NO168444B - Fremgangsmaate for fremstilling av en stabil, naturlig matriks til anvendelse ved immunologisk paavisning av psa - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en stabil, naturlig matriks til anvendelse ved immunologisk påvisning av prostata, spesifikt antigen (PSA) i et fluid. Disse og ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Prostata spesifikt antigen (PSA) som er et vel beskrevet tumor-assosiert antigen, er en betydningsfull markør for diagnose og prognose i forbindelse med prostatakreft. Ved at prostata-tumorceller frigir PSA til blodstrømmen vil PSA-konsentrasjonene i serum og andre kroppsvæsker følge utviklingen av primært karsinom eller metastase karsinom. Klinikerne får følgelig et effektivt middel for måling av terapi og de kan evaluere en reduksjon eller utvikling av sykdomstilstanden ved kvantifisering av PSA i en pasient.

De nåværende immunologiske tester for måling av PSA i væskeprøver fra pasienter som immuno-radiometrisk påvisning (IRMA) og enzym-bundet immunoabsorberende påvisning (ELISA) er avhengige av anvendelse av kunstige eller syntetiske matrikser som f.eks. bovint serumalbumin i form av matrikser for kalibrering og som fortynningsmidler. Som anvendt heri betegner uttrykket "kalibrerende matriks" en matriks hvor forhåndsbestemte konsentrasjoner av en antigen substans opprettholdes for kalibrering av ukjente antigenkonsentrasjoner i pasientprøvene. Uttrykket "fortynningsmiddel" som anvendt heri viser til en matriks som anvendes for fortynning av de pasientprøver som har så store antigenkonsentrasjoner at de overskrider måleområdet for den immunologe påvisning idet antigenkonsentrasjonen således kan måles innen måleområdet for den immunologiske påvisning.

Disse matrikser anvendes fordi ikke-modifiserte naturlige matrikser, som f.eks. serum-baserte matrikser, ansees upassende for anvendelse på grunn av at PSA er ustabil ved tilsetning til slike matrikser. Det er særlig vist at et tap av PSA-aktivitet på 30 - 7.0 % finner sted innen et døgn etter tilsetning til ikke-modifiserte matrikser basert på menneskeserum. Videre er dette tap av målbar PSA-aktivitet ikke begrenset til menneskeserum da PSA også er ustabil ved tilsetning til matrikser basert på bovint serum og på hesteserum.

På grunn av forskjellen mellom komponentene i slike matrikser og komponentene i en prøve vil kinetikk og ikke-spesifikke bindingsegenskaper i kunstige matrikser avvike betydelig fra serum eller andre kroppsvæsker som inneholder, eller ventes å inneholde PSA. Som et resultat av dette er anvendelse av disse matrikser følgelig en betydelig begrensning for PSA-bestemmelser ved hjelp av immunologisk påvisning.

For å maksimalisere nøyaktighet og sensitivitet for immunologisk påvisning' av PSA, må matriksen som anvendes for kalibrering og fortynning av prøvene være så identiske med pasientprøvene som mulig, særlig med hensyn til ikke-spesif ikke bindingsegenskaper.

Det er følgelig et behov for midler som kan gi stabilt PSA i naturlige matrikser, som serum-baserte matrikser; for anvendelse ved kvantitativ bestemmelse av PSA i pasient-prøver .

Den foreliggende; oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling, av en stabil, naturlig matriks til anvendelse ved immunologisk påvisning av PSA i et fluid. Det er således uventet funnet at naturlige matrikser med kinetikk og ikke-spesifikke bindingsegenskaper som svarer til dem i pasientprøver kan modifiseres slik at PSA er stabil i den nevnte matriks uten at matriksenes ønskelige egenskaper forandres i vesentlig grad.

I overensstemmelse med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse modifiseres derfor et biologisk bærerfluid for PSA oppnådd fra et passende pattedyr og med kinetikk og ikke-spesifikke bindingsegenskaper som er i alt vesentlig lik dem for en pasientprøve, for å inhibere aktiviteten av de komponenter i det nevnte fluid som virker destabiliserende på PSA. Det biologiske bærerfluid modifiseres ved forandring av pH fra normal pH på omtrent 7 til en pH på minst omtrent 9 over en tidsperiode for effektivt å inhibere aktiviteten av de komponenter i det nevnte fluid som virker destabiliserende på PSA. Deretter nedsettes pH i det nevnte biologiske fluid til omtrent 7.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringes en metode ved hvilke naturlige matrikser er modifisert til å stabilisere prostata-spesifikt antigen (PSA). I oppfinnel-sens sammenheng betyr uttrykket "naturlig matriks" en biologisk forekommende substans fremstilt ved levende prosesser og med en kinetikk og ikke-spesifikke bindingsegenskaper som er lik eller tilstrekkelig lik dem i en pasientprøve til å tillate at den nevnte substans anvendes som en matriks. Den stabile matriks kan anvendes for påvisning og/eller kvantitativ måling av PSA i fluide prøver fra en pasient ved hjelp av vanlig anvendte immunologiske prosedyrer.

De stabile, naturlige matrikser som er fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse kan anvendes som en kalibrerende matriks og/eller fortynningsmidler i immunologiske bestemmelser av PSA.

Immunologisk bestemmelse av antigenkonsentrasjoner i fluide prøver er velkjent for den fagkyndige på området og skal her ikke beskrives i detalj. Blant de immunologiske bestemmelser som særlig drar nytte av matriksen fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan det nevnes immunologisk bestemmelse basert på monoklonale antistoff som f.eks. "two-site" eller "sandwich" immunologisk bestemmelse som beskrevet i US patent nr. 4.376.110. Radiometriske, enzymatiske eller fluorescerende metoder kan anvendes i forbindelse med den immunologiske bestemmelse eller påvisning.

I overensstemmelse med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse anvendes det et biologisk fluid som er oppnådd fra et passende pattedyr. Fullblod, serum, plasma, cerebral spinalvæske eller urin kan passende anvendes, men det foretrukne fluid er serum fra blod fra et individ hvor tilstedeværelse av eventuelt sirkulerende PSA ikke er påviselig i betydelige konsentrasjoner. Serum fra blod fra et individ av hunkjønn er særlig foretrukket på grunn av fravær av sirkulerende PSA.

Ifølge fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse modifiseres foretrukket serum fra et individ av hunkjønn for å inhibere aktiviteten av de serum-komponenter som destabili-serer PSA. Da man ikke ønsker å bli bundet av noen teori når det gjelder ustabiliteten av PSA i ikke-modifisert serum, antar man at en slik ustabilitet, i det minste delvis, skyldes nærvær av sirkulerende prostata-antigenbindende protein (PABG). PABG som er tilstede i svært økte konsentrasjoner i serum hos menn med diagnosen prostata-karsinom, er også vist å være tilstede i normalt serum hos menn og kvinner. (Chu et al, Annals NYAS, vol. 417, side 383-389, 1983.)

Modifisering av kvinnelig serum for å tilveiebringe en stabil serum-basert matriks for PSA gjennomføres ved å øke pH til minst omtrent 9 over en tidsperiode som effektivt inhiberer aktiviteten av de serum-komponenter som virker destabiliserende på PSA. pH økes foretrukket i serum til omtrent 12 med inkubasjon i omtrent 5-45 minutter hvoretter pH nedsettes til omtrent 7. Dersom serumet må modifiseres for å gjennom-føre de nevnte pH-forandringer i henhold til fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse, kan dette gjennomføres ved hjelp av metoder som er vel kjente for den fagkyndige på området.

Ifølge fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse anvendes også chaotropiske midler for å inhibere aktiviteten av de nevnte komponenter. Blant de chaotropiske midler (dvs. midler som fører til forstyrrelser i den tertiære protein-struktur) som passende kan anvendes kan man nevne urea, KBr, Kl, KSCN, guanidin og MgCl2- Oppvarming anvendes også ved at det biologiske fluid oppvarmes og holdes ved en forhøyet temperatur i en tidsperiode som er tilstrekkelig til å inhibere aktiviteten av de nevnte serumkomponenter. De ovennevnte pH-forandringer er imidlertid særlig effektive for dette formål.

Fordelene med de stabile, naturlige matrikser som er fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er sammenliknet med syntetiske matrikser som vist i tabell I. Da de ikke-spesifikke bindingsegenskaper i slike stabile matrikser er sammenliknbare med dem for pasientprøver, økes sensitiviteten og nøyaktigheten i en immunologisk bestemmelse av PSA.

I tillegg vil stabiliteten av PSA i de naturlige matrikser som er modifisert i overensstemmelse med fremgangsmåten for oppfinnelsen gjøre slike matrikser meget effektive og ønskelige som kalibrerende matrikser og som fortynningsmidler i forbindelse med immunologiske bestemmelser av PSA i pasientprøver. Som vist i tabell II og III er PSA vesentlig mer stabil i slike matrikser sammenliknet med ikke-modifiserte, naturlige matrikser.

I denne forbindelse skal det også bemerkes at andre typer antigener som er ustabile ved tilføring til ikke-modifiserte, naturlige matrikser kan stabiliseres ved fremgangsmåten for oppfinnelsen og liknende resultater er oppnådd med det tumor-assosierte antigen kalsitonin.

De etterfølgende eksempler er gitt for bedre å illustrere den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel I

Fremstillin<g> av pH- modifIsert serum

Serum fra kvinner, oppnådd fra "the Interstate Blood Bank", Memphis, Tennessee og lagret ved -20°C, ble anvendt for fremstilling av en pH-modifisert naturlig matriks. 1000 ml serum ble innstilt til en pH på omtrent 12 ved tilsetning av 17 - 20 ml ION NaOH i et kar utstyrt med en røreinnretning. Den basiske serumløsning ble deretter inkubert i 30 minutter ved 22 - 28°C under omrøring, etterfulgt av justering av pH til omtrent 7,0, ved tilsetning av 15 - 17 ml 10N HC1. Oppløsningen med pH 7 ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 1000 x g og filtrert gjennom et filter med maskestørrelse 0,2 ym.

Alternativ metode for fremstilling av pH- modifisert serum Omtrent 0,30 ml - 0,50 ml 10N NaOH ble tilsatt under omrøring til 20 ml samleserum fra kvinner for å øke pH til 12,0. Det basiske serum ble inkubert i 30 minutter etterfulgt av tilsetning av 0,1 M natriumfosfat (0,27 6 g monobasisk natriumfosfat) under omrøring for å oppnå en forsiktig nedsettelse av pH. Deretter ble 0,40 ml - 0,60 ml 6N HCl tilsatt for å innstille pH til 6 og oppløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 2-3 timer. pH ble til slutt innstilt til pH 7 ved anvendelse av 0,10 ml - 0,5 ml IN NaOH.

Sammenlikning av ikke- spesifikk binding

Ikke-spesifikke bindingsverdier for prøver av syntetisk matriks bestående av 5 % bovint serumalbumin (Miles Labora-tories, Inc., Elkhart, Indiana); 2 % IgG (Pel-Freeze Biologicals, Rogers, Arkansas) ble sammenliknet med ikke-modifiserte prøver av kvinneserum og pH-modifiserte serum-prøver fremstilt som beskrevet over, og ikke-spesifikke bindingsverdier ble bestemt ved anvendelser av en kommersielt tilgjengelig "two-site" immunoradiometrisk bestemmelse, TANDEM-R PSA (Hybritech Incorporated, San Diego, California). Hver matriks ble evaluert ved 12 parallelle prøver ved anvendelse av 0,05 ml pr. rør i overensstemmelse med Tandem-R PSA, men med en utvidet inkubasjonstid på 4 timer.

Den etterfølgende tabell I viser gjennomsnittsverdien som er oppnådd for de syntetiske matrikser, de ikke-modifiserte serumprøver og de pH-modifiserte serumprøver. Resultatene er uttrykt i form av tellinger/minutt og konsentrasjon av PSA (ng/ml) i forhold til en standardkurve.

Fra tabell I ser man at de ikke-spesifikke bindingsverdier som er oppnådd for de ikke-modifiserte og pH-modifiserte serumprøver er sammenliknbare, mens de ikke-spesifikke bindingsverdier som er oppnådd for de syntetiske prøver er betydelig høyere.

Stabilitetsbestemmelse for PSA

En akselerert stabilitetsundersøkelse av PSA ble utført ved anvendelse av ikke-modifisert serum fra kvinner og pH-modifisert serum fremstilt som beskrevet over. 10 ul inneholdende 855 ng/ml PSA fra ubehandlet plasma ble fortynnet inn i 990 pl av hver matriksprøve og holdt ved en temperatur på 35°C. Stabiliteten av PSA som er vist i tabell II i form av tap av målbart PSA, ble bestemt for hver prøve ved henholdsvis 1, 3 og 5 døgn sammenliknet med en kontroll-prøve med en temperatur på -70°C. Ved prosedyrer som er velkjente for den fagkyndige på området kan de oppnådde verdiene ekstrapoleres til henholdsvis 1, 2, 3, 6 og 6,0 måneder ved 4°C.

Fra tabell II ser man tydelig at PSA var betydelig mer stabil i det pH-modifiserte serum sammenliknet med det ikke-modifiserte serum.

Bestemmelse av PSA

Tap av målbart PSA fra sædvæske eller serum fra menn fortynnet med ikke-behandlet serum eller modifisert serum som beskrevet over ble bestemt. I fire rør inneholdende 0,4 ml prøvematriks ble det tilsatt 0,1 ml sædvæske inneholdende 125 ng/ml PSA for å oppnå en forventet konsentrasjon på

25 ng/ml PSA. En prøve fra hver løsning ble deretter fortynnet i forholdet 1:1 i mannlig serum hvor mengden PSA på forhånd var bestemt til 19,1 ng/ml. I hvert av de fire rørene ble PSA-innholdet bestemt ved anvendelse av en vanlig anvendt "two-site" immunometrisk bestemmelse, TANDEM-R PSA, (Hybritech Incorporated, San Diego, California), med en inkubasjonstid på 4 timer. De oppnådde konsentrasjoner og prosent beregnet tap av PSA er vist i tabell III. Resultatene viser helt klart at PSA fordelaktig bestemmes i den pH-modifiserte matriks, mens det forekommer betydelig tap av PSA i det ikke-modifiserte serum.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en stabil, naturlig matriks til anvendelse ved immunologisk påvisning av prostata spesifikt antigen (PSA) i et fluid, karakterisert ved at et biologisk bærerfluid for PSA oppnådd fra et passende pattedyr modifiseres ved forandring av pH, ved tilsetning av et chaotropisk middel eller ved oppvarming for å inhibere aktiviteten av de komponenter i ovennevnte biologiske fluid som virker destabiliserende på PSA.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som biologisk bærerfluid anvendes blod, serum eller plasma, foretrukket fra et individ av hunkjønn.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved at modifiseringen gjennomføres ved regulering av pH i det, biologiske fluid.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at modifiseringen gjennomføres ved at pH i det biologiske fluid økes til minst 9, foretrukket til omtrent 12 over en tidsperiode fra 5-45 minutter hvoretter pH nedsettes til omtrent 7.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved at modifiseringen gjennomføres ved behandling av det biologiske fluid med et chaotropisk middel.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-5, for stabilisering av PSA i en serumbasert matriks for anvendelse ved immunologisk påvisning av PSA i et fluid, karakterisert ved at det anvendes et serum som er oppnådd fra et individ av hunkjønn.

7. Anvendelse av den stabile, naturlige matriks oppnådd ved fremgangsmåten som angitt i krav 1- 6, som en kalibrerende matriks og/eller et fortynningsmiddel.