DE2011352B2 - Reagens und verfahren zur direkten bestimmung von albumin - Google Patents
Reagens und verfahren zur direkten bestimmung von albuminInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Reagens zur direkten
kolorimetrischen Bestimmung von Albumin, bestehend aus der gepufferten Lösung eines Indikators aus der
Gruppe der Sulfophthaleinfarbstoffe sowie ein Verfahren
zur direkten kolorimetrischen Bestimmung von Albumin unter Verwendung einer Bromkresolgrünlösung
als Reagens.
Die Bestimmung des Gesamtalbumingchalts im .Serum wird oft in klinischen Laboratorien vorgenommen.
Diese Bestimmung wird zum Nachweis von Hypoalbiiminämie. einer Ursache oder ein mitvurursachender
Faktor von Ödemen, und zur Bestimmung des Ausmaßes von Proteinverarmung auf Grund
von massiver Albuminurie. Hämorrhagie. TranssnHafinn.
Unterernährung, neoplastischen Erkrankungen und anderen Aiiszehrungskrankheiten verwendet.
Rs wurden zahlreiche Verfahren zur Bestimmung von Smimalhiimin beschrieben. Nach der deutschen
Auslegeschrift 1255 353 sind Reagenzien zur Eiweiltbestimmung
bekannt, die aus einem saugfähigen Trii
ger. einer sauren Puffersubstanz, einem Indikator mi. Proteinfehler und zusätzlich ein oberflächenaktive;
Mittel enthalten. Der Zusatz dieses oberflächenaktiven
Mittels dient der Erhöhung der Saugfähigkeit de Trägers.
Ein weiteres Verfahren ist von F. Lee R ο d k e >.
ίο ..Bindung of Bromcresol Green by Human Serum
Albumin«., beschrieben und in »Archives of Biochemistry
and Biophysics«, 1OS, S. 510 bis 513 (1964... veröffentlicht. Dieses Verfahren beruht auf dem
Phänomen, daß die Absorption von Bromkresolgrün auf Grund seiner Affinität für Albumin selektiv bei
dessen höchster Wellenlänge verringert wird. D1τ
Gesamtalbumingehalt wird durch die Differenz de>Absorption mit Hilfe einer verdünnten Bromkresolgrünlösung
bestimmt.
Desgleichen ist es nach der österreichischen Patentschrift 202 281 bekannt, Proteine durch spektralphotometrischen
oder kolorimetrischen Vergleich von Flüssigkeiten mit einem bestimmten pH-Wert, die da-,
Protein, Puffer und einen Indikator wie beispielsweise Bromkresolgrün enthalten, quantitativ zu bestimmen.
Auch andere Verfahren, die Bromkresolgrün als Indikator verwenden, wurden bekannt, z. B. Gosslin.
Can. J. Med. Dec, 1966. S. 240. und Bartholomew.
Proc. Australian Assoc. of Clin.
Biochem.. Bd. 1, Nr. 7, S. 214 (1966). Jedoch leiden
diese Verfahren an vielen Nachteilen. Einer der größten Nachteile ist. daß diese Methoden nicht empfindlich
genug sind. So müssen suboptimale Bromkresolgrünkonzentrationen verwendet werden, um eine Trübung
der Reaktionsmischung zu vermeiden, die die optischen Bestimmungen beeinflussen würde. Al? Folge der Verwendung
von suboptimalen Konzentrationen von Bromkresolgrün reagiert ein großer Teil des Albumins
in der Probe nicht. Offensichtlich ist dieser Test überhaupt
nicht empfindlich, da in dem Test Albumin vorliegt, das nicht reagiert hat. Zusätzlich wird das
Piiffersystem bei einem suboptimalen pH-Wert verwendet,
um die Absorption der Reagensblindprobe klein zu halten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es. ein Reagens für die Bromkresolgrünmethode zur Bestimmung
von Gesamtserumalbumin zu schaffen, durch das die vorerwähnten Nachteile beseitigt werden.
Somit ist es auch Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtserumalbumin
unter Verwendung von Bromkresolgrün oder anderen Sulfonphthaleinfarbstoffm als Indikator
mit einer gesteigerten Empfindlichkeit und gleichzeitiger vollständiger Beseitigung des Problems der
Trübung zu ermöglichen.
Es wurde gefunden, daß die maximale Empfindlichkeit von Bromkresolgrün als Indikator für Albumin
in Körperflüssigkeiten bei pH 4,0 liegt. Eine Konzentration von 10 mg0/,, Bromkresolgrün in der Reaktionsmischungist
notwendig, um eine lineare Ansprechempfindlichkeit direkt proportional zu Albuminkonzentrationen
bis zu 6°/0 zu erzielen. Bei dieser Konzentration fällt der Proteinfarbstoffkomplex jedoch
schnell aus der Lösung aus. Zusätzlich ist die Absorption des Reagens-Indikators größer ?'s der
Wechsel in der Absorption, der bei normalen Mengen von Scrumnlbumin erreicht wird.
Es wurde gefunden, daß der Zusatz einer geringen
Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels Zur Bestimmung van Albumin wird eine geringe
oder einer Mischung verschiedener oberflächenaktiver Menge von Serum oder eine andere Probe, wie etwa
Mittel den Proteinfarbstoffkomplex daran hindert, 0,01 bis 0,1 m!. vorzugsweise 0,02 ml, mit etwa ImI
aus der Lösung auszufallen, wodurch das Problem der der Bromkresolgrünlösung der vorliegenden Erfindung
Trübung beseitigt wird. Zusätzlich wird eine merkliche 5 vermischt. Das System wird dann verdünnt, z. B.
Verminderung der Absorption der Reagensblindprobe mit 4 ml Wasser, und man bestimmt die optische Ab-
erreicht. sorption bei einer Wellenlänge von 620 bis 640 ηιμ.
Daserfindungsgemäße Reagens zur direkten kolo- Die Absorption des Reagens wird bestimmt in Ab-
rimetrischen Bestimmung von Albumin, bestehend aus Wesenheit von Serum oder Testproben. Der Unter-
der gepuflerten Lösung eines Indikators aus der io schied in der optischen Absorption liefert eine direkte
Gruppe der Sulfophthaleinfarbstoffe, ist gekenn- Anzeige für die Gesamtkonzentration von Albumin in
zeichnet durch den Gehalt an einem nichtionischen der Probe,
oberflächenaktiven Mittel. Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die in der
Das erwünschte Ergebnis ist eine deutliche Ver- vorliegenden Erfindung verwendet werden können,
besserung der Empfindlichkeit und der Linearität der 15 sind Nonylphenylpolyäthylenglykoläther. Polyoxy-
Bestimmung. Somit ist, wenn eine Körperflüssigkeit»- äthylensoibitanmonolaurat, Polyoxyäthylensorbitan-
probe, die Albumin enthält, zu dem gepufferten monopahrtitat, Polyoxyäthylensorbitanmonostearat,
Indikatorreagenssystem gegeben wird, der Anstieg der Polyoxyäthylensorbitantristearat, Polyoxyäthylensor-
Absorption bei 620 bis 640 πιμ direkt proportional der bitanmonooleat, Polyoxyäthylensorbitantrioleat, Na-
Konzentration des zugegebenen Albumins. 20 triumsalz von Alkylarylpolyäthersulfat, modifiziertes
Die drastischen Änderungen der Empfindlichkeit Phthaloglycerinalkylharz, Alkylarylpolyäther, äthoxy-
dieser Bestimmung sind in der Zeichnung erläutert. liertes Rizinusöl, äthoxylierter Cetyl-Stearyl-Alkohol,
In der Zeichnung ist die Kurve 1 erzielt worden, indem äthoxyiierte Ölsäure, Polyäthylenglykolfettsäureester,
man die Albuminkonzentration gegen die optische äthoxylierter Laurylalkohol, äthoxylieter Myristyl-
Absorption aufträgt, wobei 1,0 ml einer 50 mg°/oigen 25 alkohol, Polyäthylenglykol-(400)-monopalmitat, äth-
Lösung von Bromkresolgrün als Reagens verwendet oxylierter Tridecylalkohol, Polyoxyäthylenlauryläther,
wurde. Die Kurve 2 ist in ähnlicher Weise erhalten Polyoxyäthylencetyläther, Polyoxyäthylenoleyläther,
worden, jedoch wurden 1,0 ml 18mg°/oiger Brom- oder jedes andere nichtionische oberflächenaktive
kresolgrünlösung verwendet, eine suboptimale Kon- Mittel, z. B. jene, die in »Detergents and Emulsifiers«,
zentration für das Reagens. Die Kurve 3 ist in gleicher 30 1964, veröffentlicht durch John W. Mc C u t-
Weise erhalten worden wie die Kurve 1, jedoch wurde ch e ο n, Inc., Morristown, New Jersey, beschrieben
1.0 ml Bromkresolgrün verwendet mit einer Konzen- sind.
tration von bis zu 50 mg°/0, was natürlich die optimale Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter
Konzentration für Bromkresolgrün ist. und gleich- erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.
zeitig wurde eine geringe Menge des oberflächen- 35
zeitig wurde eine geringe Menge des oberflächen- 35
aktiven Mitte's in Form von Polyoxyäthylensorbitan- Beispiel 1
monolaureat verwendet. Daraus ist ersichtlich, daß die ., „ , n . . .. „
Kurve 3. die der vorliegenden Erfindung entspricht, Herstellung des Bromkresolgrun-Reagens
die empfindlichste ist und eine direkte Beziehung 50 mg Bromkresolgrün werden in 100 ml einer
zwischen der optischen Absorption und der Albumin- 40 0,1 molaren Milchsäure-Natriumlactat-ilifferlösung
konzentration zeigt. mit einem pH von 4,0 aufgelöst. Zu dieser Lösung gibt
Grob gesprochen, wird die vorliegende Erfindung man 1 ml Polyoxyäthylensorbitanmonolaureat.
ausgeführt, indem man Bromkresolgrün in einem ge- „ . . . .
eigneten konzentrierten Puffersystem auflöst das Beispiel/
einen End-pH-Wert von etwa 4 und eine Farbstoff- 45 0,02 ml Serum, das eine unbekannte Menge Serumkonzentration von etwa :0 mgn/0 oder 0.05 Gewichts- albumin enthält, wird mit 1 ml des Reagens, hergeprozent ergibt. stellt gemäß Beispiel 1, vermischt. Die entstehende
ausgeführt, indem man Bromkresolgrün in einem ge- „ . . . .
eigneten konzentrierten Puffersystem auflöst das Beispiel/
einen End-pH-Wert von etwa 4 und eine Farbstoff- 45 0,02 ml Serum, das eine unbekannte Menge Serumkonzentration von etwa :0 mgn/0 oder 0.05 Gewichts- albumin enthält, wird mit 1 ml des Reagens, hergeprozent ergibt. stellt gemäß Beispiel 1, vermischt. Die entstehende
Geeignete Puffersysteme sind z. B. Citronensäure— Lösung wird dann mit 4 ml Wasser vermischt. Die
T^atriumcitrat, Milchsäure—Natriumlactat, Phos- ortir"he Absorption dieser Lösung wird dann bei einer
phorsäurc— Natriumphosphat. F.ssigsäure—Natrium- 50 Wellenlänge von 630 ιτιμ abgelesen. In gleicher Weise
acetat usw. Diese Puffer sind dem Fachmann bekannt wird die theoretische Absorption für das Reagens ohne
und können, wie von Henry in »Clinical Clic- das Serum bestimmt. Die Differenz zwischen den bci-
mistry« beschrieben, hergestellt werden. den Systemen ist direkt proportional der Albumin-
F.inc geringe Menge, wie etwa 0.1 bis 1 Gewichts- konzentration im Serum.
oder Volumprozent, eines nichtionischen oberflächen- 55 Es ist klar, daß die obige detaillierte Beschreibung
aktiven Mittels entweder allein oder in Kombination nur zur Erläuterung gegeben wird und daß viele Varia-
mit einem anderen oberflächenaktiven Mittel wird tionen gefunden werden können, ohne daß man den
dann zu der Bromkresolgrünlösung gegeben. Rahmen der Erfindung verläßt.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Reagens zur direkten kolorimetrischen Bestimmung von Albumin, bestehend aus der gepufferten
Lösung eines Indikators aus der Gruppe der Sulfophthaleinfarbstoffe. gekennzeichnet
d u r c h den Gehalt an einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel.
2. Reagens nach Anspruch 1 mit 50 mgn 0
Bromkresolgrün in einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von 4, gekennzeichnet durch einen
Gehalt von 0.1 bis 1 Gewichts- oder Volumprozent des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels.
3. Verfaliren zur direkten kolorimetrischen Bestimmung
von Albumin unter Verwendung einer Bromkresolgrünlösung als Reagens, dadurch gekennzeichnet,
daß der Reagenslösung eine geringe Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven
Mittels zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3 zur Bestimmung des Gesamtalbumins in einer Probe, dadurch gekennzeichnet,
daß eine geringe Menge dieser Probe mit einer Lösung von Bromkresolg-mn in Gegenwart
einer geringen Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels kontaktiert wird, die
entstehende Lösung mit Wasser verdünnt und die optische Absorption des entstehenden Systems bei
einer Wellenlänge von 620 bis 640 ma bestimmt
wird und diese Absorption mit derjenigen einer Lösung von Bromkresolgrün in Gegenwart einer
geringen Menge nichtionischen oberflächenaktiven Mittels verglichen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß etwa 0,02 ml Probe mit 1 ml einer 50 mg0 oigen (O.OSgewichtsprozentigen) Lösung von
BrorriKixsolgrün in Gegenwart einer geringen
Menge eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels kontaktiert wird, die entstehende Lösung
mit etwa 4 ml Wasser verdünnt und die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 620 bis 640 ιτιμ
bestimmt und mit der verglichen wird, die durch die Mischung von ImI einer 50 mg0'„igen (0.05°/0)
Lösung von Bromkresolgrün in Gegenwart einer geringen Menge nichtionischen oberflächenaktiven
Mittels und 4 ml Wasser entsteht.
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