JP2579497B2 - 肝臓疾患診断剤 - Google Patents

肝臓疾患診断剤

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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の属する技術分野） 本発明は肝臓疾患診断剤に関するものである。
更に詳細には、本発明は体液中のUDP-N-acetylglucos
amine:glycoprotein N-acetylglucosaminyltransferase
（ウリジンジホスフェート−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン：グリコプロテイン Ｎ−アセチルグルコサミニルト
ランスフェラーゼ、以下において、Gn−Ｔ−IIIという
こともある）の量の増加を測定することによって肝臓癌
その他肝臓疾患の診断を行うために使用する肝臓疾患診
断剤に関するものである。
本発明は、体液中（例えば血清、だ液、尿等）のGn−
Ｔ−IIIの量の増加の測定によって、より簡便に肝癌
（肝硬変）等の肝臓疾患を診断することができるため、
医療界、診断界に益するところ大なるものがある。
（従来の技術及び発明が解決しようとする課題） 一般に、肝機能検査としては、GOT、GPT、LDH、ChEな
ど多くの検査事項があり、これらについて適宜検査さ
れ、肝機能の診断が行なわれている。
しかし、これらの検査事項は、あくまでも肝機能の程
度を比較して検知する程度のものであって、肝疾患、特
に肝癌の診断が直接できるというものではなかった。
更に、肝癌の診断をする場合は、AEP、CEA等の腫瘍マ
ーカーの測定も必要であり、また、行なわれるようにも
なってきた。
しかしながら、従来の腫瘍マーカーでの陽性率はせい
ぜい60％であり、かつ、早期に診断することは不可能に
近かった。
また、最近、新しい腫瘍マーカー（特に肝癌）として
γ−グルタミルトランスペプチダーゼが注目されて来
た。これは、肝癌患者が、正常人のものと比べて、糖鎖
構造の異なる糖蛋白質を血中に出現させることが知られ
たことによるものである。
しかし、このγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
は、AFP、CEA等よりもすぐれた腫瘍マーカーとはなって
ない。
また、肝臓癌以外の肝臓疾患についても、これを簡便
且つ正確に診断するための理想的な診断剤は開発されて
おらず、ましてや各種肝臓疾患の種類までも特定できる
診断システムは理想上のものとさえいわれている。
（課題を解決するための手段） 本発明は、このような技術の現状に鑑みてなされたも
のであって、本発明者らは、肝癌患者における糖鎖構造
の変化を詳細に研究したところ、アスパラギン結合型糖
鎖のトリマンノシルコア部分のβ−1,4結合したマンノ
ースにＮ−アセチルグルコサミンがβ−1,4結合で結合
したものであるとの新知見を得た。そこで本発明者ら
は、このＮ−アセチルグルコサミンを転移結合させる酵
素のGn−Ｔ−IIIの量が増加するのではないかと考え、
鋭意研究した結果、肝臓疾患、特に肝臓の患者の血清中
に、正常人の血清中と比較して、Gn−Ｔ−IIIが有意に
高い活性を示すという有用な知見を新たに得た。また、
体液中のGn−Ｔ−IIIを簡便に且つ正確に測定するのに
適した方法も見出し、本発明を完成するに至った。
更にまた、研究を続けた結果、本発明者らは、Gn−Ｔ
−IIIに関し、一般正常人の血清中に、Gn−Ｔ−III活性
は、2.0±0.5nmol/ml/h程度のごく微量含まれているも
のであるが、肝臓癌疾患者の血清中には約２〜３倍量の
Gn−Ｔ−III活性が含まれ、肝硬変の患者の血清中に
は、約1.5倍量のGn−Ｔ−IIIが含まれ、更に慢性肝炎の
患者の血清中には約1.2倍量のGn−Ｔ−IIIが含まれてい
るとの知見も得、ここにGn−Ｔ−IIIの量を測定するこ
とによって、肝臓癌以外の肝臓疾患も診断できること、
しかも肝臓疾患の種類までも特定できるという有用な知
見をはじめて得たものである。
たしかに、生化学会第60回大会予稿集634頁に、Gn−
Ｔ−IIIの活性測定にＮ−acetylglucosamineをGnGn糖鎖
に転移させ、得られた生成物を高速液体クロマトグラフ
ィーによって測定することが示されてはいるが、この方
法を肝臓癌その他の肝臓疾患の診断に用いることは全く
知られていない。ましてや、測定を阻害する物質が多量
に含まれているサンプルである各種体液から目的とする
酵素のみを、しかもごく微量しか含まれていない酵素の
みを正確に測定できることなど、従来全く知られていな
いことである。
本発明は、これらの有用新知見に基づき、更に検討の
結果なされたものであって、体液中のGn−Ｔ−IIIを測
定することを基本的メカニズムとする肝臓疾患の診断剤
に関するものである。
（発明の実施の形態） 本発明において、Gn−Ｔ−IIIの量を測定するには、G
n−Ｔ−IIIをウリジンジホスホ Ｎ−アセチルグルコサ
ミン（uridine diphospho N-acetylglucosamine、以
下、UDP-GlcNAcということもある）に作用させてＮ−ア
セチルグルコサミン（N-acetylglucosamine）をGnGn糖
鎖に転移させ、得られた生成物を高速液体クロマトグラ
フィーにかけて検出するのがよい。この場合、GnGn糖鎖
に蛍光標識をつけておき、得られた生成物を高速液体ク
ロマトグラフィーにかければ、クロマトグラムの蛍光強
度をみて容易に検出することができる。
本発明で用いるGnGn糖鎖を、まず、ヒトトランスフェ
リンより得る。得られた糖鎖を長谷らの方法（Hase,S.e
t al,Journal of Biochemistry 1984,197-203）によっ
てピリジルアミノ化（蛍光標識）したGnGn糖鎖（式
（Ｉ）に示される）を調製する。
次いで、このGnGn糖鎖にβ−ガラクトシダーゼを作用
させて式（II）で示されるピリジルアミノ化したGnGn糖
鎖を調製する。
本発明においては式（II）の化合物の２−アミノピリ
ジン（蛍光物質）を除いた部分をGnGn糖鎖といい、ま
た、このGnGn糖鎖の１位のGlcNAcにフコースが結合した
ものも含まれる。
本発明におけるGn−Ｔ−IIIの反応式は次の式（III）
に示される。
ここに得られた反応生成物を高速液体クロマトグラフ
ィーにかけて、蛍光強度によるクロマトグラムを作成
し、反応生成物の量によって、Gn−Ｔ−IIIの酵素活性
を測定するものである。
したがって、本発明に係る肝臓疾患診断剤は、下記の
式で示される標識したGnGn糖類及びウリジンジホスホ−
Ｎ−アセチルグルコサミン（UDP-GlcNAc）を含有してな
り、体液中のUDP-GlcNAc:グリコプロテイン Ｎ−アセ
チルグルコサミニルトランスフェラーゼを測定すること
によって肝臓疾患の診断を行うようにしてなること、を
特徴とするものである。
本発明に係る肝臓疾患診断剤は、上記したGnGn糖類及
びUDP-GlcNAcを含有するほか、必要に応じて、緩衝剤そ
の他酵素反応に必要な薬剤を含有せしめてもよい。更に
また、反応を停止するための薬剤をセットにすることも
可能である。
また、Gn−Ｔ−IIIの量は酵素活性の測定以外にも、
抗原抗体反応などによっても測定することができる。
（発明の効果） 本発明においては、肝臓疾患で血清中のGn−Ｔ−III
の活性が増加することを確認し、そのGn−Ｔ−IIIの活
性をUDP-GlcNAcに作用させてN-acetylglucosamineをGnG
n糖鎖に転移させて、得られた生成物を高速液体クロマ
トグラフィーで容易に測定できたものである。
本発明は肝臓等の肝臓疾患を簡便に且つ正確に診断で
きる効果を有するものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 （試薬） 250mM MES（2-（N-morpholino）ethane sulfonic a
cid monohydrate） （pH＝6.25） 400mM GlcNAc（N-acetyl glucosamine） 20mM MnCl2 40mM UDP-GlcNAc 1.0％ Triton X-100 150μＭ GnGn−糖類（蛍光標識） 上記試薬50μｌづつ入れた容器50ケに、原発性肝癌患
者の血清、肝硬変患者の血清、慢性肝炎患者の血清、脂
肪肝の患者の血清、正常人の血清をそれぞれ10検体づつ
を50μｌづつ加え、37℃で１時間インキュベートした
後、それぞれに20μｌの0.2M EDTA、0.1Mナトリウムボ
レート溶液を加えて反応を停止した。
各反応液の１μｌを高速液体クロマトグラフィーにか
けて、蛍光強度によるクロマトグラムを作成し、それぞ
れのGn−Ｔ−IIIの比活性を測定した。
その結果は次の表１に示される。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の式で示される標識したGnGn糖類及び
    ウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（UDP-Gl
    cNAc）を含有してなり、体液中のUDP-GlcNAc:グリコプ
    ロテイン Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラ
    ーゼを測定することによって肝臓疾患の診断を行うよう
    にしてなること、を特徴とする肝臓疾患診断剤。
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