DE3689240T2

DE3689240T2 - Verfahren zum Stabilisieren von Prostatspezifisch-Antigen in natürlichen Matrizen.

Info

Publication number: DE3689240T2
Application number: DE86302130T
Authority: DE
Inventors: Tina Susan Berger; Linda Patricia Ivor
Original assignee: Hybritech Inc
Current assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1985-03-29
Filing date: 1986-03-21
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2006-03-22
Also published as: EP0196845A3; IE62580B1; FI87021C; ES553482A0; FI861321A; JPS61274263A; DK165466B; FI87021B; JP2547318B2; FI861321A0; DK134686A; AU5482486A; ATE96910T1; EP0196845A2; NO168444B; EP0196845B1; ES557633A0; NO861116L; DK134686D0; IE860696L

Description

Die Erfindung betrifft die Bestimmung und Quantifizierung antigener Substanzen in Fluiden, wie z. B. Serum. Insbesondere betrifft sie Verfahren zur Herstellung stabiler natürlicher Matrices zur Verwendung in Immunoassays für prostatspezifisches Antigen.
Prostatspezifisches Antigen (PSA), ein gut charakterisiertes mit Tumoren associertes Antigen, ist ein wichtiger diagnostischer und prognostizierender Marker in menschlichem Prostata-Carcinom. Wenn Prostata-Tumorzellen PSA in den Blutstrom freisetzen, stehen die PSA-Konzentrationen im Serum und anderen Körperflüssigkeiten in Korrelation mit dem Fortschreiten primärer oder metastatischer Carcinome. Die Quantifizierung von PSA in Patientenproben verschafft dem Kliniker deshalb ein wirksames Mittel, um einen Therapieplan zu verfolgen und um die Remission oder Progression des Krankheitszustandes einzuschätzen.
Gegenwärtige Immunoassays zur Messung von PSA in flüssigen Patientenproben, wie z. B. der immunoradiometrische Assay (IRMA) und der enzym-linked immunosorbent assay (ELISA), beruhen auf der Verwendung künstlicher oder synthetischer Matrices wie z. B. von Rinderserumalbumin, als Kalibrator- Matrices und als Verdünner. Der hier verwendete Ausdruck "Kalibrator-Matrix" bezieht sich auf eine Matrix, in der bestimmte Konzentrationen an antigener Substanz zur Kalibrierung unbekannter Konzentrationen der antigenen Substanz in Patientenproben vorhanden sind. Der hier verwendete Ausdruck "Verdünner" bezieht sich auf eine Matrix zur Verdünnung von Patientenproben mit Konzentrationen an antigener Substanz, die den Bereich des Immunoassays übersteigen, wodurch die Messung der antigenen Substanz innerhalb des Immunoassaybereichs möglich wird.
Diese Matrices werden verwendet, weil unmodifizierte natürliche Matrices, wie z. B. Matrices auf der Basis von Serum, aufgrund der Instabilität von PSA bei der Einführung in solche Matrices als für die Verwendung ungeeignet angesehen werden. Spezifisch wurde gezeigt, daß nach Einführung in unmodifizierte Matrices auf der Basis von menschlichem Serum innerhalb von 24 Stunden ein 30 bis 70%iger Verlust der PSA- Aktivität auftritt. Dieser sich ergebende Verlust an meßbarem PSA ist außerdem nicht auf menschliches Serum beschränkt, da PSA ebenfalls bei der Einführung in Matrices auf der Basis von Rinder- und Pferdeserum nicht stabil ist.
Aufgrund der Verschiedenheit von Komponenten solcher Matrices gegenüber Probenkomponenten können die kinetischen Muster und nicht-spezifischen Bindungseigenschaften künstlicher Matrices beträchtlich vom Serum oder anderen Körperflüssigkeiten abweichen, die PSA enthalten, oder bei denen vermutet wird, daß sie PSA enthalten. Als Ergebnis stellt die Verwendung dieser Matrices eine inherente beträchtliche Beschränkung von Immunoassays für PSA dar.
Um die Genauigkeit und Sensibilität von Immunoassays für PSA zu maximieren, ist es deshalb wesentlich, daß Matrices zur Kalibrierung und Probenverdünnung Patientenproben so weit wie möglich entsprechen, insbesondere im Hinblick auf nicht spezifische Bindungseigenschaften.
Es besteht deshalb ein Bedürfnis für Mittel, durch die PSA in natürlichen Matrices, wie z. B. Matrices auf der Basis von Serum zur Verwendung in der quantitativen Bestimmung von PSA in Patientenproben stabilisiert werden kann.
Die vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Stabilisierung von prostatspezifischem Antigen (PSA) in natürlichen Matrices bereit. In dieser Hinsicht wurde unerwarteterweise gefunden, daß natürliche Matrices mit kinetischen Mustern und nichtspezifischen Eigenschaften, die denen von Patientproben ähnlich sind, so modifiziert werden können, daß PSA darin stabil ist, ohne im wesentlichen ihre gewünschten Eigenschaften als Matrices zu verändern.
Erfindungsgemäß wird deshalb ein biologisches Fluid, das Blut, Serum, Plasma, ceribralspirane Flüssigkeit oder Urin sein kann, das aus einem geeigneten Säuger erhalten wurde, und kinetische Muster und nicht-spezifische Bindungseigenschaften besitzt, die gleich oder im wesentlichen gleich der einer Patientenprobe sind, modifiziert, um die Wirksamkeit von Komponenten des Fluids, die auf PSA destabilisierend wirken, zu inhibieren. Das biologische Fluid wird durch eine alkalische pH-Verschiebung von normalem (ca. pH = 7) zu mindestens pH = 9 während eines Zeitraum modifiziert, der wirksam ist, um die Aktivität von Fluidkomponenten, die auf PSA destabilisierend wirken, zu inhibieren. Danach wird der pH-Wert der biologischen Flüssigkeit auf ca. pH = 7 erhöht.
Die Erfindung wurde zusammengefaßt, um die folgende detaillierte Beschreibung besser zu verstehen, und um den Beitrag zum Stand der Technik besser einzuschätzen.
Wie vorstehend angegeben, stellt die vorliegende Erfindung einen Weg bereit, mit dem natürliche Matrices modifiziert werden können, um prostatspezifisches Antigen (PSA) zu stabilisieren. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "natürliche Matrix" auf eine biologisch vorkommende durch lebende Prozesse erzeugte Zusammensetzung mit kinetischen Mustern und nicht-spezifischen Bindungseigenschaften, die die gleichen sind wie eine Patientenprobe oder ähnlich genug dazu sind, um sie als Matrix verwenden zu können. Die vorliegende Erfindung ist zur Bestimmung und/oder quantitativen Messung von PSA in Proben von Patientenflüssigkeit mittels konventioneller Immunoassayverfahren geeignet. Insbesondere sind die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten stabilen natürlichen Matrices als Kalibrator-Matrices und Verdünner in Immunoassays für PSA geeignet.
Immunoassays zur Bestimmung der Konzentrationen antigener Substanzen in flüssigen Proben sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt und müssen deshalb nicht näher beschrieben werden. Unter den Immunoassays, für die die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist, können jedoch genannt werden immunometrische Assays auf der Basis monoclonaler Antikörper, wie z. B. die im US-Patent 4376110 beschriebenen "zwei-Stellen" ("two-site") oder "Sandwich"-immunometrischen Assays. Unter den Mitteln, mit denen solche Immunoassays durchgeführt werden können, können zusätzlich erwähnt werden radiometrische Mittel, enzymatische Mittel und fluormetrische Mittel.
Erfindungsgemäß wird eine aus einem geeigneten Säuger erhaltene biologische Flüssigkeit verwendet. Gesamtblut, Serum, Plasma, cerebralspinale Flüssigkeit oder Urin können erfindungsgemäß geeigneterweise verwendet werden. Bevorzugt verwendet wird Serum, das von menschlichem Blut abgeleitet ist, in dem die Gegenwart von zirkulierendem PSA, wenn vorhanden, in merklichen Konzentrationen nicht bestimmbar ist. Insbesondere bevorzugt ist aufgrund der Abwesendheit von zirkulierendem PSA ein aus menschlichem weiblichem Blut abgeleitetes Serum.
Gemäß dem zur Zeit bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird menschliches weibliches Serum modifiziert, um die Aktivität von Serumkomponenten, die PSA destabilisieren, zu inhibieren. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, sich auf irgendeine Theorie zur Instabilität von PSA in unmodifiziertem Serum festzulegen, wird angenommen, daß eine solche Instabilität mindestens zum Teil der Gegenwart von zirkulierendem Prostatantigen-bindendem Protein (PABG) zuzuschreiben ist. PABG, das in beträchtlich erhöhten Mengen im Serum von Männern mit Prostata-Carcinom vorhanden ist, ist aber auch in normalem männlichem und weiblichem Serum vorhanden. Chu et al., Annals NYAS, Vol 417, pp. 383-389, 1983.
Die Modifizierung von menschlichem weiblichem Serum zur Bereitstellung einer stabilen auf Serum basierenden Matrix für PSA wird durch eine alkalische pH-Verschiebung zu einem pH- Wert von mindestens pH = 9 während eines Zeitraums erreicht, der wirksam ist, um die Aktivität von Serumkomponenten, die PSA destabilisieren, zu inhibieren. Vorzugsweise wird der Serum-pH auf ca. pH = 12 geändert, das Serum ca. 5 bis ca. 45 Minuten inkubiert und dann der Serum-pH auf ca. pH = 7 abgesenkt. Eine Modifizierung des Serums zur Durchführung der erfindungsgemäßen pH-Veränderungen kann durch konventionelle Verfahren, die aus dem Stand der Technik allgemein bekannt sind, erreicht werden.
Die Vorteile von erfindungsgemäß hergestellten stabilen natürlichen Matrices im Vergleich zu synthetischen Matrices werden durch Bezugnahme auf Tabelle I ersichtlich. Weil die nicht-spezifischen Bindungseigenschaften solcher stabiler natürlicher Matrices mit Patientenproben vergleichbar sind, wird die Empfindlichkeit und die Genauigkeit eines Immunoassays für PSA gesteigert.
Zusätzlich macht die Stabilität von PSA in natürlichen Matrices, die erfindungsgemäß modifiziert wurden, solche Matrices hoch wirksam und als Kalibrator-Matrices und Probenverdünner in Immunoassays für PSA gut geeignet. Wie in den Tabellen 11 und 111 angegeben, ist PSA in solchen Matrices in Vergleich zu unmodifizierten natürlichen Matrices wesentlich stabiler.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet, der sich des Nutzens dieser Erfindungsbeschreibung bewußt ist, wird es auch schätzen, daß die vorliegende Erfindung Verfahren zur Stabilisierung anderer Antigene bereitstellt, die bei Einführung in unmodifizierte natürliche Matrices nicht stabil sind. Ähnliche Ergebnisse wurden z. B. mit dem Tumor-associerten Antigen Calcitonin erhalten.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht einschränken, besser verständlich.

Beispiel 1

Herstellung von pH-modifiziertem Serum

Menschliches weibliches Serum, erhalten von der Interstate Blood Bank, Memphis, Tennessee, das bei -20ºC gehalten wurde, wurde zur Herstellung von pH-modifizierter natürlicher Matrix verwendet. 1000 ml des Serums wurden durch Zugabe von 17 bis 20 ml 10N NaOH in einem Gefäß, das mit einer Rühreinrichtung versehen war, auf einen pH-Wert von ca. 12 eingestellt. Die basische Serumlösung wurde dann 30 Minuten lang unter Rühren bei 22 bis 28ºC inkubiert, worauf durch Zugabe von 15 bis 17 ml 10N HCl eine Rückführung zu einen pH-Wert von ca. 7.0 erfolgte. Die Lösung mit dem pH-Wert von 7 wurde dann 10 Minuten lang bei 1000 x g centrifugiert und durch ein Sieb mit 0.2 um filtriert.

Alternatives Verfahren zur Herstellung von pH-modifiziertei Serum

Zur Erhöhung des pH-Wertes auf 12.0 wurden ca. 0.30 bis 0.50 ml 10N NaOH unter Rühren zu 20 ml menschlichem weiblichem Serum gegeben. Das basische Serum wurde 30 Minuten lang inkubiert, und danach 0.1 M Natriumphosphat (0.276 g monobasisches Natriumphosphat) unter Rühren zugegeben, um einen leichten Anstieg im pH-Wert zu ergeben. Danach wurden 0.40 bis 0.60 ml 6N HCl zugegeben, um den pH-Wert auf pH = 6 einzustellen, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden gerührt. Der pH-Wert wurde schließlich unter Verwendung von ca. 0.10 bis 0.5 ml 1N NaOH auf pH = 7 eingestellt.

Vergleich der nicht-spezifischen Bindung

Nicht-spezifische Bindungswerte, die synthetischen Matrixproben, die 5% Rinderserumalbumin (Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana)/2% IgG (Pel-Freeze Biologicals, Rogers, Arkansas) umfassen, zuschreibbar sind, wurden mit unmodifizierten menschlichen weiblichen Serumproben und pH- modifizierten Serumproben, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, verglichen, wobei die nicht-spezifischen Bindungswerte unter Verwendung eines kommerziellen verfügbaren Two-Site-Immunoradiometric Assay, TANDEM®-R PSA (Hybritech Incorporated, San Diego, California) bestimmt wurden. Jede Matrix wurde in 12 Assays gemäß der TANDEM®-R PSA-Anleitung bewertet unter Verwendung von 0.05 ml pro Röhrchen und einer verlängerten Inkubationszeit von 4 Stunden.
Die nachfolgende Tabelle I gibt den für die synthetischen Matrixproben, die unmodifizierten Serumproben bzw. die pH- modifizierten Serumproben erhaltenen Durchschnittswert an. Die Werte sind ausgedruckt als Zählimpulse/Minute und Konzentration an PSA (ng/ml), bezogen auf eine Standardkurve. Tabelle I Probenmatrix 5% BSA/2% IgG Unmodifiziertes Serum pH-modifiziertes
Tabelle I zeigt, daß die nicht-spezifischen Bindungswerte, die mit unmodifizierten und pH-modifizierten Serumproben erhalten wurden, vergleichbar waren, während die nicht-spezifischen Bindungswerten, die mit synthetischen Proben erhalten wurden, beträchtlich höher waren.

Bestimmung der Stabilität von PSA

Es wurde eine beschleunigte Stabilitätsuntersuchung für PSA durchgeführt unter Verwendung von unmodifiziertem menschlichem weiblichem Serum und pH-modifiziertem Serum, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde. Eine Menge von 10 ul (855 ng/ml) PSA aus Samenplasma wurde mit 990 ul jeder Matrixprobe verdünnt und bei 35ºC gehalten. Die Stabilität von PSA, die in Tabelle II als %-Verringerung von meßbarem PSA angegeben ist, wurde für jede Probe am 1., 3. und 5. Tag, bezogen auf eine Kontrollprobe (-70ºC) bestimmt. Durch allgemein bekannten Verfahren können die erhaltenen Werte auf 1.2, 3.6 bzw. 6.0 Monate bei 4ºC extrapoliert werden. Tabelle II Probenmatrix % Verringerung an meßbarem PSA Tagen bei 35ºC Unmodifiziert Modifiziert
Aus der Tabelle II ist es leicht ersichtlich, daß PSA in pH- modifiziertem Serum im Vergleich zum unmodifizierten Serum wesentlicher stabiler war.

Bestimmung der wiedergewonnenen Menge an PSA

Die Verringerung an meßbarem PSA für Samenplasma oder menschliches männliches Serum, die auf die Verdünnung mit unbehandeltem Serum oder wie vorstehend modifiziertem Serum erfolgte, wurde bestimmt. In 4 Röhrchen, die 0.4 ml Probenmatrix enthielten, wurden 0.1 ml (125 ng/ml) PSA aus Samenplasma zugegeben, um eine erwartete Konzentration von 25 ng/ml PSA zu erhalten. Ein aliquoter Teil jeder Lösung wurde dann mit menschlichem männlichem Serum, das nach vorhergehender Analyse 19.1 ng/ml PSA enthielt, auf 1 : 1 verdünnt. Jedes der 4 Röhrchen wurde auf seinen PSA-Gehalt unter Verwendung eines handelsüblich erhältlichen Two-Site Immunoradiometric Assay, TANDEM®-R PSA (Hybritech Incorporated, San Diego, California), mit einer verlängerten Inkubationsdauer von 4 Stunden, bewertet. Die erhaltenen Konzentrationen und berechneten %-Verlust an PSA sind in Tabelle III angegeben. Die Werte zeigen deutlich eine sehr wünschenswerte Wiedergewinnung von PSA bei der pH- modifizierten Matrix, während in unmodifiziertem Serum ein beträchtlicher Verlust an PSA auftritt. Tabelle III Zugabe von PSA aus Samenplasma PSA erwartet gefunden %-Verlust Unmodifiziertes Serum pH-modifiziertes 1:1-Verdünnungen mit menschlichem, PSA enthaltendem Serum PSA erwartet gefunden %-Verlust Unmodifiziertes Serum pH-modifiziertes

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen natürlichen Matrix, die geeignet ist zur Messung des Prostatspezifischen Antigens (PSA) in einer Fluidprobe mittels eines Immunoassays, umfassend die Modifizierung eines biologischen Säugetier-Trägerfluids für das vorstehende Antigen, wobei dieses Fluid Blut, Serum, Plasma, Cerebral-spinales Fluid oder Urin ist, durch Erhöhung des pH-Werts des Trägerfluids auf mindestens pH = 9 während eines Zeitraums, der wirksam ist, um die in diesem biologischen Trägerfluid vorhandenen PSA destabilisierenden Komponenten, die die Messung des PSA in der Fluidprobe stören können, zu deaktivieren, und Verringerung des pH-Werts auf ca. pH = 7.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Trägerfluid Blut, Serum oder Plasma umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier ein Mensch ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier eine Frau ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des biologischen Fluids auf ca. pH = 12 erhöht wird.

6. Verfahren zur Stabilisierung von Prostatspezifischem Antigen (PSA) in einer Fluidprobe, die zur Messung dieses PSA geeignet ist, umfassend:

(a) Gewinnung eines menschlichen weiblichen Serums;

(b) Erhöhen des pH-Werts dieses Serums auf mindestens pH = 9, der wirksam ist, um PSA oder Komponenten, die gegenüber dem in diesem Serum vorhandenen PSA destabilisierend sind, und die die Messung des PSA stören können, zu deaktivieren;

(c) nachfolgende Senkung des pH-Werts dieses Serums auf einen pH-Wert von ca. 7, um eine stabile natürliche Matrix zu bilden; und

(d) in-Kontakt-bringen dieser stabilen natürlichen Matrix mit dem PSA.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die stabile natürliche Matrix als Kalibratormatrix verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die stabile natürliche Matrixzusammensetzung als Diluens verwendet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Serums auf ca. pH = 12 erhöht wird.

10. Stabile natürliche Matrix, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

11. Verwendung einer durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlichen natürlichen Matrix als Kalibratormatrix.

12. Verwendung einer durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlichen natürlichen Matrix als Diluens.

13. Verwendung einer nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erhältlichen Matrix in einem Immunoassay.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunoassay ein immunometrischer Assay auf der Basis monoklonaler Antikörper ist.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunoassay ein "2-Stellen"immunometrischer Assay ist.

16. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der immunometrische Assay aufgeführt wird durch Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus radiometrischen Mitteln, enzymatrischen Mitteln und fluorometrischen Mitteln.