DE3853582T2 - Verfahren zur diagnose von leberkrebs oder leberzirrhose. - Google Patents
Verfahren zur diagnose von leberkrebs oder leberzirrhose.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Diagnostizieren krebsartiger Erkrankungen der Leber, basierend auf der Zunahme der Menge an UDP-N-Acetyl-glucosamin : Glycoprotein-N-acetylglucosaminyltransferase (nachstehend abgekürzt als Gn-T-III) im Serum.
- Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die einfache Diagnose von Leberkrebs (Leberzirrhose) durch Messung der Zunahme in der Menge an Gn-T-III im Serum; daher ist es von großem Vorteil im medizinischen und im diagnostischen Bereich.
- GOT, GPT, LDH, CHE und viele andere Testsubstanzen sind im Gebrauch für allgemeine diagnostische Zwecke bei Leber funktionen.
- Diese Testsubstanzen sollen jedoch nicht mehr herbeiführen als vergleichsweise den Grad der Leber funktionen zu prüfen; deren Zweckbestirnmung ist weit entfernt von direkter Diagnose der Lebererkrankungen, insbesondere des Leberkrebses.
- Die Messung von Tumormarkierungssubstanzen, z. B. AFP und CEA, ist ebenfalls bekannt als brauchbar für die Diagnose von Leberkrebs und ist bereits in der Praxis umgesetzt worden.
- Jedoch zeigen diese üblichen Tumormarkierungssubstanzen eine Positivitätsrate höchstens von 60%; das macht eine frühe Diagnose fast unmöglich.
- Die vorstehenden Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:
- GOT: Glutamin-oxalessigsäure-Transaminase;
- GPT: Glutamin-pyruvin-Transaminase;
- LDH: Lactat-Dehydrogenase;
- CHE: Cholesterinester;
- AFP: ein Fetoprotein;
- CEA: krebsembryonisches Antigen.
- In "Cancer Research", Band 39, Juni 1979, Seiten 1943 - 1951 wird berichtet über Glycosyltransferase- und Glycosidase-Aktivitäten bei Cvarialkrebs-Patienten, um den Mechanismus des Erscheinens von abnormen Glycoproteinen im Krebs zu erklären; so wurden die Aktivitäten von Glycoprotein-Glycosyltransferasen und Glycosidasen untersucht in den Homogenaten, präpariert aus normalen Eierstöcken und aus Epitheladenokarzinomen des Eierstocks. Bemerkenswert hohe Aktivitäten dieser Enzyme sind in einigen Fällen beobachtet worden ebenso wie wesentlich erhöhte Aktivitäten oberhalb normaler Kontrollen unter diesen Glycosidasen; es wird berichtet, daß der Anteil von N-Acetylglucosaminyl-Transferasen im Serum von 80 bis 90% der Patienten, die bekannterweise an Eierstockkrebs leiden, angehoben wird. Generell wurde die Aktivität von GlcNAC-Transferase unter Verwendung von zwei Substraten gemessen. Die Substrate haben keine homogenen Strukturen. Die Strukturen der Substrate sind unbestimmt; dasselbe betrifft die Struktur einer Verbindung, die durch diese Reaktion erzeugt wird. Weiterhin ist die Bezeichnung GlcNAc-Transferase ein Gattungsbegriff unter Einschluß einer Mehrzahl von unterschiedlichen Enzymen, da mehrere Arten von GlcNAc-Transferase im lebenden Körper bekannt sind.
- Neuerdings hat γ-Glutamyltranspeptidase Aufmerksamkeit erhalten als neue Tumormarkierungssubstanz, insbesondere für Leberkrebs, wegen der Tatsache, daß das Blut von Patienten mit Leberkrebs Glycoproteine enthält, die eine differierende Zuckerkettenstruktur im Vergleich zum Normalfall tragen. Jedoch sind die Resultate mit dieser γ-Glutamyltranspeptidase nicht besser als diejenigen mit AFP, CRA und anderen Substanzen bei der Tumormarkierung.
- Es können keine Rückschlüsse gezogen werden aus diesen beiden vorstehend genannten Literaturberichten mit Bezug auf die Diagnose von Leberkrebs, i.e. ein Problem, worauf die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ausgerichtet ist.
- Nach der Erfindung wird diese Aufgabe gelöst durch das anspruchsgemäße Verfahren, nämlich ein Verfahren zum Diagnostizieren von Leberzirrhose oder Leberkrebs, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
- (a) eine Fluoreszenz-markierte GnGn-Zuckerkette und UDP-GlcNAc werden zu einer Serumprobe gegeben zur Reaktion mit UDP-N-Acetylglucosamin : Glycoprotein- N-acetylglucosaminyltransferase III (Gn-T-III) in der Serumprobe zur Erzeugung der folgenden Verbindung:
- (b) die resultierende Reaktionslösung, worin die Verbindung enthalten ist, wird einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen; und
- (c) die Zunahme im Grad der Gn-T-III-Aktivität wird geprüft.
- Detaillierte Untersuchungen zum Wechsel in der Zuckerkettenstruktur bei Patienten mit Leberkrebs haben gezeigt, daß N-Acetylglucosamin über die β-1,4-Bindung gebunden ist an Mannose (β-1,4-Bindung), gebunden an das Trimannosylgerüst der Zuckerkette eines Asparagin- Bindungstyps. Weitere Untersuchungen haben zu der Annahme geführt, daß dieser Wechsel begleitet sein könnte durch die Zunahme in der Menge von Gn-T-III, d.h. ein Enzym, das in der Lage ist, dieses N-Acetylglucosamin zu übertragen. Als Resultat davon hat sich ergeben, daß die Serumflüssigkeiten von Patienten, die an Leberzirrhose oder Leberkrebs leiden, eine bedeutend höhere Gn-T-III-Aktivität im Vergleich zum Normalfall zeigen. Eine einfache Methode zum Messen der Menge dieses Enzyms wird durch die vorliegende Erfindung gewährleistet.
- Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, daß die Serumflüssigkeiten in Normal fällen im allgemeinen eine Gn-T-III-Aktivität in einer niedrigen Höhe von etwa 2,0 ± 0,5 nMol/ml/h zeigen, während die Serumflüssigkeiten von Patienten mit Leberkrebs etwa das zwei- bis dreifache der Aktivität, die Serumflüssigkeiten von Patienten mit Leberzirrhose etwa das 1,5fache und die Serumflüssigkeiten von Patienten mit chronischer Hepatitis das 1,2fache zeigen.
- Auf Seite 634 der "Preliminary Notes for the 60th Meeting of Japanese Biochemical Society" wird eine Methode zum Messen von Gn-T-III-Aktivität beschrieben, wonach N-Acetylglucosamin auf eine GnGn-Zuckerkette übertragen wird und das so gebildete Produkt durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen wird. Jedoch ist überhaupt nichts davon bekannt, diese Methode einzusetzen für die Diagnose von Krebserkrankungen.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Menge Gn-T-III vorzugsweise dadurch gemessen bzw. bestimmt, daß man diese Substanz auf Uridindiphospho-N-acetylglucosamin (nachstehend abgekürzt als UDP-GlcNAc) einwirken läßt und N-Acetylglucosamin überträgt auf die GnGn-Zuckerkette. So wird das hier gebildete Produkt bestimmt durch Hochleistungsflüssigchromatographie. Wenn in diesem Fall die Gngn-Zuckerkette zuvor fluoreszenzmarkiert ist, kann das Produkt leicht bestimmt werden durch Uberwachen der Fluoreszenzintensität. Die bei der Erfindung eingesetzte GnGn-Zuckerkette wird aus menschlichem Transferrin isoliert und dann pyridylaminiert (Fluoreszenzmarkierung) nach der Methode von Hase et al. (S. Hase et al., Journal of Biochemistry, 1984, 197 - 203), wie die nachstehende Formel (I) veranschaulicht:
- β-Galactosidase läßt man dann auf diese Zuckerkette einwirken, wobei sich die pyridylaminierte Gngn-Zuckerkette gemäß Formel (II) ergibt:
- Hierbei bedeutet die Gngn-Zuckerkette den Teil der Verbindung (II), von dem 2-Aminopyridin (Fluoreszenzsubstanz) entfernt ist; ebenfalls eingeschlossen ist ein Derivat davon, worin Fucose an die 1-Position (GlcNAc) gebunden ist.
- Die Reaktion von Gn-T-III bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die nachfolgende Gleichung (III) veranschaulicht: Fluoreszenzmarkierte Gngn-Zuckerkette
- Das Reaktionsgemisch wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen, und die Menge an Reaktionsprodukt wurde aus der Fluoreszenzintensität bestimmt, wodurch die Enzymaktivität von Gn-T-III gemessen bzw. ermittelt wurde.
- Die Menge an Gn-T-III kann ebenfalls nach anderen Methoden gemessen werden, z. B. durch die Antigen- Antikörper-Reaktion.
- Wirkungen, wie sie durch die Erfindung erzielt werden:
- Es ist gezeigt worden, daß Lebererkrankungen die Gn-T-III-Aktivität im Serum erhöhen und daß diese Enzymaktivität leicht gemessen bzw. ermittelt werden kann, indem man es auf UDP-GlcNAc einwirken läßt zur übertragung von N-Acetylglucosamin auf die GnGn-Zuckerkette, woraufhin die Menge an Reaktionsprodukt durch Hochleistungsflüssigchromatographie bestimmt wird. Somit bietet die Erfindung eine einfache Methode zum Diagnostizieren von Leberkrebs, wenn man die beschriebenen Stufen anwendet.
- Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel näher erläutert:
- 250 mM MES (2-(N-Morpholin)ethansulfonsäuremonohydrat) (pH 6,25)
- 400 mM GlcNAC (N-Acetylglucosamin)
- 20 mM MnCl&sub2;
- 40 mM UDP-GlcNAc
- 1,0% Triton X-100
- 150 uM GnGn-Zuckerkette (fluoreszenzmarkiert)
- In 50 Behälter, die jeweils 50 ul von dem vorstehend genannten Reagenz enthalten, wurden jeweils 50 ul von Serumflüssigkeiten gegeben, wie sie von Patienten mit primärem Leberkrebs, Patienten mit Leberzirrhose, Patienten mit chronischer Hepatitis, Patienten mit Fettleber und von normalen Personen (jeweils 10 Fälle) entnommen worden waren; die Mischungen wurden bebrütet bei 37ºC für eine Stunde; und die Reaktion wurde beendet durch Zugabe von jeweils 20 ul einer Lösung, enthaltend 0,2 M EDTA und 0,1 M Natriumborat.
- Jedes der Reaktionsgemische (1 ul) wurde einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen; es wurden Fluoreszenzintensitätschromatogramme hergestellt; und die Gn-T-III-Relativaktivität wurde für jeden Fall bestimmt.
- Die Resultate sind aus der nachstehenden Tabelle I ersichtlich: Tabelle 1 Gn-T-III-Relativaktivität Serum von Patienten mit primärem Leberkrebs Serum von Patienten mit Leberz irrhose Serum von Patienten mit chronischer Hepatitis Serum von Patienten mit Fettleber Serum von normalen Personen
Claims (1)
- Verfahren zum Diagnostizieren von Leberzirrhose oder Leberkrebs, gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:(a) eine Fluoreszenz-markierte GnGn-Zuckerkette und UDP-GlcNAc werden zu einer Serumprobe gegeben zur Reaktion mit UDP-N-Acetylglucosamin : Glycoprotein- N-acetylglucosaminyltransferase III (Gn-T-III) in der Serumprobe zur Erzeugung der folgenden Verbindung:(b) die resultierende Reaktionslösung, worin die Verbindung enthalten ist, wird einer Hochleistungsflüssigchromatographie unterworfen; und(c) die Zunahme im Grad der Gn-T-III-Aktivität wird geprüft.
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