CZ404997A3 - Rekombinantní lektin z jmelí - Google Patents
Rekombinantní lektin z jmelí Download PDFInfo
- Publication number
- CZ404997A3 CZ404997A3 CZ974049A CZ404997A CZ404997A3 CZ 404997 A3 CZ404997 A3 CZ 404997A3 CZ 974049 A CZ974049 A CZ 974049A CZ 404997 A CZ404997 A CZ 404997A CZ 404997 A3 CZ404997 A3 CZ 404997A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- nucleic acid
- acid molecule
- chain
- cell
- Prior art date
Links
- 241000221012 Viscum Species 0.000 title claims abstract description 129
- 235000014066 European mistletoe Nutrition 0.000 title claims abstract description 127
- 235000012300 Rhipsalis cassutha Nutrition 0.000 title claims abstract description 127
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 title claims abstract description 111
- 239000002523 lectin Substances 0.000 title claims abstract description 101
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 78
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 45
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 41
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 83
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 241000221013 Viscum album Species 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 claims description 6
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 claims description 6
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 claims description 6
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 claims description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 claims description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 20
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 19
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 19
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 18
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 14
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 14
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 13
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229930195724 β-lactose Natural products 0.000 description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 9
- 101710197072 Lectin 1 Proteins 0.000 description 9
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 9
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 8
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 8
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 8
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 8
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 7
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 108010044715 asialofetuin Proteins 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 7
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 6
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 102100022419 RPA-interacting protein Human genes 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 4
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 101000845012 Macrovipera lebetina Disintegrin lebein-1-alpha Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 238000002473 ribonucleic acid immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100438957 Mus musculus Cd8a gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000789575 Populus wilsonii Species 0.000 description 2
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007247 enzymatic mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 108700013967 (4-aminobutanoyl)melittin Proteins 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151906 31 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 1
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N Lactosamine Natural products OC1C(N)C(O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 PNIWLNAGKUGXDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101000582927 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) Lectin A Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101710158076 Ribosome-inactivating protein Proteins 0.000 description 1
- 241000630486 Robertus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000607662 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abortusequi Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 102100040706 Zinc finger protein 79 Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000009925 apoptotic mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 101150113410 eag gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N lactosamine Chemical compound O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DOVBXGDYENZJBJ-ONMPCKGSSA-N 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 229940047091 other immunostimulants in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007420 radioactive assay Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000000547 structure data Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6819—Plant toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódující pseedproteiny, které po dozrání vykazují biologickou aktivitu dimerů lektinu z jmelí, vektorů, které tyto molekuly nukleové kyseliny obsahují, hostitelů těmito vektory transformovaných a polypeptidů, případně dimery polypeptidů, které jsou těmito molekulami nukleové kyseliny kódované. Polypeptidy podle vynálezu jsou terapeuticky všestranně použitelné. Tím se vynález dále týká imunotoxinů jakož i léků, které obsahují polypeptidy případně dimery polypeptidů podle vynálezu. Dále se vynález týká diagnostických sestav, které obsahují molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, polypeptidy případně dimery polypeptidů podle vynálezu anebo primér, které specificky hybridizují na molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Konečně se vynález týká prostředků na ochranu rostlin, které obsahují polypeptidy případně dimery polypeptidů podle vynálezu.
Dosavadní stav techniky
Extrakty z jmelí se terapeuticky používaly po staletí. Od počátku tohoto století se používaly preparáty z jmelí k terapii rakoviny s různým úspěchem (Bocci, 1993; Gabius aj., 1993; Gabius a Gabius., 1994; Ganguly a Das, 1994). Hajto aj. (1989, 1990) mohli ukázat, že terapeutické účinky jsou zprostředkovány zvláště tak zvanými lektiny z jmelí • · · • · · · • · • · · · · · (viscuminy, Viscum album Agglutinine, VAA). Dnes se diskutu je vedle cytostatického účinku zvláště (nespecifické) imu nostimulace, jejíž positivní účinek se využívá k podpůrné terapii a následné péči o rakovinové pacienty. Zvýšení kva lity života takových pacientů je možná působeno uvolňováním tělu vlastních endorfinů (Heiny a Beuth, 1994).
Četné studie in vitro (Hajto aj., 1990; Mánnel aj.,
1991;
Beuth aj. 1993) a in vivo (Hajto, 1986; Hajto aj.,
1989;
Mánnel aj., 1991; Beuth aj.,
1991, Beuth aj., 1992), jakož i klinické studie (Beuth aj.,
1992) dokládají zvýšené uvolňování zánětových cytokinů (TNF-α, IL-1, IL-6), jakož i aktivaci buněčných složek imunitní soustavy (TH-buňky, TKbuňky).
Jako aktivní složka extraktů z jmelí se dnes považuje
60kDA lektinový protein (ML) z jmelí, který lze získat z extraktů bichemickou cestou (Franz aj., 1977; Gabius aj.,
1992). ML-protein se skládá ze dvou podjednotek spojených kovalentně S-S mostem, jejichž A-řetězec vyvolává enzymatickou deaktivovaci ribosomů (Endo aj., 1988) a jejichž B- řetězec vyvolává uhlovodíkovou vazbu. Biologická aktivita je podle dosavadního stavu znalostí odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990).
Znalost závislostí mezi strukturou a účinkem lektinů z jmelí (ML) je však dosud nepatrná. Tak je nejasný přínos jednotlivých řetězců a jejich rozdílné bichemické a enzymatické účinky, případně terapeutické účinky. Analýza závislostí mezi strukturou a účinkem je ztížena znečištěním • · · · · · · · · · • ····· · · · ···· · • · · · · · · ·· ·· ·· ··· ·· · · preparátů jinými látkami obsaženými v jmelí (Stein a Berg, 1994). Diskutuje se závislost aktivity extrakčních preparátů na různém složení preparátů (Hulsen aj., 1986), které opět závisí na hostitelských stromech (například jabloň, borovice, topol). Podobné účinky se postulují jak pro viskotoxiny (Garcia-Olmedo aj., 1993; Mendez aj., 1990), tak pro další viscuminy (například ML-2, ML-3) (Eifler aj, 1994). Dokonce i ML preparáty vyčištěné bichemickou cestou na vysokou čistotu (afinitní chromatografie) vykazují významnou heterogenitu (obrázek 8). Tato heterogenita se vztahuje na bichemicky měřitelnou aktivitu řetězců, na účinky vyvolané in vitro a in vivo, jakož i na samotnou strukturu proteinů. Variace struktury se diskutuje jak pro A i B-řetězce ML, tak pro variace v řetězcích. Gabius aj. (1992) a Dietrich aj. (1992) ukazují variabilitu řetězců AI a A2 u ML-1.
Aby se mohly terapeutické účinky lektinů z jmelí blíže studovat, je žádoucí jejich čistá příprava jako strukturně homogenní látky. Dále je pro odborný svět zajímavá možnost připravit lektin z jmelí nebo jeho součásti ve velkém množství v čisté formě, aby se mohl například nasadit jako účinná látka v léčivech. Tyto cíle nemohly být při současném stavu techniky dosaženy známými způsoby. Při isolaci z rostlinného materiálu se podle současného stavu techniky dostává heterogenní směs látek.
Heterogenita rostlinných preparátů lektinů z jmelí je působena mimo jiné potranslačním zpracováním ML-1 do isoforem ML-2 a ML-3, takže preparáty lektinů z jmelí v závislosfermentace vykazují aj., 1995). Každá z měnící uvede- 4 ti na metodice isolace nebo době se obsah ML-1, ML-2 a ML-3 (Jággy ných isoforem mimo to vykazuje dále jdoucí mikroheterogenitu, která je ukázána na obrázku 8 na příkladu ML-1 isoelektrickou fokuzací chromatografu.
Podstata vynálezu
Úkolem vynálezu tedy poskytnout lektin z jmelí v čisté formě v množství, které umožní zhodnocení ve velkém technickém měřítku. Úkol se řeší provedeními charakterizovanými v nárocích.
Tím se vynález se týká molekuly nukleové kyseliny, která (a) kóduje předprotein, který po dozrání vykazuje biologickou aktivitu dimerů lektinu z jmelí a který vykazuje na obrázku 4c ukázaný řetězec nukleotidů, (b) fragment předproteinu kódovaný podle (a), přičemž je fragment biologicky aktivní částí dimerů lektinu z jmelí, (c) liší se od molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b) degenerací genetického kódu molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b), nebo (d) za stringetních podmínek se hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle (a), (b) nebo (c) a kóduje polypeptid v (a) nebo (b) udanou biologickou funkcí nebo aktivitou.
V expresi řetězce genů lektinu z jmelí se mohou po prvé získat vycházeje z tohoto řetězce rekombinantní vysoce čisté jednotlivé řetězce (rMLA, rMLB), které se mohou reasociovat in vitro a tak dát rML-holoprotein, protein, který je homogenní chemicky, enzymaticky a strukturně. Reasociovaňý re kombinantní protein nevykazuje žádnou variabilitu a mikroheterogenitu, zejména vzhledem na primární strukturu a potranslační modifikace (glykosylace, fosforylace) a je zvlášú vhodný jako holoprotein, jako část řetězce a ve formě subfragmentu pro terapeutické použití.
Podle vynálezu se rozumí pod fragmentem předproteinu lektinu z jmelí každý fragment, tedy nejen přirozeně se vyskytující fragment, který je biologicky aktivní součástí dimerů lektinu z jmelí. Pro osvětlení se poukazuje na to, že odborník samozřejmě považuje za biologicky aktivní součásti dimerů lektinu z jmelí také takové součásti, které jsou součástí jednotlivých řetězců dimeru. Tím jsou předmětem vynálezu také jednotlivé řetězce a fragmenty, které jsou součástí na obrázku 4c zobrazeného řetězce.
Termín přirozeně ve spojení se součástí lektinu z jmelí znamená podle vynálezu, že takto označený fragment buď představuje řetězec dimeru lektinu z jmelí nebo je subfragmentem takového řetězce, který se přirozeně vyskytuje v řetězci. Tyto fragmenty jsou výhodně biologickou aktivní.
Pod biologicky aktivní se podle vynálezu se rozumí, že tyto fragmenty vykazují alespoň jednu biologickou funkci řetězce nebo dimeru, jak je v této přihlášce popsaná nebo jinou biologickou funkci jednotlivého řetězce nebo dimeru. Mimo to se rozumí pod biologicky aktivní také farmakologická a imunologická aktivita.
Pomocí rekombinantního ML-proteinu je mimo to po prvé možný výzkum přínosu jednotlivých domén a subdomén. Rekombi·· ·· ·· * ·· ·· • · · · · · · · · ··4 ··· ·· · · · · · • ····· · · · ····4
6· ♦ · · · · ·4 “ ···· ·· ·· ··· ·· ·· nantní ML-proteiny a rekombinantní podjednotky/části řetězce jsou základem odpovídajících definovaných preparátů s jednotlivými látkami jako náhrada extrakčních preparátů a standardizovaných extraktů.
Klonování genu kódujícího lektin z jmelí se mohlo překvapivě uskutečnit na bázi nové klonovací strategie poté, kdy selhaly konvenční klonovací strategie:
lektinu z jmelí ML-1 je známa řada chemických údajů o proteinu. Jsou to údaje o molekulové hmotnosti a struktuře podjednotek, zejména krátkých- peptidů na N-konci, jejich sekvence aminokyselin byla nezávisle popsaná Dietrichem aj. (1992) a Gabiusem aj . (1992) (viz také DE 4221836). Prakticky je nemožné připravit syntetické oligonukleotidy vycházeje z N-terminálních peptidů A- nebo B-řetězce na podkladě složení jejich aminokyselin a s tím spojeným stupněm degenerace, jejichž stupeň degenerace je dostatečně nízký, aby se došlo při skreeningu genomických knihoven genů k identifikace fragmentů ML-genů. To platí i pro cDNA-banky genů, které se připravily vycházeje z Viscum album póly-(A+) RNA.
Řetězová reakce polymerázy umožňuje amplifikaci úseků DNA, které leží mezi zmámými úseky (Erlich aj., 1988). Vycházeje ze stejnosměrného oligonukleotidu od N-konce MLA a protisměrného oligonukleotidu od N-konce MLB by byla myslitelná amplifikace mezilehlého úseku genu za předpokladu volnosti intronu ML-genu (obrázek la). V praxi ukazuje analýza N-terminální sekvence B-řetězce, že stupeň degenerace myslitelné kombinace oligonukleotidů pro úspěšné provedení • · · ·· · · · · · • ····» · · · ···· · • · · · · ··· ···· ·♦ ·· ··· ·· ·· tohoto základu je příliš vysoký. To se zakládá zvláště na Nterminální sekvenci B-řetězce nepříznivé pro konstrukci oligonukleotidu, pročež amplifikace sekvence ML-genu vycházející ze zmámých úseků aminokyselin není praktikovatelná (obrázek lb) .
Ke klonování ML-genu pomocí změněné PCR-strategie se proto zkoušelo nechat proudit ke konstrukci amplifikačního oligonukleotidu další proteinové údaje, zejména na základě příbuzenských vztahů lektinů z jmelí k ribosomy dezaktivovanými proteinům typu I a typu II (RIPs) (Stirpe aj., 1992). Na základě četných souhlasů (a) RIP proteinů typu I a A- řetězců ricinu, jakož (b) B-řetězců abrinu a ricinu se identifikovalo celkem 8 úsecích řetězců Zachovalé oblasti. Vycházeje z těchto oblastí řetězců a při použití tabulek využití kodonů příbuzných druhů se konstruovalo celkem 21 oligonukleotidů a nasadily se v různých kombinacích k více než 200 amplifikačním pokusům. V žádném případě však se nemohly získat specifické produkty, ačkoliv se měnily podmínky PCR, jako teplota spojení, obsah Mg2*, jakož i parametry cyklů v širokých mezích.
Jak skreening genomických a cDNA-bank tak také použití PCR-technik tedy nedovolily na základě uvedených úvah dosažení specifických ML-DNA-řetězců.
Hledaly se tedy nové cesty, jak nechat proudit ke konstrukci amplifikačního oligonukleotidu další strukturní vlastnosti abrinu a ricinu.
Protože zde nebyl vyloučen enzymatický mechanismus ri• · _ Q _ · · · · · ··· υ ···· ·· 99 999 99 99 bosomy dezaktivovaných proteinů (RIPs), zde zejména RIP- ricinu typu II, kterému se rovná ML (Endo aj., 1988a, 1988b), takže také strukturní souhlasy na hladině funkčních primárních a terciárních strukturních oblastí. Vycházeje z krystalické struktury ricinu Katzin aj., 1991, Rutenber a Robertus, 1991, Weston aj., 1994) dala analýza ohebností řetězce v řetězci A-ricinu návod na malou mobilitu Argl80, který leží uvnitř Zachovalé oblasti řetězce. Dále se provedla analýza na základě sférického uspořádání páteře řetězce možné substituce aminokyselin v této oblasti aktivního centra s ohledem na vzájemný vliv substrátu. Výsledky těchto úvah se nyní doplnily vyhodnocením uspořádání okolního řetězce.
S rozšířením výsledků porovnání sekvence o zavedení strukturních údajů se tak dostaly pravděpodobnostní údaje o zastoupení určitých aminokyselin v určitých polohách. Tím se umožnilo postulovat řadu teoretických ML- sekvencí aminokyselin pro tuto oblast a na jejich podkladě konstruovat odpovídající neobyčejně nepatrně degenerovaný oligonukleotid (RMLA2) (obrázek lc).
Nyní se mohly získat kombinací RMLA1 (degenerovaný oligonukleotid, který je odvozen z N-terminální sekvence aminokyselin, srovnej (obrázek lb) a podle shora uvedených úvah konstruovaný oligonukleotid s aktivním místem RMLA2 při definovaných PCR-parametrech vycházeje z komplexních genomických ML-DNA fragmentů, potom kdy všechny k tomu vedoucí alternativní pokusy zůstaly bez výsledku, jak je popsané shora.
• · _ · · · · · ··· — y — ···· ·· ·· ··· ·· ··
Doplnění sekvenční informace genu se nyní provedlo pomocí specifického nedegenerovaného priméru oligonukleotidu, odvozeného klonováním a sekvencováním fragmentu a (obrázek 3) dostupné genové části sekvence MLA a degenerovaných oligonukleotidů odvozených z RIP I a ricinu uspořádání sekvencí abrinu a ricinu s pomocí dalších PCR-amplifikací. Ke konstrukci degenerovaného B-řetězce oligonukleotidu se použilo uspořádání sekvencí B-řetězců ricinu a abrinu, kde se rovněž našly některé oblasti vysoké zachovalosti.
K expresi 5- a 3'-konců holoproteinu, B-řetězce dílčího fragmentu jakož i 5'- a 3'- nepřeložených úseků se vyjádřily odpovídající genové úseky pomocí techniky RACE (Frohman aj ., 1988) na isolované RNA analogy cDNA z jmelí syntetizované reversní transkripcí. Když bylo k dispozici více vždy se překrývajících fragmentů genu (obrázek 3), potom se vyjádřily úplné genové úseky A-řetězců a B-řetězců, vždy vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí, opět pomocí specifické PCR. Genové úseky rMLA a rMLB opatřené koncovými modifikacemi jsou ukázány na obrázcích 4a a 4b. Úplná genová sekvence ML zahrnující také nepřeložené 5'- a 3'- oblasti a také genové úseky kódující endopeptidy a signální peptidy jsou ukázány na obrázku 4c.
V jedné výhodné formě provedení molekuly nukleové kyseliny dle vynálezu je fragment A-řetězce lektinu z jmelí, který je kodován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4a (MLA).
V další výhodné formě provedení molekuly nukleové kyše- liny dle vynálezu je fragment B-řetězce lektinu z jmelí, který je kódován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4b (MLB).
Další výhodná forma provedení vynálezu se týká molekuly nukleové kyseliny, kterou je molekula DNA.
Podle vynálezu se rozumí DNA molekulou jak genomická, tak také cDNA molekula nebo (polo)syntetická DNA molekula. Způsoby přípravy těchto různých DNA molekul jsou odborníkovi na základě poučení podle vynálezu známé.
V další výhodné formě provedení vynálezu je molekulou nukleové kyseliny molekula RNA.
Vynález se dále týká molekuly nukleové kyseliny, kterou je protisměrný pás k dříve popsané molekule nukleové kyseliny. Takový protisměrný pás se může nasadit například za účelem inhibice transkripce a tím pro studie exprese nebo regulace v rostlině.
Vynález se dále týká vektoru, který obsahuje alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny dle vynálezu.
Vektor dle vynálezu může například obsahovat jedinou molekulu nukleové kyseliny dle vynálezu, která kóduje celý preprotein lektinu z jmelí. Protože tento vektor je vektor exprese, může se preprotein zpracovat ve vhodně transformovaném hostiteli a monomerní jednotky se mohou spojit na dimer lektinu z jmelí in vivo nebo in vitro. V jiné formě provedení je vektorem dle vynálezu vektor, který je nasazen jen k propagaci nukleové kyseliny dle vynálezu.
Ve výhodné formě provedení vynálezu obsahuje vektor dle • · · · · · ···· • ··· · · · · · ···· · -1Ί- · · · · · ···
XX ···* ·· ·· ··· ·· ·· vynálezu jak molekulu nukleové kyseliny, která odtud kóduje Ά-řetězec lektinu z jmelí nebo jeho fragment, tak molekulu nukleové kyseliny, která odtud kóduje B-řetězec lektinu z jmelí nebo jeho fragment. Výhodně jsou fragmenty monomeru biologicky aktivní.
V jiné výhodné formě provedení vynálezu je vektor dle vynálezu vektorem exprese. Odborníkovi je jasné, jak dá k dispozici vhodné vektory exprese pro různé hostitelské organismy. Dle vynálezu by se při heterologní expresi vyjádřila kódující sekvence A-řetězce lektinu z jmelí specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí. Přes nekomplementární oblasti nasazeného oligonukleotidového priméru se při tom přidaly kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz, čímž se umožnilo klonování a oddělená exprese A-řetězce lektinu z jmelí vycházeje z genomicky přístupného genu předlektinu z jmelí.
Oblast 5'-, která je pro kódující sekvenci rMLA odpovídající zbytku aminokyseliny tyrosin1-tyrosin17 (Dietrich aj ., 1992, Gabius aj., 1992) se vyjádřila za zapojení translačního startovacího kodonu jako syntetický fragment genu hybridizací a klonováním dvou oligonukleotidů. Tím se umožnila optimalizace sekvence genu s ohledem na výběr kodonu, jak je popsána pro silně vyjádřený gen v Escheria coli (Gribskov aj., 1984). Na 3'-konec syntetického fragmentu rMLA-genu a také na 5'-konec fragmentu genu rMLA vyjádřeného . pomocí PCR se zavedlo cílenou výměnou kodonu tyrosin17 z TAT na TAT restrikční místo střihu Ssp I, které umožnilo spojení • · · · · · ···· • ··· · · · · · ··· · · • · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· ·· obou fragmentů genu rMLA při vyjádření vektoru pML4-17 (obrázek 5). Sekvence kódující rMLA se potvrdila sekvencováním DNA (obrázek 4a). K expresi rMLA v Escheria coli se nastavila genová sekvence isolovaná z vektoru pML4-17 a vložením do vektoru exprese pl7-7 (Studier a Moffart, 1986) za kontroly promotorů T7-RNA polymerázy. S vzniklým vektorem exprese pl7-MLA (obrázek 5) se transformoval kmen exprese BL21 Escheria coli. Zavedení genu exprese je charakterizováno vystoupením proteinového pásu odpovídajícího neglykosylovanému rekombinantnímu A-řetězci lektinu z jmelí, který má relativní molekulovou hmotnost 25 kDa. Důkaz a identifikace rekombinantního produktu exprese se provedly Western-Blot analýzou s použitím specifické anti-MLA-protičástice (obrázek 7).
K heterologní expresi B-řetězce lektinu z jmelí se amplifikovala úplná kódující sekvence MLB specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí. Při tom se zavedly přes nekomplementární oblasti nasazeného oligonukleotidového priméru kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz (obrázek 6). Vzniklý 0.8 kDa produkt se nastavil po klonování v TA-klonovacím vektoru pCRII insercí do vektoru exprese pT7-7 za kontroly kontrolními prvky translace a transformoval se vzniklým vektorem exprese pT7-MLB kmenu exprese BL21 Escheria coli.
Integrita kódující sekvence MLB se potvrdila sekvencováním DNA (obrázek 4b). Důkaz exprese se provedl Westernovou skvrnovou analýzou s použitím specifické anti-MLB- protičástice (TB33, Tonevitsky aj., 1995), přičemž 2 hodiny po zave13 dění genu exprese se objevil imunoreaktivní protein s relativní molekulovou hmotností 31 kDa, odpovídající neglykosylovanému rekombinantnímu B-řetězci lektinu z jmelí (obrázek 7b). Analýza fragmentů buněk po úplném rozkladu buněk Escheria coli ukázala rozdělení syntetizovaného rMLB-řetězce v rozpustného podílu zbytku, a též v nerozpustných inklusních částicích”. Podíl v sedimentu rozkladu buněk Escheria coli, přičemž 4 hodiny po zavedení podíl rozpustného a nerozpustného podílu tvořil vždy 50 % celkového výtěžku (obr.
7b) .
Dále se vynález týká hostitele, který je transformován alespoň jedním vektorem dle vynálezu.
Podle určení cíle odborníkem se může pomocí hostitele dle vynálezu připravit pouze jeden z obou monomerů nebo kombinace obou monomerů, s výhodou jako asociovaný dimer. Hostitelem dle vynálezu může být eurokaryontní nebo prokaryontní buňka, transgenní rostlina nebo transgenní zvíře.
Hostitelem dle vynálezu může být s výhodou savčí buňka, rostlinná buňka, bakterie, buňka houby, buňka kvasinky, hmyzí buňka nebo transgenní rostlina.
Ve zvlášť. výhodném provedení je hostitelem dle vynálezu bakterie Escheria coli, buňka houby Aspergillus nebo hmyzí buňka Spodoptera, s výhodou buňka Spodoptera frugiperda.
Vynález se dále týká polypeptidu, který se kóduje molekulou nukleové kyseliny dle vynálezu nebo vektorem dle vynálezu a nebo je produkován hostitelem dle vynálezu.
Polypeptid dle vynálezu vykazuje s výhodou biologickou ··
• · · ·· ·· · • · ·· «·· · · • · · • · ·· aktivitu A-řetězce nebo B-řetězce lektinu z jmelí. V jiných formách provedení však může polypeptid dle vynálezu vykazovat jen část biologické aktivity nebo dokonce žádnou biologickou aktivitu. Pod částí biologické aktivity se podle vynálezu rozumí bud' zmenšená aktivita a nebo řada aktivit z biologického aktivitního spektra. Polypeptidem dle vynálezu také může být fragment A-řetězce nebo B-řetězce, který má shora uvedené vlastnosti.
Studium vlastností rMLA, rMLB a rML-holoproteinu (I) Relativní molekulová hmotnost a struktura
Relativní molekulové hmotnosti se stanovily elektroforézou na SDS-polyakryamidovém gelu za redukčních podmínek a následujícím barvením proteinů stříbrem, připadne Coomasiovou briliantní modří, případně imunologickým barvením v rámci Westernové skvrnové analýzy.
Při tom se překvapivě zjistilo, že rekombinantní neglykosylovaný A-řetězec lektinu z jmelí má relativní molekulovou hmotnost 25 kDa a tím se významně liší od přírodních Ařetězců lektinu z jmelí A s 31 kDa a Az s 29 kDa. Tento rozdíl v relativní molekulové hmotnosti je překvapující především proto, že ve stavu techniky se vycházelo z toho, že A-řetězec není glykosylováný. Rekombinantní B-řetězec lektinu z jmelí má relativní molekulovou hmotnost 31 kDa a tím je významně lehčí než glykosylovaný přírodní B-řetězec lektinu z jmelí s 36 kDa (obrázek 7).
Heterogenrta vyskytující se u přírodních ML-proteinů na základě glykosylaue a nebo variací řetězců, které se ukazují • ·
v SDS-gelu jako široké pásy, se v žádném případě neobjevuje u rekombinantních druhů.
Relativní molekulové hmotnosti rMLA/rMLB holoproteinů (rML) se sčítají na 56 kDa ve srovnání k těžkému nMl s 65-67 kDa.
(II) Isoelektrická homogenita rMLA se ukazuje jako isoelektricky homogenní protein s isoelektrickým bodem 6,8 na rozdíl k vysoce čistým přírodním A-řetězcům lektinu z jmelí, které se dělí na 4 typy s isoelektrickými body 5,2, 5,4, 5,7 a 6,2 (obrázek 8).
rMLB se ukazuje jako isoelektricky homogenní protein s isoelektrickým bodem 5,1 na rozdíl k vysoce čistému přírodnímu B-řetězci lektinu z jmelí, který se dělí nejméně na 2 typy s isoelektrickými body 7,1 a 7,3 (obrázek 8).
Tím se ukazuje u přírodního ML-holoproteinu řada variací a kombinací molekul (obrázek 8 níže), zatím co u rekombinantních proteinů lektinu z jmelí se ukazuje jednotná mobilita při IEF chromatofokuzaci, což dokumentuje homogenitu rML na rozdíl k mikroheterogenitě přírodních druhů proteinu.
(III) Enzymatická aktivita rMLA
Nasazením rMLA preparátů vyčištěných imunoafinitně ve spojeném testu transkripce/translace se dokázala aktivita rMLA inhibující translaci (isolovaný z rozpustného podílu zbytku) a rMLA (isolovaný z podílu nerozpustných inklusních částic) .
rMLA vykazuje na rozdíl k přírodnímu B-řetězci lektinu z jmelí rozdílnou potlačovací charakteristiku s ohledem na ··· · · · · · · · • ····· · · · ···· · • · ♦ · · · · ·· ·· · · ·*· ·· ·· závislost inhibice translace na dávce a také s ohledem na neinhibovatelnou zbytkovou translační aktivitu v použitém lysátu retikulocytů, viz obrázek 9. Enzymatická vlastnost, která představuje základ toxického účinku ML-holoproteinů, je u rekombinantních druhů významně snížena.
(IV) Aktivita rMLB vázající uhlovodíky rMLB-řetězce, které se připravily renaturací a reoxidací z primárních produktů exprese, a také rMLA/rMLB, rMLA /MLB a MLA/rMLB holoproteiny vykazují aktivitu vázající uhlovodíky, která se dá dokázat testem spojení enzymu s lektinem (ELLA) vazbou na uhlovodíkovou matrici asialofetuinu nebo fetuinu. Uhlovodíkovou specifitu rekombínantního rMLBřetězce lze určit a kvantifikovat v ELLA soustavě za kopetitivních podmínek pro galaktózu, β-laktózu, N-acetyl- galaktosamin (GalNac) a kyselinu sialinovou (kyselinu N-acetylneuraminovou, NANA). Kopetitivní ELLA při tom ukazuje překvapivě rozdílnou uhlovodíkovou specifitu pro nMLB a rMLB. Vazebná afinita se při tom popsala specifickými pro soustavu hodnotami IC50 pro poloviční maximální vytěsnění proteinů z imobilizovaného ligandu asialofetuinu galaktózou (IC50 nMLB: 4,5 mM, IC50 rMLB: vzhledem k malé reaktivitě nebyla stanovitelná), β-laktózou (IC50 nMLB: 4,9 mM, IC50 rMLB: > 70 mM), N-acetyl-galaktosaminem (IC50 nMLB: 20,7 mM, IC50 rMLB: 109 mM), nebo z imobilizovaného ligandu fetuinu kyselinou sialinovou (IC50 nMLB: 49,8 mM, IC50 rMLB: 47,1 mM).
Zatím co nMLB-řetězec lektinu popsaný jako specifický pro galaktózou je podle očekávání kompetitivní s galaktózou • ·
- 17 - · · · · · · · · • · · · · ♦ ·· ··· ·· · · a β-laktózou, neukazuje rekombinantní rMLB-řetězec připravený v Escheria coli žádnou reaktivitu s B-laktózou. Rekombinantní rMLB má místo toho zřetelnou afinitu k N-acetyl- galaktosaminu a kyselině sialinové a tím ukazuje ve srovnání s rostlinnou nMLB překvapivě zřetelný posun uhlovodíkové specifity k lektinu specifickému k N-acetyl-galaktosaminu a kyselině sialinové. S ohledem na biologickou aktivitu rMLB a holoproteinů obsažených v rMLB se naskýtá možnost pro rozšířené či rozdílné spektrum pro ligandy, receptory nebo cílové buňky ve srovnání k přírodním proteinům lektinu z jmelí.
V jedné výhodné formě provedení polypeptid dle vynálezu obsahuje alespoň jednu chemickou nebo enzymatickou modifikaci .
Tato modifikace může také měnit danou biologickou aktivitu polypeptidu, snižovat ji nebo zvyšovat. Taková modifikace může například nastat po translaci a isolaci polypeptidu. Na druhé straně lze takové modifikace zavést při chemické nebo polosyntetické přípravě polypeptidu dle -vynálezu. Tyto modifikace může zavést odborník způsobem o sobě známým, aby změnil biologickou aktivitu, s výhodou ji zvýšil.
V další výhodné formě provedení je polypeptid dle vynálezu spojený protein. Spojený protein vykazuje výhodně shora definovanou biologickou aktivitu.
Také tato forma provedení polypeptidu dle vynálezu je výhodně zaměřena na to, aby změnila farmakologické vlastnosti polypeptidu lektinu z jmelí pro další cíle na buněčné
hladině, s výhodou ji zlepšila.
Dále se vynález týká dimeru polypeptidu s biologickou aktivitou lektinu z jmelí, přičemž oba monomery se kódují molekulami nukleové kyseliny dle vynálezu.
Pod biologickou aktivitou lektinu z jmelí se rozumí každá biologická aktivita ze spektra všech biologických aktivit lektinu z jmelí. Jednou takovou funkcí je například farmakologický účinek lektinu z jmelí.
V četných lidských a myších rakovinných buňkách rostlinný lektin-1 indukoval smrt buněk apoptosickými mechanismy (Janssen aj., 1993). Lektin-1 z jmelí případně samotný Břetězec indukovaly uvolnění cytokinů z periferních mononukleárních buněk zdravých lidských dárců krve (Hajto, 1990) . Lektin-1 z jmelí indukoval vylučování superoxidovaných aniontů z neutrofilních granulocytů pacientů s rakovinou (Timoshenko, 1993). Lektin-1 z jmelí indukoval expresi A- řetězce receptorů interleukinu-2 (CD25) případně HLA-DQ- antigenu periferních lymfocytů zdravých lidských dárců krve (Beuth, 1992). Po aplikaci lektinu-1 z jmelí u myší se měřil přírůstek počtu buněk brzlíku, počtu cytotoxických T- lymfocytů (Lyt-2+) a pomocných T-buněk (L3T4+) v brzlíku a počtu peritoneálních makrofágů, zvláště těch, které nesou značku aktivace MAC-3 (Beuth, 1994) . Také se zvýšil u pokusných zvířat poměr L3T4+/Lyt2+ v brzlíku. V periferní krvi myší se zvýšila po ošetření lektinem-1 z jmelí hustota obecně leukocytů, lymfocytů, monocytů, a speciálně lymfocytů, které vyjadřují receptor interleukinu-2 jako značku aktivace (Beuth,
- 19 - · ····”;;
···· ·· ·· ·*· ·· ··
1994). V krvi pacientů s rakovinou zvýšil lektin-1 z jmelí hustotu T-lymfocytů (CD4+,CD8+), přirozených zabijáckých buněk a B-lymfocytů (Beuth, 1992).
Dále se dokázalo zvýšení endogenních opiátových mediátorů β-endorfinu v krevní plasmě u pacientek s rakovinou prsu po aplikaci lektinu-1 z jmelí (Heiny, 1994). Mimo to se dokázalo, že lektin-1 z jmelí zvyšuje cytotoxický účinek periferních přirozených zabijáckých buněk proti rakovinným buňkám K-562 a hustotu velkých granulárních lymfocytů (LGL) v periferní krvi (Hejto, 1989). Antimetastázovou aktivitu lektinu-1 z jmelí na myší buňky sarkomu doložil (Beuth, 1991) .
V jiné formě provedení vykazuje dimer polypeptidu dle vynálezu stejné spektrum biologických aktivit jako přirozený lektin z jmelí.
(V) Biologická aktivita rekombinantního lektinu z jmelí
Exprese rML-holoproteinu za použití odděleně rekombinantně syntetizovaných jednotlivých řetězců se podařila ze složených rozpustných řetězců nebo z denaturovaných rMLAa rMLB-řetězců v rámci společného složení, přičemž se výhodně rMLB reasocioval in vitro s molárním přebytkem rMLA v přítomnosti glutathionového redox systému a částečně v přítomnosti protein-disulfidové isomerázy. rML- holoprotein odpovídající heterodimeru se isoloval a čistil za oddělení volných rMLA- a rMLB-dimerů afinitní chromatografií na Nacetyl-galaktosamin-agaróze a laktosyl-agaróze z reasociované předlohy. Analogickým způsobem se připravily rMLA/rMLB • ·· · · ··· 9 9 99
9 9 9 9 9 99 99
- 2 Ο - 9 9 9 9 9 99
9999 99 99 999 9999 (rML) a rMLA/nMLB heterodimery-holodimery.
Cytotoxická aktivita
Cytotoxický účinek se testoval jako příklad biologické aktivity reasociovaných holoproteinů na lidské linii leukemických monocytů (M0LT4). Jak Ά-řetězec (povrchová vazba) tak také B-řetězec (enzymatická dezaktivace ribosomů) mají přínos k pozorovanému cytotoxickému účinku. rMLA/rMLB holoprotein reasociovaný in vitro a také rMLA/nMLB holoprotein reasociovaný in vitro se srovnávaly se dvěma šaržemi přírodního nML-holoproteinu. Rekombinantní rMLA/rMLB a rMLA/nMLB holoproteiny ukazují srovnatelně vysoké cytotoxické vlastnosti s hodnotami IC50 okolo 10-30 pg/ml (obrázek 11), což dokumentuje funkční integritu a biologickou aktivitu in vitro reasociovaných holoproteinů za použití rekombinantních řetězců. K výkonu cytotoxické aktivity je při tom potřeba funkční spojení B-řetězce s enzymaticky aktivním A- řetězcem, protože isolovaný rMLB-řetězec překvapivě neukazoval žádnou cytotoxickou aktivitu. Dosud diskutovaná cytotoxická aktivita přírodního B-řetězce lektinů z jmelí by se měla přičíst zbytkovému obsahu nML-holoproteinu. S rekombinantní expresí jednotlivých řetězců se tedy po prvé naskytla možnost odděleného popsání a použití aktivity vázající uhlovodíky a enzymatická aktivita lektinů z jmelí.
Indukce apoptosy
Pro monocytovou buněčnou linii U937 se dokázala schopnost indukce apoptosy rekombinantním rML-holoproteinem jako příklad biologické aktivity lektinů z jmelí. Ošetřením buněk
pg/ml se při tom mohla dokázat indukce apoptosy rML- holoproteinem po 24 hodinách (obrázek 12). Při pokusech s lektinem z jmelí na buňky MOLT-4 a mononukleární buňky se mohlo ukázat, že v oblasti nízkých dávek indukce apoptosních pochodů je základem cytotoxické aktivity lektinu z jmelí. Protože v koncentrační oblasti nízké cytotoxicity dochází k indukci cytokinů (obrázek 13, obrázek 14) hodnověrná. Naproti tomu je v oblasti vysokých dávek a také při delší době inkubace apoptosa překryta nekrotickými účinky. Cytotoxicita jako následek apoptosy nemohla být při ošetření citlivých buněk MOLT-4 rekombinantním B-řetězcem zjištěna, takže biologická aktivita indukce apoptosy v oblasti nízkých dávek mohla být odvozena jen od účinků holoproteinu.
Aktivita stimulující imunitu
Účinky stimulující imunitu jako biologické aktivity rekombinantního holoproteinu lektinu z jmelí se ukázaly na příkladu indukce uvolnění nekrotického faktoru tumoru-a (TNF-α) a interferonu-gamma (IFN-gamma) z lidských mononukleárních buněk zdravých dárců krve (PBMC-model) a také na příkladu indukce uvolnění interleukinu-lo? (IL-la) a interleukinu- 6 (IL-6) v společné kultuře lidských primárních keratinocytů a kožních fibroblastů (model kůže2- ZK1200). Tak se ukázalo v PBMC-modelu na dávce závislé uvolnění TNF-a a IFN-δ po 3-48 ng/ml kombinantního rML-holoproteinu, v modelu kůže2-ZK1200 na dávce závislé uvolnění IL-Ια a IL-6 po 0,25-8 ng/ml kombinantního rML-holoproteinu.
Všechny jmenované cytokiny jsou relevantní stimulující • · mediátory lidské imunitní soustavy, kterým náleží centrální funkce především při aktivaci buněčné imunitní odpovědi.
Na rozdíl od dosavadního stavu znalostí, podle kterého je aktivita stimulující imunitu odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990), nemohlo se indukovat samotným rekombinantním rMLB-řetězcem zádně shora uvedené uvolňování cytokinů. Stimulující aktivita se mohla dosáhnout v oblasti nízkých dávek pouze funkčně spojeným rML- holoproteinu. Tento překvapivý výsledek dovoluje závěr, že preparáty přírodního nMLB-řetězce stimulující imunitu obsahovaly ještě stopy nML-holoproteinu a stimulující účinek přičítaný nMLB-řetězci se musí přičíst zbytkovému obsahu nML. Zatím co dosud popsaný způsob preparace nMLB tedy neumožňuje kvantitativní oddělení holoproteinu, při rekombinantní expresi jednotlivých řetězců lektinu z jmelí se po prvé naskytla možnost studia a přípravy homogenních preparátů B-řetězce lektinu z jmelí. To po prvé dovoluje oddělené popsání a použití biologické aktivity A- a B-řetězců a také rozlišení biologické aktivity jednotlivých řetězců a funkčně spojeného holoproteinu.
(V) Biologická aktivita rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí (rMLB)
Jako výraz aktivace imunokompetentních buněk se studovala indukce proteinu CD69 na povrchu buněk. CD69 se objevuje j4X0 jeden z prvých antigenů na povrchu buněk po aktivaci T-buněk, B-buněk a zejména přirozených zabijáckých buněk (přirozené zabijácké buňky NK-buňky). CD69 při tom předsta23 • ···· · · 9 ···· ·· ·· ··· ·· vuje značku aktivace shora uvedených imunokompetentních populací buněk, protože protein na povrchu buněk se nevyjadřuje na klidových lymfocytech. Mimo to se dokázala pro indukovat elný protein na povrchu buněk CD69 podpůrná funkce pro cytotoxickou aktivitu NK-buněk a TcRgamma/delta T-buněk (Moretta aj., 1991). Průtokovou cytometrií se mohla za použití anti-CD69-mAk zjistit v koncentrační oblasti 1-100 ng/ml aktivace mononukleárních buněk, jak s ohledem na objevení se CD69 na povrchu buněk, tak s ohledem na podíl CD69 positivních buněk. Při tom se ukázala zvonovitá křivka závislosti na dávce což ukazuje na nutnost sesíťování buněčných receptorů přes obě vazná místa pro ligandy rMLB-řetězce. Cytotoxický účinek na zde studované PBMC se také nemohl dokázat při nejvyšší koncentraci 100 ng/ml rMLB.
Ve výhodné formě provedení se ukazuje dimer polypeptidu dle vynálezu jako alespoň na jednom z monomerů chemicky nebo enzymaticky modifikovaný polypeptid dle vynálezu nebo spojený protein dle vynálezu.
Modifikacemi se mohou optimalizovat na silný účinek, také sé mohou vypnutím jednotlivých kvalit účinku (například vazbná místa pro uhlovodíky B-řetězce či aktivita glykosidázová A-řetězce), které by rozšířily terapeutické možnosti použití při vyloučení případných vedlejších účinků. Polypeptidy se změněnými vlastnostmi by mohly sloužit také jao nástroje k objasnění mechanismu účinků. Pro určené terapie může být nutné zmenšit antigenitu a imunogenitu polypeptidů a nebo optimalizovat jejich farmakokinetické vlastnosti, což by •· ·
bylo možné cílenou výměnou jednotlivých aminokyselin.
Mimo to se vynález týká antičástice nebo jejího fragmentu či derivátu, které specificky vázají polypeptid nebo dimer polypeptidu dle vynálezu. Tak nepoznávají přirozený lektin z jmelí nebo jeho jednotlivé řetězce. Výhodně antičástice dle vynálezu vázají epitopy, které se maskují glykosylací přírodního lektinu z jmelí. Antičásticemi mohou být monoklonální, polyklonální nebo (polo)syntetické antičástice. Fragmenty mohou být například Fab'-, F(ab)2- nebo Fvfragmenty. Také deriváty antičástic jsou podle stavu znalostí známé.
Vynález se dále týká způsobu přípravy polypeptidu nebo dimeru polypeptidu dle vynálezu, při kterém se pěstuje hostitel dle vynálezu za vhodných podmínek a tak získaný polypeptid nebo dimer polypeptidu se isoluje.
Odborníkovi jsou známé vhodné podmínky pro pěstování a isolaci hostitele. Tak se může například polypeptid nebo dimer polypeptidu dle vynálezu dostat z hostitele pomocí vhodné expresní soustavy a sbírat v mediu. Jindy mohou polypeptidy nebo dimery polypeptidu zůstat v buňce a isolovat se z ní. Nyní se představí další výhodná forma provedení vynálezu :
K isolaci rMLA šla celá sklizeň buněk Escheria coli transformovaných vhodným vektorem exprese a oddělení rozpustných a nerozpustných částí buněk centrifugací. Analýza frakcí buněk ukázala, že rekombinantní A-řetězec lektinu z jmelí se akumuluje v závislosti na podmínkách exprese
a době exprese na 5-50 % rozpustné formy a na 50-95 nerozpustných proteinových agregátů inklusních částic.
Výskyt rozpustných a nerozpustných proteinů dává nejméně dva způsoby isolace rMLA. rMLA agregovaná na inklusní částice se rozpustila po promytí usazeniny pro odstranění proteinů
Escheria coli (Babbitt aj., 1990) za denaturačních podmínek a 90-násobným zředěním a znovu se složila v skládacím ústoji (50 mM Tris-HCl, 2 mM DTT, 1 mM
EDTA, pH 8,0).
Při této proceduře vznikly j ednak rozpustné složené druhy proteinů, které jsou zcela enzymaticky aktivní jako renaturované, původně nerozpustné denaturované druhy rMLA, jak obrázek 9 ukazuje.
lace rozpustné rMLA se
Isolace renaturované rMLA a také iso může provést imunoafinitní chromatog rafií s použitím specifické anti-MLA-protičástice TA5 (Tone vitsky aj., 1995).
S výskytem rMLB v rozpustné formě a také formě nerozpustných inklusních částic se dávají nejméně dva způsoby pro isolaci rMLB z rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí .
Pro isolaci rMLB z rozpustného B-řetězce ze silně redukčního prostředí cytoplasmy Escheria coli vede ku vzniku intrachenárních disulfidovych můstků inkubace redox-soustavy z redukovaného a oxidovaného glutathionu a také stabilizace aktivních produktů složení ligandů β-laktózy. Z násady pro složení se selektivně isoloval, případně čistil, v jednostupňovém způsobu aktivní rMLB-řetězec vázající uhlovodíky afinitní chromatografií na laktosyl-agaróze nebo na N- ace26 • · · ·· · · · · · • ··· · · · · · »··· · • ···· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· tyl- galaktosamin-agaróze.
K isolaci rMLB z nerozpustného, jako inklusní částice dostupného podílu produktu exprese se promyla usazenina celé sklizně buněk Escheria coli pro odstranění proteinů (Babbitt aj., 1990) a rozpustila se za denaturačních a redukčních podmínek. Renaturace se dosáhla zředěním v přítomnosti redox- soustavy z redukovaného a oxidovaného glutathionu a také ligandů β-laktózy, přičemž se z renaturační násady selektivně isoloval, případně čistil, aktivní rMLB-řetězec vázající uhlovodíky afinitní chromatografií na N-acetyl- galaktosamin- agaróze nebo na laktosyl-agaróze.
Vynález se dále týká léku, který obsahuje polypeptid dle vynálezu, nebo dimeru polypeptidu dle vynálezu a nebo níže popsaného imunotoxinu případně s farmaceuticky snesitelným nosičem.
Polypeptidy dle vynálezu, jejich asociáty nebo modifikace jsou vhodné pro všestranné použití při terapii rakoviny a infekcí s farmakologickými vlastnostmi odpovídajícímu přírodnímu lektinu z jmelí. Imunitu stimulující vlastnosti se mohou využít pro terapii tumorů, přičemž se přímou nebo nepřímou stimulací uschopní imunitní obrana vlastní tělu, aby účinněji bojovala s tumorem či eventuálními metastázami. Totéž platí i pro infekce, zejména virová onemocnění. Polypeptidy dle vynálezu se mohou podávat také podávat v kombinaci s jinými imunostimulanty, například interferony, cytokiny kolonie stimulujícími faktory, aby se docílily synergické účinky případně se snížila dávka kombinačního partnera a tím • · ··· ·· ····· • ····· · * · ···· · _ _ · ·······
- 27 - ♦ ··· ·· ·· ··· ···· se snížily vedlejší účinky.
V kombinaci s cytostatiky nebo ozařováním se dá zmírnit nebo zmenšit vedlejší účinek leukopenie/potlačení myela, takže se redukuje oslabení imunitní soustavy vyvolané těmito nyní obvyklými způsoby léčení.
Přímý cytotoxický účinek polypeptidu s glykosidázovou aktivitou vede k apoptose buněk tumorů a může se využít pro terapii. Tento princip se může specifičtěji při použití imunotoxinů, když se polypeptidy dle vynálezu vázají na vhodné antičástice. Tím se vynález dále týká imunotoxinů, které obsahují alespoň jeden polypeptid případně dimer polypeptidů podle vynálezu. Příkladně může jít o spojení aktivního A-řetězce nebo holoproteinu na antičástici nebo její fragment způsoby proteinové chemie. Takové způsoby spojení jsou odborníkovi známé, odpovídající konjugáty všestranně použitelné (Vitetta, 1993). Alternativně se mohou přivést k expresi také odpovídajícím způsobem konstruované konstrukty spojených proteinů, které obsahují domény vázající antigen například z antičástic a mimo to cytotoxické fragmenty polypeptidu dle vynálezu.
Mimo to se může zabránit tvorbě metastáz, když se inhibuje vazba buněk tumorů na jiné buňky. Přes kompetitivní vazbu lektinu se může pomocí polypeptidu dle vynálezu zabránit této vazbě.
Vynález se dále týká priméru anebo páru primérú, které specificky hybridizují na molekule nukleové kyseliny podle vynálezu, případně k tomu hybridizují na komplementárním pá• · su.
Mimo to se vynález týká diagnostických sestav, které obsahují alespoň:
a) molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu,
b) primér anebo pár primérů, které specificky hybridizují na molekule nukleové kyseliny podle vynálezu, případně k tomu hybridizují na komplementárním pásu a nebo
c) polypeptid a nebo dimer polypeptidů podle vynálezu.
Diagnostická sestava podle vynálezu se může ve formě provedení, která obsahuje primér anebo pár primérů použít k tomu, aby se vyšetřily organismy na existenci genu lektinu a tak příkladně se našly nové geny lektinu, které by kódovaly farmakologicky zajímavé lektiny. Také molekula nukleové kyseliny podle vynálezu obsažená v diagnostické sestavě podle vynálezu se může použít, například v Southern-Blot analýze nebo Northern-Blot analýze, k tomu, aby se vyhledaly organismy na existenci odpovídajícího genu lektinu. Variací hybridizace se mohou mimo to vyhledávat příbuzné geny lektinu. Polypeptid a dimer polypeptidů se může použít například, k tomu, aby se generovaly antičástice nebo antiséra, se kterými by se mohly stanovit například o sobě známým způsobem odpovídající lektiny (z jmelí) v různých organismech.
Konečně se vynález týká prostředků na ochranu rostlin, které obsahují polypeptid případně dimer polypeptidů podle vynálezu. Polypeptidy dle vynálezu, jejich asociáty nebo modifikace se mohou použít v rámci ochrany rostlin odpovídajícím způsobem k funkci diskutované pro rostlinný lektin • · * * ·· ··· 99
9 9 9 9 9 99 · 9 99
9 9 9 9 9 9 99 9
99999 9 9 9 99999
9 9 9 9 9 99
9999 99 99 999 99 99 z jmelí. Při tom se funkce lektinu z jmelí diskutuje jak na podkladě vlastností toxinu jako volná ochrana rostliny, tak na podkladě vlastností, které působí na permeabilitu a konstituci.
Přehled obrázků na výkresech
Na výkresech značí: obr. 1 konstrukci primárního amplifikačního oligonukleotidu, obr. 2 primární ML-amplifikační produkt z Viscum album, obr. 3 klonovací strategii k expresi ML-genu, obr. 4 inserci vektorů exprese do rMLA a rMLB a úplná ML- genová sekvence, obr. 5 konstrukci vektoru exprese pro rMLA, obr. 6 konstrukci vektoru exprese pro rMLB, obr. 7 expresi rMLA a rMLB a imunologickou detekci, obr. 8 chromatografickou fokusaci rMLA a rMLB proti přírodní ML, obr. 9 enzymatickou aktivitu rMLA (RIP), obr. 10 uhlovodíkovou charakteristiku rMLB, obr. 11 MOLT4 cytotoxicita rML, obr. 12 indukci apoptosy pomocí rML, obr. 13 účinek stimulující imunitu rekombinantního lektinu z jmelí v PBMC-modelu, obr. 14 účinek stimulující imunitu rekombinantního lektinu z jmelí v modelu kůže2-ZK1200, obr. 15 indukci značkovače CD69 na povrchu buněk v PBMC- modelu
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce primárního amplifikačního oligonukleotidu
Lektin z jmelí (ML) patří k třídě ribosomy dezaktivovanými proteiny (Stirpe aj., 1992), které představují v rošt• · linách různého taxonomického původu široce rozšířenou rodinu proteinů. Ml byl na základě aktivit podjednotek přiřazen typu II ribosomy dezaktivovaných proteinů (Endo aj., 1988a).
K určení sekvence genů je však dostupná knihovna cDNA z Vis cum album a genomických bank genů nevhodná. Tak bylo nemožné určit specifické klony pro ML z Viscum album póly-(A+) RNA přes použití různých DNA sond. S domněnkou, že sekvence genů neobsahuje žádné introny, použila se PCRstrategie. Protože byla známá sekvence N-terminálních aminokyselin MLA- a také MLB-řetězce (Dietrich aj., 1992, Gabius aj., 1992), zdála se možná amplifikace kódující oblasti MLA při použití degenerovaného amplifikačního oligonukleotidu (obr. la). Ačkoliv se použitelný oligonukleotid s malým stupněm degenerace dá odvodit z N-konce MLA-řetězce (rMLAl, obr. lb), je nemožné konstruovat odpovídající oligonukleotidy s dostatečnou specifitou z N-konce MLB-řetězce (rMLBl, rMLB2, rMLB3, obr. lb).
Musely se tedy vyvinout alternativní strategie, které umožnily při vtažení proteinových údajů příbuzných proteinů odvození amplifikačního oligonukleotidu z ještě nezmámých oblastí ML-řetězce. Tak ukázala analýza řetězce aminokyselin ribosomy dezaktivovaných proteinů typu I a typu II řadu četných souhlasů Zachovalých oblastí s vysokým stupněm homologie. Obr. lc ukazuje vysoký stupeň příbuznosti typu I a typu II RIP na příkladě aktivního centra ricinu. Uvnitř motivu řetězce MISEAARF se pro E177 a R180 diskutovala účast na enzymatickém mechanismu (Kim aj., 1992, Lord aj., 1994). Z to··· · · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 · · * 9 9 ··
9999999
- Ji - 9999 99 99 999 »·99 ho se usoudilo, že by mohly být přítomné aspoň tyto oba zbytky ML-řetězce. Z dalších strukturních úvah ohledně přítomnosti jednotlivých zbytků, přičemž se bral ohled zvláště na zbytky s nízkým stupněm degenerace použití kodonů, vznikla konstrukce amplifikačního oligonukleotidu RMLA2. Sekvenci tohoto oligonukleotidu ukazuje obr. lc.
Příklad 2
Exprese specifických fragmentů DNA z ML-genu
Vysokomolekulární genomická DNA se isolovala z čerstvých listů Vis cum album (hostitelský strom Populus wilsonii) způsobem podle Baura aj. (1993). K expresi specifických fragmentů DNA z ML-genu PCR se nasadilo 100 ng genomické DNA na amplifikační násadu. Amplifikace se provedla v celkovém objemu 50 μΐ, obsahujícím PCR-ústoj (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 1,25 mM dNTP, pH 8,3), 78 pmol priméru RMLA1 a 50 pmol (násada 1) nebo 100 pmol (násada 2) RMLA2. PCR se uskutečnila s Taq-DNA-polymerázou (1,5E/násadu) od Boehringer Mannheim s termocyklovačem Biometra. Parametry PCR byly: 1 minuta denaturace 90 °C, 1 minuta žíhání 50 °C, minuta prodlužování 72 °C při celkem 30 cyklech. Produkty amplifikace se analýzovaly elektroforézou na 5 % polyakryamidovém gelu a barvením ethidium bromidem (obr. 2). V násadě obsažený specifický produkt amplifikace s velikostí asi 500 bp se isoloval gelovou elucí a nastavil se pro klonování v TA-vektorech.
| ·· | ·· | • | ·· | |||
| • · · · | • | • | • 9 | • · | • | |
| • · · | • | • | • | « · | ·· | |
| • ··· | • · | • | • | • ··· | • | • |
| • · | • · | • | • | • | • | |
| ···« | ·· | ··· | ·♦ | ·· |
Příklad 3
Klonovací strategie
Odvození amplifikačního oligonukleotidu nasazeného k primární PCR je ukázáno v příkladě 1 (obr. la), exprese primárního fragmentu ML-genu Viscum album, dále označeného jako a je ukázáno v příkladě 2 (obr. 2). Vycházeje z řetězce a a za předpokladu, že ML-gen neobsahuje žádné introny bylo nyní možné odvodit 5'-oligonukleotidy specifické pro sekvenci, se kterými se umožnila amplifikace fragmentů b, c, d a e. Zatím co 3'-oligonukleotid pro c se rovněž odvodil z DNA- řetězce a, musela konstrukce degenerovaného 3- priméru vést k amplifikaci fragmentů genu b, d, e a g analýzou homologních oblastí typu I (b) a typu II (d, e a g) proteinů RIP. Při tom se zase z porovnání sekvencí uvnitř rodin proteinů se usoudilo na výskyt jednotlivých zbytků, přičemž se bral ohled zvláště zbytky s malým stupněm degradace použití kodonu. Zejména se použily známé cDNA ricinu a abrinu a odvozené proteinové sekvence ke konstrukci asi 50 specifických kombinací oligonukleotidů. Na obrázku 3 jsou ukázány jen ty fragmenty genu, které byly klonovatelné jako specifické amplifikační produkty a mohly se přivést k další analýze. Vycházeje z jiných kombinací oligonukleotidů nemohly se generovat žádné další ML-specifické amplifikační produkty.
Exprese fragmentu genu f (kódující MLA-řetězce) a g (kódující MLB-řetězce) je podrobně popsaná v příkladě 5 a v příkladě 6.
K analýze 5'- a 3-konců přeložených a nepřeložených sekvenčních oblastí ML-genu se vytvořily podmínky k 5a 3-RACE (Frohman aj., 1988), které vedly k fragmentům h, i a j. Amplifikace fragmentu j s RACE PCR je tak alternativou k expresi úplných fragmentů genu MLB. Reakce RACE se prováděly s použitím cDNA, která se připravila reversní transkripcí isolované i s ŘNA z Viscum album listů jmelí (hostitelský strom Populus wilsonii).
Příklad 4
Sekvence DNA a produkty translace rMLA a rMLB
Vložení vektorů exprese pT7-MLA a pT7-MLB se sekvencovaly standardní postupem strategií kráčení priméru (vyšetření zcela se překrývajících sekvencí obou pásů) s použitím různých ML-specifických oligonukleotidů (obr. 4a, 4b).
Podtržené oblasti sekvencí označují restrikčních míst střihu ke klonování vektorů exprese pT7. Oba fragmenty genu se modifikovaly podle konstrukčního schématu pro vektory exprese popsanému v příkladě 5 a v příkladě 6.
Obr. 4c ukazuje úplnou genovou sekvenci odvozenou z označených fragmentů genu. Obsahuje jak 5- a 3- nepřeložené úseky tak genové úseky kódující endopeptidy a signální peptidy.
Příklad 5
Konstrukce vektoru exprese pT7-MLA
K heterologní expresi se vyjádřila kódující sekvence A-řetězce lektinu z jmelí specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z jmelí a koncově se modifikovala. Přes někom• · ~ Λ · · · · · ··
- - ···· ·· ·· ··· ·· ·ι plementární oblasti nasazeného oligonukleotidového priméru se při tom přidaly kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz, čímž se umožnilo klonování a oddělená exprese A-řetězce lektinu z jmelí vycházeje z genomicky přístupného genu předlektinu z jmelí.
Obr. 5 ukazuje expresi MLA-kódujících fragmentů genu pomocí PCR. K amplifikaci MLA-kodující sekvence genu se nasadilo 200 ng genomické DNA z Viscum album, 1,5 mM (násada 1) nebo 2,5 mM (násada 2) chloridu hořečnatého, po 40 pmol obou primérů oligonukleotidů RLM16 a RLM17 v PCR-ústoji (10 mM Tris-HCl, 50mM KC1, 0,25 mM každého dNTP, pH 8,3) v celkovém objemu 50 μΐ. PCR se uskutečnila s použitím TaqDNA-polymerázy (1,5E/násadu, Boehringer Mannheim) s celkem 30 cykly teplotního profilu 1 minuta denaturace 94 °C, 1 minuta žíhání 52 °C, 1 minuta prodlužování 72 °C. Produkty amplifikace se analýzovaly elektroforézou na 1 % agarózovém gelu a barvením ethidium bromidem (obr. 5b) gelovou elucí se nastavil pro klonování v TA-vektorech.
Oblast 5'-, která je pro kódující sekvenci rMLA odpovídající zbytku aminokyseliny tyrosin1-tyrosin17 (Dietrich aj ., 1992, Gabius aj., 1992), se vyjádřila za zapojení translačního startovacího kodonu jako syntetický fragment genu hybridizací a klonováním dvou oligonukleotidů. Tím se umožnila optimalizace sekvence genu s ohledem na výběr kodonu, jak je popsána pro silně vyjádřený gen v Escheria coli (Gribskov aj., 1984). Na 3'-konec syntetického fragmentu rMLA-genu a také na 5'-konec fragmentu genu rMLA vyjádřeného • » · · · · 9 9 9 ·· • ·· · · ··· · ··9
9 9 9 9 9 9 99 9
99999 9 9 9 99999
- 7 R - · ···· 9 99
9999 99 99 999 9999 pomocí PCR se zavedlo cílenou výměnou kodonu tyrosin17 z TAT na TAT restrikční místo střihu Ssp I, které umožnilo spojení obou fragmentů genu rMLA při vyjádření vektoru pML4-17 (obrázek 5) .
Generovaná úplná sekvence kódující rMLA se potvrdila sekvencováním DNA (obr. 4a). K expresi rMLA v Escheria coli se nastavila genová sekvence isolovaná z vektoru pML4- 17 a vložením do vektoru exprese pl7-7 za kontroly promotorů T7-RNA polymerázy a také terminátorů transkripce. Se vzniklým vektorem exprese pl7-MLA (obr. 5) se transformoval kmen exprese BL21 Escheria coli.
Příklad 6
Konstrukce vektoru exprese pT7-MLB
K heterologní expresi B-řetězce lektinu z jmelí se amplifikovala úplná MLB kódující sekvence specifickou PCR vycházeje z úplné genomické DNA z Vis cum album.- Při tom se zavedly přes nekomplementární oblasti nasazeného oligonukleotidového priméru kontrolní prvky translace, jakož i rozlišovací sekvence restrikčních nukleáz.
Obr. 6 ukazuje expresi celých rMLB úplně kódujících fragmentů genu pomocí PCR. K amplifikaci rMLB-kódujíčího fragmentu genu se nasadilo vždy 200 ng genomické DNA z Viscum album v PCR-násadách s primérem oligonukleotidů RLM25 a 30 pmol (násada 1) nebo 10 pmol (násada 2) priméru oligonukleotidů RLM26 v celkovém objemu 50 μΐ PCR-ústoje (10 mM Tris-HCl, 50mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM každého dNTP, pH
8,3). PCR se uskutečnila s použitím Taq-DNA-polymerázy • · (1,5E/násadu, Boehringer Mannheim) s 30 cykly 1 minuta denaturace 94 °C, 1 minuta žíhání 52 °C, 1 minuta prodlužování °C. PCR-produkty se analýzovaly elektroforézou na 1 % agarózovém gelu a barvením ethidium bromidem. Vznikl 0.8 kDa produkt, který se isoloval gelovou elucí a nastavil se pro klonování v TA-vektorech. Insercí do vektoru exprese pT7-7 se nastavil rMLB kódující fragment za kontroly kontrolními prvky translace se vzniklým vektorem exprese pT7-MLB se transformoval kmen exprese BL21 Escheria coli. Integrita vzniklé celé rMLB kódující sekvence se potvrdila sekvencováním DNA (obr. 4b).
Příklad 7
Exprese, imunologický důkaz, zpětné složení a in vitro reasociace rMLA a rMLB (I) Exprese rMLA v Escheria coli
K expresi rekombinantního A-řetězce lektinu z jmelí se naočkovalo 1000 ml LBAm^-media v 2 1 třepací baňce s překážkami s 5 ml stacionárně rostlé LBAmj?-předkultury z Escheria coli BL21/pT7-MLA a kultivovalo se při 37 °C za třepání, přičemž se růst sledoval měřením zákalu při 578 nm. Exprese genu se indukovala po dosažení hustoty buněk odpovídající ODs7s asi 0,9-1,0 přidáním 0,5 mM IPTG. Ke sklizni se buňky sedimentovaly 2 hodiny po indukci 20 minutovým odstřelováním při 5000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall) a kultivační medium se dekantovalo, přičemž se z 1 1 kultivačního media isolovalo 3-4 g (vlhká hmotnost) buněčné hmoty.
Rozbití buněk se dosáhlo Frenchovým lisem (SLM Instruments) . K tomu se sediment buněk znovu suspendoval v 20 ml osvětlovacího ústoje (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 8,0) a rozbil se dvěma průchody Frenchovým lisem při 10,335 MPa. Následujícím 30 minutovým odstředbváním při 10000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru SS-34 (Sorvall) se sedimentovaly nerozpustné zbytky buněk a také Zachovalé inklusní částice a oddělily se od zbytku rozpustných proteinů Escheria coli, případně od rozpustných produktů exprese.
K analýze exprese se prohlédly stejné objemy frakcí rozbitých buněk elektroforézou na 12,5 % SDS- polyakryamidovém gelu a barvením Coomasiovou briliantní modří a také Westernovou skvrnovou analýzou s použitím MLA- specifického antiséra TA5 (obr. 7a). Monoklonální antičástice TA5 (Tonevitsky aj., 1995) dal k dispozici autor. Podobně jako jiné zde použité antičástice jsou představitelné standardním postupem s použitím odpovídajících imunogenů (v případě TA5 je to ML-1 nebo MLA). K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy rozpustné frakce (stopa 2, 4, 6, 8) a také nerozpustné frakce inklusních částic (stopa 1, 3,5, 7) rozbitých buněk Escheria coli na obsah rMLA. K představení průběhu exprese se při tom nasadily vzorky (stopa 1 +2),2 hodiny (stopa 3 + 4), 4 hodiny (stopa 5+6) a 6 hodin (stopa 7-8) po zavedení genu exprese. Exprese se projevila již 1 hodinu po indukci objevením se imunoreaktivního 25 kDa produktu exprese, jehož maximum exprese se dosáhlo již 2 hodiny po in- 38 dukci. Rozdělení rMLA na rozpustné frakce a případně nerozpustné frakce bylo 2 hodiny po indukci vždy asi 50 %, přičemž delší doba exprese vedla k rostoucí tvorbě nerozpustných inklusních částic.
(II) Isolace rMLA z nerozpustných inklusních částic
Sediment rozbitých buněk Escheria coli se promyl dvakrát po 20 ml STET-ústoje (50 mM Tris-HCl, 8 % (hmotnost/ objem) sacharózy, 50 mM EDTA, 1 % (objem/ objem) Triton X-100, pH 7,4) podle Babbit a J. (1990), aby se odstranily nerozpustné- proteiny. Zbylý sediment se Zachovalými inklusními částicemi se rozpustil v 20 ml denaturačního ústoje (6 M gvanidiumchlorid, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) 16 hodinovou inkubací za třepání při pokojové teplotě.
K renaturaci rMLA se roztok proteinu v denaturačním ustojí pomalu přikapal do 90-násobného objemu skládacího ústoje (50 mM Tris-HCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0) a 16 hodin se za míchání inkuboval při pokojové teplotě. Znovu složený protein se oddělil 30 minutovým odstředbváním při 6000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall). Zbytek obsahující rMLA se zředil na 20 % (objem/objem) glycerinem a skladoval se při 4 °C.
(III) Čistění rMLA imunoafinitní chromatografií
K jednostupňovému čistění rMLA (rozpustný podíl produktu exprese nebo znovu složený protein) imunoafinitní chromatografií se kovalentně imobilizovalo 260 μ$ monoklonální antičástice anti-nMLA-IgG zaměřené proti A-řetězci lektinu z jmelí (TA5, Tonevitsky aj., 1995) na protein-A-sefaróze • · ·· ·· « ·· ·· ···· · · ·· · · · · ··· · · · · · · · • ···*· · · · ···· · • ♦ · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··
CL4B (Sigma, Deisenhofen) podle způsobu Harlova a Spura (1988). Po inkubaci v imunoafinitní matrici se vzorkem rMLA a promytí matrice 10 objemy sloupce promývacího ústoje (1 M NaCl, 10 mM fosfátový ústoj, pH 7,0) a 10 objemy sloupce promývacího ústoje (10 mM fosfátový ústoj, pH 7,0) k odstranění nespecificky vázaných proteinů se eluovala specificky vázaná rMLA elučním ústojem (0,1 M glycin, pH 2,5). Eluce vedla k obnovení hodnoty pH v předloze na 1 M fosfátový ústoj , pH 8,0.
(IV) Exprese rMLB v Escheria coli
K expresi rekombinantního B-řetězce lektinu z jmelí se naočkovalo 1000 ml LBAmj?-media v 2 1 třepací baňce s překážkami s 5 ml stacionárně rostlé LB^^-předkultury z Escheria coli BL21/pT7-MLB a kultivovalo se při 37 °C za třepání, přičemž se růst sledoval měřením zákalu při 578 nm. Exprese genu se indukovala po dosažení hustoty buněk odpovídající 0Dsve asi 0,9-1,0 přidáním 0,5 mM IPTG. Ke sklizni se buňky sedimentovaly 4 hodiny po indukci 20 minutovým odstředováním při 5000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall) a kultivační medium se dekantovalo.
Rozbití buněk se dosáhlo Frenchovým lisem(TM) (SLM Instruments) . K tomu se sediment buněk znovu suspendoval v 20 ml osvětlovacího ústoje B (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50mM KC1, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,2) a rozbil se dvěma průchody Frenchovým lisem při 10,335 MPa. Následujícím 30 minutovým odstředováním při 10000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru SS-34 (Sorvall) se sedimentovaly nerozpustné zbytky • · · · ·
buněk a také Zachovalé inklusní částice a oddělily se od zbytku rozpustných proteinů Escheria coli, případně od rozpustných produktů exprese.
K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy frakcí rozbitých buněk elektroforézou na 12,5 % SDS-polyakryamidovém gelu a barvením Coomasiovou briliantní modří a také Westernovou skvrnovou analýzou s použitím MLA-specifického antiséra TB33 (obr. 7b). Monoklonální antičástice TB33 (Tonevitsky aj ., 1995) dal k dispozici autor. Připravily se s použitím standardního postupu. Odpovídající antičástice jsou rovněž připravítelné odborníkem s použitím standardního postupu s ML-1 nebo MLB imunogenu. K důkazu exprese se prohlédly stejné objemy rozpustné frakce (stopa 2, 4, 6, 8) a také nerozpustné frakce inklusních částic (stopa 1, 3, 5, 7) rozbitých buněk Escheria coli na obsah rMLB. K představení průběhu exprese se při tom nasadily vzorky (stopa 1 + 2), 2 hodiny (stopa 3 + 4), 4 hodiny (stopa 5+6) a 6 hodin (stopa 7-8) po zavedení genu exprese. Westernová skvrnová analýza ukázala již 1 hodinu po indukci objevení se imunoreaktivního 31 kDa proteinového pásu odpovídajícího rMLB, přičemž se maximum exprese dosáhlo 4 hodiny po indukci. 4 hodiny po indukci se rozdělí množství rMLB vždy asi 50 % na rozpustné a případně nerozpustné frakce rozbitých buněk. Delší doba inkubace vedla k rostoucí akumulaci exprimované rMLB ve formě nerozpustných inklusních částic.
(IV) Isolace rMLB z nerozpustných inklusních částic
Sediment rozbitých buněk Escheria coli se promyl dvak41
rát po 20 ml STET-ústoje (50 mM Tris-HCl, 8 % (hmotnost/ objem) sacharózy, 50 mM EDTA, 1 % (objem/ objem) Triton X-100, pH 7,4) podle Babbit a J. (1990), aby se odstranily nerozpustné proteiny. Zbylý sediment se Zachovalými inklusními částicemi se rozpustil v 20 ml denaturačního ústoje (6 M gvanidiumchlorid, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) 16 hodinovou inkubací za třepání při pokojové teplotě.
K renaturaci rMLA se roztok proteinu v denaturačním ústoji pomalu přikapal do 90-násobného objemu skládacího ústoje (20 mM fosfátový ústoj, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 100 mM glukózy, 10 % (objem/objem) glycerin, 10 mM β-laktózy, pH 5,5) a 16 hodin se za míchání inkuboval při pokojové teplotě. Znovu složený protein se oddělil 30 minutovým odstřeďováním při 6000 otáčkách za minutu při 4 °C v rotoru GS-3 (Sorvall).
(VI) Isolace rMLB afinitní chromatografií na N-acetyl-Dgalaktosamin-agaróze
K isolaci aktivní rMLB vázající uhlovodíky se vyrovnala afinitní matrici N-acetyl-D-galaktosamin-agarózy (PIERCE, USA) s 10 objemy sloupce chromatografického ústoje (50 mM fosfátový ústoj, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 0,05 % (objem/objem) Tween-20(R), pH 7,0). Nastavení testu se uskutečnilo šaržovou inkubací afinitní matrice v roztoku vzorku obsahujícím rMLB po aspoň 2 hodiny při 4 °C. Po promytí afinitní matrice chromatografickým ústojem k odstranění nespecificky vázaných proteinů se eluovala vázaná rMLB kompetitivnítn. vytěsněním s 0,3 M N-acetyl-D- ga42
laktosaminem v chromatografickém ústoji, pH 4,0.
(VII) Reasociace in vitro řetězce lektinu z jmelí k expresi holoproteinu
Exprese rekombinantního holoproteinu lektinu z jmelí (ML) může vyjít z isolovaného složeného a také z denaturovaného, během společného skládání renaturovaného A-řetězce lektinu z jmelí a B-řetězce lektinu z jmelí. K reasociaci isolovaného složeného jednotlivého řetězce se inkuboval isolovaný B- řetězec lektinu z jmelí (nMLB nebo rMLB) s molárním přebytkem rMLA v 20 mM fosfátový ústoj, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,2 při 4 °C 16-48 hodin. Aby se vytvořily interchenární disulfidové můstky, následovala inkubace v přítomnosti redox systému z 6mM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 5:1) nebo lOmM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 2:1) + 1 μΜ protein-disulfidové isomerázy (Boehringer Mannheim).
K reasociaci denaturovaného jednotlivého řetězce během skládání se rozpustil rMLA-řetězec v 6 M gvanidiumchloridu, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 na koncentraci 2 mg/ml. rMLB-řetězec se rozpustil k úplné redukci cysteinových zbytků v 6 M gvanidiumchloridu, 100 mM DTT, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 a po inkubaci 20 minut při pokojové teplotě se přenesl do ústoje 6 M gvanidiumchloridu, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 pomocí gelové permeace na PD-10 (Pharmacia, Švédsko) a nastavil se na koncentraci 0,200 mg/ml. K reasociaci došlo v rámci společného skládání rMLB s molárním přebytkem rMLA pomalým ředěním 1:30 gvanidium roztoků v spojovacím ústoji (50 • · mM sodno-fosfátový ústoj, 50 mM KC1, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 100 mM glukózy, 20 mM laktózy, pH 8,0) a inkubaci 16 hodin při 4 °C. Aby se vytvořily interchenární disulfidové můstky, následovala inkubace v přítomnosti redox systému z 2mM glutathionu (poměr redukovaný k oxidovanému 1:1).
Spojovací násady se dialýsovaly v skladovacím ústoji (50 mM sodno-fosfátový ústoj, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % (objem/objem) glycerin, 0,05 % (objem/objem) Tween-20(R), pH 8,0). Důkaz a identifikace vzniklých heterodimerů se provedly SPS-PAGE za neredukujících podmínek a následující Western- skvrnovou analýzou s použitím specifické monoklonální protičástice proti A-řetězci lektinu z jmelí (TA5), případně B-řetězci (TB33). Isolace volné rMLA, případně rMLA agregátů se provedla afinitní chromatografií na N-acetyl-D- galaktosamin- agaróze, jak se popisuje pod (VI).
Příklad 8
Isoelektrická homogenita rMLA a rMLB
1-2 μΐ rMLA, přírodní rMLA, rMLB, přírodní rMLB nebo MLholoprotein se fokusovalo spolu s IEF-proteinovými standardy (BioRad, USA) na Servalyt Prenets IEF-gelech (pH 3-10, 125 x 125 mm, 150 μτη, Serva Heildelberg) . K důkazu se proteiny imobilizovaly polosuchým elektrickým skvrnováním na nitrocelulózových membránách (0,2 μπι, Schleicher a Schull, Dassel). Imunologické barvení se provedlo s pomocí MLA- specifické monoklonální protičástice (TA5, Tonevitsky aj., 1995) pro rMLA a nMLA, případně s pomocí MLB-specifické monoklo44 ·· ·· ·· · ·· ·· ···· · · · · ···· ··· ·· · · · · · • ··· · · · · · ··· · · • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·« ·· nální protičástice (TB33, Tonevitsky aj., 1995) pro rMLB, nMLB a ML-holoprotein. Imunokomplexy se barvily za použití anti-myší igG-IgG (Sigma, Deisenhofen) konjugovanou s alkalickou fosfátázou s výměnou substrátů NBT a BCIP (obr. 8).
Zatím co se vysoce čistý přírodní A-řetězec lektinu z jmelí a také vysoce čistý přírodní B-řetězec lektinu z jmelí ukazuje jako isoelektricky nehomogenní protein s isoelektrickými body nMLA 5,2, 5,4, 5,5 a 6,2, rekombinantní rMLA-řetězec se ukazuje jako isoelektricky homogenní protein s isoelektrickými bodem 6,8 a také rekombinantní rMLB-řetězec se ukazuje jako isoelektricky homogenní protein s isoelektrickými bodem 5,1 (obr. 8) .
Tím se ukazuje u přírodního ML-holoproteinu heterogenní řada variací molekul (obr. 8 níže), zatím co jednotná mobilita rekombinantních proteinů lektinu z jmelí dokumentuje homogenitu rML na rozdíl k mikroheterogenitě přírodních lektinů z jmelí.
Příklad 9
Důkaz enzymatické ribosomy dezaktivující aktivity rMLA
Koncentrace proteinů ve rMLA (znovu složený) a rMLA (rozpustný) a také přírodního MLA-řetězce (nMLA) vyčištěných imunoafinitní chromátografií se stanovila podle Bradforda (1976) za použití BSA-standardů.
K důkazu a kvantifikování enzymatické rRNA-N- glykosidázové aktivity MLA se upravil za použití TNT spojeného systému retikulocytů (Promega, USA) neradioaktivní testovací systém. Na násadu se předem inkubovaly stejná množství ··· ·· · ···· • ······ · · ···· • · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· (20 μΐ) TNT systému při 30 °C po 15 minut. Ke kvantifikování inhibice translace se přisadily kontrolní násady 2 μΐ odpovídajících ústojů, případně testované násady 2 μΐ stoupajících MLA-ředění (rozsah koncentrací 350-0 pM). Z každé násady se odebraly v odstupech 8 minut 2 vzorky a k zastavení reakce se zmrazily v kapalném dusíku. Jako míra translační aktivity se stanovilo relativní množství luciferázy (sqrtcpm) v bioluminiscenčním testu pomocí scintilačního přístroje. Pro každou násadu se při tom určila diference měřeného sqrt-cpm u obou časových vzorků jako míra relativní translační aktivity, přičemž aktivita kontrolní násady bez RIP nasadila na 0 %.
Vynesením relativní rychlosti inaktivace translace proti nasazeným koncentracím rMLA se určily pomocí nelineární regrese ty koncentrace proteinů, které vedly k 50 % inhibici translační aktivity ve srovnání s kontrolní násadou. Tato hodnota IC5O představuje veličinu závislou na systému, která umožňuje důkaz a kvantifikování enzymatické aktivity rMLA (znovu složený) a rMLA (rozpustný) ve srovnání s nMLA (obr. 9).
Obr. 9 ukazuje důkaz enzymatické ribosomy dezaktivující aktivity rekombinantního MLA-řetězce, přičemž se zachovává enzymaticky aktivní produkt jak při isolaci rozpustného podílu produktu exprese rMLA (rozpustný) tak u proteinu isolovaného znovusložením z nerozpustných inklusních částic (rMLA znovu složený). rMLA (rozpustný) a rMLA (znovu složený) vykazují hodnoty ICso 10,7 +/- 1,7 pM, případně 15,6
Λ Z- * · · · · - 46 - ···· ·· ·· ··· +/- 6,6 ρΜ překrývajících se aktivit. Tím vykazují nižší toxickou aktivitu než přírodní MLA-řetězec (IC5O 1,1 +/-.0,7 pM) .
Příklad 10
Aktivita vázající uhlovodíky B-řetězce lektinu z jmelí
Důkaz aktivity vázající uhlovodíky B-řetězce lektinu z jmelí a také srovnání aktivit vázajících uhlovodíky B- řetězců rekombinantního a rostlinného lektinu z jmelí a jejich specifit se provede testem spojení enzymu s lektinem (ELLA) v přítomnosti kopetitivních uhlovodíků. K vazbě nMLBa rMLB-řetězců došlo za použití imobilizované matrice asialofetuinu převážně na zbytcích galaktózy a N-acetyl- galaktosaminu a také za použití imobilizované matrice fetuinu převážně na zbytcích kyseliny sialinové.
K imobilizaci uhlovodíkové matrice se dalo 100 μΐ roztoku 1,1 mg asialofetuinu (Sigma, Deisenhofen) v 11 ml PBS do dutin MaxiSorp C96 mikrotitračních desek (Nunc, Wiesbaden) a inkubovalo se 16 hodin při pokojové teplotě. Po promytí mikrotitračních desek třikrát s 150 μΐ/dutinu PBS-T (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/ objem) Tween-20(R), pH 7,2) se mikrotitrační desky inkubovaly se 1 hodinu při 36 °C, aby se blokovaly nespecifická vazná místa v 200 μΐ/dutinu PBS-T-1 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/ objem) Tween-20(R), 1 % (hmotnost/objem) BSA pH 7,2) a pak se opět promyly, jak popsáno. K testu se nasadily 100 μΐ preparáty obsahující Břetězce v koncentraci 100-500 ng/ml, výhodně 400 ng/ml, při4 • · čemž se testované koncentrace upravily ředěním vzorků v PBS0,05 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,05 % (hmotnost/ objem) BSA pH 7,2). Na testované koncentrace se daly 2-3 opakování. Stanovení prázdné hodnoty se provede s PBS-0,05 % BSA nebo s daným preparačním ústojem. K stanovení vazebných specifit se provedla inkubace vzorků v přítomnosti kopetitivních cukrů. K vytěsnění rMLB, nMLB nebo ML- holoproteinů z vazby na asialofetuinovou nebo fetuinovou matrici se přidala galaktóza výhodně v koncentračním rozmezí 0-280 mM, N-acetyl-galaktosamin v koncentračním rozmezí 0-140 mM, v koncentračním rozmezí 0-280 mM, laktóza nebo kyselina sialinová v koncentračním rozmezí 0-140 mM. Desky se po naložení inkubovaly se 2 hodiny při 36 °C a potom se promyly, jak popsáno. V naložených dutinách se dalo 100 μΐ/ dutinu séra z koz proti lektinů z jmelí (1:19800 zředění sérových poolů v PBS-T-0,1 % BSA-Tx (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 0,1 % (objem/objem) Tween-20(R), 0,1 % (hmotnost/objem) BSA, 1 % (objem/objem) Triton X-100, pH 7,2), inkubovalo se 2 hodiny při 36 °C a pak se opět promyly, jak popsáno. K důkazu imunokomplexů se na naloženou dutinu dalo 100 μΐ/dutinu séra protikozího IgG-IgG (Sigma, Deisenhofen) konjugovaného s křenovou peroxidázou v 1:3500 zředění v PBS-1 % BSA (10 mM sodno fosfátový ústoj, 130 mM NaCl, 1 % (objem/objem) BSA, pH 7,2) a inkubovalo se 1 hodinu při 36 °C. Dutiny se pak šestkrát promyly 150 μΐ/dutinu PBS-T. X vyvolání se přidalo 100 μΐ/dutinu roztoku substrátu (1 tableta o-fenylendiaminu • ····· · · · ···· · • · · · · ··· ···· ·· ·· ··♦ ·· ·· (Sigma, Deisenhofen) v 25 ml 65 mM kyseliny citrónové, pH 5,0 + 10 μΐ peroxidu vodíku) a inkubovalo se 20 minut při pokojové teplotě v temnu. K zastavení reakce došlo přidáním 100 μΐ/dutinu 1 M kyseliny sírové. Vyhodnocovalo se měřením absorbce při 450 nm s referenční vlnovou délkou 690 nm a výpočtem hodnot IC50 popsáním naměřených dat 4-parametrickou korelací. Obr. 10 ukazuje vynášení pozorovaných vytěsnění v ELLA-soustavě rMLB a nMLB z imobilizováných ligandů asialofetuinu rostoucími množstvími D-galaktózy (obr. 10a), β-laktózy (obr. 10b) N- acetyl-galaktosaminu (obr. 10c). a také vytěsnění z imobilizovaných ligandů asialofetuinu rostoucími množstvími kyseliny sialinové (obr. lOd). Vazebné charakteristiky rMLB a nMLB byly popsané hodnotou IC50 odpovídající polovičnímu maximálnímu vytěsnění.
Zatím co vazba uhlovodíků rostlinného nMLB-řetězce může soutěžit s galaktózou (IC50 = 4,5 mM) a β-laktózou (IC50 = 4,9 mM), ukazuje rekombinantní rMLB-řetězec překvapivě zřetelně změněnou uhlovodíkovou specifitu. Na rozdíl od nMLB nesoutěží uhlovodíková vazebná aktivita s galaktózou (IC50 nebyla stanovitelná) a jen v malé míře s β-laktózou (IC50 > 70 mM). Vedle drasticky snížené afinitě ke galaktóze, ukazuje rekombinantní rMLB-řetězec přece zřetelnou afinitu k N-acetyl-galaktosaminu. Další aktivita popsaná pro NMLB, vazba na ligandy kyseliny sialinové však mohla být pro rekombinantní rMLB-řetězec dokázaná (obr. lOd). Při tom se ukazují souhlasné hodnoty pro rostlinný nMLB-řetězec (IC50 = 49,8 mM) a pro rekombinantní rMLB-řetězec (IC50 = 47,1
ΦΦ φ φ φφ ·« φ φφ φφ • φ φ φ φ · · ·· • · · · φφ φ φ • ·« · · φ φ · »φ φ ·φ φ φ · φ φ φφ • · φφ · · · φφ φφ mM) .
Proti rostlinnému nMLB-řetězi.v prvé řadě specifickému pro galaktózu a β-laktózu, má rekombinantně vyjádřený rMLBřetězec zřetelně rozdílnou, na stranu N-acetyl- galaktosaminu a kyseliny sialinové posunutou uhlovodíkovou specifitu. Příklad 11
Stanovení cytotoxické aktivity rML-holopróteinu reasociovaného in vitro na lidské leukemické buňky
Integrita holoproteinu lektinu z jmelí se dokázala kvantitativním stanovením cytotoxicity proti lidské linii leukemických mononukleárních (lymfatických) buněk M0LT4 (Evropská sbírka zvířecích buněčných kultur číslo 85011413).
Buňky MOLT4 se kultivovaly v mediu bez séra MDC-1 (PAN SYSTEMS, Aidenach) a pro test se nasadily při násadové hustotě l,6xlOs buněk M0LT-4/ml při viabilitě > 98 %. K stanovení cytotoxicity se naočkovaly dutiny mikrotitrační desky s 96 prohlubněmi 90 μΐ suspenze buněk MOLT s 18000 buněk/ dutinu a smíchaly se s 10 μΐ zkušebního roztoku. K testu se nasadily preparáty holoproteinu lektinu z jmelí (šarže číslo 220793 (Madaus) a BRAIN 12/94, které se isolovaly z listů jmelí nebo čaje z jmelí standardním postupem na laktosylsefaróze (Franz aj., 1977), tak také rMLB holoprotein reasociovaný in vitro v koncentračním rozmezí 0-100 pg/ml odpovídajícímu (1,6 fM-1,66 pM), přičemž se řady ředění upravily kultivovačním mediem pro buňky MDC-1. Na koncentrace vzorků a kontrol se dalo 6 opakování.
Buňky se inkubovaly se 72 hodin při 37 °C v 5 % CO2 ·· ·Φ ·99 99
9 9 99 9 9 99
9 9 · 9 999
999 9 9 9 9 · 9999· • 9 9 9 9 9 99
9999 99 99 999 99 99 v zaplynovaném inkubátoru. Kvantifikace cytotoxického účinku se provedla měřením viability buněk pomocí rozpustných formazanových barviv způsobem WST-1 (Scudiero aj., 1988) za použití odpovídajícího reagentu proliferace buněk WST-1 (Boehringer Mannheim).
Rekombinantní holoprotein a také chimérní holoprotein rMLA/nMLB ukazují vzhledem MOLT4-cytotoxicitě biologickou aktivitu shodnou s přírodním proteinem s hodnotami IC50 okolo 10-30 pg/ml. Naproti tomu rMLB neukazuje v testované oblasti (rMLB až do 1 ng/ml) žádnou cytotoxickou aktivitu. Příklad 12
Indukce apoptosy rekombinantním lektinem z jmelí (rML) na příkladu lidské monocytové buněčné linie U937
Indukce apoptosních pochodů rekombinantním lektinem z jmelí (rMLA/rMLB) se dokázala barvěním buněčných jader fluorescentním barvivém DAPI (Hotz aj., 1992). Typické apoptosní změny morfologie jader se tím mohly zviditelnit mikroskopem a kvantifikovat se spočítáním 500-1000 buněk na vzorek. Použití media bez séra má význam pro citlivost testů, protože přítomnost proteinů séra v daném množství lektinu se drasticky snižuje (asi o faktor 40 při 10 % FCS, Ribereau-Gayon aj., 1995). Doba indukce 24 hodin dovoluje jen podmíněně přímou korelaci s MOLT-testem, neboú cytotoxický účinek v testu viability se plně projeví teprve po 72 hodinách, apoptosa je však dřívější účinek. Při delší době inkubace apoptosa překryta nekrotickými účinky.
Obr. 12 ukazuje zřetelné zvýšení rychlosti apoptosních
| ·· | ·· | • 9 | • | • 9 | ·· | |
| « · | • · | • * | ·· | • · | • | • |
| • | • · | • · | • | • · | ·· | |
| • | • ·· · | • · | • | • ··· | • | • |
| • | <· | • · | • | • | • | • |
| ··*· | • · | • 9 | ··· | ·· | ·· |
pochodů buněk U937 po ošetření rekombinantním ML- holoproteinem. Při 70 pg/ml je počet apoptosních buněk po 2 hodinách v dvou rozdílných kulturách v mediích bez séra zvýšena o faktor 3. Rekombinantní lektin z jmelí má také jako přírodní protein schopnost indukovat apoptosní smrt buněk (Janssem aj., 1993) .
Příklad 13
Účinek stimulující imunitu rekombinantního lektinu z jmelí v PBMC-modelu
U cytokinů TNF-α (monocyty, makrofágy) a IFN-gamma (Tpomocné buňky) se jedná o centrální mediátory uvnitř složité sítě lidského imunitního systému. Lidské mononukleární buňky (PBMC, obsahují monocyty a lymfocyty) ze zdravých dárců krve se isolovaly FICOLL-PAQUE(R) odstřeďováním s hustotním gradientem podle údajů výrobce (Pharmacia, Švédsko).
Pro indukci uvolnění TNF-α se inkubovaly buňky (4xlOs mononukleárních buněk/ml) v mediu RPMI 1640 s 10 % (objem/ objem) fetálního telecího séra, 100 E/ml penicilinu, 100 ^g/ ml streptomycinu nejprve 18 hodin se samotnými rekombinantními proteiny lektinu z jmelí a pak dalších 24 hodin s 1 /zg/ml lipopolysacharidů ze Salmonella abortus equi jako kostimulačního faktoru při 37 °C v 5 % C02 a 95 % relativní vlhkosti vzduchu v U-tvarovaných mikrotitračních deskách pro buněčné kultury v zaplynovaném inkubátoru. Pak se ihned kvantifikovala koncentrace TNF-α ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (Genzyme Diagnostics, Růsselheim).
Pro indukci uvolnění IFN-gamma se inkubovaly buňky ve • · shora uvedeném mediu nejprve 1 hodinu se samotnými rekombinantními proteiny lektinu z jmelí a pak dalších 65 hodin s 0,5 gg/ml fytohemagglutininu-L jako kostimulačního faktoru, jak popsáno. Pak se ihned kvantifikovala koncentrace IFN-gamma ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (ENDOGEN INC., Cambridge, USA).
Příklad 14
Účinek stimulující imunitu rekombinantního lektinu z jmelí v modelu kůže2-ZK1200
Jako biotest zavedený model kůže2-ZK1200 sestává z třídimensionální kůže obsahující fibroblasty a ze strukturované pokožky z nezrohovatělých keratinocytů v jejich vlastní přirozeně oddělené matrici (Joller aj., 1996) . Kousky kůže (11x11 mm, připravené z lidských primárních buněk (Advanced Tissue Sciences, lne. (ATS), La Jolla, USA) se nastavily vždy na mřížce z nylonové tkaniny a ihned po dodání se převedly do speciálního media A (ATS, La Jolla, USA). Jak IL-Ια tak IL-6 jsou relevantní stimulující cytokiny lidského imunitního systému.
Pro indukci uvolnění IL-Ια, případně IL-6, se kousky tkáně kůže2 se vždy inkubovaly se zkoušenou látkou v 2 ml speciálního media B (ATS, La Jolla, USA) 24 hodin při 37 °C, 5 % C02 ve vzduchu a přes 95 % relativní vlhkosti vzduchu v 12 miskových deskách pro buněčné kultury (Corning Glass Works, Corning, USA). Pak se kvantifikovala koncentrace IL-Ioí ve zbytcích bez buněk pomocí ELISA (Quantikine human IL-la Assay, RandD Systems, Minneapolis, USA), případně
9 9 ·· · 9 99 9 • ····· · · · 99999 • 9999999 ···· 99 99 999 9999
IL-6 (h-interleukin 6 ELISA, Boehringer Mannheim).
V modelu kůže2 se ukázalo na dávce závislé uvolnění, 0,25-8 ng rML/ml indukované uvolnění, IL-lce a také na dávce závislé uvolnění, 0,5-8 ng rML/ml indukované uvolnění, IL-6 (obr. 14). Samotným rekombinantním rMLB-řetězcem se nemohlo překvapivě indukovat žádně shora uvedené uvolňování cytokinů, což je v rozporu s dosavadním stavu znalostí, podle kterého je aktivita stimulující imunitu odvozena hlavně od lektinové aktivity B-řetězce (Hajto aj., 1990).
Příklad 15
Aktivace imunokompetentních buněk rekombinantním rMLBřetězcem lektinu z jmelí
Aktivace imunokompetentních buněk se studovala na indukci proteinu CD69 na povrchu buněk. CD69 se objevuje jako jeden z prvých antigenů na povrchu buněk po aktivaci T-buněk, B-buněk a zejména přirozených zabijáckých buněk (NK-buňky), které na základě své schopnosti rozeznávat a rozpouštět neoplastické buňky mají centrální význam při přirozené obraně proti tumorům. CD69 představuje značku aktivace shora uvedených imunokompetentních populací buněk, protože protein na povrchu buněk se nevyjadřuje na klidových lymfocytech. Mimo to se dokázala pro indukovatelný protein na povrchu buněk CD69 podpůrná funkce pro cytotoxickou aktivitu NK-buněk a TcRgamma/delta T-buněk (Moretta aj., 1991). K důkazu značkovačů na povrchu buněk na lidských mononukleárních buňkách průtokovou cytometrií (FACS) se PBMC podobně jako v příkladě 13 isolovaly hustotním gradientem na Hypaque • · (Sigma). Po převedení buněk do media RPMI 160 s 5 % FCS a násadou asi 25000 buněk/jamku mikrotitrační desky následovala 4-hodinová inkubace s 1, 10, 30 a 100 ng testované látky. Po 20 minutové inkubaci s fluorescenčně značeným anti-CD69-MAK v ledové lázni následovalo promývání v Hankově roztoku s 5 % FCS. Sedimentované značené buňky se převedly do 200 μΐ obalové kapaliny a měřily se v FACScan (Becton Dickinson). Vynesena je střední fluorescence odpovídající počtu CD69- značkovače na povrchu buněk na buňku, tak podílu CD69 positivních buněk v celé populaci buněk,
V koncentračním rozmezí í-100 ng/ml se mohla zjistit aktivace mononukleárních buněk jak s ohledem na objevení se CD69 na povrchu buněk, tak s ohledem na podíl CD69 positivních buněk. Při tom se ukázala zvonovíta křivka závislosti na dávce. Cytotoxický účinek na zde studované PBMC se také nemohl dokázat při nejvyšší koncentraci 100 ng/ml rMLB.
Literatura
Babbitt, P.C., West, B.L., Buechter, D.D., Kuntz, I.D. und Kenyon, G.L. [1990]: Removal of a proteolytic activity associated with aggregates formed from expression of creatine kinase in Eschexichia coli leads to improved recovery of active enzyme. Bio/Technology 8, 945-949.
Baur,A., Buschinger, A. und Zimmermann, F.K. (1993): Molecular cloning and sequencing of 18S rDNA fragments of six different ant species. Ins. Soc. 40, 325-335.
Beuth, J., Ko, H.L., Gabius, H.-J. und Pulverer, G. [1991]: Influence of treatment with the immunomodulatory effective dose of the β-galactoside-specific lectin from Mistletoe on tumor colonization in BALB/cmice for two experimental model systems. in vivo 5, 23-32.
Beuth, J., Ko, H.L., Gabius, H.-J., Burrichter, H., Oette, K. und Pulverer, G. [1992]: Behavior of lymphocyte subsets and expression of activation markers in response to immunotherapy with galactoside-specific lectin from mistletoe in breast cancer patients. Clin. Investig. 70,' 658-661.
Beuth, J., Ko,· H.L., Tunggal, L., Steuer, M.K., Geisel, J., Jeljaszewicz, J. und Pulverer, G. [1993]: Thymocyte proliferation and maturation in response to galactoside-specific Mistletoe Lectin-1. in vivo 7, 407-410.
Beuth, J., Ko, K.L., Tunggal, L., Geisel, J. und Pulverer,
| G. [1993]: | Vergleichende Untersuchungen zur im- |
munaktiven Wirkung von Galactosid-spezifischem Mistellektin. Arzneim. Forsch. 43, 166-169.
Bocci, V. [1993]: Mistletoe (Viscum album} lectins as cytokine inducers and immunoadjuvant in tumor therapy. J. of Biological Řegulators and Homeostatic Agents 7, 1-6.
• · • ···· ··· ···· ·· ·· ··· ·· ··
Beuth, J., Ko, H.L., Tungal, L., Buss, G., Jeljaszewicz,J., Steuer, M.K. und Pulverer, G. [1994]: Immunaktive Wirkung von Mistellektin-1 in Abhángigkeit von der Dosierung. Arzneim. Forschung 44, 1255-1258.
Bradford, M.M. [1976]': A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein . utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254.
Dietrich, J.B., Ribéreau-Gayon. G., Jung, M.L., Franz, H., Beck, J.P. und Anton, R. [1992]: Identity of the Nterminal sequenceš of the three A chains of mistletoe (Viscum album L.) lectins: homology with ricin-like plant toxins and single-chain ribosome-inhibiting proteins. Anti-Cancer Drugs 3, 507-511.
Eifler, R., Pfullěr, K., Gockeritz, W. und Puller, U. [1994]: Improved procedures for isolation and standardization of mistletoe lectins and their subunits: implications for the analysis of lectin pattern of the european mistletoe. In: Lectins Biology-Biochemistry Clinical Biochemistry (Bog-Hansen, Hrsg.) Vol. 9, M/S Wiley, New Delhi.
Endo, Y., Tsurugi, K. und Franz, H. [1988a]: The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotic -ribosomes. The RNA N-glycosidase activity of the protein. FEBS Lett. 231, 378-80.
Endo, Y., Tsurugi, K. und Lambert, J.M. [1988b]: The site of action of six differtent ribosom-inactivating proteins from plants on eukaryotic ribosomes: the RNA Nglycosidase activity of the proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 1032-1036.
Erlich, H.A., Gelfand, D.H. und Saiki, R.K. [1988]: Specific DNA amplification. Nátuře 331, 461.
Franz, H., Haustein, B., Luther, P., Kuropka, U. und Kindt, A. [1977] : Isolierung und Charakterisierung von Inhaltsstoffen der Mistel (Viscum album L.) I. Affinitátschromatographie an fixierten Plasmaproteinen. Acta biol. med. germ. 36, 113-117.
• ···· ··· ···· ·· ·· ··* ·* ··
Frohman, M.A., Dush, M.K. und Martin, G.R. [1988]: Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002.
Gabius, H.-J., Walzel, H., Joshi, S.S., Kruip, J., Kojima, S., Gerke, V., Kratzin, H. and Gabius, S. [1992]: The immunomodulatory β-galactoside-specif ic lectin from Mistletoe: Partial sequence analysis, cell and tissue binding, and impact on intracellular biosignalling of monocytic leukemia cells. Anticancer Res. 12, 669-676.
Gabius, H.-J., Gabius, S., Joshi, S.S., Koch, B., Schroeder, M., Manzke, W.M. und Westerhausen, M. [1993] : From III-defined extracts to the immunomodulatory lectin: Will there be a reason for oncological application of Mistletoe ? Planta Med. 60, 2-7.
Gabius, H.-J. und Gabius, S. [1994]: Die Misteltherapie auf dem naturwissenschaftlichen Prtifstand. PZ 139, 9-,
16.
Ganguly, C. und Das, S. [1994]: Plant Lectins as inhibitors of tumor growth and modulators of host immune response. Chemotherapy 40, 272-278.
Garcia-Olmedo, · F., Carbonero, P., Hernandez-Lucas, C., Paz-Ares, J., Ponz, F., Vicente, 0. und Sierra, J.M. [1983] : Inhibition of eukaryotic cell-free protein synthesis by thionins from Wheat endosperm. Biochim. Biophys. Acta 740, 52-56.
Gribskov, M., Devereux, J. und Burgess, R. [1984] Nucl. Acids Res. 12, 539-549.
Hajto, T. [1986]: Immunmodulatory effects of Iscador: A Viscum album preparation. Oncology 43 suppl.l, 51-65.
Hajto, T., Hostanska, K. und Gabius, H.-J. [1989]: Modulatory potency of the β-galactoside-specific lectin from Mistletoe extract (Iscador) on the host defense systém ih vivo in Rabbits and Patients. Cancer Res. 49, 4803-4808.
♦ · • ·
• · · ···· · · ··
Hajto, T., Hostanska, K., Frei, K., Roraorf, C. und Gabius, H.-J. [1990]: Increased secretion of Tumor necrosis factor a, Interleukin 1, and Interleukin 6 by Human Mononuclear Cells exposed to β-Galactosidespecific lectin from clinically applied Mistletoe extract. Cancer Res. 50, 3322-3326.
Harlowe, E. und Spur, D. [1988] In: Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Heiny, B.-M. und Beuth, J. [1994]: Mistletoe extract standardized for the galactoside-specific lectin (ML1) induces. β-endorphin release and immunopotentiation in breast cancer patients. Anticancer Research 14, 1339-1342.
Hotz, M., Del Bino, G., Lassota, P., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. [1992] Cytostatic and cytotoxic effects of fostriecin on human promyelocytic HL-60 and lymphocytic MOLT-4 leukemic cells. Cancer Res. 52, 1530-1535.
Hulsen, H., Doser, C. und Mechelke, F. [1986]: Differences in the in vitro effectiveness of preparations produced from Mistletoes of various host trees. Drug. Res. 36, 433-436.
Jaggy, C., Musielski, H.z Urech, K. und Schaller, G. [1995]: Quantitative Determination of lectins in
Mistletoe preparations. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 45, 905-909.
Janssen, O., Scheffler, A., und Kabelitz, D. [1993]
In vitro Effects of Misteletoe Extracts and Mistletoe Lectins. Cytotoxicity towards tumor cells due to the induction of programmed cell death (apoptosis). Arzneim. forsch. 43, 1221-1227
Joller, P.W., Menrad,· J.M., Schwarz, T., Pfuller, U., Parnham, M.L., Weyhenmeyer, R. und Lentzen, H. [1996]: Stimulation of cytokine production via a speciál standardized Mistletoe preparation in an in vitro skin bioassay. Arzneim.-Forsch./Drug Res. 46, 649-653.
• · • · · · · · · · ···· ·· ·· ··· ·· ··
Katzin, B.J., Collins, E.J. und Robertus, J.D. [1991]: Structure of Ricin A-Chain at 2.5 A. Proteins 10, 251259.
Kim, Y., Misna, D., Monzingo, A.F., Ready, M.P., Frankel, A., und Robertus, J.D. [1992]: Structure of a Ricin mutant showing rescue of activity by a noncatalytic residue. Biochemistry, 31, 3294-3296.
Lord, J.M., Roberts, . L.M. und Robertus, J.D. [1994]:
Ricin: structure, mode of action, and some current applications._FASEB J. 8, 201-208.
Mánnel, D.N., Becker, H., Gundt, A., Kist, A. und Franz, H. [1991]: Induction of tumor necrosis factor expression by a lectin from Viscum album. Cancer Immunol. Immunother. 33, 177-182.
Minowada, J., Ohnuma, T.z Moore, G.E. [1972] Rosetteforming human lymphoid cell lineš. J. Nat. Cancer Inst. 49, 891-895
Mendez, E., Mořeno, A., Colilla, F., Pelaez, F., Limas, G.G., Mendez, R., Soriano, F.,_ Salinas, M. und de Haro, C. [1990]: Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free systém of a novel thionin,· g-hordothionin, from barley endosperm. Eur. J. Biochem. 194, 533-539.
Moretta, A. et al. [1991] J. Exp. Med. 172, 701-707.
Ribereau-Gayon, G., Jung, M.-L., Beck, J.-P., Anton, R. [1995]: Effect of fetal calf sérum on the cytotoxic activity of Mistletoe (Viscum album L. ) lectins in cell culture. Phytotherapy Res. 9, 336-339.
Rutenber, E. und Robertus, J.D. [1991]: Structure of Ricin B-chain at 2.5 A resolution. Proteins 10, 260-269.
Scudiero, P.A. et al. [1988] Cancer Res. 48, 4827-4823.
Stein, G. und Berg, P.A. [1994): Non-lectin component in a fermented extract from Viscum album L. grown on pines induces proliferation of lymphocytes from heallthy and allergic individuals in vitro. Eur. J. Clin. Pharmacol. 47, 33-38.
• ·
Stirpe, F.z Barbieri, L., Battelli, M.G., Soria, M. und Lappi, D.A. [1992]: Riboso.me-inactivating proteins from plants: Present status and future prospects. Bio/Technology 10, 405-412.
Studier, F.W. und Moffart, B.A. [1986]: Use of Bacteriophage T7 RNA Polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, 113130.
Tonevitsky, A.G., Rakhmanova, V.A., .Agapov, I.I ., Shamshiev, A.T., Usacheva, E.A., Prokoph'ev, S.A., Denisenko, O.N., Alekseev, Y. and Pfueller, U. (1995): The interactions of anti-MLI monoclonal antibodies with isoforms of the lectin from Viscum album. Immunol. Lett. 44, 31-4.
Vitetta, E. S., Thorpe, P. E.z Uhr, J. W. (1993) Iminunotoxins: magie bullets or misguided missiles? Inununol. Today, 14, 252-259
Weston, S.A., Tucker, A.D., Thatcher, D.R., Derbyshire, D.J. und Pauptit, R.A. [1994]: X-ray structure of recombinant Ricin A-Chain at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 244, 410-422.
Claims (25)
- (podklad pro mezinárodní řízení)É N Á R průzkum a kyseliny,1. Molekula nukleové (a) kóduje p^edprotein, který která po dozrání vykazuje biologickou aktivitu dimeru lektinu z jmelí a který vykazuje na obrázku 4c ukázaný řetězec nukleotidů, (b) kóduje fragment předproteinu podle (a), přičemž je fragment biologicky aktivní částí dimeru lektinu z jmelí, (c) liší se od molekuly nukleové kyseliny podle (a) nebo (b), degenerací genetického kódu nebo (d) za stringetních podmínek se hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle (a), (b) nebo (c) a kóduje polypeptid v (a) nebo (b) udanou biologickou funkcí nebo aktivitou.
- 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, vyznačená tím, že fragmentem je A-řetězce lektinu z jmelí, který je kodován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4a.
- 3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, vyznačená tím, že fragmentem je B-řetězce lektinu z jmelí, který je kodován sekvencí nukleotidů ukázanou na obrázku 4b.
- 4. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačená tím, že jí je DNA molekula.
- 5. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho z nároků1 až 3, vyznačená tím, že jí je RNA molekula.
- 6. Molekula nukleové kyseliny, kterou je protisměrný pás k molekule nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5.
- 7. Vektor, který obsahuje alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 6.
- 8. Vektor podle nároku 7 vyznačený tím, že obsahuje jak molekulu nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo 4, tak molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4.
- 9. Vektor podle nároku 7 nebo 8, který je vektorem exprese .
- 10. Hostitel, který je transformován alespoň jedním vektorem jednoho z nároků 7 až 9.
- 11. Hostitel podle nároku 10, kterým je rostlinná buňka nebo transgenní rostlina.
- 12. Hostitel podle nároku 10, kterým je savčí buňka, rostlinná buňka, bakterie, buňka houby, buňka kvasinky nebo hmyzí buňka.
- 13. Hostitel podle nároku 10 vyznačený tím, že je to bakterie Escheria coli, buňka houby Aspergillus nebo buňka • 9 ~ ~ · ··· · · · · · 999 99 • 9 9 9 9 9 999999 99 99 999 9999Spodoptera, s výhodou buňka Spodoptera frugiperda.
- 14. Polypeptid, který se kóduje molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5, nebo vektorem podle jednoho z nároků 7 až 9 a nebo je produkován hostitelem podle jednoho z nároků 10 až 12.
- 15. Polypeptid podle nároku 14 vyznačený tím, že obsahuje alespoň jednu chemickou nebo enzymatickou modifikaci, přičemž enzymatická modifikace není žádnou glykosylací vyskytující se Viscum album.
- 16. Polypeptid podle nároku 14 nebo 15 vyznačený tím, že je to spojený protein.
- 17. Dimer polypeptidu s biologickou aktivitou lektinu z jmelí, přičemž jeden monomer se kóduje molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 2, 4 nebo 5 a druhý monomer se kóduje molekulou nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 3 až 5, přičemž dimer polypeptidu je produkován hostitelem podle nároku 13 nebo 14.
- 18. Dimer polypeptidu podle nároku 17 vyznačený tím, že alespoň jeden z monomerů je polypeptid podle nároku 15 nebo 16.
- 19. Antičástice nebo její fragment či derivát, které • ··· · · · · · ··· · · • ···· · · · ···· ·· ·· ··· ·· ·· specificky vázají polypeptid podle jednoho z nároků 14 až 16 a nebo dimer polypeptidu podle nároku 17 nebo 18.
- 20. Způsob přípravy polypeptidu podle jednoho z nároků 14 až 16, nebo dimeru polypeptidu podle nároku 17 nebo 18, při kterém se pěstuje hostitel podle jednoho z nároků 12 nebo 13 za vhodných podmínek a tak získaný polypeptid nebo dimer polypeptidu se isoluje.
- 21. Imunotoxin obsahující alespoň jeden polypeptid podle jednoho z nároků 14 až 16 a nebo dimer polypeptidu podle nároku 17 nebo 18.
- 22. Lék obsahující polypeptid podle jednoho z nároků 14 až 16 a nebo dimer polypeptidu podle nároku 17 nebo 18 a nebo imunotoxin podle nároku 21, případně spolu s farmaceuticky snesitelným nosičem.
- 23. Primér nebo pár primérů, který specificky hybridizují na molekule nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5, případně hybridizují na komplementárním pásu.
- 24. Diagnostická sestava obsahující alespoň:a) molekulu nukleové kyseliny podle jednoho z nároků 1 až 5,b) primér anebo pár primérů podle nároku 23,c) polypeptid podle jednoho z nároků 14 až 16 a nebo dimer polypeptidů podle nároku 17 nebo 18.
- 25. Prostředek na ochranu rostlin obsahující polypeptid podle jednoho z nároků 14 až 16 a nebo dimer polypeptidů podle nároku 17 nebo 18.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95109949A EP0751221B1 (de) | 1995-06-26 | 1995-06-26 | Rekombinantes Mistellektin (rML) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ404997A3 true CZ404997A3 (cs) | 1998-06-17 |
| CZ292689B6 CZ292689B6 (cs) | 2003-11-12 |
Family
ID=8219389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19974049A CZ292689B6 (cs) | 1995-06-26 | 1996-06-25 | Rekombinantní lektin z jmelí |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6271368B1 (cs) |
| EP (3) | EP0751221B1 (cs) |
| JP (2) | JP3291548B2 (cs) |
| KR (1) | KR100292918B1 (cs) |
| CN (1) | CN1160457C (cs) |
| AR (1) | AR003961A1 (cs) |
| AT (1) | ATE170922T1 (cs) |
| AU (1) | AU719297B2 (cs) |
| BR (1) | BR9609223A (cs) |
| CA (1) | CA2225924C (cs) |
| CZ (1) | CZ292689B6 (cs) |
| DE (1) | DE59503524D1 (cs) |
| DK (1) | DK0751221T3 (cs) |
| ES (1) | ES2124470T3 (cs) |
| HU (1) | HU225738B1 (cs) |
| NO (1) | NO327165B1 (cs) |
| PL (1) | PL193281B1 (cs) |
| RU (1) | RU2241750C2 (cs) |
| SK (1) | SK173197A3 (cs) |
| WO (1) | WO1997001636A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA965361B (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE170922T1 (de) * | 1995-06-26 | 1998-09-15 | Madaus Ag Koeln | Rekombinantes mistellektin (rml) |
| CA2276534C (en) * | 1997-01-02 | 2011-11-22 | B.R.A.I.N. Biotechnology Research And Information Network Gmbh | Recombinant fusion proteins based on ribosome-inactivating proteins of the mistletoe viscum album |
| CN1104438C (zh) * | 1997-06-02 | 2003-04-02 | 山东医科大学附属医院 | 槲寄生提取物及其用途 |
| DE19804210A1 (de) | 1998-02-03 | 1999-08-12 | Biosyn Arzneimittel Gmbh | Rekombinante Mistellektine |
| KR20010011330A (ko) * | 1999-07-27 | 2001-02-15 | 김종배 | 한국산 겨우살이 추출물과 이로부터 분리한 단백질 및 상기 단백질에서 분리한 렉틴 |
| DE10044027A1 (de) * | 2000-09-06 | 2002-03-14 | Viscum Ag | Rekombinant erzeugtes Mistellektin (ML III) |
| NZ526202A (en) * | 2000-11-14 | 2005-08-26 | Ian Pryme | Orally ingestible preparation of mistletoe lectins, ML-I, ML-II and ML-III and methods fro treating cancer and autoimmune diseases |
| EP1418800B1 (en) | 2001-07-09 | 2007-05-09 | University of Copenhagen | Methods and cuttings for mass propagation of plant parasites |
| DE10149030A1 (de) * | 2001-10-05 | 2003-04-10 | Viscum Ag | Stabile galenische gefriergetrocknete Arzneimittelzubereitung von rViscumin |
| ES2287353T3 (es) * | 2001-12-21 | 2007-12-16 | Viscum Ag | Procedimiento para la determinacion de la capacidad de respuesta de un individuo a la lectina de muerdago. |
| DE102011003478A1 (de) | 2011-02-01 | 2012-08-02 | Cytavis Biopharma Gmbh | Antivirales Mittel enthaltend rekombinante Mistellektine |
| EP2508195A1 (de) * | 2011-04-06 | 2012-10-10 | Cytavis BioPharma GmbH | Arzneimittel enthaltend rekombinante Mistellektine zur Behandlung des malignen Melanoms |
| WO2013000980A1 (de) | 2011-06-27 | 2013-01-03 | Cytavis Biopharma Gmbh | Rekombinantes mistellektin und dessen verwendung als adjuvans |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| EP3205348A1 (de) | 2016-02-15 | 2017-08-16 | Melema Pharma GmbH | Arzneimittel enthaltend rekombinante mistellektine zur behandlung von hirntumoren |
| CN106166223A (zh) * | 2016-09-17 | 2016-11-30 | 四川易创生物科技有限公司 | 一种治疗肺肾阴亏、潮热盗汗的中药组合物及其制备方法 |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| CN115025207B (zh) * | 2022-06-23 | 2023-02-07 | 黑龙江中医药大学 | 一种用于治疗类风湿性关节炎的药物及其制备方法 |
| CN117924453B (zh) * | 2024-03-19 | 2024-08-06 | 广东现代汉方科技有限公司 | 一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6127532A (en) * | 1989-09-12 | 2000-10-03 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Lectin cDNA and transgenic plants derived therefrom |
| US5407454A (en) * | 1989-11-07 | 1995-04-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Larvicidal lectins and plant insect resistance based thereon |
| DE4221836A1 (de) | 1992-07-03 | 1994-01-05 | Gabius Hans Joachim Prof Dr | Das biochemisch aufgereinigte Mistel-Lektin (ML-1) als therapeutisch anwendbarer Immunmodulator |
| DE4341476A1 (de) * | 1993-12-02 | 1995-06-08 | Uwe Dr Pfueller | Mittel zur Untersuchung und Beeinflussung zellulärer Veränderungen auf Lektinbasis |
| ATE170922T1 (de) * | 1995-06-26 | 1998-09-15 | Madaus Ag Koeln | Rekombinantes mistellektin (rml) |
-
1995
- 1995-06-26 AT AT95109949T patent/ATE170922T1/de active
- 1995-06-26 EP EP95109949A patent/EP0751221B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-26 EP EP98105660A patent/EP0884388A1/de not_active Withdrawn
- 1995-06-26 DE DE59503524T patent/DE59503524D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-26 DK DK95109949T patent/DK0751221T3/da active
- 1995-06-26 ES ES95109949T patent/ES2124470T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-31 CN CNB961960256A patent/CN1160457C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-25 EP EP96923926A patent/EP0835312A2/de not_active Withdrawn
- 1996-06-25 HU HU9900316A patent/HU225738B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-06-25 CZ CZ19974049A patent/CZ292689B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-06-25 AU AU64163/96A patent/AU719297B2/en not_active Ceased
- 1996-06-25 KR KR1019970709890A patent/KR100292918B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-25 RU RU98101194/13A patent/RU2241750C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-06-25 BR BR9609223A patent/BR9609223A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-06-25 US US08/776,059 patent/US6271368B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-25 JP JP50416997A patent/JP3291548B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-25 WO PCT/EP1996/002773 patent/WO1997001636A2/de not_active Ceased
- 1996-06-25 SK SK1731-97A patent/SK173197A3/sk unknown
- 1996-06-25 PL PL324209A patent/PL193281B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-06-25 CA CA002225924A patent/CA2225924C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-25 ZA ZA9605361A patent/ZA965361B/xx unknown
- 1996-06-26 AR ARP960103316A patent/AR003961A1/es unknown
-
1997
- 1997-12-23 NO NO19976058A patent/NO327165B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-12-28 JP JP2001401821A patent/JP2002300890A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ404997A3 (cs) | Rekombinantní lektin z jmelí | |
| Eck et al. | Characterization of recombinant and plant‐derived mistletoe lectin and their B‐chains | |
| Lord et al. | Ricin: structure, mode of action, and some current applications | |
| Li et al. | Systematic dual targeting of dendritic cell C-type lectin receptor DC-SIGN and TLR7 using a trifunctional mannosylated antigen | |
| Büssing | Induction of apoptosis by the mistletoe lectins: a review on the mechanisms of cytotoxicity mediated by Viscum album L. | |
| KR20090102772A (ko) | Ｈｌａ-ａ*1101 구속성 ｗｔ1 펩티드 및 이를 포함하는 의약 조성물 | |
| JPH03501208A (ja) | 細胞毒性結合体 | |
| JPH07506842A (ja) | 二本鎖を有する非毒性リボソーム不活性化蛋白（ｒｉｐ），その製法および適用 | |
| KR20160029069A (ko) | 세포 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트 | |
| CA2116359A1 (en) | Anti-hiv proteins gap 31, dap 30, and dap 32, dna coding therefor and therapeutic uses thereof | |
| Lele et al. | Effect of distal sugar and interglycosidic linkage of disaccharides on the activity of proline rich antimicrobial glycopeptides | |
| Pevzner et al. | Differences in amino acid sequences of mistletoe lectin I and III B-subunits determining carbohydrate binding specificity | |
| CN100519577C (zh) | 重组白喉毒素及其制备方法和应用 | |
| MXPA97010522A (es) | Lectina de muerdago recombinante (rml) | |
| KR100423117B1 (ko) | 한국산 겨우살이의 신규한 항암성 렉틴 및 그 유전자와 렉틴의 분리방법 | |
| EP2739644B1 (en) | Proteins with pro-apoptotic and antitelomerase activity on cancer cells, their preparation and use. | |
| Bhardwaj et al. | A Comprehensive Review on Ganoderma lucidum derived Bioactive peptide Ling Zhi-8 | |
| EP1846441B1 (en) | Riproximin , a novel type ii ribosome-inactivating protein and uses thereof | |
| Endo et al. | Mechanisms of action of ribotoxins | |
| Williams | 4.5 Toxin-specific antibodies for the detection of snake venom metalloproteases in clinical samples obtained from snakebite victims | |
| Yoo et al. | Isolation and partial characterization of heparin-binding protein from Korean mistletoe (Viscum album coloratum) | |
| Prasad | Isolation and characterization of lectins from red seeds of Abrus precatorius | |
| KR20090026838A (ko) | 세포투과성 융합단백질 세포도입 활성 증가용3-Ｏ-[β-Ｄ-글루코피라노실(1→4)-α-Ｌ-아라비노피라노실]-헤데라제닌 | |
| HK1015826A (en) | Recombinant mistletoe lectin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20130625 |