DK165466B - Fremgangsmaade til fremstilling af en stabil biologisk vaeske til anvendelse som baggrundsmateriale ved immunassaymaalinger, samt anvendelse af en saadan stabil biologisk vaeske som materiale ved kalibrering, som fortyndingsmiddel og i et immunassay baseret paa monoklonalt antistof - Google Patents

Description

DK 165466 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde ti-1 fremstilling af en stabil biologisk væske til anvendelse som baggrundsmateriale ved målingen af prostata-specifikt antigen (PSA) i en væskeformig prøve ved hjælp af et im-5 munassay samt anvendelse af en således fremstillet stabil biologisk væske som materiale ved kalibrering, som fortyndingsmiddel og i et immunassay baseret på monoklo-nalt antistof.

Prostata-specifikt antigen (PSA) , et godt 10 karakteriseret antigen associeret med tumorer,er en betydningsfuld diagnostisk og prognostisk markør ved human prostata-carcinom. Som følge af, at prostata-tumorceller frigør PSA til blodstrømmen,vil koncentrationen af PSA i serum og andre kropsvæsker korrelere 15 med væksten af primære eller metastasiske carcinomer.

Derfor vil en kvantitativ bestemmelse af PSA i prøver fra patienter give læger et effektiv middel til at kontrollere en terapi og vurdere, om sygdommen er fremadskridende eller på tilbagetogt.

20 Kendte immunassays til måling af PSA i prøver fra patienter, såsom immunradiometrisk assay (IRMA) og enzymbaseret immunsorbentassay (ELISA) hviler på anvendelse af kunstige eller syntetiske baggrundsmaterialer, såsom serumalbumin fra køer, som kali-25 breringsbaggrundsmaterialer og som fortyndingsmidler.

I denne forbindelse vil "kalibreringsbaggrundsmateriale" betyde et baggrundsmateriale, i hvilket forudbestemte koncentrationer af et antigen kan opretholdes til brug for kalibrering af ukendte koncentra-30 tioner af antigenet i prøver fra patienter. Betegnelsen 'fortyndingsmiddel" vil betyde et baggrundsmateriale benyttet til fortynding af prøver fra patienter, hvori koncentrationen af antigen er større, end immunassayet kan dække, hvorved det tillades, at man kan måle anti-35 genet ved hjælp af immunassayet.

Disse baggrundsmaterialer benyttes,fordi umodificerede naturlige baggrundsmaterialer, såsom baggrundsmaterialer baseret på serum, anses for uegnede 2

DK 165466B

på grund af at PSA er instabilt, når det indføres i sådanne baggrundsmaterialer. Man har især vist, at der foregår et tab på 30-70% af PSA-aktivitet indenfor 24 timer efter, at det er indført i ikke modificerede 5 baggrundsmaterialer baseret på menneskeligt serum.

Ydermere er dette tab af målelig PSA ikke begrænset til serum fra mennesker, idet PSA også er ustabilt/ når det indføres i baggrundsmaterialer baseret på serum fra køer eller heste.

10 Da komponenterne i sådanne baggrundsmaterialer er forskellige fra komponenterne i analyseprøver, vil bindingskinetikken og den ikke specifikke bindingskarakteristik af kunstige baggrundsmaterialer kunne afvige kraftigt fra serum eller andre kropsvæsker, der 15 indeholder eller mistænkes for at indeholde PSA.

Anvendelse af disse baggrundsmaterialer vil derfor i sig selv være en alvorlig begrænsning på immunassays for PSA.

Det er meget vigtigt, når immunassays for PSA 20 skal gøres så nøjagtige og følsomme som muligt, at baggrundsmateriale til kalibrering og fortynding skal minde så meget som muligt om analyseprøver fra patienten, især hvad angår ikke specifik bindingskarakteristik.

Der er følgelig et behov for midler til stabili-25 sering af PSA i naturlig baggrundsmaterialer, såsom serumbaserede baggrundsmaterialer, så de kan benyttes til kvantitativ bestemmelse af PSA i prøver fra patienter.

Opfindelsen tilvejebringer fremgangsmåder til 30 stabilisering af prostata-specifikt antigen (PSA) i naturlige baggrundsmaterialer. I denne sammenhæng· har vi uventet fundet,at naturlige baggrundsmaterialer med bindingskinetik og uspecifik bindingskarakteristik, der minder om hvad man finder i patientprøver, kan 35 modificeres på en måde, så PSA er stabilt deri, uden at man herved i væsentlig grad ændrer deres ønskede egenskaber som baggrundsmaterialer.

DK 165466 B

3 I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man modificerer en biologisk bærervæske indeholdende PSA fra et egnet pattedyr ved at væskens pH hæves og derefter holdes konstant 5 i et passende tidsrum, hvorefter pH ændres til den oprindelige værdi.

Ifølge opfindelsen benytter man biologiske væsker fra et egnet pattedyr med bindingskinetik og ikke specifik bindingskarakteristik, der er lig 10 med eller i det væsentlige lig med hvad man finder i patientprøver og modificerer dem, hvorved man inhiberer aktiviteten af komponenter i væsken, der destabiliserer PSA. I en foretrukken fremgangsmåde ifølge opfindelsen modificerer man sådanne biologiske væsker ved at skifte 15 pH fra normal (ca. pH 7) til i dét mindste ca. pH 9 i så lang tid at den destabiliserende aktivitet af komponenter i den biologiske væske effektivt hæmmes. Derefter sænkes pH i den biologiske væske til ca. pH 7.

Dette er et resumé af opfindelsen, så at den 20 følgende detaljerede beskrivelse bedre kan forstås af fagmanden.

Som angivet ovenfor tilvejebringer opfindelsen et middel, hvorved naturligt baggrundsmateriale kan modificeres så prostata-specifikt antigen (PSA) kan 25 stabiliseres deri. I denne sammenhæng vil betegnelsen "naturlig baggrundsmateriale" angive en biologisk forekommet komposition dannet ved livsprocesser, og hvori bindingskinetikken og den ikke specifikke bindingskarakteristik er den samme som, eller tilstrækkelig 30 tilsvarende en patientprøve, så man kan benytte den som baggrundsmateriale. Opfindelsen er nyttig til påvisning og/eller kvantitativ måling af PSA i væskeformige prøver fra patienter ved hjælp af konventionelle immunassay-fremgangsmåder. Især er 35 stabile naturlige baggrundsmaterialer fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendelige som materiale ved kalibrering og fortynding ved immunassays for PSA.

4

DK 165466B

Iiranunassays, hvorved man bestemmer koncentrationen af antigener i væskeformige prøver, er velkendte og behøver ikke at beskrives i detaljer.

Imidlertid er ved visse immunassays opfindelsen særlig 5 nyttig, og man kan nævne monoklone antistofbaserede immunometriske assays, såsom "two-site" eller "sandwich" immunometrisk assays beskrevet i US-patent 4.376.110. Derudover kan det nævnes, at sådanne immunassays kan gennemføres ved hjælp af midler valgt 10 blandt radiometriske, enzymatiske og fluorometriske midler.

Ifølge opfindelsen anvender man en biologisk væske fra et egnet pattedyr. F;eks. blod, serum, plasma, cerebro-spinalvæske eller urin kan anvendes 15 ifølge opfindelsen. Foretrukket er serum fra menneskeblod, i hvilket man ikke på påvise nogen som helst cirkulerende PSA i målelicp koncentrationer. Især foretrukket er serum fra blod fra mennesker af hunkøn, da der her ikke findes cirkulerende PSA.

20 Ifølge en for tiden foretrukken fremgangsmåde ved opfindelsen modificerer man serum fra mennesker af hunkøn for at hæmme aktiviteten af serumkomponenter, som destabiliserer PSA, jævnfør krav 6. Ansøgeren ønsker ikke at bindes til nogen teori for instabiliteten af PSA i umodifi-25 ceret serum, men man tror, at en sådan instabilitet i det mindste delvis skyldes, at der findes cirkulerende protein, der binder prostata-antigen (PABG). Man har fundet PABG i betydelig forhøjede mængder i serum fra mænd med prostatacarcinomer, men man har også fundet, 30 at det er tilstede i serum fra raske mænd og kvinder.

Chu et al., Annals NYAS, vol. 417, side 383-389, 198-3.

Man udfører modificeringen af serum fra menneskeraf hunkøn for at tilvejebringe et stabilt serumbaseret baggrundsmateriale for PSA ved at ændre 35 pH i alkalisk retning til et pH på i det mindste ca.

9 i så lang tid, at aktiviteten af serumkomponenter, der destabiliserer PSA, effektivt hæmmes. Det fore-

DK 165466 B

5 trækkes at pH i serum forhøjet til ca. 12,"serum inkuberes i 5-45 minutter og derefter sænker man pH i serum til ca. 7. Modifikationen af serum, hvorved pH ændres ifølge opfindelsen, kan udføres ved hjælp af 5 kendte fremgangsmåder.

Fordelene ved stabile naturlige baggrundsmaterialer fremstillet ifølge opfindelsen i forhold til syntetisk baggrundsmateriale ses i tabel 1.

Da den ikke specifikke bindingskarakteristik ved sådanne 10 stabile naturlige baggrundsmaterialer kan sammenlignes med, hvad man finder i prøver fra patienter vil følsomheden og nøjagtigheden i et immunassay for PSA blive forstærket.

Derudover vil stabiliteten af PSA i naturligt 15 baggrundsmateriale modificeret ifølge opfindelsen gøre sådant baggrundsmateriale meget effektivt og anvendeligt som kalibreringsmateriale eller som fortyndingsmiddel i immunassays for PSA. Som vist i tabel II og III er PSA betydelig mere stabilt i sådanne baggrundsmaterialer 20 end i ikke modificerede naturlige baggrundsmaterialer.

Opfindelsen forstås bedre ved hjælp af det følgende eksempel.

Eksempel 1 25 Fremstilling af pH modificeret serum.

Serum fra menneskeraf hunkøn, tilvejebragt fra Interstate Blood Bank, Memphis, Tennessee og holdt ved -20°C, blev benyttet til at fremstille et pH modificeret naturligt baggrundsmateriale. I 1000 ml serum ind-30 stillede man pH på ca. 12 ved at tilsætte 17-20 ml

DK 165466 B

6 ION NaOH i en beholder med omrører. Den basiske serumopløsning blev derefter inkuberet i 30 minutter ved 22-28°C under omrøring, hvorefter man vendte tilbage til pH ca. 7,0 ved at tilsætte 15-17 ml ION HC1.

5 Man centrifugerede derefter denne opløsning med pH 7 i 10 minutter ved 1000 g og filtrerede gennem en sigte på 0,2 y.

Alternativ metode til fremstilling af pH modificeret 10 serum.

Ca. 0,30-0,50 ml 10N NaOH blev under omrøring sat til 20 ml serum fra forskellige mennesker af hunkøn, hvorved pH steg til 12,0. Det basiske serum blev inkuberet i 30 minutter, hvorefter man tilsatte 0,1M . 15 natriumphosphat (0,276 g monobasisk natriumphosphat), under omrøring, herved faldt pH en smule. Man tilsatte derefter 0,40-0,60 ml 6N HC1 for at fastsætte pH til 6, og opløsningen blev holdt under omrøring ved stuetemperatur i 2-3 timer. Endelig fastsatte man pH til 7 20 ved anvendelse af ca. 0,10-0,50 ml IN NaOH.

Sammenligning af ikke specifik binding.

Ikke specifikke bindingsværdier for prøver af syntetisk baggrundsmateriale, der indeholdt 5% serum 25 albumin fra køer (Miles Laboratories, Inc., Elkhart,

Indiana)/2% IgG (Pel-Freeze Biologicals, Rogers,

Arkansas), blev sammenlignet med prøver af ikke modificeret serum fra mennesker af hunkøn og prøver af pH modificeret serum fremstillet som beskrevet ovenfor, 30 hvorved de ikke specifikke bindingsværdier blev bestemt ved hjælp af et "two-site” immunradiometrisk assay, TANDEM-R PSA, som er i handelen fra Hybritech Incorporated, San Diego, California. Hvert baggrundsmateriale blev prøvet i 12 ens assays, hvor der blev 35 anvendt 0,05 ml per prøverør ifølge forskriften for TANDEM-R PSA med en forlænget inkubationsperiode på 4 timer.

DK 165466 B

7 I den følgende tabel I vises middelværdier for prøver med det syntetiske baggrundsmateriale for prøver med ikke modificeret serum og for prøver med pH modificeret serum. Data udtrykkes som impulser 5 per minut og koncentration af PSA (ng/ml) i forhold til en standardkurve.

Tabel I

Baggrunds- Impuls/ PSA (ng/ml) 10 materiale_minut_ 5% BSA/2% IgG 1179 0f24

Ikke modifieret serum 930 0,07 pH modifieret 15 serum 946 0,09

Det ses fra tabel I, at de ikke specifikke bindings værdier for ikke modificeret og pH modificeret serum er sammenlignelige, mens værdierne for den ikke 20 specifikke binding for de syntetiske prøver lå betydelig højere.

Bestemmelse af stabiliteten af PSA.

En accelereret stabilitetsundersøgelse af PSA 25 blev udført under anvendelse af ikke modificeret serum fra menneske af hunkøn, og pH modificeret serum fremstilles som vist ovenfor. Man fortyndede 10 yl 855 ng/ml PSA fra sædplasma med 990 yl af hver prøve af baggrundsmateriale og opretholdt det ved 35°C.

30 Man bestemte stabiliteten af PSA, vist i tabel II som procenttab af målelig PSA, for hver prøve efter 1, 3 5 dage i forhold til en kontrolprøve opbevaret ved -70°C. Ved velkendte fremgangsmåder kan man ekstrapolere de målte værdier til 1,2, 3,6 og 6,0 måneder 35 og til 4°C.

DK 165466 B

8

Tabel II

Baggrundsmateriale Procenttab af målelig PSA

_Dage ved 35°C_ 13 5 5 Ikke modificeret 21 32 ‘36 pH 12 modificeret 430

Ikke modificeret 20 26 30 pH 12 modificeret 875 10

Det ses tydeligt fra tabel, II at PSA var betydelig mere stabilt i pH modificeret serum end i ikke modificeret serum.

Man bestemte tabet af måleligt PSA fra enten 15 plasma fra sæd eller fra serum fra mennesker af hankøn efter fortynding med ubehandlet serum eller serum modificeret som ovenfor beskrevet. Til fire rør, der indeholdt 0,4 ml prøve af baggrundsmateriale, satte man 0,1 ml 125 ng/ml PSA fra plasma fra sæd, hvorved man 20 opnåede en forventet koncentration på 25 ng/ml PSA.

Lige store mængder af hver opløsning blev derefter fortyndet 1:1 med serum fra menneske af hankøn, som man tidligere analyserede og som indeholdt 19,1 ng/ml PSA.

Hver af de 4 rør blev undersøgt for PSA indhold ved 25 hjælp af et "two-site" immunoradiometrisk assay, TANDEM-R· PSA, (kan fås hos Hybritech Incorporated,

San Diego, Californien) med en forlænget inkubationstid på 4 timer. Slutkoncentrationerne og beregnet procenttab af PSA vises i tabel III. Data viser klart 30 at PSA i høj grad genfindes når man benytter det pH modificerede baggrundsmateriale, mens der forekommer et kraftigt tab af PSA ved benyttelse af ikke modificeret serum.

35

DK 165466 B

9

Tabel III

Tilsætning af PSA fra plasma fra sæd.

PSA teoretisk PSA observeret PSA

ng/ml_ng/ml_procenttab 5 Ikke modificeret serum 25,0 12,33 51 pH modificeret 25,0 24,16 3 serum 10

Opløsninger fortyndet 1:1 med humant serum, der indeholder PSA.

PSA teoretisk PSA observeret PSA

15 ng/ml_ng/ml_procenttab

Ikke modificeret serum 15,72 15,29 3 pH modificeret 21,63 22,17 0 20 serum

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en stabil biologisk væske til anvendelse som baggrundmateriale ved målingen af prostata-specifikt antigen (PSA) i en væskeformig 5 prøve ved hjælp af et immunassay, kende.tegnet ved, at man modificerer en biologisk bærervæske indeholdende PSA fra et egnet pattedyr ved at væskens pH hæves og derefter holdes konstant i et passende tidsrum, hvorefter pH ændres til den oprindelige værdi.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den biologiske væske udvælges blandt blod, serum eller plasma.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at pattedyret er et menneske.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at pattedyret er et menneske af hunkøn.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at modificeringen omfatter, at man bringer pH af den biologiske væske op på en værdi af mindst ca. 20 9, fortrinsvis til en værdi af ca. 12 i så lang tid, at den destabiliserende aktivitet af komponenter i den biologiske væske effektivt hæmmes, og derefter sænker pH i den biologiske væske til en værdi på ca. 7.

6. Fremgangsmåde til stabilisering af prostata-spe- 25 cifikt antigen i et serumbaseret baggrundsmateriale til brug for måling af nævnte PSA i en væskeformig prøve ved hjælp af et immunassay, kendetegnet ved, at man modificerer nævnte serum fra et menneske af hunkøn ved at væskens pH hæves og derefter holdes konstant i et passende 30 tidsrum, hvorefter pH ændres til den oprindelige værdi.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at modificeringen omfatter, at man bringer pH af serum op på en værdi af mindst ca. 9, fortrinsvis til en værdi af ca. 12, i så lang tid, at den destabiliserende ak- 35 tivitet af serumkomponenterne effektivt hæmmes, og derefter sænker pH i serum til en værdi på ca. 7.

8. Anvendelse af den stabile biologiske væske frem- DK 165466B stillet ifølge krav 1 eller 2, eller af det serumbaserede baggrundsmateriale indeholdende PSA stabiliseret ifølge krav 6 som materiale ved kalibrering.

9. Anvendelse af den stabile biologiske væske frem-5 stillet ifølge krav 1 eller 2, eller af det serumbaserede baggrundsmateriale indeholdende PSA stabiliseret ifølge krav 6 som fortyndingsmiddel.

10. Anvendelse af den stabile biologiske væske fremstillet ifølge krav 1 eller 2 i et immunassay baseret på 10 monoklonalt antistof.

11. Anvendelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at immunassayet er et såkaldt "two-site" immunassay.

12. Anvendelse ifølge krav 10, kendetegnet ved, at immunassayet gennemføres ved hjælp af midler ud- 15 valgt blandt radiometriske, enzymatiske og fluorometriske midler.