FI87021C - Foerfarande foer stabilisering av prostataspecifik antigen i naturella matriser och foerfarande foer framstaellning av matriser - Google Patents

Description

1 87021

Menetelmiä eturauhasspesifisen antigeenin stabiloimiseksi luonnollisissa matriiseissa ja matriisien valmistusmenetelmä 5 Kyseessä oleva keksintö liittyy antigeenien havait semiseen ja paljouden määrittämiseen nesteissä, kuten esimerkiksi seerumissa. Lähemmin keksintö koskee menetelmiä stabiilien, luonnosta peräisin olevien matriisien valmistamiseksi eturauhasspesifisen antigeenin (PSA) immunologi-10 sissa pitoisuusmäärityksissä suoritettavaa käyttöä varten. Keksintö koskee myös menetelmiä PSA:n stabiloimiseksi see-rumipohjaisessa matriisissa sekä menetelmillä valmistettuja matriiseja.

Eturauhasen suhteen spesifinen antigeeni (PSA), 15 hyvin karakterisoitu, kasvaimeen kytkeytyvä antigeeni, on tärkeä diagnoosi- ja ennustemarkkeri ihmisen eturauhasen syövässä. Kun kasvainsolut luovuttavat PSA:a verenkiertoon, PSA:n konsentraatiot seerumissa ja muissa kehonnes-teissä korreloivat primaarisen tai metastaattisen syövän 20 etenemisen kanssa. Niinpä, PSA:n määrittäminen potilas-näytteistä antaa lääkäreille tehokkaita keinoja hoito-ohjeiden valvontaan sekä taudin tilan tilapäisen hellittämi-sen tai etenemisen arviointiin.

Nykyiset immunologiset pitoisuusmääritykset PSA:n 25 mittaamiseksi potilaan nestenäytteistä, kuten esimerkiksi immunoradiometrinen pitoisuusmääritys (IRMA) ja entsyymiin kytketty immunosorbentti-pitoisuusmääritys (ELISA), perustuvat keinotekoisten tai synteettisten matriisien käyttöön, kuten esimerkiksi häränseerumin albumiiniin, kalib-30 raattorimatriiseina ja laimentimina. Tässä yhteydessä käytettynä, termi "kalibraattorimatriisi" tarkoittaa matriisia, jossa voidaan pitää yllä antigeenisen aineen ennalta määritetyt konsentraatiot potilasnäytteisiin sisältyvien antigeenisten aineiden kalibroimiseksi. Termi "laimennin" 35 tässä yhteydessä käytettynä tarkoittaa matriisia potilas-näytteiden laimentamista varten näytteiden sisältämän an- 2 87021 tigeenisen aineen konsentraatioiden ylittäessä immunologisen pitoisuusmäärityksen alueen, laimentamisen salliessa antigeenisen aineen mittauksen immunologisen pitoisuusmäärityksen alueella.

5 Näitä matriiseja käytetään, koska muuntamattomat, luonnosta peräisin olevat matriisit, kuten esimerkiksi seerumipohjaiset matriisit on osoitettu käyttöön sopimattomiksi PSA:n epävakaisuuden vuoksi sellaisiin matriiseihin vietäessä. Nimenomaan, on havaittu, että PSA:n aktii-10 visuudesta häviää noin 30 - 70 % 42 tunnin kuluessa, muun-tamattomiin, humaaniseerumipohjäisiin matriiseihin panemisen jälkeen. Lisäksi, tämä tuloksena oleva mitattavan PSA:n häviö ei rajoitu humaaniseerumiin, koska PSA on py-symätön myös pantaessa häränseerumi- ja hevosenseerumipoh-15 jäisiin matriiseihin.

Sellaisten matriisien komponenttien erilaisuuden vuoksi näytteen komponentteihin nähden, keinotekoisten matriisien kineettiset ja epäspesifiset sitoutumisominai-suudet saattavat poiketa huomattavasti seerumista tai 20 muista kehon nesteistä, jotka sisältävät tai joiden oletetaan sisältävän PSA:a. Tämän johdosta näiden matriisien käyttö on luonnostaan todellinen rajoitus PSA:n immunologisille pitoisuusmäärityksille.

Niinpä, PSA:n immunologisten pitoisuusmääritysten 25 tarkkuuden ja herkkyyden maksimoimiseksi on välttämätöntä, että kalibrointi ja näytelaimennusmatriisit ovat lähes potilaan näytteiden kaltaisia, erityisesti epäspesifisten sitoutumisominaisuuksien suhteen, mikäli mahdollista.

Sen mukaisesti tarvitaan keinoja, joilla PSA saate-30 taan stabiloida luonnosta peräisin olevissa matriiseissa, kuten esimerkiksi seerumipohjäisissä matriiseissa, poti-lasnäytteiden PSA:n kvantitatiivisessa määrityksessä suoritettavaa käyttöä varten.

Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän 35 eturauhasen suhteen spesifisen antigeenin (PSA) stabiloi- 3 87021 miseksi luonnosta peräisin olevissa matriiseissa. Tässä suhteessa on yllättäen havaittu, että luonnosta peräisin oleat matriisit, joiden kineettiset ja epäspesifiset si-toutumisominaisuudet ovat samankaltaiset kuin potilasnäyt-5 teillä, voidaan muuntaa niin, että PSA on niissä stabiili, muuttamatta huomattavasti niiden haluttuja matriisin ominaisuuksia.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle pysyvän, luonnosta peräisin olevan matriisin valmistamiseksi, joka sopii 10 käytettäväksi PSA:n määrittämiseen nestenäytteestä immuno-määritysmenetelmän avulla, on tunnusomaista, että muunnetaan sopivalta nisäkkäältä saadun PSA:n biologinen, nestemäinen kantaja-aine säätämällä pH:ta, lisäämällä kaotroop-pista ainetta tai lämmöllä, biologisen nesteen PSA:n epä-15 vakaaksi tekevien komponenttien aktiivisuuden inhiboimi-seksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle PSA:n stabiloimi-seksi seerumipohjäisessä matriisissa käytettäväksi PSA:n määritykseen nestenäytteestä immunomääritysmenetelmän 20 avulla on tunnusomaista, että muunnetaan seerumi, joka on saatu sopivalta naispuoliselta henkilöltä, säätämällä pH-:ta, lisäämällä kaotrooppista ainetta tai lämmöllä, jotta inhiboidaan seerumin komponenttien aktiivisuus, joka tekee PSA:n epästabiiliksi.

25 Kyseessä olevan keksinnön mukaisessa, edullisessa menetelmässä sellainen biologinen neste muunnetaan siirtämällä pH normaalilta alueelta (noin pH 7) alkaliselle pH-alueelle, ainakin pH 9:ään, ajaksi, joka on tehokas PSA:a epästabiloivien nestekomponenttien aktiivisuuden inhiboi-30 miseksi. Tämän jälkeen biologisen nesteen pH lasketaan noin pH 7:ksi.

Keksintöä koskeva yhteenveto on esitetty, jotta yksityiskohtainen kuvaus, joka esitetään seuraavana, tulisi paremmin ymmärrettyä ja jotta saatetaan paremmin ar-35 vioida merkitys kyseessä olevan tutkimuksen alueella.

4 87021

Kuten edellä on esitetty, kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön keinot, joilla luonnosta peräisin oleva matriiseja saatetaan muuntaa eturauhasen suhteen spesifisen antigeenin (PSA) stabiloimiseksi. Kyseessä olevan kek-5 sinnön yhteydessä termillä "luonnosta peräisin oleva matriisi" tarkoitetaan biologisesti esiintyvää koostumusta, jonka ovat tuottaneet elintoiminnat ja jonka kineettiset ja epäspesifiset sitoutumisominaisuudet ovat samat tai riittävän samanlaiset kuin potilasnäytteellä, jotta sitä 10 voidaan käyttää matriisina. Kyseessä oleva keksintö on käyttökelpoinen PSA:n ilmaisemiseksi sekä kvantitatiiviseksi määrittämiseksi potilasnäytteistä tavanomaisin immunologisin pitoisuusmääritysmenetelmin. Erityisesti, kestävät, luonnosta peräisin olevat matriisit, joita valmis-15 tetaan kyseessä olevan keksinnön mukaisin menetelmin, ovat käyttökelpoisia kalibraattorimatriiseina sekä laimennusai-neina PSA:n immunologisissa pitoisuusmäärityksissä.

Immunologiset pitoisuusmääritykset antigeeniainei-den konsentraation määrittämiseksi nestenäytteistä ovat 20 hyvin tunnettuja eikä niitä tarvitse kuvata yksityiskohtaisesti .

Immunologiset pitoisuusmääritykset antigeeniainei-den konsentraation määrittämiseksi nestenäytteistä ovat hyvin tunnettuja eikä niitä tarvitse kuvata yksityiskoh-25 taisesti. Kuitenkin immunologisten pitoisuusmääritysten joukosta, joiden suhteen kyseessä oleva keksintö on erityisen käyttökelpoinen, saatetaan mainita monoklonaaliseen vasta-aineeseen perustuvat immunometriset pitoisuusmääritykset, kuten esimerkiksi kaksipuoliset, "two-site", tai 30 "sandwich" immunometriset pitoisuusmääritykset, joita on kuvattu US-patentissa nro 4 376 110. Lisäksi, menetelmien joukossa, joilla sellaisia immunologisia pitoisuusmääri-tyksiä voidaan suorittaa, saatetaan mainita radiometriset, entsymaattiset ja fluorometriset menetelmät.

35 Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti käytetään hy- 5 87021 väksi biologista nestettä, joka on saatu sopivalta nisäkkäältä. Esimerkiksi, kyseessä olevassa keksinnössä saatetaan käyttää sopivasti hyväksi esimerkiksi koko verta, seerumia, plasmaa, selkäydinnestettä tai virtsaa. Käytön 5 suhteen edullista on seerumi, joka on peräisin humaani verestä, jossa kiertävän PSA:n läsnäolo, jos ollenkaan, ei ole havaittavissa merkittävinä konsentraatioina. Käytön suhteen erityisen edullista on seerumi, joka on peräisin naispuolisilta henkilöiltä, mikä johtuu kiertävän PSA:n 10 puuttumisesta.

Kyseessä olevan keksinnön tällä hetkellä edullisen menetelmän mukaisesti naispuolisen henkilön seerumia modifioidaan PSA:a epästabiloivien seerumin komponenttien aktiivisuuden muuntamiseksi. Vaikka patentin hakijoiden tar-15 koituksena ei ole sitoutua mihinkään teoriaan, joka koskee PSA:n pysymättömyyttä muuntamattomassa seerumissa, sellaisen epästabiliteetin uskotaan liittyvän ainakin osittain kiertävän, eturauhasantigeenia sitovan oroteiinin (PABG) läsnäoloon. PABG:n, samalla kun sitä on läsnä kohonneina 20 tasoina seerumeissa miehillä, joilla on todettu eturauhas syöpä, on todettu olevan läsnä myös terveiden miesten ja naisten seerumissa. Chu et ai., Annals NYAS, osa 417, ss. 383 - 389, 1983.

Naispuolisten henkilöiden seerumin muuntaminen py-25 syvän seerumipohjaisen matriisin käyttöön antamiseksi • - PSA:a varten suoritetaan muuttamalla pH alkaliseksi aina kin noin pH 9:ään saakka ajaksi, joka on tehokas inhiboimaan seerumin komponentit, jotka tekevät PSA:n epästabiiliksi. Mieluummin seerumin pH siirretään noin pH 12:ksi, 30 seerumia inkuboidaan noin 5 - noin 45 minuuttia, ja tämän jälkeen seerumin pH lasketaan noin pH 7:ksi. Seerumin muuntaminen pH-muutosten toteuttamiseksi kyseessä olevan keksinn#n mukaisesti saatetaan saada aikaan tavanomaisin, tutkimustyössä tunnetuin menetelmin.

35 Lisäksi, tulisi huomata, että samalla kun pH:n muu- 6 87021 tos on edullinen tapa inhiboida PSA:n kanssa reaktiivisten seeruminkomponenttien aktiivisuus, kyseessä olevassa keksinnössä saatetaan myös käyttää kaotrooppisia aineita. Kaotrooppisten aineiden joukossa (se on aineet, jotka ai-5 kaansaavat epäjärjestystä proteiinin tertiaariseen rakenteeseen) sopivina käytettäviksi kyseessä olevassa keksinnössä saatetaan mainita urea, KBr, KI, KSCN, guanidiini ja MgC^· Lämpöä saatetaan myös käyttää, se on, neste saatetaan kuumentaa, ja saatetaan pitää sitä kohotetussa lämpö-10 tilassa riittävä aika seerumin komponenttien aktiivisuuden inhiboimiseksi. Kuitenkin on havaittu, että mainitut pH:n säädöt ovat kaikista tehokkaimmat tähän tarkoitukseen.

Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti valmistettujen, stabiilien, luonnosta peräisin olevien matriisien 15 edut, kun niitä verrataan synteettisiin matriiseihin, käy vät ilmi taulukosta I. Kun sellaisten kestävien, luonnosta peräisin olevien matriisien epäspesifisiä sitoutumisomi-naisuuksia verrataan potilasnäytteisiin, PSA:n immunologisen pitoisuusmäärityksen herkkyys ja tarkkuus on lisäänty-20 nyt.

Lisäksi, PSA:n säilyvyys luonnosta periäisin olevissa matriiseissa, jotka on muunnettu kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, tekevät sellaiset matriisit erittäin tehokkaiksi ja halutuiksi kalibraattorimatriiseina sekä 25 näytteen laimennusaineina PSA:n immunologisissa pitoisuus- määrityksissä. Kuten taulukoissa II ja III on osoitettu, PSA on huomattavasti kestävämpi sellaisissa matriiseissa muuntamattorniin luonnosta peräisin oleviin matriiseihin verrattuna.

30 Kyseessä oleva keksintö saattaa olla paremmin ym märrettävissä seuraavien esimerkkien avulla.

7 87021

Esimerkki 1 pH:n avulla muunnetun seerumin valmistus

Naispuolisten henkilöiden seerumia, jota oli saatu the Interstate Blood Bankista, Memphis, Tennessee, sekä 5 säilytetty -20 °C:ssa, käytettiin pH:n avulla muunnetun, luonnosta peräisin olevan matriisin valmistamiseen. 1 000 ml:n suuruinen erä seerumia säädettiin noin pH 12:een lisäämällä 17 - 20 ml 10N NaOH:a astiaan, jossa oli sekoi-tuslaite. Emäksistä seerumiliuosta inkuboitiin tämän jäl-10 keen 30 minuutin ajan 22 - 28 °C:ssa sekoittaen, minkä jälkeen pH palautettiin noin 7,0:ksi lisäämällä 15 - 17 ml 10N HCl:a. Tämän jälkeen liuosta, jonka pH oli säädetty 7:ksi, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 1 000 x g:llä sekä suodatettiin lopuksi 0,2 μ:η siivilän läpi.

15 Vaihtoehtoinen menetelmä pH:n avulla muunnetun see rumin valmistamiseki

Suunnilleen 0,30 - 0,50 ml 10N NaOH:a lisättiin sekoittaen 20 ml:aan naispuolisilta henkilöiltä saatua, yhdistettyä seerumia pH:n nostamiseksi 12,0:aan. Emäksistä 20 seerumia inkuboitiin 30 minuutin ajan, jonka jälkeen lisättiin 0,1 M natriumfosfaattia (0,276 g monoemäksistä natriumfosfaattia) sekoittaen, jotta pH:ssa saatiin aikaan vähäinen nousu. Tämän jälkeen lisättiin 0,40 - 0,60 ml 6N HCl:a pH:n säätämiseksi pH 6:ksi ja liuosta sekoitettiin 25 huoneenlämpötilassa 2-3 tunnin ajan. Lopuksi pH säädettiin 7:ksi käyttämällä noin 0,10 - 0,5 ml IN NaOH:a.

Epäspesifisen sitoumlsen vertailu

Epäspesifisen sitoutumisen arvoja, jotka ovat ominaisia synteettisille matriisinäytteille, jotka käsittävät 30 häränseeruminalbumiinia (Miles Laboratories, Inc.,

Elkhart, Indiana)/2 % igG (Pel-Freeze Biologicals, Rogers, Arkansas), verrattiin muuntamattomiin, naispuolisilta henkilöiltä saatuihin seeruminäytteisiin sekä pH: n avulla muunnettuihin seeruminäytteisiin, jotka oli valmistettu 35 yllä kuvatulla tavalla, epäspesifisen sitoutumisen arvot 8 87021 määritettiin käyttämällä kaupallista "two-site"-immunora-diometristä pitoisuusmääritystä, TANDEM®-r psa (Hybritech Incorporated, San Diego, California). Kukin matriisi arvioitiin 12 rinnakkaismäärityksenä käyttäen 0,05 ml putkea 5 kohti TANDEM®-r PSA-ohjeen mukaisesti, käyttäen pidennettyä, 4 tunnin pituista inkubointiaikaa.

Tässä yhteydessä alempana esitetty taulukko I ilmaisee keskimääräisen arvon, joka on saatu vastaavasti synteettisille matriisinäytteille, muuntamattomille seeru-10 minäytteille sekä pH:n avulla muunnelluille seeruminäytteille. Tulokset ilmaistaan iskuina minuutissa (cpm) sekä PSA:n konsentraationa (ng/ml) vakiokäyrään verrattuna.

Taulukko I

Näytematriisi Iskuja minuutissa PSA (ng/ml) 15 5 % BSA/2 % IgG 1179 0,24

Muuntamaton seerumi 930 0,07 pH:n avulla muunnet- 946 0,09 tu seerumi

Taulukon I perusteella osoitetaan, että epäspesi-20 fisen sitoutumisen arvot, jotka on saatu muuntamattomille ja pH:n avulla muunnetuille seeruminäytteille, ovat vertailukelpoisia, kun taas epäspesifisen sitoutumisen arvot, jotka on saatu synteettisille näytteille, ovat huomattavasti korkeammat.

25 PSA:n pysyvyyden määrittäminen

Nopeutettu PSA:n pysyvyyden tutkimus suoritettiin käyttämällä muunnettua naispuolisen henkilön seerumia sekä pH:n avulla muunnettua seerumia, joka oli valmistettu yllä kuvatulla tavalla. 10 μ1:η suuruinen määrä siemennestees-30 tä saatua PSA:a, jonka konsentraatio oli 855 ng/ml, laimennettiin 990 pl:aan kutakin matriisinäytettä sekä säilytettiin 35 °C:ssa. PSA:n pysyvyys, joka on esitetty taulukossa II mitattavan PSA:n prosentuaalisena häviönä, määritettiin kullekin näytteelle päivinä 1, 3 ja 5, suhteessa 35 -70 °C:n kontrollinäytteeseen. Tutkimustyössä tunnetuin 9 87021 menetelmin ekstrapoloitiin saadut arvot 1,2, 3,6 ja 6,0 kuukauteen, vastaavasti 4 °C:ssa.

Taulukko II

Mitattavan PSA:n prosentuaalinen 5 Näytematriisl häviö päiviä 35 8C:ssa_ 13 5

Muuntamaton 21 32 36

Muunnettu, pH 12 4 3 0

Muuntamaton 20 26 30 10 Muunnettu, pH 12 8 7 5

Taulukosta II käy selvästi ilmi, että PSA oli huomattavasti kestävämpi pH:n avulla muunnetussa seerumissa muuntamattomaan seerumiin verrattuna.

PSA:n saannon määritys 15 Määritettiin häviö mitattavalle PSA:lie, joka oli saatu siemennesteestä tai miespuolisten henkilöiden seerumista ja joka oli laimennettu käsittelemättömään seerumiin tai yllä kuvatulla tavalla muunnettuun seerumiin. Neljään putkeen, jotka sisälsivät 0,4 ml näytematriisiä, 20 lisättiin 0,1 ml 125 ng/ml PSA:a, joka oli peräisin siemennesteestä, jotta saatiin odotettu konsentraatio PSA:a, 25 ng/ml. Sitten erä kutakin liuostä laimennettiin suhteessa 1:1 miespuolisen henkilön seerumiin, joka oli aiemmin analysoitu, ja analyysin perusteella sisälsi 19,1 ng/ 25 ml PSA:a. Kunkin neljän putken PSA-pitoisuus arvioitiin käyttämällä kaupallisesti saatavaa "two-site"-immunoradio-metristä pitoisuusmääritystä, TANDEM®-r psa (Hybritech Incorporated, San Diego, California), käyttäen pidennettyä, neljän tunnin mittaista inkubointiaikaa. Saadut kon-30 sentraatiot sekä PSA:n laskettu, prosentuaalinen häviö on esitetty taulukossa III. Tulokset ilmaisevat selvästi erittäin tavoitellun saannon pH:n avulla muunnetun matriisin ollessa kysymyksessä, kun taas muuntamattomassa seerumissa tapahtuu PSA:n merkittävää häviötä.

10 87021

Taulukko III

Siemennesteestä saadun PSA:n lisäys PSA odotettu PSA havaittu PSA ng/ml ng/ml häviö-% 5 Muuntamaton seerumi 25,0 12,33 51 pH:n avulla muunnettu 25,0 24,16 3 seerumi

Liuosten laimennukset 1:1 humaaniseerumilla, joka sisältää PSA:a

10 PSA odotettu PSA havaittu PSA

ng/ml ng/ml häviö-%

Muuntamaton seerumi 15,72 15,29 3 pH:n avulla muunnet- 21,63 22,17 0 tu seerumi 15

Edellä esitetty kuvaus on kohdistettu kyseessä olevan keksinnön edullisiin suoritusmuotoihin patenttiasetuk-sen vaatimusten mukaisesti, valaisemaan ja selittämään kyseessä olevaa keksintöä. On kuitenkin selvää aiheeseen pe-20 rehtyneille, että muunnokset ja muutokset ovat mahdollisia.

Claims (22)

1. Menetelmä pysyvän, luonnosta peräisin olevan matriisin valmistamiseksi, joka sopii käytettäväksi etu- 5 rauhasen suhteen spesifisen antigeenin (PSA) määrittämiseen nestenäytteestä immunomäritysmenetelmän avulla, tunnettu siitä, että muunnetaan sopivalta nisäkkäältä saadun PSA:n biologinen, nestemäinen kantaja-aine säätämällä pH:ta, lisäämällä kaotrooppista ainetta tai 10 lämmöllä, biologisen nesteen PSA:n epävakaaksi tekevien komponenttien aktiivisuuden inhiboimiseksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologoinen neste käsittää verta, seerumia tai plasmaa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkäs on ihminen.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkäs on naispuolinen henkilö.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luonnosta peräisin olevaa matriisia käytetään kalibraattorimatriisina.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luonnosta peräisin olevaa 25 matriisia käytetään laimentimena.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunomääritysmenetelmä on monoklonaaliseen vasta-aineeseen pohjautuva immunometrinen määritysmenetelmä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunomääritysmenetelmä on kaksikohtainen immunometrinen määritysmenetelmä.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunometrinen määritysmene- 35 telmä käsittää radiometrisiä, entsymaattista tai fluoro-metrisia menetelmiä. 12 87021

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntamisvaiheessa, biologisen nesteen pH säädetään sellaiseen pH-arvoon ja sellaiseksi ajaksi, että biologiseen nesteeseen sisältyvien epä- 5 vakaaksi tekevien komponenttien aktiivisuus inhiboituu.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntamisvaihe käsittää edelleen biologisen nesteen pH;n noston ainakin noin pH 9:ään ajaksi, joka on tehokas inhiboimaan biologisen nesteen 10 komponenttien aktiivisuuden, sekä biologisen nesteen sitä seuraavan pH:n laskun noin pH 7:ksi.

11 87021

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun biologisen nesteen pH nostetaan noin pH 12:een.

13. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntamisvaihe käsittää biologisen nesteen käsittelyn kaotrooppisella aineella riittävän pitkän aikaa biologisen nesteen sisältämien, epävakaaksi tekevien komponenttien aktiivisuuden inhiboimisek- 20 si.

14. Menetelmä esirauhasen suhteen spesifisen antigeenin (PSA) stabiloimiseksi seerumipohjäisessä matriisissa käytettäväksi PSA:n määritykseen nestenäytteestä immu-nomääritysmenetelmän avulla, tunnettu siitä, että 25 muunnetaan seerumi, joka on saatu sopivalta naispuoliselta henkilöltä, säätämällä pH:ta, lisäämällä kaotrooppista ainetta tai lämmöllä, jotta inhiboidaan seerumin komponenttien aktiivisuus, joka tekee PSA:n epästabiiliksi.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että seerumipohjaista matriisia käytetään kalibraattorimatriisina.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seerumipohjaista matriisi- koostumusta käytetään laimentimena. i3 87021

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntamisvaihe käsittää edelleen seerumin pH:n muuttamisen ajaksi, joka on tehokas mainittujen seerumin komponenttien aktiivisuuden inhiboi- 5 miseksi.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muuntamisvaihe käsittää seerumin pH:n noston ainakin noin pH 9:ksi, ajaksi, joka on riittävä inhiboimaan mainittujen seerumin komponenttien 10 aktiivisuuden, sekä seerumin pH:n laskun noin pH 7:ään.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seerumin pH nostetaan noin pH 12 reen.

20. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että muuntamisvaihe käsittää see rumin käsittelyn katrooppisella aineella riittävän aikaa epävakaaksi tekevien seerumin komponenttien aktiivisuuden inhiboimiseksi.

21. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3, 4, 11 tai 12 mu- 20 kaisella menetelmällä valmistettu pysyvä, luonnosta peräi sin oleva matriisi.

22. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukaisella menetelmällä valmistettu pysyvä seerumipohjainen matriisi. 14 87021