DE2163315A1 - Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents
Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen FlüssigkeitenInfo
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Description
V/ORTHINGTOiT BIOCHEMICAL CORPORATION,
Freehold, New Jersey, V.St.A.
Freehold, New Jersey, V.St.A.
" Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung
saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten "
j Priorität: 21. Dezember 1970, Y.St.A., Nr. 100 345
Diese Erfindung betrifft den Nachweis und die quantitative Bestimmung von Enzymen in biologischen Flüssigkeiten. Sie betrifft
insbesondere den Nachweis und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase in Blutserum und anderen biologischen
Flüssigkeiten,
Der Nachweis und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten wird insbesondere
für die klinische Diagnose eines Prostatacarcinoma verwendet. Ein bekanntes Symptom ist nämlich der erhöhte Gehalt
an saurer Prostata-Phosphatase in Blut, Urin und anderen biologischen Flüssigkeiten, *
EfJ sind einige Substrate, die auf die katalytische Aktivität der sauren Proatata-Phosphatas© ansprechen, bekannt. Die diesbezüg-
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lieh bekanntesten Substrate sind Phenolphosphat, PhenolphthaiGinmonophosphat,
»-Naphthylphosphat, p-Nitrophenylphosphat
und ß-Glyeerophosphat. Es können jedoch auch andere
saure Phosphatasen als die Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten vorkommen. In bedeutenderen Mengen kommen im all-,
gemeinen im Blut die sauren Phosphatasen der Erythrocyten und der -ulutplättchen vor. Bei der Verwendung eines der hier genannten
Substrate zum Nachweis der sauren Prostata-Phosphatase
entstehen Schwierigkeiten durch die Aktivität anderer saurer . Phosphatasen', die, wenn vorhanden, eine positive Reaktion vortäuschen.
Von den oben genannten Substraten haben ß-Glycerophosphat
und tf-Naphthylphosphat die grösste Spezifität für saure
Prostata-Phosphatase, doch sogar diese sind nicht spezifisch genug.
Obwohl dieser Mangel mit Hilfe bekannter Inhibitoren, wie Tartrat oder Formalin, und Vergleich der Ergebnisse
wesentlich verringert werden kann, sind solche Techniken doch
relativ lästig. Überdies ist das Bestimmungsverfahren, das ß-Glycerophosphat als Substrat verwendet, ziemlich schwierig .
W durchzuführen. ·
Aufgabe dieser Erfindung war daher, ein Substrat zu finden, das
spezifischer für saure Prostata-Phosphatase als die bisher bekannten Substrate ist. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung
war, ein zuverlässiges diagnostisches Verfahren für den Nachweis und die Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase anzugeben,
das einfach ist und mit den üblichen und bereits vorhandenen
Labargeräten durchgeführt werden kann. * -
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Gegenstand dieser .Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis
und/oder zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten t wobei ein Substrat
zusammen mit der enzymhaltigen Flüssigkeit in einem wässrigen Medium bei saurem p„-Wert inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet,
dass als Substrat ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz des Thymolphthaleinmonophosphats verwendet wird.
Obwohl das Natriumsalz vorzuziehen ist, können noch andere Salze des Thymolphthaleinmonophosphats verwendet werden, insbesondere
die Salze der anderen Alkalimetalle, z.B. Kalium, und die Salze der Erdalkalimetalle. Es versteht sich, dass zu den Salzen der
Erdalkalimetalle die Magnesiumsalze gehören.
Gemäss einem Vorschlag.· kann das Magnes iumthymolphthal einmoophosphat
als Substrat für den Nachweis und die quantitative Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Blutserum verwendet
werden, wobei man-im allgemeinen bei pH 10 in einer gepufferten
Lösung arbeitet. Dieses Enzym tritt vor allem bei Osteoblastentätigkeit bei Erkrankungen der Leber und der Galle bei Schwangerschaft
sowi-e bei Ikterusversehluss auf. Erniedrigte Werte werden bei Hypophosphätasie und Unterernährung beobachtet. Daher
besteht kein Zusammenhang mit der Bildung der sauren Prostata-Phosphat
as e.
Die erfindungsgemäßoe Bestimmungstechnik ist einfach. Eine abgemessene
Menge Serum oder anderer biologischer Flüssigkeit v/ird zu einer auf einen sauren p„-V/ert gepufferten Substratlößung
zugesetzt. Eu v/ird bei einer bestimmten Temperatur für
bestimmte Zeit inkubiert. Während der Inkubation wird
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Thymolphenolphthalein freigesetzt, am Ende der Inkubationszeit ■
v/ird die Lösung alkalisch gemacht, dadurch die Enzymreaktion gestoppt und die Farbe des Thymolphenolphtnaleins \roll entwikkelt.
Sie bleibt für mindestens zwei Stunden stabil. Der Test wird gegen einen leerwert bestimmt und die erhaltene Absorption
mit den Absorptionen, die.mit reinen Thymolphenolph-thaleinlösungen
in verschiedenen Konzentrationen erhalten wurden, verglichen. Die Ergebnisse v/erden in internationalen Einheiten
(I.U.) angegeben, d.h. Mikromole Substrat, die je Minute und je
w Liter biologischer Flüssigkeit umgesetzt werden. Der Vorteil
der erfindungsgemäs-sen Bestimmungsmethode liegt nicht nur in dereinfachen
Technik, sondern auch in der Verwendung stabiler Reagentien, so dass die Möglichkeit der Eichung durch Verwendung
einer Grundstandardlösimg besteht.
Ein anderer Vorteil der Methode ist, dass die Reaktion, gegen die Inkubationszeit aufgetragen, über einen grossen Bereich der Enzymkonzentration
nullter Ordnung ist. Bei entsprechenden Versuchen waren die Aktivitäten aus verschiedenen Verdünnungen -von
Prostatacarcinom-Serum und Prostataextrakt der Enzymkonzentration bis zu 110 l.U. proportional, das entspricht etwa dem
JOO fachen der normalen oberen Grenze. Bei Inkubationszeiten von
10 bis 120 Minuten war die Reaktion bis zu einer Aktivität von
UO l.U. linear.
Ein wesentlicher Vorteil der erfindungsgemässen Methode ist ihre
gute Spezifität für saure Prostata-Phosphatase; saure· Nicht-Pro stata-Phosphatase-1soenzyme, die für das falsche positive
Ergebnis auf saure Prostata-Phosphatase verantwortlich sind,
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stören weniger als bei der Verwendung anderer bekannter Substrate.
Genauer gesagt ist die Aktivität oder Affinität der sauren Erythrocyten-Phosphatase zu Phenolphosphat etwa 88 mal grosser
als zu Watriurathymolphthaiein-monophosphat. Das ist von grösster
diagnostischer Bedeutung, da die saure Erythrocyten-Phosphatase gewöhnlich zusätzlich zu. jeder sauren Prostata-Phosphatase
in Blutserum enthalten ist und ihre Reaktivität mit Phenolphosphat so gross' ist, dass sie die Bestimmung der sauren
Prostata-Phosphatase stört oder verschleiert Andererseits ist·
bei Verwendung des Natriumthymolphthalein-monophosphats als Substrat für ein Serum, das saure Prostata-Phosphatase zusammen
mit saurer ErythrOcyten-Phosphatase enthält, die Aktivität der sauren Erythrocyten-Phosphatase verglichen mit der Aktivität der
sauren Prostata-Phosphatase no schwach, da3s ein positives Ergebnis
quantitativ für die Anwesenheit von saurer Prostatäjfhosphatase
im Serum spricht. Der erhaltene positive Wert liegt zwar über den Normalv/erten dieser Methode, bestimmt im Serupi
von Härmern ohne Leber- oder Nierenerkrankungen oder Geschwüren. Der Normalwert für diese Methode beträgt etwa von 0,04 bis
0,37 I.U.
Auch verglichen mit anderen bekannten Substraten folgt die Spezifität des ' Natriumthymolphthalein-monophosphats diesem
allgemeinen Schema» So sind Phenolphthaleinmonophosphat und'
p-Nitrophenolphosphat 500 mal aktiver mit saurer Eryjbhrocyten-Phosphatase
als das Natrium«alz von Thymolphthaleinmonophosphat,
während tf-Naphthylphosphat dreimal aktiver ist. Obwohl
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man die Aktivität der sauren Erythrocyten-Phosphatase, die die
Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase stört, durch Vartrat
oder Formalin hemmen·kann, hat die erfindungsgemässe Methode
den praktischen Vorteil der grösseren Einfachheit, da solche Hemmstoffe nicht notwendig sind.
Ein anderes saures Phosphatase-Isoenzym, das gewöhnlich zusätzlich
zur sauren Prostata-Phosphatase im Blutserum vorkommt,
ist saure Blutplättchen-Phosphatase. Hier ist die Spe- \ zifität des Natriumthymolphthalein-monophosphatBauf saure
Proatata-Phosphätase ebenfalls grosser als bei den anderen
Substraten. Phenolphosphat und Phenolphthaleinmonophoaphat sind etwa 5 mal aktiver mit saurer Blutplättchenphosphatase als das
Matriumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats, o(-Naphthyl-.
phosphat hat etwa die gleiche Aktivität, p-Nitrophenolphosphat
ist etwa 16 mal aktiver und ß-Glyeerophospliat etwa viermal aktiver.
Ausser bei Phenolphthaleinmonophosphat kann weder
Tartrat noch Pormalin diese Störungen beseitigen.
" Sn normalen Blutserum kommen als störende saure Phosphatasen
in grösseren Mengen nur saure Erythrocyten-Phosphataoen und
saure Blutplättchen-Phoaphatase vor. Dementsprechend zeigt ein positives Ergebnis, dass über dem Normalwert von Blutserum liegt,
die Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphataae an. Es ist
nicht notwendig, weitere Tests mit einem Inhibitor, wie Tartrat oder Formalin, durchzuführen.
Das Natriumaalz des Thymolphthulein-monophosphabs kann auch
zur Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase in anderen KörperflUasigküiten,
wie Urin, verwendet werden, obwohl die Storan«
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fälligkeit der erfindungsgemässen Methode dann grosser ist als
mit Blutserum.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird bei saurem p^-Wert durchgeführt.
Obwohl der p^-Wert nicht kritisch ist, ist ein p.T-Wert
von 5,5 bis etwa 6,4 vorzuziehen, da normalerweise bei einem • PjT-Wert von 6 die grösste Aktivität erreicht wird. Diese p„-Werte
v/erden bei 25 C gemessen. Jeder angemessene Puffer kann verwendet werden, obwohl gewöhnlich ein Citrat- oder Acetatpuffer
eingesetzt wird. Die Reaktion beginnt sofort und verläuft bis zu 35 Minuten linear. Im Norinalfal] -vp.rd 30 Minuten
lang bei 37 C inkubiert. Die Konzentration des erfindungsgemässen
Substrats ist nicht kritisch, da die Aktivität bis zu einem Optimum von etwa 2,2 mMol Substrat pro Liter steigt,
um dann wieder abzufallen. Die vorzuziehende Substrat-Konzentration liegt etwa bei 1,5 bis 3 mMol pro Liter.
Das Verfahren der, Erfindung wird durch das. folgende Beispiül
erläutert,
Ausführungsbeispiel
Zu einem 0,1 molaren Gitratpuffer (Citronensäure plus Hatriumcitrat)
wird genügend Natriumthymolphthalein-nionophosphat zugesetzt,
um eine Konzentration von 2,2 inMol pro Liter zu erreichen.
Der p„-Wert der Lösung ist 6 bei 25-G. 1,0 ml des gepufferten
Substrats wird mit 0f2 ml Serum 30 Minuten lang bei
37 C inkubiert. Bei Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphataee
wird aus dem Substrat Thymolphthalein freigesetzt, und zwar
in um" so grösseren Mengen, je mehr saure Prostata-Phosphatase
in der Serumprobe vorhanden ist. Am Ende der Inkubationszeit
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werden 5 ml eines Heavens, das 0,0p Hol Natriumcarbonat und
0,05 Mol Natriumhydav: ·:;<! je Liter enthält, zugesetzt, wodurch
die enzyniatische Iku " -on unterbrochen und gleichzeitig die
Farbe des freigeaei:;;. f η l'hymolphthaleina voll entwi ekelt wird.
Die erhaltene Absorption wird vorzugsweise mit einem Spektruphotometer
bei 590 nm bestimmt und mit den Absorptionen, die
mit reinen 'J-hymolphthaleinlösungen erhalten und gegebenonfallü
auf einem Diagramm festgehalten wurden, verglichen. Man kann auch ein Colorimeter verwenden. Der Test wird gegen einen Leerwert
abgelesen und jede Aktivität, die, wie oben beschrieben, über dem Normal'wert liegt, wird in internationalen Einheiton
angegeben.
Jn der Praxis wird eine trockene Mischung von Substrat und
Puffer in einer Ampulle vorbereitet, so dass man nach Zugabe einer bestimmten Menge an destilliertem Wasser eine Lösung erhält,
die eine vorher festgelegte Molarität an Substrat und
Puffer hat, um damit die gewünschte Anzahl von BeStimmungen
durchführen zu können.
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Claims (3)
1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten,
wobei ein Substrat zusammen mit der enzymhaltigen Flüssigkeit in einem wässrigen Medium bei saurem ρ,,-V/ert inkubiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat
ein Alkali- oder Erdalkalimetallsalz des Thymolphthaleinmonophosphats
verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Natriumsalz von Thymolphthaleinmonophosphat verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase im Blutserum, dadurch gekennzeichnet,
dass das Thymolphtnaleinmonophosphat-Substrat in einer
gepufferten Lösung des Blutserums inkubiert und die Menge des umgesetzten Substrats bestimmt wird.
4-r Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
enzymatische Reaktion durch Einstellen eines alkalischen p„-Wertes unterbrochen und die Menge des freigesetzten
Thymolphthaieins nach Entwickeln der Farbe kolorimetrisch bestimmt
v/ird.
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Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10034570 | 1970-12-21 | ||
US00100345A US3823071A (en) | 1970-12-21 | 1970-12-21 | Prostatic acid phosphatase determination |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
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DE2163315B2 DE2163315B2 (de) | 1976-09-16 |
DE2163315C3 DE2163315C3 (de) | 1977-05-05 |
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Also Published As
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CA975268A (en) | 1975-09-30 |
US3823071A (en) | 1974-07-09 |
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FR2120776A5 (de) | 1972-08-18 |
ES397269A1 (es) | 1974-04-16 |
JPS5137040B1 (de) | 1976-10-13 |
DE2163315B2 (de) | 1976-09-16 |
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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