瘍に対してターゲティングするために抗体を用いる方法は、他の抗原やオリゴ糖構造と関連して開示されている（米国特許第4,851,511号、第4,904,596号、第5,874,060号、第6,025,481号、第5,795,961号、第4,725,557号、第5,059,520号、第5,171,667号、第5,173,292号、第6,090,789号、第5,708,163号、第5,902,725号および第6,203,999号）。癌特異的オリゴ糖を癌ワクチンとして用いることも、他のオリゴ糖配列に関連して開示されている（米国特許第5,102,663号、第5,660,834号、第5,747,048号、第5,229,289号および第6,083,929号）。
【００７２】
治療方法および診断方法の組み合わせ
本発明は特に、ヒトの腫瘍または癌に存在する異常なグリコシル化構造および正常なグリコシル化構造の分析、ならびにその分析結果を用いた、本発明の治療用抗体または癌ワクチンの製造方法に関する。本発明は特に、以下の工程を包含する癌の治療方法に関する：
１．患者の腫瘍組織または癌組織のグリコシル化産物を分析し、
２．一部が癌化した組織の正常なグリコシル化産物を分析し、そして
３．患者の癌に本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列が存在するが、正常組織の細胞表面には該腫瘍特異的オリゴ糖配列が提示されていないか、微量しか提示されていない場合に、本発明の治療方法を実施する。
【００７３】
腫瘍組織および正常な組織のグリコシル化には個体差があるので、本発明の腫瘍特異的構造の分析は、異常なグリコシル化構造と正常なグリコシル化構造とを組み合わせて分析することが有用であり、これは本願の実施例に示したデータによって明示される。腫瘍の近傍に位置する正常な組織は、腫瘍により分泌された物質で部分的に汚染されていることもあるので、正常な組織のデータを分析する際には考慮したほうがよい。
【００７４】
本発明の抗原性物質は、担体に結合することができる。オリゴ糖を一価または多価の担体に結合する方法は当業界では知られている。癌特異的オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体をその還元末端から担体分子に結合することが好ましい。担体分子を用いると、一つの担体に多数の本発明の抗原性物質分子を結合することができるので、免疫応答の刺激および抗体結合効率が増大する。最適な抗体産生を達成するためには、分子量が１０ｋＤａよりも大きい結合体で、一般的に１０個を超えるオリゴ糖配列を担持したものを用いることが好ましい。
【００７５】
本発明のオリゴ糖配列は、グリコシル基転移酵素によって酵素的に合成するか、あるいはグリコシダーゼまたはトランスグリコシダーゼによって触媒されるトランスグリコシル化反応で合成することができる（文献としてErnst et al., 2000を参照）。これらの酵素の特異性および補因子（例えば糖ヌクレオチド供与体）の必要性については改良することができる。修飾された特定の酵素を用いてより効率よく合成することもでき、例えば、グリコシル基転移反応を触媒するが、グリコシダーゼ反応は触媒しない酵素を得ることができる。本発明で開示する糖類および糖結合体またはそれらと類似した化合物の有機合成も知られている（Ernst et al., 2000）。炭水化物材料を天然の原料から単離して、化学的または酵素学的に修飾して本願で開示する化合物とすることができる。種々の反芻動物や他の動物の乳から天然のオリゴ糖を単離することができる。グリコシル化酵素を発現するトランスジェニックな生物、例えばウシや微生物も糖の製造に用いることができる。
【００７６】
本発明のオリゴ糖配列は、所望により担体と共に、患者の癌または腫瘍の治療に適当な医薬組成物に加えることができる。本発明によって治療することのできる病態の例としては、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を少なくとも一種発現している腫瘍からなる癌が挙げられる。治療可能な癌の症例は、患者から得た生物学的試料中に腫瘍特異的オリゴ糖配列の存在を検出することによって発見することができる。該試料としては、例えば生検材料または血液試料が挙げられる。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、他の物質、例えば不活性なベヒクルまたは医薬的に許容される担体や保存剤などの公知の物質を包含してもよい。
【００７８】
本発明の物質または医薬組成物は、適当な方法で投与すればよい。治療用抗体またはワクチンの投与方法は公知である。
【００７９】
本願において「治療」とは、疾患または病態を治癒または改善するための治療と、疾患または病態の発症を予防するための治療の両方を意味する。治療は急性的または慢性的に行うことができる。
【００８０】
本願において「患者」とは、本発明による治療を必要とするいかなる哺乳類も意味する。
腫瘍特異的オリゴ糖または本発明の腫瘍特異的オリゴ糖を特異的に認識する化合物を診断または型の同定に用いる場合、例えば、オリゴ糖または化合物はプローブやテストスティックに含まれていてもよく、所望により、テストキットの一部を構成してもよい。このようなプローブやテストスティックが、癌患者から得た抗体を包含する試料あるいは患者の癌細胞または癌組織と接触すると、癌陽性試料の成分はプローブまたはテストスティックに結合し、試料から取り出されてさらに分析される。
【００８１】
本願において「腫瘍」は、固形の多細胞腫瘍組織を意味する。さらに、本願において「腫瘍」は、前悪性状態の組織であって、固形腫瘍に分化し、腫瘍に特異的な特徴を有するものを意味する。本願において「腫瘍」という用語は、白血病のような単一細胞癌、培養した癌細胞、またはそのような細胞のクラスターを意味するものではない。本発明は特に、初期のヒト癌試料を対象とする。培養した癌細胞のグリコシル化反応は変化し、それは癌との関連性を通常は示さないことが知られている。さらにトランスフェクション、細胞培養用培地および単一細胞への固形腫瘍の分離はグリコシル化反応に劇的な影響を与える場合があることも知られている。治療においては、腫瘍特異的オリゴ糖または腫瘍特異的オリゴ糖配列（時に「癌特異的オリゴ糖／オリゴ糖配列」ということもできる）は全ての種類の癌および腫瘍の治療を目的としている。「癌」という用語は腫瘍も意味する。
【００８２】
本発明は特に、本発明の腫瘍特異的オリゴ糖配列を発現している全ての癌および腫瘍の治療に関する。好ましい癌の種類としては、喉頭癌、結腸癌、胃癌、卵巣癌および肺癌が挙げられる。特に本発明のＮ−グリカン型末端GlcNAcが関連する治療法および組成物は、このような種類の癌に対して好ましい。肺癌は、本発明のタンパク質結合GlcNAcに関連した治療法および組成物の好ましい標的である。Ｏ−グリカン型物質は、特に卵巣癌および粘液性癌（特に卵巣腺癌）に対する本発明の治療方法および組成物に用いることが好ましい。好ましい態様においては、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型末端GlcNAc-構造を副腎腫である癌の治療および診断に用いる。本発明は特に、本発明の末端GlcNAc-構造をその表面に発現しているいかなる種類の癌および腫瘍に対する本発明の治療の実施に関する。
【００８３】
糖脂質および炭水化物の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会の推奨する命名法（Carbohydr. Res. 1998, 322:167; Carbohydr. Res. 1997, 297:1; Eur. J. Biochem. 1998, 257:29）に従った。
【００８４】
Gal、Glc、GlcNAc および NeuNAcはＤ型であり、FucはＬ型であり、全ての単糖残基はピラノース環構造であるものとする。グルコサミンはGlcNと示し、ガラクトサミンはGalNと示す。グリコシド結合は略記で示す場合と正式名称で示す場合とあり、NeuNAc残基のα３およびα６結合はそれぞれα２−３およびα２−６結合と同じである。β１−３、β１−４およびβ１−６結合はそれぞれβ３、β４およびβ６と略すことができる。ラクトサミン、Ｎ−アセチルラクトサミンまたはGalβ3/4GlcNAcは、１型構造残基であるGalβ3GlcNAcおよび２型構造残基であるGalβ1-4GlcNAcのいずれかを示し、シアル酸はＮ−アセチルノイラミン酸またはNeuNAcであり、Lacはラクトースを示し、Cerはセラミドを示す。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
実施例１
細菌の培養および標識
GlcNAc認識GafDアドへシンを発現している、組換えＧ−フィンブリェ発現 Escherichia coli（G-fimbriated Escherichia coli）IHE11088（pRR-5）株（Rhen, M. et al., 1986）を、テトラサイクリン（２５μｇ／ｍｌ）および１０μｌの［35Ｓ］−メチオニン（４００ｍＣｉ；英国、リトルチャルフォント、Amersham Pharmacia Biotech社製）を含有するルリア培地中で３７℃で一晩培養した。細菌を遠心分離で回収してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で二回洗浄し、１×１０9ＣＦＵ／ｍｌになるようにＰＢＳに再懸濁した。比活性は約１００ＣＦＵ／ｃｐｍであった。
【００８６】
Erythrina cristagalli 由来レクチンの標識
Erythrina cristagalli由来のGalβ4GlcNAcβ−結合レクチン（Teneberg et al., 1994）をVector Laboratories社（カリフォルニア州、バーリンゲーム）から購入した。一つが１００μｇの複数のタンパク質標本を125Ｉで標識した。具体的には、Ｎａ125Ｉ（１００ｍＣｉ/ｍｌ；Amersham Pharmacia Biotech社製）とＩＯＤＯ−ＧＥＮ試薬（イリノイ州、ロックフォード、Pierce社製）を用いて、製造者のプロトコールに従って標識した。約５×１０3ｃｐｍ／μｇのタンパク質が得られた。
【００８７】
グリコスフィンゴ脂質結合アッセイ
薄層クロマトグラムで分離したグリコスフィンゴ脂質に対する、放射性標識した細菌およびレクチンの結合を、公知の方法（Teneberg et al., 1994; Hansson et al., 1985）に従って行った。グリコスフィンゴ脂質の薄層クロマトグラフィーは、アルミニウムで裏打ちしたシリカゲル６０ＨＰＴＬＣプレート（ドイツ国、ダルムシュタット、Merck社製）上で、クロロフォルム／メタノール／水（容量比は６０：３５：８）を溶媒系として行った。乾燥したクロマトグラムを、０．５％（ｗ／ｖ）ポリイソブチルメタクリレート（ウィスコンシン州、ミルウォーキー、Aldrich Chem. Comp. Inc.社製）を含有するジメチルエーテル／ｎ−ヘキサン（容量比は１：５）に１分間浸した。乾燥後、クロマトグラムを２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3を含有するＰＢＳに室温で２時間浸漬した。続いてクロマトグラムを、ＰＢＳで希釈した放射性標識細菌（２〜５×１０6ｃｐｍ／ｍｌ）または放射性標識レクチンのＢＳＡ溶液（２×１０3ｃｐｍ／ｍｌ）で被覆した。室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳで繰り返し洗浄した。その後クロマトグラムをXAR-5 Ｘ線フィルム（ニューヨーク州、ロチェスター、Eastman Kodak社製）に１２時間露光させた。
【００８８】
実施例２
末端 GlcNAc 構造の腫瘍特異性の説明
放射性標識したＧ−フィンブリェ発現 Escherichia coliを用いて薄層オーバーレイアッセイを行い、種々の腫瘍組織および正常な組織のスクリーニングを行った。E. coli IHE11088 (pRR-5) 株は、末端GlcNAcβ−構造を特異的に認識する（Rhen, M. et al. 1986）。結合活性のある糖脂質は、検討した四つの副腎腫である腫瘍の一つに由来する非酸性画分から検出された（図１）。ここで検討した、ヒトの正常な腎臓由来の非酸性グリコスフィンゴ脂質からなる対応画分や対照組織には、上記結合は見られなかった。
【００８９】
実施例３
ヒトの副腎腫由来の末端 GlcNAc β−構造の特徴づけ
ヒトの副腎腫である腫瘍に由来する非酸性グリコスフィンゴ脂質を分画し、薄層オーバーレイアッセイによってGlcNAcβ−特異的Ｇ−フィンブリェ発現 E. coli（図１Ａ）および末端Galβ4GlcNAcβ−構造を認識するErythrina cristagalli由来レクチン（図２Ｂ）のそれぞれによる結合を分析した。二種の結合試薬のそれぞれに結合するグリコスフィンゴ脂質種の一部は重複している。このデータは、末端GlcNAc−種の大部分がＮ−アセチルラクトサミン型非酸性グリコスフィンゴ脂質に存在することを示す。レクチン結合活性種とは重複しない末端GlcNAc−種においては、その末端構造は、Ｎ−アセチルラクトサミンをGlcNAc（例えばGlcNAcβ3Galβ3/4GlcNAcβ-）で誘導化したものである可能性が最も高く、拡散したバンドも、異性体であるGlcNAcβ6Galβ3/4GlcNAcβ-の存在を示すと考えられる。この試料には、一つの糖脂質に末端GlcNAcおよびＮ−アセチルラクトサミンの両方が存在する希少な種も含まれていると考えられる。これは分岐構造、例えばGalβ3/4GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ3/4GlcNAcβ-およびGlcNAcβ3(Galβ3/4GlcNAcβ6)Galβ3/4GlcNAcβ-の存在を示し、グリコスフィンゴ脂質のサイズ分布は、少なくとも二つの末端GlcNAcを有する脂質種の存在も示すと考えられる。Erythrina cristagalli由来レクチンの結合は、ほとんどのラクトサミンがおそらく２型Ｎ−アセチルラクトサミン構造であるGalβ4GlcNAcを含むことを示す。パーメチル化後の糖脂質をＦＡＢ質量分析法およびＥＩ質量分析法によって部分的に分析したところ、末端HexNAcの存在を示し、さらに末端GlcNAcを含むもっとも小さい脂質種が五糖グリコスフィンゴ脂質であり、おそらくはラクト系またはネオラクト系であることを示した。また、七量体およびより大きな十五量体までの構造も観察された（図１）。レクチンの結合は、ラクトサミンの大部分がおそらくは２型Ｎ−アセチルラクトサミン構造を有することを示す。
【００９０】
実施例４
タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法
ホルマリン固定化組織試料またはホルマリン固定化・パラフィン包埋組織試料からのグリカンの単離
ホルマリン固定化試料からグリカンを単離する前に、Manzi et al. (2000)の記載と実質的に同様のクロロホルム−メタノール抽出を行うことでタンパク質を濃縮した。糖タンパク質の定量的抽出は、放射性標識標準糖タンパク質によって確認した（データは示さない）。ホルマリン固定化・パラフィン包埋試料からグリカンを単離する前に、試料を脱パラフィン処理に付した。糖タンパク質試料から非還元的β脱離法でグリカンを分離し、クロマトグラフィーにより精製した。
【００９１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Voyager-DE STR BioSpectrometry Workstationを用い、Saarinen et al. (1999)、Papac et al. (1996)およびHarvey(1993)の記載と実質的に同様に行った。
【００９２】
エキソグリコシダーゼ消化
全てのエキソグリコシダーゼ反応をNyman et al. (1998)およびSaarinen et al. (1999)の記載と実質的に同様に行い、結果はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析した。使用した酵素とそれによって特徴付けられるオリゴ糖を用いた特異的な対照反応を以下に示す：β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、オリゴ糖中のGlcNAcβ1-6Gal-Rを消化したが、GalNAcβ1-4GlcNAcβ1-3/6Gal-Rは消化しなかった；β１，４−ガラクトシダーゼ（Streptococcus pneumoniae由来、E. coli組換え体；米国、Calbiochem社製）は、オリゴ糖中のGalβ1-4GlcNAc-Rを消化したが、Galβ1-3GlcNAc-Rは消化しなかった；α−マンノシダーゼ（ナタマメ由来；英国、Glyko社製）は高マンノースＮ−グリカン類からなる混合物をMan1GlcNAc2Ｎ−グリカンコア三糖に転換した。対照の消化反応も分析用のエキソグリコシダーゼ反応と並行して行い、その結果も同様に分析した。
【００９３】
UDP-GalN −ビオチンの合成
ＵＤＰ−ガラクトサミン（UDP-GalN）を、UDP-Glcおよびガラクトサミン−１−リン酸からガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（E.C. 2.7.7.12；米国、Sigma社製）の作用により合成する。典型的な合成プロトコールを以下に示す。反応混合物は、１０ｍＭのガラクトサミン−１−リン酸、２０ｍＭのUDP-Glc、５Ｕ／ｍｌのガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、１００ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する。反応容器を窒素雰囲気下、室温で３日間インキュベートし、その後、Maki et al. (2002)の記載と実質的に同様に、黒鉛化炭素のカラム（graphitised carbon column）を用いて糖ヌクレオチドを反応混合物から単離する。UDP-GlcおよびUDP-GalNを含有する糖ヌクレオチド混合物を、過剰モル量のスルフォスクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（sulfo-NHS-LC-ビオチン；米国、Pierce社製）を含む５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3中で、室温で２．５時間インキュベートする。生成物であるUDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）をゲルろ過および逆層ＨＰＬＣによって精製する。
【００９４】
UDP-GalN −ビオチンによる、オリゴ糖中および組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
RamakrishnanとQasba (2002)に記載の酵素に類似する組換えβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミンをUDP-GalN−ビオチンから末端GlcNAc含有受容体へ転換することができる。典型的な方法においては、オリゴ糖受容体（例えばGlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc）または脱パラフィンした、ホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を、１０ｍＭのUDP-GalN−ビオチン、１６０Ｕ／ｌの酵素、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび２０ｍＭのＭｎＣｌ2を含有する反応混合物と共に３７℃でインキュベートする。洗浄後、ストレプトアビジン結合試薬またはアビジン結合試薬、例えばストレプトアビジン−ＦＩＴＣ、を用いて、当業界では標準的な方法によってビオチン基を視覚化する。
【００９５】
UDP-[ 14 C]Gal による組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
ホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を脱パラフィンし、UDP-[14C]Gal、２００Ｕ／ｌのウシ乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（米国、Calbiochem社製）、５０ｍＭのＮａ−ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）および２０ｍＭのＭｎＣｌ2を含有する反応混合物中で３７℃でインキュベートした。洗浄後、標識した組織片をオートラジオグラフィーに付した。Nyman et al. (1998)の記載と実質的に同様の方法に従って、Chryseobacterium meningosepticum Ｎ−グリコシダーゼＦ（米国、Calbiochem社製）を用いて組織片からＮ−グリカンを分離した。クロマトグラフィーは、図７Ａおよび図７Ｂに関する「図面の簡単な説明」の欄に記載したように行った。
【００９６】
実施例５
肺腺癌試料由来の癌関連末端 GlcNAc 含有Ｎ−グリカン
腫瘍およびその周囲の健康な組織のホルマリン固定化試料を、肺腺癌の患者から調製した。腫瘍試料（図３Ａ）と健康組織の試料（図３Ｂ）のそれぞれから単離した中性Ｎ−グリカン、具体的には、m/z 1485.48に観測される、[Hex3HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1485.53）に対応するピークにおいて、有意な差が見られた。このグリカンのピークの相対強度は、健康な組織と比較して、腫瘍試料では６．１倍以上も増加した。さらに、m/z 1647.53に観測される、[Hex4HexNAc4Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1647.59）に対応するピークは、腫瘍組織においてはより高いシグナル強度を有していた。β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の際には（図３Ｃ）、２種のピークはそれぞれ、m/z 1079.18に観測される、[Hex3HexNAc2Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1079.38）に対応するピーク、およびm/z 1444.24に観測される、[Hex4HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1444.51）に対応するピーク、に完全に変化し、これは末端β−GlcNAc残基の存在を示す。ナタマメ由来α−マンノシダーゼ消化の際には（図３Ｄ）、これらのピークはそれぞれ、m/z 755.19に観測される、[Hex1HexNAc2Fuc1+Na]+ イオン（計算値：m/z 755.27）に対応するピーク、およびm/z 1282.29に観測される、[Hex3HexNAc3Fuc1+Na]+イオン（計算値：m/z 1282.45)に対応するピーク、にさらに変化した。しかしながらβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化の前にα−マンノシダーゼ消化を実施しても、２種のピークに影響を与えることはなく、これは、α−Man残基は末端β−GlcNAc残基に隣接して存在することを示している。さらに、もとの中性グリカン試料のβ１，４−ガラクトシダーゼ消化によって、m/z 1647.5に観測されるピークがm/z 1485.5に観測されるピークに変化したことは、末端Galβ1-4GlcNAc単位の存在を示す。これらの結果を全て考慮すると、肺腺癌腫瘍試料においては、周囲の健康な組織と比較して、複合Ｎ−結合グリカンコア構造であるGlcNAcβ-Manα1-6(GlcNAcβ-Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAcは非常に増量しており、該構造のモノ−β１，４−ガラクトシル化誘導体（GalがGlcNAcに結合している）はわずかに増量していることが示唆された。
【００９７】
実施例６
癌試料における末端 GlcNAc 含有Ｎ−グリカンの出現
種々の腫瘍および健康な対照試料における上記構造の出現は、中性グリカン画分の単離と分析をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳとエキソグリコシダーゼ消化行うことで検討した。検討した腫瘍−対照のペアは次の通りである：七種の肺癌試料のペアおよび各一種の結腸癌、胃癌および喉頭癌のペア。分析の結果、全てのペアにおいて、m/z 1485.5に観測される２つの末端GlcNAcを含有するＮ−グリカンの相対的な存在量が、癌試料では上昇することが判明した。しかしながら、健康な組織と癌化組織の両方において、このグリカンエピトープの発現レベルに有意な個体差が存在した。表１に、単離した中性グリカン画分について、m/z 1485.5に観測されるＮ−グリカンの特異的な発現量をまとめた。
【００９８】
実施例７
UDP-GalN −ビオチンの合成
ＵＤＰ−ガラクトサミンを、上記の「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように合成した。生成物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて特徴付けたところ（[C15H25N3O16P2-H]_イオンの実測値はm/z 564.42であり、計算値はm/z 564.31）（図４Ａ）、予想されたピークは、マススペクトルにおいて、UDP-Glcのピークよりも１質量単位小さい位置に現れた（[C15H24N2O17P2-H]_イオンの実測値はm/z 565.37であり、計算値はm/z 565.29）（図４Ａ）。粗糖ヌクレオチド調製物をビオチン化試薬、即ちスクシニミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートと反応させた。反応後、予想された生成物を反応混合物の質量分析スペクトルに観察することができた（[C31H50N6O19P2S-H]_イオンの実測値はm/z 902.93であり、計算値はm/z 903.76）（図４Ｂ）。UDP-Glcはビオチン化試薬とまったく反応しなかった。合成したUDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）を、GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc および RamakrishnanとQasba (2002)に記載の酵素と類似の組換えβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼと反応させた。生成物である［Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン］β1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて特徴づけた（[M+Na]+イオンの実測値はm/z 1433.38であり、計算値はm/z 1433.55）。これらの結果を全て考慮すると、合成した生成物は予想通りの構造を有することが判明した（図５）。生成物は、均質になるまでクロマトグラフィーで精製した。
【００９９】
実施例８
UDP-[ 14 C]Gal および UDP-GalN −ビオチンによる、組織片中の末端 GlcNAc 残基の標識
脱パラフィンしたホルマリン固定化・パラフィン包埋組織片を、UDP-[14C]Galおよびウシ乳β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いて、「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように放射性標識した。オートラジオグラフィーによって、腫瘍試料と健康組織の試料の間にはっきりとした差異が示され（図６）、肺腺癌試料においては、末端GlcNAc残基の量が非常に上昇していることが判明した。同様の結果は、「タンパク質結合構造の調製およびガラクトシルトランスフェラーゼによる標識のための材料と方法」の欄で記載したように、UDP-GalN−ビオチン試薬としてストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いた実験および蛍光顕微鏡観察からも得られた。重要なことは、癌細胞はこのビオチン化試薬で標識できることである。
【０１００】
実施例９
肺腺癌試料からの [ 14 C]Gal 標識オリゴ糖の単離
肺腺癌試料および周囲の健康な組織の組織片を上記のように[14C]Galで標識した後に、標識したオリゴ糖をＮ−グリコシダーゼＦ消化およびβ−脱離反応のそれぞれで単離した。Ｎ−グリコシダーゼＦで遊離された肺腺癌由来グリカンのゲルろ過クロマトグラム（図７Ａ）においては、１つのピークだけが見られ、それは標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6(Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc および Galβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]と共に溶出した。このピークをプールし、多孔性黒鉛化炭素のカラムを用いたＨＰＬＣに付したところ、１つの大きなピークと二つの小さなピークに分割された（図７Ｂ）。総放射能のほぼ全てを含む大きなピークは、標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]と共に溶出した。
【０１０１】
肺腺癌から非還元的β−脱離法により遊離させた材料のゲルろ過ＨＰＬＣクロマトグラム（図７Ｃ）においては、総放射能の４５％を含む幅広いピークが、移動相の容量（void volume）（８ｍｌ）と標準Ｎ−グリカンであるGalβ1-4[GlcNAcβ1-2Manα1-6(GlcNAcβ1-2Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc]の溶出時間との間で溶出した。この幅広いピークをプールし、強カチオン交換材料のカラムとＣ18シリカのカラムに通したところ、すべての糖ペプチド材料は保持されたが、遊離のオリゴ糖は定量的に溶出された。プールした画分中のほぼ８０％の放射能がカラムに保持され、これは幅広いピークは[14C]Gal標識グリカン部分が分離されていないアルカリ−遊離糖ペプチドと実際に対応することを示した。残りの放射能の大部分は、上記のＮ−グリカン構造に対応することが判明したが、他の標識オリゴ糖の存在を否定することはできなかった。総放射能の５５％を含むゲルろ過ＨＰＬＣクロマトグラムの大きなピークは、標準Ｎ−アセチルラクトサミン（LacNAc）と共に溶出した。
【０１０２】
実施例１０
癌試料由来のタンパク質結合 GlcNAc
さらに、１５〜１８分に溶出した画分をプールしたものを、黒鉛化炭素のカラムを用いたＨＰＬＣに付したところ、主要なピークがLacNAcと共に溶出した。これは、試料が塩基不安定GlcNAc単糖−タンパク質結合体（最も可能性が高いのはGlcNAcβ-O-Ser/Thr単位）を含有することを示唆している。重要なことには、肺腺癌試料における[14C]−標識LacNAcの存在量は、その周囲の健康組織の試料と比較した場合に、有意に（１．９９倍にも）増加していた。
【０１０３】
これらの結果をまとめると、UDP-[14C]Gal標識肺腺癌試料組織片から遊離することのできる総放射能の約半分は、[14C]Gal標識型の癌関連Ｎ−グリカン（即ち、GlcNAcβ-Manα1-6(GlcNAcβ-Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc）であることが判明した。さらに、UDP-GalN−ビオチン反応においても、標識は上記の記載で特徴付けられたオリゴ糖構造に転移されることが明らかである。
【０１０４】
実施例１１
ヒト血清からの抗 GlcNAc 抗体の単離
粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得たヒト血清を、エピトープであるGlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαまたはGalβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαを共有結合でカップリングさせたセファロースカラムに通した。カラムを洗浄した後、初めに０．５ＭのGlcNAcを含有する緩衝液で特異的に溶出させ、次に酸性緩衝液で非特異的に溶出させた。対照としては、健康な提供者、即ち悪性疾患の病歴のないヒト、からプールしたヒト血清から調製したＩｇＧ調製物も上記のカラムクロマトグラフィー工程に付した。回収した画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した（図８）。その結果、標準ＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の分子量に類似した分子量を有するタンパク質に対応する２つのバンドが、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムからの０．５ＭのGlcNAcによる特異的溶出で溶出したが、これは癌から生還したヒトから得た血清試料のみで見られた。対照的に、このような特異的な溶出は、二種の試料をGalβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムクロマトグラフィーにかけても検出できなかった。それらの相対的な分子量から、特異的に溶出したタンパク質はＩｇＧヒト抗体またはＩｇＡヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のサブユニットを表すが、ＩｇＭヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖のサブユニットは表さないと考えられる。上述の結果は、癌から生還したヒトの血清中には、上昇したレベルの末端GlcNAc特異的抗体、より具体的にはグリカンエピトープであるGlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαを認識するＩｇＧ抗体および／またはＩｇＡ抗体、が存在することを示す。
【０１０５】
【表１】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】GlcNAcβ−特異的E. coliの菌体をオーバーレイして結合させた、薄層オーバーレイアッセイ後のオートラジオグラムであり、末端GlcNAc残基を有するオリゴ糖配列の腫瘍特異性を表すものである：副腎腫である腫瘍に由来する非酸性グリコスフィンゴ脂質類（第一レーン）およびそれに対応する、正常な腎臓由来のグリコスフィンゴ脂質画分（第二レーン）。
【図２】Ａは［35Ｓ］で標識したGlcNAcβ−特異的E. coliを用いて薄層オーバーレイアッセイを行った結果であり、Ｂは［125Ｉ］で標識したGalβ4GlcNAcβ−特異的Erythrina cristagalli由来レクチンを用いて薄層オーバーレイアッセイを行った結果である。レーン１〜８：ヒト副腎腫由来の非酸性グリコスフィンゴ脂質の副画分、レーン９：参照用のグリコスフィンゴ脂質であるGlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer、レーン１０：参照用のグリコスフィンゴ脂質グロボシドであるGalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer。
【図３Ａ】肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｂ】健康な肺の試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｃ】S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化後の、肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図３Ｄ】S. pneumoniae β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ消化およびナタマメα−マンノシダーゼ消化後の、肺腺癌試料由来の中性グリカンの、リフレクター型の陽イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ａ】ＵＤＰ−ガラクトサミン合成反応後に精製した糖ヌクレオチドの、リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図４Ｂ】UDP-GalN−ビオチン合成反応後に精製した糖ヌクレオチドの、リニア型の陰イオンモードＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトル。
【図５】UDP-GalN−ビオチン（即ち、ウリジン５’−ジフォスフォ−Ｎ−（６−ビオチンアミドヘキサノイル）ガラクトサミン）の構造。
【図６】ａは[14C]Galで標識した肺腺癌切片のオートラジオグラムであり、ｂは健康な肺の組織片のオートラジオグラムである。
【図７Ａ】Ｎ−グリコシダーゼＦで消化した肺腺癌試料に由来する、[14C]Galで標識したオリゴ糖。グリカン類は、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3（ｐＨ約８．３）で膨潤させたSuperdex Peptide HR 10/30 カラム（スウェーデン国、Pharmacia社製）を用い、流速１ｍｌ／分の条件下でゲルろ過ＨＰＬＣに付した。各１ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。１２〜１５分に得た画分をプールした。
【図７Ｂ】Ｎ−グリコシダーゼＦで消化した肺腺癌試料に由来する、[14C]Galで標識したオリゴ糖。Superdex Peptideカラムを用いたゲルろ過ＨＰＬＣで回収した１２〜１５分に得た画分（図１０Ａ）を、１０ｍＭのＮＨ3溶液で膨潤させたHypercarb 5uカラム（4.6 x 250 mm）（米国、Thermo Hypersil社製）を用い、流速０．７ｍｌ／分、移動相のアセトニトリル濃度勾配が１００分間で０〜４０％まで直線的に増加する条件下でＨＰＬＣに付した。各０．７ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。
【図７Ｃ】肺腺癌試料から非還元的β−脱離法によって遊離した、[14C]Galで標識した標品。これを、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3で膨潤させたSuperdex Peptide HR 10/30カラム（スウェーデン国、Pharmacia社製）を用い、流速１ｍｌ／分の条件下でゲルろ過ＨＰＬＣに付した。各１ｍｌの画分を回収し、その放射能を測定した。８〜１５分に溶出した画分（プール１）のみならず、１５〜１８分に溶出した画分（プール２）もプールした。
【図８】クーマシーブルー染色した還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。矢じりはそれぞれＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖の位置を示す。Ａ：粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得た血清を、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。Ｂ：ヒト血清からプールしたＩｇＧを、GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。Ｃ：銀染色したゲル。粘液性卵巣腺癌から生還したヒトから得た血清を、Galβ1-4GlcNAcβ1-6(Galβ1-3)GalNAcαセファロースカラムにかけたもの。左のレーンは０．５ＭのGlcNAcで溶出したものであり、右のレーンは酸性緩衝液で溶出したものである。
Claims (30)
- 腫瘍特異的末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含むオリゴ糖配列の存在を生物学的試料中に検出することを特徴とする、生物学的試料を用いて癌を診断する方法。
- 以下の工程（ａ）または工程（ｂ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
（ａ）該生物学的試料を該オリゴ糖配列に結合する結合性物質と接触させ、そして
該オリゴ糖配列を介した該結合性物質と該生物学的試料との結合を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する、または
（ｂ）酵素学的または化学的方法によって該生物学的試料中のオリゴ糖構造を遊離させて、該生物学的試料から遊離したオリゴ糖構造を含む画分を生成し、そして
該画分中の該オリゴ糖配列の存在を指標として、該生物学的試料中の癌の存在を検出する。 - 該結合性物質が、下記式（Ｉ）で表される少なくとも一種のＮ−グリカン型構造の末端オリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN[β4(Fucα6)r3GN]r4]r5}r6 （Ｉ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ３、ｒ４、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（Ｉ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている。） - 該結合性物質が、下記式（ＩＩ）で表される少なくとも一種のＮ−グリカン型構造の末端オリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項３に記載の診断方法。
[GNβ2Man]r1α3([GNβ2Man]r2α6){Man[β4GN]r5}r6 （ＩＩ）
（式中、
ｒ１、ｒ２、ｒ５およびｒ６は各々独立に０または１の整数であるが、ｒ１とｒ２の少なくとも一方は１であり、
ＧＮはGlcNAcであるが、
但し、ｒ１とｒ２が共に１である場合には、下記 (i) 〜 (iv) からなる群より選ばれる少なくとも一種の変更を式（ＩＩ）に加えることができる：
(i) １つのGNβManが、１つまたは複数の他の単糖残基、例えばガラクトース、で伸長されている、 (ii) １つのGNβ2ManがManに縮められている、 (iii) Manα6残基およびManα3残基からなる群より選ばれる少なくとも一種がGNβ6またはGNβ4で置換されている、および (iv) Manβ4がGNβ4で置換されている。） - 該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項３に記載の診断方法。
GlcNAcβ2Man、GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Man、GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3(Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Man、Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
Manα3(GlcNAcβ2Manα6)Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Man、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、
GlcNAcβ2Manα3Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Man、
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAc、GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4GlcNAc、そして
GlcNAcβ2Manα6Manβ4GlcNAcβ4(Fucα6)GlcNAc 。 - 該結合性物質が、下記式（ＩＩＩ）で表される少なくとも一種のＯ−グリカン型構造の末端オリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
[GlcNAcβ3]s1[Galβ3]s2({[GlcNAcβ3]s3Galβ4}s4GlcNAcβ6)s5GalNAc（ＩＩＩ）
（式中、ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４およびｓ５は各々独立に０または１の整数であるが、式（ＩＩＩ）で表される末端オリゴ糖配列が少なくとも一種の非還元末端GlcNAcβ-残基を有するために、下記条件の少なくとも一種を満足する：ｓ１は１である；ｓ５、ｓ３およびｓ４は共に１である；そしてｓ５は１であるが、ｓ３とｓ４は１である。） - 該オリゴ糖配列が、タンパク質結合GlcNAcまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
- 該オリゴ糖配列が、下記式からなる群より選ばれるオリゴ糖配列であることを特徴とする、請求項６に記載の診断方法。
Galβ3(GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3(Galβ4GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ3Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ3Galβ3GalNAc、Galβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、
GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)GalNAc、GlcNAcβ6GalNAc、そして GlcNAcβ3GalNAc 。 - 該結合性物質が、下記式からなる群より選ばれる少なくとも一種の末端オリゴ糖配列に特異的であることを特徴とする、請求項２に記載の診断方法。
GlcNAcβ3Gal、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcβ6Gal、GlcNAcβ6Galβ4GlcNAc、
GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Gal、そして GlcNAcβ3(GlcNAcβ6)Galβ4GlcNAc 。 - 該結合性物質が、アプタマー、ペプチドまたはタンパク質であることを特徴とする、請求項２〜９のいずれかに記載の診断方法。
- 該タンパク質が、抗体、レクチンまたはそれらの断片であることを特徴とする、請求項１０に記載の診断方法。
- 請求項２〜１１のいずれかで定義されている結合性物質を包含する、癌または癌の型の診断に用いる診断剤。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列を、化学的または生化学的に合成した多価の形態で含んでいることを特徴とする、抗原性物質。
- 請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法。
- 請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、血清、好ましくはヒトの血清から抗体を精製する方法。
- 請求項１３の抗原性物質あるいはその類似体または誘導体を用いて、抗体の検出および定量のいずれかまたは両方を行う方法。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に結合する結合性物質を包含する、癌治療用医薬組成物。
- 該結合性物質が抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列あるいはその類似体または誘導体を含むオリゴ糖鎖を包含する、癌治療用医薬組成物。
- 医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含することを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列を含む少なくとも一種のオリゴ糖鎖に結合する結合性物質を、癌細胞の転移能または増殖能を低下させるか、腫瘍または癌を排除するためにヒトまたは動物の患者に投与することを特徴とする治療方法。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に対する抗体を、結合性物質として用いる癌の治療方法。
- 該抗体が、ヒト抗体または人体に適応させた抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の癌の治療方法。
- 該抗体は、血清から精製されたものであることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の癌の治療方法。
- 該抗体によって、毒性物質が腫瘍または癌をその標的とすることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれかに記載の癌の治療方法。
- 免疫抑制剤療法を受けているか、免疫不全に陥っている患者を治療するための、請求項２１〜２５のいずれかに記載の治療方法。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖あるいはその類似体または誘導体を包含する、癌ワクチン。
- 医薬的に許容される担体および所望によりアジュバンドを更に包含することを特徴とする、請求項２７に記載の癌ワクチン。
- 請求項２で定義されている末端オリゴ糖配列を含むオリゴ糖鎖に結合する物質であって、アプタマー、人体に適応させた抗体またはペプチドであることを特徴とする、オリゴ糖鎖結合性物質。
- 請求項２〜９のいずれかで定義されているオリゴ糖配列と化合物を接触させる工程、および
該化合物と該オリゴ糖配列との結合の有無を検出する工程
を包含する、癌または腫瘍に特異的な治療剤または診断剤を検出する方法。
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