DE3103612A1 - "verfahren und reagens zur bestimmung von chlorid im blutserum" - Google Patents
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Description
"Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Chlorid im
Blutserum"
Beanspruchte Priorität:
4. Februar 1980, V.St.A., Nr. 118,215
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagens für die direkte quantitative Bestimmung von Chlorid im Blutserum.
Es ist in der Biologie seit langem bekannt, daß Chlorid das extrazelluläre Hauptanion in biologischen Flüssigkeiten ist.
Die Bewegung des Chlorids in die rote Zelle und aus der roten Zelle ist wesentlich für den Transport von Bicarbonationen
in Antwort auf sich verändernde Mengen von Kohlendioxid. Erhöhte, Chloridwerte im Serum deuten im allgemeinen
auf Entwässerung, Hyperventilation, Herzinfarkt, Harnwegobstruktion durch Prostata oder andere Leiden hin. Niedrige
Serumchloridwerte findet man bei ausgedehnten Verbrennungen, übermäßigem Erbrechen, metabolischer Acidose, Nephritis,
Darmverschluß, Addisonkrise und Diarrhöe.
130083/0615
3NTO: DEUTSCHE BANK KQ. M
POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN 50175-809 · BANKKON
MÖNCHEN, LEOPOLDSTRASSE 71. KONTO-NR. W/3578«
Das früheste praktisch durchführbare Bestinunungsverfahren für
Chlorid wurde von T. Volhard1874 (J. Prakt. ehem., Bd. 9, S. (1874)) angegeben. Seit dieser Zeit sind in der Literatur
Dutzende von direkten und indirekten Analyseverfahren beschrieben worden. Die beliebtestenMethoden sind die coulometrische
Titration, das spezifische Ion-Elektrodenverfahren und
die kolorimetrische Quecksilber(II)-thiocyanat-Methode.
P.W. West und H. Coil berichten in "Anal, ehem.", Bd. 28
(1956), über eine direkte spektrophotometrische Methode für
die Chloridbestimmung im Bereich von 0,02 bis 0,2 mVal/1.
Später wurde dieses Verfahren, in dem kein Quecksilber verwendet wird,
für die Chloridbestimmung im Serum übernommen (vgl. B. Fingerhut,"Clin.
Chem. Acta", Bd. 41, S. 247 (1972)). Da das Reagens ein starkes Perchlorsäure-Medium ist, wird die Dialyse zur
Vermeidung von Problemen, die mit der Proteinausfällung zusammenhängen,
verwendet. Diese Methode fand keine weite Verbreitung in klinischen Laboratorien, obwohl bei dieser direkten
kolorimetrischen Bestimmung kein Quecksilber verwendet wird, das in anderen kolorimetrischen Bestimmungsverfahren
unerwünschte Beseitigungsprobleme schafft. Festgestellt werden sollte, daß in dem originalen West- und CoIl-Artikel
keine Absorptionsveränderung bei einer Säurekonzentration unter 2,On. beobachtet wurde.
Es wurde nun festgestellt, daß man durch Verwendung eines quecksilberfreien Reagens, das Eisen(III)-perchlorat
und Perchlorsäure in verdünnten Mengen enthält, und vorzugsweise
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VM ν * ζ- y.
in Gegenwart eines nicht-ionischen Netzmittels zuverlässige Werte bei der direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid
erhalten kann.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein neues Verfahren und ein neues Reagens für die direkte quantitative Bestimmung
von Chlorid in Blutserum zur Verfügung zu stellen, das die Reaktion zwischen dem Chlorid und Eisen(III)-ionen ausnützt,
jedoch kein Quecksilber enthält. Außerdem sollte das neue Reagens Perchlorsäure in niedrigeren Konzentrationen als
bisher enthalten. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren für die Bestimmung von Chloridionen zur
Verfügung zu stellen, das eine hohe Linearität für die Chloridionenbestimmung aufweist, durch andere im Blutserum
vorhandene Verbindungen nicht gestört wird und dank einer bichromatischen Methode die Chloridbestimmung in einem
spektrophotometrischen Zentrifugalanaiysator erleichtert.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid im Blutserum, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man in folgenden Stufen
(a) eine Probe des Serums mit einem Reagens zu einer Lösung umsetzt, wobei das Reagens
(i) etwa 0,01 bis etwa 2,On Perchlorsäure in entionlsiertam
Wasser,
(.ti) etwa 0,01 bis etwa 1,0n Eisen(III)-perchlorat in
entionisiertem Wasser und
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-Jr-
(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösung enthält,
das die Ausfällung des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes
nicht stört,
(b) die Absorption der Lösung nach Inkubation bestimmt,
(c) diese Absorption mit den Absorptionen von Lösungen mit bekanntem Chloridgehalt vergleicht, und
(d) die Chloridmenge im Serum bestimmt.
Die Figur zeigt eine Serie von Spektralabtastkurven, die nach dem Vermischen der Probe und des Reagens jede Sekunde in
einem analytischen Abtastspektrophotometer aufgenommen wurden. Aus der Figur ist ersichtlich,· daß die durch Bilirubin verursachte Absorption ein Maximum bei 450 nm hat, das sich mit ,der Zeit auf 370 nm verlagert. Die nach 4 Sekunden aufgenommene Absorption bei 420 nm entspricht der zuletzt abgelesenen Absorption bei 340 nm.
einem analytischen Abtastspektrophotometer aufgenommen wurden. Aus der Figur ist ersichtlich,· daß die durch Bilirubin verursachte Absorption ein Maximum bei 450 nm hat, das sich mit ,der Zeit auf 370 nm verlagert. Die nach 4 Sekunden aufgenommene Absorption bei 420 nm entspricht der zuletzt abgelesenen Absorption bei 340 nm.
Wie oben angegeben^ wurden bisher zur Bestimmung von geringen
Mengen Chlorid in wäßrigen Proben Eisen(III)-perchlorat und eine 2n bis 8,5n. Perchlorsäure verwendet. Der gelbe Eisen(III)-chlorokomplex
zeigt eine intensive Absorptionsbande in der Nähe von 340 nm, während das Eisen(III)-perchlorat enthaltende
Reagens im sauren Medium nur eine geringe Lichtab-
— j& —
sorption in diesem Bereich hat und somit zur quantitativen Bestimmung
geeignet ist.
Perchlorsäure ist als gutes Ausfällmittel für Serumproteine
bekannt. Um jedoch die Chloridkonzentration im Serum bestimmen zu können, muß man ein Trennungsverfahren für die Serumproteine,
wie die von Fingerhut beschriebene Dialyse/ verwenden, bevor die Bestimmungsmethode für ein automatisches
Verfahren angepaßt werden kann. Harnstoff wurde verwendet, um die Ausfällung von Protein in einem Perchlorsäuremedium
einer anderen Farbreaktion zu verhindern, es wurde jedoch beobachtet, daß Harnstoff ein gefärbtes Produkt mit
Eisen (TII)-ionen bildet, dessen Absorption bei 340 nm liegt, und deshalb für die direkte Reaktion nicht geeignet ist.
Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Verfahren wurde festgestellt, daß Eisen(III)-perchlorat und Perchlorsäure
in sehr verdünnten Konzentrationen verwendet werden können und daß die Verwendung eines Netzmittels eine getrennte
ProtGintrennungsstufe überflüssig macht. Dank einer systematischen
Untersuchung der pH-Abhängigkeit der Eisen(III)-chloridkomplexe
wurde entdeckt, daß sich Eisen(III)-chloride unter wohldefinierten Bedingungen bei niedriger Azidität
bilden. So wurde zum Beispiel beobachtet, daß die Komplexe linear bei 340 nm im und jenseits des physiologischen Bereiches
von Chlorid im Serum absorbieren, wobei die Standardkurve dem Beer1sehen Gesetz unterliegt. Mit dem erfindungsqeiru-ißen
Verfahren erhält man eine Empfindlichkeit, die mit
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dem Reagens vergleichbar ist, das konzentrierte Perchlorsäure enthält. Außerdem wurde beobachtet, daß im erfindungsgemäßen
Verfahren sich der Chloridkomplex in weniger als einer Minute bildet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Perchlorsäure und
Eisen(III)-perchlorat als verdünnte Lösungen verwendet. In der Praxis wurde jedoch festgestellt, daß man die Zusammensetzung
des Reagens variieren kann und gute Ergebnisse mit verschiedener Empfindlichkeit erhält. Ein typisches Beispiel
für ein erfindungsgemäßes Reagens enthält somit:
1. Perchlorsäure (HClO4),etwa 0,01 bis etwa 2,On
2. Eisen(III)-perchlorat, nicht-gelbes /Fc(ClO4)J3,
etwa 0,01 η bis etwa 1,0n
3. Polyoxyäthylen-lauryläther (oder ein entsprechendes nicht-ionisches Netzmittel), etwa 0,1 bis etwa
20 Gewichtsprozent.
Für den speziellen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten
Analysator ist besonders ein Reagens geeignet, das 0,0378 η Fe(ClO4)3, 9,65 % Polyoxyäthylen-lauryläther und 0,246 η
HC-IO4 enthält.
Das nicht-ionische Netzmittel im erfindungsgemäßen Verfahren
dient der Unterbindung und/oder Ausschaltung der Ausfällung von
Blutproteinen. Im Gegensatz zu Harnstoff bildet das nicht-
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ionische Netzmittel mit Eisen(III)-ionen kein gefärbtes Produkt,
das bei 34 0 nm absorbiert, und ist daher ideal für diesen Zweck geeignet.
Die einzigen Anforderungen an das Netzmittel sind, daß es nicht ionisch sein darf, die Ausfällung von Blutproteinen
unterdrückt oder verhindert und, im Gegensatz zu Harnstoff, die Absorptionsbestimmung nicht stört. Bevorzugte Netzmittel
sind Polyoxyäthylen-äther mit 2 bis 40 Äthylenoxideinheiten,
die sich von primären und sekundären Alkoholen mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen ableiten. Ein besonders bevorzugtes
nicht-ionisches Netzmittel für das erfindungsgemäße Verfahren
ist Polyoxyäthylen-lauryläther, der im Handel erhältlich ist.
Es können aber auch andere nicht-ionische Netzmittel verwendet
werden, vorausgesetzt, sie erfüllen die oben angegebenen Bedingungen.
Da das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens
ein Oxidationsmittel ist, das Bilirubin oxidiert, erzeugt es bei Serumproben ein dynamisches Interferenzproblem. Bei
einer Untersuchung der Interferenz wurde festgestellt, daß das herkömmliche Verfahren der Leerwertbestimmung des Serums,
der chemischen Veränderung sowie der Abtrennung durch Extraktion entweder zu kompliziert ist oder zu lange dauert.
bichromatischen Deshalb wird im erfindungsgemäßen/Verfahren ein 420 nm-FiIter
zur Durchführung der dynamischen Leerwertbestimmung verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Verwendung von
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ΑΛ
-Jf-
Filtern im Bereich von 380 bis 450 nm für die bichromatische
Leerwertbestimmung ein. Das 420 nm-Filter wird bevorzugt,
da es gleichzeitig die Interferenzen von Bilirubin und Hämoglobin ausschaltet. Der Serum-Leerwert verändert sich mit
der Zeit, da der Bilirubin-Absorptionsgipfel sich langsam
von 450 nm auf 370 nm verschiebt. Ein Absorptions-Leerwert,
der mit dem übereinstimmt, der bei 34 0 nm sowohl für die statische Hämolyse·- als auch die dynamische Bilirubininterferenz gemessen
wird, kann bei 420 nm bei entsprechender Zeitwahl erhalten werden; dies wurde experimentell bestimmt und ist auch aus
der Figur ersichtlich. Dieser Serum-Leerwert wird gespeichert und von dem bei 340 nm bestimmten Endwert abgezogen. Dieses
Verfahren ist einfach, es umgeht die Lagerung einer Serum-Leerprobe und scheidet das Bilirubin-Interferenzproblem
aus.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Analysator, der
eine bichromatische Bestimmungsausrüstung hat, verwendet werden. Besonders geeignet ist ein Analysator (CentrifiChem
der Firma Union Carbide Corporation), der für das Vermischen und Einbringen der Reagentien ein Zentrifugalfeld verwendet.
Wird die Analyse manuell in einem auf 3O0C thormostatisierten
Spektrophotometer durchgeführt, so wird eine Durchflußküvette bevorzugt. Bei einem Zentrifugalfeld-Analysator
werden die Proben und Reagentien mit einem Probenverdünnungsfaktor von 1:40 in die Transferscheibe pipettiert. Die Analysator-Parameter
können manuell gewählt werden oder man kann den Computer so programmieren, daß die experimentellen
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Stufen automatisch ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und die
Rotation begonnen. Nach dem Ausdrucken wird der Analysator für die Endergebnisse auf die geänderte Wellenlänge neu
eingestellt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung des Reagens
Eine Vorratslösung von 0,7n Eisen(III)-perchlorat wird durch
Lösen von 360 g Eisen(III)-perchlorat als nicht-gelbe Kristalle in einem Liter entionisiertem Wasser hergestellt.
Diese Lösung wird filtriert und mit Kaliumdichromat standardisiert.
Eine 5n Perchlorsäure-Vorratslösung wird durch Verdünnen von 450 ml 70-prozentiger Perchlorsäure mit einem
Liter entionisiertem Wasser hergestellt und mit Natriumhydroxid standardisiert.
Die Arbcitslösungen werden wie folgt hergestellt: Die Lösung A
wird aus den Vorratslösungen hergestellt und enthält 0,0756n Ei sen(III)-perchlorat und 0,492n Perchlorsäure. Die Lösung B
wird als wäßrige Lösung hergestellt und enthält 19,3 Gewichtsprozent
Polyoxyäthylen-lauryläther. Dieses Netzmittel ist im Handel als 3 0-gewichtsprozentige Lösung erhältlich,
Lösung B wird daraus durch Verdünnung hergestellt. Die Lösungen A und B werden im Volumenverhältnis von 1:1 zum er-
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findungsgemäßen Reagens vermischt.
Manuelles Verfahren
In ein 13 χ 100 min-Probenröhrchen werden erst 2 ml Lösung B,
dann 70μ1 Probe pipettiert und vermischt. In Serumproben kann eine weiße Trübung erscheinen, sie verschwindet jedoch nach
dem Vermischen. Anschließend werden 2 ml Lösung A zugesetzt, das Teströhrchen wird zum Vermischen geschüttelt.
Durch Versetzen eines 13 χ 100 mm-Probenröhrchens mit 2 ml Lösung B, 70μ1 entionisiertem Wasser und 2 ml Reagens A und Vermischen
wird eine Reagais-Leerwertlösung hergestellt.
Die Serum-Leerwertlösung wird durch Pl-
pettieren von 4 ml entionisiertem Wasser in ein 13 χ 100 ml-Teströhrchen
und Zugabe von 70μ1 Probe sowie anschließendes Vermischen hergestellt.
Beim manuellen Verfahren werden alle Lösungen in einem 300C
warmen Wasserbad oder einem Heizblock 5 Minuten inkubiert. Dann werden die Lösungen in das Spektrophotometer eingeführt,
die Werte werden abgelesen, wenn die Absorption stabil ist (etwa 15 Sekunden).
Bichromatisches Verfahren
Jedes Instrument, das eine bichromatische Bestimmungsausrüstung hat, wie der CentrifiChem-Analysator, kann verwendet
werden. Gemäß der Anleitung für den Analysator werden
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die Proben und das Reagens mit einem Probenverdünnungsfaktor von 1:40 in die Transferscheibe pipettiert. Die Analysator-Parameter
können manuell gewählt werden oder der Computer wird so programmiert, daß die experimentellen Stufen automatisch
ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und die Rotation
begonnen. Nach dem Ausdrucken wird der Analysator für die Endergebnisse auf die veränderte Wellenlänge eingestellt.
Beispiele 2 bis 9
Mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Reagentien werden verschiedene Human-Blutserumproben auf ihren Chloridgehalt
in einem CentrifiChem-Analysator untersucht. Die Serumproben
und die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.
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2 3 4 5
Probe
-* co
Normalserum ikterisches Serum hämolysiertes Serum
trübes Serum
Kontrollserum (500 mg Hämogobin/dl enthaltend)
Kontrollserum (43,5 mg Bilirubin/dl enthaltend)
entionisiertes Wasser (40 mVal Br~/1 haltend)
Kontrollserum (sehr trüb)
coulometrisch
(mVal/1)
(mVal/1)
102
97
109
103
107
104
104
32
106
106
/ci"7
gefunden (mVal/1)
101
96
108
104
106 104
1 105
verwendete Methode
bichromatisch bichromatisch bichromatisch bichromatisch
bichromatisch bichromatisch
bichromatisch bichromatisch
ι vn
*) mittels Digital-Meßgerät der Fa. Corning Glass Works
O CO CD
Beispiel 10
Die verscniedenen Parameter des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden unter Verwendung der bichromatischen und der manuellen Methode verglichen. Auch die Parameter einer Leerwertbestimmung
sind angegeben. Alle Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt .
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Parameter | Linearität | Tabelle II | bi chrctnatisch | manuell | |
Genauigkeit | Methode | 0-120 mVal/1 | 0-120 mVal/1 | ||
1. | während 1 Tages | ||||
2. | von Tag zu Tag | 1,54 % | 1 ,7 % | ||
Genauigkeit | 0,8 % | 1 ,4 % | |||
(% Wiedergewinnung) | |||||
3. | Stabilität | ||||
Verhältnis zur coulo- | |||||
4. | metrischen Methode | ||||
5. | Interferenzen | 0,9743 | 0,968 | ||
co | Br" | ||||
CD »—k |
cn | F~ | keine bis zu 40 mVal/1 | ||
Ii ι W CD |
Bilirubin | keine bis zu 40 mVal/1 | |||
G> | Hämoglobin | keine | keine bis zu 5iwj/d] | ||
O | Trübung | keine bis zu 300 mg/dl | keine bis zu 300 ing/d.1 | ||
σ> | keine bis zur starken | keine bis zur starken | |||
<n | Trübuna | Trübung | |||
Leerwert
0-180 mVal/1
1 ,3 % 1 ,8 %
95 - 103 %
1 Jahr bei 25°C
0,9256
keine bis zu 100 mVal/1 keine bis zu 40 mVal/1 keine bis zu 5 mq/dl
keine bis zu 500 mg/dl
keine bis zur starken Trübung
Leerseite
Claims (8)
1.λ Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von
Chlorid im Blutserum, dadurch gekennzeichnet ,
daß man in folgenden Stufen
(a) eine Probe des Serums mit einem Reagens zu einer Lösung umsetzt, wobei das Reagens
(i) etwa 0,01n bis etwa 2,0n Perchlorsäure in entionisiertem Wasser,
(ii) etwa 0,01n bis etwa 1,On Eisen(III)-perchlorat
in entionisiertem Wasser und
(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösungenthält,
das die Ausfällung des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes
nicht stört,
(b) die Absorption der Lösung nach Inkubation bestimmt,
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(c) diese Absorption mit den Absorptionen von Lösungen mit
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bekanntem Chloridgehalt vergleicht und (d) die Chloridmenge im Serum bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Absorption der Lösung bei 340 nm bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß man die durch die Gegenwart von Bilirubin in Serumleerproben
bedingte Interferenz durch ein bichromatisches Verfahren ausschaltet, bei dem man den Bilirubin-Absorptionsgipfel
bei 420 nm während dessen Verlagerung von 460 auf 370 nm mißt und diesen Wert von der Endbestimmung bei 340 nm der Blutserumprobe
abzieht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man als nicht-ionisches Netzmittel Polyoxyäthylen-lauryläther verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die BTUtserumprobe in einer Menge von 70μ1 verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch von gleichen Volumina entionisierter Lösungen
herstellt, die 0,0756n Eisen(III)-perchlorat bzw. 0,492n Perchlorsäure
enthalten, und von diesem Gemisch insgesamt 2 ml verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine wäßrige 19,3 Gewichtsprozent Polyoxy-
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äthylen-lauryläther enthaltende Lösung in einer Menge von 2 ml verwendet.
8. Reagens zur Verwendung für die direkte quantitative Chloridbestimmung im Blutserum nach Anspruch 1, enthaltend:
(i) etwa 0,01η bis etwa 2,On Perchlorsäure in entionisiertem
Wasser,
(ii) etwa 0,01n bis etwa 1,0n Eisen(III)-perchlorat in entionisiertem Wasser und
(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösung, das die Ausfällung
des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes nicht stört.
130063/0615
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Clin.Chim.Acta, Vol.41, 1972, S.247-253 * |
Z.: Anal.Chem., Bd.269, 1974, S.85 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102012108720A1 (de) * | 2012-09-17 | 2014-03-20 | Diasys Diagnostic Systems Gmbh | Chloridbestimmung |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2068541A (en) | 1981-08-12 |
JPS56120949A (en) | 1981-09-22 |
US4278440A (en) | 1981-07-14 |
GB2068541B (en) | 1983-11-23 |
FR2475226A1 (fr) | 1981-08-07 |
FR2475226B1 (fr) | 1985-09-06 |
DE3103612C2 (de) | 1984-03-15 |
CA1144460A (en) | 1983-04-12 |
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