DE68913797T2 - Verwendung von Paraaminosalicylsäure zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von Peroxydase in Lösung, Stabilisierungsmittel und Verwendung von stabiliserter Lösung. - Google Patents
Verwendung von Paraaminosalicylsäure zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von Peroxydase in Lösung, Stabilisierungsmittel und Verwendung von stabiliserter Lösung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von p-Aminosalicylsäure zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von Peroxidasen und Lösung sowie das Stabilisierungsmittel und stabilisierte Lösungen unter Verwendung dieses Stabilisierungsmittels.
- Peroxidasen sind bei diagnostischen Tests häufig verwendete Enzyme, die auf enzymatisch-immunologischen Reaktionen beruhen. Als solche Tests können Schwangerschaftstests und Tests zum Nachweis antiviraler Antikörper, wie z. B. bei Hepatitis, HIV (human immunodeficiency virus) und Röteln, genannt werden.
- Peroxidasen, die gegebenenfalls an ein immunologisches Reagens gekuppelt sind, sind in verdünnter Form instabil. Dies zwingt die Hersteller der Tests, die Enzyme in einer konzentrierten Form in einem flüssigen Medium zu liefern, das Stabilisierungsmittel, wie Rinderserumalbumin oder Rinderserum enthalten, deren Konzentration bis zu 20 % des Gesamtvolumens des Reagens ausmacht. Der Verwender muß deshalb eine Verdünnung des Reagens zum Zeitpunkt der Verwendung vornehmen, was Fehlerquellen und zusätzliche Kosten verursachen kann.
- Es ist deshalb vorteilhaft, stabilisierende Substanzen zu finden, die die Bereitstellung von Reagentien, an welche die Peroxidase gekuppelt ist, in verdünnter, gebrauchsfertiger Form erlauben, was die zusätzliche Anforderung mit sich bringt, daß gelegentlich bei einem pH-Wert in der Nähe des Neutralpunktes gearbeitet werden kann.
- Es sind bereits verschiedene Untersuchungen durchgeführt worden, die zu Patenten geführt haben:
- - DE 35 09 238 und
- - DE 35 11 327, beide von Boehringer Mannheim, in denen der Zusatz von Phenol oder Aminopyrin in einer Konzentration von mindestens 0,005 % angegeben wird;
- - CH 4944/84 von Hoffmann-LaRoche, in dem 4-Aminoantipyrin beansprucht wird,
- - EP-A-0 110 429 von Abbott, in dem die Verwendung von 8-Anilinonaphthalinsulfonsäure angegeben wird. Keine dieser Verbindungen ist allerdings zufriedenstellend.
- Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das neue technische Problem zu lösen, das in der Herstellung eines neuen Stabilisierungsmittels zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von Peroxidaselösungen bei 4 ºC oder bei Raumtemperatur über mindestens 10 Tage besteht.
- Dieses neue technische Problem wird nun erstmalig durch die vorliegende Erfindung gelöst. Es wurde nämlich festgestellt, daß p-Aminosalicylsäure (PASA) in bezug auf die enzymatische Aktivität von Peroxidasen in Lösung bei niedrigen Temperaturen oder bei 37 ºC über mindestens 10 Tage bemerkenswerte Stabilisierungseigenschaften aufweist.
- Dies ist insofern ziemlich überraschend, als ein Derivat der Salicylsäure, 5-Aminosalicylsäure, ein Substrat für enzymatische Reaktionen von Peroxidasen darstellt, weshalb es unerwartet ist, unter den Derivaten der Salicylsäure eine Verbindung zu finden, welche die enzymatische Aktivität von Peroxidasen zu stabilisieren vermag.
- Zusätzlich haben, wie die nachstehenden Beispiele zeigen, andere Derivate der Salicylsäure keine stabilisierende Wirkung auf die enzymatische Aktivität von Peroxidasen.
- Die Erfindung betrifft dementsprechend die Verwendung von p-Aminosalicylsäure als Mittel zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität von Peroxidasen in Lösung, die frei vorliegen oder an ein immunologisches Reagens gekuppelt sind.
- Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft das Stabilisierungsmittel selbst, das PASA enthält. Ein vorteilhaftes Merkmal besteht darin, die Konzentration an PASA auf Werte von etwa 8 ug bis etwa 2000 ug pro Milliliter Lösung des Stabilisierungsmittels oder der zu stabilisierenden Lösung einzustellen.
- Dieses Stabilisierungsmittel enthält vorzugsweise p-Aminosalicylsäure, die in einem aus Tris bestehenden Puffer gelöst ist, der mit einer Säure, die vorzugsweise unter Essigsäure, Bernsteinsäure, Borsäure und Diethylbarbitursäure ausgewählt ist, auf einen pH-Wert gebracht ist, der etwa 7 bis etwa 8 beträgt.
- Dieses Stabilisierungsmittel kann außerdem mindestens 2 % Serum enthalten.
- Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich Lösungen stabilisierter Peroxidasen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine wirksame Menge p-Aminosalicylsäure zur Stabilisierung enthalten. Vorzugsweise liegt diese wirksame Menge im Bereich von etwa 8 ug pro Milliliter und etwa 2000 ug pro Milliliter der stabilisierten Lösung.
- Die Lösungen stabilisierter Peroxidasen liegen vorzugsweise in einem Tris-Puffer vor. Vorzugsweise enthalten diese Lösungen außerdem mindestens 2 % Serum. Nach einer weiteren Ausführungsform enthalten diese Lösungen stabilisierter Peroxidasen mindestens 0,01 Gew.-% CaCl&sub2; und mindestens 0,01 Gew.-% MgCl&sub2; 6H&sub2;O.
- Nach einer weiteren Ausführungsform liegen die stabilisierten Lösungen in gebrauchsfertiger Form mit einer Peroxidasekonzentration ≤ 50 ug/ml, bezogen auf die Gesamtlösung, vor.
- Die Erfindung betrifft schließlich auch das Verfahren zur Herstellung des Stabilisierungsmittels und der Lösungen stabilisierter Peroxidasen, wobei der Fachmann das Verfahren unmittelbar aus dem zuvor Gesagten und aus der folgenden Beschreibung entnehmen kann, bei dem p-Aminosalicylsäure zu dem obengenannten Stabilisierungsmittel oder den obengenannten Peroxidaselösungen zugegeben oder darin eingebracht wird.
- Andere Ziele, Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung und den nachstehenden Beispielen, die den Umfang dieser Erfindung in keiner Weise beschränken.
- 4-Aminosalicylsäure, die auch als p-Aminosalicylsäure (PASA) bezeichnet wird, Sulfosalicylsäure und 5-Nitrosalicylsäure wurden in einer Konzentration von 2 mg/ml in einer 0,02 M Tris-Lösung gelöst. Mit Ausnahme der Sulfosalicylsäure, die sauer reagiert, wurde der pH-Wert mit 0,02 M Essigsäure auf 8 und mit 0,02 M Bernsteinsäure auf 7 eingestellt.
- Nach Zugabe einer Peroxidase zu diesen Medien wurden die Lösungen 11 Tage bei 4 ºC bzw. bei 37 ºC gehalten. Die vergleibende enzymatische Aktivität wurde durch Einbringen von 5 ul jeder Lösung in 100 ul eines Substrats für die enzymatische Reaktion gemessen, das aus 0,4 ml o-Phenylendiamin (OPD), das in 1 ml eines Citronensäure-Phosphat-Puffers bei pH 5,3 gelöst war, der 0,02 % H&sub2;O&sub2; enthielt, bestand. Nach 10 min Inkubieren wurde die gelbe Farbreaktion durch Zugabe von 100 ul 4 N H&sub2;SO&sub4; gestoppt, wonach die Intensität der Färbung bei 492 nm gemessen wurde. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Kontrolle ºC Essigsäure ºC Bernsteinsäure ºC Peroxidase (Kontrolle) PASA (Erfindung) Sulfosalicylsäure Nitrosalicylsäure
- Die Überlegenheit von PASA bei 4 ºC und 37 ºC ist auch dann offensichtlich, wenn der pH-Wert der Lösung auf 8 oder 7 gesenkt wird.
- Sulfosalicylsäure und Nitrosalicylsäure zeigen andererseits gegenüber den Kontrollversuchen keine merkliche stabilisierende Wirkung.
- Danach wurde die optimale PASA-Konzentration bestimmt. Die Peroxidase wurde 9 Tage bei 4 ºC und 37 ºC in einem Tris- Barbitursäure-Puffer in Gegenwart von verschiedenen PASA- Konzentrationen gelöst gehalten. Die verbleibende enzymatische Aktivität wurde wie in Beispiel 1 analysiert; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 PASA-Konzentration (ug/ml)
- Die PASA-Konzentration ist in ug/ml angegeben; die optische Dichte wurde bei 292 nm bestimmt. Die hier gezeigten Ergebnisse machen deutlich, daß die stabilisierende Wirkung von PASA auch bei geringen Konzentrationen von 8 ug/ml eintritt, daß sie aber ab 200 ug/ml optimal ist.
- Eine 0,6%ige Peroxidaselösung in Tris wurde auf einen Borsäuregehalt von 0,4 % und einen PASA-Gehalt von 0,05 % eingestellt. Nachdem ein Teil dieser Lösung mit 2 % Truthahnserum ergänzt worden war, wurden die beiden so erhaltenen Lösungen 7 Tage bei 4 ºC und 37 ºC inkubiert, wonach eine Analyse der verbleibenden enzymatischen Aktivität durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Kontrolle Serum
- Man sieht, daß die enzymatische Aktivität der Peroxidaselösung bei 37 ºC in Gegenwart des Serums erhalten bleibt.
- 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANSA), Phenol, Aminopyrin und 4-Aminoantipyrin wurden gemäß den in den Patenten gemachten Empfehlungen verwendet; die enzymatische Aktivität wurde mit der enzymatischen Aktivität einer Peroxidase verglichen, die in einem Medium gelöst war, das 0,9 % NaCl enthielt, mit 0,05 M Tris-Essigsäure-Puffer auf pH 8,0 gepuffert war und 5 % Serum, 0,25 % PASA und 0,1 % CaCl&sub2;-MgCl&sub2; 6H&sub2;O enthielt.
- In der Lösung entstand ein Niederschlag, der vor der Zugabe des Enzyms durch Filtration entfernt wurde. Die Lösungen wurden 7 Tage bei 37 ºC und 4 ºC gehalten und wie in Beispiel 1 analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4 Erfindung Stand der Technik PASA Aminopyrin Phenol Antipyrin ANSA
- PASA ist den anderen geprüften Substanzen überlegen. Diese Enzymstabilität wird auch bei 4 ºC beobachtet und bleibt im Gegensatz zu dem, was bei den im Stand der Technik empfohlenen Verbindungen beobachtet wird, bei 37 ºC vollständig erhalten.
Claims (11)
1. Verwendung von p-Aminosalicylsäure zur Stabilisierung der
enzymatischen Aktivität von Peroxidasen in Lösung, die frei
vorliegen oder an ein immunologisches Reagens gekoppelt
sind.
2. Stabilisierungsmittel zur Stabilisierung der
enzymaßischen Aktivität von Peroxidasen in Lösung, dadurch
gekennzeichnet, daß es p-Aminosalicylsäure enthält.
3. Stabilisierungsmittel nach Anspruch 2, dadurch
gekennzeichnet, daß es p-Aminosalicylsäure in einer für die
Stabilisierung ausreichenden Menge enthält, die bevorzugt
zwischen etwa 8 und etwa 2000 ug pro Milliliter der Lösung des
Stabilisierungsmittels oder der zu stabilisierenden Lösung
liegt.
4. Stabilisierungsmittel nach Anspruch 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die p-Aminosalicylsäure in einem
Tris-Puffer gelöst ist, der mit einer Säure auf einen pH-Wert
zwischen 7 und 8 eingestellt ist, die bevorzugt unter
Essigsäure, Bernsteinsäure, Borsäure und Diethylbarbitursäure
ausgewählt ist.
5. Stabilisierungsmittel nach den Ansprüchen 2 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 2 % Serum enthält.
6. Lösungen stabilisierter Peroxidasen, dadurch
gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge p-Aminosalicylsäure zur
Stabilisierung enthalten.
7. Lösungen stabilisierter Peroxidasen nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Menge zur
Stabilisierung im Bereich zwischen etwa 8 und 2000 ug pro Milliliter
der stabilisierten Lösung liegt.
8. Lösungen stabilisierter Peroxidasen nach Anspruch 6 und
7, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung in einem
Tris-Puffer vorliegt.
9. Lösungen stabilisierter Peroxidasen nach einem der
Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner 2 %
Serum enthalten.
10. Lösungen von Peroxidasen nach einem der Ansprüche 6 bis
9, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 0,01 Gew. %
CaCl&sub2; und mindestens 0,01 Gew.-% MgCl&sub2; 6H&sub2;O enthalten.
11. Lösungen von Peroxidasen nach einem der Ansprüche 6 bis
10, dadurch gekennzeichnet, daß sie in gebrauchsfertiger
Form mit einer Peroxidasekonzentration ≤ 50 um pro
Milliliter der Gesamtlösung vorliegen.
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| FR2630457A1 (fr) | 1989-10-27 |
| EP0340068A1 (de) | 1989-11-02 |
| FR2630457B1 (fr) | 1990-08-31 |
| DE68913797D1 (de) | 1994-04-21 |
| EP0340068B1 (de) | 1994-03-16 |
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