DE2163315C3 - Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Description

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Diese Erfindung betrifft die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Blutserum und anderen biologischen Flüssigkeiten.

Die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten wird insbesondere für die klinische Diagnose eines Prostatacarcinoms verwendet. Ein bekanntes Symptom ist nämlich der erhöhte Gehalt an saurer Prostata-Phosphatase in Blut, Urin und anderen biologischen Flüssigkeiten.

Es sind einige Substrate, die auf die katalytische Aktivität der sauren Prostata-Phosphatase ansprechen, bekannt. Die diesbezüglich bekanntesten Substrate sind Phenolphosphat, Phenolphthaleinmonophosphat,

«-Naphthylphosphat, p-Nitrophenylphosphat und jS-Glycerophosphat. Des weiteren ist die Verwendung von Salzen des Thymolphthaleinmonophosphats bekanntgeworden. Es können jedoch auch andere saure Phosphatasen als die Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten vorkommen. In bedeutenderen Mengen kommen im allgemeinen im Blut die sauren Phosphatasen der Erythrocyten und der Blutplättchen vor. Bei der Verwendung eines der hier genannten Substrate zum Nachweis der sauren Prostata-Phosphatase entstehen Schwierigkeiten durch die Aktivität anderer saurer Phosphatasen, die, wenn vorhanden, eine positive Reaktion vortäuschen. Von den obengenannten Substraten· haben /J-Flycerophosphat und a-Naphthylphosphat die größte Spezifität für saure Prostata-Phosphatase, doch sogar diese sind nicht spezifisch genug.

Obwohl dieser Mangel mit Hilfe bekannter Inhibitoren, wie Tartrat oder Formalin, und Vergleich der Ergebnisse wesentlich verringert werden kann, sind solche Techniken doch relativ lästig. Überdies ist das Bestiniraungsverfahren, das ji-Glycerophosphat als Substrat verwendet, ziemlich schwierig durchzuführen.

Auch bei einer Verwendung des Magnesiumsalzes des Thymolphthaleinmonophosphats als Substrat hat CoIeman (vgl. Clinical Chemistry \2 (1966), 529) das beschriebene Verfahren angewendet Dieses Substrat hat er mit dem Calciumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats verglichen. Mit den beiden Substraten wurde jeweils einmal mit und einmal ohne Inhibitor der s?ure Phosphatase-Gehalt bestimmt Aus der Differenz beider Ergebnisse erhält man die Menge an saurer Prostata-Phosphatase. Wenn nun in der Literaturstelle konstatiert wird, daß als ausgewähltes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase das Calciumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats zu verwenden sei, also dieser Verbindung der Vorgang gegenüber dem Magnesiumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats gegeben wird, so beruht dies auf der raschen Ansprechbarkeit des Phenolphthaleinmonophosphats. Bei der Nacharbeitung des in der Literatur nur sehr knapp beschriebenen Versuchs sind zwar die jeweiligen Natriumsalze eingesetzt worden, doch konnte bestätigt werden, daß das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats g:anz bedeutend reaktionsfähiger als das Natriumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats ist und deswegen sehr viel rascher mit anderen sauren Phosphatasen als der sauren Prostata-Phosphatase reagiert. Wenn dementsprechend ein Serum mit einem Gehalt an einem Gemisch saurer Phosphatasen mit den beiden Natriunisalzen als jeweiligen Substrat untersucht wird, so zeigt das Natrium-phenolphthalein-monophosphat eine größere Aktivität, und zwar aus zwei Gründen. Einmal ist das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats bedeutend empfindlicher gegenüber bestimmten anderen sauren Phosphatasen als gegenüber der sauren Prostata-Phosphatase. Zum zweiten ist das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats gegenüber saurer Prostata-Phosphatase reaktionsfähiger. Es ist jedoch bekannt, daß das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats eine außerordentlich größere Reaktionsfähigkeit gegenüber anderen sauren Phosphatasen als gegenüber saurer Prostata-Phosphatase besitzt, die ein erstes Problem darstellt, wemii sich die Untersuchung auf saure Prostata-Phosphatase richten soll, da die stattfindende Reaktion ein positiv falsches Ergebnis in dem Sinne liefern kann, daß die angezeigte saure Phosphatase-Reaktivität in erster Linie auf anderen sauren Phosphatasen als der sauren Prostata-Phosphatase beruht und daß somit das Vorliegen von saurer Prostata-Phosphatase in klinisch signifikanten Mengen verschleiert werden kann. Unter den zahlreichen im Blut aufgefundenen sauren Phosphatasen ist die saure Prostata-Phosphatase nur eine der Phosphatasen von höchstem klinischen Interesse. Aus diesen Gründen war es bisher üblich, zwei saure Phosphatase-Bestimmungen durchzuführen. Bei der ersten Bestimmung wird die gesamte saure Phosphatase Reaktionsfähigkeit unter bezug auf das jeweilig eingesetzte Substrat, z. B. das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats, gemessen. Bei der zweiten Bestimmung wird in genau der gleichen Weise verfahren, jedoch mit der Ausnahme, daß ein Inhibitor für die saure Prostata-Phosphatase vorhanden ist. Die Differenz bei der sauren Phosphata-

se-Aktivität bei den beiden Bestimmungen wird dann errechnet und als Maß für die Menge der vorliegenden sauren Prostata-Phosphatase im Serum genommen. Auch dieses Verfahren zeigt nicht in wünschenswerter Genauigkeit das Vorhandensein von saurer Prostata-Phosphatase an.

Aufgabe dieser Erfindung war es daher, ein Substrat zu finden, das spezifischer für saure Prostata-Phosphatase als die bisher bekannten Substrate ist. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung war, ein zuverlässiges diagnostisches Verfahren für die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase anzugeben, das einfach ist und mit den üblichen und bereits vorhandenen Laborgeräten durchgeführt werden kann.

Gegenstand dieser Erfindung ist somit ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten durch Inkubation einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit einem Alkali- oder Erdalkalisalz des Thymolphthaleinmonophosphats als Substrat in einem wäßrigen Medium bei saurem pH-Wert und Messen der Menge des während einer bestimmten Dauer umgesetzten Substrats gegen einen Leerwert.

Dieses Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß sowohl der Meßwert als auch der Leerwert in einem von Inhibitoren für saure Prostata-Phosphatase freien Medium bestimmt werden, wobei der Leerwert mit einer reinen Lösung des als Substrat verwendeten Salzes des Thymolphthaleinmonophosphats erhalten wird.

Obwohl das Natriumsalz vorzuziehen ist, können noch andere Saize des Thymolphthaleinmonophosphats verwendet weiden, insbesondere die Salze der anderen Alkalimetalle, z. B. Kalium, und die Salze der Erdalkaümetalle. Es versteht sich, daß zu den Salzen der Erdalkalimetalle die Magnesiumsalze gehören.

Gemäß einem Vorschlag kann das Magnesiumthyrr.olphthaleinmonophosphat als Substrat für den Nachweis und die quantitative Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Blutserum verwendet werden, wobei man im allgemeinen bei pn IO in einer gepufferten Lösung arbeitet. Dieses Enzym tritt vor allem bei Osteoblastentätigkeit bei Erkrankungen der Leber und der Galle bei Schwangerschaft sowie bei lkterusver-Schluß auf. Erniedrigte Werte werden bei Hypophosphatas'e und Unterernähtung beobachtet. Daher besteht kein Zusammenhang mit der Bildung der sauren Prostata- Phosphatase.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von allgemeinen Ausführungen und einem speziellen Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Die erfindungsgemäße Bestimmungstechnik ist einfach. Eine abgemessene Menge Serum oder anderer biologischer Flüssigkeit wird zu einer auf einen sauren PH-Wert gepufferten Substratlösung zugesetzt. Es wird bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit inkubiert. Während der Inkubation wird Thymolph enolphthalein freigesetzt, am Ende der Inkubationszeit wird die Lösung alkalisch gemacht, dadurch die Enzymreaktion gestoppt und die Farbe des Thymolphenolphthaleins voll entwickelt. Sie bleibt für miir.destens zwei Stunden stabil. Der Test wird gegen einen Leerwert bestimmt und die erhaltene Absorption mit den Absorptionen, die mit reinen Thymolphenolphtha- ή₅ leinlösungen in verschiedenen Konzentrationen erhalten wurden, verglichen. Die Ergebnisse werden in internationalen Einheiten (I.U.) angegeben, d. h. Mikromole Substrat, die je Minute und je Liter biologischer Flüssigkeit umgesetzt werden. Der Vorteil der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode liegt nicht nur in der einfachen Technik, sondern aueh in der Verwendung stabiler Reagentien, so daß die Möglichkeit der Eichung durch Verwendung einer Grundstandardlösung besteht

Ein anderer Vorteil der Methode ist, daß die Reaktion, gegen die Inkubationszeit aufgetragen, über einen großen Bereich der Enzymkonzentration nullter Ordnung ist Bei entsprechenden Versuchen waren die Aktivitäten aus verschiedenen Verdünnungen von Prostatacarcinom-Serum und «,ostataextrakt der Enzymkonzentration bis 110 LU. proportional, das entspricht etwa dem 300fachen der normalen oberen Grenze. Bei Inkubationszeiten von 10 bis 120 Minuten war die Reaktion bis zu einer Aktivität von 110 I.U. linear.

Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Methode ist ihre gute Spezifität für saure Prostata-Phosphatase; saure Nicht-prostata-Phosphatase-Isoenzyme, die für das falsche positive Ergebnis auf saure Prostata-Phosphatase verantwortlich sind, stören weniger als bei der Verwendung anderer bekannter Substrate.

Genauer gesagt ist die Aktivität oder Affinität der sauren Erythrocyten-Phosphatase zu Phenolphosphat etwa 83miil größer als zu Natriumthymolphthalein-monophosphat. Das ist von größter diagnostischer Bedeutung, da die saure Erythrocyten-Phosphatase gewöhnlich zusätzlich zu jeder sauren Prostata-Phosphatase in Blutserum enthalten ist und ihre Reaktivität mit Phenolphosphat so groß ist, daß sie die Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase stört oder verschleiert. Andererseits ist bei Verwendung des Natriumthymolphthalein-monophosphats als Substrat für ein Serum, das saure Prostata-Phospliatase zusammen mit saurer Erythrocyten-Phosphatase enthält, die Aktivität der sauren Erythrocyten-Phosphatase verglichen mit der Aktivität der sauren Prostata-Phosphatase so schwach, daß ein positives Ergebnis quantitativ für die Anwesenheit von saurtr Prostata-Phosphatase im Serum spricht. Der erhaltene positive Wert liegt zwar über den Standardwerten dieser Methode, bestimmt im Serum von Männern ohne Leber- oder Nierenerkrankungen oder Geschwüren. Der Standardwert für diese Methode beträgt etwa von 0,04 bis 0,37 I.U.

Auch verglichen mit anderen bekannten Substraten folgt die Spezifität des Natriumthymolphthalein-monophosphats diesem allgemeinen Schema. So sind Phenolphthaleinmonophosphal und p-Nitrophenolphosphat 500mal aktiver mit saurer Erythrocyten-Phosphatase als das Nairiumsalz von Thymolphthaleinmonophosphat, während «-Naphthylphosphat dreimal aktiver ist. Obwohl man die Aktivität der sauren Erythrocyten-Phosphatase, die die Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase stört, durch Tartrat oder Formalin hemmen kann, hat die erfindungsgemäße Methode den praktischen Vorteil der größeren Einfachheit, da solche Hemmstoffe nicht notwendig sind.

Ein anderes saares, Phosphatase-isoenzym, das gewöhnlich zusätzlich zur sauren Prostata-Phosphatase im Blutserum vorkommt, ist saure Blutplättchen-Phosphatase. Hier ist die Spezifität des Natriumthymolphthalein-monophosphats auf saure Prostata-Phosphatase ebenfalls größer als bei den anderen Substraten. Phenolphosphat und Phenolphthaleinmonophosphat sind etwa 5mal aktiver mit saurer Blutplättchenpho-

sphatase als das Natriumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats. a-Naphthylphosphat hat etwa die gleiche Aktivität, p-NitrophenoIphosphat ist etwa 16mal aktiver und jS-Glycerophosphat etwa viermal aktiver. Außer bei Phenolphthaleinmonophosphat kann weder Tartrai noch Formalin diese Störungen beseitigen.

Im normalen Blutserum kommen als störende saure Phosphatasen in größeren Mengen nur saure Erythrocyten-Phosphatasen und saure Blutplättchen-Phosphatase vor. Dementsprechend zeigt ein positives Ergebnis, das über dem Normalwert von Blutserum liegt, die Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphatase an. Es ist nicht notwendig, weitere Tests mit einem Inhibitor, wie Tartrat oder Formalin, durchzuführen.

Das Natriumsalz des Thymolphthalein-monophosphats kann auch zur Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase in anderen Körperflüssigkeiten, wie Urin, verwendet werden, obwohl die Störanfälligkeit der erfindungsgemäßen Methode dann größer ^t als mit Blutserum.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei saurem PH-Wert durchgeführt Obwohl der pH-Wert nicht kritisch ist, ist ein pH-Wert von 5,5 bis etwa 6,4 vorzuziehen, da normalerweise bei einem PH-Wert von 6 die größte Aktivität erreicht wird. Diese ph-Werte werden bei 25°C gemessen. Jeder angemessene Puffer kann verwendet werden, obwohl gewöhnlich ein Citrat- oder Acetatpuffer eingesetzt wird. Die Reaktion beginnt sofort und verläuft bis zu 35 Minuten linear. Im Norrnalfall wird 30 Minuten lang bei 37^CC inkubiert. Die Konzentration des erfindungsgemäßen Substrats ist nicht kritisch, da die Aktivität bis zu einem Optimum von etwa 2,2 mMol Substrat pro Liter steigt, um dann wieder abzufallen. Die vorzuziehende Substrat-Konzentration liegt etwa bei 1,5 bis 3 mMol pro Liter.

Ausführungsbeispiel

Zu einem 0,1 molaren Citratpuffer (Citronensäure plus Natriumeitrat) wird genügend Natriumthymoiphthalein-monophosphat zugesetzt, um eine Konzentration von 22 mMol pro Liter zu erreichen. Der p_H-Wert der Lösung ist 6 bei 25⁰C. 1,0 ml des gepufferten Substrats wird mit 0,2 ml Serum 30 Minuten lang bei 37° C inkubiert. Bei Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphatase wird aus dem Substrat Tiiymolphthalein freigesetzt, und zwar in um so größeren Mengen, je mehr saure Prostata-Phosphatase in der Serumprobe vorhanden ist. Am Ende der Inkubationszeil werden 5 ml eines Reagens, das 0,05 Mol Natriumcarbonat und 0,05 Mol Natriumhydroxid je Liter enthält, zugesetzt, wodurch die enzymatische Reaktion unterbrochen und gleichzeitig die Farbe des freigesetzten Thymolphthaleins voll entwickelt wird. Die erhaltene Absorption wird vorzugsweise mit einem Spektrophotometer bei 590 nm bestimmt und mit den Absorptionen, die mit reinen Thymolphthaleinlösungen erhalten und gegebenenfalls auf einem Diagramm festgehalten wurden, verglichen. Man kann auch ein Colorimeter verwenden. Der Test wird gegen einen Leerwert abgelesen und jede Aktivität, die, wie oben beschrieben, üuer dem Standardwert liegt, wird in internationalen Einheiten angegeben.

In der Praxis wird eine trockene Mischung von Substrat und Puffer in einer Ampulle vorbereitet, so daß man nach Zugabe einer bestimmten Menge an destilliertem Wasser eine Lösung erhält, die eine vorher festgelegte Molarität an Substrat und Puffer hat, um damit die gewünschte Anzahl von Bestimmungen durchführen zu können.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung saurer Prostata- Phosphatase in biologisehen Flüssigkeiten durch Inkubation einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit einem Alkali- oder Erdalkalisalz des Thymolphthaleinmonophosphats als Substrat in einem wäßrigen Medium bei saurem pH-Wert und Messen der Menge des während einer bestimmten Dauer umgesetzten Substrats gegen einen Leerwert, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl der Meßwert als auch der Leerwert in einem von Inhibitoren für saure Prostata-Phosphatase freien Medium bestimmt werden, wobei der Leerwert mit einer reinen Lösung des als Substrat verwendeten Salzes des Thymolphthaleinmonophosphats erhalten wird

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalisalz des Thymolphihaleinmonophosphats dessen Natriumsalz verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß das Thymolphthaleinmonophosphat-Substrat in einer gepufferten Lösung des Blutserums inkubiert und die Menge des umgesetzten Substrats bestimmt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion durch Einstellen eines alkalischen pH-Wertes unterbrochen und die Menge des freigesetzten Thymolphthaleins nach Entwickeln der Farbe kolorimetrisch bestimmt wird.