JPS62235563A - エリスロポエチンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、エリスロポエチン（以下ＥＰＯと略称するこ
ともある）の測定方法に関するものである。

［従来の技術］ ＥＰＯは未熱な赤血球系前駆細胞に働き、分化増殖を誘
導する造血ホルモンの１つで、赤血球数を恒常的に保つ
上で非常に重要な役割を果ている。即ちＥＰＯは通常、
組織の酸素需要に応じて主に腎臓で産生され、体内の赤
血球量を調節する役割を担っている。低酸素状態では、
その産生が促進され、逆に高酸素系状態では、低く抑え
られている。

血中ＥＰＯ量を測定することは、組織における酸素需要
のバランスを知る上て非常に重要であり、またその他臨
床上、多数の有用な情報を得ることができる。例えば真
性多血症及び２次性多血症は、臨床上類似した多血症状
を示すが、その原因が全く異なり、その治療方法も異な
っている。

即ちそれらの症状における血中ＥＰＯ量は、前者では非
常に低値を示すのに対し、後者では、高値を示すが、血
中ＥＰＯを測定することにより両者を容易に区別でき、
適切な治療を行なうことができる、この様に、血中（又
は体液中）ＥＰＯ量を測定することは、臨床的に非常に
重要である。

ＥＰＯの測定には、マウスやラット等の小動物を用いる
バイオアッセイ法が一般的に知られていたが、該方法は
測定操作が煩雑なうえに、測定感度が悪く、臨床応用に
は至らなかった。また細胞培養技術の発達によって骨髄
細胞の培養が可能となり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッ
セイ法が確立し、測定感度の改善が行なわれたが、試料
中の夾雑物の影響を受けやすく、煩雑な操作を要する為
やはり臨床応用には至らなかった。

［発明が解決しようとする問題点］ 近年ＥＰＯと特異的に反応する抗体（以下特異抗体と呼
ぶ）を用いた免疫学的な測定法であるラジオイムノアッ
セイ法（ＲＩＡ法）が確立されたが、この場合、特異抗
体に結合した抗原と非結合の抗原の分離には２次抗体を
用い、生じた沈殿物（抗原−特異抗体−２次抗体の結合
物）を遠心操作により分離していた。しかし、この技術
は非常に煩雑であり、多くの時間を要するという欠点が
あった。特にＥＰＯの特異抗体は後述する理由によりア
フイニテイの低い場合が多く、一般的に行なわれている
前記遠心分離操作では（沈殿物と上清とを分別するのに
吸引操作が行なわれているが）多数の検体を処理する場
合、時間がかかり過ぎて測定誤差が大きくなるという欠
点を有し、臨床的に応用できる測定としては問題を残し
ていた。

本発明者らは上記の現状に鑑み、遠心分離の様な煩雑な
操作を必要とせず、極めて短時間に実施でき、且つ検出
精度の極めて高いＥＰＯの測定方法を鋭意研究し、ここ
に本発明を完成するに至った。

［問題点を解決する為の手段］ 上記問題点を解決し得た本発明は、エリスロポエチンと
特異的に反応する抗体を不溶性支持体に結合させた抗体
結合不溶性支持体、エリスロポエチンを含む被検液及び
標識エリスロポエチンを反応せしめて、前記不溶性支持
体上に少なくとも抗体−標識エリスロポエチン複合体を
形成させた後、抗体結合不溶性支持体に結合した標識エ
リスロポエチンの量を測定するか、若しくは抗体結合不
溶性支持体に結合しなかった標識エリスロポエチンの量
を測定することにより、前記被検液中のエリスロポエチ
ンの量を間接的に測定する点に要旨を有するＥＰＯの測
定方法である。

［作用］ 本発明は上述の如く構成されるが、要は特異抗体結合抗
原と非結合抗原の分離操作を施すに当たり、従来技術で
は２次抗体を用いていたのであるが、抗体を不溶性支持
体に結合させた抗体結合不溶性支持体を用いることにし
たので２次抗体の添加操作もなく、また分離のための遠
心操作をも不要とし、煩雑な操作を除去することを可能
とした。この様にして非常に簡便な血中ＥＰＯ測定方法
を実現した。即ち本発明法では不溶性支持体を用いるこ
とにより、直接反応液を測定するか、或は不溶性支持体
を洗浄する操作のみでＥＰＯの測定を行なうことができ
たのである。

本発明で用いる不溶性支持体は、ポリスチレン、ナイロ
ンなどの不溶性坦体であれば、何ら限定されるものでは
ないが、特にポリスチレンが好ましい、また不溶性支持
体の形状は、球状、棒状などいずれでもよいが、特に球
状が好ましい、これらの不溶性支持体に結合される特異
抗体は、ＥＰＯを比較的多量に産生じている再生不良性
貧血患者の尿から精製したＥＰＯｌ或は遺伝子組み換え
法で製造したＥＰＯなどを、ヒト以外の哺乳動物例えば
ウサギ、ラット、モルモット等の皮下に数回免疫し、得
られた抗血清を硫安沈殿。

ＤＥＡＥ・セルロースなどで精製して得られる。

そして特異抗体は、前記抗血清を硫安で沈殿させ適当な
緩衝液に沈殿物を溶解させた硫安分画抗体、或は前記硫
安分画抗体を更にＤＥＡＥ−セルロースで精製したＩｇ
Ｇ分画抗体のいずれを使用しても良いが、硫安分画抗体
の方が抗体の収率が高く、不溶性支持体を効率よく利用
できるため有利である。一般的には不溶性支持体に結合
される特異抗体としては、測定感度、特異性などを考慮
してＩｇＧ分画抗体が用いられているが、本発明では硫
安分画抗体でも利用できるのが利点である。即ち本発明
においては、前記硫安分画抗体を結合させた不溶性支持
体を用いても、測定感度、特異性、精度等格別の悪影響
を与える訳ではない。

このようにして得られた特異抗体のアフイニテイは、一
般的には非常に低いものが得られる。その理由としては
、ＥＰＯをヒト以外の動物に免疫した場合、ＥＰＯの代
謝が速いこと、投与したＥＰＯに対して動物が生理的に
反応して極度の貧血症状におちいることなどが考えられ
ているが、本発明ではこのようなアフイニテイの低い抗
体を用いても、短時間で操作できることにより極めて良
好な測定精度が得られる。

不溶性支持体に結合される特異抗体は、細胞融合法によ
り得られるモノクローナル抗体を用いてもよい、ＥＰＯ
に対するモノクローナル抗体の作製は、上記精製したＥ
ＰＯをマウスに免疫して得られた牌臓細胞と、ミエロー
マ細胞とをポリエチレングリコールなどで細胞融合させ
、）ＩＡＴ培地によるクローニングをくり返してモノク
ロナール抗体産生細胞を得、このモノクローナル抗体産
生細胞を培養して得ることができる（特開昭５９−１５
５３９５号公報参照）。

こうして得られたＥＰＯに対する特異抗体を不溶性支持
体に結合させるには、物理的方法、化学的共有結合法な
どいずれでも良いが、操作の簡便な物理的方法の方が好
ましい、物理的方法で特異抗体を不溶性支持体に結合さ
せるには、例えば抗体を適当な溶媒で抗体濃度１〜１０
００μｇ／　ｍｊｌに希釈した溶液に不溶性支持体を浸
漬し数時間から一夜放置した後、燐酸緩衝液等で洗浄す
ればよい。

この様にして得られた抗体結合不溶性支持体は牛血清ア
ルブミン、アジ化ナトリウム等の安定化剤を加えて保存
すれば、少なくとも１年は安定である。

次に、ＥＰＯの標識方法について説明する。

標識する物質としては、酵素、アイソトープ。

蛍光物質０発光物室、金属等が挙げられるが、アイソト
ープが好ましい、アイソトープは、３Ｈ。

＄２１１．１３１■等が例示できるが、１２６１が特に
好ましい。１２ＪによるＥＰＯの標識は、クロラミンＴ
法、ラクトースペルオキシダーゼ法、１０００−ＧＥＮ
法等があげられるがＩ　０００−ＧＥＮ法が特に好まし
い。

１２ＪによるＥＰＯの標識方法について説明する。クロ
ロホルムに溶解したｌ０ＤＯ−ＧＥＮ（１，３，４，６
−テトラクロロ−３α、６α−ジフエニルグリクリル：
約５０μｇ）をエッペンドルフマイクロチューブに入れ
、クロロホルムを気化することによりチューブ内壁にｌ
０ＤＯ−ＧＥＮを固定化した。該チューブ内へ精製した
ＥＰＯ（約１μｇ）、０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０）及びＮ　ａ　”’Ｉ　（０，５＋ａＣｉ）
を加え、反応後ヨウ化カリウム及びＢＳＡ等のタンパク
成分を含む反応停止液を加え反応を停止した後、ゲル濾
過にて未反応物を除去して１１１ＩＩｓ識ＥＰＯを調製
することができる。

以上の様にして得られた抗体結合不溶性支持体及びアイ
ソトープ標識ＥＰＯを用いてＥＰＯの量を測定する方法
を説明する。

まず適当な試験管に、既知量の標準エリスロポエチン或
は被検液の血清と、アイソトープ標識（１２’Ｉ）ＥＰ
Ｏ及びＲＩＡ反応緩衡液を入れ、各試験管に１個ずつ抗
体結合不溶性支持体を加え、４℃で１夜〜５日間インキ
エベートして前記不溶性支持体上に抗体−標識ＥＰＯ複
合体を形成した後、反応液中に回収されるアイソトープ
量、或はＰＢＳ　（燐酸塩緩衝食塩水）にて洗浄して不
溶性支持体に結合したアイソトープ量を測定し、既知量
・のＥＰＯにて作成した検量曲線と比較することにより
被検液中のＥＰＯ量を正確に測定することができる。

［実施例］ く特異抗体の作成〉 （ａ）ポリクローナル抗体の作成−エリスロポエチンに
対するポリクローナル特異抗体の作成は、純化ＥＰＯ（
貧血患者尿由来）を抗原として使用し、ウサギに対し次
のとおり３回の免疫を行なうことにより抗血清を作成し
、常法に従って■ｇＧ精製を行なうことにより行った。

第１回免疫−ＰＢＳ中に純化ＥＰＯを４００μｇ／ｆｆ
ｆＬとなる様に溶解し、これに等量のフロイント完全ア
ジュバントを混合して得たエマルジョン１．５ｍｆｔを
ウサギ（約２にｇ）に対しを椎にそって１５〜２０カ所
に皮下注射を行なって投与した。

第２回免疫−２週間後に、第１回免疫と同様の方ｔｔｘ
でエマルジョン１　　ｍｌ２を１０〜１５力に投与した
。

第３回免疫−さらに２週間後に、ＰＢＳに対し２００μ
ｇ／　ｍｌ２で溶解した抗原を用い、同様にして得たエ
マルジョン１　ｍｌを１０カ所に投与した。

第３回免疫の前日に少量の血液を試験採血し、その血清
中に含まれる抗ＥＰＯ活性を調べ、第３回免疫（最終免
疫）の１週間後に全採血を行ない、常法により血清分離
を行なって抗ＥＰＯ血清を得た。抗ＥＰＯ血清からの抗
ＥＰＯ−ＩｇＧの調製は常法に従い、５０％硫安沈殿。

ＤＥＡＥ−セルロース未吸着画分を取得することにより
行なった。

（ｂ）モノクローナル抗体の作成−前述した特開昭５９
−１５５３９５号公報に開示された方法に従い、免疫マ
ウス牌細胞とミエローマ細胞Ｎ５−１との細胞融合法に
より確立した抗エリスロポエチン・モノクローナル抗体
産生細胞を用い、常法に従い、本細胞を培養することに
よりモノクローナル抗体を作成した。

く抗体結合ポリスチレンビーズの作成〉前記の様にして
得られた特異抗体を、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム水
溶液にて１５μｇ／　ｍ１ｌ（ポリクローナル抗体）或
は５０μｓ／　ａｎ　（モノクローナル抗体）に希釈し
、ポリスチレンビーズを適当量添加し、４℃で一夜放置
した。その後燐酸緩衝液にて数回洗浄し、牛血清アルブ
ミンを含む保存液に浸漬して使用時まで保存した。

くエリスロポエチンのアイソトープ（１２ｓＩ）による
標識〉 ＋２ｓ■によるエリスロポエチンの標識は、固相触媒を
用いるｌ０ＤＯ−ＧＥＮ法により行なった。

即ち１．５ｉＩＩＪＺエツペンドルフマイクロチユーブ
に２．５ｍｇ／　ｍｕの濃度でクロロホルムに溶解した
１０ＤＯ−ＧＥＮ２０μＬを入れ、４０℃にてクロロホ
ルムを気化し、チューブの内壁にＩ　０ＤＯ−ＧＥＮを
固定した。当該チューブを０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）で洗浄した後、純化ＥＰＯ溶液（１Ｍ
ｇ７１０μｆｔ）１０μｍ、０．５Ｍ燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７，０）５μｍ及び、０．５＋＋＋Ｃ１Ｎａ
Ｉ２’Ｉ　（Ｎ　Ｅ　Ｚ−０３３）（，０，Ｉ　Ｎ−Ｎ
ａ０）ｉ水溶液１μｍに溶解）を加え、ボルテクサーで
攪拌し、３０秒間室温で反応させた後、予め用意した０
、５Ｍ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）に１０　ｆｆ１ｇ
／ｍ４となる様に溶解したＫＩ溶液８０μβ及び５％Ｂ
ＳＡを含むｐＢｓ溶ｔｌｓμ２を入れたエツベンドール
フチューブに移し、標識化反応を停止した０反応液を予
め０．１％ＢＳＡ及び０．０１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ
で平衡化したセファデックスＧ２５フアインカラムを用
い、ゲル濾過を行ない、未反応の１２Ｊを除去し、標識
化したＥＰＯ溶液ＺｏｏμＬを得た。その溶液に４００
μｍの０．１％ＢＳＡ及び０．０１％ＮａＮ、を含むＰ
ＢＳを加え、標識ＥＰＯ溶液を得た。尚木操作によりＥ
ＰＯは５０〜１５０μｃｉ／μｇに標識された。

く不溶性支持体を用いた血中ＥＰＯの測定〉（ａ）標準
検量曲線の作成−〇〜２９１８　ｍｕの標準ＥＰＯを含
む５％ＢＳＡ−ＰＢＳ１００μｍをプラスチックチュー
ブ（１、’ｌ　Ｃｍｌ　ｘ　８ｅ　１８栄研チユ一ブ１
号）に入れ、約２Ｘ１０’ｃｐｍの１゜！標識ＥＰＯを
含む０．２％Ｔｗｅｅｎ　２０−２　　ｍＭ　Ｅ　ＤＴ
Ａ−０，０２％ＮａＮ５−ＰＢＳ、１００μｊｌを加え
た後、ポリスチレンビーズを各チューブに１個ずつ入れ
た。４℃で３日間インキエベートした後、ＰＢＳにてポ
リスチレンビーズの洗浄を行ない、当該支持体の入った
プラスチックチューブをオートガンマ−カウンターにて
計測し、支持体に結合した＋２Ｊ量を測定した。非標識
ＥＰＯ不存在下において、支持体に結合したカウント（
Ｂｏ　）に対する多量の非標識ＥＰＯ共存下における支
持体に結合したカウントＣＢ）の割合（Ｂ／Ｂｅ）を、
非標識ＥＰＯ量に対してプロットした標準検量線は第１
図の如くである。その結果、ポリクローナル抗体結合支
持体を用いた場合、１ｍＵ〜７２９ｍＵにおいて、モノ
クローナル抗体結合ポリスチレンビーズを用いた場合は
、３６ｍＵ〜２９１６ｍＵにおいて夫々ＥＰＯの測定が
可能な標準検量曲線が得られた。

（ｂ）血中ＥＰＯの測定−上記ＥＰＯ標準検量曲線を基
準とし、各種疾患者血清中に含まれるＥＰＯ量を測定し
た。即ち、検量曲線は、前記方法に従って作成し、標準
ＥＰＯ（１００μＬ）に代えて、血清（１００ｕＪ２）
を用い、同様の操作を行ない、検量曲線に基づいて血清
中に含まれるＥＰＯ量を測定した。第１表にその結果を
示したが、従来法の遠心による抗体結合抗原と非結合抗
原の分離を行なう方法によって測定した結果を比較した
ところ、本方法が非常に有効であることが示された。

［発明の効果］ 以上述べた如く本発明によれば、既述の構成を採用する
ことによって、従来法における様な２次抗体を必要とす
ることなく、また煩雑な遠心分離操作も不要となり、非
常に簡便にＥＰＯの測定が可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明におけるＥＰＯの標準曲線を示すグラ
フである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エリスロポエチンと特異的に反応する抗体を不溶性支持
   体に結合させた抗体結合不溶性支持体、エリスロポエチ
   ンを含む被検液及び標識エリスロポエチンを反応せしめ
   て、前記不溶性支持体上に少なくとも抗体−標識エリス
   ロポエチン複合体を形成させた後、抗体結合不溶性支持
   体に結合した標識エリスロポエチンの量を測定するか、
   若しくは抗体結合不溶性支持体に結合しなかった標識エ
   リスロポエチンの量を測定することにより、前記被検液
   中のエリスロポエチンの量を間接的に測定することを特
   徴とするエリスロポエチンの測定方法。